WO1998049334A1 - Nouveau site interne d'entree des ribosomes et vecteur le contenant - Google Patents

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WO1998049334A1
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Marcelo Lopez Lastra
Caroline Gabus-Darlix
Jean-Luc Darlix
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Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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Definitions

  • the present invention relates to the use of a nucleotide sequence derived from the 5 ′ end of genomic RNA or the proviral DNA of a reticuloendotheliosis virus as internal ribosome entry site (IRES) and / or to improve retroviral packaging. More particularly, it relates to expression vectors comprising this sequence and in particular polycistronic vectors allowing the efficient and stable expression of several genes of interest under the dependence of the same promoter.
  • the present invention finds an interesting application in the field of gene therapy vectors.
  • the vectors are obtained by deletion of at least part of the viral genes which are replaced by the genes of therapeutic interest.
  • Such vectors can be propagated in a complementation line which provides in trans the deleted viral functions to generate a viral particle defective for replication but capable of infecting a host cell.
  • retroviral vectors are among the most used, but mention may also be made of vectors derived from adenoviruses, viruses associated with adenoviruses, poxviruses and herpes viruses. This type of vectors, their organization and their mode of infection are widely described in the literature accessible to those skilled in the art.
  • the retroviral genome consists of a linear, single-stranded RNA with positive polarity.
  • the regulation sequences R and TJ5 and U3 and R present at the 5 'and 3' ends respectively, it carries three genes: gag coding for the proteins of the capsid, pol coding for the reverse transcriptase and the integrase and env coding for the proteins of the envelope.
  • the packaging signals located downstream of the U5 sequences up to the start of the coding region of the gag gene, participate in the dimerization and packaging of the viral RNA in the viral particles.
  • the 5 'end of the genome includes a cap (cap) and the 3' end is polyadenylated.
  • Retroviruses can be classified into 4 subfamilies A to D, based on their morphology. Type C includes the majority of retroviruses including the MLV (Murine Leukemia Virus) and MSV (Murine Sarcoma Virus) viruses used in most gene therapy vectors and the REV (Reticuloendotheliosis Virus) viruses from which the nucleotide sequence of the present invention.
  • ribosomes enter the messenger RNA (mRNA) through the cap located at the 5 'end of all eukaryotic mRNAs.
  • the 40S ribosomal subunits move along the RNA until they meet an appropriate AUG codon to start protein synthesis. Generally, initiation takes place at the first AUG codon. But, if this is in an unfavorable context, the 40S subunits continue until a later AUG codon situated in a better translational context (Kozak, 1984, Nucleic Acid Res. 12, 3873-3893; Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266, 19867-19870; Pain, 1996, Eur. J. Biochem. 236, 747-771).
  • Cellular mRNAs having IRES elements have also described have been those coding for the protein BIP (for Immunoglobulin heavy chain binding protein; Macejak and Sarnow, 1991, Nature 353, 90-94), certain growth factors (Teerink et al., 1995, Biochem. Biophy Acts 1264, 403-408; Vagner et al., 1995, Mol. Cell. Biol. 15, 35-44), the translation initiation factor eIF4G (Gan and Rhoads, 1996, J. Biol. Chem. 271, 623-626) and two yeast transcription factors TFIID and HAP4 (lizuka et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14, 7322-7330).
  • protein BIP for Immunoglobulin heavy chain binding protein
  • certain growth factors Teerink et al., 1995, Biochem. Biophy Acts 1264, 403-408; Vagner et al., 1995, Mol. Cell. Biol. 15, 35-44
  • IRES sites have also highlighted in murine retrotransposons of the VL30 type (Berlioz et al., 1995, J. Virol. 69, 6400-6407) and, more recently in the mRNAs coding for the gag precursor of the Friend (FMLV) and Moloney murine leukemia viruses (MoMLV) (Berlioz and Darlix, 1995, J. Virol. 69, 2214-2222; Vagner et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 20376-20383).
  • FMLV gag precursor of the Friend
  • MoMLV Moloney murine leukemia viruses
  • a new internal ribosome entry site has now been found in the 5 'non-coding region of avian reticuloendotheliosis virus (REV) RNA type A (REV-A) and shown to be effective in initiating the translation of coding sequences placed after it in a monocistronic or dicistonic manner.
  • REV avian reticuloendotheliosis virus
  • the IRES site of the present invention is particularly advantageous compared to those already described in the literature. First, it allows a high level of expression of the cistron it controls. In addition and, unexpectedly, it can also, in the context of a retroviral vector, contribute or improve, in association with an appropriate packaging region, the dimerization or packaging functions, allowing an increase in the viral titer . And finally, because of its weak homology with the murine retroviral sequences used in most gene therapy vectors intended for human use, its use considerably reduces the risk of production of viruses competent for replication.
  • the present invention relates to the use of a nucleotide sequence derived from all or part of the 5 'end of the genomic RNA of a type C retrovirus with the exception of the murine leukemia viruses of Friend (FMLV) and Moloney (MoMLV), as internal ribosome entry site (IRES) in a vector and / or to allow or improve the packaging of a retroviral vector.
  • FMLV murine leukemia viruses of Friend
  • MoMLV Moloney
  • IRS internal ribosome entry site
  • nucleotide sequence is meant a sequence composed of ribo (RNA) or deoxyribonucleotides (DNA).
  • RNA ribo
  • DNA deoxyribonucleotides
  • the 5 ′ end of the genomic RNA of a retrovirus corresponds to the 5 ′ quarter of said RNA which extends from the site of initiation of transcription (nucleotide +1) to approximately 2 kb in direction 3 '.
  • retrovirus is widely defined in basic virology works accessible to those skilled in the art and the essential characteristics have been summarized by way of indication above.
  • derivative refers to a sequence having a type C retroviral origin, but which may have undergone at least one modification with respect to the native sequence.
  • the possible modification (s) include the deletion, addition, substitution and / or mutation of one or more nucleotides (nt). Such modifications may have the aim, for example, of increasing the IRES functions, of packaging, or of introducing adequate restriction sites to facilitate the subsequent cloning steps.
  • the term "derivative" also includes the DNA equivalent of genomic RNA in a modified or unmodified form.
  • the term IRES denotes a site capable of promoting the entry of ribosomes into an RNA molecule in a manner independent of the cap.
  • the IRES function can be exercised in any vector or expression cassette.
  • a sequence used in the context of the present invention can also act as an activating element for the packaging of retroviruses or retroviral vectors by promoting the dimerization of two copies of the retroviral genome and / or the packaging of the dimer in the particles. viral.
  • said sequence is capable of exercising an IRES function and of improving the function encapsidation when introduced into an appropriate retroviral vector.
  • a nucleotide sequence as used in the context of the present invention can be isolated from the 5 ′ end of the genomic RNA or of the proviral DNA of a type C retrovirus or of any plasmid of the state of the technique carrying the retroviral fragment of interest. It goes without saying that it can be generated by any technique in use in the field of art, for example by cloning using appropriate probes, by PCR (Polymerase Chain reaction) or by chemical synthesis.
  • said sequence comprises all or part of the region which follows the U3 domain of the 5 'LTR, up to the codon AUG initiator of the gag gene.
  • nucleotides for the purposes of the present invention, it comprises at least 50 nucleotides, advantageously at least 100 nucleotides, preferably at least 200 nucleotides and preferably at least 300 nucleotides included in said 5 ′ end. But, of course, it can extend beyond in the 5 ′ or 3 ′ direction or include additional sequences.
  • said sequence comprises from 100 to 1500 nucleotides and, in particular, from 300 to 800 nucleotides.
  • a type C retrovirus which is more particularly suitable is selected from the REV viruses (Reticuloendotheliosis virus), MSV (Murine sarcoma virus) and in particular that of Moloney (MMSV), MHV (Mus hortulanus virus), MEV (Mouse endogenous retrovirus) , FMOV (FBR murine osteosarcoma virus), AMLV (AKV murine leukemia virus), MEELV (Mouse endogenous ecotropic murine leukemia virus), SFFV (Friend spleen focus-forming virus), RAS V (rat sarcoma virus), FLV (Feline leukemia virus ), FSV (feline sarcoma virus), EFLV (Cat endogenous proviral feline leukemia virus), SSV (Simian sarcoma virus), GALV (Gibbon ape leukemia virus) and
  • a nucleotide sequence in use in the present invention derives from all or part of the 5 'end of the genomic RNA of a reticuloendotheliosis virus (REV).
  • the REV viruses include in particular different subtypes A, B and T as well as the DIAV viruses (Duck infectious anemia virus), SNV (spleen necrosis virus) and CSV (Chick syncytial virus) (see for example Encyclopedia of Virology, 1994, Enrietto , Reticuloendotheliosis viruses, p 1227-1232 Ed. R. Webster and A. Granoff, Académie Press, Hartourt Brace ⁇ Company Publishers).
  • a REV virus which is very particularly suitable is the avian reticuloendotheliosis virus, in particular that of type A (REV-A).
  • nucleotide sequence comprising at least 100 nucleotides and at most 800 nucleotides (nt) of the 5 ′ non-coding end of the REV-A virus and more particularly a substantially homologous or identical nucleotide sequence to all or part of the sequence presented in the sequence identifier SEQ ID NO: 1.
  • substantially homologous refers to a degree of homology greater than 70%, advantageously greater than 80%, preferably greater than 90% and, most preferably, greater than 95%.
  • said nucleotide sequence may have a sequence slightly different from that described in SEQ ID NO: 1 or 2, provided, however, that the modification or modifications does not affect its IRES functions and / or packaging.
  • the nucleotide sequence used in the context of the present invention is identical to the sequence presented in the sequence identifier SEQ ID NO: 2: (i) starting at nucleotide 1 and ending at nucleotide 578, (ii) starting at nucleotide 265 and ending at nucleotide 578, or
  • the IRES function of said nucleotide sequence is particularly advantageous in a context poor in magnesium ion, for example in a cellular context.
  • a high concentration of Mg 2+ ions can decrease the efficiency of sequence-mediated translation initiation.
  • a nucleotide sequence in use in the present invention is more particularly intended to be integrated into a vector for the transfer and expression of one or more gene (s) of interest.
  • the choice of such a vector is wide and the techniques of cloning into the selected vector are within the reach of those skilled in the art.
  • adenovirus adenovirus
  • baculovirus herpes virus
  • virus associated with an adenovirus or retrovirus Such vectors are widely described in the literature.
  • adenoviral vector it can be derived from a human (preferably type 2 or 5), animal (preferably canine or bovine) adenovirus or a hybrid between various species.
  • the general technology for adenoviruses is disclosed in Graham and Prevec (1991,
  • said nucleotide sequence is preferably positioned upstream of a gene of interest to improve the translation of the expression product for which it codes.
  • It can be implemented in an expression cassette of the monocistronic type (for the expression of a gene of interest placed under the control of a promoter) or polycistronic (for the expression of at least two genes d 'interest placed under the control of the same promoter).
  • the latter can contain several elements in tandem "IRES site-gene of interest" of which at least one of the IRES sites consists of a nucleotide sequence as defined above.
  • Particularly preferred is the use in a dicistronic cassette either upstream of the first gene of interest or upstream of the second, the latter variant being the preferred.
  • a vector according to the invention comprises several expression cassettes, these can be inserted in any orientation relative to each other, either in the same orientation (promoter acting in the same direction) or in reverse orientation ( promoter acting in an opposite orientation).
  • a vector according to the invention can comprise several nucleotide sequences in use according to the invention. In this case, it is preferable that they are derived from different type C retroviruses.
  • a vector according to the invention derives from a retrovirus.
  • retroviruses such as avian erythroblastosis virus (AEV), avian leukemia virus (AVL), avian sarcoma virus (ASV), necrosis virus of spleen (SNV) and Rous sarcoma virus (RSV), bovine retroviruses, feline retroviruses (FLV, FSV ....), murine retroviruses such as murine leukemia virus (MuLV), the virus Friend's (FMLV) and murine sarcoma virus (MSV) and primate retroviruses (GALV, FSV, BAEV ).
  • AEV avian erythroblastosis virus
  • AEV avian leukemia virus
  • ASV avian sarcoma virus
  • SNV necrosis virus of spleen
  • RSV Rous sarcoma virus
  • bovine retroviruses bovine retroviruses
  • retroviral vectors which can be envisaged for the purposes of the present invention comprise at least the following elements which are operatively associated: a 5 'LTR and a 3' LTR retroviral, one or more gene (s) of interest, and the nucleotide sequence use in the context of the present invention to allow or improve the packaging of said vector in a viral particle and / or as an IRES site to allow or promote the expression of a gene of interest positioned downstream of said nucleotide sequence.
  • the retroviral 5 'LTR can be used as a promoter, but an internal promoter can also be used.
  • the 5 ′ and possibly 3 ′ LTR may have the same retroviral origin (for example REV) as the nucleotide sequence or a different origin.
  • a monocistronic vector will comprise from 5 'to 3' a 5 'LTR, the nucleotide sequence, a gene of interest and a 3' LTR.
  • a retroviral vector according to the invention can also comprise a conventional (E +) packaging region.
  • E + conventional packaging region
  • the presence of the latter is not required when the nucleotide sequence in use in the present invention can alone exercise the packaging function.
  • the retroviral LTR 5 ′ derives from a REV virus and, preferably from SNV, and the nucleotide sequence is substantially homologous or identical to the sequence presented in SEQ ID NO: 2, starting at nt 1 and ending at nt 578 or starting at nt 265 and ending at nt 578.
  • a retroviral vector according to the invention comprises at least: (a) a 5 'retroviral LTR,
  • the retroviral vector according to the invention comprises an expression cassette directed by an internal promoter region
  • Other elements can also be included, for example another IRES site and another gene of interest or another expression cassette.
  • a preferred retroviral vector according to the invention comprises an encapsidation region deriving from a murine retrovirus, in particular from a MoMLV, or from a VL30 type retrotransposon and an IRES site comprising a nucleotide sequence substantially homologous or identical to the sequence presented in the sequence identifier SEQ ID NO: 2:
  • the packaging region derives from a MoMLV and the IRES site consists of a nucleotide sequence identical to the sequence presented in SEQ ID NO: 2 starting at nucleotide 265 and ending at nucleotide 578 or starting at nucleotide 452 and ending at nucleotide 578.
  • the packaging region derives from a MoMLV
  • the IRES site consists of a nucleotide sequence identical to the sequence presented in SEQ ID NO: 2 starting at nucleotide 265 and ending at nucleotide
  • a gene of interest in use in the invention can be obtained from a eukaryotic or prokaryotic organism or from a virus by any conventional molecular biology technique. It can code for a polypeptide corresponding to a native protein as found in nature homologous to the host cell or not, a protein fragment, a chimeric protein originating from the fusion of polypeptides of various origins or a mutant with improved and / or modified biological properties. Such a mutant can be generated by substitution, deletion and / or addition of one or more amino acid residues.
  • polypeptide can be (i) intracellular (ii) membrane present on the surface of the host cell or else (iii) secreted outside the host cell and therefore comprise appropriate additional elements, such as a sequence coding for a signal of secretion or a transmembrane anchoring region.
  • a vector according to the invention is particularly intended for the prevention or treatment of cystic fibrosis, hemophilia A or B, Duchenne or Becker's myopathy, cancer, AIDS, cardiovascular diseases (restenosis, arteriosclerosis, ischemia %) and other infectious diseases due to a pathogenic organism: virus, bacteria, parasite or prion.
