FR2763071A1 - Analogues peptidiques, et leurs utilisations notamment dans des compositions pharmaceutiques et pour le diagnostic - Google Patents

Analogues peptidiques, et leurs utilisations notamment dans des compositions pharmaceutiques et pour le diagnostic Download PDF

Info

Publication number
FR2763071A1
FR2763071A1 FR9705677A FR9705677A FR2763071A1 FR 2763071 A1 FR2763071 A1 FR 2763071A1 FR 9705677 A FR9705677 A FR 9705677A FR 9705677 A FR9705677 A FR 9705677A FR 2763071 A1 FR2763071 A1 FR 2763071A1
Authority
FR
France
Prior art keywords
peptide
mhc molecules
peptides
parent
cytotoxic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
FR9705677A
Other languages
English (en)
Other versions
FR2763071B1 (fr
Inventor
Jean Gerard Guillet
Gilles Guichard
Marina Ostankovitch
Francine Connan
Anne Quesnel
Jeannine Choppin
Jean Paul Briand
Sylviane Muller
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9506703&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FR2763071(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority to FR9705677A priority Critical patent/FR2763071B1/fr
Priority to PCT/FR1998/000923 priority patent/WO1998050423A2/fr
Priority to EP98924401A priority patent/EP0984985A2/fr
Priority to CA002289110A priority patent/CA2289110A1/fr
Publication of FR2763071A1 publication Critical patent/FR2763071A1/fr
Application granted granted Critical
Publication of FR2763071B1 publication Critical patent/FR2763071B1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56977—HLA or MHC typing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

L'invention a pour objet l'utilisation d'analogues peptidiques de peptides parents, caractérisés en ce qu'ils correspondent auxdits peptides parents dans lesquels :- au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique, est modifiée, à l'exception des modifications du type rétro, ou rétro-inverso, ou- au moins un acide aminé de la chaîne peptidique, est substitué par un acide aminé non protéinogénique, ou- au moins une liaison peptidique -CO-NH- dela chaîne peptidique, est modifiée, et au moins un acide aminé de ladite chaîne peptidique est substitué par un acide non protéinogénique,pour :- la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies susmentionnées, ou- la préparation d'une composition destinée au diagnostic in vivo des pathologies susmentionnées, ou à l'évaluation in vivo de la réponse immunitaire dans le cadre des pathologies susmentionnées, par mise en oeuvre d'une réaction cutanée d'hypersensibilité par injection intradermique de ladite composition, ou- la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro desdites pathologies.

