WO1998049335A1 - Construction et expression d'enveloppe chimerique de retrovirus par des vecteurs, et compositions pharmaceutiques les contenant - Google Patents

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WO1998049335A1
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Anne Weber
Tuan Nguyen
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Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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Definitions

  • the present invention relates to new constructs for the expression of a chimeric virus envelope protein comprising a nucleic sequence of a gene coding for a protein fused with a nucleic sequence coding for a transmembrane virus envelope protein, the vectors or viral particles containing them, the cells transformed by said viral particles as well as the methods for producing said viral particles.
  • the invention also includes the use of said viral particles for the preparation of a medicament intended for the treatment and / or prevention of a disease treatable by gene therapy as well as the pharmaceutical compositions containing them.
  • the vectors are obtained by deletion of at least part of the viral genes which are replaced by the genes of therapeutic interest.
  • Such vectors can be propagated in a complementation line which provides in trans the deleted viral functions to generate a viral vector particle defective for replication but capable of infecting a host cell.
  • retroviral vectors are among the most used, but mention may also be made of vectors derived from adenoviruses, viruses associated with adenoviruses, poxviruses and herpes viruses. This type of vector, their organization and their mode of infection are widely described in the literature accessible to those skilled in the art.
  • the principle of gene therapy is to deliver a functional gene whose RNA or corresponding protein will produce the desired biochemical effect in the targeted cells or tissues.
  • Gene therapy has several potential advantages compared to conventional biochemical pharmacology.
  • the insertion of genes allows the prolonged expression of complex and unstable molecules such as RNA or proteins which can be extremely difficult or even impossible to obtain or administer directly.
  • the controlled insertion of the desired gene inside specific targeted cells makes it possible to regulate the expression product in defined tissues.
  • gene therapy is in principle permanent in the individual as soon as the gene continues to function in the chosen cell or in its offspring. For this, it is necessary to be able to insert the desired therapeutic gene inside selected cells and therefore to have an insertion method capable of specifically targeting the selected cells or tissues.
  • the level of expression of the transferred gene, to be functional must be in line with the appropriate level of the product required in the cell.
  • retroviral type gene transfer systems exhibit both a low infectious power
  • retroviruses a number of ligands have been fused to the N-terminal part of a surface protein (denoted SU) of the envelope of the retrovirus.
  • a surface protein denoted SU
  • single chain fragments of antibodies directed against surface antigens of the target cells are inserted by fusion at the N-terminal part of the SU (VALSESIA-ITTMAN, S. et al., J. of Virology , 1996, 70, 3, 2059-2064; TEARINA CHU, TH et al., J. of Virology 1997, 71, 1, 720-725).
  • avian retroviruses the spleen necrosis virus (SNV or “Spleen Necrosis Virus”) or the murine Moloney leukemia virus (Mo-MuLV virus) with modified type envelopes. ecotropic or amphotropic. All of these studies have shown the possibility for these modified envelope viral particles to bind specifically to new cellular receptors. However, they have highlighted the ineffectiveness of the transduction mechanisms that follow the step of binding the ligand to its receptor.
  • the liver is one of the important targets of gene therapy in particular as an alternative for the treatment of genetic diseases. Hepatocytes are quiescent cells which must be induced to proliferate in order to allow transduction of retroviruses (Weber-Benarous, A.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • the present invention relates to a construct for the expression of a chimeric virus envelope protein, characterized in that it comprises the nucleic sequence of a gene, or of its cDNA, coding for a protein, or one of its biologically active fragments, capable of binding to an animal cell, said nucleic sequence being fused with a nucleic sequence coding for a transmembrane protein of the envelope of a virus, or for one of its biologically active fragments.
  • protein capable of binding to an animal cell is meant any protein capable of binding specifically to the surface of the membrane of an animal cell, such as for example the binding linked to interactions of antibody-antigen, ligand-receptor or enzyme type. - substrate.
  • biologically active fragment means any fragment capable of fully or partially exercising the biological activity of the protein from which it is derived.
  • the constructions according to the invention are preferred, characterized in that the transmembrane protein of the envelope of the virus is a transmembrane protein of the envelope of the retrovirus, in particular the avian, bovine, murine, feline retroviruses or the retroviruses. primate.
  • Amphotropic retroviruses are particularly preferred, such as amphotropic murine leukemia Moloney viruses.
  • avian retroviruses such as avian erythroblastosis virus (AEV), avian leukemia virus (AVL), avian sarcoma virus (ASV), necrosis virus of spleen (SNV) and Rous sarcoma virus (RSV), bovine retroviruses, feline retroviruses, murine retroviruses such as murine leukemia virus (MuLV), Friend virus (F - MLV) and murine sarcoma virus (MSV) and primate retroviruses.
  • AEV avian erythroblastosis virus
  • ASV avian leukemia virus
  • ASV avian sarcoma virus
  • SNV necrosis virus of spleen
  • RSV Rous sarcoma virus
  • bovine retroviruses bovine retroviruses
  • feline retroviruses murine retroviruses
  • murine retroviruses such as murine leukemia virus (MuLV), Friend virus
  • the invention also relates to constructs according to the invention, characterized in that the nucleic sequence coding for the transmembrane protein is fused to the 3 'terminal part of the nucleic sequence of the gene, or of its cDNA, coding for the protein capable of attach to an animal cell.
  • transmembrane protein is thus fused to the C-terminal part of said protein which can bind to an animal cell
  • the invention furthermore comprises the constructions according to the invention, characterized in that the nucleic sequence coding for the protein which can bind to an animal cell is fused to the 5 ′ -terminal part of the nucleic sequence coding for the transmembrane protein.
  • Said protein which can bind to an animal cell is thus fused with the N-terminal part of said transmembrane protein.
  • the invention also relates to constructions according to the invention, characterized in that the nucleic sequence coding for the transmembrane protein is a nucleic sequence coding for a transmembrane protein comprising a mutation.
  • mutation is meant in the present description any modification obtained by insertion, deletion or substitution of at least one nucleotide of the nucleic sequence coding for the transmembrane protein of the wild virus.
  • mutations such as the transmembrane protein encoded by the nucleic sequence comprising said mutation are preferred, which conserves at least one of the biological characteristics of the transmembrane protein of the wild virus, in particular its incorporation into the membrane when, for example, a particle recombinant virus expresses such a transmembrane protein thus mutated.
  • the constructions according to the invention are preferred, characterized in that the mutation is located at the 3 ′ -terminal and / or 5 ′ -terminal part of the nucleic sequence coding for the transmembrane protein.
  • the constructions are also preferred, characterized in that the mutation located at the 3 ′ -terminal part makes it possible to express a chimeric virus envelope protein in which the cytoplasmic domain of the transmembrane protein is not expressed , in particular by the insertion of a stop codon at the Clal cleavage site of the nucleic sequence coding for the transmembrane protein.
  • the constructs according to the invention are characterized in that the mutation located at the 5 ′ -terminal part makes it possible to express a chimeric virus envelope protein in which the SU-TM cleavage site enters the SU surface protein and the transmembrane protein is not expressed or deleted.
  • the constructs according to the invention are characterized in that the mutation located at the 5 ′ -terminal part makes it possible to express a chimeric virus envelope protein in which the first 6 amino acids of transmembrane protein is not expressed or deleted.
  • the invention comprises constructs according to the invention, characterized in that the animal cell on which said protein can be fixed is a mammalian cell. preferably human, more preferably selected from muscle cells, lung cells, liver cells, or lymphocytes.
  • liver cells such as hepatocytes are the most preferred.
  • the invention comprises constructs according to the invention, characterized in that said protein which can bind to an animal cell is chosen from: a) a polypeptide ligand of a cellular receptor of said animal cell; b) a single chain anti-cell surface antigen antibody of said animal cell. Also designated by protein capable of binding to an animal cell, any biologically active fragment of said protein capable of binding to said animal cell.
  • the protein which can bind to an animal cell induces the proliferation of said animal cell, such as in particular a cell growth factor, in particular the factor of hepatocyte growth called HGF.
  • a cell growth factor in particular the factor of hepatocyte growth called HGF.
  • Cell growth factor is understood to mean any cell protein, or one of its biologically active fragments, capable of inducing, for example, cell proliferation such as HGF or growth factors specific for hematopoietic cells, or of exercising an activity. mitogenic.
  • constructs for the expression of a chimeric envelope protein of the invention may further comprise the elements allowing the expression of said chimeric envelope protein, in particular a promoter capable of directing the expression of said chimeric envelope protein such as for example the LTR promoter or the cytomegalovirus promoter.
  • elements allowing the expression of said chimeric envelope protein also include the polyadenylation sequences or any other promoter or regulatory sequence known to those skilled in the art allowing the expression of said chimeric envelope protein.
  • the invention also includes the proteins expressed by a construct according to the invention.
  • the invention also relates to vectors, characterized in that they comprise a construction according to the invention, in particular the plasmid vectors or the viral particles, in particular the retroviral particles.
  • the invention relates to a method for producing a viral particle, characterized in that it implements a construction or a vector according to the invention.
  • a production method according to the invention is preferred in which the chimeric envelope protein encoded by the nucleic sequence of a construction according to the invention or included in a vector according to the invention is expressed on the surface of said viral particle obtained by said process.
  • the method for producing a viral particle according to the invention is characterized in that it comprises a step in which a cell capable of producing a viral particle capable of infecting a host cell is transfected with a vector according to the invention.