  • genes of interest which can be used in the present invention are those which code for the following proteins: a cytokine and in particular an interleukin (IL-2, IL-7, IL-10, IL-12 ...), an interferon, a tissue necrosis factor and a growth factor and in particular hematopoietic (G-CSF, GM-CSF), a factor or cofactor involved in coagulation and in particular factor VIII, factor IX, von Willebrand factor, antithrombin III , protein C, thrombin and hirudin, an enzyme and in particular trypsin, a ribonuclease, alkaline phosphatase (plap) and ⁇ -galactosidase, an enzyme inhibitor such as ⁇ l-antitrypsin and inhibitors of viral proteases an expression product of a suicide gene such as thymidine kinase of the HSV virus (herpes virus) type 1, that of the fiirl gene and / or fcy
  • adenosine diaminose glucocerebrosidase and phenylhydroxylase
  • a protein capable of inhibiting the initiation or progression of cancers such as the expression products of tumor suppressor genes, for example the p53, p73 and Rb genes, a protein capable of stimulating an immune response, an antibody, the antigens of the major histocompatibility complex or an immunotoxin
  • a protein capable of inhibiting a viral infection or its development for example the antigenic epitopes of the virus in question or altered variants of viral proteins likely to compete with native viral proteins, a cellular or nuclear receptor or one of their ligands, a growth factor (FGF for Fibroblast Growth Factor, VEGF for Vascular Endothelial cell Growth Factor ...), and a apoptosis inducer (Bax %), an apoptosis inhibitor (Bcl2, BclX %), a cytostatic agent (p21, pl6, Rb %), a n
  • a use in gene of interest in the present invention may also encode a selectable marker to select or identify the transfected host cell with a vector according to the invention.
  • neo gene neomycin
  • dhjr gene dihydrofolate reductase
  • CAT gene Chloramphenicol Acetyl Transferase
  • gpt gene xanthine phosphoribosyl
  • a functional promoter in the host cell considered and, preferably, a human cell.
  • the choice of promoter is very wide and within the reach of those skilled in the art. It may be a promoter naturally governing the expression of a gene of interest in use in the present invention or any other promoter of any origin. Furthermore, it can be constitutive or regulable in nature, in particular in response to certain tissue-specific or event-specific cellular signals. For example, it may be advantageous to target the expression of the gene of interest at the level of lymphocyte cells in the context of AIDS, of lung cells in the context of cystic fibrosis or of muscle cells in the context of myopathies.
  • the promoters suitable for the present invention can be chosen from promoters SV40 (Simian 40 virus), CMV (Cytomegalovirus), HMG (Hydroxymethyl-Glutaryl Coenzyme A), TK (Thymidine kinase), Retroviral LTRs such as that of MoMLV, RSV or MSV when a retroviral vector, the adenoviral El A and late MLP (Major Late Promotor) promoters are used, in particular in the context of an adenoviral vector, the 7.5K promoters, H5R, pKlL, p28 and pi 1 intended for poxviral vectors like the vaccinia virus, the promoter PGK (Phosphoglycero kinase), the liver-specific promoters of the genes coding for the alpha-antitrypsin, factor IX, albumin and transferrin, the promoters of the immunoglobulin genes which allow expression in lymphocytes,
  • Muc-1 gene promoters overexpressed in breast and prostate cancers can be mentioned in particular (Chen et al., 1995, J. Clin. Invest. 96, 2775-2782), CEA (for carcinoma embryonic antigen) overexpressed in colon cancer (Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 2738-2748), tyrosinase overexpressed in melanomas (Vile et al ., 1993, Cancer Res.
  • ERB-2 overexpressed in breast and pancreatic cancers (Harris et al., 1994, Gene Therapy 1, 170-175), ⁇ -fetoprotein overexpressed in cancers liver (Kanai et al., 1997, Cancer Res. 57, 461-465), APC overexpressed in colorectal cancers, BRCA-1 and 2 (Wooster et al., 1995, Nature 378, 789-792) overexpressed in ovarian cancer and PSA (for prostate specifies antigen) overexpressed in prostate cancer.
  • the gene of interest in use in the present invention may comprise other sequences improving its expression, both at the level of transcription and of translation; for example an enhancer-type transcription activating sequence, an intronic sequence, a transcription termination signal (polyA) and, as indicated above, a secretion signal or a transmembrane region.
  • an enhancer-type transcription activating sequence for example an enhancingr-type transcription activating sequence, an intronic sequence, a transcription termination signal (polyA) and, as indicated above, a secretion signal or a transmembrane region.
  • polyA transcription termination signal
  • the invention also covers the viral particles generated from a viral vector according to the invention. This is generally done by transfection of the latter into a suitable cell line. If the viral vector used is defective for replication, a complementation line will be used. In general, a person skilled in the art knows the lines that can be used to generate infectious viral particles as well as the process to be implemented according to the vector used.
  • adenoviral vector use may be made of line 293 (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36, 59-72). Being a retroviral vector, one can consider using ecotropic cell lines, such as the CRE line (Danos and Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 6460-6464) or GP + E-86 (Markowitz et al., 1988, J. Virol., 62, 1120-1124). However, it is particularly preferred to use an amphotropic complementation line such as the PG13 line (Miller et al., 1991, J.
  • infectious viral particles are recovered in the culture supernatant of the transfected complementation cells.
  • the invention also extends to cells comprising a vector according to the invention or infected with infectious viral particles according to the invention.
  • the transfection methods are well known to those skilled in the art. Mention may be made of the calcium phosphate precipitation technique, that of DEAE dextran, microinjection or encapsulation in lipid vehicles.
  • the vectors according to the invention can be present in the host cell in a form integrated into the cell genome or in the form of episomes both in the nucleus and in the cytoplasm.
  • the cell according to the invention is advantageously a eukaryotic cell, in particular a mammalian cell and, preferably, a human cell.
  • It can be a primary or tumor cell of hematopoietic origin (totipotent stem cell, leukocyte, lymphocyte, monocyte, macrophage ...), hepatic, epithelial, fibroblast, of the central nervous system and, in particular, d '' a muscle cell (myoblast, myocyte, satellite cell, smooth muscle ...), cardiac, vascular, tracheal, pulmonary or central nervous system.
  • totipotent stem cell leukocyte, lymphocyte, monocyte, macrophage
  • hepatic epithelial
  • fibroblast of the central nervous system
  • d '' a muscle cell myoblast, myocyte, satellite cell, smooth muscle
  • cardiac vascular, tracheal, pulmonary or central nervous system.
  • the present invention also relates to the therapeutic use of a vector, a viral particle or a cell according to the invention, for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment and / or prevention of a disease.
  • treatable by gene therapy including a genetic disease, an acquired disease such as cancer or an infectious disease.
  • a vector according to the invention can be used for other purposes such as the recombinant production in prokaryotic or eukaryotic cells of expression product (s) encoded by at least one of the genes of interest.
  • expression product s
  • the coexpression of an antibiotic resistance gene as a second cistron can make it possible to increase the expression of a first cistron.
  • mice can be mice, rats, rabbits, fish, primates or farm animals (cattle, sheep, pigs ”).
  • the techniques for generating these transgenic animals are known.
  • the polypeptide of interest can be recovered in a conventional manner, for example in the biological fluids (blood, milk, etc.) of the animal.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, as therapeutic or prophylactic agent, a vector, a viral particle or a cell according to the invention or a polypeptide of interest obtained in accordance with the use according to the invention, in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can be manufactured in a conventional manner.
  • a therapeutically effective amount of such an agent is combined with an acceptable carrier, diluent or adjuvant. It can be administered according to any route of administration and this in a single or repeated dose after a certain time interval.
  • intravenous, intramuscular, intrapulmonary (possibly aerosolized) or intratumoral administration is preferred.
  • the amount to be administered will be chosen according to different criteria, in particular the use as treatment or vaccine, the route of administration, the patient, the type of disease to be treated and its state of evolution, the duration of treatment, the vector retained ... etc.
  • a pharmaceutical composition according to the invention comprises between 10 4 and 10 14 pfu (unit forming plaques), advantageously between 10 5 and 10 13 pfu and, preferably, between 10 6 and 10 "pfu of viral particles.
  • a vector-based composition can be formulated as doses comprising from 0.01 to 100 mg of DNA, preferably from 0.05 to 10 mg and, most preferably, from 0.1 to 5
  • the formulation can also include, alone or in combination, a pharmaceutically acceptable diluent, adjuvant or excipient, as well as a solubilizing, stabilizing or preserving agent. single or in multiple doses in liquid or dry form (lyophilisate ...) capable of being reconstituted extamporanally with an appropriate diluent.
  • the invention relates to a method of treatment of genetic diseases, cancers and infectious diseases according to which a therapeutically effective amount of a vector, a viral particle or a cell according to the invention is administered to a patient having need such treatment.
  • a therapeutically effective amount of a vector, a viral particle or a cell according to the invention is administered to a patient having need such treatment.
  • they can be administered directly in vivo, for example by intravenous, intramuscular, intratumoral injection or by aerosolization in the lungs.
  • an ex vivo gene therapy protocol which consists in removing the cells from a patient (stem cells from the bone marrow, peripheral blood lymphocytes, etc.), transfecting them with a vector according to the invention and cultivating them in vitro before re-implanting them in the patient.
  • the invention relates to the use of a vector, a viral particle or a pharmaceutical composition according to the invention for the transfection or infection of pluripotent cells, in particular pluripotent cells of the central nervous system.
  • Figure 1 is a schematic representation of the monocistronic plasmids used as templates for the in vitro synthesis of capped and non-capped RNAs. They contain the early cytomegalovirus (Po CMV) promoter usable for expression in vivo, the promoter of the gene coding for phage T7 RNA polymerase (Po T7) usable for in vitro experiments, different portions of the 5 end '' untranslated (leader) of the REV-A virus (1 to 578 for pREV CB-95, 578 to 1 for pREV CG-53, 1 to 578 deleted from nt 268 to 452 for pREV CG-54, 265 to 578 for pREV CG-55 and 452 to 578 for pREV CG-56) and the LacZ gene ( ⁇ LacZ) coding for a truncated ⁇ -galactosidase at the C-terminal end with a
  • FIG. 2 is a schematic representation of the dicistronic plasmids used as templates for the in vitro synthesis of capped and uncapped RNA. They contain the early cytomegalovirus promoter (Po CMV) usable for expression in vivo, the promoter of the gene coding for phage T7 RNA polymerase (Po T7) usable for in vitro experiments, the neo gene, different portions of the 5 'untranslated end (leader) of the REV-A virus (1 to 578 for pREV CB-54, 578 to 1 for pREV CG-50, 1 to 578 deleted from nt 268 to 452 for pREV CG-52, 265 to 578 for pREV CB-55 and 452 to 578 for pREV CG-58) and the LacZ gene ( ⁇ LacZ) coding for a truncated ⁇ -galactosidase at the C-terminal end with a molecular mass of approximately
  • Figure 3A is a schematic representation of the dicistronic retroviral vectors having two elements of different retroviral origin, as IRES and packaging region (E) and two genes of interest such as the reporter genes coding for phosphatase alkaline placenta and neo coding for neomycin phosphotransferase.
  • VL30E + corresponds to the 5 'untranslated region of HaMSV and MoMLV E + corresponds to the packaging region of MoMLV.
  • FIG. 4 illustrates the effect of rapamycin on the activities A) alkaline phosphatase and B) neomycin phosphotransferase produced in GP + E-86 cells not transfected or stably transfected by the different vectors pREV HW or pEMCV-CBTV (pCBlOO ) and treated with rapamycin (full boxes) or not treated (control, dotted boxes).
  • Figure 5 illustrates the optimization of the transduction protocol applied to Dev neuroectodermal cells. The percentage of Dev cells transduced by the pEMCV-CBTV (IRES EMCV) and pREV HW-3 viruses (IRES REV-A) is determined by flow cytometry.
  • EXAMPLE 1 Identification of an IRES site at the 5 ′ end of the REV-A RNA.
  • the DNA fragments corresponding to sequences 1 to 578, 265 to 578 and 452 to 578 of the REV-A RNA are isolated by PCR from the pREVSC-1 template (Darlix et al., 1992, J. Virol. 66, 7245-7252). Appropriate primers are used that a person skilled in the art can design, provided at their ends with a Mzel site. After digestion with this enzyme, the PCR fragments are inserted upstream of the LacZ gene in the vector pEMCV-M260-837 (Berlioz et al., 1995, J. Virol. 69, 6400-6407) previously cleaved by Nhel.
  • the LacZ gene used codes for a truncated ⁇ -galactosidase product at the C-terminal end.
  • the monocistronic plasmids pREV CB-95 (1-578), pREV CG-55 (265-578) and pREV CG-56 (452-578) are obtained, illustrated in Figure 1.
  • the dicistronic plasmids pREV CB-54 (1- 578), pREV CB-55 (265-578) and pREV CG-58 (452-578) are shown in Figure 2 and result from the insertion of the previous PCR fragments between the neo and LacZ genes of pEMCV-D260-837 (pCBlOl) (Berlioz et al., 1995, J. Virol. 69, 6400-6407) also subjected to digestion with Nhel.
  • Amplification of nt 1 to 578 deleted from sequences 268 to 452 is carried out using the vector pREVSC-1 previously digested with Kpnl and S ⁇ , treated with the Klenow fragment of AD de polymerase from E. coli and religious.
  • the amplified fragment digested by Mzel is cloned in pEMCV-M260-837 upstream of the LacZ gene or between the neo and LacZ genes of pEMCV-D260-837, the two vectors having been digested with Mzel, to give respectively pREV CG-54 (Fig 1) and pREV CG-52 (Fig 2).
  • monistristrum control plasmids pREV CG-53 (Fig 1) and dicistronic pREV CG-50 (Fig 2) were constructed by introduction of the PCR fragment carrying the sequences REV-A l to 578 in the previous vectors in reverse orientation (578- 1).
  • the initiation of the translation of ⁇ -galactosidase is under the control of the AUG codon of the gag gene of REV-A located at position 574-576, while in the control plasmids, the synthesis of ⁇ -galactosidase depends on an AUG placed in a favorable Kozak context introduced by PCR.
  • RNAs are synthesized from 1 ⁇ g of plasmid DNA linearized by Sspl (position 1240 in the LacZ gene) using T7 RNA polymerase (mMessage mMachine or MAXIscript, Ambion) in a reaction volume 20 ⁇ l according to the protocol indicated by the supplier. Transcription is stopped by treatment of the DNA matrix with the enzyme DNasel followed by precipitation of the RNAs in the presence of lithium chloride. The RNAs are taken up in 50 ⁇ l of TE buffer (10 mM Tris-HCl pH7.5, EDTA ImM) before being purified and desalted by passage through an S-300 MicroSpin TM column (Pharmacia BioTech) according to the supplier's instructions.
  • TE buffer 10 mM Tris-HCl pH7.5, EDTA ImM
  • RNA luciferase is tested in same reaction conditions (positive control).
  • the samples are heat denatured in 62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% sodium dodecyl sulphate (SDS), 10% glycerol, 5% ⁇ -mercaptoethanol and 0.02% bromophenol blue and the labeled proteins analyzed by electrophoresis on polyacrylamide gel 12% (weight / vol), 0.2% SDS.
  • SDS sodium dodecyl sulphate
  • the neo gene product and ⁇ -galactosidase migrate at a molecular mass of approximately 28 and 46 kDa respectively.
  • the efficiency of the cap-dependent and independent translation is quantified by CT scan (Phospho-Image ⁇ r Storm 840, version 4.00, Molecular Dynamics; Image Quant TM version 1.1, Molecular Dynamics).