Description

ANALOGUES PEPTIDIQUES ET LEURS UTILISATIONS NOTAMMENT
DANS DES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES ET POUR LE
DIAGNOSTIC
La présente invention a pour objet des analogues peptidiques et leurs utilisations, principalement dans le domaine de la préparation de compositions pharmaceutiques, notamment de vaccins, et pour le diagnostic in vitro ou in vivo
de diverses pathologies.
Le développement des neuropeptides, des hormones peptidiques et des antibiotiques à base de peptides, ou des vaccins synthétiques à base de peptides, est fortement perturbé par la grande sensibilité des peptides vis à vis de la
protéolyse qui limite, entre autres, l'administration orale et parentérale.
Les pseudopeptides représentent une classe de molécules particulièrement intéressante dans la conception d'inhibiteurs d'enzymes. Le clivage par les peptidases est impliqué dans une variété de processus biologiques puisqu'il permet de générer à partir de précurseurs inactifs des fragments protéiques ou peptidiques actifs. L'idée qu'un lien isostère pouvait être considéré comme un mime de l'intermédiaire tétraédrique formé lors du passage par l'état de transition, a ouvert la voie des inhibiteurs de type pseudopeptidiques. Au début des années 80, cette approche a été utilisée avec succès dans le développement d'inhibiteurs puissants de l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACE), de la rénine (Szelke et al., 1982; Boger et al., 1983) et de la protéase aspartique du VIH (Huff, 1991). Plus récemment, plusieurs inhibiteurs pseudopeptidiques sélectifs de la Ras farnesyl transférase ont été proposés. Ces molécules présentent un intérêt thérapeutique potentiel dans le traitement des cancers impliquant l'oncogène Ras muté (Buss &
Marsters, 1995).
Les analogues pseudopeptidiques d'hormones peptidiques ont également fait l'objet de nombreuses études avec pour objectif premier la stabilisation du peptide de départ et une conservation de l'activité. Cette stratégie a effectivement permis la découverte d'agonistes puissants (Chorev et al., 1979; Nagain et al., 1988; Doulut et al., 1992), mais aussi d'agonistes partiels et même d'antagonistes de l'hormone étudiée (Martinez et al., 1985; Coy et al., 1989; Leban et al., 1993; Cai et al., 1994). Des analogues plus sélectifs au niveau d'un récepteur ont aussi été obtenus dans certains cas (Mendre, 1988; Nagain et al., 1988; Schiller et al., 1993). Par ailleurs, la liaison pseudopeptidique permet d'explorer les caractéristiques conformationnelles du ligand au niveau du site modifié et, d'évaluer la contribution de la liaison amide et des liaisons hydrogènes inter- ou
intramoléculaires dans l'interaction avec le ou les récepteurs.
Toutefois, les modifications effectuées jusqu'à présent sur les peptides à usage imnmunologique se limitent essentiellement à l'adjonction de sucres, à celle d'acides gras plus ou moins longs pour permettre l'émulsion des lipopeptides résultants, à la cyclisation par formation de ponts disulfure ou covalents, ainsi qu'à l'adjonction de molécules telles que la biotine, pour augmenter, par exemple, la
sensibilité des tests immunochimiques en phase solide.
Plusieurs auteurs ont affirmé que les pseudopeptides possèdent probablement très peu ou pas d'immunogénicité, puisqu'ils ne pouvaient pas être transformés et présentés aux molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) pour être
reconnus par les cellules T auxiliaires ou par les lymphocytes T cytotoxiques.
C'est ainsi que Dintzis et al. ont décrit que l'énantiomère L de la rubrexodine induit une forte réponse immunitaire par production d'immunoglobulines d'isotype G (IgG), tandis que la protéine correspondante constituée d'acides aminés tous de
configuration D, n'induit pas de réponse immunitaire.
C'est dans ce contexte que les immunorétroides décrits ci-après, ainsi que les anticorps dirigés contre ces derniers, ont été décrits dans la demande internationale WO 95/24916, comme étant utilisables dans le domaine de la vaccination contre des pathologies dans lesquelles les peptides dont ils dérivent (peptides parents)
étaient impliqués, ainsi que pour le diagnostic de ces pathologies.
Les auteurs de cette demande internationale, qui sont également les auteurs de la présente demande, avaient en effet, pour la première fois, mis en évidence que la modification par remplacement d'une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique d'un peptide, par une liaison -NH-CO-, et, le cas échéant par remplacement d'un acide aminé de configuration L par un acide aminé de
configuration D, permet d'obtenir des analogues peptidiques (rétro ou rétro-
inverso respectivement) susceptibles d'être utilisés dans le cadre du traitement de
pathologies impliquant la réponse immunitaire à médiation humorale ou cellulaire.
Les immunorétroides susmentionnés sont des composés du type peptidique, à savoir des composés constitués d'une chaîne d'acides aminés protéinogéniques,
dont l'une au moins des liaisons -CO-NH-, et avantageusement toutes les liaisons -
CO-NH-, de la chaîne peptidique du peptide parent correspondant, (ne comportant pas de liaison -NH-CO- dans sa chaîne peptidique), est (sont) remplacée(s) par une (des) liaison(s) -NH-CO-, la chiralité de chaque résidu aminoacyle, qu'il soit impliqué ou non dans une ou plusieurs liaisons -NH-CO- susmentionnées, étant soit conservée (peptide rétro), soit inversée (peptide rétro-inverso) par rapport aux
résidus aminoacyles correspondants constituant ledit peptide parent.
Par peptides rétro-inverso, il faut entendre tout peptide et analogue peptidique répondant à la défminition donnée ci-dessus des immunorétroïdes, ledit peptide étant plus particulièrement constitué d'une chaîne peptidique dans laquelle l'un au moins des résidus d'une part est lié à au moins un résidu voisin par une liaison -NH-CO-, et d'autre part, est de chiralité opposée à celle de ce même
résidu aminoacyle dans la chaîne peptidique du peptide parent.
Par peptide rétro, il faut entendre tout peptide répondant à la définition donnée ci-dessus des immunorétroides, ledit peptide étant plus particulièrement constitué d'une chaîne peptidique dans laquelle l'un au moins des résidus, est lié à au moins un résidu voisin par une liaison -NH-CO-, la chiralité de la totalité des résidus aminoacyles impliqués dans au moins une liaison -NH-CO- étant conservée
par rapport au résidu correspondant de la chaîne peptidique du peptide parent.
Il va de soi que les liaisons -CO-NH- et -NH-CO- doivent être prises en compte dans ce qui précède et ce qui suit, dans le sens de la chaîne peptidique parente allant de l'extrémité aminoterminale (N-terminale) vers l'extrémité
carboxyterminale (C-terminale).
Compte tenu du contexte général d'incertitude sur l'efficacité des analogues peptidiques rappelé ci-dessus, les auteurs de cette demande internationale WO95/24916 avaient considéré que cette inversion du sens de la liaison amide entre les acides aminés protéinogéniques, et/ou la modification de la configuration des acides aminés protéinogéniques, représentaient les seules modifications possibles des peptides parents pour obtenir des analogues peptidiques présentant une demi-vie supérieure, et des propriétés biologiques, notamment immunologiques, comparables, voire supérieures, à celles des peptides parents susmentionnés. Or, la présente invention découle de la découverte faite par les auteurs de la présente demande que, contrairement à ce qu'ils avaient cru bon de déduire dans le cadre de leur invention précédente en raison du contexte général rappelé ci- dessus, ces modifications du type rétro ou rétro-inverso de la chaîne peptidique des peptides parents, ne représentent pas les seules modifications possibles permettant d'obtenir des analogues peptidiques d'intérêt, du moins dans le cadre du diagnostic et/ou du traitement de pathologies impliquant la réponse immunitaire à médiation
cellulaire.
En effet, les auteurs de la présente demande ont mis en évidence que la modification de peptides naturels impliqués dans des pathologies dans lesquelles intervient l'immunité à médiation cellulaire, par remplacement des liaisons peptidiques -CO-NH- de la chaîne peptidique desdits peptides naturels par d'autres liaisons encore que la liaison -NH-CO-, et/ou par remplacement des acides aminés protéinogéniques du peptide naturel par des acides aminés non protéinogéniques, permet d'obtenir des analogues peptidiques desdits peptides naturels pouvant être utilisés avec les avantages susmentionnés dans le cadre du traitement ou du
diagnostic desdites pathologies.
Par "acide aminé protéinogénique", on entend, dans ce qui précède et ce qui suit, tout acide aminé entrant dans la constitution d'une protéine ou d'un peptide naturel. Par "acide aminé non protéinogénique", on entend par opposition à la définition précédente, tout acide aminé n'entrant pas dans la constitution d'une protéine ou d'un peptide naturel. On entend plus particulièrement par "acide aminé non protéinogénique", tout acide aminé dont le carbone portant la chaîne latérale R, à savoir le groupe -CHR-, situé entre -CO- et -NH- dans la chaîne peptidique naturelle, est remplacé par un motif n'entrant pas dans la constitution d'une
protéine ou d'un peptide naturel.
La présente invention a pour but de fournir des compositions pharmaceutiques, et plus particulièrement des vaccins, comprenant des analogues peptidiques présentant une demi vie nettement supérieure à celle des peptides naturels ou des protéines naturelles, ou à celle des peptides de synthèse issus ou non de ces protéines naturelles (ces protéines naturelles, ou peptides issus ou non de ces dernières, étant encore désignés dans ce qui suit par l'expression "protéines ou peptides parents"), dont ils sont les analogues, tout en présentant une activité biologique, et plus particulièrement immunologique, comparable, voire même supérieure, à celle des protéines ou peptides parents susmentionnés, ou encore une
activité différente ou opposée à celle desdites protéines ou peptides parents.
Un autre but de la présente invention est de fournir des méthodes de diagnostic in vivo ou encore d'évaluation in vivo de la capacité de la réponse immunitaire d'un individu dans le cadre de pathologies dans lesquelles des peptides naturels ou protéines naturelles (exogènes ou endogènes) sont susceptibles d'intervenir en se liant aux molécules de CMH et, le cas échéant, aux récepteurs reconnaissant lesdits peptides naturels ou protéines naturelles et situés sur les cellules T. L'invention a également pour but de fournir des compositions et des trousses (ou kits) pour la mise en oeuvre des méthodes de diagnostic ou d'évaluation in
vivo de la réponse immunitaire susmentionnées.
La présente invention a également pour but de fournir des méthodes de diagnostic in vitro de pathologies associées à la présence dans l'organisme d'un individu de protéines endogènes ou exogènes, ces méthodes étant réalisées à l'aide des analogues peptidiques tels que définis ci-dessus, ou à l'aide d'anticorps dirigés contre les complexes entre ces anticorps et les molécules de CMH, et présentant l'avantage d'être plus performantes que les méthodes de diagnostic actuelles réalisées à l'aide des peptides ou protéines parents, ou à l'aide d'anticorps dirigés
contre ces derniers.
La présente invention a également pour but de fournir de nouveaux kits pour
la mise en oeuvre de telles méthodes de diagnostic in vitro.
La présente invention a pour objet l'utilisation d'analogues peptidiques de peptides parents, ces peptides parents étant le cas échéant issus de protéines s exogènes ou endogènes, lesdits peptides parents pouvant interagir avec des molécules du CMH dans le cadre de pathologies chez l'homme ou l'animal, lesdits analogues étant caractérisés en ce qu'ils correspondent auxdits peptides parents dans lesquels: - au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique, est modifiée, à l'exception des modifications du type rétro, ou rétro-inverso, ou - au moins un acide aminé de la chaîne peptidique, est substitué par un acide aminé non protéinogénique, ou - au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique, est modifiée, et au moins un acide aminé de ladite chaîne peptidique est substitué par un acide non protéinogénique, pour: la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies susmentionnées, ou - la préparation d'une composition destinée au diagnostic in vivo des pathologies susmentionnées, ou à l'évaluation in vivo de la réponse immunitaire dans le cadre des pathologies susmentionnées, par mise en oeuvre d'une réaction cutanée d'hypersensibilité par injection intradermique de ladite composition, ou la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro desdites pathologies. Comme nous l'avons déjà vu précédemment, il faut entendre par l'expression "peptide parent" susmentionnée,
- soit un peptide existant tel quel à l'état naturel, notamment dans un micro-
organisme ou dans un organisme supérieur (notamment dans l'organisme humain), - soit tout peptide d'intérêt immunologique obtenu par synthèse peptidique, à partir d'acides aminés protéinogéniques, - soit un peptide issu d'une protéine telle qu'elle existe à l'état naturel dans les organismes susmentionnés, notamment par fragmentation de ladite protéine (notamment à l'aide de protéases appropriées, puis purification du peptide en question), ou par synthèse peptidique (selon les méthodes classiquement utilisées dans ce domaine) - soit un peptide issu d'une protéine telle qu'elle existe à l'état naturel mais dont l'activité immunologique a été modifiée, conservée ou optimisée par remplacement de certains amino acides de la séquence naturelle par des acides aminés protéinogéniques, par exemple à la suite d'un criblage d'une librairie de
peptides analogues obtenue par synthèse peptidique.
L'invention a également pour objet les analogues peptidiques de peptides parents, ces peptides parents étant le cas échéant issus de protéines exogènes ou endogènes, lesdits peptides parents pouvant interagir avec des molécules du CMH dans le cadre de pathologies chez l'homme ou l'animal, lesdits analogues étant caractérisés en ce qu'ils correspondent auxdits peptides parents dans lesquels: - au moins une liaison peptidique -CO-NHde la chaîne peptidique est modifiée, à l'exception des modifications du type rétro, ou rétro-inverso, ou - au moins un acide aminé de la chaîne peptidique, est substitué par un acide aminé non protéinogénique, ou - au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique, est modifiée, et au moins un acide aminé de la chaîne peptidique, est substitué par un
acide non protéinogénique.
Avantageusement, les analogues peptidiques susmentionnés de l'invention sont caractérisés en ce que le nombre de résidus aminoacyles protéinogéniques ou non, et reliés par une liaison modifiée ou non, est compris entre environ 5 et environ 20, de préférence entre 8 et 12 pour les analogues peptidiques se liant aux molécules du CMH de classe I, et de préférence entre 8 et 16 pour les analogues
peptidiques se liant aux molécules du CMH de classe II.
L'invention a plus particulièrement pour objet les analogues peptidiques tels que décrits ci-dessus, caractérisés en ce que l'une au moins des liaisons peptidiques -CO-NH- de la chaîne peptidique du peptide parent est remplacée par une liaison différente de la liaison -CO-NH-, ladite liaison différente étant notamment choisie parmi les suivantes: - CH2-NH(méthylène amino); -CH2-CH2- (carba); -CO-CH2- (cétométhylène); -CH2-O(méthylène-oxy); -CHOH-CH2- (hydroxyéthylène); -CHOH-CHOH(di-hydroxyéthylène); -CH=CH- (E ou Z oléfine); -CHCN-NH- (cyanométhylène amino); -S-CH2- (thiométhylène); -CH2-S- (méthylène thio); -CS-NH(thioamide); -PO2-NH- (phosphonamide); -CHOH- (hydroxyméthylène); -NH-CO-NH- (urée); -CHCH- (oxirane); / o -C N- (tétrazole) II'
N N
\. N //
-CH2-CO-NH- (3-homologation); -CHOH-CH2-NH- (hydroxyéthylène amino);
-CO-NH-NH- (hydrazino).
L'invention a également pour objet les analogues peptidiques tels que décrits ci-dessus, et caractérisés en ce que l'une au moins des liaisons peptidiques -CO-NH- de la chaîne peptidique du peptide parent est remplacée par une liaison du type rétro ou rétro-inverso telle que définie ci-dessus, dans le cas o l'un au moins des acides aminés dudit analogue peptidique est un acide aminé non
protéinogénique.
Des analogues peptidiques préférés dans le cadre de la présente invention sont caractérisés en ce que l'une au moins des liaisons peptidiques -CO-NH- de la chaîne peptidique ou peptide parent est remplacée par une liaison méthylène amino, ou du type 13-homologation, ou carba, ou cétométhylène, ou
cyanométhylène amino, ou hydroxyéthylène amino.
L'invention a plus particulièrement pour objet les analogues peptidiques du peptide parent Mart-1 27-35 du mélanome, comportant une liaison méthylène amino et répondant aux formules suivantes: Séquences
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
MART127-35 H-A -A- G- I- G - I- L- T - V -OH
P(1-2) H-Av(cH2NHA-G- I - G - I - L- T - V-OH
I(2-3) H-A- A(CH2NH)G- I - G - I - L- T - V-OH
%'(3-4) H-A - A-GC(cH2NH)I- G - I - L- T - V-OH
I(4-5) H- A -A - G- I'Y(CH2N,)G- I - L - TV -OH
%P(5-6) H-A -A - G- I - GC(CH2NH)I- L- T - V-OH
T(6-7) H-A -A - G- I - G -I'(Ca2N)L- T -V -OH %I(7-8) H-A -A - G- I - G I - Lv(CH2NH)T-V -OH
I(8-9) H-A -A - G- I - G - I - L- TY(CH2NH)V-OH
Ces analogues peptidiques y (1-2), y (2-3), y (3-4), y (4-5), y (5-6), y (6-
7), yl (7-8) et W (8-9), encore désignés peptides réduits analogues de Mart-1 27-
, correspondent à ce dernier peptide dans lequel la liaison -CO-NH- située entre les résidus P1 et P2, P2 et P3, P3 et P4, P4 et P5, P5 et P6, P6 et P7, P7 et P8, P8 et P9 est remplacée respectivement par une liaison -CH2-NH-. L'invention a également pour objet les analogues peptidiques du peptide parent Mart-1 27-35 du mélanome, comportant une liaison du type,3-homologation et répondant aux formules suivantes Séquences
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
MART127-35 H-A -A- G- I - G I- L- T V-OH
