FR2762851A1 - Construction et expression d'enveloppe chimerique de retrovirus par des vecteurs et compositions pharmaceutiques les contenant - Google Patents

Abstract

L'invention concerne de nouvelles constructions de séquences nucléotidiques pour l'expression de protéine chimérique d'enveloppe de virus, des vecteurs et particules virales comprenant lesdites constructions et des cellules transformées par lesdits vecteurs.L'invention comprend également une méthode pour la préparation desdites particules virales et des compositions pharmaceutiques incluant lesdits vecteurs, particules virales ou cellules.

Description

La présente invention concerne de nouvelles particules rétrovirales présentant une enveloppe externe de type chimérique et les applications thérapeutiques de celles-ci, notamment dans le domaine de la thérapie génique humaine in vivo.

La faisabilité de la thérapie génique appliquée à l'homme n'est plus à démontrer et ceci concerne de nombreuses applications thérapeutiques comme les maladies génétiques, les maladies infectieuses et les cancers. De nombreux documents de l'art antérieur décrivent les moyens de mettre en oeuvre une thérapie génique, notamment par l'intermédiaire de vecteurs viraux.

D'une manière générale, les vecteurs sont obtenus par délétion d'au moins une partie des gènes viraux qui sont remplacés par les gènes d'intérêt thérapeutique. De tels vecteurs peuvent être propagés dans une lignée de complémentation qui fournit en trans les fonctions virales délétées pour générer une particule de vecteur viral défective pour la réplication mais capable d'infecter une cellule hôte. A ce jour, les vecteurs rétroviraux sont parmi les plus utilisés mais on peut citer également des vecteurs issus des adénovirus, virus associés aux adénovirus, poxvirus et virus de l'herpès. Ce type de vecteur, leur organisation et leur mode d'infection sont largement décrits dans la littérature accessible à l'homme de l'art.

Le principe de la thérapie gènique est de délivrer un gène fonctionnel dont 1'ARN ou la protéine correspondante produira l'effet biochimique désiré dans les cellules ou tissus ciblés. La thérapie génique présente plusieurs avantages potentiels comparée à la pharmacologie biochimique classique. D'une part l'insertion de gènes permet l'expression prolongée de molécules complexes et instables comme des ARN ou des protéines qui peuvent être extrèmement difficiles voire impossibles à obtenir ou à administrer directement. D'autre part l'insertion contrôlé du gène désiré à l'intérieur de cellules spécifiques ciblées permet de réguler le produit d'expression dans des tissus définis. Enfin la thérapie génique est en principe permanente dans l'individu dès lors que le gène continue de fonctionner dans la cellule choisie où dans ses progénitures. Pour cela, il est nécessaire de pouvoir insérer le gène thérapeutique désiré à l'intérieur de cellules choisies et donc de disposer de méthode d'insertion capable de cibler spécifiquement les cellules ou les tissus choisis. De plus, le niveau d'expression du gène transféré , pour être fonctionnel, doit être en adéquation avec le niveau approprié du produit requis dans la cellule
Parmi les méthodes d'insertion de gènes, comme par exemple la microinjection, l'électroporation ou la recombinaison homologue, l'utilisation de particules virale, comme les rétrovirus, est largement répandue.

Cependant, appliqués in vivo, les systèmes de transfert de gène de type rétroviral recombinant présentent à la fois un faible pouvoir infectieux (concentration insuffisante de particules virales ) et un manque de spécificité vis à vis des cellules cibles choisies. Ainsi la plupart des protocoles d'expérimentation de transfert de gène sont réalisées actuellement ex vivo sur des cultures de tissus spécifiques. De tels protocoles dans lesquels les tissus ciblés doivent être infectés hors du patient, sont très coûteux, très complexes et techniquement limitées à certaines applications.

C'est pourquoi, la réalision de vecteurs viraux cellules spécifiques , présentant un tropisme tissu spécifique, et dont la transduction du gène d'intérêt peut être effectuée de manière adéquate par les cellules cibles, est certainement un des objectifs à atteindre pour garantir le succés de la thérapie génique.

Plusieurs approches ont été testées pour modifier l'éventail des cellules hôtes cibles des particules virales ou rétrovirales en réalisant des chimères écotropiques et amphotropiques d'enveloppe externe de ces particules virales. En ce qui concerne les rétrovirus, nombre de ligands ont été fusionnés à la partie N-terminale d'une protéine de surface(notée SU) de l'enveloppe externe du rétrovirus.

Dans une première approche, on a substitué à des petits fragments de SU de l'enveloppe externe du virus (noté Env) des ligands spécifiques (en générale des peptides linéaires)de molécules de surface de la cellule hôte cible. On peut citer par exemple la construction de particules rétrovirales présentant la molécule CD4 à la surface de l'Env de manière à cibler les cellules humaines infectées par le virus HIV (YOUNG, J. A. T. et al.,
Sciences 1990, 250, 1421-1423), de particules virales présentant une hormone peptidique fusionnée avec une SU de l'Env pour infecter spécifiquement les cellules exprimant le récepteur correspondant (KASAHARA, N. Et al., Sciences 1994, 266, 1373-1376) ou bien encore de particules virales présentant un polypeptide fusionné capable de se fixer sur le récepteur du facteur de croissance de l'épiderme (EGF) (COSSET, F.L. et al. , J. Of Virology 1995, 69, 10, 6314-6322). Néanmoins ces insertions de nouveaux domaines de reconnaissances sur l'enveloppe externe du virus inhibent généralement l'étape suivant la fixation (fusion membranaire, endocytose) nécessaire à la transduction de la particul virale. Récemment , une augmentation à la fois de la sélectivité et de l'efficacité de ces vecteurs rétroviraux a été rapportée mais cette approche ne permet pas d'obtenir le transfert du gène ciblé.