  • said viral particle capable of infecting a host cell is a retrovirus chosen from the retroviruses mentioned above for the preferred retroviruses from which the transmembrane proteins originate, in particular retroviruses of amphotropic nature.
  • the invention further comprises the viral particles obtained by a method according to the invention.
  • the viral particles the envelope of which comprises a chimeric protein expressed by a construct according to the invention, or obtained by a method according to the invention are characterized in that they additionally comprise envelope proteins of wild virus.
  • wild virus envelope proteins is intended to denote unmodified virus envelope proteins, such as, for example, the surface envelope proteins SU and the transmembrane proteins TM of the particles. viral from which are obtained after transformation said viral particles of the invention.
  • the invention also relates to a viral particle according to the invention, characterized in that it comprises a nucleic sequence coding for a gene of interest.
  • a gene of interest for use in the invention can be obtained from a eukaryotic or prokaryotic organism or from a virus by any conventional technique. It is preferably capable of producing an expression product having a therapeutic effect and it may be a product homologous to the host cell or, alternatively, heterologous.
  • the term expression product denotes a protein or a fragment thereof.
  • a gene of interest can encode a product (i) intracellular (ii) membrane present on the surface of the host cell or (iii) secreted outside the host cell. It can therefore include appropriate additional elements such as, for example, a sequence coding for a secretion signal. These signals are known to those skilled in the art.
  • a gene of interest can code for a protein corresponding to all or part of a native protein as found in nature. It can also be a chimeric protein, for example originating from the fusion of polypeptides of various origins or a mutant exhibiting improved and / or modified biological properties. Such a mutant can be obtained by conventional biological techniques by substitution, deletion and / or addition of one or more amino acid residues.
  • a vector according to the invention is particularly intended prevention or treatment, hemophilia A or B, cancer, AIDS or other infectious diseases caused by a pathogenic organism: virus, bacteria, parasite or prion.
  • genes of interest which can be used in the present invention are those which code for the following proteins: a cytokine and in particular an interleukin, an interferon, a tissue necrosis factor and a growth factor and in particular hematopoietic (G-CSF, GM- CSF), a factor or cofactor involved in coagulation and in particular factor VIII, von illebrand factor, antithrombin III, protein C, thrombin and hirudin, - an enzyme such as in particular trypsin or a ribonuclease, a enzyme inhibitor such as ⁇ l-antitrypsin and viral protease inhibitors, a suicide gene expression product such as HSV (herpes virus) thimidine kinase type 1, an activator or a ion channel inhibitor, a protein whose absence, modification or deregulation of expression is responsible for a genetic disease, such as the protein CFTR, insulin, ADA (adenosine diaminase), glucoc
  • a gene of interest in use in the present invention can also code for a selection marker making it possible to select or identify the host cells transfected with a vector according to the invention.
  • a selection marker making it possible to select or identify the host cells transfected with a vector according to the invention.
  • viral particles according to the invention are preferred, characterized in that said gene of interest codes for a protein, or one of its biologically active fragments, chosen from factor VIII, factor IX, protein
  • CFTR dystrophin
  • insulin gamma interferon
  • interleukin an interleukin or a selection marker.
  • the invention also includes animal cells, in particular mammalian and in particular human cells, such as those in which the chimeric envelope proteins of the invention can be fixed, transformed by a viral particle according to the invention.
  • the invention further relates to the use of a viral particle according to the invention or of a cell according to the invention, for the preparation of a medicament intended for the treatment and / or prevention of a disease treatable by therapy. gene.
  • the invention also includes pharmaceutical compositions comprising, as therapeutic or prophylactic agent, a viral particle according to the invention or a cell according to the invention in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the invention preferably comprises the pharmaceutical compositions according to the invention, characterized in that they comprise between 10 4 and 10 14 pfu, and preferably between 10 ⁇ and 10 11 pfu of viral particles according to the invention.
  • the use of the viral particles, cells or pharmaceutical compositions of the invention will be particularly intended for the treatment and / or prevention of a genetic disease or of an acquired disease such as cancer or to a infectious disease.
  • a vector according to the invention can be used for other purposes such as the recombinant production in eukaryotic cells of expression products intended to be included after purification in said pharmaceutical composition.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can be manufactured in a conventional manner.
  • a therapeutically effective amount of such an agent is combined with an acceptable carrier, diluent or adjuvant. It can be administered by any route of administration and this in a single or repeated dose after a certain interval of interval.
  • the quantity to be administered will be chosen according to certain criteria, in particular the use as a treatment or vaccine, the route of administration, the patient, the type of disease to be treated and its state of progress, the duration of treatment etc.
  • a pharmaceutical composition according to the invention comprises between 10 4 and 10 14 pfu (unit forming plaques), advantageously between 10 5 and 10 13 pfu and, preferably, between 10 6 and 10 11 pfu of viral particles .
  • FIGURE 1 Schematic representation of plasmid encoding the HGF-TM chimeric proteins. - The shaded boxes represent the sequences of the retroviral LTR or the promoter of the human cyto-equalovirus. The open boxes represent the sequences of 1 HGF.
  • the solid boxes represent the sequences of the transmembrane proteins TM of the envelope of the amphotropic virus 4070A;
  • the hepatocyte growth factor (HGF) cDNA comprising its signal sequence is fused to the gene for the transmembrane protein TM of the envelope of the amphotropic virus 4070A at amino acid 435 (located after the SU / TM cleavage site ).
  • HGF hepatocyte growth factor
  • FIGURE 2 Detection of the HGF-TM chimeric envelope.
  • Pr65gag, Pr80 env and the chimeric HGF-TM are represented.
  • Line 1 control cells (HY); 2, LHT cells; 3, LHTC cells; 4, clone LHTC8;
  • Control cells (- -) and LHTC5 cells are revealed by an anti-HGF antibody.
  • FIGURE 3 Infection of murine hepatocytes with modified retroviral particles transduced with the nls-lacZ gene.
  • the medium of the confluent virus producing cells is replaced by 5 ml of a mixture (v / v) consisting of a medium for hepatocytes and a medium for producing cells containing 5 mM of butyrate sodium and 10 "6 of dexamethasone.
  • the hepatocytes are infected 48 hours after spreading in the presence of 3 ⁇ g / ml of polymer.
  • the infection is stopped by replacing the viral supernatant with a culture medium containing 5 ng / ml of recombinant HGF.
  • the transduction of the cells is detected by histochemical staining with an X-Gal solution.
  • Top left hepatocytes infected with 1 ml of undiluted viral vector containing the wild envelope, harvested from the producer cells HY.
  • HGF-TM and wild harvested from LHT producing cells Top right: hepatocytes infected with 1 ml of undiluted viral vector with the chimeric envelope
  • HGF-TM / Cla and wild harvested from LHTC producing cells were assessed for HGF-TM / Cla and wild harvested from LHTC producing cells.
  • FIGURE 4 Biological activity of. retroviral particles expressing chimeric envelopes a Viral particles expressing proteins of chimeric or wild envelopes are harvested from different cell lines and used to transduce NIH3T3 or MDCK cells to determine virus titers. The number of cells expressing the bacterial gene lacZ (containing the signal for the location of the nucleus, nls-lacZ), the cells are labeled with 5-bromo- -chloro-3 -indoyl- ⁇ -d-galactopyranoside. MDCK cells are cultured on essential minimum Dulbeco medium (DMEM) containing 10% of fetal calf serum. The 3T3 cells are cultured on DMEM containing newborn calf serum. b In order to correct the slight variation in titer between the wild and modified viruses of the two cell lines, the percentage of infection of MDCK cells relative to 3T3 cells was calculated according to the formula:
  • the medium of the producing cells is incubated with anti-HGF antibodies (10 ⁇ g / ml) or with the c- receptor
  • EXAMPLE 1 CONSTRUCTION OF THE CHEMICAL ENVELOPE HGF is a monomeric protein which can be obtained by proteolytic reaction in an active form composed of heterodimers linked by disulfide bridges
  • the construction of the retroviral particles exhibiting HGF was carried out by fusing the coding sequence for TM (transmembrane protein) to the 3 'terminal part of the cDNA coding for human HGF.
  • the TM coding sequence was obtained by PCR using the following two primers: TM 5 '(CATCTTAGGTACCCGCGGTTCTGGCCCTTCTACTAGGA)
  • HGF-TM protein has the entire coding sequence for HGF and virtually the complete coding sequence for TM, with the exception of the first 6 amino acids of the ectodomain.
  • the HGF-TM / Cla chimera has a stop codon inserted at the ClaI site, site of the TM gene, in order to eliminate the cytoplasmic domain of the HGF-TM protein.
  • HGF-TM and HGF-TM / Cla were cloned into a vector expression cassette and expressed under the control of different promoters such as the retroviral LTR or the cytomegalovirus promoter (FIG. 1).
  • the constructs were then cotransfected into LLZ- ⁇ -CRIP cells with a plasmid expressing the gene for resistance to hygromycin B.
  • the LLZ cells express the retroviral reporter vector MFG-nlsLacZ and produce amphotropic type viral particles which can infect host cells.
  • Stable lines expressing the chimeric protein were produced by selection with hygromycin B for 3 weeks and then analyzed.
  • the LLZ- ⁇ -CRIP cells were also transfected with the selected plasmid alone and then cultured for 3 weeks in a medium containing hygromycin B in order to obtain control cells for the infection experiments having the same number of passages that cells expressing viruses with the chimeric envelope.