01 H-p-homnoA-A- G - I - G I- L- T -V-OH 2 H-A-0-homoA- G - I- G- I- L- T -V-OH 3 H-A - A -homoG-I- G- I- L- T -V-OH 54 H-A - A - G--h-I-G- I- L- T -V-OH H-A -A- G- I- -ho moG-I - L- T - V -OH 56 H- A - A - G - I - G -homoI-L - T - V -OH 137 H-A - A - G- I- G- I --homoL-T - V-OH 18 H-A- AG- I - G - I - L -homoT-V -OH 9 H-A - A - G- I- G - I- L - T -- homoV-OH Ces analogues peptidiques 31 à 139 de Mart-1 27-35 correspondent à ce dernier peptide dans lequel la liaison -CO-NH- située entre les résidus P1 et P2, P2 et P3, P3 et P4, P4 et P5, P5 et P6, P6 et P7, P7 et P8, P8 et P9, est
remplacée respectivement par une liaison -CH2-CO-NH-.
L'invention a également pour objet les analogues peptidiques du peptide parent muté Mart-1 27-35 Leu28, correspondant au peptide Mart-1 27-35 dans lequel l'alanine en position 28 est remplacée par la leucine, et comportant une
liaison du type 13-homologation entre les mêmes résidus que dans le cas décrit ci-
dessus des analogues peptidiques l31 à,39.
L'invention a plus particulièrement pour objet les analogues peptidiques du peptide parent M58-66 du virus de la grippe, comportant une liaison méthylène amino et répondant aux formules suivantes: Séquences
P1 P2 P3 P4 PS P6 P7 P8 P9
M58-66 H-G -L- L- G- F- V F- T L -OH
kI(1-2) H-GY*(CH2NH)L-L- G- F- V- F- T -L -OH
YI(2-3) H-G- L?(CH2NH>L- G - F - V - F- T - L -OH
'I(3-4) H-G - L-L4(CH2NH)G-F - V - F- T - L -OH
11(4-5) H-G -L - L-G'P(CH2NH)F-V - F- T - L -OH
1(5-6) H-G -L - L- G - F.(cH2NH)V- F- T - L-OH
ÀI(6-7) H-G -L - L- G- F - V(CH2NH)F- T - L-OH
F(7-8) H-G -L - L- G - F - V - F.(CH2NH)T - L -OH
%'(8-9) H-G -L - L- G - F - V - F-T?(CH2NH)L-OH
Ces analogues peptidiques y (1-2), t (2-3), v (3-4), y (4-5), y (5-6), y (6-
7), y (7-8) et y (8-9), encore désignés peptides réduits analogues de M58-66, correspondent à ce dernier peptide dans lequel la liaison -CO-NHsituée entre les résidus P1 et P2, P2 et P3, P3 et P4, P4 et P5, P5 et P6, P6 et P7, P7 et P8, P8 et
P9 est remplacée respectivement par une liaison -CH2-NH-.
Des analogues peptidiques préférés dans le cadre de la présente invention sont caractérisés en ce que l'un au moins des acides aminés de la chaîne peptidique du peptide parent, est substitué par un acide aminé non protéinogénique, tel que
défini ci-dessus.
Avantageusement, les acides aminés non protéinogéniques utilisés sont choisis parmi les acides aminés suivants: - les acides aminés de configuration D, - les acides cc-aminés de formule générale: g "Z\ xe c 4,tX/ 3 dans laquelle - R1, R2 et R3, représentent indépendamment les uns des autres: un atome d'hydrogène, un hydroxyle, un radical alkyle de 1 à 25 atomes de carbone, un radical contenant un groupe allyle et ayant de 3 à 25 atomes de carbone, un radical contenant un ou plusieurs cycles aromatiques ou non, notamment un groupe aryle, et ayant de 6 à 25 atomes de carbone, et notamment les groupes suivants: -CH3 (méthyl), -CH2CH3 (éthyl), -(CH2)4- CH3, -CH(CH3)2 (isopropyl), -C(CH3)3 (tertiobutyl), -0 (phényl), -CH2> (benzyl), -CH2:CI (para-chlorobenzyl), -CH2-CH2<F (2-phényl-éthyl), - CH2CHCH2 (alkyl), méthylfluorényl, -CH2CONH2 (glycolamide), - CH2CON(D2 (benzhydrylglycolamide), -CHOHD, -CH 2 e / jCH2- -CH2-()2 étant entendu que l'un des deux groupes R2 et R3 peuvent représenter une chaîne latérale d'acides aminés naturels lorsque soit R1, soit l'autre des deux groupes R2 et R3 ne représentent pas un atome d'hydrogène, - le cas échéant, R1, R2, Ca et N forment un hétérocycle de 4 à 8 atomes de carbone, aromatique ou non, le cas échéant substitué, notamment un hétérocycle de formule: ou t41 - les acides,-aminés de formule générale: dans laquelle R1, R2 et R3, indépendamment les uns des autres représentent une chaîne latérale d'un acide aminé naturel, ou sont tels que définis ci-dessus, notamment: les P-homo amino acides de formule: 1 iL V 4,, SuS l+ dans laquelle R1 et R2, sont tels que définis ci-dessus, ou les x-hydroxy p-homo amino acides de formule: o dans laquelle R1 et R2, sont tels que définis ci-dessus, - les acides y-aminés de formule générale:
Rt g 4t o1.
dans laquelle R1, R2, R3 et R4 représentent indépendamment les uns des autres une chaîne latérale d'un acide aminé naturel, ou R1, R2 et R3, sont tels que définis ci-dessus, et R4 a la même signification que celle donnée ci-dessus pour R1, R2 et R3, notamment les dérivés de statine de formule:
dans laquelle R1, et R2 sont tels que définis ci-dessus.
Avantageusement, les acides aminés non protéinogéniques utilisés dans le cadre de la présente invention sont choisis parmi 0H
OH H H
N NH 2 NH 2
O? O O
N HH OH N OH H
NH2 H N 0
o O O
12 -',
cH3 Hj J <-(e L'invention a plus particulièrement pour objet les analogues peptidiques du peptide parent M58-66 du virus de la grippe et comportant des acides aminés non protéinogéniques, répondant aux formule suivantes [Tic62)M58-66 N " H-Gly58- lie- Leu-Gly T/rLeu66OH
0 0
HGl-GIIe-Leeu-GIyu Hf N a X Thr Leu6-OH [D-Phe62]M58-66 e t ctam o H-Gly'-Ie-Leu-Gly.,. %Ik.JL..Th-r-Ieuoe-OH O [3-Pya62]M58-66 ( H H-GIy58-11e-Le u-G,'y.j. ?H Thr-Leum-OH n 1:
O O
Ho-see.i -esA'D- o 0 0 HO-C9nel-j4t V.rnilallH I C 99- 99VWI[9LtldOVW-N] C tV 99-8SV9W[ho] ó> 998SVW1t9O'd-O1 Ho. 99-aSlN[l9- jq IE9o ói 6 99-89SW7t9e'Ad-ú o. HO-,,neNl-.t- 'na9H "'f l HI DII9 o 4 C 99.9-8SAIrv9oi ú1
ILOE9LZ
o Or' on
HO- 99n31-J4199HJ 99-
ILOE9Zo ro H oV o HO-gfnal-J '11'""n
TLOE9LZ
Avantageusement, les analogues peptidiques susmentionnés de l'invention sont sélectionnés parmi ceux susceptibles: - d'une part d'être reconnus par les molécules du CMH et de s'associer avec ces dernières, notamment par mise en oeuvre de la méthode suivante: 5. incubation (notamment pendant environ 2 heures à 25 C, puis environ 12 heures à 4 C) de l'analogue peptidique en présence de molécules du CMH, provenant de la lyse de cellules humaines ou animales, ou purifiées notamment par chromatographie d'affinité à partir de lignées cellulaires humaines ou animales, sur un support solide recouvert d'un premier anticorps, notamment monoclonal, reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison audit analogue peptidique, addition sur le support solide précédent d'un deuxième anticorps marqué, notamment par couplage à un marqueur radioactif, enzymatique ou fluorescent, ledit anticorps marqué reconnaissant spécifiquement soit les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison à l'analogue peptidique, soit une molécule se liant elle-même spécifiquement aux molécules du CMH dans leur conformation susmentionnée, notamment la P32-microglobuline reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH de classe I, détection, après rinçage du support solide, de l'éventuelle présence du deuxième anticorps marqué resté fixé sur le support solide, témoignant d'un effet de reconnaissance et d'association entre les molécules du CMH et l'analogue peptidique étudié, - et, d'autre part, de former un complexe avec lesdites molécules du CMH, dont la stabilité peut être évaluée par mise en oeuvre d'une méthode de suivi dans le temps de la liaison établie entre l'analogue peptidique et les molécules du CMH, cette méthode étant avantageusement effectuée selon un protocole identique à la méthode précédente, mais dans laquelle l'étape d'incubation de l'analogue peptidique en présence des molécules du CMH sur le support solide recouvert dudit premier anticorps, se fait (avantageusement à une température de 37 C) pendant des temps variables de quelques minutes à plusieurs jours. Les analogues peptidiques de l'invention doivent être reconnus par les molécules de CMH et s'associer à ces dernières, notamment dans le cadre de la mise en oeuvre du test de reconnaissance décrit ci-dessus. Cette association peut être faible (détectable à des concentrations en analogues peptidiques de l'ordre de -4 à 10-5 M), intermédiaire (détectable à des concentrations en analogues peptidiques de l'ordre de 10-5 à 10-7 M), ou forte (détectable à des concentrations
en analogues peptidiques de l'ordre de 10-8 à 10-9 M).
Les analogues peptidiques reconnus par les molécules du CMH dans le cadre de la présente invention sont de préférence susceptibles de se lier pendant au
moins environ 30 minutes auxdites molécules du CMH.
L'invention a plus particulièrement pour objet les analogues peptidiques tels que décrits ci-dessus et caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés parmi ceux susceptibles: - d'induire in vitro l'apparition et la croissance de lymphocytes T cytotoxiques à partir de cellules humaines ou animales, notamment à partir de cellules mononucléées issues du sang périphérique (PBMC), en présence de facteurs nécessaires à la croissance et la différenciation des cellules T cytotoxiques, - d'induire in vitro la cytolyse par des lymphocytes T cytotoxiques, de cellules cibles présentant à leur surface l'analogue peptidique associé aux molécules du CMH, lesdits lymphocytes T cytotoxiques étant avantageusement prélevés sur un patientatteint d'une pathologie dans laquelle est impliqué le peptide parent de l'analogue peptidique étudié, - et d'induire in vitro la sécrétion de cytokines (ou interleukines) par les lymphocytes T cytotoxiques susmentionnés, notamment IL-2, IL-4 ou l'interféron Y, lesdits analogues peptidiques ainsi sélectionnés étant: soit des agonistes des récepteurs (TCR) reconnaissant l'antigène (à savoir le peptide parent) des cellules T cytotoxiques, et dérivent de peptides parents se comportant eux-mêmes comme des agonistes ou des antagonistes desdits récepteurs, 25. soit des agonistes partiels desdits récepteurs, et dérivent de peptides parents se comportant eux-mêmes comme des agonistes desdits récepteurs, ces agonistes partiels induisant notamment la sécrétion d'une ou plusieurs cytokines différentes de celles dont la sécrétion est induite par les
peptides parents.
L'invention a plus particulièrement pour objet les analogues peptidiques tels que décrits ci-dessus et caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés parmi ceux: - susceptibles d'induire in vitro l'apparition et la croissance de lymphocytes T cytotoxiques à partir de cellules humaines ou animales, notamment à partir de cellules mononucléées issues du sang périphérique (PBMC), en présence de facteurs nécessaires à la croissance et la différenciation des cellules T cytotoxiques, - n'induisant pas in vitro la cytolyse par des lymphocytes T cytotoxiques, de cellules cibles présentant à leur surface l'analogue peptidique associé aux molécules du CMH, lesdits lymphocytes T cytotoxiques étant avantageusement prélevés sur un patient atteint d'une pathologie dans laquelle est impliqué le peptide parent de l'analogue peptidique étudié, - n'induisant pas in vitro la sécrétion de cytokines (ou interleukines) par les lymphocytes T cytotoxiques susmentionnés, notamment IL-2, IL-4 ou l'interféron y, lesdits analogues peptidiques ainsi sélectionnés étant des antagonistes des
récepteurs des cellules T cytotoxiques.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'analogues peptidiques tels que définis ci-dessus pour la préparation de médicaments, notamment de vaccins, destinés à la prévention ou au traitement des pathologies dans lesquelles les peptides parents sont des agonistes ou antagonistes des récepteurs reconnaissant l'antigène des cellules T cytotoxiques, et plus particulièrement des pathologies neurodégénératives infectieuses (d'origine virale ou bactérienne), tumorales
(notamment le mélanome), auto-immunes et allergiques.
Parmi les maladies d'origine virale susceptibles d'être traitées dans le cadre de la présente invention, on peut citer: - le SIDA provoqué par le virus de l'immuno-déficience humaine HIV1 et HIV2, - la paraplégie associée à HTVL-1, ou la leucémie à cellules T de l'adulte, provoquée par le virus de la leucémie humaine à cellules T (virus HTLV), - infections provoquées par le virus respiratoire syncitial, - infections provoquées par le virus coxsakie, par exemple méningites aiguës lymphocytaires, infections provoquées par le virus d'Epstein- Barr, par exemple la mononucléose infectieuse, - infections provoquées par le cytomégalovirus, par exemple maladie des inclusions cytomégaliques, - herpès provoqué par le virus de l'herpès humain, - herpès provoqué par le virus 6 de l'herpès simplex,
- infections provoquées par le parvovirus B19 humain, par exemple gastro-
entérites infectieuses, - l'hépatite B provoquée par le virus de l'hépatite B, - l'hépatite C provoquée par le virus de l'hépatite C, - la grippe provoquée par le virus influenza, - la rubéole provoquée par le virus de la rubéole, - infections provoquées par le virus de la Dengue, par exemple arboviroses, - rhumes, rhinites, coryza provoqués par les rhinovirus - la fièvre aphteuse provoquée par le virus de la fièvre aphteuse,
- le cancer du col de l'utérus provoqué par le papillomavirus (HPV).
Parmi les principales maladies auto-immunes susceptibles d'être traitées dans le cadre de la présente invention, on peut citer celles rassemblées dans le Tableau
A qui suit.
Tableau A
Principales maladies auto-immunes (en allant de haut en bas, des maladies auto-immunes spécifiques d'organes aux maladies auto-immunes non spécifiques d'organes). Maladies Autoantigènes impliqués Thyroidite de Hashimoto Thyroglobuline, microsomes Maladie de Basedow Récepteur TSH Maladie d'Addison Corticosurrénale Insuffisance hypophysaire Hypophyse Gastrite de Biermer Cellule pariétale de l'estomac Facteur intrinsèque Certaines stérilités Spermatozoides, ovaires Diabète juvénile de type 1 Ilots Langerhans, insuline Syndrome de Goodpasture Membrane basale glomérulaire Myasthénie Muscle strié, récepteur acétyl-choline Rhumatisme articulaire aigu Myocarde (streptocoques) Pemphigus Ponts intercellaires épiderme Pemphigoide bulleuse Membrane basale cutanée Dermatite herpétiforme Gliadine, réticuline Vitiligo Mélanocytes Pelade Follicule pileux Psoriasis Ophtalmie sympathique Uvée Uvéite Chambre antérieure de l'oeil Syndrome de Guillain-Baré Sclérose en plaques Myéline Anémie hémolytique Hématies Purpura thrombopénique idiopathique Plaquettes Leucopénie idiopathique Granulocytes Cirrhose biliaire primitive Mitochondries Hépatite chronique active Muscle lisse, noyaux Rectocolite hémorragique Iléite de Crohn Côlon (E. colt) Syndrome de Gougerot-Sjogren Noyaux: SS-A, SS-B Polyarthrite rhumatoïde IgG, noyaux Dermatopolymyosite Noyaux: Jol, muscles Sclérodermie Noyaux: Scl-70 Connectivite mixte Noyaux: RNP Lupus érythémateux discoide Noyaux: Lupus érythémateux disséminé Noyaux: ADN, antigène Sm Facteurs de coagulation
Cardiolipine, etc...
L'invention a également pour objet toute composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, au moins un analogue
peptidique (agoniste, le cas échéant partiel, ou antagoniste) tel que défini ci-
dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Avantageusement, les compositions pharmaceutiques selon l'invention se présentent sous une forme administrable par voie orale, ou parentérale, notamment à raison d'environ 500 /g à 5 mg par prise, notamment à raison de 3 prises par jour. L'invention a plus particulièrement pour objet les compositions pharmaceutiques telles que décrites ci-dessus, contenant à titre de principe actif au moins un antagoniste selon l'invention, et leur utilisation dans le cadre du
traitement des maladies auto-immunes.
L'invention a plus particulièrement pour objet encore, les compositions pharmaceutiques telles que décrites ci-dessus, contenant à titre de principe actif au moins un agoniste partiel selon l'invention, et leur utilisation dans le cadre du
traitement des maladies allergiques.
L'invention a également pour objet tout vaccin, caractérisé en ce qu'il comprend à titre de principe actif, au moins un analogue peptidique, de préférence agoniste, le cas échéant partiel, tel que défmini ci-dessus, en association avec un
véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Avantageusement, les vaccins selon l'invention se présentent sous une forme administrable par voie orale, ou parentérale, notamment à raison d'environ 500 lig
à 5 mg par prise, notamment à raison de 3 prises par jour.
L'invention a également pour objet toute composition destinée au diagnostic in vivo des pathologies susmentionnées, ou à l'évaluation in vivo de la réponse immunitaire dans le cadre des pathologies susmentionnées, par mise en oeuvre d'une réaction cutanée d'hypersensibilité par injection intradermique de ladite composition de diagnostic, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un analogue peptidique, de préférence agoniste, le cas échéant partiel, tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule biologiquement acceptable. L'invention concerne également les complexes entre un analogue peptidique tel que défini ci-dessus, et une molécule du complexe majeur d'histocompatibilité
(encore désigné complexes binaires CMH-analogue peptidique).
En effet, la réponse immunitaire met en jeu la reconnaissance d'un antigène endogène ou exogène par des cellules spécialisées. Pour être reconnu, l'antigène doit être initialement présenté de façon adéquate par des cellules présentatrices d'antigène (CPA). Alors que les lymphocytes B reconnaissent des épitopes portés par les antigènes intacts non modifiés, la présentation de l'antigène aux lymphocytes T est plus complexe dans la mesure o l'antigène est d'abord internalisé par la cellule présentatrice, protéolysé, puis éventuellement réexprimé à sa surface sous forme de fragments peptidiques en association avec les protéines du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH). Le lymphocyte T qui ne reconnaît pas l'antigène natif, reconnaît un fragment peptidique associé à une
molécule CMH.
Ces molécules CMH appartiennent essentiellement à deux classes: I et II.
Les molécules de classe I sont des glycoprotéines transmembranaires constituées d'une chaîne lourde ao polymorphe associée de façon non covalente à une chaîne légère non glycosylée [32m. Leur structure cristallographique a été résolue (Bjorkman et al. (1987), Nature, 329: 506-512), et montre la présence d'un sillon formant le site de présentation du peptide dont le fond est composé de huit feuillets 13 et les bords de deux hélices a. Ces molécules sont présentées à la