Dans une autre approche, des fragments simple chaine d'anticorps dirigés contre des antigènes de surface des cellules cibles, sont insérés par fusion à la partie N-terminale de la SU (VALSESIA-WITTMAN, S. et al.,
J. of Virology 1996, 70, 3, 2059-2064 ; TEARINA CHU, T. H.

et al., J.of Virology 1997, 71, 1, 720-725).

De telles statégies ont été testées avec des rétrovirus aviaires, le virus de la nécrose de la rate (virus SNC) ou le virus murin de la leucémie de Moloney (Mo-MuLV virus) avec des enveloppes modifiées de type écotropique ou amphotropique. Toutes ces études ont montré la possibilité pour ces particules virales à enveloppe modifiée de se fixer spécifiquement sur de nouveaux récepteurs cellulaires. Néanmoins, elles ont mis en évidence l'inefficacité des mécanismes de transduction qui suivent l'étape de fixation du ligand sur son récepteur.

Le foie est une des cibles importantes de la thérapie génique en particulier comme alternative pour le traitement de maladies génétiques. Les hépatocytes sont des cellules quiescentes qui doivent être induits pour proliférer afin de permettre la transduction de retrovirus (HUMPHEY, P.A.V. et al, Am. J. of Pathology, 1995, 147, 2, 386-396). Cette induction peut être réalisée au moins en partie, en ajoutant des facteurs de croissance exogènes au milieu de culture avant l'infection. L'efficacité maximale de transduction a été obtenue pour des cultures d'hépatocytes primaires réalisés en présence du facteur de croissance hépathocytaire (HGF). L'HGF est le plus puissant agent mitogène connu pour les hépatocytes, à la fois ex vivo et in vivo. Son activité biologique est médiée par son récepteur, récepteur c-met (DI RENZO, M.F.

et al., Oncogene, 1991, 6, 1997-2003; D'ERRICO, A. et al.,
Hepathology 1996, 24, 1, 60-64).

La présente invention concerne une construction pour l'expression d'une protéine chimérique d'enveloppe de virus, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence du gène, ou de son ADNc, codant pour une protéine pouvant se fixer sur une cellule animale, ledit gène étant fusionné avec un gène, ou son ADNc, codant pour une protéine transmembranaire d'enveloppe de virus, ou pour un de ses fragments biologiquement actifs.

Par protéine pouvant se fixer sur une cellule animale, on entend toute protéine capable de se fixer spécifiquement à la surface de la membrane d'une cellule animale, comme par exemple la fixation liée aux interactions de type anticorps-antigène, ligand-récepteur ou enzyme-substrat.

On entend par fragment biologiquement actif, tout fragment capable d'exercer en totalité ou partiellement l'activité biologique de la protéine dont il est dérivé.

Parmi ces constructions, on préfère les constructions selon l'invention, caractérisées en ce que la protéine transmembranaire d'enveloppe de virus est une protéine transmembranaire d'enveloppe de rétrovirus, en particulier les rétrovirus aviaires, bovins, murins, félins ou les rétrovirus de primate. Les plus préférés étant les rétrovirus amphotropes et le virus de la leucémie murine, notamment le virus de la leucémie murine de Moloney.

On peut citer à titre d'exemples, les rétrovirus aviaires tels que le virus de l'érythroblastose aviaire (AEV), le virus de la leucémie aviaire (AVL), le virus du sarcome aviaire (ASV), le virus de la nécrose de la rate (SNV) et le virus du sarcome de Rous (RSV), les rétrovirus bovins, les rétrovirus félins, les rétrovirus murins tels que le virus de la leucémie murine (MuLV), le virus de
Friend (F-MLV) et le virus du sarcome murin (MSV) et les rétrovirus de primate. Bien entendu, d'autres rétrovirus peuvent être mis en oeuvre. Les nombreux vecteurs rétroviraux dérivés de ces derniers qui sont décrits dans la littérature, notamment le vecteur N2 (dérivée du virus de la leucémie murine) ou un de ses dérivés peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention.

L'invention concerne également des constructions selon, caractérisées en ce que le gène codant pour la protéine transmembranaire est fusionnée à la partie 3' terminale du gène codant pour la protéine pouvant se fixer sur une cellule animale (cf. Exemple 1).

L'invention comprend de plus des constructions selon l'invention, caractérisées en ce que la cellule sur laquelle peut se fixer la protéine est une cellule humaine, notamment des cellules choisies parmi les cellules musculaires, les cellules pulmonaires, les cellules hépatiques ou les lymphocytes. Parmi les cellules préférées, on peut citer les cellules quiescentes, notamment les cellules hépatiques comme par exemple les hépatocytes.

