FR2746317A1 - Nouvelles compositions antitumorales - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une nouvelle composition antitumorale comprenant une population de cellules capables d'exprimer au moins trois gènes thérapeutiques et notamment des gènes immuno-stimulateurs et/ou cytotoxiques. Elle a également pour objet une cellule d'encapsidation exprimant l'interleukine-2 et un vecteur rétroviral exprimant les gènes interferon gamma et thymidine kinase du virus de l'herpes HSV-1 ainsi que leur utilisation thérapeutique pour la prévention et le traitement des cancers.

Description

NOUVELLES COMPOSITIONS ANTITUMORALES
La présente invention a pour objet une composition cellulaire pour le traitement ou la prévention de tumeurs chez l'homme ou l'animal. Plus particulièrement, elle comprend une population de cellules capables d'exprimer une combinaison d'au moins trois gènes thérapeutiques à effet antitumoral. L'invention concerne également l'utilisation thérapeutique d'une telle composition dans le domaine de la cancérologie.

Depuis une dizaine d'années, de nombreuses publications font état de la possibilité d'éliminer les tumeurs ou, à défaut retarder leur progression, par la technique du transfert de gène. Les nombreux essais cliniques mis en place confirment l'intérêt grandissant de la thérapie génique du cancer. La majorité des protocoles emploie des vecteurs rétroviraux du fait de leur capacité d'intégration dans les cellules en division, pour transferer un gène à visée antitumorale. Ces derniers ainsi que les lignées d'encapsidation permettant de les produire sont décrits dans de nombreux documents de l'état de la technique.

Plusieurs approches ont été considérées, notamment le transfert de gènes immunostimulateurs (immunothérapie) susceptibles d'induire ou activer une réponse cellulaire immune à l'égard de la tumeur, de gènes cytotoxiques conférant une toxicité aux cellules les exprimant et d'anti-oncogènes (gènes suppresseurs de tumeurs ou capables d'inhiber l'activité d'un oncogène). Ces différentes approches sont résumées dans l'état de la technique (voir par exemple Moolten, 1994, Cancer
Gene Therapy 1,279-287 ; Anderson, 1994, Human Gene Therapy 5, 1-2, vile et
Russe, 1994, Gene Therapy 1, 88-89; Culver et Blaese, 1994, Trends in Genetics 10, 174-178 ; Zier et al., 1996, Immunology Today, 17, 39-45).

L'immunothérapie est fondée sur le transfert de gènes codant pour les cytokines et molécules co-stimulatrices dans le but de rendre les cellules tumorales plus immunogènes et renforcer la réponse immunitaire antitumorale de l'hôte. Les cytokines ainsi évaluées dans des modèles murins et, pour lesquelles une propriété antitumorale a été mise en évidence, sont l'interleukine (IL) 2,1'IL4,1lL-6, llL-7, llL-12, le facteur nécrosant des tumeurs (TNF) de type alpha, le GM-CSF (pour
Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) et les interférons (if). Des cellules xénogéniques produisant 1'IL-2 ont ainsi démontré un effet antitumoral (voir la demande européenne EP 0 579 791).

L'approche cytotoxique consiste à accroître spécifiquement la sensibilité des cellules tumorales à une chimiothérapie par transfert d'un gène dit suicide dont le produit est capable de transformer un précurseur inactif en produit hautement cytotoxique. Le plus employé à ce jour est le gène tk du virus Herpes Simplex de type 1 (HSV-1) codant pour l'enzyme thymidine kinase (TK) qui a la propriété de convertir l'acyclovir et le ganciclovir en analogues phosphorylés de nucléosides.

Ces nucléotides aberrants sont alors incorporés durant la division cellulaire dans les chaînes d'ADN chromosomiques néoformées, ce qui a pour conséquence une inhibition de la replication génétique et une mort des cellules tumorales en division (Moolten, 1986, Cancer Res. 46, 52765281). Un avantage supplémentaire de cette approche est conféré par l'effet de voisinage ( by stander en anglais) qui résulte d'une propagation des propriétés cytotoxiques aux cellules avoisinantes causant leur destruction (Freeman et al., 1993, Cancer Res. 53, 5274-5283). Ainsi des rétrovirus portant le gène tk ont été utilisés dans le cadre du traitement de tumeurs cérébrales malignes dans le but de déclencher le suicide cellulaire après administration de ganciclovir (Izquierdo et al., 1996, Gene Therapy 3, 491-495).