  • the intensity of the labeling of the expression product of the second cistron ( ⁇ -galactosidase) whose translation is mediated by PIRES is evaluated after standardization of the level of expression of the neo product.
  • RNAs obtained from the monocistronic plasmids pREV CB-95, pREV CG-53, pREV CG-54, pREV CG-55 and pREV CG-56 is as efficient as that of the capped RNAs.
  • the amount of ⁇ -galactosidase generated from the plasmid pREV CG-53 in which the REV-A sequences (1 to 578) are in antisense orientation is much lower than that obtained with the constructions using a REV sequence -A in sense orientation.
  • Table 1 Report of gene expression in the presence and absence of FMDV protease L.
  • FIG. 3 illustrates the vectors of the pREV HW series having LTRs of MoMLV type and the control vectors used in the experiments described below. Although these are not represented, vectors designated pMC have also been constructed which differ from pREV HW only in that their LTRs are of SNV origin and negative controls in which the REV-A sequences are positioned in orientation reverse (3 '-> 5') compared to LTRs. For all the molecular biology stages, these vectors are introduced into the plasmid pBR322.
  • the control vector pEMCV-CBTV (pBC100) is a dicistronic vector comprising, in addition to the LTRs and the packaging region derived from MoMLV, the gene coding for placental alkaline phosphatase (plap), the translation of which is cap-dependent and the gene neo. whose translation is site dependent
  • pREV HW-1 the REV-A fragment extending from nt 265 to 578 generated by PCR and digested with zel is cloned between the plap and neo genes of pMLV-CB71 (Berlioz and Darlix, 1995, J. Virol. 69, 2214-2222).
  • pREV HW-2 the EcoRI fragment of pVL CBT5 (Torrent et al., 1996, Human Gene Therapy 7, 603-611) carrying the LTR 5 ′ MoMLV and the packaging sequences of VL30 is introduced into the vector pR ⁇ V HW- 1 linearized by EcoRI.
  • pR ⁇ V HW-3 the EcoRI fragment from p ⁇ MCV-CBTV containing the 5 'LTR and the packaging sequences of MoMLV is inserted into the vector pR ⁇ V HW-1 linearized by EcoRI.
  • pR ⁇ V HW-4 the R ⁇ V-A fragment extending from nt 452 to 578 generated by PCR and digested with Nftel is cloned between the plap and neo genes of pMLV-CB71.
  • pR ⁇ V HW-5 the EcoRI fragment of pVL CBT5 carrying the LTR 5 ′ MoMLV and the packaging sequences of VL30 is introduced into the vector pR ⁇ V HW-4 linearized by EcoRI.
  • pR ⁇ V HW-6 the EcoRI fragment from p ⁇ MCV-CBTV containing the 5 'LTR and the MoMLV packaging sequences is inserted into the vector pR ⁇ V HW-4 linearized by EcoRI.
  • the pMC series vectors are obtained according to the following construction scheme:
  • the S ⁇ V LTRs are generated by PCR from the plasmid R ⁇ V-A 2-20-6 (O'Rear and Temin, 1982, Proc. ⁇ atl. Acad. Sci USA 79, 1230-1234; Darlix et al., 1992, J. Virol. 66, 7245-7252).
  • the neo gene is isolated from pMLV-CB71 by digestion with Sali and BamHI then introduced between the same sites of the vector pUC19 (Gibco BRL).
  • the 5 'LTR of S ⁇ V (nt 1 to 861) is digested with H di ⁇ and Sali, and inserted into pUC19-neo previously cleaved by these same enzymes.
  • the LTR 3 'S ⁇ V (nt 7230-8300) digested with Sm ⁇ l and EcoRI is cloned in the preceding vector to give pCG-61 containing LTR 5' S ⁇ V-neo-LTR 3 'S ⁇ V.
  • a vector designated pCG-62 is generated which differs from the previous one by deleting the env sequences (nt 7230-7691) obtained by BglR-AvrTl, Klenow treatment and religation.
  • the plap gene isolated from the clone Cla-12AP (DGoff) is introduced between the EcoRI and Xbal sites of a bluescript plasmid previously deleted from the Sali site (EcoRI-.X7zoI digestion) before being re-isolated in the form of a Kpnl-SaR fragment and cloned between the same pCG-61 sites and pCG-62, to give pCG-63 and pCG-64 respectively.
  • the LacZ gene is obtained by partial digestion of pR ⁇ V CB-95 with the enzymes Sali and Bam ⁇ l. Its insertion between the SalI and BamUl sites of pCG-61 and pCG-62 gives rise to pCG-65 and pCG-66 respectively.
  • LTR-Gene-LTR block is isolated from each plasmid pCG-62, pCG-64 and pCG-66 by H dlII-EcoRI digestion to be inserted into the vector pBR322 cleaved by these same enzymes. PMCl, pMC2 and pMC3 are generated.
  • the GP + ⁇ -86 ecotropic complementation line (Markowitz et al., 1988, J. Virol., 62, 1120-1124) and the NI ⁇ 3T3 target cells (mouse fibroblastic cells) available at TATCC, are cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 in DM ⁇ M medium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco BRL) supplemented with 10% newborn calf serum.
  • DM ⁇ M medium Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco BRL
  • GP + ⁇ -86 helper cells and NIH3T3 target cells are cultured the day before transfection and infection. Viral infections are carried out according to the conventional protocol described in the literature.
  • the viral supernatants were filtered (on 0.45 ⁇ m filters) and placed in the presence of polybrene to a final concentration of 8 ⁇ g / ml.
  • the infection is continued overnight at 37 ° C. and the following day, the cells are washed and cultured in fresh medium. After 48 h, the cells are placed in a selective medium (1 mg / ml of G418) or stained to determine the number of cells expressing the alkaline phosphatase plap.
  • fixing is carried out in PBSxl buffer containing 2% formaldehyde and 0.2% glutaraldehyde.
  • the cells are washed twice in AP buffer (0.1 M Tris-HCl pH 9.5, 0.1 M NaCl, 50 mM MgCl 2 in PBSxl) and placed for 5 h in the staining solution (0.1 mg / ml of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP), 1 mg / ml of a terazolium salt of Nitroblue (NBT) and 1 mM Levamisol in buffer AP).
  • AP buffer 0.1 M Tris-HCl pH 9.5, 0.1 M NaCl, 50 mM MgCl 2 in PBSxl
  • the staining solution 0.1 mg / ml of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP), 1 mg / ml of a terazolium salt of Nitroblue (NBT) and 1 mM Levamisol in buffer AP.
  • the titer of the recombinant viruses is determined after transfection of the GP + E-86 ecotropic cells. After two days of incubation, the viral supernatant is harvested and used to determine the viral titer (transient expression). Then, the transfected cells are selected with G418 for one month. After this selection, the viral titer is determined on the harvested supernatant (stable expression). This corresponds to the number of infectious particles per ml of supernatant.
  • the pREV HW-1 and pREV HW-4 vectors lacking a conventional packaging region are incapable of producing infectious viral particles after transfection into the MLV helper line (GP + E-86).
  • the vector pMC1 can be packaged in SNV viral particles after transfection of the helper line SNV D17-C3A2 (for example ATCC CRL8468), indicating that the REV-A sequences extending from nt 265 to 578 can be used in this context as an encapsidation region.
  • Retroviral vectors comprising both a REV-A sequence (265-578 or 452-578) and a conventional packaging region produce high titer viral particles (pREV HW-2, 3, 5 and 6).
  • the association with the packaging region of MLV proves to be particularly advantageous since it gives viral titers 2 (pREV HW-6) to 5 times (pREV HW-3) higher than the reference vector pEMCV-CBTV combining this same encapsidation region and TIRES EMCV.
  • the comparison of the data obtained with the identical vectors varying only at the level of the REV-A segment used suggests that the sequence ranging from nt 265 to 578 is capable of cooperating with the packaging region and thus improving the packaging of viral RNAs and consequently the viral titers.
  • An element interacting positively with packaging could be present between nt 452 and 265 in the REV-A genome.
  • the morphology of the recombinant pREV HW virions produced after transfection of the GP + E-86 line with the corresponding vectors is analyzed by electron microcopying.
  • the viruses obtained from pEMCV-CBTV under the same conditions are used as controls and the wild retroviruses obtained after infection of the NIH3T3 cells with the FMLV-29 strain (Friend murine leukemia virus strain 29). Microscopy results indicate that the RNA content does not affect the morphology of the recombinant viruses.
  • GP + E-86 cells are stably transfected with 20 ⁇ g of vectors of the pREV HW or pEMCV-CBTV series and cultured under selective conditions (G418) for 15 days. At 70 to 80% confluence, they are brought into the presence of rapamycin at a final concentration of 20 ng / ml. The latter has an inhibitory effect on cap-dependent translation varying from 15 to 40% depending on the cell line (Beretta et al., 1996, EMBO J. 15, 658-664) but does not affect cap-independent translation. Cell extracts are conventionally prepared after 20 h of incubation.
  • the cells are washed twice in PBSxl, placed in 1 ml of TEN (40 mM Tris-HCl pH7.5, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl) for a 10 cm dish then recovered by scraping and centrifuged on low speed.
  • the pellet is taken up in 100 ⁇ l of 0.25 M Tris-HCl, pH8 and subjected to cell lysis by 3 freeze-thaw cycles. After centrifugation for 10 min at 14,000 g, the supernatant is recovered and can be stored at -70 ° C while waiting for the enzymatic tests.
  • the final protein concentration is determined by the Micro BCA test (Pierce).
  • the plap enzymatic activity of the cell extracts is evaluated spectrophotometrically (alkaline phosphatase kit, BIORAD).
  • the plap units are determined in relation to a standard consisting of alkaline phosphatase from calf intestine (Boehringer Mannheim).
  • the neo activities are measured by the transfer of phosphate labeled with [ ⁇ - 32 P] on neomycin (Ramesh and Osborne, 1991, Anal. Biochem. 193, 316-318).
  • the results of the expression of the plap and neo genes measured in the absence and in the presence of rapamycin are illustrated in FIG. 4 and presented in Table 3.
  • Table 3 effect of rapamycin on the expression of plap and neo cistrons expressed in% relative to untreated cells.
  • rapamycin reduces the cap-dependent translation and increases that dependent on TIRES. This stimulation can be explained by less competition for the translational machinery in the presence of rapamycin.
  • the addition of rapamycin is accompanied by an increase in the expression of the two genes.
  • quantitative expression data indicate that the relative activity of IRES is different, suggesting a competition between them for ribosomes.
  • Dev cell line which constitutes a cellular model of the central nervous system, a potential target for human gene therapy.
  • Dev cells are derived from a human primary tumor of neuroectodermal origin (PNET) and behave like pluripotent stem cells (Derrington et al., 1997, Oncogene, in press). Moreover, it is possible to induce their differentiation either into neurons or into glial cells (Derrington et al., 1997, supra; Dufay et al., 1994, Eur. J. Neurosci. 6, 1633-1640; Giraudon et al ., 1993, Neurosci. 52, 1069-1079).
  • the dicistronic vector pREV HW-3 (IRES REV-A 265-578) is compared with the control vector pEMCV CBTV (IRES EMCV).
  • the Dev cells are infected with a 1/100 dilution of viral supernatant for 2 days then fixed, histochemically stained according to the above protocol and counted.
  • the viral titer is similar for the two vectors and of the order of 3 ⁇ 10 3 TU / ml.
  • the transduction units (TU / ml) correspond to the ratio of the number of colonies x dilution of the infecting retrovirus by the total volume (ml) of the diluted vector placed on the cells.
  • the target cells are as previously transduced with a 1/100 dilution of viral supernatant and selected in the presence of G418 for 3 weeks.
  • the intensity of the fluorescence is determined by flow cytometry with an antibody specific for the plap (DAKO). It is indicated that a polyclonal antibody is suitable.
  • the results show the production of the enzyme plap by cells transduced and selected with G418. In parallel, the synthesis of the enzyme plap is confirmed by histochemical staining of the resistant clones.
  • Variants are the cell culture conditions in the presence or absence of serum and the presence or absence of growth factors (FGF-2) and the production of viruses in the presence or absence of serum.
  • FGF-2 growth factors
  • Protocol 1 cells cultured in medium with serum (10%), virus produced in the presence of serum (10%).
  • Protocol 2 cells cultured in medium with serum (10%), virus produced in the absence of serum.
  • Protocol 3 cells cultured in serum-free medium, virus produced in the presence of serum (10%).
  • Protocol 4 cells cultured in serum-free medium, virus produced in the absence of serum.
  • Protocol 5 cells cultured in serum-free medium, virus produced in the presence of serum (10%), presence of FGF-2.
  • Protocol 6 cells cultured in serum-free medium, virus produced in the absence of serum, presence of FGF-2.
  • the percentage of Dev cells transduced is determined by flow cytometry ( Figure 5). The percentage of cells transduced by pREV HW-3 exceeds 30% when the culture of Dev cells is carried out in the absence of serum. Such a% is not reached with the conventional virus pEMCV CBTV. The addition of growth factors is also advantageous. Among all the protocols used, protocol 5 allows more than 50% of Dev cells to be transduced.
  • the expression of plap and neo cistrons is evaluated after neuronal and glial differentiation (Derrington et al., 1997, supra). Briefly, the Dev cells adopt a differentiated phenotype in the presence of serum and FGF-2 whereas when the culture is carried out in the absence of serum, the phenotype is pluripotent. Immunofluorescence results with a specific anti-plap antibody on transduced Dev cells, selected with G418 and differentiated show expression of the plap in neuronal and glial cells. These data suggest that the state of differentiation does not inhibit TIRES REV-A mediated translation.
  • TYPE OF MOLECULE RNA (genomics)
  • HYPOTHETIC NO
  • ANTI-SENSE NO
  • ORGANISM Reticuloendotheliosis virus
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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'une séquence nucléotidique dérivée de tout ou partie de l'extrémité 5' de l'ARN génomique d'un rétrovirus de type C à l'exception des virus de la leucémie murine de Friend (FMLV) et de Moloney (MoMLV) à titre de site interne d'entrée des ribosomes ou d'élément permettant ou améliorant l'encapsidation de vecteurs rétroviraux. Elle a également pour objet un vecteur comprenant ladite séquence nucléotidique, une particule virale générée à partir de ce vecteur, une cellule comprenant ce vecteur ou infectée par la particule virale, leur utilisation thérapeutique ainsi qu'une composition pharmaceutique les comprenant. Enfin, elle a trait à l'utilisation d'un vecteur, d'une particule virale ou d'une composition pharmaceutique pour la transfection ou l'infection de cellules pluripotentes.

Description

Nouveau site interne d'entrée des ribosomes et vecteur le contenant
La présente invention concerne l'utilisation d'une séquence nucléotidique dérivée de l'extrémité 5' de TARN génomique ou de l'ADN proviral d'un virus de la réticuloendothéliose à titre de site interne d'entrée des ribosomes (IRES) et/ou pour améliorer l'encapsidation rétrovirale. Plus particulièrement, elle concerne des vecteurs d'expression comportant cette séquence et notamment des vecteurs polycistroniques permettant l'expression efficace et stable de plusieurs gènes d'intérêt sous la dépendance d'un même promoteur. La présente invention trouve une application intéressante dans le domaine des vecteurs de thérapie génique.