La présente invention concerne de plus des constructions selon l'invention, caractérisées en ce que la protéine pouvant se fixer sur une cellule animale est choisie parmi:
a) un ligand polypeptidique de récepteur cellulaire
b) un anticorps simple chaîne anti-antigène de surface cellulaire.

Dans un mode préféré , l'invention a pour objet des constructions selon l'invention, caractérisées en ce que la protéine, ou un de ses fragments biologiquement actifs, induit la prolifération de la cellule animale (cf.

Exemple 1)
L'invention s'adresse également à des constructions selon l'invention, caractérisées en ce que la protéine est un facteur de croissance cellulaire ou un de ses fragments biologiquement actifs. On entend par facteur de croissance cellulaire toute protéine capable d'induire par exemple la prolifération cellulaire comme par exemple l'HGF ou les facteurs de croissance spécifiques des cellules hématopoiétiques, ou d'exercer une activité mitogène.

L'invention comprend également les protéines exprimées par une construction selon l'invention.

L'invention concerne aussi les vecteurs caractérisés en ce qu'ils comprennent l'acide nucléique codant pour une protéine selon l'invention. On préfère parmi ces vecteurs les vecteurs plasmidiques ou les vecteurs viraux, notamment les vecteurs retoviraux selon l'invention, caractérisés en ce que le produit d'expression de la construction selon l'invention est exprimé à la surface externe de l'enveloppe dudit vecteur.

L'invention s'adresse aussi aux vecteurs selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils comprennent un gène d'intérêt.

Aux fins de la présente invention, un gène d'intérêt en usage dans l'invention peut être obtenu d'un organisme eucaryote, procaryote ou d'un virus par toute technique conventionnelle. Il est, de préférence, capable de produire un produit d'expression ayant un effet thérapeutique et il peut s'agir d'un produit homologue à la cellule hôte ou, de manière alternative, hétérologue.

Le terme produit d'expression désigne une protéine ou un fragment de celle-ci. Dans le cadre de la présente invention, un gène d'intérêt peut coder pour un produit (i) intracellulaire (ii) membranaire présent à la surface de la cellule hôte ou (iii) secrété hors de la cellule hôte. Il peut donc comprendre des éléments additionnels appropriés comme, par exemple, une séquence codant pour un signal de sécrétion. Ces signaux sont connus de l'homme de l'art.

Conformément aux buts poursuivis par la présente invention, un gène d'intérêt peut coder pour une protéine correspondant à tout ou partie d'une protéine native telle que trouvée dans la nature. Il peut également s'agir d'une protéine chimérique, par exemple provenant de la fusion de polypeptides d'origines diverses ou d'un mutant présentant des propriétés biologiques améliorées et/ou modifiées. Un tel mutant peut être obtenu par des techniques de biologie classiques par substitution, délétion et/ou addition d'un ou plusieurs résidus acides aminés.

On préfère tout particulièrement mettre en oeuvre un gène d'intérêt thérapeutique codant pur un produit d'expression capable d'inhiber ou retarder l'établissement et/ou le développement d'une maladie génétique ou acquise.

Un vecteur selon l'invention est particulièrement destiné à la prévention ou au traitement de la mucoviscidose, de l'hémophilie A ou B, de la myopathie de Duchenne ou de
Becker, du cancer, du SIDA et d'autres bactéries ou maladies infectieuses dues à un organisme pathogène: virus, bactérie, parasite ou prion. Les gènes d'intérêt utilisables dans la présente invention, sont ceux qui codent pour les protéines suivantes: - une cytokine et notamment une interleukine, un interféron, un facteur de nécrose tissulaire et un facteur de croissance et notamment hématopoiétique (G-CSF,
GM-CSF), - un facteur ou cofacteur impliqué dans la coagulation et notamment le facteur VIII, le facteur von Willebrand, l'antithrombine III, la protéine C, la thrombine et lthirudine, - une enzyme et notamment la trypsine, une ribonucléase et la ss-galactosidase, - un inhibiteur d'enzyme tel que l'al-trypsine et les inhibiteurs de protéases virales - un produit d'expression d'un gène suicide comme la thimidine kinase du virus HSV (virus de l'herpès) de type 1, - un activateur ou un inhibiteur de canaux ioniques, - une protéine dont l'abscence, la modification ou la dérégulation de l'expression est responsable d'une maladie génétique, telle que la protéine CFTR, la dystrophine ou minidystrophine, l'insuline, l'ADA (adénosine diaminose), la glucocérébrosidase et la phénylhydroxylase, - une protéine capable d'inhiber l'initiation ou la progression de cancers, tels que les produits d'expression des gènes supresseurs de tumeurs, par exemple les gènes
P53 et Rb, et - une protéine capable de stimuler une réponse immunitaire ou un anticorps, - une protéine capable d'inhiber une infection virale ou son développement, par exemple les épitopes antigéniques du virus en cause ou des variants altérés de protéines virales susceptibles d'entrer en compétition avec les protéines virales natives.

Par ailleurs, un gène d'intérêt en usage dans la présente invention, peut également coder pour un marqueur de sélection permettant de sélectionner ou d'identifier les cellules hôtes transfectées par un vecteur selon l'invention. On peut citer le gène néo (néomycine) conferrant une résistance à l'antibiotique G418, le gène dhfr (dihydrofolate réductase), le gène CAT (Chloramphenicol Transférase) ou encore le gène gpt (xanthine phosphoribosyl).