Dans la même optique, la demande WO 95/06486 propose l'injection de fibroblastes murins produisant un vecteur rétroviral exprimant le gène cytotoxique.

Enfin, la stratégie anti-oncogène repose sur l'introduction dans les cellules tumorales d'une copie fonctionnelle d'un gène suppresseur de tumeur (par exemple le gène associé au rétinoblastome ou p53) ou l'inhibition de l'expression des oncogènes par le transfert de gènes codant pour des polynucléotides antisens ou des ribozymes capables de dégrader les ARN messagers des oncogènes dans le but de réduire ou abolir la prolifération des cellules cancéreuses.

Certains protocoles expérimentaux anticancéreux récents proposent de combiner plusieurs gènes thérapeutiques pour obtenir un effet antitumoral synergique (voir par exemple la demande PCT/FR94/00192 ; Rosenthal et al., 1994, Blood 83, 1289-1298 ; O'Malley et al., 1996, Cancer Res. 56, 1737-1741; Lollini et al., 1995, Human Gene Therapy 6, 743-752). Cependant, vu leur grand nombre et leur diversité, I'ensemble de ces études ne permet pas aujourd'hui de clairement identifier la molécule ou la combinaison de molécules la mieux adaptée au traitement d'une tumeur donnée.

On a maintenant mis en évidence une composition antitumorale basée sur des cellules génétiquement modifiées pour sécréter de 1'IL-2 et produire des particules rétrovirales exprimant les gènes tk du virus HSV-I et IFN y. Une telle composition permet d'inhiber ou retarder la prolifération cellulaire en induisant la mort spécifique des cellules tumorales, une meilleure présentation des antigènes et une stimulation des cellules immunes de l'hôte. La présente invention offre une alternative efficace aux techniques de l'art antérieur pour traiter le cancer chez l'homme ou l'animal.

C'est pourquoi la présente invention a pour objet une composition antitumorale comprenant une population de cellules permettant l'expression d'au moins trois gènes thérapeutiques antitumoraux.

Par "gènes thérapeutiques antitumoraux", on entend des gènes dont les produits d'expression ont un effet antitumoral; notamment pour accroître l'immunité dirigée spécifiquement contre la tumeur et/ou inhiber au moins partiellement la division cellulaire. De préférence, il s'agit de gènes codant pour des polypeptides immunostimulateurs de la réponse immunitaire et/ou cytotoxiques. Par "immunostimulateur", on entend tout polypeptide capable d'amplifier la production d'anticorps dirigés contre les cellules et antigènes tumoraux ou de stimuler une réponse immunitaire à médiation cellulaire, en activant les lymphocytes T, afin de déclencher une réponse cytotoxique ou de type hypersensitivité retardée significative à l'encontre des cellules tumorales. Par "cytotoxique", on entend tout polypeptide capable d'induire une mort cellulaire soit directement soit indirectement par l'intermédiaire d'une drogue susceptible d'être administrée de manière indépendante.

Parmi les gènes immunostimulateurs utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut envisager les gènes codant pour les cytokines et notamment les interleukines (IL), les facteurs de stimulation des colonies (G-CSF, M-CSF et GM
CSF), les interférons (if), les facteurs de nécrose des tumeurs (TNF), les facteurs de co-stimulation tels que les polypeptides B7.1 et B7.2 et les facteurs activant l'expression des antigènes d'histocompatibilité de classe II.