  • Lysates of cells transfected with plasmids expressing the fused protein TM-HGF were analyzed by immunoblotting with anti-TM polyclonal antibodies and anti-HGF monoclonal antibodies (FIG. 2).
  • the precursor Pr80 env and the recombinant protein TM of 15 kDa were detected in the cell extracts by the anti-TM serum.
  • a 95 kDa protein has been specifically detected in LHTC5 cell extracts by anti-HGF monoclonal antibodies.
  • the molecular weight of this protein accurately reflects the predicted size for the HGF-TM / Cla chimeric envelope protein.
  • no TM hybrid was detected in the pellets of control control cells.
  • the 3 cell lines were analyzed using the FACS " system (" Fluorescence-Activated Cell Sorter ") using an anti-HGF monoclonal antibody . The three populations were specifically labeled with the anti-HGF antibody.
  • the cell supernatants are ultracentrifuged using a Beckman centrifuge equipped with an S 28 rotor at 25,000 rpm for 1.5 hours at 4 ° C.
  • the virion pellets obtained are then analyzed by immunoblotting using different antibodies directed against the viral structural proteins: polyclonal goat anti-SU serum (Quality Biotech Inc. Camden N.J.); anti-capsid protein p30; anti-TM antibodies. Results not shown.
  • the virus titer is determined by infection of murine fibroblasts N1H3T3 with a cell culture supernatant. These fibroblasts do not express the c-met receptor.
  • Control control cells produce 5.10 5 colony forming units per ml of supernatant.
  • the viral particles presenting the wild envelope and the fused chimeric envelope do not show a reduction in the titer in virus.
  • the chimeric protein does not alter the functionality of the wild envelope protein or the binding to the viral receptor. Nor does it alter the events which follow the binding of the viral particle to the receptor with regard to the efficiency of the transduction.
  • retroviral vectors exhibiting chimeric envelope proteins of the ecotropic type or of the avian type show at least a reduction of two logarithms of the titer of virus even for viruses with wild type envelope protein.
  • LacZ retroviral vector was carried out on primary cultures of murine hepatocytes as already described.
  • the infections were carried out on hepatocytes for 5 hours.
  • the virus with an HGF envelope shows an infection efficiency three times greater on hepatocytes than the wild type viruses (FIG. 3).
  • HGF is a powerful mitogen for hepatocytes, it has been examined whether the incorporation of HGF on the viral particles results not only in the binding of these viral particles to the c-met receptor, but also in the induction of hepatocyte proliferation.
  • the infection of murine hepatocytes was carried out in the presence of bromo-deoxy-Uridine (BrdU).
  • the murine hepatocytes are cultured in the absence of growth factor.
  • few hepatocytes incorporate BrdU when cells are infected with wild type retroviral particles.
  • the infection is carried out with retroviral particles expressing HGF on the envelope, the cells labeled with BrdU are easily detectable.
  • HGF-TM or HGF-TM / Cla are capable of binding to c-met receptors, but also of being cleaved by proteolysis to give a completely active heterodimer, capable of inducing transduction of a signal leading to the proliferation of one hepatocyte.
  • knowing that hepatocytes divide only once in culture (rarely twice) the increase in the efficiency of infection is not due to the mitogenic activity of the particles having 1 HGF.
  • Viral infection is a multi-step operation which depends first of all on the binding of glycoproteins from the viral envelope to the specific receptor on the cell surface. This fixation causes a conformational change in the protein of the viral envelope and then the fusion of the cell and viral membrane.
  • the tropism of the virus is determined by the surface proteins SU while TM is a transmembrane protein which plays an important role as a mediator during membrane fusion.
  • the envelope complex is selectively incorporated in the form of an oligomer in the virions at the time of their replication.
  • HGF human leukemia retrovirus
  • TM murine leukemia retrovirus
  • CD4 or a chimeric cytoplasmic CD4 of retroviral origin, could be effectively incorporated into RSV virus particles (Rous sarcoma virus).
  • the HGF-TM chimeric proteins do not interfere with the maturation of the envelope glycoprotein precursor, nor with its incorporation into the virion membrane.
  • the particles having both an amphotropic glycoproteic envelope of the wild type and a chimeric HGF-TM protein and as obtained in Example 1 infect with greater efficiency the cells expressing the c-met receptor. It is likely, from these results, that the modified virions are better fixed and retained on the surface of the cells by the HGF receptor. Subsequently, by lateral diffusion of the membrane, the SU subunit can 23
  • the TM subunit bind to the viral receptor and the TM subunit trigger the fusion of the viral and cellular membrane.
  • a chimeric protein corresponding to the fusion of HGF and TM was constructed and stable cell lines producing retroviral vectors such as amphotropic retroviral vectors exhibiting HGF were produced.
  • This chimeric envelope protein exhibiting HGF-TM is capable of binding the viral particle to the surface of the cell via HGF and its receptor without preventing the binding of the SU viral subunit to its membrane receptor. . It also appears that the presence of wild type envelope is necessary as an aid to efficient membrane fusion.
  • signal transduction, via the HGF group increases the proliferation of hepatocytes.
  • the chimeric protein HGF-TM does not interfere with the maturation of the glycoproteic precursor of the envelope or with its incorporation into the membrane of the virion.
  • the co-expressed HGF molecules correspond to a polypeptide of 674 amino acids, but this does not prevent the SU subunit from reaching and binding to its receptor, suggesting that these two receptors can be positioned close to each other on the membrane of the target cell.
  • the triggering of signals mediated by the c-met receptor during the attachment of the HGF group associated with the virus does not block the dissociation of the SU trimer, the rearrangement of TM and the entry of the virus.
  • the initial phase could be the binding of the virus exhibiting HGF to the HGF receptor, given the high affinity of HGF for its receptor c- met compared to that of the SU-Ram-I interaction (close to the nanomole).
  • stabilization of the fixed viral particle allows the SU subunit to bind to the nearby viral receptor by lateral diffusion of the membrane and to trigger membrane fusion via the unmodified TM subunit of the type wild. This makes it possible to obtain modified virions capable of efficiently transferring a gene to cells expressing the c-met receptor.

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Abstract

La présente invention concerne des constructions pour l'expression d'une protéine chimérique d'enveloppe de virus comprenant une séquence nucléique d'un gène codant pour une protéine fusionnée avec une séquence nucléique codant pour une protéine transmembranaire d'enveloppe de virus, les vecteurs ou particules virales les contenant, les cellules transformées par lesdites particules virales ainsi que les procédés de production desdites particules virales. L'invention comprend également l'utilisation desdites particules virales pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention de maladie traitable par thérapie génique ainsi que les compositions pharmaceutiques les contenant.

Description

CONSTRUCTION ET EXPRESSION D'ENVELOPPE CHIMERIQUE DE RETROVIRUS PAR DES VECTEURS, ET COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LES CONTENANT
La présente invention concerne de nouvelles constructions pour l'expression d'une protéine chimérique d'enveloppe de virus comprenant une séquence nucléique d'un gène codant pour une protéine fusionnée avec une séquence nucléique codant pour une protéine transmembranaire d'enveloppe de virus, les vecteurs ou particules virales les contenant, les cellules transformées par lesdites particules virales ainsi que les procédés de production desdites particules virales. L'invention comprend également l'utilisation desdites particules virales pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention de maladie traitable par thérapie génique ainsi que les compositions pharmaceutiques les contenant.
L'intérêt de la thérapie génique appliquée à l'homme n'est plus à démontrer car elle pourrait concerner de nombreuses applications thérapeutiques comme les maladies génétiques, les maladies infectieuses et les cancers. De nombreux documents de 1 ' art antérieur décrivent les moyens de mettre en oeuvre une thérapie génique, notamment par l'intermédiaire de vecteurs viraux. D'une manière générale, les vecteurs sont obtenus par délétion d'au moins une partie des gènes viraux qui sont remplacés par les gènes d'intérêt thérapeutique. De tels vecteurs peuvent être propagés dans une lignée de complémentation qui fournit en trans les fonctions virales délétées pour générer une particule de vecteur viral défective pour la réplication mais capable d'infecter une cellule hôte. A ce jour, les vecteurs rétroviraux sont parmi les plus utilisés mais on peut citer également des vecteurs issus des adénovirus , virus associés aux adénovirus, poxvirus et virus de l'herpès. Ce type de vecteur, leur organisation et leur mode d'infection sont largement décrits dans la littérature accessible à l'homme de l'art.
Le principe de la thérapie génique est de délivrer un gène fonctionnel dont l'ARN ou la protéine correspondante produira l'effet biochimique désiré dans les cellules ou tissus ciblés. La thérapie génique présente plusieurs avantages potentiels comparée à la pharmacologie biochimique classique. D'une part l'insertion de gènes permet 1 ' expression prolongée de molécules complexes et instables comme des ARN ou des protéines qui peuvent être extrêmement difficiles voire impossibles à obtenir ou à administrer directement. D'autre part l'insertion contrôlée du gène désiré à 1 ' intérieur de cellules spécifiques ciblées permet de réguler le produit d'expression dans des tissus définis. Enfin la thérapie génique est en principe permanente dans 1 ' individu dès lors que le gène continue de fonctionner dans la cellule choisie ou dans ses progénitures. Pour cela, il est nécessaire de pouvoir insérer le gène thérapeutique désiré à 1 ' intérieur de cellules choisies et donc de disposer de méthode d'insertion capable de cibler spécifiquement les cellules ou les tissus choisis. De plus, le niveau d'expression du gène transféré, pour être fonctionnel, doit être en adéquation avec le niveau approprié du produit requis dans la cellule.