La faisabilité de la thérapie génique appliquée à l'homme n'est plus à démontrer et ceci concerne de nombreuses applications thérapeutiques comme les maladies génétiques, les maladies infectieuses et les cancers. De nombreux documents de l'art antérieur décrivent les moyens de mettre en oeuvre une thérapie génique, notamment par l'intermédiaire de vecteurs viraux. D'une manière générale, les vecteurs sont obtenus par délétion d'au moins une partie des gènes viraux qui sont remplacés par les gènes d'intérêt thérapeutique. De tels vecteurs peuvent être propagés dans une lignée de complémentation qui fournit en trans les fonctions virales délétées pour générer une particule virale défective pour la réplication mais capable d'infecter une cellule hôte. A ce jour, les vecteurs rétroviraux sont parmi les plus utilisés mais on peut citer également des vecteurs issus des adénovirus, virus associés aux adénovirus, poxvirus et virus de l'herpès. Ce type de vecteurs, leur organisation et leur mode d'infection sont largement décrits dans la littérature accessible à l'homme de l'art.
A titre indicatif, le génome rétroviral est constitué par un ARN linéaire, simple brin et de polarité positive. Outre les séquences de régulation R et TJ5 et U3 et R présentes aux extrémité 5' et 3' respectivement, il porte trois gènes : gag codant pour les protéines de la capside, pol codant pour la transcriptase inverse et l'intégrase et env codant pour les protéines de l'enveloppe. Les signaux d'encapsidation, situés en aval des séquences U5 jusqu'au début de la région codante du gène gag, participent à la dimérisation et l'encapsidation de l'ARN viral dans les particules virales. L'extrémité 5' du génome comprend une coiffe (cap) et l'extrémité 3' est polyadénylée. Lors du cycle infectieux, l'ARN viral est converti en un ADN pro viral linéaire, double brin muni à chaque extrémité de séquences répétées inversées LTRs (pour Long Terminal Repeat en anglais) nécessaires à l'initiation de la transcription. Celle-ci, réalisée par la machinerie cellulaire, permet la production des ARN génomiques et subgénomiques à partir desquels sont synthétisées les protéines virales. Les retrovirus peuvent être classés en 4 sous-familles A à D, sur la base de leur morphologie. Le type C regroupe la majorité des retrovirus dont les virus MLV (Murine Leukemia Virus) et MSV (Murine Sarcoma Virus) utilisés dans la plupart des vecteurs de thérapie génique et les virus REV (Reticuloendotheliosis Virus) d'où dérive la séquence nucléotidique de la présente invention.
Il peut être avantageux de disposer de vecteurs de thérapie génique plus performants et capables notamment de produire efficacement plusieurs protéines d'intérêt. Cependant, la présence de plusieurs promoteurs au sein du même vecteur se traduit très souvent par une réduction voire même une perte de l'expression au cours du temps. Ceci est dû à un phénomène bien connu d'interférence entre les séquences promotrices. Dans ce contexte, la publication de la demande internationale WO93/03143 propose une solution à ce problème qui consiste à mettre en oeuvre un site interne d'entrée des ribosomes (IRES). Elle décrit un vecteur rétroviral dicistonique pour l'expression de deux gènes d'intérêt placés sous le contrôle du même promoteur. La présence d'un site IRES de picornavirus entre ceux-ci permet la production du produit d'expression issu du second gène d'intérêt par initiation interne de la traduction de l'ARNm dicistronique.
Normalement, l'entrée des ribosomes au niveau de l'ARN messager (ARNm) se fait par la coiffe située à l'extrémité 5' de l'ensemble des ARNm eucaryotes. Les sous unités ribosomales 40S se déplacent le long de l'ARN jusqu'à rencontrer un codon AUG approprié pour débuter la synthèse protéique. Généralement, l'initiation a lieu au niveau du premier codon AUG. Mais, si celui-ci est dans un contexte peu favorable, les sous unités 40S poursuivent jusqu'à un codon AUG ultérieur situé dans un meilleur contexte traductionnel (Kozak, 1984, Nucleic Acid Res. 12, 3873-3893 ; Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266, 19867-19870 ; Pain, 1996, Eur. J. Biochem. 236, 747-771).
Cependant, cette règle universelle connaît des exceptions. L'absence de coiffe chez certains ARNm viraux laissait supposer l'existence de structures alternatives permettant l'entrée des ribosomes à un site interne de ces ARN. A ce jour, un certain nombre de ces structures, nommées IRES du fait de leur fonction, ont été identifiées dans la région 5' non codante des ARNm viraux non coiffés comme celle notamment des picornavirus tel que le virus de la poliomyélite (Pelletier et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8, 1103-1112) et l'EMCV (Encephalomyocarditis virus (Jang et al., 1988, J. Virol. 62, 2636-2643). Des ARNm cellulaires possédant des éléments IRES ont également été décrits. On peut citer ceux codant pour la protéine BIP (pour Immunoglobulin heavy chain binding protein ; Macejak et Sarnow, 1991, Nature 353, 90-94), certains facteurs de croissance (Teerink et al., 1995, Biochem. Biophy. Acts 1264, 403- 408 ; Vagner et al., 1995, Mol. Cell. Biol. 15, 35-44), le facteur d'initiation de la traduction eIF4G (Gan et Rhoads, 1996, J. Biol. Chem. 271, 623-626) et deux facteurs de transcription de levure TFIID et HAP4 (lizuka et al. , 1994, Mol. Cell. Biol., 14, 7322-7330). Des sites IRES ont également mis en évidence dans les retrotransposons murins de type VL30 (Berlioz et al., 1995, J. Virol. 69, 6400-6407) et, plus récemment dans les ARNm codant pour le précurseur gag des virus de la leucémie murine de Friend (FMLV) et de Moloney (MoMLV) (Berlioz et Darlix, 1995, J. Virol. 69, 2214-2222 ; Vagner et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 20376-20383).
On a maintenant trouvé un nouveau site interne d'entrée des ribosomes dans la région 5' non codante de l'ARN du virus aviaire de la réticuloendothéliose (REV) de type A (REV-A) et montré son efficacité pour initier la traduction de séquences codantes placées à sa suite d'une manière monocistronique ou dicistonique.
Le site IRES de la présente invention est particulièrement avantageux par rapport à ceux déjà décrits dans la littérature. En premier lieu, il permet un taux d'expression important du cistron qu'il contrôle. En outre et, de manière inattendue, il peut également, dans le cadre d'un vecteur rétroviral, contribuer ou améliorer, en association avec une région d'encapsidation appropriée, les fonctions de dimérisation ou d'encapsidation, permettant une augmentation du titre viral. Et enfin, du fait de sa faible homologie avec les séquences rétrovirales murines utilisées dans la plupart des vecteurs de thérapie génique destinés à un usage humain, son emploi réduit considérablement le risque de production de virus compétents pour la réplication.
La plupart des protocoles de thérapie génique approuvés par le RAC (Recombinant DNA Advisory Committee) aux Etats Unis utilisent des vecteurs dérivés du virus MoMLV. A l'heure actuelle, le choix d'un vecteur rétroviral spécifique pour une application thérapeutique donnée reste empirique et les facteurs influençant le titre viral et l'expression des gènes n'ont pas encore été clairement élucidés. L'étude des séquences agissant en cis qui contrôlent l'encapsidation et l'établissement des forces relatives de divers éléments IRES peuvent permettre d'optimiser les vecteurs de thérapie génique en termes de titre et d'expression génique. Un des buts de la présente invention est de proposer de nouveaux vecteurs rétroviraux susceptibles d'être propagés à haut titre et de permettre une expression optimale d'un ou plusieurs gènes d'intérêt.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet l'utilisation d'une séquence nucléotidique dérivée de tout ou partie de l'extrémité 5' de l'ARN génomique d'un retrovirus de type C à l'exception des virus de la leucémie murine de Friend (FMLV) et de Moloney (MoMLV), à titre de site interne d'entrée des ribosomes (IRES) dans un vecteur et/ou pour permettre ou améliorer l'encapsidation d'un vecteur rétroviral.
Par séquence nucléotidique, on entend une séquence composée de ribo (ARN) ou de désoxyribonucléotides (ADN). Dans le cadre de la présente invention, l'extrémité 5' de l'ARN génomique d'un retrovirus correspond au quart 5' dudit ARN qui s'étend du site d'initiation de la transcription (nucleotide +1) jusqu'à environ 2 kb dans la direction 3'. Le terme retrovirus est largement défini dans les ouvrages de base de virologie accessibles à l'homme de l'art et les caractéristiques essentielles ont été résumées à titre indicatif ci-dessus. Le terme "dérivée" fait référence à une séquence ayant une origine rétrovirale de type C, mais qui peut avoir subi au moins une modification par rapport à la séquence native. La ou les modifications envisageables incluent la délétion, l'addition, la substitution et/ou la mutation d'un ou plusieurs nucléotides (nt). De telles modifications peuvent avoir pour but par exemple d'accroître les fonctions IRES, d'encapsidation ou d'introduire des sites de restriction adéquates pour faciliter les étapes de clonage ultérieures. Le terme "dérivée" comprend également l'équivalent ADN de l'ARN génomique sous une forme modifiée ou non.
Par IRES, on désigne un site capable de promouvoir l'entrée des ribosomes dans une molécule d'ARN d'une manière indépendante de la coiffe. Conformément aux buts poursuivis par la présente invention, la fonction IRES peut s'exercer dans tout vecteur ou cassette d'expression. Une séquence en usage dans le cadre de la présente invention peut également agir en tant qu'élément activatèur de l'encapsidation des retrovirus ou vecteurs rétroviraux en favorisant la dimérisation de deux copies du génome rétroviral et/ou l'encapsidation du dimère dans les particules virales. Selon un mode de réalisation préféré, ladite séquence est capable d'exercer une fonction IRES et d'améliorer la fonction d'encapsidation lorsqu'elle est introduite dans un vecteur rétroviral approprié.
Une séquence nucléotidique telle qu'utilisée dans le cadre de la présente invention, peut être isolée de l'extrémité 5' de l'ARN génomique ou de l'ADN proviral d'un retrovirus de type C ou de tout plasmide de l'état de la technique portant le fragment rétroviral d'intérêt. Il va sans dire qu'elle peut être générée par toute technique en usage dans le domaine de l'art, par exemple par clonage à l'aide de sondes appropriées, par PCR (Polymerase Chain reaction) ou encore par synthèse chimique. Avantageusement, ladite séquence comprend tout ou partie de la région qui suit le domaine U3 du LTR 5', jusqu'au codon AUG initiateur du gène gag. Aux fins de la présente invention, elle comprend au moins 50 nucléotides, avantageusement au moins 100 nucléotides, de préférence au moins 200 nucléotides et de manière préférée au moins 300 nucléotides compris dans ladite extrémité 5'. Mais, bien entendu, elle peut s'étendre au delà dans la direction 5' ou 3' ou comporter des séquences supplémentaires. Avantageusement, ladite séquence comprend de 100 à 1500 nucléotides et, en particulier, de 300 à 800 nucléotides.
On préfère mettre en oeuvre dans le cadre de la présente invention un retrovirus de type C à l'exception des virus FMLV et MoMLV. Un retrovirus de type C convenant plus particulièrement, est sélectionné parmi les virus REV (Virus de la réticuloendothéliose), MSV (Murine sarcoma virus) et notamment celui de Moloney (MMSV), MHV (Mus hortulanus virus), MEV (Mouse endogenous retrovirus), FMOV (FBR murine osteosarcoma virus), AMLV (AKV murine leukemia virus), MEELV (Mouse endogenous ecotropic murine leukemia virus), SFFV (Friend spleen focus-forming virus), RAS V (rat sarcoma virus), FLV (Féline leukemia virus), FSV (féline sarcoma virus), EFLV (Cat endogenous proviral féline leukemia virus), SSV (Simian sarcoma virus), GALV (Gibbon ape leukemia virus) et BAEV (Baboon endogenous virus).
Selon un mode de réalisation tout à fait préféré, une séquence nucléotidique en usage dans la présente invention dérive de tout ou partie de l'extrémité 5' de l'ARN génomique d'un virus de la réticuloendothéliose (REV). Les virus REV comprennent notamment différents sous-types A, B et T ainsi que les virus DIAV (Duck infectious anémia virus), SNV (spleen necrosis virus) et CSV (Chick syncytial virus) (voir par exemple Encyclopedia of Virology, 1994, Enrietto, Reticuloendotheliosis viruses, p 1227- 1232 Ed. R. Webster et A. Granoff, Académie Press, Hartourt Brace § Company Publishers). Un virus REV convenant tout particulièrement est le virus de la réticuloendothéliose aviaire, notamment celui de type A (REV- A).
Selon cette dernière variante, on aura de préférence recours à une séquence nucléotidique comprenant au moins 100 nucléotides et au plus 800 nucléotides (nt) de l'extrémité 5' non codante du virus REV-A et plus particulièrement une séquence nucléotidique substantiellement homologue ou identique à tout ou partie de la séquence présentée dans l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 1. A titre d'exemples préférés, on peut citer une séquence nucléotidique substantiellement homologue ou identique à la séquence présentée dans l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 2 :
(i) commençant au nucleotide 1 et se terminant au nucleotide 578, (ii) commençant au nucleotide 265 et se terminant au nucleotide 578, ou (iii) commençant au nucleotide 452 et se terminant au nucleotide 578.
Le terme substantiellement homologue fait référence à un degré d'homologie supérieur à 70%, avantageusement supérieur à 80%, de préférence supérieur à 90% et, de manière tout à fait préférée, supérieur à 95%. Comme déjà indiqué, ladite séquence nucléotidique peut avoir une séquence légèrement différente de celle décrite dans la SEQ ID NO: 1 ou 2, à la condition toutefois que la ou lès modifications n'affecte(nt) pas ses fonctions IRES et/ou d'encapsidation. Selon un mode avantageux, la séquence nucléotidique utilisée dans le cadre de la présente invention est identique à la séquence présentée dans l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 2 : (i) commençant au nucleotide 1 et se terminant au nucleotide 578, (ii) commençant au nucleotide 265 et se terminant au nucleotide 578, ou
(iii) commençant au nucleotide 452 et se terminant au nucleotide 578. La fonction IRES de ladite séquence nucléotidique est particulièrement avantageuse dans un contexte pauvre en ion magnésium, par exemple dans un contexte cellulaire. Un concentration élevée en ions Mg2+ peut diminuer l'efficacité de l'initiation de la traduction médiée par la séquence.
Une séquence nucléotidique en usage dans la présente invention, est plus particulièrement destinée à être intégrée dans un vecteur de transfert et d'expression d'un ou plusieurs gène(s) d'intérêt. Le choix d'un tel vecteur est large et les techniques de clonage dans le vecteur retenu sont à la portée de l'homme de l'art. Conformément aux buts poursuivis par la présente invention, on peut envisager un vecteur plasmidique ou un vecteur dérivé d'un virus animal et, en particulier, d'un poxvirus (canari pox ou virus de la vaccine, notamment
Copenhage ou MVA), adénovirus, baculovirus, virus de l'herpès, virus associé à un adénovirus ou retrovirus. De tels vecteurs sont largement décrits dans la littérature. En particulier, lorsqu'il s'agit d'un vecteur adénoviral, celui-ci peut être issu d'un adénovirus humain (de préférence de type 2 ou 5), animal (de préférence canin ou bovin) ou encore d'un hybride entre des espèces variées. La technologie générale concernant les adénovirus est divulguée dans Graham et Prevec (1991,
Methods in Molecular Biology, Vol 7, Gène transfer and Expression Protocols ;
Ed E.J. Murray, the Human Press Inc, p 109-118).