A l'heure actuelle, 16 interleukines ont été identifiées. n est particulièrement difficile de leur attribuer une fonction spécifique car elles exercent des effets pleiotropes. Dans le cadre de la présente invention, toutes les interleukines présentent un intérêt, mais on cite plus particulièrement l'IL-2,11L4, l'IL6, l'IL- 10, llL-12. Dans ce contexte, 1'IL-2 est particulièrement préférée. Elle est responsable de la prolifération des lymphocytes T activés, et, en association avec IIFNy, stimule les macrophages, les cellules tueuses naturelles NK (pour Natural
Killer en anglais) et les cellules T. De plus, certaines études tendent à montrer qu'elle a un rôle chimiotactique pour les lymphocytes lorsqu'elle est produite au niveau d'une tumeur.

Les interférons possédent des propriétés antivirales et immunomodulatrices. Ils peuvent activer les cellules phagocytaires et accroître l'expression des antigènes de surface de classe I et II du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) et stimuler également la cytotoxicité des cellules NK et celles activées par les lymphokines (LAK pour Lymphokine Activated Killer en anglais) à l'encontre des cellules tumorales. Bien que les trois classes principales d'IFNs, respectivement cr, 5 et y, présentent un intérêt dans le cadre de la présente invention, on préférera tout particulièrement IlFNy.

Les facteurs stimulant les colonies interviennent au niveau de la maturation des cellules souches hématopolétiques et leur différentiation en cellules matures de la circulation sanguine. On distingue les GM-CSF, G-CSF et M-CSF (pour
Granulocyte-Macrophage, Granulocyte et Macrophage respectivement) selon le stade de maturation et le type cellulaire sur lequel ces facteurs exercent leur influence.

Pour ce qui est des facteurs nécrosant des tumeurs, on distingue le TNFa produit par les macrophages et le TNFss produit par les lymphocytes T. Tous deux sont responsables de l'activité cytotoxique anti-tumorale des macrophages et lymphocytes et de l'altération tissulaire locale observée dans la réaction inflammatoire.

Parmi les gènes cytotoxiques, on peut citer ceux codant pour une thymidine kinase et, notamment la thymidine kinase (TK) du virus Herpes Simplex de type 1 (HSV1), la cytosine déaminase, le cytochrome P450 2B1, la purine nucléoside phosphorylase codée par le gène DeoD d'E.coli, la nitroréductase et la ss- glucoronidase. D'une manière générale, ces gènes toxiques sont décrits dans la litérature (voir par exemple Moolten, 1994, Cancer Gene Therapy 1, 279-287).

Selon un mode de réalisation préféré, les trois gènes thérapeutiques mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention codent pour les polypeptides TK-HSV1, IL 2 et IFNy. L'origine des gènes immunostimulateurs est choisie de manière à ce qu'ils soient fonctionnels dans l'hôte à qui la composition antitumorale selon l'invention est destinée. S'agissant d'un hôte humain, on retiendra de préférence les séquences codante pour 1'IL-2 et l'IFNe humains.

Les gènes thérapeutiques peuvent être obtenus par clonage, par PCR ou par synthèse chimique selon les techniques conventionnelles communément en usage.

Il peut s'agir de gènes natifs ou dérivés de ces derniers par mutation, délétion, substitution et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides. Bien entendu, ils peuvent comprendre les éléments appropriés de régulation de la transcription ainsi que des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction permettant leur expression.

D'une façon générale, on aura recours à une région promotrice fonctionnelle dans les cellules de l'hôte que l'on veut traiter, de préférence dans les cellules humaines.

n peut s'agir de la région promotrice gouvernant naturellement l'expression dudit gène ou d'une région promotrice d'origine différente, par exemple issue de gènes eucaryotes ou viraux. D'autre part, la région promotrice peut être modifiée de manière à contenir des séquences régulatrices, par exemple un élément activateur de la transcription (enhancer).

La région promotrice retenue pourra être constitutive ou régulable, et dans ce dernier cas, en réponse à certains signaux cellulaires. ll sera avantageux d utiliser une région promotrice tissu-spécifique, lorsque la tumeur à traiter est issue d'un type cellulaire particulier. D'une manière alternative, l'utilisation d'un promoteur répondant à des signaux spécifiquement tumoraux (par exemple répondant à des facteurs surexprimés par les cellules tumorales) peut s' avérer avantageuse puisque l'expression sera limitée aux cellules tumorales.