La présente invention concerne également des particules virales générées à partir d'un vecteur virale selon l'invention. Elle concerne de plus des méthodes pour la préparation de particules virales selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles mettent en oeuvre un vecteur selon l'invention.

L'invention a également pour objet des cellules animale transfectées par un vecteur selon l'invention.

Sont également compris dans l'invention les cellules de mammifère infectées par une particule virale selon l'invention.

La présente invention concerne également un vecteur, une particule virale ou une cellule selon l'invention, pour le traitement et/ou la prévention d'une maladie génétique ou d'une maladie acquise comme le cancer ou une maladie infectieuse. Cependant,un tel usage n'est pas limité à une application de type thérapie génique somatique. En particulier, un vecteur selon l'invention peut être utilisé à d'autres fins comme la production par voie recombinante dans des cellules eucaryotes de produits d'expression destinés à être inclus après purification dans ladite composition pharmaceutique.

L'invention s'adresse également à une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique un vecteur ou une cellule selon l'invention, en association avec un véhicule acceptable d'un point de vue pharmaceutique.

Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier, on associe une quantité thérapeutiquement efficace d'un tel agent à un support, un diluant ou un adjuvant acceptable. Elle peut être administrée selon n'importe quelle route d'administration et ceci en dose unique ou répétée après un certain délai d'intervalle. La quantité à administrer sera choisie en fonction de certains critères, en particulier l'usage à titre de traitement ou de vaccin, la voie d'administration , le patient, le type de maladie à traiter et son état d'évolution, la durée du traitement....etc. A titre indicatif, une composition pharmaceutique selon l'invention, comprend entre 104 et 1014 pfu (unité formant des plages), avantageusement entre 105 et 1013 pfu et, de préférence, entre 106 et 1011 pfu de particules virales.

L'invention est illustrée ci-après par référence aux
Figures suivantes
FIGURE 1 Représentation schématique de plasmide codant les protéines chimèriques HGF-TM.

- Les boites ombrées représentent les séquences du LTR rétrovirale ou le promoteur du cytomégalovirus humain - Les boites ouvertes représentent les séquences de l'HGF.

- Les boites solides représentent les séquences des protéines transmembranaires TM de l'enveloppe de 4070A le gène du facteur de croissance hépatocytaire (HGF) comprenant sa séquence signale est fusionné au gène de la protéine transmembranaire TM de l'enveloppe de 4070A au niveau de l'acide aminé 435 (localisé après le site de clivage SU/TM).

- TGA : Un codon stop est inséré au niveau du site unique
Clal de la séquence LHT - poly(A) : Site de polyadénylation - SP Séquence du peptide signal de l'HGF.

FIGURE 2 : Détection de l'enveloppe chimérique HGF-TM.

Immunoblots de lysats of LLZ cells transfectées avec la protéine chimérique HGF-TM montrée à la figure 1.

Lysats de 2 populations
(A) Le blot est révélé avec un antisérum anti-TM.

(B) Le blot est révélé avec un anticorps monoclonal anti-HGF.

Les positions des standards de masse moléculaire,Pr65gag, Pr80 env et l'HGF-TM chimerique ( flèche) sont représentés. Ligne 1, cellules de contrôle (HY) ; 2, cellules LHT ; 3, cellules LHTC ; 4, clone
LHTC8
(C) Analyse du clone LHTC5 par FACS (e Fluorescence
Activated Cell Sorter ). Cellules de contrôle (-- ) et cellules LHTC5 (,,,) sont révélés par un anticorps anti
HGF.

FIGURE 3 : infection d'hépatocytes murins avec des particules rétrovirales modifiées transduites avec le gène nls-lacZ.

Les hépatocytes sont isolés par infusion de collagénase à J = 0 jour et sont cultivés sur des botes
Primaria de 6 cm de diamètre, sur milieu M199 (Gibco) contenant 10-6 M de dexaméthasone, 10-6 M d'hormones tyroidiennes, 1Os M d'insuline, 102 M d'acide lactique et 2. 10-3 M de glutamine en présence d'antibiotique (pénicilline et streptomycine).

A J = 1 jour et à J = 2 jours, le milieu de culture est remplacé par du milieu supplémenté avec 5 ng d'HGF recombinant (Genentech). La nuit précédant l'infection, le milieu des lignées cellulaires confluentes est remplacé par 5 ml d'un mélange (v/v) constitué d'un milieu pour hépatocytes et d'un milieu pour cellules productrices contenant 5 mM de butyrate de sodium et 106 de dexaméthasone. Les hépatocytes sont infectés 48 heures après étalement en présence de 3 Ag/ml de poly brène.

Trois heures plus tard, l'infection est stoppée en remplaçant le surnageant viral par un milieu de culture contenant 5 mg/ml d'HGF recombinante.

A J = 5 jours, la transduction des cellules est détectée par coloration histochimique avec une solution de
X-Gal.

En haut à gauche les hépatocytes infectés aveclml de vecteur viral non dilué contenant l'enveloppe sauvage récoltés à partir des cellules productrices HY.

En bas à gauche : hépatocytes infectés 1 ml de vecteur viral non dilué présentant l'enveloppe chimérique
HGF-TM et sauvage récoltés à partir des cellules productrices LHT.