surface de la quasi totalité des cellules.
Les molécules de classe II sont également des glycoprotéines membranaires constituées de deux chaînes polymorphes a et 13 liées de façon non covalentes pour former, comme le montre la structure cristallographique récemment élucidée (Brown et al. (1993), Nature, 364: 33-39), une plateforme P3 plissée supportant deux hélices a. Le sillon formé est le site de présentation du peptide. Ces molécules ne sont exprimées qu'à la surface de certaines cellules parmi lesquelles les macrophages et les cellules B. Les lymphocytes T cytotoxiques (cellules possédant des marqueurs CD8) reconnaissent des fragments protéolytiques de protéines virales associées aux molécules CMH de classe I et provoquent la lyse des cellules présentant l'antigène. Les lymphocytes T auxiliaires (cellules portant des marqueurs CD4) reconnaissent des fragments de protéines exogènes capturées par endocytose présentés en association avec les molécules CMH de classe II et induisent la
stimulation cellulaire de la réponse immunitaire.
L'invention a également pour objet les complexes entre un analogue peptidique selon l'invention, et un récepteur de cellules T (encore désignés
complexes récepteur T-analogue peptidique).
L'invention vise également les complexes entre une molécule du complexe majeur d'histocompatibilité, un analogue peptidique tel que défini cidessus, et un récepteur de cellules T (encore désigné complexe ternaire CMH-analogue
peptidique-récepteur T).
L'invention a également pour objet l'utilisation d'analogues peptidiques tels que définis ci-dessus, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro
des pathologies mentionnées ci-dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet, toute méthode de diagnostic in vitro de pathologies associées à la présence dans l'organisme d'un patient, de peptides exogènes ou endogènes pouvant interagir avec des molécules du CMH, et susceptibles d'être directement ou indirectement impliqués dans le processus de développement de ces pathologies chez l'homme ou l'animal, caractérisée en ce qu'elle comprend: - la mise en contact d'un échantillon biologique provenant d'un patient, notamment du sang ou tout échantillon biologique susceptible de contenir des lymphocytes, avec un analogue peptidique tel que défmini ci-dessus, dans des conditions permettant la réaction entre les récepteurs des cellules T susceptibles d'être présentes dans l'échantillon biologique, et le susdit complexe binaire formé entre ledit analogue peptidique et les molécules de CMH présentes dans ledit échantillon;
- la détection in vitro du complexe ternaire CMH-analogue peptidique-
récepteur T, susceptible d'être formé à l'étape précédente.
Les méthodes de diagnostic susmentionnées de l'invention sont avantageusement réalisées de la façon suivante: - incubation dudit échantillon biologique avec des analogues peptidiques selon l'invention, lesdits analogues peptidiques étant fixés sur un support solide, notamment à l'intérieur de puits de plaques de microtitration de type de celles habituellement utilisées pour la mise en oeuvre de techniques de détection ou dosage bien connues sous le nom d'ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), - rinçage du support solide, - incubation des éléments restés fixés sur le support solide après l'étape de rinçage précédente avec un milieu contenant des anticorps, notamment des anticorps anti-complexe ternaire selon l'invention, marqués (notamment de manière radioactive, enzymatique ou fluorescente), ou susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué, - rinçage du support solide, - détection des anticorps marqués restés respectivement liés aux complexes
ternaires lors de l'étape d'incubation précédente.
L'invention a également pour objet les nécessaires ou kits pour la mise en oeuvre de méthodes de diagnostic in vitro telles que décrites ci- dessus, comprenant: - un analogue peptidique tel défini ci-dessus; - des réactifs pour rendre un milieu apte à la formation d'une réaction immunologique; des réactifs permettant de détecter le complexe ternaire selon l'invention, qui a été produit à l'issue de la réaction immunologique, lesdits réactifs contenant éventuellement un marqueur ou étant susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas o l'analogue peptidique n'est
pas marqué.
L'invention a également pour objet les anticorps dirigés contre les complexes binaires CMH-analogue peptidique tels que définis ci-dessus, lesdits anticorps étant tels qu'obtenus par immunisation d'un animal avec au moins un des complexes susmentionnés, lesdits anticorps étant susceptibles de former un
complexe avec ces complexes binaires.
Les anticorps selon l'invention sont des anticorps polyclonaux ou monoclonaux. Les anticorps polyclonaux susmentionnés sont obtenus par immunisation d'un animal avec au moins un complexe CMH-analogue peptidique selon l'invention, suivie de la récupération des anticorps recherchés sous forme purifiée, par prélèvement du sérum dudit animal, et séparation desdits anticorps des autres constituants du sérum, notamment par chromatographie d'affinité sur une colonne sur laquelle est fixée un antigène spécifiquement reconnu par les anticorps,
notamment un complexe CMH-analogue peptidique selon l'invention.
Les anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent être obtenus par la
technique des hybridomes dont le principe général est rappelé ci-après.
Dans un premier temps, on immunise un animal, généralement une souris, (ou des cellules en culture dans le cadre d'immunisations in vitro) avec un complexe CMH-analogue peptidique selon l'invention, dont les lymphocytes B sont alors capables de produire des anticorps contre ledit complexe. Ces lymphocytes producteurs d'anticorps sont ensuite fusionnés avec des cellules myélomateuses "immortelles" (notamment murines) pour donner lieu à des hybridomes. A partir du mélange hétérogène des cellules ainsi obtenu, on effectue alors une sélection des cellules capables de produire un anticorps particulier et de se multiplier indéfiniment. Chaque hybridome est multiplié sous la forme de clone, chacun conduisant à la production d'un anticorps monoclonal dont les propriétés de reconnaissance vis-à-vis du complexe CMH-analogue peptidique de l'invention pourront être testées par exemple en ELISA, par immunotransfert en une ou deux dimensions, en immunofluorescence, ou à l'aide d'un biocapteur. Les anticorps monoclonaux ainsi sélectionnés, sont par la suite purifiés notamment selon la
technique de chromatographie d'affinité décrite ci-dessus.
Les anticorps selon l'invention, sont plus particulièrement caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles de former un complexe avec des complexes CMH-analogues peptidiques, et/ou avec les complexes CMH-peptides ou protéines
parents correspondant auxdits analogues peptidiques.
Avantageusement, les anticorps anti-complexes CMH-analogues peptidiques de l'invention reconnaissent les complexes CMH-peptides ou protéines parents susmentionnés avec une affinité au moins égale à celle présentée par les anticorps anti-complexes CMH-peptides ou protéines parents vis à vis des complexes
CMH-peptides ou protéines parents.
L'affinité dont il est question ci-dessus peut se mesurer par la constante d'affinité à l'équilibre Ka des complexes impliquant l'un des susdits anticorps avec
l'un des susdits complexes.
L'invention a également pour objet toute composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend des anticorps tels que définis cidessus, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable, ainsi que leur
utilisation dans le cadre du traitement des pathologies susmentionnées.
L'invention concerne également le procédé de criblage d'analogues peptidiques tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: incubation (notamment à une température de 37 C) pendant des temps variables de quelques minutes à plusieurs jours, de l'analogue peptidique en présence de molécules du CMH, provenant de la lyse de cellules humaines ou animales, ou purifiées notamment par chromatographie d'affinité à partir de lignées cellulaires humaines ou animales, sur un support solide recouvert d'un premier anticorps, notamment monoclonal, reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison audit analogue peptidique, addition sur le support solide précédent d'un deuxième anticorps marqué, notamment par couplage à un marqueur radioactif, enzymatique ou fluorescent, ledit anticorps marqué reconnaissant spécifiquement soit les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison à l'analogue peptidique, soit une molécule se liant elle-même spécifiquement aux molécules du CMH dans leur conformation susmentionnée, notamment la [P2-microglobuline reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH de classe I, À détection, après rinçage du support solide, de l'éventuelle présence du deuxième anticorps marqué resté fixé sur le support solide, À évaluation de la durée de l'association entre ledit analogue peptidique
et les molécules du CMH.
L'invention a également pour objet toute trousse ou kit pour la mise en oeuvre d'un procédé de criblage d'analogues peptidiques tel que défini ci-dessus, comprenant: - des molécules du CMH, et/ou - des anticorps, reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison audit analogue peptidique, avantageusement fixés sur un support solide, ou fournis avec les réactifs nécessaires à leur fixation sur le support solide, et/ou - des anticorps marqués, notamment par couplage à un marqueur radioactif, enzymatique ou fluorescent, reconnaissant spécifiquement soit les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison à l'analogue peptidique, soit une molécule se liant elle-même spécifiquement aux molécules du CMH dans leur conformation susmentionnée, notamment la [2-microglobuline reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH de classe I, et/ou - un protocole pour la mise en oeuvre dudit procédé, et/ou
- un peptide de contrôle.
L'invention sera davantage illustrée à l'aide des exemples qui suivent
d'obtention et d'étude des propriétés d'analogues peptidiques tels que décrits ci-
dessus.
I- Synthèse des analogues peptidiques de l'invention: A) Généralités: A titre d'illustration, la méthode de synthèse en phase liquide consiste à condenser successivement deux à deux les aminoacyles dans l'ordre requis ou à condenser des aminoacyles et des fragments préalablement formés et contenant déjà plusieurs aminoacyles dans l'ordre approprié, ou encore plusieurs fragments préalablement ainsi préparés, étant entendu que l'on aura eu soin de protéger au préalable toutes les fonctions réactives portées par ces aminoacyles ou fragments, à l'exception des fonctions amines de l'un et carboxyles de l'autre ou vice-versa, qui doivent normalement intervenir dans la formation des liaisons peptidiques, notamment après activation de la fonction carboxyle, selon les méthodes bien
connues dans la synthèse des peptides.
On pourra par exemple utiliser des groupements protecteurs de type uréthane (Boc, Fmoc benzyloxycarbonyl ou allyloxycarbonyl) pour protéger les extrémités N-terminales des acides aminés et des groupements de type ester (méthylique, éthylique, benzylique, tertio-butylique, allylique ou encore benzhydrilglycolamidique) pour protéger les extrémités C-terminales des acides
aminés.
Une telle synthèse peut être effectuée en condensant tout d'abord le résidu aminoacyle AA1 dont la fonction COOH est protégée avec le résidu aminoacyle AA2 dont la fonction NH2 est protégée. La fonction amine du résidu AA2 dans le fragment AA2-AA1 ainsi obtenu, est alors déprotégée, pour condenser par la suite
ledit fragment avec le résidu aminoacyle AA3 dont la fonction amine est protégée.
Les étapes précédentes sont répétées autant de fois qu'il y a de résidus
aminoacyles à introduire dans la chaîne des rétro analogues à synthétiser.
Selon une autre technique préférée de l'invention, on a recours à celle décrite par R.D. Merrifield dans l'article intitulé "Solid phase peptide synthesis"
(J. Am. Chem. Soc. (1963), 85, 2149-2154).
Pour fabriquer une chaîne peptidique selon le procédé de Merrifield, on a recours à une résine polymère très poreuse, sur laquelle on fixe le premier acide aminé C-terminal (en l'occurrence AA1-OH) de la chaîne. Cet acide aminé est fixé sur la résine par l'intermédiaire de son groupe carboxylique et sa fonction amine
est protégée, par exemple par le groupe t-butyloxycarbonyle.
Lorsque le premier acide aminé C-terminal est ainsi fixé sur la résine, on
enlève le groupe protecteur de la fonction amine en lavant la résine avec un acide.
On fixe ainsi, les uns après les autres, les acides aminés qui vont constituer la chaîne peptidique sur le groupe amine chaque fois déprotégé au préalable de la
portion de la chaîne peptidique déjà formée, et qui est rattachée à la résine.
Lorsque la totalité de la chaîne peptidique désirée est formée, on élimine les groupes protecteurs des différents acides aminés constituant la chaîne peptidique et
on détache le peptide de la résine par exemple à l'aide d'acide fluorhydrique.
B) Cas particulier des analogues peptidiques de l'invention: Une ou plusieurs des étapes de synthèse décrites ci-dessus peuvent être interrompues afin d'insérer une liaison différente de la liaison -CO-NHentre certains résidus aminoacyles, et/ou un ou plusieurs acides aminés non protéinogéniques. B.1.) Synthèse d'analogues peptidiques comportant des liaisons peptidiques modifiées: La notation Y (Spatola & Darlak, 1988) est généralement d'usage pour désigner le lien pseudopeptidique remplaçant la liaison amide (CONH). Parmi les modifications les plus fréquemment rencontrées, on peut citer par exemple les suivantes dont les synthèses sont détaillées dans les références bibliographiques indiquées: la liaison méthylèneamino (réduite) I[CH2NH] (Szelke et al., 1982; Martinez et al., 1985; Sasaki & Coy, 1987); rétro-inverso I[NHCO] (Shemyakin et al., 1969; Goodman & Chorev, 1979; Chorev & Goodman, 1993); oléfme F[CH=CH] (Hann et al., 1982; Kempf et al., 1991; Bohnstedt et al., 1993); carba 'F[CH2CH2] (Rodriguez et al., 1990a, 1990b); méthylèneoxy (éther) Y[CH2O] (TenBrink, 1986; Breton et al., 1990); cétométhylène F[COCH2] (Harbeson & Rich, 1989; Gonzalez-Muniz et al., 1995), hydroxy
éthylène 'P[CH(OH)CH2] (Evans et al., 1985; Wuts et al., 1992).
1) Synthèse des pseudopeptides réduits correspondant aux séquences de MART et du peptide matrice M58-66: La contribution de la fonction amine de chaque liaison peptidique de l'antigène Mart-1 27-35 (AAGIGILTV) de la protéine Martl-1 du mélanome et de l'antigène M58-66 (GLLGFVFTL) de la protéine matrice du virus de la grippe a été évaluée au niveau des interactions de ces antigènes avec leurs récepteurs: la
molécule de classe I du MHC HLA-A2 et le TCR.
O libre rotation Structure./ Structure / rigide N flexible N plane 120
H H
Liaison peptidique Liaison réduite
Schéma 1: Représentation schématique des liaisons peptidique et réduite.
La liaison réduite ou méthylène amino a la particularité d'être plus flexible
que la liaison peptidique en raison d'une libre rotation de la liaison carbone-
carbone (schéma 1). L'introduction d'une liaison réduite peut modifier localement l'orientation des chaînes latérales des acides aminés. La liaison réduite peut exister sous sa forme protonée à pH physiologique. Les modifications entraînées par la présence d'une liaison réduite, à savoir la modification de la structure et la modification du caractère hydrophile du peptide parent, peuvent avoir des
implications dans les phénomènes de fixation et de reconnaissance de l'antigène.
* La synthèse de chaque peptide réduit a été réalisée en phase solide et en chimie Fmoc classique. La liaison réduite est obtenue par condensation d'un
a-amino aldéhyde N-protégé avec l'acide ca-aminé immobilisé sur la résine.
L'imine formée est réduite in situ par le cyanoborohydrure de sodium pour conduire à la liaison réduite selon la méthode décrite par Sasaki et Coy en 1987
(schéma 2).
o pGa H R R1 H2Nr Peptide résine R PG N uu Peptide résine N NaBH3CN H DMF, 1% AcOH Schéma 2: Incorporation en phase solide de la liaison réduite. PG:
groupement protecteur Fmoc.
L'ac-amino aldéhyde est synthétisé par la méthode de Fehrentz et Castro, 1983. Cette méthode permet l'obtention rapide, sans racémisation, de l'a-amino
aldéhyde N-protégé à partir du N,O-diméthylhydroxamate de l'acide aminé N-
protégé correspondant (schéma 3).
HC1,NH(CH3)OCH3 O O
PGN J BOP, DIEA, DMF H H
pGN/- H "I LiAIH4 N PGOHPG N LiA1H4H PG N(CH3)CH3
R1 R1 THF R
Schéma 3: Synthèse des "-amino aldéhydes N-protégés par la méthode de
Fehrentz et Castro. PG: groupement protecteur Fmoc.
Les acides aminés suivants de la séquence du peptide réduit sont couplés d'une manière classique. Après synthèse, le peptide réduit est déprotégé et décroché de la résine par l'acide trifluoroacétique (TFA). Chaque peptide réduit est purifié par chromatographie liquide haute pression à polarité de phases inversée (RP-HPLC). La masse de chaque peptide est contrôlée par désorption laser
assistée d'une matrice (MALDI) à l'aide du spectromètre Bruker Protein TOF.
Les temps de rétention (Tr) sur colonne RP-HPLC C18 dans un gradient de à 65 % de B en 30 mn (avec A= eau à 0,1% de TFA et B= acétonitrile (ACN) à 0,08% de TFA) ainsi que les masses des différents peptides sont reportés dans
les tables 1 et 2.
Table 1: Séquences et caractéristiques des peptides réduits analogues deMart-1 27-35 Séquences P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 Tr masse
MART1 27-35 H-A -A - G- - G- I- L- T - V -OH 12.74 814.4
Y'(1-2) H-AtP(CH2NH)A-G - I- G I - L- T - V -OH 12.53 802.7 'F(2-3) H-AAtP(CH2NH)G- I- G- I - L- T - V -OH 12.58 802.9
[(3-4) H-A - A-GWI(CH2NH)I- G I- L- T - V -OH 11.85 801.6
[(4-5) H-A -A - G - It(CH2NH)G- I - L- T - V -OH 12.03 801.5 ti(5-6) H-A -A - G- I -GI(CH2NH)I- L- T - V -OH 11.29 801.4 W(6-7) H-A -A - G- I - G -Il(CH2NH)L- T - V -OH 12.00 800.4
'(7-8) H-A -A - G- I - G - I - L'(CH2NH)T-V -OH 12.77 801.5
Y'(8-9) H-A -A - G- I - G - I - L- TF(CH2NH)V-OH 12.46 801.3