De tels promoteurs sont généralement connus de l'homme de l'art. On peut citer notamment les promoteurs SV40 virus Simian 40), PGK (Adra et al., 1987, Gene 60, 65-74), HMG (Hydroxy-Methyl-Glutaryl-coenzyme A), TK (Thymidine
Kinase), les LTRs (Long Terminal Repeat) du RSV (Rous Sarcoma Virus), du
Mo-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) et les promoteurs des gènes codant pour les antigènes MHC de classe I qui sont activés par IlFNy. Ces exemples ne sont pas limitatifs.

Dans le cadre de la présente invention, les gènes thérapeutiques peuvent être placés sous le contrôle d'éléments permettant leur expression de façon indépendante ou commune. En d'autres termes, ils peuvent être exprimés d'une manière monocistronique ou polycistronique. Dans ce dernier cas, on mettra en oeuvre un élément permettant la réinitiation de la traduction au niveau du second cistron, par exemple un site interne d'entrée des ribosomes (IRES) bien connu de l'homme de l'art. A ce jour, un certain nombre d'IRES ont été identifiés dans la région 5' des
ARNm viraux et, notamment, des picornavirus tels que le virus de la poliomyélite (Pelletier et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8, 1103-1112) et l'EMCV (Encephalomyocarditis virus; Jang et al., 1988, J. Virol. 62, 2636-2643). Il est également possible d'employer les IRES décrits dans la demande internationale WO 96/01324.

Par ailleurs, il peut être avantageux que les polypeptides immunostimulateurs soient sécrétes à l'extérieur des cellules composant la composition antitumorale selon l'invention. Dans ce contexte, les gènes correspondants peuvent également inclure une séquence signal. 11 peut s'agir de la séquence signal naturelle ou bien d'une séquence hétérologue du moment qu'elle soit fonctionnelle dans la cellule hôte.

Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, la population cellulaire composant la composition antitumorale selon l'invention est constituée de cellules d'encapsidation rétrovirale permettant la production de particules infectieuses comprenant un vecteur rétroviral. Généralement et pour des raisons de sécurité, le vecteur rétroviral est défectif par délétion ou mutation des gènes viraux gag, pol et env et ne peut, de ce fait, se repliquer de manière autonome. Sa propagation nécessite l'apport des polypeptides viraux pour lesquels il est déficient. Une cellule d'encapsidation est capable de fournir en trans l'ensemble des polypeptides que le vecteur rétroviral ne peut synthétiser et qui sont nécessaires à la constitution des particules infectieuses. De préférence, les cellules d'encapsidation en usage dans la présente invention sont dérivées d'une lignée d'origine humaine et, notamment, de la lignée 293. Celle-ci peut être générée par transfection de vecteurs parmettant l'expression des gènes gag/pol du virus FMuLV (Friend Murine Leukemia Virus) de la souche FB29 et le gène env du virus amphotropique 4070A. A titre d'exemple, on peut citer la lignée E17 décrite dans la demande internationale
PCT/IB96/00439 dont le contenu est incorporé par référence.

Une composition antitumorale préférée selon l'invention comprend une population de cellules comportant un vecteur permettant l'expression d'un gène codant pour llL-2 et permettant la production de particules infectieuses ayant incorporé un vecteur rétroviral exprimant un gène codant pour la thymidine kinase du virus
HSV-1 et un gène codant pour l'IFNy.

Selon un mode de réalisation avantageux, la population de cellules en usage dans le cadre de la présente invention est sensible à une drogue permettant son élimination. Dans le cas où elle exprime le gène tk du HSV-1, on peut envisager d'employer une drogue dérivée de l'acyclovir et, notamment, le ganciclovir. La population de cellules peut en outre exprimer un marqueur de sélection positive, par exemple un gène de résistance à un antibiotique facilitant sa sélection. On peut citer les génes neo (néomycine) conférant une résistance à l'antibiotique G418, ~ (dihydrofolate réductase), pac (puroacetyl transferase) (Morgenstern et Land, 1990, Nucleic Acids Res. 18, 3587-3596), hygromycine B et gpt (xanthine phosphoribosyl).