En haut à droite : hépatocytes infectés avec 1 ml de vecteur viral non dilué présentant l'enveloppe chimérique
HGF-TM/Cla et sauvage récoltés à partir de cellules productrices LHTC.

En bas à droite : efficacité relative de l'infection par particules virales à enveloppes chimériques d'hépatocytes murins comparés à des particules virales contenant l'enveloppe sauvage.

FIGURE 4. Activité biologique de particules rétrovirales exprimant des enveloppes chimériques ales particules virales exprimant des protéines d'enveloppes chimériques ou sauvages sont récoltées de différentes lignées cellulaires et utilisées pour transfecter les cellules NIH3T3 ou MDCK afin de déterminer les titres des virus. Le nombre de cellules exprimant le gène bactérien lacZ (contenant le signal de localisation du noyau, nls-lacZ), les cellules sont marqués avec le 5 bromo-4-chloro-3-indoyle-ss-d-galactopyranoside. Les cellules MDCK sont cultivées sur milieu minimum essentiel de Dulbeco (DMEM) contenant 10% du sérum de veau fétal.

Les cellules 3T3 sont cultivées sur DMEM contenant du sérum de veau de nouveau-né.

b Afin de corriger la légère différence de titre de virus des deux lignées cellulaires, le pourcentage d'infection des cellules MDCK par rapport aux cellules 3T3 a été calculé suivant la formule
(Titre de MDCK / Titre 3T3) / (1,2/6) x 100 les surnageant s du milieu des cellules productrices sont incubés avec des anticorps monoclonaux anti-HGF (Institute of Immulogy, Japon) pendant 45 mn à 370C puis titrés par dilution successive sur des cellules 3T3. Le pourcentage d'infection aété calculé suivant la formule (Titre sur 3T3 en présence d'anticorps) / (Titre sur 3T3 sans anticorps) X 100 d non fait Le milieu des cellules productrices est incubé avec des anticorps anti-HGF (10pg/ml) ou avec le récepteur c-Met soluble (30pg/ml) pendant 45 mn à 370C puis titré par dilution successive dans les cellules MDCK, le pourcentage d'infection a été calculé suivant la formule (Titre sur MDCK avec anticorps ou avec le récepteur c-met soluble) / (Titre sur MDCK sans anticorps ou sans récepteur c-Met soluble) X 100.

EXEMPLE 1
CONSTRUCTION DE L'ENVELOPPE CHIMERIQUE
L'HGF est une protéine monomérique qui peut être obtenue par réaction protéolytique sous une forme active composée d'hétérodimères reliés par des ponts disulfures (sous unités a et ss).

La construction des particules rétrovirales présentant l'HGF a été effectuée en fusionnant la séquence codante pour TM (protéine transmembanaire) à la partie 3' terminale de 1'ADNc codant 1'HGF humain.

La séquence codant TM a été obtenue par PCR en utilisant les deux amorces suivantes
TM 5' (CATCTTAGr-TzCGCGGTTCTGGCCCTTCTACTAGGA)
TM 3' (TCTTTCACTGATGCISSCTCGTACTCTATGGGTTTTAAG), avec un site de restriction KpnI. Le produit obtenu par
PCR a ensuite été digéré par KpnI et inséré au niveau du site unique KpnI de l'ADN codant pour HGF.

Cette protéine HGF-TM fusionnée présente toute la séquence codant de l'HGF et pratiquement la séquence codante complète de TM, à l'exception des 6 premiers amino-acides de l'ectodomaine.

La chimère HGF-TM/Cla présente un codon d'arrêt inséré au niveau du site ClaI, site du gène TM, afin d'éliminer la queue cytoplasmique de la protéine HGF-TM.

Cette enveloppe protéique ne contient pas le motif de clivage SU-TM et par conséquent la fusion de membrane ne pourra pas s'effectuer.

Les deux constructions, HGF-TM et HGF-TM/Cla, ont été clonées dans une cassette d'expression de vecteurs et exprimées sous le contrôle de différents promoteurs comme le LTR rétroviral ou le promoteur du cytomégalovirus (figure 1).

Les constructions ont ensuite été cotransfectées dans des cellules LLZ- < p-CRIP par un plasmide exprimant le gène de la résistance à l'hygromycine B. Les cellules LLZ expriment le vecteur rétroviral reporter MFG-nlsLacZ et produisent des particules virales pouvant infecter des cellules hôtes de type amphotropique.

Des lignées stables exprimant la protéine chimérique ont été réalisées par sélection à l'hygromycine
B pendant 3 semaines puis analysées.

Ces lignées peuvent produire des particules rétrovirales présentant des protéines d'enveloppes chimériques ou sauvages. Les cellules LLZ-(p-CRIP ont été également transfectées par le plasmide sélectionné seul puis ensuite cultivées pendant 3 semaines dans un milieu contenant de l'hygromycine B afin d'obtenir des cellules témoins de contrôle pour les expériences de transfection, en particulier des témoins présentant la même gamme de titre de particule virale et le même nombre de passages entre les cellules témoins de contrôle et les cellules exprimant l'enveloppe chimérique.