Parmi les méthodes d'insertion de gènes, l'utilisation de particules virale, comme les rétrovirus, est largement répandue. Cependant, appliqués in vivo, les systèmes de transfert de gène de type rétroviral recombinant présentent à la fois un faible pouvoir infectieux
(concentration insuffisante de particules virales ) et un manque ' de spécificité vis à vis des cellules cibles choisies. Ainsi la plupart des protocoles d'expérimentation de transfert de gène sont réalisées actuellement ex vivo sur des cultures de tissus spécifiques. De tels protocoles dans lesquels les tissus ciblés doivent être infectés hors du patient, sont très coûteux, très complexes et techniquement limitées à certaines applications.
C'est pourquoi, la réalisation de vecteurs viraux cellules spécifiques, présentant un tropisme spécifique de tissu et permettant la transduction du gène d'intérêt dans les cellules cibles, est certainement un des objectifs à atteindre pour garantir le succès de la thérapie génique.
Plusieurs approches ont été testées pour modifier l'éventail des cellules hôtes cibles des particules retrovirales en réalisant des chimères d'enveloppe écotropiques et amphotropiques de ces particules virales. En ce qui concerne les rétrovirus, nombre de ligands ont été fusionnés à la partie N-terminale d'une protéine de surface (notée SU) de l'enveloppe du rétrovirus. Dans une première approche, on a substitué à des petits fragments de SU de l'enveloppe externe du virus
(noté Env) des ligands spécifiques (en général des peptides linéaires) de molécules de surface de la cellule hôte cible. On peut citer par exemple la construction de particules retrovirales présentant la molécule CD4 à la surface de 1 'Env de manière à cibler les cellules humaines infectées par le virus HIV (YOUNG, J. A. T. et al., Sciences 1990, 250, 1421-1423), de particules virales présentant une hormone peptidique fusionnée avec une SU de l'Env pour infecter spécifiquement les cellules exprimant le récepteur correspondant (KASAHARA, N. Et al., Sciences 1994, 266, 1373-1376) ou bien encore de particules virales présentant un polypeptide fusionné capable de se fixer sur le récepteur du facteur de croissance de 1 ' épiderme (EGF) (COSSET, F.L. et al. , J. Of Virology 1995, 69, 10, 6314-6322) . Néanmoins ces insertions de nouveaux domaines de reconnaissances sur l'enveloppe externe du virus inhibent généralement l'étape suivant la fixation (fusion membranaire, endocytose) nécessaire à 1 ' internalisation de la particule virale. Récemment, une augmentation à la fois de la sélectivité et de l'efficacité de ces vecteurs rétroviraux a été rapportée mais cette approche ne permet pas d'obtenir le transfert du gène ciblé.
Dans une autre approche, des fragments simple chaîne d'anticorps dirigés contre des antigènes de surface des cellules cibles, sont insérés par fusion à la partie N- terminale de la SU (VALSESIA- ITTMAN, S. et al., J. of Virology, 1996, 70, 3, 2059-2064 ; TEARINA CHU, T. H. et al., J.of Virology 1997, 71, 1, 720-725).
De telles stratégies ont été testées avec des rétrovirus aviaires, le virus de la nécrose de la rate (virus SNV ou « Spleen Necrosis Virus ») ou le virus murin de la leucémie de Moloney (Mo-MuLV virus) avec des enveloppes modifiées de type écotropique ou amphotropique . Toutes ces études ont montré la possibilité pour ces particules virales à enveloppe modifiée de se fixer spécifiquement sur de nouveaux récepteurs cellulaires. Néanmoins, elles ont mis en évidence l'inefficacité des mécanismes de transduction qui suivent l'étape de fixation du ligand sur son récepteur. Le foie est une des cibles importantes de la thérapie génique en particulier comme alternative pour le traitement de maladies génétiques . Les hepatocytes sont des cellules quiescentes qui doivent être induits pour proliférer afin de permettre la transduction de rétrovirus (Weber-Benarous, A. et al, Exp . Cell. Res . , 199, 205, 91- 110) . Cette induction peut être réalisée au moins en partie, en ajoutant des facteurs de croissance exogènes au milieu de culture avant l'infection. L'efficacité maximale de transduction a été obtenue pour des cultures d ' hepatocytes primaires réalisés en présence du facteur de croissance hépatocytaire (HGF) (Pages.. J.C. et al., 1995, Hum. Gén. Ther . , 6, 21-30). L ' HGF est le plus puissant agent mitogène connu pour les hepatocytes, à la fois ex vivo et in vivo . Son activité biologique est médiée par son récepteur, récepteur c-met (DI RENZO, M. F. et al., Oncogene, 1991, 6, 1997-2003; Bottaro, D.P. et al., Science, 251, 802-804) . La présente invention concerne une construction pour l'expression d'une protéine chimérique d'enveloppe de virus, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence nucléique d'un gène, ou de son ADNc , codant pour une protéine, ou un de ses fragments biologiquement actifs, pouvant se fixer sur une cellule animale, ladite séquence nucléique étant fusionnée avec une séquence nucléique codant pour une protéine transmembranaire d'enveloppe de virus, ou pour un de ses fragments biologiquement actifs. Par protéine pouvant se fixer sur une cellule animale, on entend toute protéine capable de se fixer spécifiquement à la surface de la membrane d'une cellule animale, comme par exemple la fixation liée aux interactions de type anticorps-antigène, ligand-récepteur ou enzyme- substrat .
On entend par fragment biologiquement actif, tout fragment capable d'exercer en totalité ou partiellement l'activité biologique de la protéine dont il est dérivé. Parmi ces constructions, on préfère les constructions selon l'invention, caractérisées en ce que la protéine transmembranaire d'enveloppe de virus est une protéine transmembranaire d'enveloppe de rétrovirus, en particulier les rétrovirus aviaires, bovins, murins , félins ou les rétrovirus de primate. On préfère notamment les rétrovirus amphotropes comme les virus de Moloney de la leucémie murine amphotropes .
On peut citer à titre d'exemples, les rétrovirus aviaires tels que le virus de 1 ' érythroblastose aviaire (AEV) , le virus de la leucémie aviaire (AVL) , le virus du sarcome aviaire (ASV) , le virus de la nécrose de la rate (SNV) et le virus du sarcome de Rous (RSV) , les rétrovirus bovins, les rétrovirus félins, les rétrovirus murins tels que le virus de la leucémie murine (MuLV) , le virus de Friend (F--MLV) et le virus du sarcome murin (MSV) et les rétrovirus de primate . L'invention concerne également, des constructions selon l'invention, caractérisées en ce que la séquence nucléique codant pour la protéine transmembranaire est fusionnée à la partie 3' terminale de la séquence nucléique du gène, ou de son ADNc, codant pour la protéine pouvant se fixer sur une cellule animale.
Ladite protéine transmembranaire est ainsi fusionnée à la partie C-terminale de ladite protéine pouvant se fixer sur une cellule animale L'invention comprend en outre les constructions selon l'invention, caractérisées en ce que la séquence nucléique codant pour la protéine pouvant se fixer sur une cellule animale est fusionnée à la partie 5 '-terminale de la séquence nucléique codant pour la protéine transmembranaire .
Ladite protéine pouvant se fixer sur une cellule animale est ainsi fusionnée à la partie N-terminale de la ladite protéine transmembranaire.
L'invention est aussi relative à des constructions selonl ' invention, caractérisée en ce que la séquence nucléique codant pour la protéine transmembranaire est une séquence nucléique codant pour une protéine transmembranaire comportant une mutation.
Par mutation, on entend désigner dans la présente description toute modification obtenue par insertion, délétion ou substitution d'au moins un nucléotide de la séquence nucléique codant pour la protéine transmembranaire du virus sauvage .
Parmi ces mutations, on préfère les mutations telles que la protéine transmembranaire codée par la séquence nucléique comportant ladite mutation conserve l'une au moins des caractéristiques biologiques de la protéine transmembranaire du virus sauvage, en particulier son incorporation dans la membrane lorsque par exemple une particule virale recombinante exprime une telle protéine transmembranaire ainsi mutée. On préfère les construction selon l'invention, caractérisées en ce que la mutation est située à la partie 3 ' -terminale et/ou 5 '-terminale de la séquence nucléique codant pour la protéine transmembranaire. Parmi ces constructions, on préfère également les construction, caractérisée en ce que la mutation située à la partie 3 ' -terminale permet d'exprimer une protéine chimérique d'enveloppe de virus dans laquelle le domaine cytoplasmique de la protéine transmembranaire n'est pas exprimée, notamment par l'insertion d'un codon stop au niveau du site de clivage Clal de la séquence nucléique codant pour la protéine transmembranaire .
Dans un mode de réalisation préféré, les construction selon l'invention sont caractérisées en ce que la mutation située à la partie 5 '-terminale permet d'exprimer une protéine chimérique d'enveloppe de virus dans laquelle le site de clivage SU-TM entre la protéine de surface SU et la protéine transmembranaire n'est pas exprimé ou délété .