Table 2: Séquences et caractéristiques des peptides réduits analogues de
M58-66
Séquences P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 Tr masse
M58-66 H-G -L- L- G-F- V F- - T -L-OH 12. 35*968.0
lo'(1-2) H-GII(CH2NH)L-L- G- F- V- F- T - L -OH 10. 67*956.2 t(2-3) H-G-LIl(CH2NH)L- G- F V- F- T - L -OH 11.18*957.1
W(3-4) H-G - L -LI(CH2NH)G-F - V F- T - L -OH 16.01 957.3
ÀY(4-5) H-G -L - L-GW(CH2NH)F-V - F- T - L -OH 15.61 954.3
F(5-6) H-G -L - L- G - FP(CH2NH)V- F- T - L-OH 10. 80*955.8
I(6-7) H-G -L - L- G- F - V-(CH2NH)F- T - L-OH 11. 85*953.2
Y'(7-8) H-G -L - L- G - F - V- FW(CH2NH)T-L -OH 13. 05*954.7
T(8-9) H-G -L - L- G - F - V - F-T T(CH2NH)L-OH 11. 21*957.3
Temps de rétention dans le gradient 20 à 80% de B en 30 mn (avec A= eau
à 0,1% de TFA et B= ACN à 0,08% de TFA).
2) Synthèse des analogues P3 du peptide MART parent et du peptide MART muté (Leu28): Les analogues [, sont obtenus par couplage de [-homo acides aminés à la
place des acides aminés naturels.
O
H2N H2N OH
H. H
OH
R RO0
Acide aminé [3-homo acide aminé Schéma 4: Représentation schématique d'un acide aminé et d'un [3-homo acide aminé Le P-homo acide aminé est un acide aminé dans lequel un groupe méthylène a été inséré entre le carbone a et le carboxyle. La configuration du Ca est inchangée (schéma 4). L'incorporation d'un [3-homo acide aminé à la place d'un acide aminé dans une séquence peptidique a pour conséquence d'allonger la chaîne peptidique des analogues peptidiques résultants. Ces analogues peptidiques plus longs peuvent être amenés à se tordre, à s'arc-bouter pour pénétrer dans la poche de liaison de la molécule de classe I du CMH. Dans ce cas, certaines chaînes latérales peuvent être déplacées latéralement ou leur orientation modifiée, ce qui peut entraîner des interactions préférentielles avec la molécule de classe I du CMH
et/ou le TCR.
Les O-homo acides aminés sont obtenus par synthèse chimique en plusieurs étapes à parfir des acides aminés N-protégés correspondants d'après le schéma
suivant (Schéma 5).
L'acide aminé protégé sur sa fonction amine par le groupement Boc est dans un premier temps activé par la méthode aux anhydrides mixtes. L'acide aminé activé réagit avec le diazométhane pour conduire à la diazométhylcétone 2. Le réarrangement de Wolff de cette diazométhylcétone dans le méthanol, en présence du benzoate d'argent et de triéthylamine donne le P-homo méthylester de l'acide
aminé protégé par le groupement Boc. Une saponification conduit au composé 3.
La déprotection du Boc, suivie de la reprotection de la fonction amine par le groupement Fmoc sont les dernières étapes pour l'obtention du O- homo acide
aminé, protégé par le Fmoc.
Le composé 4 est introduit par les méthodes conventionnelles de couplage des acides aminés au cours de la synthèse en phase solide en stratégie Fmoc. En pratique, 5 équivalents du mélange (4/BOP/HOBt) sont couplés pendant 20 mn dans le DMF. Le groupement Fmoc est déprotégé par la pipéridine à 50% dans le DMF et la synthèse est poursuivie d'une manière classique. Pour le décrochage et la déprotection du peptide ainsi que la purification et la caractérisation des
peptides, voir paragraphe précédent.
O 1) N-méthylmorpholine BocHN ll chloroformiate OH disobutyle BocHN CHN2
= R2) CH2N2
R= 1) C6H5COOAg Et3N MeOH 2) NaOH 3 5 FmocHN OH I) ITFA 3 5 FmocHNOH 2) FmocOSu BocHN OH
4 R O
Schéma 5: Schéma de synthèse des Fmoc-p-homo acides aminés b'lL8 1'b1'l HO-Aowoq-q- 1 - I - I - D - - V-H 6q O S'ILS 9S'ú1 HO- A-OWOq-q-' I - D I -D - 1- V-H gq úILS SLL'úI1 HO- A - ú-1OWOI-q- I - D I -D - 1- V-H Lq L'IL8 SO'PI HO- A - J -q-lowoq-q- - I - - - V-H 9q ú'ILS 1'1'1 HO- A - -1 I-DoWoq-q- I - - - V-H sq b'lL8 OZ'1 HO- A - - -1-I - 1-Iowoq-q- - 1- V-H q q O'IL8 0L'1l HO- A - -1 - I - 9 I- DOWOq-q-1 - V -H 6'0L8 91'bl1 HO- A - 1 - I - 9 - I - i--OOq- q-V-H zq Z'IL8 L'171 HO- A - ú1 - - I - 9 -I-OUImoq-q-H Eq O'LS8 0'1'1 HO- A - 1 - - I - 9 - I -- Y- V-Hginal SEg-LZ -IAN asseW lu 6d 8d Ld 9d Sd bd úd Zd Id soouQnbos gzno'I 9ilnu úE-LZ i-ljleA op songolue '0 sop!ldod sop sQnbilsuJ9pno lo soouonbgS:b olqL sz +M+N, puodso- oo* Z'6ZS 89'ZI HO-Aomoq-- J. -1 - I - D - I -D - - V -H 60 1'6Z8 Z6'11 HO- A-lWOoq"--1 - I - D - I -D - V- V-H 80 oZ 6'8Z8 0I'ZI HOA - -IOWoq4-d I - D I -D - V -H Li 0'6Z8 t9 ZI HO- A - L -1-IoWoq4-- D I -D - V-H 90 6'8Z8 0S'ZI HO- A - -1 - I- Dowoq'j- I -D - V V-H S'6Z8 OS'ZI HO- A - i -1 - I - D-IOwOq-O j - V V-H 6'8Z8 8SIZI HO- A - J. - 1 - I- D -I-DoWoq0-V - V-H ú0 l 6'6Z8 OS'ZI HO- A - 1 -1 - I - 9- I -9VOwOq-'-V-H Z *6'898 Z9'ZI HO- A - ú -1 I - 9 - I - 9 -V-VOwOq--H I0 1'17181L'ZI HO- A- - 1I - D I - D - V- V-H SE-LZ Ilú1VN oSSLtW lu 6d gd Ld 9d Sd bd úd Zd Id 01 soouonbos Sú-LZ I-leyN op sonolrue '0 sop!ldod sop sonb!ls!iljaeleo li soouonbgs:g IlqreL
IU1j-VN i1?d osstu minj op osluue,l onb isum (vúL op %80'0. NDV =I lo VaJ op %1'0.
ea =V MAU uw 0t uoa ap %9 9. S Op luI!pel2) 81D OUUoloa aun ins 0 sop!ldod sop D-IdH-d" uo uo!luoloa op sdwol sol s91aoda. luos b lo ú sQlqei sol sue(I Iú gLOE9LZ 3) Synthèse du peptide LI!e30I- (CH2CH2)Gly31] Mart-1 27-35 Cet analogue correspond à l'introduction d'une liaison carba à la place de la
liaison peptidique entre les résidus Ile30 et Gly31 de l'antigène Mart-1 27-35.
Ca' - C+
120 I
H Liaison peptidique Liaison carba Schéma 6: Représentation schématique des liaisons peptidique et carba La liaison carba confère une certaine flexibilité au pseudopeptide et ceci en raison de libres rotations autour des liaisons carbone-carbone. Ces libres rotations peuvent entraîner des changements dans l'orientation des chaînes latérales (portées par les carbones Ca et Ca+ 1, voir schéma 6) des deux acides aminés situés de part et d'autre de la liaison carba. Ces modifications dans l'orientation des chaînes latérales peuvent avoir de nombreuses implications dans les phénomènes de fixation, de reconnaissance et d'induction de signaux différents par rapport à ceux
engendrés avec le peptide parent.
Le synthon Fmoc-IleW(CH2CH2)Gly-OH (4 de la Figure 7) est nécessaire à la synthèse de l'analogue [Ile30W'(CH2CH2)Gly31] Mart-1 27-35. Ce synthon est
obtenu par synthèse chimique en plusieurs étapes (schéma 7).
Le diméthylhydroxamate du Boc-P-homoIle-OH (1) (pour la synthèse des O-homo acides aminés, voir paragraphe précédent) est réduit par l'hydrure d'aluminium lithium à basse température (-25 C) dans le tétrahydrofurane afin d'obtenir l'aldéhyde correspondant (2). La réaction de Horner-Emmons en
présence de triéthyl phosphonoacétate conduit au dipeptide éthylénique 3.
L'hydrogénation de la double liaison, la saponification de l'ester, la déprotection et la reprotection de la fonction amine par le groupe Fmoc permettent d'obtenir le
Fmoc-IleP(CH2CH2)Gly-OH (4).
BocHN OH 1)HCI,NH(OMe)Me BocHN H
BOP, DIEA, DMP
A 2) LiAIH4 O
THF
2 /0 O O l 2 (OEt)2PFR kOEt NaH- 1) H2, Pd/C FmocHN 2/3) TFA BocHN OEt _ 4)FmocOSu
O O
4 3
Schéma 7: Schéma de synthèse de Fmoc-Ile30t'(CH2CH2)Gly31-OH (4) Ce synthon (4) est incorporé en phase solide en chimie Fmoc. Le couplage de 5 équivalents du mélange (synthon/BOP/HOBt) est réalisé 2 fois de suite (20 mn chaque) dans le DMF. Le groupement Fmoc est déprotégé par la pipéridine à 50% dans le DMF. Les acides aminés suivants sont couplés de manière classique. Le peptide est déprotégé et décroché de la résine dans le TFA,
précipité dans l'éther et purifié par RP-HPLC.
Le pseudopeptide [Ile30OP(CH2CH2)Gly31] Mart-1 27-35 est obtenu avec une pureté de 100%. Son temps de rétention dans le gradient de 5 à 65% de B
(avec A=eau à 0,1% de TFA et B=ACN à 0,08% de TFA) est de 13,49 mn.
L'analyse de la masse du pseudopeptide par MALDI à l'aide du spectromètre
Bruker Protein TOF donne la masse attendue M+H+ 800.0.
B.2.) Synthèse d'analogues peptidiques comportant des acides aminés non protéinogéniques: Synthèse du peptide analogue [Tic62] M58-66 Le tétrahydroisoquinolène-3-carboxylique acide est un analogue contraint de la phénylalanine. Il a été introduit en position 62 dans la séquence du peptide matrice de la grippe à la place de la phénylalanine naturelle afin d'étudier l'importance de l'orientation du groupe phényl dans l'interaction avec la molécule
CMH et le TCR.
La synthèse du peptide analogue a été réalisée en chimie Fmoc classique. Le dérivé Fmoc-L-Tic-OH (commercialisé par la société Néosystem) a été introduit dans la chaîne en croissance en utilisant un procédé classique de couplage (BOP/HOBt/Fmoc-L-Tic-OH) en excès de 5 durant 20 mn dans du DMF. La déprotection du groupement Fmoc a été réalisée en plusieurs étapes en 50% pipéridine dans du DMF (4 traitements de 30 mn chacun séparés de 3 lavages de la résine en DMF). L'assemblage des acides aminés suivants n'a pas posé de problèmes particuliers. Après déprotection classique en TFA et purification HPLC, le peptide a été obtenu à 90% de pureté. La masse mesurée à l'aide du
spectromètre Bruker Protein TOF était la masse attendue M+H+ 978.9.
La synthèse du peptide analogue [Tic64]M58-66 est effectuée de la même façon que précédemment en introduisant le tétrahydroisoquinolène-3carboxylique
acide en lieu et place de la phénylalanine en position 64.
Toujours selon le même protocole: les analogues 3-Pya62 et 3-Pya64 de M58-66 ont été obtenus en introduisant l'acide aminé de formule [ o en lieu et place de la phénylalanine en positions 62 et 64 respectivement; 25. les analogues 2-Tha62 et 2-Tha64 de M58-66 ont été obtenus en introduisantl'acide aminé de formule
0
en lieu et place de la phénylalanine en positions 62 et 64 respectivement; les analogues D-Phe62 et D-Phe64 de M58-66 ont été obtenus en introduisant la D-phénylalanine en lieu et place de la phénylalanine en positions 62 et 64 respectivement; les analogues Cha62 et Cha64 de M58-66 ont été obtenus en introduisant l'acide aminé de formule _ x 1< } 02* ol en lieu et place de la phénylalanine en positions 62 et 64 respectivement; l'analogue N-MePhe62 de M58-66 a été obtenu en introduisant l'acide aminé de formule
II 0
C c- en lieu et place de la phénylalanine en position 62 les analogues pCl-Phe62 et pCl-Phe64 de M58-66 ont été obtenus en introduisant l'acide aminé de formule c;e en lieu et place de la phénylalanine en positions 62 et 64 respectivement; les analogues Phg62 et Phg64 de M58-66 ont été obtenus en introduisant l'acide aminé de formule
' O
en lieu et place de la phénylalanine en positions 62 et 64 respectivement.
II- Etude des propriétés biologiques des analogues peptidiques synthétisés: A) Méthodologie: 1) Détection de l'association entre les peptides et les molécules d'histocompatibilité 1.1. Matriel Sources de molécules d'histocompatibilité Elles sont actuellement de deux types principaux: les cellules mutantes et les
molécules d'histocompatibilité purifiées.
- La cellule mutante utilisée est la cellule humaine T2 (DeMars et al., 1985; Ljunggren & Karre, 1985; Salter & Cresswell, 1986) qui est un variant de la lignée T1 produite par fusion du lymphome T CEM et du lymphome B 721.174. Cette cellule qui est dépourvue de transporteurs de peptides contient des chaînes lourdes de molécules de classe I libres de peptides qui vont pouvoir accepter des
peptides exogènes.
- Des molécules d'histocompatibilité de classe I purifiées par chromatographie d'affinité à partir de lignées de cellules B humaines transformées par I'EBV peuvent être également utilisées. Dans ce cas les peptides endogènes doivent être éliminés par un traitement avec de l'urée 1,5 M et de la soude 12,5 mM (pH 11.7) pendant 1 h à 4 C, suivi de leur élimination par une colonne de désalage (PD10, Pharmacia). Les molécules d'histocompatibilité sont immédiatement remises en présence des peptides à tester dans un tampon PBS avec 0,05 % Tween 20, 2 mM EDTA, 0,1% NP40 et 6 mM CHAPS, en présence de
2 /g/ml B2m pour faciliter la réassociation (Gnjatic et al.,1995).
Peptides Les peptides testés sont utilisés à des concentrations variant de 100 /aM à
0,1 nM.
1.2. Protocole de l'assemblage Des aliquots de 8 x 105 cellules T2 dans un volume de 64 /l, répartis dans des tubes microfuge Eppendorf, sont mis en présence d'un tampon de lyse contenant 10 mM PBS, pH 7.5, 1% NP40, des inhibiteurs de protéases (1 mM PMSF, 100 /M iodoacétamide, 2 /ig/ml aprotinine, 10 /M leupeptine, 10 /M pepstatine et 10 iig/ml inhibiteur de trypsine). La lyse se fait en présence des peptides à tester pendant 30 mn ou 1 h à 37 C. Après élimination du matériel non solubilisé par une centrifugation à 15 000 rpm à 4 C, le surnageant est additionné de 140 /al de PBS contenant 0,05 % de Tween 20, 3 mM d'azide de sodium, 1 mM PMSF et 10 mg/ml d'albumine bovine. Chaque échantillon est incubé pendant h à 4 C dans 2 puits d'une plaque à microtitration de type Nunc, Maxisorb, préalablement recouverts d'un anticorps monoclonal (Parham & Brodsky, 1981) (10 /g/ml en PBS) qui reconnaît les molécules d'histocompatibilité ayant une(des) conformation(s) conforme(s) pour la présentation des peptides et semblable(s) à celle(s) présente(s) à la surface des cellules. La plaque recouverte d'anticorps est préalablement saturée par de l'albumine bovine à 10 mg/ml dans du PBS-Tween avant la mise de l'échantillon. Le second anticorps qui permet la détection de l'assemblage des molécules d'histocompatibilité est dirigé contre la béta2m. Il est couplé soit à la biotine (NHS-LC biotin, Pierce) soit à la phosphatase alcaline (P- 5521, Sigma) et est incubé à 2 lig/ml pendant 1 h à 37 C. Dans le cas de l'emploi de la biotine, une incubation de 45 mn à 20-25 C avec de l'extravidine couplée à la phosphatase alcaline (E-2636, Sigma) est réalisée. L'activité de la phosphatase alcaline est mesurée en utilisant comme substrat du 4-méthyl-umbelliferyl phosphate(M-8883, Sigma) à 100 /M dans de la diéthanolamine 50 mM, pH 9.5 avec du MgC12 1 mM. La lecture est faite à
340/460 nm à l'aide d'un cytofluorimètre 2300, Millipore.
1.3. Contrôle de la stabilité des complexes HLA/peptide
Le matériel utilisé est soit du HLA purifié, soit le lysat de la cellule T2.
Avec le HLA purifié il faut éliminer les peptides endogènes comme décrit dans le paragraphe I-1 et le mettre en présence du peptide à tester en tube Eppendorf à 37 C pendant des temps variables de quelques mn à plusieurs jours. La phase suivante d'incubation sur plaque 96 puits (voir paragraphe I-2) avec l'anticorps anti-HLA (Parham & Brodsky, 1981) se fait pendant 1 h à 37 C. La révélation est classique (Teillaud et al., 1982). Avec le lysat de la cellule T2, toutes les incubations se font également à 37 C après avoir ajouté tous les inhibiteurs de
protéases.
1.4. Analyse de la conformation des complexes HLA/peptide par la résonance plasmonique de surface par le BIAcore Cet appareil mesure à l'aide d'un faisceau de lumière réfléchie les interactions moléculaires se produisant en temps réel dans un flux de tampon continu. Les anticorps anti-HLA sont dilués à 25 gg/ml dans du tampon acétate de Na pH 7.4 et fixés de façon covalente par leurs amines libres sur la matrice de dextran carboxyméthylée du "Sensor Chip CM5" activée avec 50 mM NHS et mM EDC. L'injection se fait à 5 Ml/mn pendant 6 mn puis les groupements réactifs résiduels sont bloqués avec 30 ttl de chlorure d'éthanolamine pH 8.5. Les complexes HLA/peptide formés comme indiqué dans le paragraphe I-1 sont injectés (30 /1) à 2 /l/mn et vont pouvoir se lier à l'anticorps immobilisé. Les résultats sont exprimés en unités de résonance (RU) qui correspondent à l'angle de déviation du faisceau lumineux, déviation proportionnelle à la concentration de protéines au contact de la matrice. Le système peut être réutilisé après régénération en injectant 1 M éthanolamine pendant 2 mn. Des mesures cinétiques
et d'affinité peuvent être réalisées.
2) Induction de lymphocytes T cytolytiques in vitro Les cellules mononucléées issues du sang périphérique (PBMC), non purifiées, sont cultivées en RPMI 1640 et 10% SAB avec des antibiotiques, à la concentration de 2x 106 /ml à raison de 2 ml par puits (plaque Costar 24 puits). A ces cellules sont ajoutés la toxine tétanique (TT) à 1 gg/ml qui stimule les cellules T CD4+ et le peptide à tester en tant qu'inducteur de CTL à 1 lg/ml. Au jour 3 ou 4, de l'IL-7 est ajoutée à 50 U/ml. Pour chaque culture, 10 réplicats sont traités de manière indépendante. Les cellules effectrices générées sont restimulées par des PBMC préincubées avec le peptide (50 zg/ml pendant 4 h pour lOx 106 cellules) puis irradiées à 6000 rads. Les cellules stimulatrices sont diluées à 106/ml et 1 ml est ajouté par puits de culture après avoir enlevé 1 ml de surnageant. Le lendemain et 4 jours plus tard, de l'IL-2 (10 U/ml) et de l'IL-7 (50 U/ml) sont ajoutées. Les effecteurs sont restimulés tous les 7 à 10 jours de la
même façon. Quand l'activité cytolytique est apparue l'IL-2 est ajoutée à 50 U/ml.
La cytotoxicité peut être testée après 2 stimulations puis chaque semaine.
3) Analyse des fonctions effectrices
3.1. Test de cytolyse direct.