RYPpRARTON nw.s: PROTEINE D'ENVgTlnPPES CRTMRRTQTR.q
Les lysats de cellules transfectées par les plasmides exprimant la protéine fusionnée TM-HGF ont été analysés par immunoblotting avec des anticorps polyclonaux anti-TM et des anticorps monoclonaux anti-HGF (figure 2).

Le précurseur Pr80 env et la protéine recombinante
TM de 15 kDa ont été détectés dans les extraits cellulaires par le sérum anti-TM. Une protéine de 95 kDa a été spécifiquement détectée dans les extraits cellulaires de LHTCS par les anticorps monoclonaux anti-HGF. Le poids moléculaire de cette protéine reflète précisément la taille prédite pour la protéine d'enveloppe chimérique
HGF-TM/Cla. Comme attendu, aucun hybride TM n'a été mis en évidence dans les culots de cellules témoins de contrôle.

Pour démontrer que la protéine chimérique a bien été transportée et orientée correctement dans la membrane cellulaire, on a analysé les 3 lignées cellulaires à l'aide ddu système FACS (o Fluorescence-Activated Cell
Sorter ) en utilisant un anticorps monoclonal anti-HGF.

Les trois populations ont été marquées spécifiquement avec l'anticorps anti-HGF.

Afin de démontrer que les protéines fusionnées ont été incorporées dans les virions produits par ces cellules, les surnageants de cellules sont ultracentrifugés au moyen d'une centrifugeuse Beckman munie d'un rotor SW28 à 25000 tours/min pendant 1,5 heures à 40C. Les culots de virions obtenus sont ensuite analysés par immunoblotting en utilisant différents anticorps dirigés contre les protéines virales de structure : sérum polyclonal de chèvre anti-SU (Quality Biotech Inc. Camden
N.J.) ; anticorps anti-protéine p30 de capside ; anticorps anti-TM. Résultats non représentés.

ETUDES DE L'INFECTION DE CELLULE SPECIFIQUE MDCK PAR LES PARTICULES VIRALES (Figure 4)
Le titre en virus est déterminé par infection de fibroblastes murins N1H3T3 avec un surnageant de culture de cellules. Ces fibroblastes n'expriment pas le récepteur c-met.

Les cellules témoins de contrôle produisent 5.105 unités formant des colonies par ml de surnageant. Les particules virales présentant l'enveloppe sauvage et l'enveloppe chimérique fusionnées ne montrent pas de diminution du titre en virus. Ces résultats sont obtenus aussi bien pour la partie TM entière que pour la partie TM dont la queue cytoplasmique a été délétée.

Ainsi, la protéine chimérique n'altère ni la fonctionnalité de la protéine d'enveloppe sauvage ni la fixation sur le récepteur viral. Elle n'altère pas non plus les événements qui suivent la fixation de la particule virale sur le récepteur au regard de l'efficacité de la transduction. Par opposition, les vecteurs rétroviraux présentant des protéines d'enveloppe chimérique de type écotrope ou de type aviaire montrent au moins une diminution de deux logarythmes du titre des virus même pour des virus présentant une protéine d'enveloppe de type sauvage.

Pour caractériser en outre les propriétés d'infection des particules virales à enveloppe chimérique, on a effectué la transduction de deux types différents de cellules exprimant le récepteur c-met de l'HGF. Dans une première série d'expériences, on réalise la transduction de cellules Madin-Darby de reins de chiens (MDCK) portant les récepteurs de rétrovirus amphotropes avec des virus de type sauvage ou des virus présentant une enveloppe chimérique. Les infections réalisées à partir de surnageant de cultures contenant ces particules virales permettent d'obtenir une augmentation significative de l'efficacité de la transduction. Pour confirmer que cette augmentation d'efficacité de transduction n'est pas liée à la variabilité du titre de virus présent dans les surnageants, l'efficacité relative de l'infection est estimée en normalisant le nombre de colonies par boîte avec le titre de virus déterminé pour les fibroblastes
NIH3T3). Les rétrovirus recombinants présentant les protéines HGF-TM ou HGF-TMc ont un pouvoir infectieux deux fois plus grand que les virus de type sauvage.

Pour démontrer que l'augmentation du pouvoir infectieux est lié au récepteur de l'HGF, des expériences de neutralisation ont été réalisées en préincubant le surnageant contenant les particules virales avec des anticorps anti-HGF. Les résultats obtenus pour le clone
LHTC5 montrent que dans ces conditions l'efficacité de la transduction de rétrovirus à enveloppe chimérique (clone
LHTC5) est diminuée sur les cellules MDCK alors qu'elle reste inchangée sur des cellules de fibroblastes NIH3T3 (figure 4).

Ces résultats montrent clairement que l'augmentation de l'efficacité de la transduction dépend des interactions spécifiques entre les protéines d'enveloppe chimérique et le récepteur c-met.

Dans le but d'examiner la cinétique d'infection par des particules virales sur des cultures primaires de cellules exprimant le récepteur c-met, la transduction de vecteur rétroviral LacZ a été réalisée sur des cultures primaires d'hépatocytes murins comme déjà décrit.

Les infections ont été réalisées sur hépatocytes pendant 5 heures. Le virus présentant une enveloppe HGF montre une efficacité d'infection trois fois plus grande sur hépatocytes que les virus de type sauvage (figure 3).