Dans un autre mode de réalisation préféré, les construction selon 1 ' invention sont caractérisées en ce que la mutation située à la partie 5 ' -terminale permet d'exprimer une protéine chimérique d'enveloppe de virus dans laquelle les 6 premiers acides aminés de de la protéine transmembranaire ne sont pas exprimés ou délétés . Sous un autre aspect, l'invention comprend des constructions selon l'invention, caractérisées en ce que la cellule animale sur laquelle peut se fixer ladite protéine est une cellule de mammifère. de préférence humaine, de manière plus préférée choisie parmi les cellules musculaires, les cellules pulmonaires, les cellules hépatiques, ou les lymphocytes.
Parmi ces cellules, les cellules hépatiques telles que les hepatocytes sont les plus préférées.
Sous encore un autre aspect, l'invention comprend des constructions selon l'invention, caractérisées en ce que ladite protéine pouvant se fixer sur une cellule animale est choisie parmi : a) un ligand polypeptidique d'un récepteur cellulaire de ladite cellule animale ; b) un anticorps simple chaîne anti-antigène de surface cellulaire de ladite cellule animale . Sont désignés également par protéine pouvant se fixer sur une cellule animale, tout fragments biologiquement actif desdites protéines capable de fixer sur ladite cellule animale.
Sont également compris dans l'invention, les construction selon l'invention, caractérisées en ce que la protéine pouvant se fixer sur une cellule animale, induit la prolifération de ladite cellule animale, telle qu'en particulier un facteur de croissance cellulaire notamment le facteur de croissance hépatocytaire dénommé HGF. On entend par facteur de croissance cellulaire toute protéine cellulaire, ou un de ses fragments biologiquement actifs, capable d'induire par exemple la prolifération cellulaire comme par exemple 1 'HGF ou les facteurs de croissance spécifiques des cellules hématopoiétiques , ou d'exercer une activité mitogène.
Les constructions pour l'expression d'une protéine chimérique d'enveloppe de virus selon l'invention pourront comprendre en outre les éléments permettant l'expression de ladite protéine chimérique d'enveloppe, en particulier un promoteur capable de diriger l'expression de ladite protéine chimérique d'enveloppe tel que par exemple le promoteur LTR ou le promoteur du cytomégalovirus .
Par éléments permettant l'expression de ladite protéine chimérique d'enveloppe comprennent également les séquences de polyadenylation ou tout autre séquence promotrice ou régulatrice connues de l'homme de l'art permettant l'expression de ladite protéine chimérique d ' enveloppe .
L'invention comprend également les protéines exprimées par une construction selon l'invention.
L'invention s'adresse également aux vecteurs, caractérisés en ce qu'ils comprennent une construction selon l'invention, notamment les vecteurs plasmidiques ou les particules virales, en particulier les particules retrovirales .
Sous un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de production de particule virale, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une construction ou un vecteur selon l'invention.
On préfère un procédé de production selon 1 ' invention dans lequel la protéine chimérique d'enveloppe codée par la séquence nucléique d'une construction selon l'invention ou comprise dans un vecteur selon l'invention, est exprimée à la surface de ladite particule virale obtenue par ledit procédé.
Dans un mode particulier de réalisation, le procédé de production de particule virale selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle une cellule capable de produire une particule virale capable d'infecter une cellule hôte est transfectée par un vecteur selon l'invention. De préférence, ladite particule virale capable d'infecter une cellule hôte est un rétrovirus choisi parmi les rétrovirus cités précédemment pour les rétrovirus préférés dont sont issues les protéines transmembranaires , notamment les rétrovirus de nature amphotrope. L'invention comprend en outre les particules virales obtenues par un procédé selon l'invention.
De manière préférée, les particules virales dont 1 ' enveloppe comprend une protéine chimérique exprimée par une construction selon l'invention, ou obtenues par un procédé selon l'invention, sont caractérisées en ce qu'elles comprennent en outre des protéines d'enveloppe de virus sauvage .
On entend désigner par protéines d'enveloppe de virus sauvage, des protéines non modifiées d'enveloppe de virus, comme par exemple les protéines d'enveloppe de surface SU et les protéines transmembranaires TM des particules virales à partir desquelles sont obtenues après transformation lesdites particules virales de l'invention. Sous un autre aspect, l'invention a aussi pour objet une particule virale selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléique codant pour un gène d'intérêt.
Aux fins de la présente invention, un gène d'intérêt en usage dans l'invention peut être obtenu d'un organisme eucaryote, procaryote ou d'un virus par toute technique conventionnelle. Il est, de préférence, capable de produire un produit d'expression ayant un effet thérapeutique et il peut s'agir d'un produit homologue à la cellule hôte ou, de manière alternative, hétérologue. Le terme produit d'expression désigne une protéine ou un fragment de celle-ci. Dans le cadre de la présente invention, un gène d'intérêt peut coder pour un produit (i) intracellulaire (ii) membranaire présent à la surface de la cellule hôte ou (iii) sécrété hors de la cellule hôte. Il peut donc comprendre des éléments additionnels appropriés comme, par exemple, une séquence codant pour un signal de sécrétion. Ces signaux sont connus de l'homme de 1 ' art .
Conformément aux buts poursuivis par la présente invention, un gène d'intérêt peut coder pour une protéine correspondant à tout ou partie d'une protéine native telle que trouvée dans la nature. Il peut également s'agir d'une protéine chimérique, par exemple provenant de la fusion de polypeptides d'origines diverses ou d'un mutant présentant des propriétés biologiques améliorées et/ou modifiées. Un tel mutant peut être obtenu par des techniques de biologie classiques par substitution, délétion et/ou addition d'un ou plusieurs résidus acides aminés .
On préfère tout particulièrement mettre en oeuvre un gène d'intérêt thérapeutique codant pour un produit d'expression capable d'inhiber ou retarder l'établissement et/ou le développement d'une maladie génétique ou acquise. Un vecteur selon l'invention est particulièrement destiné à la prévention ou au traitement , de l'hémophilie A ou B, du cancer, du SIDA ou d'autres maladies infectieuses dues à un organisme pathogène: virus, bactérie, parasite ou prion. Les gènes d'intérêt utilisables dans la présente invention, sont ceux qui codent pour les protéines suivantes : une cytokine et notamment une interleukine , un interféron, un facteur de nécrose tissulaire et un facteur de croissance et notamment hématopoiétique (G-CSF, GM-CSF) , un facteur ou cofacteur impliqué dans la coagulation et notamment le facteur VIII, le facteur von illebrand, 1 ' antithrombine III, la protéine C, la thrombine et 1 ' hirudine, - une enzyme comme notamment la trypsine ou une ribonucléase, un inhibiteur d'enzyme tel que 1 ' αl-antitrypsine et les inhibiteurs de protéases virales, un produit d'expression d'un gène suicide comme la thimidine kinase du virus HSV (virus de l'herpès) de type 1, un activateur ou un inhibiteur de canaux ioniques, une protéine dont l'absence, la modification ou la dérégulation de l'expression est responsable d'une maladie génétique, telle que la protéine CFTR, l'insuline, l 'ADA (adénosine diaminase) , la glucocérébrosidase et la phénylhydroxylase , une protéine capable d'inhiber l'initiation ou la progression de cancers, tels que les produits d'expression des gènes supresseurs de tumeurs, par exemple les gènes P53 et Rb, et une' protéine capable de stimuler une réponse immunitaire ou un anticorps, une protéine capable d'inhiber une infection virale ou son développement, par exemple les épitopes antigéniques du virus en cause ou des variants altérés de protéines virales susceptibles d'entrer en compétition avec les protéines virales natives.
Par ailleurs, un gène d'intérêt en usage dans la présente invention, peut également coder pour un marqueur de sélection permettant de sélectionner ou d'identifier les cellules hôtes transfectées par un vecteur selon l'invention. On peut citer le gène -néo (néomycine) conférant une résistance à l'antibiotique G418, le gène dhfr (dihydrofolate réductase) , le gène CAT (Chloramphenicol Transférase) ou encore le gène gpt
(xanthine phosphoribosyl) .
On préfère les particules virales selon l'invention, caractérisées en ce que ledit gène d'intérêt code pour une protéine, ou un de ses fragments biologiquement actifs, choisie parmi le facteur VIII, le facteur IX, la protéine
CFTR, la dystrophine, l'insuline, 1 ' interféron gamma, une interleukine ou un marqueur de sélection.
L'invention comprend également les cellules animales, notamment de mammifères et en particulier humaines, telles que celles où peuvent se fixer les protéines chimériques d'enveloppe de l'invention, transformées par une particule virale selon l'invention.
L'invention concerne en outre l'utilisation d'une particule virale selon l'invention ou d'une cellule selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou la prévention d'une maladie traitable par thérapie génique.
L'invention comprend également les compositions pharmaceutiques comprenant à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique, une particule virale selon l'invention ou une cellule selon 1 ' invention en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Enfin, l'invention comprend de préférence, les compositions pharmaceutiques selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles comprennent entre 104 et 1014 pfu, et de préférence entre 10δ et 1011 pfu de particules virales selon l'invention. Selon la présente invention, l'utilisation des particules virale, des cellules ou des compositions pharmaceutiques de l'invention seront particulièrement destinées au traitement et/ou à la prévention d'une maladie génétique ou d'une maladie acquise comme le cancer ou à une maladie infectieuse. Cependant, un tel usage n'est pas limité à une application de type thérapie génique somatique. En particulier, un vecteur selon l'invention peut être utilisé à d'autres fins comme la production par voie recombinante dans des cellules eucaryotes de produits d'expression destinés à être inclus après purification dans ladite composition pharmaceutique.
Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier, on associe une quantité therapeutiquement efficace d'un tel agent à un support, un diluant ou un adjuvant acceptable. Elle peut être administrée selon n'importe quelle voie d'administration et ceci en dose unique ou répétée après un certain délai d'intervalle. La quantité à administrer sera choisie en fonction de certains critères, en particulier l'usage à titre de traitement ou de vaccin, la voie d'administration, le patient, le type de maladie à traiter et son état d'évolution, la durée du traitement etc. A titre indicatif, une composition pharmaceutique selon l'invention, comprend entre 104 et 1014 pfu (unité formant des plages) , avantageusement entre 105 et 1013 pfu et, de préférence, entre 106 et 1011 pfu de particules virales .
L'invention est illustrée ci-après par référence aux Figures suivantes :
FIGURE 1 : Représentation schématique de plasmide codant les protéines chimériques HGF-TM. - Les boites ombrées représentent les séquences du LTR rétroviral ou le promoteur du cyto égalovirus humain. Les boites ouvertes représentent les séquences de 1 ' HGF .
Les boites solides représentent les séquences des protéines transmembranaires TM de l'enveloppe du virus amphotrope 4070A ; L ' ADNc du facteur de croissance hépatocytaire (HGF) comprenant sa séquence signal est fusionné au gène de la protéine transmembranaire TM de l'enveloppe du virus amphotrope 4070A au niveau de l'acide aminé 435 (localisé après le site de clivage SU/TM) . - TGA : Un codon stop est inséré au niveau du site unique Clal de la séquence LHT
- poly(A) : Site de polyadenylation
- SP : Séquence du peptide signal de 1 ' HGF .
FIGURE 2 : Détection de l'enveloppe chimérique HGF-TM.
Immunoblots de lysats de cellules LLZ transfectées avec la protéine chimérique HGF-TM montrée à la figure 1.
Lysats de 2 populations :
(A) Le blot est révélé avec un antisérum anti-TM. (B) Le blot est révélé avec un anticorps monoclonal anti-HGF.
Les positions des standards de masse moléculaire,
Pr65gag, Pr80 env et l'HGF-TM chimérique (flèche) sont représentées. Ligne 1, cellules de contrôle (HY) ; 2, cellules LHT ; 3, cellules LHTC ; 4, clone LHTC8 ;
(C) Analyse du clone LHTC5 par FACS (« Fluorescence
Activated Cell Sorter ») . Les cellules de contrôle (- - ) et les cellules LHTC5 (...) sont révélées par un anticorps anti-HGF.
FIGURE 3 : Infection d ' hepatocytes murins avec des particules retrovirales modifiées transduites avec le gène nls-lacZ .
Les hepatocytes sont isolés par perfusion de collagénase à J = 0 jour et sont cultivés sur des boîtes
Primaria de 6 cm de diamètre, sur milieu M199 (Gibco) contenant 10"6 M de dexaméthasone , 10"6 M d'hormones tyroïdiennes, 10"8 M d'insuline, 10"2 M d'acide lactique et 2. 10~3 M de glutamine en présence d'antibiotique (pénicilline et streptomycine) .
A J = 1 jour et à J = 2 jours, le milieu de culture est remplacé par du milieu supplémenté avec 5 ng d 'HGF recombinant (Genentech) . La nuit précédant l'infection, le milieu des cellules productrices de virus confluentes est remplacé par 5 ml d'un mélange (v/v) constitué d'un milieu pour hepatocytes et d'un milieu pour cellules productrices contenant 5 mM de butyrate de sodium et 10"6 de dexaméthasone . Les hepatocytes sont infectés 48 heures après étalement en présence de 3 μg/ml de polymère.
Trois heures plus tard, l'infection est stoppée en remplaçant le surnageant viral par un milieu de culture contenant 5 ng/ml d ' HGF recombinant.
A J = 5 jours, la transduction des cellules est détectée par coloration histochimique avec une solution de X-Gal .
En haut à gauche : les hepatocytes infectés avec 1 ml de vecteur viral non dilué contenant l'enveloppe sauvage, récoltés à partir des cellules productrices HY.
En bas à gauche : hepatocytes infectés avec 1 ml de vecteur viral non dilué présentant l'enveloppe chimérique
HGF-TM et sauvage récoltés à partir des cellules productrices LHT. En haut à droite : hepatocytes infectés avec 1 ml de vecteur viral non dilué présentant l'enveloppe chimérique
HGF-TM/Cla et sauvage récoltés à partir de cellules productrices LHTC .
En bas à droite : efficacité relative de l'infection par particules virales à enveloppes chimériques d ' hepatocytes murins comparés à des particules virales contenant
1 ' enveloppe sauvage .
FIGURE 4 : Activité biologique de. particules retrovirales exprimant des enveloppes chimériques aLes particules virales exprimant des protéines d'enveloppes chimériques ou sauvages sont récoltées de différentes lignées cellulaires et utilisées pour transduire les cellules NIH3T3 ou MDCK afin de déterminer les titres des virus. Le nombre de cellules exprimant le gène bactérien lacZ (contenant le signal de localisation du noyau, nls-lacZ) , les cellules sont marquées avec le 5- bromo- -chloro-3 -indoyle-β-d-galactopyranoside . Les cellules MDCK sont cultivées sur milieu minimum essentiel de Dulbeco (DMEM) contenant 10% du sérum de veau foetal. Les cellules 3T3 sont cultivées sur DMEM contenant du sérum de veau de nouveau-né. b Afin de corriger la légère variation de titre entre les virus sauvages et modifiés des deux lignées cellulaires, le pourcentage d'infection des cellules MDCK par rapport aux cellules 3T3 a été calculé suivant la formule :
(Titre de MDCK / Titre 3T3) / (1,2/6) x 100
c les surnageants du milieu des cellules productrices sont incubés avec des anticorps monoclonaux anti-HGF
(Institute of Immulogy, Japon) pendant 45 mn à 37°C puis titrés par dilution successive sur des cellules 3T3. Le pourcentage d'infection a été calculé suivant la formule :
(Titre sur 3T3 en présence d'anticorps) / (Titre sur 3T3 sans anticorps) X 100
non fait eLe milieu des cellules productrices est incubé avec des anticorps anti-HGF (lOμg/ml) ou avec le récepteur c-
Met soluble (30μg/ml) pendant 45 mn à 37°C puis titré par dilution successive dans les cellules MDCK, le pourcentage d'infection a été calculé suivant la formule :
(Titre sur MDCK avec anticorps ou avec le récepteur c-met soluble) / (Titre sur MDCK sans anticorps ou sans récepteur c-Met soluble) X 100. 17
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : CONSTRUCTION DE L'ENVELOPPE CHIMERIQUE L 'HGF est une protéine monomérique qui peut être obtenue par réaction protéolytique sous une forme active composée d ' hétérodimères reliés par des ponts disulfures
(sous unités α et β) .
La construction des particules retrovirales présentant 1 ' HGF a été effectuée en fusionnant la séquence codante pour TM (protéine transmembanaire) à la partie 3 ' terminale de 1 'ADNc codant 1 'HGF humain.
La séquence codant TM a été obtenue par PCR en utilisant les deux amorces suivantes : TM 5 ' (CATCTTAGGTACCCGCGGTTCTGGCCCTTCTACTAGGA)
TM 3' (TCTTTCACTGATGGTACCTCGTACTCTATGGGTTTTAAG) . avec un site de restriction Kpnl. Le produit obtenu par
PCR a ensuite été digéré par Kpnl et inséré au niveau du site unique Kpnl de l'ADN codant pour HGF. Cette protéine HGF-TM fusionnée présente toute la séquence codant de 1 ' HGF et pratiquement la séquence codante complète de TM, à l'exception des 6 premiers amino-acides de 1 ' ectodomaine .
La chimère HGF-TM/Cla présente un codon d'arrêt inséré au niveau du site Clal, site du gène TM, afin d'éliminer le domaine cytoplasmique de la protéine HGF-TM.
Cette enveloppe protéique ne contient pas le motif de clivage SU-TM et par conséquent la fusion de membrane ne pourra pas s'effectuer. Les deux constructions, HGF-TM et HGF-TM/Cla, ont été clonées dans une cassette d'expression de vecteurs et exprimées sous le contrôle de différents promoteurs comme le LTR rétroviral ou le promoteur du cytomégalovirus (figure 1) . Les constructions ont ensuite été cotransfectées dans des cellules LLZ-φ-CRIP par un plasmide exprimant le gène de la résistance à 1 ' hygromycine B. Les cellules LLZ expriment le vecteur rétroviral reporter MFG-nlsLacZ et produisent des particules virales de type amphotropique pouvant infecter des cellules hôtes .
Des lignées stables exprimant la protéine chimérique ont été réalisées par sélection à 1 ' hygromycine B pendant 3 semaines puis analysées.
Ces lignées peuvent produire des particules retrovirales présentant des protéines d'enveloppes chimériques ou sauvages. Les cellules LLZ-φ-CRIP ont été également transfectées par le plasmide sélectionné seul puis ensuite cultivées pendant 3 semaines dans un milieu contenant de 1 ' hygromycine B afin d'obtenir des cellules de contrôles pour les expériences d'infection présentant le même nombre de passages que les cellules exprimant des virus avec 1 ' enveloppe chimérique .