Les lignées T induites sont testées sur leur capacité à reconnaître le peptide inducteur présenté sur le HLA à la surface de cellules cibles, qui sont le plus fréquemment des cellules lymphoblastoides EBV. La cytolyse qui en résulte est déterminée par le test standard de 4 h de relargage de 51Cr. Au Jour -3 ou 4 avant le test, l'ajout d'interleukines n'est pas fait car les cellules doivent être sevrées pour être en condition d'activation optimale. Pour les inductions primaires, la lyse ne peut être détectée avant 3 semaines. Les cellules cibles marquées pendant 1 h avec 10 lCi de 51Cr sont préincubées avec le peptide (5 tg/ml classiquement ou concentration variable). Après 2 lavages ces cellules sont réparties dans les puits d'une plaque de microtitration 96 puits à raison de 5000 par puits et les cellules effectrices sont ajoutées à des rapports variant de 1 à 100. Le relargage de 51Cr (R) obtenu pendant l'incubation de 4 h à 37 C est mesuré. Le pourcentage de lyse est déterminé par la formule suivante: (R. expérimental - R. spontané / R. total - R. spontané) x 100 3.2. Analyse des interleukines L'analyse de l'expression des gènes codant pour les interleukines est faite avec une technique de RT-PCR semiquantitative. Des PBMC ou des cellules purifiées CD8+ (1 à 2 x 106) sont mises en culture dans des plaques 24 puits et stimulées avec soit des anticorps monoclonaux anti-CD3 + en présence de 100 nM de Phorbol Myristate Acetate (PMA) avec des PBMC autologues irradiés et sensibilisés ou non pendant 1 h 30 avec un peptide dont la reconnaissance est restreinte par les molécules du CMH. Pour les différentes interleukines, au bout de 12 à 14 h de stimulation (ou de 3, 10 et 24 h pour l'analyse cinétique de l'apparition des ARNm), les cellules sont récupérées et l'ARN total extrait par la technique au RNAzol (Bioprobe, Montreuil, France). L'ARN (1 à 2 mg) est rétrotranscrit avec la superscript II (Gibco BRL). Les cDNA synthétisés sont dilués au 1/5 avec de l'eau et leur concentration quantifiée par PCR compétitive avec un plasmide (pQB.2) contenant la séquence de la B actine (produit de 237 pb gracieusement fourni par D. Shire). La réaction de PCR est faite en présence de mM de Tris-HCl, 50 mM de KCl, 1.5 mM de MgC12, 0.2 mM de chaque dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0.4 mM d'amorce sense et antisense, 2 U de Taq polymérase (Promega). L'amplification est réalisée en commençant par une dénaturation à 94 C, 5 mn, puis par 30 cycles à 94 C, 30 s, 55 C, 30 s, 72 C, 30 s, et une dernière élongation à 72 C, 10 mn, dans un thermostat régulé (Perkin Elmers 9600). L'analyse de I'IL-2, de 1'IL-4 et de l'IFN-g est faite dans les mêmes conditions que pour la B-actine, excepté le nombre de cycles qui varie
entre 30 et 40. La quantification relative est réalisée par PCR compétitive.
B) Résultats: 1) Analogues peptidiques du peptide M58-66 comportant des acides aminés non protéinogéniques: 1.1. Liaison sur la molécule A2 des peptides de la série M58-66
Les résultats sont représentés sur la figure 1 (figures 1A à 1C).
Les peptides ont été incubés à différentes concentrations à 4 C 18 h en présence de molécules HLA-A2 dénaturées et de 32 microglobuline. Les complexes stables HLA-A2/peptide formés à 4 C sont capturés à l'Ac BB7.2 adsorbé sur plaque et révélés par un second Ac anti P32 microglobuline couplé à la phosphatase alcaline. La quantité de complexes formés HLA-A2/peptide est proportionnelle à l'intensité de fluorescence détectée au cytofluor. NP 383-391 est un peptide contrôle négatif. 0. peptide correspond au bruit de fond en absence de
peptide. U.F.: unité arbitraire de fluorescence.
Seules deux modifications affectent la liaison de ces peptides modifiés sur la molécule HLA-A2: modification par la D-Phényl en position 62
([D-Phe62]M58-66) et en position 64 ([D-Phe64]M58-66).
1.2. Capacité de ces peptides à induire la lyse des cellules cibles T2 par une lignée de cellules T cytotoxiques (CTL) spécifique de M58-66 et restreinte par la
molécule HLA-A2.1.
Les résultats sont représentés sur la figure 2 (figures 2A à 2D).
Les cellules cibles T2 A2 ont été chromées (Cr51), puis incubées pendant 2 h avec 1 /xg/ml de peptide. Après lavage, les cibles (5000 par puits) ont été incubées pendant 4 h avec la lignée CTL à un rapport 10 cellules effectrices (E)/1 cellule cible (C). La lyse spécifique est exprimée en % de lyse en fonction de la
concentration en peptide incubée avec les cibles.
Les modifications Phg-62 et 64, DPhe-62 et 64, Cha62 et 64, Tic 62 et 64 affectent la reconnaissance des lymphocytes T cytolytiques spécifiques du peptide
MS58-66.
1.3. Dose répone.
1S Les résultats sont représentés sur la figure 3 (figures 3A et 3B).
Les cellules cibles T2 A2 ont été chromées (Cr51), puis incubées pendant 1 h avec différentes concentrations de peptide. Après lavage, les cibles (5000 par puits) ont été incubées pendant 4 h avec la lignée CTL à un rapport 10E/lC. La lyse spécifique est exprimée en % de lyse en fonction de la concentration en
peptide incubée avec les cibles.
Les lymphocytes T cytolytiques spécifiques du peptide M58-66 ont une
affinité plus faible pour les peptides modifiés.
2) Analogues peptidiques de Mart-1 comportant une liaison du type,-
homologation:
2.1. Liaison sur la molécule A2.
Les résultats sont représentés sur la figure 4 (figures 4A et 4B).
Les différents peptides sont comparés pour leur capacité à se lier à la
molécule HLA-A2.1 purifiée.
Les peptides ont été incubés à différentes concentrations à 4 C 18 h en présence de molécules HLA-A2 dénaturées et de P2 microglobuline. Les complexes stables HLA-A2/peptide formés à 4 C sont capturés à l'Ac BB7.2 adsorbé sur plaque et révélés par un second Ac anti P2 microglobuline couplé à la phosphatase alcaline. La quantité de complexes formés HLA-A2/peptide est proportionnelle à l'intensité de fluorescence détectée au cytofluor. (U.F.: unité
arbitraire de fluorescence).
NP est un peptide de la nucléoprotéine du virus de l'influenza qui ne se lie
pas à la molécule HLA-A2 (contrôle négatif).
A part le peptide 14 homo qui se lie mieux que le peptide parent, les autres peptides 13 homo ont une affinité intermédiaire à faible par rapport au peptide Mart-1. 2.2. Capacité de ces peptides à induire la lyse des cellules cibles T2 par 3
clones T spécifiques de Mart-l restreints par la molécule HLA-A2.1.
Les résultats sont représentés sur la figure 5.
Les cellules cibles T2 A2 ont été chromées (Cr51), puis incubées pendant 2 h avec 1 /ig/ml de peptide. Après lavage, les cibles (1500 par puits) ont été incubées pendant 4 h avec les différents clones T (LT8, LT 11, LT12) à un rapport 3 cellules effectrices/1 cellule cible (E/T). La lyse spécifique est exprimée en % de lyse. Les cellules cibles T2 incubées avec le peptide parent Mart-1 sont lysées à % par les trois clones cytolytiques (LT8, LT11 et LT12) spécifiques de ce peptide. En absence de peptide (0), aucune lyse n'est détectée. Seul le peptide [54 homo est capable d'induire une activité de lyse similaire au peptide parent pour un
seul clone (LT12).
2.3. Dose répons.
Les résultats sont représentés sur la figure 6.
Les cellules cibles T2 A2 ont été chromées (Cr51), puis incubées pendant 2 h avec différentes concentrations de peptide. Après lavage, les cibles (1500 par puits) ont été incubées pendant 4 h avec le clone T LT12 à un rapport 3E/1C. La lyse spécifique est exprimée en % de lyse en fonction de la concentration en
peptide incubée avec les cibles.
Le clone T LT12 a une affinité plus faible pour le peptide p4 que vis-àvis
du peptide Mart-1.
3) Analogues peptidiques du peptide Mart-1 comportant une liaison
-CH2-NH-.
3.1. Liaison sur la molécule A2 des peptides de la série Mart-1 réduit.
Les résultats sont représentés sur la figure 7 (figures 7A et 7B).
Complexes formés peptides/HLA-A2 en fonction de la concentration en peptide: Les peptides ont été incubés à deux concentrations différentes (10-4 M et -6 M) à 4 C 18 h en présence de molécules HLA-A2 dénaturées et de 132 microglobuline. Les complexes stables HLA-A2/peptide formés à 4 C sont capturés à l'Ac BB7.2 (spécifique de cette molécule de classe I et adsorbé au fond des puits) et révélés par un second Ac anti 12 microglobuline couplé à la phosphatase alcaline. La quantité de complexes formés HLA-A2/peptide est proportionnelle à l'intensité de fluorescence détectée au cytofluor. (U.F.: unité
arbitraire de fluorescence).
Les peptides y 1-2 à 4-5 ont une affinité intermédiaire à faible par rapport au peptide Mart-1. Les peptides v 4-5 à 8-9 se lient très faiblement à la molécule
A2.1 purifiée.
3.2. Capacité des peptides de la série Mart réduit à induire la lyse des cellules cibles T2 par 3 clones T spécifiques de Mart restreints par la molécule
HLA-A2.1.
Les résultats sont représentés sur la figure 8.
Test de lyse: Des cellules cibles T2 A2 ont été chromées (Cr51), puis incubées pendant 2 h avec 1 /g/ml de peptide. Après lavage, les cibles (1500 par puits) ont été incubées pendant 4 h avec les différents clones T (LT8, LT11, LT 12) à un rapport 3 cellules effectrices/1 cellule cible (E/T). La lyse spécifique est exprimée en % de
lyse en fonction des différents clones testés.
Les cellules cibles T2 incubées avec le peptide parent Mart-I sont lyséesà 90% par les trois clones cytolytiques (LT8, LT11 et LT12) spécifiques de ce peptide. En absence de peptide (0), aucune lyse n'est détectée. Seuls les peptides v 2-3, v 5-6 sont capables d'induire une activité de lyse similaire au peptide parent pour un seul clone (LT8 et LT12 respectivement). y 7-8 induit une activité
de lyse plus faible détectée uniquement avec le clone LT12.
3.3. Dose réponse des différents peptides qui induisent une lyse avec les
clones LT8 et LT12.
Les résultats sont représentés sur la figure 9 (figures 9A et 9B).
Test de lyse: Des cellules cibles T2 A2 ont été chromées (Cr51), puis incubées pendant 2 h avec différentes concentrations de peptide. Après lavage, les cibles (1500 par puits) ont été incubées pendant 4 h avec les différents clones T (LT8, LT12) à un rapport 3E/1C. La lyse spécifique est exprimée en % de lyse en fonction de la
concentration en peptide incubée avec les cibles.
Les peptides y 2-3 et w 5-6 ont une dose réponse comparable à celle du peptide parent alors que le peptide v 7-8 n'induit la lyse que faiblement même à concentration forte en peptide. Ce résultat suggère que la modification introduite
diminue l'affinité du TCR (récepteur T) du clone LT8 pour ce peptide.
4) Analogues peptidiques du peptide M58-66 comportant une liaison
-CH2-NH-.
4.1. Liaison sur la molécule A2 des peptides de la série M58-66 réduit.
Les résultats sont représentés sur la figure 10 (figures 10A et 10B). Les peptides ont été incubés à différentes concentrations à 4 C 18 h en présence de molécules HLA-A2 dénaturées et de 12 microglobuline. Les complexes stables HLA-A2/peptide formés à 4 C sont capturés à l'Ac BB7.2 adsorbé sur plaque et révélés par un second Ac anti 132 microglobuline couplé à la phosphatase alcaline. La quantité de complexes formés HLA-A2/peptide est proportionnelle à l'intensité de fluorescence détectée au cytofluor. U.F.: unité
arbitraire de fluorescence.
Les peptides Mart-1 modifiés par réduction ont une affinité intermédiaire pour la molécule HLA-A2. La réduction en position 2-3 et 8- 9 rend la liaison
indétectable pour le clone étudié.
4.2. Capacité des peptides de la série réduit M58-66 à induire la lyse des cellules cibles T2 par une lignée CTL induite par M58-66 et restreinte par la
molécule HLA-A2.1.
Les résultats sont représentés sur la figure 11.
Les cellules cibles T2 A2 ont été chromées (Cr51), puis incubées pendant 1 h avec 1 /ig/ml de peptide. Après lavage, les cibles (5000 par puits) ont été incubées pendant 4 h avec la lignée CTL à un rapport 10E/1C. La lyse spécifique
est exprimée en % de lyse.
La réduction en position 2-3 et 5-6 n'affecte pas la reconnaissance du peptide
par les lymphocytes T cytolytiques spécifiques du peptide M58-66.
LEGENDE DES FIGURES:
- Figure 1 étude de la liaison aux molécules du CMH (HLA-A2) des analogues peptidiques du peptide M58-66 comportant des acides aminés non protéinogéniques: les concentrations des analogues peptidiques (10-4 à 10-10 M) sont indiquées en abscisse, les unités de fluorescence sont indiquées en ordonnée: Figure 1A: étude de la liaison des analogues peptidiques [Tic62]M58-66 (encore désigné M58-66 Tic62 ou Tic62), [3Pya62]M58-66 (3-Pya62), [2-Tha62]M58-66 (2-Tha62), [D- Phe62]M58-66 (D-Phe62), [Tic64]M58-66 (Tic64), Figure lB: étude de la liaison des analogues peptidiques [3-Pya64]M58-66 (3-Pya64), [2- Tha64]M58-66 (2-Tha64), [D-Phe64]M58-66 (D-Phe64), [Cha62]M58-66 (Cha62), [N-MePhe62]M58-66 (N-MePhe62), Figure 1C: liaison des analogues peptidiques [pCl-Ph62]M58-66 (pCl-Phe62), [Phg62]M58-66 (Phg62), [Cha64]M58-66 (Cha64), [pCI-Phe64]M58-66 (pCI-Phe64), [Phg64]M58-66 (Phg64),
en comparaison avec le peptide M58-66, le peptide de contrôle négatif NP383-
391, et une solution ne contenant aucun peptide (0 peptide). - Figure 2: étude de l'effet d'analogues peptidiques de M58-66 comportant des acides aminés non protéinogéniques sur la lyse d'une lignée de cellules cibles T2 par une lignée de cellules T cytotoxiques spécifiques de M58-66: le pourcentage de lyse est indiqué en ordonnée et le rapport E/T (cellules effectrices/cellules cibles) est représenté en abscisse: Figure 2A effet des analogues Tic62 et Tic64 sur la lyse des cellules T2, Figure 2B effet des analogues D-Phe62, D-Phe64, Cha62, Cha64 sur la lyse des cellules T2, Figure 2C: effet des analogues 3-Pya62, 3-Pya64, 2-Tha62, 2- Tha64 sur la lyse des cellules T2, Figure 2D: effet des analogues pCl-Phe64, Phg64, pCl-Phe62, Phg62 sur la lyse des cellules T2, en comparaison avec les effets du peptide M58-66, et d'une solution ne contenant
pas de peptide (0 peptide).
- Figure 3: étude de la réponse des cellules T cytotoxiques en fonction de la concentration d'analogues peptidiques du peptide M58-66 comportant des acides aminés non protéinogéniques: le pourcentage de lyse est indiqué en ordonnée, et la concentration des peptides en abscisse:
Figure 3A étude en fonction de la concentration de pCl-Phe62 et pCl-
Phe64,
Figure 3B étude en fonction de la concentration de 2-Tha62 et de 2-
Tha64,
en comparaison avec la concentration de M58-66.
- Figure 4: étude de la liaison aux molécules du CMH (HLA-A2) des analogues peptididiques du peptide Mart-1 comportant une liaison du type [-homologation; les concentrations des analogues peptidiques (10-5 à 10- 7 M) sont indiquées en abscisse, les unités de fluorescence sont indiquées en ordonnée: Figure 4A: étude de la liaison des analogues P31 homo (BI1),,B2 homo (B2),,33 homo (B3), p4 homo (B4), 35. Figure 4B: étude de la liaison des analogues P5 homo (B5), f36 homo (B6), f37 homo (B7), P38 homo (B8), P9 homo (B9), en comparaison avec le peptide Mart-1 (Mart), et un peptide de contrôle négatif (NP). - Figure 5: étude de l'effet d'analogues peptidiques du peptide Mart-1 comportant une liaison du type P-homologation sur la lyse des cellules cibles T2 par 3 clones de cellules T cytotoxiques (LT8, T11 et LT12) spécifiques de Mart- 1: le pourcentage de lyse est indiqué en ordonnée, et les analogues peptidiques B1 à B9 sont indiqués en abscisse, en comparaison avec Mart-1 et une solution sans
peptide (0).
- Figure 6: étude de la réponse des cellules T cytotoxiques en fonction de la concentration de l'analogue 14 homo de Mart-l, en comparaison avec Mart-1: le pourcentage de lyse est indiqué en ordonnée, et la concentration en peptide
(/g/ml) en abscisse.
- Figure 7: étude de la liaison aux molécules du CMH (HLA-A2) des
analogues peptidiques du peptide Mart-1 comportant une liaison -CH2-NH-
(analogues réduits): les peptides aux concentrations de 10-6 M ou de 104 M sont indiqués en abscisse, et les unités de fluorescence sont indiquées en ordonnée: 15. Figure 7A: étude de la liaison des peptides W(1-2)Mart-1 (représenté par 1-2), xP(2-3)Mart-1 (2-3), 'P(3-4)Mart-1 (3- 4), '-'(4-5)Mart-1 (4-5), Figure 7B: étude de la liaison des peptides W(5-6)Mart-1 (5-6), (6-7)Mart-1 (6-7), 'F(7-8)Mart-1 (7-8), '(8-9)Mart-1 (8-9),
en comparaison avec Mart-1.
- Figure 8: étude de l'effet des analogues réduits 1-2 à 8-9 de Mart-1 sur la lyse de cellules T2 par 3 clones de cellules T (LT8, LT 1 et LT12) spécifiques de Mart-1: le pourcentage de lyse est indiqué en ordonnée, et les analogues peptidiques 1-2 à 8-9 sont indiqués en abscisse, en comparaison avec Martl-1 et
une solution sans peptide (0).
- Figure 9: étude de la réponse des cellules T cytotoxiques en fonction de la concentration d'analogues réduits de Mart-1: le pourcentage de lyse est indiqué en ordonnée, et la concentration des peptides en abscisse (/ig/ml): Figure 9A: étude en fonction de la concentration des analogues 2-3 et 7-8, Figure 9B: étude en fonction de la concentration de l'analogue 5-6,
en comparaison avec la concentration de Mart-1.
- Figure 10: étude de la liaison aux molécules du CMH (HLA-A2) des
analogues peptidiques du peptide M58-66 comportant une liaison -CH2-NH-
(analogues réduits): les concentrations des peptides (10-10 à 10-4 M) sont indiquées en abscisse, et les unités de fluorescence sont indiquées en ordonnée: 35. Figure 10A: étude de la liaison des peptides W(1-2)M58- 66 (1-2), x (2-3)M58-66 (2-3), F(3-4)M58-66 (3-4), W(4-5)M58-66 (4-5), Figure 10B: étude de la liaison des peptides 'F(5-6)M58-66 (5-6), IF(6- 7)M58-66 (6-7), I(7-8)M58-66 (7-8), k(8-9)M58-66 (8-9), en comparaison avec M58-66, et un peptide muté (GIL) de M58-66 portant la mutation GLL - > GIL [M58-66 (GIL)], - Figure 11: étude de l'effet des analogues réduits 1-2 à 8-9 de M58-66 sur la lyse de cellules T2 par un clone de cellules T spécifique de M58-66: le pourcentage de lyse est indiqué en ordonnée, et le rapport cellules effectrices/cellules cibles (E/T) est indiqué en abscisse, en comparaison avec
M58-66, M58-66 muté (GLL) et une solution sans peptide (0).
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
1. Bohnstedt A.C. et al. Tetrahedron Lett. 1993, 34:5217-5220.
2. Breton P. et al. Int. J. Peptide Protein Res. 1990, 35:346-351.
3. Chorev M. & Goodman M. Acc. Chem.. Res. 1993, 26:266-273.
4. DeMars et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82:8183.
5. Evans B.E. et al. J. Org. Chem. 1985, 5Q:4615-4625.
6. Gnjatic S. et al. Eur. J. Immunol. 1995, 25: 1638-1642.
7. Gonzalez-Muniz R. et al. J. Med. Chem. 1995, 38:1015-1021.
8. Goodman M. & Chorev M. Acc. Chem. Res. 1979, 12:1-7.
9. Harbeson S.L. & Rich D.H. J. Med. Chem. 1989, 32:1378-1392.
* 10. Hann M.M. et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1982, 1:307-314.
11. Kempf D.J. et al. Int. J. Peptide Protein Res. 1991, 38:237-241.
12. Ljunggren H.G. & KIrre K. J. Exp. Med. 1985, 162:1745.
13. Martinez J. et al. J. Med. Chem. 1985, 28: 1874.
14. Parham P. & Brodsky F.M. J. Immunol. 1981, 3:277.
15. Rodriguez M. et al. Tetrahedron Lett. 1990a, 31:5153-5156.
16. Rodriguez M. et al. Tetrahedron Lett. 1990b, 31:7319-7322.
17. Salter R.D. & Cresswell P. EMBO J. 1986, 5:943.
18. Sasaki Y. & Coy D.H. Peptides 1987, 8:119-121.
19. Shemyakin M.M. et al. Angew Chem. Internat. Edit. 1969, 8:492-499.
20. Szelke M. et al. Nature 1982, 299:555-557.
21. Teillaud et al. Immunogenetics 1982, 15:377.
22. TenBrink R.E. J. Org. Chem. 1987, 52:418-422.
23. Wuts P.G.M. et al. J. Org. Chem. 1992, 51:6696-6700.
I0