ETUDE DE LA PROLIFERATION
L'HGF étant un puissant mitogène pour les hépatocytes, nous avons examiné si l'incorporation d'HGF sur les particules virales se traduisait non seulement par la fixation de ces particules virales sur le récepteur cmet, mais également par l'induction de la prolifération des hépatocytes.

Pour celà, nous avons réalisé l'infection d'hépatocytes murins en présence de bromo--deoxy-Uridine (BrdU). Dans une première série d'expériences, les hépathocytes murins sont cultivés en abscence de facteur de croissance. Comme attendu, peu d'hépatocytes incorporent BrdU lorsque les cellules sont infectées avec les particules rétrovirales de type sauvage. Au contraire, lorsque l'infection est réalisée avec des particules retrovirales exprimant l'HGF sur l'enveloppe, les cellules marquées au BrdU sont facilement détectables Ces résultats indiquent que non seulement HGF-TM ou HGF-TM/Cla sont capables de se fixer sur les récepteurs c-met, mais également d'être clivés par protéolyse pour donner un hétérodimère complètement actif, capable d'induire la transduction d'un signal conduisant à la prolifération de l'hépatocyte. De plus, sachant que les hépatocytes ne se divisent qu'une seule fois en culture (rarement deux fois), l'augmentation de l'efficacité d'infection n'est pas due à l'activité mitogène des particules présentant l'HGF. Ces résultats sont corroborés par le fait que les cellules MDCK utilisées dans cet example, sont issues d'un clone qui ne répond pas à l'activité mitogène de l'HGF.

DISCUSSION
L'infection virale est une opération multi-étapes qui dépend en premier lieu de la fixation de glycoprotéines de l'enveloppe virale sur le récepteur spécifique de la surface de la cellule. Cette fixation provoque un changement conformationnel de la protéine de l'enveloppe virale puis la fusion de la membrane cellulaire et virale. Le tropisme du virus est déterminé par les protéines de surface SU tandis que TM est une protéine transmembranaire qui joue un rôle important comme médiateur lors de la fusion membranaire. Le complexe de l'enveloppe est sélectivement incorporé sous forme d'oligomères dans les virions au moment de leur réplication.

Nos résultats montrent qu'une grosse molécule soluble et non virale, l'HGF, peut être incorporée dans des virions du rétrovirus murin de la leucémie (MLV virus) en la fusionnant avec l'extrémité amino-terminale de la protéine TM. Il avait déjà été montré que le CD4 ou un CD4 cytoplasmique chimérique d'origine rétrovirale, pouvait être efficacement incorporé dans les particules du virus
RSV (virus du sarcome de Rous).

Les protéines chimériques HGF n'interfèrent ni avec la maturation du précursseur glycoprotéique de l'enveloppe, ni avec son incorporation dans la membrane du virion. Au contraire, les particules présentant à la fois une enveloppe glycoprotéique amphotrope de type sauvage et une protéine HGF chimérique, infectent avec une plus grande efficacité les cellules exprimant le récepteur cmet. Il est vraisemblable, d après ces résultats, que les virions modifiés sont mieux fixés et retenus à la surface des cellules par le récepteur de l'HGF. Par la suite, par diffusion latérale de la membrane, la sous-unité SU peut se fixer sur le récepteur viral et la sous-unité TM déclencher la fusion de la membrane virale et cellulaire.

Afin de cibler l'infection virale, de nombreux auteurs ont modifié la sous-unité SU d'enveloppe écotrope ou aviaire en insérant des ligands (polypeptidiques ou simples chaines d'anticorps). Mais jusqu'à maintenant, ces protéines d'enveloppe chimériques n'ont eu qu'un succès marginal. Malgrè l'efficacité de la fixation de ces virus à enveloppe modifiée sur les cellules cibles humaines, ceux-ci se sont montrés peu fusiogéniques en dépit de la présence d'enveloppe de type sauvage.

Le réarrangement conformationnel du complexe enveloppe, après fixation sur le récepteur viral, est nécessaire pour la fusion de la membrane cellulaire et virale. Les enveloppes glycoprotéiques de type écotrope ou aviaire ne possèdent pas le récepteur viral correspondant aux cellules humaines.

Une protéine chimérique correspondant à la fusion de l'HGF et TM a été construite et des lignées cellulaires stables produisant des vecteurs rétroviraux amphotropes présentant l'HGF ont été réalisées. Cette protéine d'enveloppe chimérique présentant HGF-TM est capable de fixer la particule virale sur la surface de la cellule par l'intermédiaire de l'HGF et de son récepteur sans empêcher la fixation de la sous-unité virale SU sur son récepteur membranaire. Il semble également que la présence d'enveloppe de type sauvage est nécessaire comme aide à la fusion efficace de la membrane. D'autre part, la transduction du signal, via le groupement HGF, augmente la prolifération des hépatocytes.

Ces résultats montrent que (i) la protéine chimérique HGF-TM n'interfère pas avec la maturation du précurseur glycoprotéique de l'enveloppe ou avec son incorporation dans la membrane du virion. Les molécules d'HGF coexprimées correspondent à un polypeptide de 674 acides aminés, mais celà n'empêche pas la sous-unité SU d'atteindre et de se fixer sur son récepteur, suggérant que ces deux récepteurs pourraient être positionnés à proximité l'un de l'autre sur la membrane de la cellule cible. Enfin, le déclenchement des signaux médiés par le récepteur c-met lors de la fixation du groupement HGF associé au virus, ne bloque pas la dissociation du trimère
SU, le réarrangement de TM et l'entrée du virus.