Conforméments aux buts poursuivis dans le cadre de la présente invention, ladite séquence nucléotidique est de préférence positionnée en amont d'un gène d'intérêt pour améliorer la traduction du produit d'expression pour lequel celui-ci code. Elle peut être mise en oeuvre dans une cassette d'expression de type monocistronique (pour l'expression d'un gène d'intérêt placé sous le contrôle d'un promoteur) ou polycistronique (pour l'expression d'au moins deux gènes d'intérêt placés sous le contrôle d'un même promoteur). Cette dernière peut contenir plusieurs éléments en tandem "site IRES-gène d'intérêt" dont au moins un des sites IRES est constitué par une séquence nucléotidique telle que définie auparavant. On préfère tout particulièrement l'utilisation dans une cassette dicistronique soit en amont du premier gène d'intérêt soit en amont du second, cette dernière variante étant la préférée.
Lorsqu'un vecteur selon l'invention comprend plusieurs cassettes d'expression, celles-ci peuvent être insérées dans une orientation quelconque les unes par rapport aux autres, soit dans une même orientation (promoteur agissant dans une même direction) ou en orientation réverse (promoteur agissant dans une orientation opposée). Par ailleurs, un vecteur selon l'invention peut comprendre plusieurs séquences nucléotidiques en usage selon l'invention. Dans ce cas, il est préférable qu'elles dérivent de retrovirus de type C différents.
Selon un mode de réalisation tout à fait préféré, un vecteur selon l'invention dérive d'un retrovirus. On peut citer à titre d'exemples, les retrovirus aviaires tels que le virus de l'érythroblastose aviaire (AEV), le virus de la leucémie aviaire (AVL), le virus du sarcome aviaire (ASV), le virus de la nécrose de la rate (SNV) et le virus du sarcome de Rous (RSV), les retrovirus bovins, les retrovirus félins (FLV, FSV....), les retrovirus murins tels que le virus de la leucémie murine (MuLV), le virus de Friend (FMLV) et le virus du sarcome murin (MSV) et les retrovirus de primate (GALV, FSV, BAEV...). Bien entendu, d'autres retrovirus peuvent être mis en oeuvre. Cependant, on préfère tout particulièrement avoir recours au virus MoMLV. Les nombreux vecteurs rétroviraux décrits dans la littérature peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention. Les vecteurs rétroviraux envisageables aux fins de la présente invention comprennent au moins les éléments suivants associés d'une manière fonctionnelle : un LTR 5' et un LTR 3' rétroviraux, un ou plusieurs gène(s) d'intérêt, et la séquence nucléotidique en usage dans le cadre de la présente invention pour permettre ou améliorer l'encapsidation dudit vecteur dans une particule virale et/ou à titre de site IRES pour permettre ou favoriser l'expression d'un gène d'intérêt positionné en aval de ladite séquence nucléotidique. Il va sans dire que le LTR 5' rétroviral peut être utilisé comme promoteur mais on peut également avoir recours à un promoteur interne. Par ailleurs, le LTR 5' et éventuellement 3' peuvent avoir la même origine rétrovirale (par exemple REV) que la séquence nucléotidique ou une origine différente. Par exemple, un vecteur monocistronique comprendra de 5' vers 3' un LTR 5', la séquence nucléotidique, un gène d'intérêt et un LTR 3'.
Bien entendu, un vecteur rétroviral selon l'invention peut également comprendre une région d'encapsidation (E+) conventionnelle. Cependant, la présence de cette dernière n'est pas exigée lorsque la séquence nucléotidique en usage dans la présente invention peut exercer à elle-seule la fonction d'encapsidation. Un tel mode de réalisation peut être plus particulièrement envisagé lorsque le LTR 5' rétroviral dérive d'un virus REV et, de préférence du SNV, et la séquence nucléotidique est substantiellement homologue ou identique à la séquence présentée dans la SEQ ID NO: 2, commençant au nt 1 et se terminant au nt 578 ou commençant au nt 265 et se terminant au nt 578.
Selon un mode de réalisation avantageux, un vecteur rétroviral selon l'invention, comprend au moins : (a) un LTR 5' rétroviral,
(b) une région d'encapsidation,
(c) de manière optionnelle, un premier gène d'intérêt suivi d'une région promotrice interne d'une origine différente de celle dudit LTR 5' rétroviral, (d) un second gène d'intérêt,
(e) un site IRES,
(f) un troisième gène d'intérêt, et
(g) un LTR 3' rétroviral, l'un au moins de la région d'encapsidation et du site IRES étant constitué par ladite séquence nucléotidique en usage selon l'invention.
Dans le cas où le vecteur rétroviral selon l'invention comporte une cassette d'expression dirigée par une région promotrice interne, il est préférable pour favoriser l'expression génique, que celle-ci soit dans une orientation inverse par rapport aux LTRs 5' et 3' rétroviraux. On peut également inclure d'autres éléments, par exemple un autre site IRES et un autre gène d'intérêt ou une autre cassette d'expression.
Un vecteur rétroviral préféré selon l'invention comprend une région d'encapsidation dérivant d'un retrovirus murin, notamment d'un MoMLV, ou d'un rétrotransposon de type VL30 et un site IRES comprenant une séquence nucléotidique substantiellement homologue ou identique à la séquence présentée dans l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 2 :
(i) commençant au nucleotide 1 et se terminant au nucleotide 578,
(ii) commençant au nucleotide 265 et se terminant au nucleotide 578, ou
(iii) commençant au nucleotide 452 et se terminant au nucleotide 578.
On peut citer en particulier les vecteurs rétroviraux dicistroniques de type pREV HW-3 et HW-6, dans lesquels la région d'encapsidation dérive d'un MoMLV et le site IRES est constitué par une séquence nucléotidique identique à la séquence présentée dans la SEQ ID NO: 2 commençant au nucleotide 265 et se terminant au nucleotide 578 ou commençant au nucleotide 452 et se terminant au nucleotide 578. Bien entendu, l'homme du métier peut faire varier les gènes d'intérêt selon l'effet thérapeutique recherché.
Aux fins de la présente invention, un gène d'intérêt en usage dans l'invention peut être obtenu d'un organisme eucaryote, procaryote ou d'un virus par toute technique conventionnelle de biologie moléculaire. Il peut coder pour un polypeptide correspondant à une protéine native telle que trouvée dans la nature homologue à la cellule hôte ou non, un fragment protéique, une protéine chimérique provenant de la fusion de polypeptides d'origines diverses ou un mutant présentant des propriétés biologiques améliorées et/ou modifiées. Un tel mutant peut être généré par substitution, délétion et/ou addition d'un ou plusieurs résidus acides aminés. En outre, le polypeptide peut être (i) intracellulaire (ii) membranaire présent à la surface de la cellule hôte ou encore (iii) sécrété hors de la cellule hôte et donc comprendre des éléments additionnels appropriés, comme une séquence codant pour un signal de sécrétion ou une région d'ancrage transmembranaire.
On préfère tout particulièrement mettre en oeuvre un gène d'intérêt thérapeutique codant pour un produit d'expression capable d'inhiber ou retarder l'établissement et/ou le développement d'une maladie génétique ou acquise. Un vecteur selon l'invention est particulièrement destiné à la prévention ou au traitement de la mucoviscidose, de l'hémophilie A ou B, de la myopathie de Duchenne ou de Becker, du cancer, du SIDA, de maladies cardiovasculaires (resténose, arthériosclérose, ischémie...) et d'autres maladies infectieuses dues à un organisme pathogène : virus, bactérie, parasite ou prion. Les gènes d'intérêt utilisables dans la présente invention, sont ceux qui codent pour les protéines suivantes : une cytokine et notamment une interleukine (IL-2, IL-7, IL- 10, IL- 12...), un interféron, un facteur de nécrose tissulaire et un facteur de croissance et notamment hématopoïétique (G-CSF, GM-CSF), un facteur ou cofacteur impliqué dans la coagulation et notamment le facteur VIII, le facteur IX, le facteur von Willebrand, l'antithrombine III, la protéine C, la thrombine et l'hirudine, une enzyme et notamment la trypsine, une ribonucléase, la phosphatase alcaline (plap) et la β-galactosidase, un inhibiteur d'enzyme tel que l'αl-antitrypsine et les inhibiteurs de protéases virales un produit d'expression d'un gène suicide comme la thymidine kinase du virus HSV (virus de l'herpès) de type 1, celui du gènefiirl et/ou fcyl de Saccharomyces cerevisiae, la ricine, un activateur ou un inhibiteur de canaux ioniques, une protéine dont l'absence, la modification ou la dérégulation de l'expression est responsable d'une maladie génétique, telle que la protéine CFTR, la dystrophine ou minidystrophine, l'insuline, l'ADA
(adénosine diaminose), la glucocérébrosidase et la phénylhydroxylase, une protéine capable d'inhiber l'initiation ou la progression de cancers, telles que les produits d'expression des gènes supresseurs de tumeurs, par exemple les gènes p53, p73 et Rb, une protéine capable de stimuler une réponse immunitaire, un anticorps, les antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité ou une immunotoxine, une protéine capable d'inhiber une infection virale ou son développement, par exemple les épitopes antigéniques du virus en cause ou des variants altérés de protéines virales susceptibles d'entrer en compétition avec les protéines virales natives, un récepteur cellulaire ou nucléaire ou un de leur ligand, un facteur de croissance (FGF pour Fibroblast Growth Factor, VEGF pour Vascular Endothelial cell Growth Factor...), et un inducteur d'apoptose (Bax...), un inhibiteur d'apoptose (Bcl2, BclX...), un agent cytostatique (p21, pl6, Rb...), une nitric oxide synthase (NOS), une apolipoprotéine (apoAI, apoE...), une catalase, une SOD, un facteur agissant sur l'angiogénèse (PAI pour Plasminogen Activator Inhibitor... ) .
' Par ailleurs, un gène d'intérêt en usage dans la présente invention, peut également coder pour un marqueur de sélection permettant de sélectionner ou identifier les cellules hôtes transfectées par un vecteur selon l'invention. On peut citer le gène néo (néomycine) conferrant une résistance à l'antibiotique G418, le gène dhjr (dihydrofolate réductase), le gène CAT (Chloramphenicol Acetyl Transférase) ou encore le gène gpt (xanthine phosphoribosyl).
D'une manière générale, on aura recours pour l'expression d'un ou des gène(s) d'intérêt à un promoteur fonctionnel dans la cellule hôte considérée et, de préférence, une cellule humaine. Le choix du promoteur est très large et à la portée de l'homme du métier. Il peut s'agir d'un promoteur gouvernant naturellement l'expression d'un gène d'intérêt en usage dans la présente invention ou de tout autre promoteur d'une origine quelconque. Par ailleurs, il peut être de nature constitutive ou régulable, notamment en réponse à certains signaux cellulaires tissu- spécifiques ou événements-spécifiques. Par exemple, il peut être avantageux de cibler l'expression du gène d'intérêt au niveau des cellules lymphocytaires dans le cadre du SIDA, des cellules pulmonaires dans le cadre de la mucoviscidose ou des cellules musculaires dans le cadre des myopathies.
A titre d'exemples, les promoteurs convenant dans le cadre de la présente invention peuvent être choisis parmi les promoteurs SV40 (Virus Simian 40), CMV (Cytomégalovirus), HMG (Hydroxyméthyl-Glutaryl Coenzyme A), TK (Thymidine kinase), les LTRs rétroviraux comme celui du MoMLV, RSV ou du MSV lorsqu'on met en oeuvre un vecteur rétroviral, les promoteurs adénoviraux El A et tardif MLP (Major Late Promoteur) notamment dans le contexte d'un vecteur adénoviral, les promoteurs 7,5K, H5R, pKlL, p28 et pi 1 destinés à des vecteurs poxviraux comme le virus de la vaccine, le promoteur PGK (Phosphoglycéro kinase), les promoteurs foie-spécifiques des gènes codant pour l'αl-antitrypsine, le facteur IX, l'albumine et la transferrine, les promoteurs des gènes d'immunoglobulines qui permettent une expression dans les lymphocytes, et enfin les promoteurs des gènes codant pour le surfactant ou la protéine CFTR qui présentent une certaine spécificité pour les tissus pulmonaires. Il peut également s'agir d'un promoteur stimulant l'expression dans une cellule tumorale ou cancéreuse. On peut citer notamment les promoteurs des gènes MUC-1 surexprimé dans les cancers du sein et de la prostate (Chen et al., 1995, J. Clin. Invest. 96, 2775-2782), CEA (pour carcinoma embryonic antigen) surexprimé dans les cancers du colon (Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 2738-2748), tyrosinase surexprimé dans les mélanomes (Vile et al., 1993, Cancer Res. 53, 3860-3864), ERB-2 surexprimé dans les cancers du sein et du pancréas (Harris et al., 1994, Gène Therapy 1, 170-175), α-fétoprotéine surexprimée dans les cancers du foie (Kanai et al., 1997, Cancer Res. 57, 461-465), APC surexprimé dans les cancers colorectaux, BRCA-1 et 2 (Wooster et al., 1995, Nature 378, 789-792) surexprimés dans les cancers des ovaires et PSA (pour prostate spécifie antigen) surexprimé dans les cancers de la prostate. Par ailleurs, le gène d'intérêt en usage dans la présente invention peut comporter d'autres séquences améliorant son expression, tant au niveau de la transcription que de la traduction ; par exemple une séquence activatrice de la transcription de type enhancer, une séquence intronique, un signal de terminaison de la transcription (polyA) et, comme indiqué précédemment, un signal de sécrétion ou une région transmembranaire.
L'invention couvre également les particules virales générées à partir d'un vecteur viral selon l'invention. On procède généralement par transfection de celui- ci dans une lignée cellulaire adéquate. Si le vecteur viral utilisé est défectif pour la réplication, on aura recours à une lignée de complémentation. D'une manière générale, l'homme du métier connaît les lignées pouvant être employées pour générer des particules virales infectieuses ainsi que le procédé à mettre en oeuvre selon le vecteur utilisé.
Par exemple, dans le cas d'un vecteur adénoviral, on peut avoir recours à la lignée 293 (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36, 59-72). S'agissant d'un vecteur rétroviral, on peut envisager d'employer des lignées cellulaires écotropes, comme la lignée CRE (Danos et Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 6460-6464) ou GP+E-86 (Markowitz et al., 1988, J. Virol., 62, 1120-1124). Mais on préfère tout particulièrement mettre en oeuvre une lignée de complémentation amphotrope telle que la lignée PG13 (Miller et al., 1991, J. Virol., 65, 2220-2224) ou Psi Env-am (Markowitz et al., 1988, T.A.A.P. Vol. CI, 212-218). Généralement, on récupère les particules virales infectieuses dans le surnageant de culture des cellules de complémentation transfectées.
L'invention s'étend également aux cellules comprenant un vecteur selon l'invention ou infectées par des particules virales infectieuses selon l'invention. Les méthodes de transfection sont bien connues de l'homme de l'art. On peut citer la technique de précipitation au phosphate de calcium, celle au DEAE dextrane, la microinjection ou l'encapsulation dans des véhicules lipidiques. D'autre part, les vecteurs selon l'invention peuvent être présents dans la cellule hôte sous forme intégrée dans le génome cellulaire ou sous forme d'épisomes aussi bien dans le noyau que dans le cytoplasme. La cellule selon l'invention est avantageusement une cellule eucaryote, notamment mammifère et, de préférence, une cellule humaine. Il peut s'agir d'une cellule primaire ou tumorale d'une origine hématopoïétique (cellule souche totipotente, leucocyte, lymphocyte, monocyte, macrophage ...), hépatique, épithéliale, fibroblaste, du système nerveux central et, tout particulièrement, d'une cellule musculaire (myoblaste, myocyte, cellule satellite, muscle lisse...), cardiaque, vasculaire, trachéale, pulmonaire ou du système nerveux central.