EXEMPLE 2 : EXPRESSION DES PROTEINES D'ENVELOPPES CHIMERIQUES
Les lysats de cellules transfectées par les plasmides exprimant la protéine fusionnée TM-HGF ont été analysés par immunoblotting avec des anticorps polyclonaux anti-TM et des anticorps monoclonaux anti-HGF (figure 2) .
Le précurseur Pr80 env et la protéine recombinante TM de 15 kDa ont été détectés dans les extraits cellulaires par le sérum anti-TM. Une protéine de 95 kDa a été spécifiquement détectée dans les extraits cellulaires de LHTC5 par les anticorps monoclonaux anti-HGF. Le poids moléculaire de cette protéine reflète précisément la taille prédite pour la protéine d'enveloppe chimérique HGF-TM/Cla. Comme attendu, aucun hybride TM n ' a été mis en évidence dans les culots de cellules témoins de contrôle. Pour démontrer que la protéine chimérique a bien été transportée et orientée correctement dans la membrane cellulaire, on a analysé les 3 lignées cellulaires à l'aide du système FACS " (« Fluorescence-Activated Cell Sorter ») en utilisant un anticorps monoclonal anti-HGF. Les trois populations ont été marquées spécifiquement avec l'anticorps anti-HGF.
Afin de démontrer que les protéines fusionnées ont été incorporées dans les virions produits par ces cellules, les surnageants de cellules sont ultracentrifugées au moyen d'une centrifugeuse Beckman munie d'un rotor S 28 à 25000 tours/min pendant 1,5 heures à 4°C. Les culots de virions obtenus sont ensuite analysés par immunoblotting en utilisant différents anticorps dirigés contre les protéines virales de structure : sérum polyclonal de chèvre anti-SU (Quality Biotech Inc. Camden N.J.) ; anticorps anti-protéine p30 de capside ; anticorps anti- TM. Résultats non représentés.
EXEMPLE 3 : ETUDES DE L'INFECTION DE CELLULE SPECIFIQUE MDCK PAR LES PARTICULES VIRALES (Figure 4)
Le titre en virus est déterminé par infection de fibroblastes murins N1H3T3 avec un surnageant de culture de cellules. Ces fibroblastes n'expriment pas le récepteur c-met.
Les cellules témoins de contrôle produisent 5.105 unités formant des colonies par ml de surnageant. Les particules virales présentant l'enveloppe sauvage et l'enveloppe chimérique fusionnées ne montrent pas de diminution du titre en virus. Ces résultats sont obtenus aussi bien pour la partie TM entière que pour la partie TM dont la queue cytoplasmique a été délétée .
Ainsi, la protéine chimérique n'altère ni la fonctionnalité de la protéine d'enveloppe sauvage ni la fixation sur le récepteur viral. Elle n'altère pas non plus les événements qui suivent la fixation de la particule virale sur le récepteur au regard de l'efficacité de la transduction. Par opposition, les vecteurs retroviraux présentant des protéines d'enveloppe chimérique de type écotrope ou de type aviaire montrent au moins une diminution de deux logarithmes du titre des virus même pour des virus présentant une protéine d'enveloppe de type sauvage.
Pour caractériser en outre les propriétés d'infection des particules virales à enveloppe chimérique, on a effectué la transduction de deux types différents de cellules exprimant le récepteur c-met de 1 ' HGF . Dans une première série d'expériences, on réalise la transduction de cellules Madin-Darby de reins de chiens (MDCK) portant les récepteurs de rétrovirus amphotropes avec des virus de type sauvage ou des virus présentant une enveloppe chimérique. Les infections réalisées à partir de surnageant de cultures contenant ces particules virales permettent d'obtenir une augmentation significative de l'efficacité de la transduction. Pour confirmer que cette augmentation d'efficacité de transduction n'est pas liée à la variabilité du titre de virus présent dans les surnageants, l'efficacité relative de l'infection est estimée en normalisant le nombre de colonies par boîte avec le titre de virus déterminé pour les fibroblastes NIH3T3). Les rétrovirus recombinants présentant les protéines HGF-TM ou HGF-TMc ont un pouvoir infectieux deux fois plus grand que les virus de type sauvage .
Pour démontrer que l'augmentation du pouvoir infectieux est liée au récepteur de l'HGF, des expériences de neutralisation ont été réalisées en préincubant le surnageant contenant les particules virales avec des anticorps anti-HGF. Les résultats obtenus pour le clone LHTC5 montrent que dans ces conditions l'efficacité de la transduction de rétrovirus à enveloppe chimérique (clone LHTC5) est diminuée sur les cellules MDCK alors qu'elle reste inchangée sur des cellules de fibroblastes NIH3T3 (figure' 4) .
Ces résultats montrent clairement que l'augmentation de l'efficacité de la transduction dépend des interactions spécifiques entre les protéines d'enveloppe chimérique et le récepteur c-met. 21
Dans le but d'examiner la cinétique d'infection par des particules virales sur des cultures primaires de cellules exprimant le récepteur c-met, la transduction de vecteur rétroviral LacZ a été réalisée sur des cultures primaires d ' hepatocytes murins comme déjà décrit.
Les infections ont été réalisées sur hepatocytes pendant 5 heures . Le virus présentant une enveloppe HGF montre une efficacité d'infection trois fois plus grande sur hepatocytes que les virus de type sauvage (figure 3) .
EXEMPLE 4 : ETUDE DE LA PROLIFERATION
L ' HGF étant un puissant mitogène pour les hepatocytes, il a été examiné si l'incorporation d 'HGF sur les particules virales se traduisait non seulement par la fixation de ces particules virales sur le récepteur c-met, mais également par l'induction de la prolifération des hepatocytes .
Pour cela, l'infection d ' hepatocytes murins a été réalisée en présence de bromo-déoxy-Uridine (BrdU) . Dans une première série d'expériences, les hépathocytes murins sont cultivés en absence de facteur de croissance. Comme attendu, peu d ' hepatocytes incorporent BrdU lorsque les cellules sont infectées avec les particules retrovirales de type sauvage. Au contraire, lorsque l'infection est réalisée avec des particules retrovirales exprimant 1 ' HGF sur l'enveloppe, les cellules marquées au BrdU sont facilement détectables. Ces résultats indiquent que non seulement HGF-TM ou HGF-TM/Cla sont capables de se fixer sur les récepteurs c-met, mais également d'être clivés par protéolyse pour donner un hétérodimère complètement actif, capable d'induire la transduction d'un signal conduisant à la prolifération de 1 ' hépatocyte . De plus, sachant que les hepatocytes ne se divisent qu'une seule fois en culture (rarement deux fois), l'augmentation de l'efficacité d'infection n'est pas due à l'activité mitogène des particules présentant 1 'HGF . Ces résultats sont corroborés par le fait que les cellules MDCK utilisées dans cet exemple, sont issues d'un clone qui ne répond pas à l'activité mitogène de 1 'HGF .
L'infection virale est une opération multi-étapes qui dépend en premier lieu de la fixation de glycoprotéines de l'enveloppe virale sur le récepteur spécifique de la surface de la cellule. Cette fixation provoque un changement conformationnel de la protéine de l'enveloppe virale puis la fusion de la membrane cellulaire et virale. Le tropisme du virus est déterminé par les protéines de surface SU tandis que TM est une protéine transmembranaire qui joue un rôle important comme médiateur lors de la fusion membranaire . Le complexe de l'enveloppe est sélectivement incorporé sous forme d'oligomèreε dans les virions au moment de leur réplication.
Nos résultats montrent qu'une grosse molécule soluble et non virale, l'HGF, peut être incorporée dans des virions de rétrovirus tels que le rétrovirus murin de la leucémie (MLV virus) en la fusionnant avec l'extrémité amino-terminale de la protéine TM . Il avait déjà été montré que le CD4 ou un CD4 cytoplasmique chimérique d'origine rétrovirale, pouvait être efficacement incorporé dans les particules du virus RSV (virus du sarcome de Rous) .
Les protéines chimériques HGF-TM n'interfèrent ni avec la maturation du précurseur glycoproteique de l'enveloppe, ni avec son incorporation dans la membrane du virion. Au contraire, les particules présentant à la fois une enveloppe glycoproteique amphotrope de type sauvage et une protéine HGF-TM chimérique et telles que obtenues à l'exemple 1, infectent avec une plus grande efficacité les cellules exprimant le récepteur c-met. Il est vraisemblable, d'après ces résultats, que les virions modifiés sont mieux fixés et retenus à la surface des cellules par le récepteur de l'HGF. Par la suite, par diffusion latérale de la membrane, la sous-unité SU peut 23
se fixer sur le récepteur viral et la sous-unité TM déclencher la fusion de la membrane virale et cellulaire.
Afin de cibler l'infection virale, de nombreux auteurs ont modifié la sous-unité SU d'enveloppe écotrope ou aviaire en insérant des ligands (polypeptidiques ou simples chaînes d'anticorps). Mais jusqu'à maintenant, ces protéines d'enveloppe chimériques n'ont eu qu'un succès marginal. Malgré l'efficacité de la fixation de ces virus à enveloppe modifiée sur les cellules cibles humaines, ceux-ci se sont montrés peu fusiogéniques en dépit de la présence d'enveloppe de type sauvage.