IL semble que, pour des cellules exprimant le récepteur c-met, la phase initiale pourrait être la fixation du virus présentant l'HGF sur le récepteur de 1'HGF, compte tenu de la haute affinité de l'HGF pour son récepteur c-met comparée à celle de l'intéraction SU-Ram-I (voisine de la nanomole). Par la suite, la stabilisation de la particule virale fixée permet à la sous-unité Su de se fixer sur le récepteur viral situé à proximité par diffusion latérale de la membrane et de déclencher la fusion membranaire via la sous-unité TM non modifiée de type sauvage. Ceci pourrait permettre d'obtenir des virions modifiés capables de transférer efficacement un gène à des cellules exprimant le récepteur c-met.

Claims (27)

REVENDICATIONS

1. Construction pour l'expression d'une protéine chimérique d'enveloppe de virus, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence du gène, ou de son ADNc, codant pour une protéine pouvant se fixer sur une cellule animale, ledit gène étant fusionné avec un gène, ou son ADNC, codant pour une protéine transmembranaire d'enveloppe de virus, ou pour un de ses fragments biologiquement actifs.

2. Construction selon la revendication 1, caractérisée en ce que la protéine transmembranaire d'enveloppe de virus est une protéine transmembranaire d'enveloppe de rétrovirus.

3. Construction selon la revendication 2, caractérisée en ce que le rétrovirus est choisi parmi les rétrovirus aviaires, les rétrovirus bovins, les rétrovirus murins, les rétrovirus félins ou les rétrovirus de primate.

4. Construction selon l'une des revendications 1 ou 3, caractérisée en ce que le rétrovirus a un tropisme de type amphotrope.

5. Construction selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisée en ce que le rétrovirus est le virus de la leucémie murine, notamment le virus de la leucémie murine de Moloney.

6. Construction selon l'une des revendications 1 ou 5, caractérisée en ce que le gène codant pour la protéine transmembranaire est fusionnée à la partie 3' terminale du gène codant pour la protéine pouvant se fixer sur une cellule animale.

7. Construction selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisées en ce que la cellule sur laquelle peut se fixer la protéine est une cellule humaine.

8. Construction selon la revendication 7, caractérisée en ce que la cellule humaine est une cellule choisie parmi les cellules musculaires, les cellules pulmonaires, les cellules hépatiques ou les lymphocytes.

9. Construction selon l'une des revendications 7 et 8, caractérisée en ce que la cellule humaine est une cellule quiescente, notamment une cellule hépatique.

10. Construction selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la protéiné pouvant se fixer sur une cellule animale est choisie parmi:

a) un ligand polypeptidique de récepteur cellulaire

b) un anticorps simple chaîne anti-antigène de surface cellulaire.

11. Construction selon la revendication 10, caractérisée en ce que la protéine, ou un de ses fragments biologiquement actifs, induit la prolifération de la cellule animale.

12. Construction selon la revendication 10, caractérisée en ce que la protéine est un facteur de croissance cellulaire ou un de ses fragments biologiquement actifs.

13. Construction selon la revendication 12, caractérisée en ce que la protéine est l'HGF ou un de ses fragments biologiquement actifs.

14. Protéine exprimée par une construction selon l'une des revendications 1 à 13.

15. Vecteur, caractérisé en ce qu'il comprend une construction selon l'une des revendications 1 à 13.

16. Vecteur selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur plasmidique ou d'un vecteur viral.

17. Vecteur selon l'une des revendications 15 à 16, caractérisé en ce que le produit d'expression de la construction selon l'une des revendications 1 à 13 est exprimé à la surface externe de l'enveloppe dudit vecteur

18. Vecteur selon l'une des revendications 15 à 17, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur rétroviral recombinant.

19. Vecteur selon l'une des revendications 15 à 18, caractérisé en ce qu'il comprend un gène d'intérêt.

20. Vecteur selon la revendication 19, caractérisé en ce que le gène d'intérêt code pour un produit d'expression sélectionné parmi le facteur VIII, le facteur IX, la protéine CFTR, la dystrophine, l'insuline, l'interféron gamma, une interleukine ou un marqueur de sélection.

21. Particule virale générée à partir d'un vecteur selon l'une des revendications 15 à 20.

22. Méthode pour la préparation de particules virales selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un vecteur selon l'une des revendications 15 à 20.

23. Cellule animale transfectée par un vecteur selon l'une des revendications 15 à 20.

24. Cellule de mammifère infectée par une particule virale selon la revendication 21.

25. Vecteur selon l'une des revendications 15 à 20, particule virale selon la revendication 21 ou cellule animale selon l'une des revendications 23 à 24, pour le traitement et/ou la prévention d'une maladie traitable par thérapie génique.

26. Composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique, un vecteur selon l'une des revendications 15 à 20, une particule virale selon la revendication 21 ou une cellule animale selon l'une des revendications 23 à 24 en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

27. Composition pharmaceutique selon la revendication 26, caractérisée en ce qu'elle comprend entre 104 et 10 pfu, et de préférence entre 106 et 1011 pfu particules virales selon la revendication 21.