La présente invention concerne également l'usage thérapeutique d'un vecteur, d'une particule virale ou d'une cellule selon l'invention, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention d'une maladie traitable par thérapie génique, notamment d'une maladie génétique, d'une maladie acquise comme le cancer ou d'une maladie infectieuse.
Cependant, un tel usage n'est pas limité à une application de type thérapie génique somatique. En particulier, un vecteur selon l'invention peut être utilisé à d'autres fins comme la production par voie recombinante dans des cellules procàryotes ou eucaryotes de produit(s) d'expression codé(s) par au moins un des gènes d'intérêt. Par exemple, on peut envisager la coexpression de deux gènes d'intérêt dans un vecteur d'expression dicistronique utilisant une séquence nucléotidique selon l'invention. La coexpression d'un gène de résistance à un antibiotique à titre de second cistron peut permettre d'augmenter l'expression d'un premier cistron. Il est possible d'obtenir un produit mature par la coexpression de deux gènes dont le produit d'expression de l'un permet la maturation du polypeptide codé par l'autre (par exemple précurseur polypeptidique et une protéase clivant le précurseur en polypeptide mature). Dans ce cas, on peut avoir recours à des cellules procàryotes (E.coli ...), eucaryotes inférieures (levure, champignon, insecte ...) ou animales. Il s'agira ensuite de récolter et éventuellement purifier ledit produit d'expression d'intérêt du surnageant ou de la culture cellulaire par les techniques conventionnelles. Une autre possibilité d'utilisation consiste en la production d'animaux transgéniques ayant intégré dans leur génome une cassette pour l'expression d'un ou plusieurs gènes d'intérêt et comprenant une séquence nucléotidique selon l'invention. Il peut s'agir de souris, rats, lapins, poissons, primates ou d'animaux de ferme (bovins, ovins, porcins ...) Les techniques pour générer ces animaux transgéniques sont connues. Le polypeptide d'intérêt peut être récupéré de manière conventionnelle par exemple dans les fluides biologiques (sang, lait ... etc) de l'animal.
L'invention s'adresse également à une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique un vecteur, une particule virale ou une cellule selon l'invention ou un polypeptide d'intérêt obtenu conformément à l'utilisation selon l'invention, en association avec un véhicule acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier, on associe une quantité thérapeutiquement efficace d'un tel agent à un support, un diluant ou un adjuvant acceptable. Elle peut être administrée selon n'importe quelle route d'administration et ceci en dose unique ou répétée après un certain délai d'intervalle. On préférera notamment l'administration intraveineuse, intramusculaire, intrapulmonaire (éventuellement par aérosolisation) ou intratumorale. La quantité à administrer sera choisie en fonction de différents critères, en particulier l'usage à titre de traitement ou de vaccin, la voie d'administration, le patient, le type de maladie à traiter et son état d'évolution, la durée du traitement, le vecteur retenu ...etc. A titre indicatif, une composition pharmaceutique selon l'invention comprend entre 104 et 1014 pfu (unité formant des plages), avantageusement entre 105 et 1013 pfu et, de préférence, entre 106 et 10" pfu de particules virales. Une composition à base de vecteur peut être formulée sous forme de doses comprenant de 0,01 à 100 mg d'ADN, de préférence, de 0,05 à 10 mg et, de manière tout à fait préférée, de 0,1 à 5 mg. La formulation peut également inclure seul ou en combinaison un diluant, un adjuvant ou un excipient acceptable d'un point de vue pharmaceutique, de même qu'un agent de solubilisation, de stabilisation ou de conservation. La composition peut être présentée en dose unique ou en multidoses sous forme liquide ou sèche (lyophilisât...) susceptible d'être reconstituée de manière extamporanée par un diluant approprié.
Par ailleurs, l'invention concerne une méthode de traitement de maladies génétiques, cancers et maladies infectieuses selon laquelle on administre une quantité thérapeutiquement efficace d'un vecteur, d'une particule virale ou d'une cellule selon l'invention à un patient ayant besoin d'un tel traitement. Selon un premier protocole thérapeutique, on peut les administrer directement in vivo, par exemple par injection intraveineuse, intramusculaire, intratumorale ou par aérosolisation dans les poumons. De manière alternative, on peut adopter un protocole de thérapie génique ex vivo qui consiste à prélever les cellules d'un patient (cellules souches de la moelle osseuse, lymphocytes du sang périphérique...), à les transfecter avec un vecteur selon l'invention et à les cultiver in vitro avant de les réimplanter au patient.
Enfin, l'invention concerne l'utilisation d'un vecteur, d'une particule virale ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention pour la transfection ou l'infection de cellules pluripotentes, notamment de cellules pluripotentes du système nerveux central.
L'invention est illustrée ci-après par référence aux figures suivantes. La Figure 1 est une représentation schématique des plasmides monocistroniques utilisés comme matrices pour la synthèse in vitro d' ARN coiffés et non-coiffés. Ils contiennent le promoteur précoce du cytomégalovirus (Po CMV) utilisable pour l'expression in vivo, le promoteur du gène codant pour l'ARN polymérase du phage T7 (Po T7) utilisable pour les expériences in vitro, différentes portions de l'extrémité 5' non traduite (leader) du virus REV-A (1 à 578 pour pREV CB-95, 578 à 1 pour pREV CG-53, 1 à 578 délétées des nt 268 à 452 pour pREV CG-54, 265 à 578 pour pREV CG-55 et 452 à 578 pour pREV CG-56) et le gène LacZ (ΔLacZ) codant pour une β-galactosidase tronquée à l'extrémité C-terminale de masse moléculaire d'environ 46 kDa.
La Figure 2 est une représentation schématique des plasmides dicistroniques utilisés comme matrices pour la synthèse in vitro d'ARN coiffés et non-coiffés. Ils contiennent le promoteur précoce du cytomégalovirus (Po CMV) utilisable pour l'expression in vivo, le promoteur du gène codant pour l'ARN polymérase du phage T7 (Po T7) utilisable pour les expériences in vitro, le gène neo, différentes portions de l'extrémité 5' non traduite (leader) du virus REV-A (1 à 578 pour pREV CB-54, 578 à 1 pour pREV CG-50, 1 à 578 délétées des nt 268 à 452 pour pREV CG-52, 265 à 578 pour pREV CB-55 et 452 à 578 pour pREV CG-58) et le gène LacZ (ΔLacZ) codant pour une β-galactosidase tronquée à l'extrémité C-terminale de masse moléculaire d'environ 46 kDa.
La Figure 3 A est une représentation schématique des vecteurs rétroviraux dicistroniques possédant deux éléments d'origine rétrovirale différente, à titre d'IRES et de région d'encapsidation (E) et deux gènes d'intérêt comme les gènes rapporteurs plap codant pour la phosphatase alcaline placentaire et neo codant pour la néomycine phosphotransférase. B) Vecteurs rétroviraux de la série pREV HW possédant des LTRs dérivés de MLV et placés dans un contexte plasmidique pBR322. VL30E+ correspond à la région 5' non traduite de HaMSV et MoMLV E+ correspond à la région d'encapsidation de MoMLV. C) Vecteur de référence pEMCV-CBTV ayant des LTR et la région d'encapsidation de MoMLV et 1TRES de EMCV. Dans tous les cas, les séquences sont numérotées par rapport au site cap (position +1) de l'ARN génomique. La Figure 4 illustre l'effet de la rapamycine sur les activités A) phosphatase alcaline et B) néomycine phosphotransférase produites dans les cellules GP+E-86 non transfectées ou transfectées de manière stables par les différents vecteurs pREV HW ou pEMCV-CBTV (pCBlOO) et traitées par la rapamycine (boîtes pleines) ou non traitées (contrôle, boîtes pointillées). La Figure 5 illustre l'optimisation du protocole de transduction appliqué aux cellules neuroectodermales Dev. Le pourcentage de cellules Dev transduites par les virus pEMCV-CBTV (IRES EMCV) et pREV HW-3 (IRES REV-A) est déterminé par cytométrie de flux.
EXEMPLES
Les constructions ci-après décrites sont réalisées selon les techniques générales de génie génétique et de clonage moléculaire détaillées dans Sambrook et al. (1989, Molecular cloning : A Laboratory Manual, 2nd εd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) ou selon les recommandations du fabricant lorsqu'on utilise un kit commercial. Les techniques de PCR sont connues de l'homme de l'art et abondamment décrites dans PCR Protocols, a guide to methods and applications (Ed : Innis, Gelfand, Sninsky et White, Académie Press, Inc.). Les amplifications d'ADN plasmidique sont réalisées dans Eschenchia coli HB101 souche 1035 (recA). Par ailleurs, la position des séquences REV-A utilisées dans les constructions est indiquée par référence à la molécule ARN, la position + 1 correspondant au premier nucleotide de la molécule d'ARN, c'est à dire au site d'initiation de la transcription (Darlix et al., 1992, J. Virol. 66: 7245-7252). EXEMPLE 1 : Identification d'un site IRES au niveau de l'extrémité 5' leader de l'ARN de REV-A.
Des études de synthèse protéique in vitro ont été entreprises à l'aide d'une série de plasmides mono et dicistroniques contenant des fragments du leader 5' de l'ARN génomique REV-A afin de rechercher s'ils permettent la traduction de cistrons par liaison interne des ribosomes.
1. Construction des plasmides mono et dicistroniques .
Les fragments d'ADN correspondant aux séquences 1 à 578, 265 à 578 et 452 à 578 de l'ARN REV-A sont isolés par PCR à partir de la matrice pREVSC-1 (Darlix et al., 1992, J. Virol. 66, 7245-7252). On utilise des amorces appropriées que l'homme du métier peut concevoir, munies à leurs extrémités d'un site Mzel. Après digestion par cette enzyme, les fragments PCR sont insérés en amont du gène LacZ dans le vecteur pEMCV-M260-837 (Berlioz et al. , 1995, J. Virol. 69, 6400-6407) préalablement clivé par Nhel. Le gène LacZ mis en oeuvre code pour un produit β-galactosidase tronqué à l'extrémité C-terminale. On obtient les plasmides monocistroniques pREV CB-95 (1-578), pREV CG-55 (265-578) et pREV CG-56 (452-578) illustrés à la Figure 1. Les plasmides dicistroniques pREV CB-54 (1-578), pREV CB-55 (265-578) et pREV CG-58 (452-578) sont représentés à la Figure 2 et résultent de l'insertion des fragments PCR précédents entre les gènes neo et LacZ de pEMCV-D260-837 (pCBlOl) (Berlioz et al., 1995, J. Virol. 69, 6400-6407) également soumis à une digestion par Nhel. L'amplification des nt 1 à 578 délétés des séquences 268 à 452 est réalisée à partir du vecteur pREVSC-1 préalablement digéré par Kpnl et Sα , traité par le fragment Klenow de l'ADΝ polymérase d'E. coli et religué. Le fragment amplifié digéré par Mzel est clone dans pEMCV-M260-837 en amont du gène LacZ ou entre les gènes neo et LacZ de pEMCV-D260-837, les deux vecteurs ayant été digérés par Mzel, pour donner respectivement pREV CG-54 (Fig 1) et pREV CG-52 (Fig 2). Enfin des plasmides contrôles monocistronique pREV CG-53 (Fig 1) et dicistronique pREV CG-50 (Fig 2) ont été construits par introduction du fragment PCR portant les séquences REV-A l à 578 dans les vecteurs précédents en orientation inverse (578-1). Dans l'ensemble des constructions contenant les séquences REV-A en orientation sens, l'initiation de la traduction de la β-galactosidase est sous le contrôle du codon AUG du gène gag de REV-A situé en position 574-576, alors que dans les plasmides contrôles, la synthèse de la β-galactosidase dépend d'un AUG placé dans un contexte de Kozak favorable introduit par PCR.
2. Synthèse d 'ARN et traduction in vitro.
Les ARN coiffés et non coiffés sont synthétisés à partir de 1 μg d'ADN plasmidique linéarisé par Sspl (position 1240 dans le gène LacZ) à l'aide de l'ARN polymérase T7 (mMessage mMachine ou MAXIscript , Ambion) dans un volume réactionnel de 20 μl selon le protocole indiqué par le fournisseur. La transcription est stoppée par traitement de la matrice ADN par l'enzyme DNasel suivi d'une précipitation des ARN en présence de chlorure de lithium. Les ARN sont repris dans 50 μl de tampon TE (Tris-HCl 10 mM pH7,5, EDTA ImM) avant d'être purifiés et désalés par passage sur une colonne S-300 MicroSpin™ (Pharmacia BioTech) selon les indications du fournisseur. L'intégrité des ARN transcrits est vérifiée par électrophorèse sur gel d'agarose 0,7 % contenant du bromure d'éthidium (0,5 μg/ml). La concentration finale en ARN est déterminée spectrophotométriquement. Les ARN coiffés et non coiffés (10 μg/ml) sont traduits dans le système cellulaire RRL (Promega) utilisé à 50 % de sa concentration initiale en présence de 1 mCi de [35S] méthionine par ml (Amersham) à 31 °C pendant 1 h. Le mélange réactionnel est supplémenté par de l'acétate de potassium à une concentration finale de 120 mM. Par ailleurs, l'ARN luciférase est testé dans les mêmes conditions réactionnelles (témoin positif). Un essai mené en absence d'ARN constitue le témoin négatif. En parallèle, on teste l'effet de la protéase L du virus FMDV (Foot and mouth disease virus) sur la traduction des ARN dicistroniques. Cette protéase clive le facteur d'initiation de la traduction eIF4G entre la glycine en position 479 et l'arginine en position 480 pour générer deux fragments peptidiques dépourvus d'activité initiatrice (Kirchweger et al., 1995, J. Virol. 68, 5677-5684). En outre, Ohlmann et al. (1995, Nucleic Acid Res. 23, 334-340 ; 1996, EMBO J. 15, 1371-1382) a montré que le traitement des lysats de réticulocyte par la protéase L inhibe la traduction in vitro des ARN cellulaires coiffés alors que l'initiation interne dirigée par 1TRES du cardiovirus n'est pas touchée. Ainsi si un élément IRES existe dans le leader 5' REV-A, la présence de la protéase L ne devrait pas affecter l'expression du cistron dont la traduction est sous sa dépendance. Dans ce cas, les essais mettent en oeuvre le système RRL Flexi (Promega) à 50 % de sa concentration initiale, 8 μg/ml d'ARN, 1 mCi de [35S] méthionine par ml (Amersham) et 30 ng de protéase L recombinante et purifiée par les méthodes conventionnelles. Le mélange réactionnel est supplémenté par du chlorure de potassium à une concentration finale de 80 mM. La réaction est poursuivie à 31 °C pendant 1 h.
Les échantillons sont dénaturés par la chaleur dans 62,5 mM de Tris-HCl pH6,8, 2 % de sodium dodecyl sulphate (SDS), 10 % de glycérol, 5 % de β- mercaptoéthanol et 0,02 % de bleu de bromophénol et les protéines marquées analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 12 % (poids/vol), 0,2 % SDS. Le produit du gène neo et la β-galactosidase migrent à une masse moléculaire d'environ 28 et 46 kDa respectivement. L'efficacité de la traduction coiffe-dépendante et indépendante est quantifiée par scanographie (Phospho- Imageύr Storm 840, version 4.00, Molecular Dynamics ; Image Quant ™ version 1.1, Molecular Dynamics). Dans le cas des vecteurs dicistroniques, l'intensité du marquage du produit d'expression du second cistron (β- galactosidase) dont la traduction est médiée par PIRES est évaluée après standardisation du niveau d'expression du produit neo.