Le réarrangement conformationnel du complexe enveloppe, après fixation sur le récepteur viral, est nécessaire pour la fusion de la membrane cellulaire et virale. Les enveloppes glycoprotéiques de type écotrope ou aviaire ne possèdent pas le récepteur viral correspondant aux cellules humaines.
Une protéine chimérique correspondant à la fusion de l'HGF et TM a été construite et des lignées cellulaires stables produisant des vecteurs retroviraux tels que des vecteurs retroviraux amphotropes présentant l'HGF ont été réalisées. Cette protéine d'enveloppe chimérique présentant HGF-TM est capable de fixer la particule virale sur la surface de la cellule par l'intermédiaire de l'HGF et de son récepteur sans empêcher la fixation de la sous- unité virale SU sur son récepteur membranaire. Il semble également que la présence d'enveloppe de type sauvage est nécessaire comme aide à la fusion efficace de la membrane. D'autre part, la transduction du signal, via le groupement HGF, augmente la prolifération des hepatocytes.
Ces résultats montrent que (i) la protéine chimérique HGF-TM n'interfère pas avec la maturation du précurseur glycoproteique de l'enveloppe ou avec son incorporation dans la membrane du virion. Les molécules d'HGF coexprimées correspondent à un polypeptide de 674 acides aminés, mais cela n'empêche pas la sous-unité SU d'atteindre et de se fixer sur son récepteur, suggérant que ces deux récepteurs puissent être positionnés à proximité l'un de l'autre sur la membrane de la cellule cible. Enfin, le déclenchement des signaux médiés par le récepteur c-met lors de la fixation du groupement HGF associé au virus, ne bloque pas la dissociation du trimère SU, le réarrangement de TM et l'entrée du virus.
IL semble que, pour des cellules exprimant le récepteur c-met, la phase initiale pourrait être la fixation du virus présentant l'HGF sur le récepteur de l'HGF, compte tenu de la haute affinité de l'HGF pour son récepteur c-met comparée à celle de l'interaction SU-Ram-I (voisine de la nanomole) . Par la suite, la stabilisation de la particule virale fixée permet à la sous-unité SU de se fixer sur le récepteur viral situé à proximité par diffusion latérale de la membrane et de déclencher la fusion membranaire via la sous-unité TM non modifiée de type sauvage. Ceci permet d'obtenir des virions modifiés capables de transférer efficacement un gène à des cellules exprimant le récepteur c-met.

Claims

REVENDICATIONS
1. Construction pour l'expression d'une protéine chimérique d'enveloppe de virus, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence nucléique d'un gène, ou de son ADNc, codant pour une protéine, ou un de ses fragments biologiquement actifs, pouvant se fixer sur une cellule animale, ladite séquence nucléique étant fusionnée avec une séquence nucléique codant pour une protéine transmembranaire d'enveloppe de virus, ou pour un de ses fragments biologiquement actifs.
2. Construction selon la revendication 1, caractérisée en ce que la protéine transmembranaire d'enveloppe de virus est une protéine transmembranaire d'enveloppe de rétrovirus .
3. Construction selon la revendication 2, caractérisée en ce que le rétrovirus est choisi parmi les rétrovirus aviaires, les rétrovirus bovins, les rétrovirus murins, les rétrovirus félins ou les rétrovirus de primate.
4. Construction selon la revendication 2 et 3, caractérisée en ce que le rétrovirus a un tropisme de type amphotrope .
5. Construction selon la revendication, caractérisée en ce que le rétrovirus est virus de Moloney la leucémie murine .
6. Construction selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la séquence nucléique codant pour la protéine transmembranaire est fusionnée à la partie 3 ' terminale de la séquence nucléique du gène, ou de son ADNc, codant pour la protéine pouvant se fixer sur une cellule animale . 26
7. Construction selon la revendication 6, caractérisée en ce que la séquence nucléique codant pour la protéine pouvant se fixer sur une cellule animale est fusionnée à la partie 5 '-terminale de la séquence nucléique codant pour la protéine transmembranaire.
8. Construction selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce que la séquence nucléique codant pour la protéine transmembranaire est une séquence nucléique codant pour une protéine transmembranaire comportant une mutation .
9. Construction selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce que la mutation est située à la partie 3 ' -terminale et/ou 5 '-terminale de la séquence nucléique codant pour la protéine transmembranaire.
10. Construction selon la revendication 9, caractérisée en ce que la mutation située à la partie 3 ' -terminale permet d'exprimer une protéine chimérique d'enveloppe de virus dans laquelle le domaine cytoplasmique de la protéine transmembranaire n'est pas exprimée.
11. Construction selon la revendication 10, caractérisée en ce que la mutation située à la partie 3 ' -terminale est obtenue par l'insertion d'un codon stop au niveau du site de clivage Clal de la séquence nucléique codant pour la protéine transmembranaire.
12. Construction selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisée en ce que la mutation située à la partie 5 ' - terminale permet d'exprimer une protéine chimérique d'enveloppe de virus dans laquelle le site de clivage SU- TM entre la protéine de surface SU et la protéine transmembranaire n'est pas exprimé. 27
13. Construction selon l'une des revendications 9 à 12 , caractérisée en ce que la mutation située à la partie 5'- terminale permet d'exprimer une protéine chimérique d'enveloppe de virus dans laquelle les 6 premiers acides aminés de la protéine transmembranaire ne sont pas exprimés .
14. Construction selon l'une des revendications 1 à 13 , caractérisée en ce que la cellule animale sur laquelle peut se fixer la protéine est une cellule choisie parmi les cellules musculaires, les cellules pulmonaires, les cellules hépatiques ou les lymphocytes humaine.
15. Construction selon la revendication 14, caractérisée en ce que la cellule animale est une cellule humaine.
16. Construction selon la revendication 14 ou 15, caractérisée en ce que la cellule est une cellule hépatique .
17. Construction selon la revendication 16, caractérisée en ce que la cellule hépatique est un hépatocyte .
18. Construction selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisée en ce que la protéine pouvant se fixer sur une cellule animale est choisie parmi: a) un ligand polypeptidique d'un récepteur cellulaire de ladite cellule animale ; b) un anticorps simple chaîne anti-antigène de surface cellulaire de ladite cellule animale .
19. Construction selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisée en ce que la protéine pouvant se fixer sur une cellule animale, induit la prolifération de ladite cellule animale. 28
20. Construction selon la revendication 19, caractérisée en ce que ladite protéine est un facteur de croissance cellulaire .
21. Construction selon la revendication 19 ou 20, caractérisée en ce que la protéine pouvant se fixer sur une cellule animale est l'HGF.
22. Construction pour l'expression d'une protéine chimérique d'enveloppe de virus selon l'une des revendications 1 à 21 , caractérisée en ce qu'elle comprend en outre les éléments permettant l'expression de ladite protéine chimérique d'enveloppe.
23. Construction selon la revendication 22, caractérisée en ce qu'elle comprend un promoteur capable de diriger l'expression de ladite protéine chimérique d'enveloppe.
24. Construction selon la revendication 23, caractérisée en ce le promoteur capable de diriger l'expression de ladite protéine chimérique d'enveloppe est le promoteur LTR ou le promoteur du cytomégaloλ'Jrus .
25. Protéine exprimée par une construction selon l'une des revendications 1 à 24.
26. Vecteur, caractérisé en ce qu'il comprend une construction selon l'une des revendications 1 à 24.
27. Vecteur selon la revendication 26, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur plasmidique ou d'une particule virale. •
28. Procédé de production de particule virale, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une construction ou un vecteur selon l'une des revendications 1 à 24 et 26 à 27. 29
29. Procédé de production de particule virale selon la revendication 28, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle une cellule capable de produire une particule virale capable d'infecter une cellule hôte est transfectée par un vecteur selon la revendication 26 ou 27.
30. Procédé de production selon la revendication 28 ou 29, caractérisé en ce que ladite particule virale capable d'infecter une cellule hôte est un rétrovirus de type amphotrope .
31. Particule virale obtenue par un procédé selon l'une des revendications 28 à 30.
32. Particule virale dont l'enveloppe comprend une protéine chimérique exprimée par une construction selon l'une des revendications 1 à 24, ou selon la revendication 31, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre des protéines d'enveloppe de virus sauvage.
33. Particule virale selon la revendication 31 ou 32, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléique codant pour un gène d'intérêt.
34. Particule virale selon la revendication 33, caractérisée en ce que ledit gène d'intérêt code pour une protéine, ou un de ses fragments biologiquement actifs, choisie parmi le facteur VIII, le facteur IX, la protéine CFTR, l'insuline, 1 ' interféron gamma, une interleukine ou un marqueur de sélection.
35. Cellule animale transformée par une particule virale selon l'une des revendications 31 à 34.
36. Cellule selon la revendication 35, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule humaine.
37. Utilisation d'une particule virale selon l'une des revendications 31 à 34 ou d'une cellule selon la revendication 35 ou 36, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou la prévention d'une maladie traitable par thérapie génique.
38. Composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique, une particule virale selon l'une des revendications 31 à 34 ou une cellule selon la revendication 35 ou 36, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
39. Composition pharmaceutique selon la revendication 38, caractérisée en ce qu'elle comprend entre 104 et 1014 pfu, et de préférence entre 106 et 1011 pfu de particules virales selon l'une des revendications 31 à 34.
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