Claims (21)

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'analogues peptidiques de peptides parents, ces peptides parents étant le cas échéant issus de protéines exogènes ou endogènes, lesdits peptides parents pouvant interagir avec des molécules du CMH dans le cadre de pathologies chez l'homme ou l'animal, lesdits analogues étant caractérisés en ce qu'ils correspondent auxdits peptides parents dans lesquels: - au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique, est modifiée, à l'exception des modifications du type rétro, ou rétro-inverso, ou - au moins un acide aminé de la chaîne peptidique, est substitué par un acide aminé non protéinogénique, ou - au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique, est modifiée, et au moins un acide aminé de ladite chaîne peptidique est substitué par un acide non protéinogénique, pour: - la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies susmentionnées, ou - la préparation d'une composition destinée au diagnostic in vivo des pathologies susmentionnées, ou à l'évaluation in vivo de la réponse immunitaire dans le cadre des pathologies susmentionnées, par mise en oeuvre d'une réaction cutanée d'hypersensibilité par injection intradermique de ladite composition, ou - la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro desdites pathologies.
2. Analogues peptidiques de peptides parents, ces peptides parents étant le cas échéant issus de protéines exogènes ou endogènes, lesdits peptides parents pouvant interagir avec des molécules du CMH dans le cadre de pathologies chez l'homme ou l'animal, lesdits analogues étant caractérisés en ce qu'ils correspondent auxdits peptides parents dans lesquels: - au moins une liaison peptidique - CO-NH- de la chaîne peptidique est modifiée, à l'exception des modifications du type rétro, ou rétro-inverso, ou - au moins un acide aminé de la chaîne peptidique, est substitué par un acide aminé non protéinogénique, ou - au moins une liaison amide -CO-NH- de la chaîne peptidique, est modifiée, et au moins un acide aminé de la chaîne peptidique, est substitué par un
acide non protéinogénique.
3. Analogues peptidiques selon la revendication 2, caractérisés en ce que le nombre de résidus aminoacyles protéinogéniques ou non, et reliés par une liaison modifiée ou non, est compris entre environ 5 et environ 20, de préférence entre 8 et 12 pour les analogues peptidiques se liant aux molécules du CMH de classe I, et de préférence entre 8 et 16 pour les analogues peptidiques se liant aux molécules
du CMH de classe II.
4. Analogues peptidiques selon la revendication 2 ou la revendication 3, caractérisés en ce que l'une au moins des liaisons peptidiques -CO-NH- de la chaîne peptidique du peptide parent est remplacée par une liaison différente de la liaison -CO-NH-, ladite liaison différente étant notamment choisie parmi les 1o suivantes: -CH2-NH- (méthylène amino); -CH2-CH2- (carba); -CO-CH2- (cétométhylène); -CH2-O- (méthylène-oxy); -CHOH-CH2- (hydroxyéthylène); - CHOH-CHOH- (di-hydroxyéthylène); -CH=CH(E ou Z oléfmine); -CHCN- NH- (cyanométhylène amino); -S-CH2(thiométhylène); -CH2-S- (méthylène thio); -CS-NH- (thioamide); - PO2-NH(phosphonamide); -CHOH- (hydroxyméthylène); - NH-CO-NH- (urée); -CEH L H(oxirane); o -C -N- (tétrazole);
N N
\ N Se -CH2-CO-NH- ([-homologation); -CHOH-CH2-NH- (hydroxyéthylène amino);
-CO-NH-NH- (hydrazino).
5. Analogues peptidiques selon la revendication 4, caractérisés en ce que l'une au moins des liaisons amides -CO-NH- de la chalne peptidique ou peptide parent est remplacée par une liaison méthylène amino, ou du type P-homologation, ou carba, ou cétométhylène, ou cyanométhylène amino, ou hydroxyéthylène amino.
6. Analogues peptidiques selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisés
en ce que l'un au moins des acides aminés de la chaîne peptidique du peptide parent, est substitué par un acide aminé non protéinogénique, ledit acide aminé non protéinogénique étant choisi notamment parmi les acides aminés suivants: s - les acides aminés de configuration D, - les acides ax-aminés de formule générale:
14 \ /1/O
dans laquelle - R1, R2 et R3, représentent indépendamment les uns des autres: un atome d'hydrogène, un hydroxyle, un radical alkyle de 1 à 25 atomes de carbone, un radical contenant un groupe allyle et ayant de 3 à 25 atomes de carbone, un radical contenant un ou plusieurs cycles aromatiques ou non, notamment un groupe aryle, et ayant de 6 à 25 atomes de carbone, et notamment les groupes suivants: -CH3 (méthyl), -CH2CH3 (éthyl), -(CH2)4-CH3, -CH(CH3)2 (isopropyl), -C(CH3)3 (tertiobutyl), -O (phényl), -CH2I (benzyl), -CH2DCI (para-chlorobenzyl), -CH2-CH20 (2-phényl-éthyl), -CH2CHCH2 (alkyl), méthylfluorényl, -CH2CONH2 (glycolamide), -CH2COND2 (benzhydrylglycolamide), -CHOHO,
-CH2- /,-CH2LD, -CH2J
étant entendu que l'un des deux groupes R2 et R3 peuvent représenter une chaîne latérale d'acides aminés naturels lorsque soit R1, soit l'autre des deux groupes R2 et R3 ne représentent pas un atome d'hydrogène, - le cas échéant, R1, R2, Ca et N forment un hétérocycle de 4 à 8 atomes de carbone, aromatique ou non, le cas échéant substitué, notamment un hétérocycle de formule: 1 / ou sC) - les acides L-aminés de formule générale: Ro 4u \ v014 k4g dans laquelle R1, R2 et R3, indépendamment les uns des autres représentent une chaîne latérale d'un acide aminé naturel, ou sont tels que définis ci-dessus, notamment: les P-homo amino acides de formule: o Pl4 dans laquelle R1 et R2, sont tels que définis ci-dessus, ou les a-hydroxy O-homo amino acides de formule: o 0 14 oH dans laquelle R1 et R2, sont tels que définis ci-dessus, - les acides y-aminés de formule générale:
?-., ?.;
Ye1\,0fo1-4 14,] o dans laquelle R1, R2, R3 et R4 représentent indépendamment les uns des autres une chaîne latérale d'un acide aminé naturel, ou R1, R2 et R3, sont tels que définis ci-dessus, et R4 a la même signification que celle donnée ci-dessus pour R1, R2 etR3, notamment les dérivés de statine de formule: Ra X <L 01 o
7. Analogues peptidiques selon l'une des revendications 2 à 6, caractérisés
en ce qu'ils sont sélectionnés parmi ceux susceptibles: - d'une part d'être reconnus par les molécules du CMH et de s'associer avec ces dernières, notamment par mise en oeuvre de la méthode suivante: 5. incubation, de l'analogue peptidique en présence de molécules du CMH, provenant de la lyse de cellules humaines ou animales, ou purifiées notamment par chromatographie d'affinité à partir de lignées cellulaires humaines ou animales, sur un support solide recouvert d'un premier anticorps, notamment monoclonal, reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison audit analogue peptidique, addition sur le support solide précédent d'un deuxième anticorps marqué, notamment par couplage à un marqueur radioactif, enzymatique ou fluorescent, ledit anticorps marqué reconnaissant spécifiquement soit les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison à l'analogue peptidique, soit une molécule se liant elle-même spécifiquement aux molécules du CMH dans leur conformation susmentionnée, notamment la [32-microglobuline reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH de classe I, détection, après rinçage du support solide, de l'éventuelle présence du deuxième anticorps marqué resté fixé sur le support solide, témoignant d'un effet de reconnaissance et d'association entre les molécules du CMH et l'analogue peptidique étudié, - et, d'autre part, de former un complexe avec lesdites molécules du CMH, dont la stabilité peut être évaluée par mise en oeuvre d'une méthode de suivi dans le temps de la liaison établie entre l'analogue peptidique et les molécules du CMH, cette méthode étant avantageusement effectuée selon un protocole identique à la méthode précédente, mais dans laquelle l'étape d'incubation de l'analogue peptidique en présence des molécules du CMH sur le support solide recouvert dudit premier anticorps, se fait pendant des temps
variables de quelques minutes à plusieurs jours.
8. Analogues peptidiques selon l'une des revendications 2 à 7, caractérisés
en ce qu'ils sont sélectionnés parmi ceux susceptibles: - d'induire in vitro l'apparition et la croissance de lymphocytes T cytotoxiques à partir de cellules humaines ou animales, notamment à partir de cellules mononucléées issues du sang périphérique (PBMC), en présence de facteurs nécessaires à la croissance et la différenciation des cellules T cytotoxiques, - d'induire in vitro la cytolyse par des lymphocytes T cytotoxiques, de cellules cibles présentant à leur surface l'analogue peptidique associé aux molécules du CMH, lesdits lymphocytes T cytotoxiques étant avantageusement prélevés sur un patient atteint d'une pathologie dans laquelle est impliqué le peptide parent de l'analogue peptidique étudié, - et d'induire in vitro la sécrétion de cytokines (ou interleukines) par les lymphocytes T cytotoxiques susmentionnés, notamment IL-2, IL-4 ou l'interféron , lesdits analogues peptidiques ainsi sélectionnés étant soit des agonistes des récepteurs (TCR) reconnaissant l'antigène (à savoir le peptide parent) des cellules T cytotoxiques, et dérivent de peptides l0 parents se comportant eux- mêmes comme des agonistes ou des antagonistes desdits récepteurs, soit des agonistes partiels desdits récepteurs, et dérivent de peptides parents se comportant eux-mêmes comme des agonistes desdits récepteurs, ces agonistes partiels induisant notamment la sécrétion d'une ou plusieurs cytokines différentes de celles dont la sécrétion est induite par les
peptides parents.
9. Analogues peptidiques selon l'une des revendications 2 à 7, caractérisés
en ce qu'ils sont sélectionnés parmi ceux: - susceptibles d'induire in vitro l'apparition et la croissance de lymphocytes T cytotoxiques à partir de cellules humaines ou animales, notamment à partir de cellules mononucléées issues du sang périphérique (PBMC), en présence de facteurs nécessaires à la croissance et la différenciation des cellules T cytotoxiques, - n'induisant pas in vitro la cytolyse par des lymphocytes T cytotoxiques, de cellules cibles présentant à leur surface l'analogue peptidique associé aux molécules du CMH, lesdits lymphocytes T cytotoxiques étant avantageusement prélevés sur un patient atteint d'une pathologie dans laquelle est impliqué le peptide parent de l'analogue peptidique étudié, - n'induisant pas in vitro la sécrétion de cytokines (ou interleukines) par les lymphocytes T cytotoxiques susmentionnés, notamment IL-2, IL-4 ou l'interféron Y, lesdits analogues peptidiques ainsi sélectionnés étant des antagonistes des
récepteurs des cellules T cytotoxiques.
10. Utilisation d'analogues peptidiques définis dans l'une des revendications
1 à 9, pour la préparation de médicaments, notamment de vaccins, destinés à la prévention ou au traitement des pathologies dans lesquelles les peptides parents sont des agonistes ou antagonistes des récepteurs reconnaissant l'antigène des cellules T cytotoxiques, et plus particulièrement des pathologies neurodégénératives infectieuses (d'origine virale ou bactérienne), tumorales
(notamment le mélanome), auto-immunes et allergiques.
11. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif au moins un analogue peptidique défini dans l'une des revendication 1 à 9, en association avec un véhicule pharmaceutiquement
acceptable.
12. Composition pharmaceutique selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme administrable par voie orale, ou parentérale, notamment à raison d'environ 500 zig à 5 mg par prise, notamment à raison de
3 prises par jour.
13. Vaccin caractérisé en ce qu'il comprend un analogue peptidique
agoniste, le cas échéant partiel, défini dans l'une des revendications 1 à 8, en
association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
14. Composition de diagnostic pour le diagnostic in vivo des pathologies définies dans la revendication 10, ou pour l'évaluation in vivo de la réponse immunitaire dans le cadre des pathologies susmentionnées, par mise en oeuvre d'une réaction cutanée d'hypersensibilité par injection intradermique de ladite composition de diagnostic, caractérisée en ce qu'elle comprend un analogue
peptidique défini dans l'une des revendications 1 à 9, en association avec un
véhicule physiologiquement acceptable.
15. Complexe entre un analogue peptidique défini dans l'une des
revendications 1 à 9, et un élément du complexe d'histocompatibilité majeur
(encore désigné complexe binaire MHC-analogue peptidique), et éventuellement un récepteur de cellules T (encore désigné complexe ternaire MHC-analogue
peptidique-récepteur T).
16. Méthode de diagnostic in vitro de pathologies associées à la présence dans l'organisme d'un patient, de peptides exogènes ou endogènes pouvant interagir avec des molécules du CMH, et susceptibles d'être directement ou indirectement impliqués dans le processus de développement de ces pathologies chez l'homme ou l'animal, caractérisée en ce qu'elle comprend: - la mise en contact d'un échantillon biologique provenant d'un patient, avec
un analogue peptidique défini dans l'une des revendications 1 à 9, dans des
conditions permettant la réaction entre les récepteurs des cellules T susceptibles d'être présentes dans l'échantillon biologique, et le complexe binaire susceptible d'être formé entre ledit analogue peptidique et les molécules du CMH présentes dans ledit échantillon; - la détection in vitro du complexe ternaire CMH-analogue peptidique
peptidique-récepteur T, susceptible d'être formé à l'étape précédente.
17. Nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre de méthodes de diagnostic in vitro selon la revendication 16, comprenant:
- un analogue peptidique défmini dans l'une des revendications 1 à 9;
- des réactifs pour rendre un milieu apte à la formation d'une réaction immunologique; - des réactifs permettant de détecter le complexe ternaire selon la revendication 15, qui a été produit à l'issue de la réaction immunologique, lesdits réactifs contenant éventuellement un marqueur ou étant susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas o
ledit analogue peptidique n'est pas marqué.
18. Anticorps dirigés contre les complexes binaires tels que définis dans la revendication 15, lesdits anticorps étant tels qu'obtenus par immunisation d'un animal avec au moins un complexe binaire susmentionné, lesdits anticorps étant
susceptibles de former un complexe avec ces complexes binaires.
19. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend des anticorps selon la revendication 18, en association avec un véhicule
physiologiquement acceptable.
20. Procédé de criblage d'analogues peptidiques définis dans l'une des
revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
À incubation pendant des temps variables de quelques minutes à plusieurs jours, de l'analogue peptidique en présence de molécules du CMH, provenant de la lyse de cellules humaines ou animales, ou purifiées notamment par chromatographie d'affinité à partir de lignées cellulaires humaines ou animales, sur un support solide recouvert d'un premier anticorps, notamment monoclonal, reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison audit analogue peptidique, a addition sur le support solide précédent d'un deuxième anticorps marqué, notamment par couplage à un marqueur radioactif, enzymatique ou fluorescent, ledit anticorps marqué reconnaissant spécifiquement soit les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison à l'analogue peptidique, soit une molécule se liant elle-même spécifiquement aux molécules du CMH dans leur conformation susmentionnée, notamment la 132-microglobuline reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH de classe I, détection, après rinçage du support solide, de l'éventuelle présence du deuxième anticorps marqué resté fixé sur le support solide, évaluation de la durée de l'association entre ledit analogue peptidique
et les molécules du CMH.
21. Trousse ou kit pour la mise en oeuvre d'un procédé de criblage selon la revendication 20, comprenant: - des molécules du CMH, et/ou - des anticorps, reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison audit analogue peptidique, avantageusement fixés sur un support solide, ou fournis avec les réactifs nécessaires à leur fixation sur le support solide, et/ou - des anticorps marqués, notamment par couplage à un marqueur radioactif, enzymatique ou fluorescent, reconnaissant spécifiquement soit les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison à l'analogue peptidique, soit une molécule se liant elle-même spécifiquement aux molécules du CMH dans leur conformation susmentionnée, notamment la [2-microglobuline reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH de classe I, et/ou - un protocole pour la mise en oeuvre dudit procédé, et/ou
- un peptide de contrôle.
FR9705677A 1997-05-07 1997-05-07 Analogues peptidiques, et leurs utilisations notamment dans des compositions pharmaceutiques et pour le diagnostic Expired - Fee Related FR2763071B1 (fr)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9705677A FR2763071B1 (fr) 1997-05-07 1997-05-07 Analogues peptidiques, et leurs utilisations notamment dans des compositions pharmaceutiques et pour le diagnostic
PCT/FR1998/000923 WO1998050423A2 (fr) 1997-05-07 1998-05-07 Analogues peptidiques et leurs utilisations notamment dans des compositions pharmaceutiques et pour le diagnostic
EP98924401A EP0984985A2 (fr) 1997-05-07 1998-05-07 Analogues peptidiques et leurs utilisations notamment dans des compositions pharmaceutiques et pour le diagnostic
CA002289110A CA2289110A1 (fr) 1997-05-07 1998-05-07 Analogues peptidiques et leurs utilisations notamment dans des compositions pharmaceutiques et pour le diagnostic