On observe que la traduction des ARN non coiffés obtenus à partir des plasmides monocistroniques pREV CB-95, pREV CG-53, pREV CG-54, pREV CG-55 et pREV CG-56 est aussi efficace que celle des ARN coiffés. Cependant, comme attendu, la quantité de β-galactosidase générée à partir du plasmide pREV CG-53 dans lequel les séquences REV-A (1 à 578) sont en orientation antisens est beaucoup plus faible que celle obtenue avec les constructions utilisant une séquence REV-A dans l'orientation sens. Lorsque les fragments REV-A sont mis en oeuvre d'une manière dicistronique entre les gènes neo et LacZ, l'expression de la β-galactosidase n'apparaît qu'en présence d'un IRES fonctionnel (pREV CB-54, pREV CB-55, et pREV CG-52) alors que celle du premier cistron (neo) est efficace dans tous les cas (y compris pREV CG-50). Des essais compatifs de traduction in vitro menés avec les vecteurs précédents et le plasmide pEMCV-D260-837 comprenant TIRES EMCV de référence montrent que les fragments REV-A 1-578, 265-578 et 452-578 sont capables d'initier la traduction du second cistron d'une manière plus efficace que celle dirigée par TIRES EMCV. Par ailleurs, le traitement des lysats de réticulocytes par la protéase L s'accompagne d'une inhibition de l'expression coiffe- dépendante du gène neo alors que l'expression de la β-galactosidase dépendante de TIRES est sensiblement augmentée. Pour le témoin pREV CG-50, on observe également l'inhibition de l'expression neo alors que l'expression de la β- galactosidase est à peine détectable que le traitement à la protéase L ait lieu ou non. A titre indicatif, l'effet de la protéase sur l'expression des deux gènes rapporteurs est illustré ci-après.
Tableau 1 : Rapport de l'expression des gènes en présence et en absence de protéase L de FMDV.
Figure imgf000027_0001
EXEMPLE 2 Vecteurs rétroviraux comprenant une séquence IRES REV-A
On a construit une série de vecteurs rétroviraux utilisant les séquences REV-A à titre de sites IRES ou d'éléments augmentant l'encapsidation. La Figure 3 illustre les vecteurs de la série pREV HW possédant des LTRs de type MoMLV et les vecteurs témoins utilisés dans les expériences décrites ci-après. Bien que ceux-ci ne soient pas représentés, on a également construit des vecteurs désignés pMC qui diffèrent des pREV HW uniquement par le fait que leurs LTRs sont d'origine SNV et des contrôles négatifs dans lesquels les séquences REV-A sont positionnées en orientation reverse (3' -> 5') par rapport aux LTRs. Pour toutes les étapes de biologie moléculaire, ces vecteurs sont introduits dans le plasmide pBR322.
1. Construction des vecteurs rétroviraux.
Le vecteur témoin pEMCV-CBTV (pBClOO) est un vecteur dicistronique comprenant, outre les LTRs et la région d'encapsidation dérivés de MoMLV, le gène codant pour la phosphatase alcaline placentaire (plap) dont la traduction est coiffe-dépendante et le gène neo dont la traduction est dépendante du site
IRES EMCV (Torrent et al., 1996, Human Gène Therapy 7, 603-611).
Les vecteurs pREV HW ont été obtenus de la façon suivante : pREV HW-1 : le fragment REV-A s'étendant des nt 265 à 578 généré par PCR et digéré par zel est clone entre les gènes plap et neo de pMLV-CB71 (Berlioz et Darlix, 1995, J. Virol. 69, 2214-2222). pREV HW-2 : le fragment EcoRI de pVL CBT5 (Torrent et al. , 1996, Human Gène Therapy 7, 603-611) portant le LTR 5' MoMLV et les séquences d'encapsidation de VL30 est introduit dans le vecteur pRΕV HW-1 linéarisé par EcoRI. pRΕV HW-3 : le fragment EcoRI de pΕMCV-CBTV contenant le LTR 5' et les séquences d'encapsidation de MoMLV est inséré dans le vecteur pRΕV HW-1 linéarisé par EcoRI. pRΕV HW-4 : le fragment RΕV-A s'étendant des nt 452 à 578 généré par PCR et digéré par Nftel est clone entre les gènes plap et neo de pMLV-CB71. pRΕV HW-5 : le fragment EcoRI de pVL CBT5 portant le LTR 5' MoMLV et les séquences d'encapsidation de VL30 est introduit dans le vecteur pRΕV HW-4 linéarisé par EcoRI. pRΕV HW-6 : le fragment EcoRI de pΕMCV-CBTV contenant le LTR 5' et les séquences d'encapsidation de MoMLV est inséré dans le vecteur pRΕV HW-4 linéarisé par EcoRI.
Les vecteurs de la série pMC sont obtenus selon le schéma de construction suivant : Les LTRs SΝV sont générés par PCR à partir du plasmide RΕV-A 2-20-6 (O'Rear et Temin, 1982, Proc. Νatl. Acad. Sci. USA 79, 1230- 1234 ; Darlix et al., 1992, J. Virol. 66, 7245-7252). Le gène neo est isolé de pMLV-CB71 par digestion avec Sali et BamΑl puis introduit entre les mêmes sites du vecteur pUC19 (Gibco BRL). Le LTR 5' du SΝV (nt 1 à 861) est digéré par H diπ et Sali, et inséré dans pUC19-neo préalablement clivé par ces mêmes enzymes. Le LTR 3' SΝV (nt 7230-8300) digéré par Smαl et EcoRI est clone dans le vecteur précédent pour donner pCG-61 contenant LTR 5' SΝV-neo-LTR 3' SΝV. En parallèle, on génère un vecteur désigné pCG-62 qui diffère du précédent par la délétion des séquences env (nt 7230-7691) obtenu par traitement BglR-AvrTl, Klenow et religation. Le gène plap isolé du clone Cla-12AP (DGoff) est introduit entre les sites EcoRI et Xbal d'un plasmide bluescript préalablement délété du site Sali (digestion EcoRI-.X7zoI) avant d'être réisolé sous la forme d'un fragment Kpnl-SaR et clone entre les mêmes sites de pCG-61 et pCG-62, pour donner pCG-63 et pCG-64 respectivement. Le gène LacZ est obtenu par digestion partielle de pRΕV CB-95 par les enzymes Sali et BamΑl. Son insertion entre les sites Sali et BamUl de pCG-61 et pCG-62 donne lieu à pCG-65 et pCG-66 respectivement. Enfin, le bloc LTR-Gene-LTR est isolé de chaque plasmide pCG-62, pCG-64 et pCG-66 par digestion H dlII-EcoRI pour être inséré dans le vecteur pBR322 clivé par ces mêmes enzymes. On génère pMCl, pMC2 et pMC3.
2. Génération de particules virales infectieuses et détermination du titre viral et de l'expression des gènes reporteurs plap et neo.
La lignée de complémentation écotrope GP+Ε-86 (Markowitz et al., 1988, J. Virol., 62, 1120-1124) et les cellules cibles NIΗ3T3 (cellules fibroblastiques de souris) disponibles à TATCC, sont cultivées à 37 °C en présence de 5% de CO2 dans du milieu DMΕM (Dulbecco's Modified Εagle's Médium, Gibco BRL) complémenté avec 10% de sérum de veau de nouveau-né. Les cellules helper GP+Ε-86 et les cellules cibles NIH3T3 sont mises en culture la veille de la transfection et de l'infection. Les infections virales sont réalisées selon le protocole conventionnel décrit dans la littérature.
20 μg de vecteurs pRΕV HW-1 à 6 ainsi que de vecteur de référence pΕMCV-CBTV sont transfectés en parallèle dans les cellules GP+Ε-86 (5xl05 cellules par boîte de 10cm) selon la méthode de Chen et Okyama (1987, Mol. Cell. Biol. , 7, 2745-2753 ; 1988, Bio/Techniques 6, 632-637). Différentes dilutions de surnageants des cultures GP+Ε-86 stables ou transitoires sont utilisées pour infecter les cellules cibles NIH3T3 ensemencées la veille de l'infection à raison de 2x10* cellules par puits. Au préalable, les surnageants viraux ont été filtrés (sur filtres de 0,45 μm) et mis en présence de polybrène à une concentration finale de 8 μg/ml. L'infection est pousuivie toute la nuit à 37°C et le jour suivant, les cellules sont lavées et cultivées dans du milieu frais. Après 48 h, les cellules sont placées en milieu sélectif (1 mg/ml de G418) ou colorées pour déterminer le nombre de cellules exprimant la phosphatase alcaline plap. On procède tout d'abord à une fixation dans du tampon PBSxl contenant 2% de formaldéhyde et 0,2% de glutaraldéhyde. Après deux rinçages dans du PBSxl suivis d'une incubation de 30 min à 65 °C dans du PBSxl, les cellules sont lavées à deux reprises dans du tampon AP (0,1 M Tris-HCl pH 9,5, 0,1 M NaCl, 50 mM MgCl2 dans du PBSxl) et placées 5 h dans la solution de coloration (0,1 mg/ml de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP), 1 mg/ml d'un sel de térazolium de Nitroblue (NBT) et 1 mM de Levamisol dans du tampon AP). Ces expériences de coloration histochimique confirment l'expression de la phosphatase alcaline dans les cellules helper GP+E-86 et dans les cellules cibles NIH3T3. Le titre des virus recombinants est déterminé après transfection des cellules écotropes GP+E-86. Après deux jours d'incubation, le surnageant viral est récolté et utilisé pour déterminer le titre viral (expression transitoire). Ensuite, les cellules transfectées sont sélectionnées au G418 pendant un mois. Après cette sélection, on détermine le titre viral sur le surnageant récolté (expression stable). Celui-ci correspond au nombre de particules infectieuses par ml de surnageant. Par la méthode des dilutions limites, les cellules cibles NIH3T3 sont infectées avec des dilutions en série de surnageant viral et, après deux jours d'incubation, les cellules sont colorées histochimiquement et comptées. Les résultats suivants sont obtenus (Tableau 2):
Figure imgf000031_0001
Les vecteurs pREV HW-1 et pREV HW-4 dépourvus de région d'encapsidation conventionnelle sont incapables de produire des particules virales infectieuses après transfection dans la lignée helper MLV (GP+E-86). Cependant, on indique que le vecteur pMCl peut être encapsidé dans des particules virales SNV après transfection de la lignée helper SNV D17-C3A2 (par exemple ATCC CRL8468), indiquant que les séquences REV-A s'étendant des nt 265 à 578 peuvent être utilisées dans ce contexte à titre de région d'encapsidation. Les vecteurs rétroviraux comprenant à la fois une séquence REV-A (265-578 ou 452-578) et une région d'encapsidation conventionnelle produisent des particules virales à un titre élevé (pREV HW-2, 3, 5 et 6). Cependant l'association avec la région d'encapsidation de MLV s'avère particulièrement avantageuse puisqu'elle donne des titres viraux 2 (pREV HW-6) à 5 fois (pREV HW-3) plus élevés que le vecteur de référence pEMCV-CBTV combinant cette même région d'encapsidation et TIRES EMCV. De plus, la comparaison des données obtenues avec les vecteurs identiques variant uniquement au niveau du segment REV-A mis en oeuvre (pREV HW-2 et pREV HW-5 oμ pREV HW-3 et pREV HW-6) laisse supposer que la séquence allant des nt 265 à 578 est capable de coopérer avec la région d'encapsidation et ainsi améliorer l'encapsidation des ARN viraux et en conséquence les titres viraux. Un élément interagissant d'une manière positive avec l'encapsidation pourrait être présent entre les nt 452 et 265 dans le génome REV-A.
3. Analyse des virus recombinants par microscopie électronique.
La morphologie des virions recombinants pREV HW produits après transfection de la lignée GP+E-86 par les vecteurs correspondants est analysée par microcopie électronique. On utilise à titre de témoins les virus obtenus de pEMCV-CBTV dans les mêmes conditions et les retrovirus sauvages obtenus après infection des cellules NIH3T3 avec la souche FMLV-29 (Friend murine leukemia virus souche 29). Les résultats de microscopie indiquent que le contenu en ARN n'affecte pas la morphologie des virus recombinants.
4. Effet de la rapamycine sur l'expression des cistrons plap et neo.
Les cellules GP+E-86 sont transfectées d'une manière stable par 20 μg de vecteurs de la série pREV HW ou pEMCV-CBTV et cultivées en conditions sélectives (G418) pendant 15 jours. A 70 à 80 % de confluence, elles sont mises en présence de rapamycine à une concentration finale de 20 ng/ml. Cette dernière a un effet inhibiteur sur la traduction coiffe-dépendante variant de 15 à 40 % selon la lignée cellulaire (Beretta et al. , 1996, EMBO J. 15, 658-664) mais n'affecte pas la traduction cap-indépendante. Les extraits cellulaires sont préparés classiquement après 20 h d'incubation. Brièvement, les cellules sont lavées deux fois dans du PBSxl, placées dans 1 ml de TEN (40 mM Tris-HCl pH7,5, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl) pour une boîte de 10 cm puis récupérées par grattage et centrifugées à faible vitesse. Le culot est repris dans 100 μl de Tris-HCl 0,25 M, pH8 et soumis à une lyse cellulaire par 3 cycles de congélation-décongélation. Après centrifugation 10 min à 14000 g, le surnageant est récupéré et peut être conservé à -70 °C en attendant de procéder aux tests enzymatiques. La concentration finale en protéine est déterminée par le test Micro BCA (Pierce). L'activité enzymatique plap des extraits cellulaires est évaluée spectrophotométriquement (kit alcaline phosphatase, BIORAD). Les unités plap sont déterminées par rapport à un standard constitué par la phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim). Les activités neo sont mesurées par le transfert de phosphate marqué au [γ-32P]sur la néomycine (Ramesh et Osborne, 1991, Anal. Biochem. 193, 316-318). Les résultats de l'expression des gènes plap et neo mesurés en absence et en présence de rapamycine sont illustrés à la Figure 4 et présentés dans le Tableau 3.
Tableau 3 : effet de la rapamycine sur l'expression des cistrons plap et neo exprimé en % par rapport aux cellules non traitées.
Figure imgf000033_0001
Dans les vecteurs pREV HW-1 et pREV HW-4, la présence de rapamycine réduit la traduction cap-dépendante et augmente celle dépendante de TIRES. Cette stimulation peut s'expliquer par une moindre compétition pour la machinerie traductionnelle en présence de rapamycine. Lorsque deux éléments IRES sont présents, l'addition de rapamycine s'accompagne d'une augmentation de l'expression des deux gènes. Cependant, les données quantitatives d'expreέsion indiquent que l'activité relative des IRES est différente, ce qui suggère une compétiton entre eux pour les ribosomes.
En résumé, l'ensemble des données montrent la présence d'un site IRES efficace dans le leader 5' des ARN du virus REV-A et, probablement d'un élément interagissant de manière positive avec l'encapsidation. L'élément IRES minimum est contenu au sein d'une séquence de 129 nt (positions 452 à 578).
EXEMPLE 3 : Transduction de cellules neuroectodermales humaines pluripotentes
Cette étude est réalisée dans la lignée cellulaire humaine Dev qui constitue un modèle cellulaire du système nerveux central, cible potentielle pour la thérapie génique humaine. Les cellules Dev dérivent d'une tumeur primaire humaine d'origine neuroectodermale (PNET) et se comportent comme des cellules souches pluripotentes (Derrington et al., 1997, Oncogene, sous presse). De plus, il est possible d'induire leur différenciation soit en neurones soit en cellules gliales (Derrington et al., 1997, supra ; Dufay et al., 1994, Eur. J. Neurosci. 6, 1633-1640 ; Giraudon et al., 1993, Neurosci. 52, 1069-1079). Dans cette étude, le vecteur dicistronique pREV HW-3 (IRES REV-A 265-578) est comparé au vecteur contrôle pEMCV CBTV (IRES EMCV).
Les cellules Dev sont infectées avec une dilution au 1/100 de surnageant viral pendant 2 jours puis fixées, colorées histochimiquement selon le protocole ci-dessus et comptées. Le titre viral est similaire pour les deux vecteurs et de Tordre de 3xl03 TU/ml. Les unités de transduction (TU/ml) correspondent au rapport du nombre de colonies x dilution du retrovirus infectant par le volume total (ml) du vecteur dilué placé sur les cellules.
On vérifie également l'expression des deux cistrons neo et plap. Pour ce faire, les cellules cibles sont comme précédemment transduites avec une dilution 1/100 de surnageant viral et sélectionnées en présence de G418 pendant 3 semaines. On détermine l'intensité de la fluorescence par cytométrie de flux avec un anticorps spécifique pour la plap (DAKO). On indique qu'un anticorps polyclonal convient. Les résultats montrent la production de l'enzyme plap par les cellules transduites et sélectionnées au G418. En parallèle, la synthèse de l'enzyme plap est confirmée par coloration histochimique des clones résistants. Ces données montrent que le vecteur dicistronique pREV HW-3 peut transduire de façon efficace des cellules humaines dérivées du système nerveux central et y transférer des gènes d'intérêt et confirment la fonctionnalité du site IRES REV-A pour médier la production du produit d'expression du second cistron.
Par ailleurs, différents protocoles de transduction ont été étudiés dans un but d'optimisation. Les variantes sont les conditions de culture des cellules en présence ou en absence de sérum et en présence ou en absence de facteurs de croissance (FGF-2) et la production des virus en présence ou en absence de sérum.
Les six protocoles suivants ont été comparés avec les virus pEMCV CBTV et pREV HW-3 possédant l'enveloppe polytrope GaLV (production sur cellules
PG13, ATCC CRL-10686). Protocole 1 : cellules cultivées en milieu avec sérum (10 %), virus produit en présence de sérum (10 %).
Protocole 2 : cellules cultivées en milieu avec sérum (10 %), virus produit en absence de sérum. Protocole 3 : cellules cultivées en milieu sans sérum, virus produit en présence de sérum (10 %).
Protocole 4 : cellules cultivées en milieu sans sérum, virus produit en absence de sérum. Protocole 5 : cellules cultivées en milieu sans sérum, virus produit en présence de sérum (10 %), présence de FGF-2. Protocole 6 : cellules cultivées en milieu sans sérum, virus produit en absence de sérum, présence de FGF-2. Le pourcentage de cellules Dev transduites est déterminé par cytométrie de flux (Figure 5). Le pourcentage de cellules transduites par pREV HW-3 dépasse 30% lorsque la culture des cellules Dev est effectuée en absence de sérum. Un tel % n'est pas atteint avec le virus conventionnel pEMCV CBTV. L'ajout de facteurs de croissance est également avantageux. Parmi tous les protocoles mis en oeuvre, le protocole 5 permet de transduire plus de 50 % de cellules Dev. Ces résultats montrent que les vecteurs polycistroniques de l'invention portant TIRES REV-A sont fonctionnels pour transduire les cellules neuroectodermales pluripotentes. Le développement de protocoles pour la transduction efficace de lignées cellulaires humaines est un point essentiel dans l'élaboration des stratégies de transfert de gènes.
L'expression des cistrons plap et neo est évaluée après différenciation neuronale et gliale (Derrington et al., 1997, supra). Brièvement, les cellules Dev adoptent un phénotype différencié en présence de sérum et de FGF-2 alors que lorsque la culture est réalisée en absence de sérum, le phénotype est pluripotent. Les résultats d'immunofluorescence avec un anticorps spécifique anti-plap sur cellules Dev transduites, sélectionnées au G418 et différenciées montrent une expression de la plap dans les cellules neuronales et gliales. Ces données suggèrent que l'état de différenciation n'inhibe pas la traduction médiée par TIRES REV-A.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: INSERM
(B) RUE: 101 rue de Tolbiac
(C) VILLE: Paris cedex 13
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 75654
(G) TELEPHONE: 01 44 23 60 00 (H) TELECOPIE: 01 45 85 68 56
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Nouveau site interne d'entrée des ribosomes et vecteur le contenant.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 940 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Reticuloendotheliosis virus
(B) SOUCHE: type A (REV-A)
(C) INDIVIDUEL ISOLE: leader 5' de l'ARN génomique REV-A
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
AAUGUGGGAG GGAGCUCCGG GGGGAAUAGC GCUGGCUCGC UAACUGCCAU AUUAGCUUCU 60
GUAAUCAUGC UUGCUUGCCU UAGCCGCCAU UGUACUUGAU AUAUUUCGCU GAUAUCAUUU 120
CUCGGAAUCG' GCAUCAUUUC UCGGAAUCGG CAUCAAGAGC AGGCUCAUAG ACCAUAAAAG 180
GAAAUGUUCG' UUGGAGGCGA GCAUCAGACC ACUUGCGCCA UCCAAUCACG AGCAAACACG 240
AGAUCGAACU AUCAUACUGA GCCAAUGGUU GUAAAGGGCA GAUGCUAUCC UCCAAUGAGG 300
GAAAAUGUCA UGCAACAUCC UGUCCUGUAA GCGGCUAUAU AAGCCAGGUG CAUCUCUUGC 360 UCGGGGUCGC CGUCCUACAC AUUGUUGUGA CGCGCGGCCC AGAUUCGAAU CUGUAAUAAA 420
AGUUUUUUUC UUCUAUAUCC UCAGAUUGGC AGUGAGAGGA GAUUUUGUUC GUGGUGUAGG 480
CUGGCCUACU GGGUGGGGUA GGGGUCCGGA CUGAAUCCGU AGUAUUUCGA UACAACAUUU 540
GGGGGCUCGU CCGGGAUUCC UCCCCAUCGG CAGAAGUGCC UACUGUUUCU UCGAACUCCG 600
GCGCCGGUAA GUAAGUACUU GAUUUUGGUA CCUCGCGAGG GUUUGGGAGG AUCGGAGUGG 660
CGGGACGCUG CCGGGAAGCU CCACCUCCGC UCAGCAGGGG ACGCCCUGAU CUGAGCUCUG 720
UGGUAUCUGA UUGUUGUUGG ACCGUCUCCA AGACGGUGAU AAUAUAAGUC GUGGUUUGUG 780
UGUUUGUUUG UUACCUUGUG UUUGUUCGUC ACUUGUCGAC AGCGCCCUGC GAAUUGGUGU 840
GCCCACACCG CGCGGCUUGC GAAUAAUACU UUGGAGAGUC UUUUGCCUCC AGUGUCUUCC 900
GUUUGUACUC GUCCUCCUCU CCCUCUCCGG CCGGGAUGGG 940 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 578 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Reticuloendotheliosis virus
(B) SOUCHE: type A (REV-A)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
GGGGUCGCCG UCCUACACAU UGUUGUGACG CGCGGCCCAG AUUCGAAUCU GUAAUAAAAG 60
UUUUUUUCUU CUAUAUCCUC AGAUUGGCAG UGAGAGGAGA UUUUGUUCGU GGUGUAGGCU 120
GGCCUACUGG GUGGGGUAGG GGUCCGGACU GAAUCCGUAG UAUUUCGAUA CAACAUUUGG 180
GGGCUCGUCC GGGAUUCCUC CCCAUCGGCA GAAGUGCCUA CUGUUUCUUC GAACUCCGGC 240
GCCGGUAAGU AAGUACUUGA UUUUGGUACC UCGCGAGGGU UUGGGAGGAU CGGAGUGGCG 300
GGACGCUGCC GGGAAGCUCC ACCUCCGCUC AGCAGGGGAC GCCCUGAUCU GAGCUCUGUG 360
GUAUCUGAUU GUUGUUGGAC CGUCUCCAAG ACGGUGAUAA UAUAAGUCGU GGUUUGUGUG 420
UUUGUUUGUU ACCUUGUGUU UGUUCGUCAC UUGUCGACAG CGCCCUGCGA AUUGGUGUGC 480
CCACACCGCG CGGCUUGCGA AUAAUACUUU GGAGAGUCUU UUGCCUCCAG UGUCUUCCGU 540
UUGUACUCGU CCUCCUCUCC CUCUCCGGCC GGGAUGGG 578

Claims

Revendications
1. Utilisation d'une séquence nucléotidique dérivée de tout ou partie de l'extrémité 5' de TARN génomique d'un retrovirus de type C à l'exception des virus de la leucémie murine de Friend (FMLV) et de Moloney
(MoMLV), à titre de site interne d'entrée des ribosomes (IRES) dans un vecteur et/ou pour permettre ou améliorer l'encapsidation d'un vecteur rétroviral.
2. Utilisation selon la revendication 1, selon laquelle le retrovirus de type C est sélectionné parmi les virus REV, MSV, MHV, MEV, FMOV, AMLV, MEELV, SFFV, RASV, FLV, FSV, EFLV, SSV, GALV et BAEV.
3. Utilisation selon la revendication 2, selon laquelle ladite séquence nucléotidique dérive de tout ou partie de l'extrémité 5' de TARN génomique d'un virus de la réticuloendotéliose.
4. Utilisation selon la revendication 3, selon laquelle ladite séquence nucléotidique dérive de tout ou partie de l'extrémité 5' de TARN génomique d'un virus de la réticuloendotéliose aviaire et, notamment de type A.
5. Utilisation selon Tune des revendications 1 à 4, selon laquelle ladite séquence nucléotidique est substantiellement homologue ou identique à tout ou partie de la séquence présentée dans l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 1.
6. Utilisation selon la revendication 5, selon laquelle ladite séquence nucléotidique est substantiellement homologue ou identique à la séquence présentée dans l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 2 : (i) commençant au nucleotide 1 et se terminant au nucleotide 578, (ii) commençant au nucleotide 265 et se terminant au nucleotide 578, ou (iii) commençant au nucleotide 452 et se terminant au nucleotide 578.
7. Utilisation selon la revendication 6, selon laquelle ladite séquence nucléotidique est identique à la séquence présentée dans l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 2 :
(i) commençant au nucleotide 1 et se terminant au nucleotide 578, (ii) commençant au nucleotide 265 et se terminant au nucleotide 578, ou (iii) commençant au nucleotide 452 et se terminant au nucleotide 578.
8. Vecteur pour l'expression d'un ou plusieurs gène(s) d'intérêt comprenant ladite séquence nucléotidique en usage selon Tune des revendications 1 à 7.
9. Vecteur selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur plasmidique ou d'un vecteur viral dérivé d'un virus sélectionné parmi le groupe des poxvirus, adénovirus, baculovirus, virus de l'herpès, virus associé à un adénovirus et retrovirus.
10. Vecteur selon la revendication 8 ou 9, dérivant d'un retrovirus et comprenant au moins les éléments suivants associés d'une manière fonctionnelle : un LTR 5' et un LTR 3' rétroviraux, un ou plusieurs gène(s) d'intérêt, et ladite séquence nucléotidique telle que définie dans Tune des revendications 1 à 7 pour permettre ou améliorer l'encapsidation dudit vecteur dans une particule virale et/ou à titre de site IRES pour permettre ou améliorer l'expression d'un gène d'intérêt positionné en aval de ladite séquence nucléotidique.
1 1. Vecteur rétroviral selon la revendication 10, dans lequel ladite séquence nucléotidique est à titre de site IRES et comprenant en outre une région d'encapsidation hétérologue à ladite séquence nucléotidique.
12. Vecteur rétroviral selon la revendication 10 ou 1 1, comprenant au moins :
(a) un LTR 5' rétroviral,
(b) une région d'encapsidation,
(c) de manière optionnelle, un premier gène d'intérêt suivi d'une région promotrice interne une origine différente de celle dudit LTR 5' rétroviral,
(d) un second gène d'intérêt,
(e) un site 1RES,,
(f) un troisième gène d'intérêt, et
(g) un LTR 3' rétroviral, l'un au moins de la région d'encapsidation et du site IRES étant constitué par ladite séquence nucléotidique en usage selon Tune des revendications l à 7.
13. Vecteur rétroviral selon la revendication 12, dans lequel la région promotrice interne, le second gène d'intérêt, le site IRES et le troisième gène d'intérêt sont dans une orientation inverse par rapport aux LTRs 5' et 3' rétroviraux.
14. Vecteur rétroviral selon la revendication 12 ou 13, dans lequel la région d'encapsidation dérive d'un retrovirus murin, notamment d'un MoMLV, ou d'un rétrotransposon de type VL30 et le site IRES comprend une séquence nucléotidique telle que définie à la revendication 6.
15. Vecteur rétroviral selon la revendication 14, dans lequel la région d'encapsidation dérive d'un MoMLV et le site IRES comprend une séquence nucléotidique identique à la séquence présentée dans l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 2 commençant au nucleotide 265 et se terminant au nucleotide 578 ou commençant au nucleotide 452 et se terminant au nucleotide 578.
16. Vecteur rétroviral selon la revendication 10, comprenant un LTR 5' rétroviral dérivé d'un virus REV, notamment SNV, un LTR 3' rétroviral d'une origine quelconque, un ou plusieurs gène(s) d'intérêt, et une séquence nucléotidique substantiellement homologue ou identique à la séquence présentée dans l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 2 commençant au nucleotide 1 et se terminant au nucleotide 578, ou commençant au nucleotide 265 et se terminant au nucleotide 578, à titre de région d'encapsidation.
17. Un vecteur selon l'une des revendications 8 à 16, comprenant un gène d'intérêt codant pour un produit d'expression sélectionné parmi le facteur VIII, le facteur IX, la protéine CFTR, la dystrophine, l'insuline, l'interféron alpha, béta, gamma, une interleukine (IL) notamment TIL-2 et un marqueur de sélection.
18. Une particule virale générée à partir d'un vecteur viral selon l'une des revendications 8 à 17.
19. Une cellule comprenant un vecteur selon l'une des revendications 8 à 17 ou infectée par une particule virale selon la revendication 18.
20. Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 8 à 17, d'une particule virale selon la revendication 18 ou d'une cellule selon la revendication 19 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention d'une maladie traitable par thérapie génique.
21. Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 8 à 17, d'une particule virale selon la revendication 18 ou d'une cellule selon la revendication 19 pour la préparation d'un ou plusieurs polypeptides d'intérêt par voie recombinante ou pour la production d'un animal transgénique.
22. Une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique, un vecteur selon l'une des revendications 8 à 17, une particule virale selon la revendication 18, une cellule selon la revendication 19 ou un polypeptide d'intérêt obtenu selon l'utilisation selon la revendication 21, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
23. Une composition pharmaceutique selon la revendication 22, caractérisée en ce qu'elle comprend entre 104 et 10'4 pfu, et de préférence entre 106 et 10" pfu particules virales selon la revendication 18.
24. Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 8 à 17, d'une particule virale selon la revendication 18 ou d'une composition pharmaceutique selon la revendication 22 ou 23, pour la transfection ou l'infection de cellules pluripotentes, notamment de cellules pluripotentes du système nerveux central.
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