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9705677A FR2763071B1 (fr) 1997-05-07 1997-05-07 Analogues peptidiques, et leurs utilisations notamment dans des compositions pharmaceutiques et pour le diagnostic

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FR2763071A1 true FR2763071A1 (fr) 1998-11-13
FR2763071B1 FR2763071B1 (fr) 2003-05-16

Family

ID=9506703

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FR9705677A Expired - Fee Related FR2763071B1 (fr) 1997-05-07 1997-05-07 Analogues peptidiques, et leurs utilisations notamment dans des compositions pharmaceutiques et pour le diagnostic

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP0984985A2 (fr)
CA (1) CA2289110A1 (fr)
FR (1) FR2763071B1 (fr)
WO (1) WO1998050423A2 (fr)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9090673B2 (en) 2003-12-12 2015-07-28 City Of Hope Synthetic conjugate of CpG DNA and T-help/CTL peptide
WO2013037804A1 (fr) * 2011-09-12 2013-03-21 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Procédé de surveillance des réponses des lymphocytes t cytotoxiques (ctl) par une réaction d'hypersensibilité de type retardée à l'aide d'épitopes viraux de ctl définis

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992002543A1 (fr) * 1990-08-01 1992-02-20 Cytel Corporation Nouveaux peptides immunosuppresseurs
WO1993004080A1 (fr) * 1991-08-26 1993-03-04 Japan Tobacco Inc. Pseudopentapeptides presentant une acivite d'immunomodulation
WO1994005311A1 (fr) * 1992-08-27 1994-03-17 Deakin Research Limited Analogues peptidiques de synthese a modifications retro, inverse ou retro-inverse
WO1995024916A1 (fr) * 1994-03-14 1995-09-21 Centre National De La Recherche Scientifique RETROPEPTIDES, ANTICORPS DIRIGES CONTRE CES DERNIERS, ET LEURS UTILISATIONS POUR LA VACCINATION ET LE DIAGNOSTIC $i(IN VITRO)
WO1996039443A1 (fr) * 1995-06-06 1996-12-12 Igen, Inc. Analogues de peptides et leur utilisation en tant qu'haptenes pour l'induction d'anticorps catalytiques

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AUPM411994A0 (en) * 1994-02-25 1994-03-24 Deakin Research Limited Epitopes
CA2188432C (fr) * 1994-04-22 2011-02-01 Yutaka Kawakami Antigenes du melanome
AU712820B2 (en) * 1996-03-19 1999-11-18 University Of Virginia Patent Foundation Peptides recognized by melanoma-specific A1-, A2- and A3-restricted cytotoxic lymphocytes, and uses therefor
ZA975858B (en) * 1996-07-11 1998-09-01 Akzo Nobel Nv Melanoma associated peptide analogues and vaccines against melanoma

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992002543A1 (fr) * 1990-08-01 1992-02-20 Cytel Corporation Nouveaux peptides immunosuppresseurs
WO1993004080A1 (fr) * 1991-08-26 1993-03-04 Japan Tobacco Inc. Pseudopentapeptides presentant une acivite d'immunomodulation
WO1994005311A1 (fr) * 1992-08-27 1994-03-17 Deakin Research Limited Analogues peptidiques de synthese a modifications retro, inverse ou retro-inverse
WO1995024916A1 (fr) * 1994-03-14 1995-09-21 Centre National De La Recherche Scientifique RETROPEPTIDES, ANTICORPS DIRIGES CONTRE CES DERNIERS, ET LEURS UTILISATIONS POUR LA VACCINATION ET LE DIAGNOSTIC $i(IN VITRO)
WO1996039443A1 (fr) * 1995-06-06 1996-12-12 Igen, Inc. Analogues de peptides et leur utilisation en tant qu'haptenes pour l'induction d'anticorps catalytiques

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BENKIRANE, NADIA ET AL: "Exploration of requirements for peptidomimetic immune recognition. Antigenic and immunogenic properties of reduced peptide bond pseudopeptide analogs of a histone hexapeptide", J. BIOL. CHEM. (1996), 271(52), 33218-33224 CODEN: JBCHA3;ISSN: 0021-9258, 1996, XP002053876 *
C.M. HILL ET AL.: "Exploration of Requirements for Peptide Binding to HLA DRB1*0101 and DRB*0401", JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 152, no. 6, 15 March 1994 (1994-03-15), BALTIMORE US, pages 2890 - 2898, XP002053879 *
GUICHARD, G. ET AL: "Synthesis and antigenic properties of reduced peptide bond pseudopeptide analogs of a histone H3 hexapeptide", PEPT. RES. (1994), 7(6), 308-21 CODEN: PEREEO;ISSN: 1040-5704, 1994, XP002053878 *
GUICHARD, GILLES ET AL: "Efficient binding of reduced peptide bond pseudopeptides to major histocompatibility complex class I molecule", J. BIOL. CHEM. (1995), 270(44), 26057-9 CODEN: JBCHA3;ISSN: 0021-9258, 1995, XP002053877 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO1998050423A2 (fr) 1998-11-12
EP0984985A2 (fr) 2000-03-15
FR2763071B1 (fr) 2003-05-16
WO1998050423A3 (fr) 1999-08-19
CA2289110A1 (fr) 1998-11-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101385805B1 (ko) 신규 펩티드 화합물
JPH06501938A (ja) ペプチドよりなるｈｉｖ複製阻害剤
EP0750508B1 (fr) RETROPEPTIDES, ANTICORPS DIRIGES CONTRE CES DERNIERS, ET LEURS UTILISATIONS POUR LA VACCINATION ET LE DIAGNOSTIC $i(IN VITRO)
FR2591227A1 (fr) Peptides capables d&#39;inhiber les interactions entre les virus lav et les lymphocytes t4, produits qui en sont derives et leurs applications
FR2830940A1 (fr) Procede de selection de ligands d&#39;hla-dp4 et ses applications
FR2763071A1 (fr) Analogues peptidiques, et leurs utilisations notamment dans des compositions pharmaceutiques et pour le diagnostic
WO2003083124A2 (fr) Epitopes peptidiques communs a des antigenes d&#39;une meme famille multigenique
EP0149581B1 (fr) Nouvelles compositions contenant des oligo-muramylpeptides et leur application, notamment pour l&#39;activation des macrophages
FR2797441A1 (fr) Derives des cyclohexane, cyclohexene, cyclohexadiene et benzene pour la preparation de ligands du recepteur du mannose
JPH11507620A (ja) 合成ペプチドおよびそれらを含有する医薬組成物
FR2855971A1 (fr) Analogues peptidiques comprenant au moins un residu aza-beta3-aminoacyle, et leurs utilisations, notamment en therapie
CA2234723A1 (fr) Production de peptides d : methodes et compositions
JPH06501961A (ja) 免疫調節活性を有するシユードペンタペプチド

Legal Events

Date Code Title Description
ST Notification of lapse

Effective date: 20090119