La présente invention concerne également une cellule d'encapsidation dérivée de la lignée 293 et comprenant: - les gènes gag/pol du virus FMuLV (Friend Murine Leukemia Virus) de la
souche FB29 et le gène env du virus amphotropique 4070A, et - un vecteur permettant l'expression d'un gène codant pour l'IL-2.

Un vecteur approprié peut être constitué par le vecteur pTG5324 décrit ci-après dans lequel l'expression de l'IL-2 est dirigée par le promoteur précoce du virus
CMV (Cytomegalovirus). Mais, bien entendu, d'autres vecteurs d'expression peuvent être employés.

La présente invention a également pour objet un vecteur rétroviral caractérisé en ce qu'il comprend de 5' vers 3': - un LTR 5', - une région d'encapsidation, - un gène codant pour l'interféron gamma, - un promoteur interne constitutif, - un gène codant pour la thymidine kinase du virus HSV-1, - un site interne d'entrée des ribosomes (IRES), - un gène codant pour un marqueur de sélection positive, et - un LTR 3'.

Un vecteur selon l'invention peut dériver d'un rétrovirus quelconque. On peut citer à titre d'exemples, les rétrovirus aviaires tels que le virus de l'érythroblastose aviaire (AEV), le virus de la leucémie aviaire (AVL), le virus du sarcome aviaire (ASV), le virus de la nécrose de la rate (SNV) et le virus du sarcome de Rous (RSV), les rétrovirus bovins, les rétrovirus félins, les rétrovirus murins tels que le virus de la leucémie murine (MuLV), le virus de Friend (F-MLV) et le virus du sarcome murin (MSV) et les rétrovirus de primate. Cependant, on préfère tout particulièrement avoir recours au virus de la leucémie murine de Moloney (MoMuLV). Les nombreux vecteurs rétroviraux dérivés de ce dernier qui sont décrits dans la littérature, notamment le vecteur N2 ou un de ses dérivés peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention.

La présente invention concerne également l'utilisation d'une composition antitumorale, d'une cellule d'encapsidation ou d'une vecteur rétroviral selon l'invention, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention du cancer ou d'une affection cancéreuse chez un homme ou un animal.

Les cancers qui pourraient être ainsi traités sont, avantageusement, des tumeurs solides telles que les cancers renaux, du sein, du poumon et du colon et les mélanomes.

Le médicament issu de la présente invention peut être administré selon n'importe quelle voie générale communément en usage, notamment par voie parentérale telle que la voie systémique, intramusculaire sous-cutanée ou intraperitonéale. D'une maniére générale, la voie intratumorale est indiquée comme étant particuliérement avantageuse. D'une manière générale, I'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée, une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, le médicament comprendra en outre un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. n peut également comprendre un véhicule, un diluant ou un adjuvant acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Le dosage approprié varie en fonction de différents paramètres, par exemple de la voie d'administration, de l'individu à traiter, de la nature et de la sévérité de l'état tumoral, du type de gènes thérapeutiques employés.

Enfin, la présente invention a également pour objet une méthode de traitement du cancer chez les mammifères, selon laquelle on injecte à un individu ayant besoin d'un tel traitement, une quantité efficace d'un point de vue pharmaceutique d'une composition antitumorale, d'une cellule d'encapsidation ou d'une vecteur rétroviral selon l'invention.

La présente invention est illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants dans lesquels:
La Figure 1 illustre le vecteur pTG5324 permettant l'expression de 11LA2 humaine à partir du promoteur précoce CMV. Il comprend le gène de sélection pac dirigé par le promoteur SV40.

La Figure 2 illustre le vecteur rétroviral pTG9344 comprenant un LTR 5', une région d'encapsidation, une cassette d'expression bicistronique "gène tk du virus
HSV-1 suivi de l'IRES EMCVet du gène de sélection neo" dirigée par le promoteur PGK murin.

La Figure 3 illustre le vecteur rétroviral pTG9326 dérivant du vecteur pTG9344 par insertion du gène codant pour l'IFNy canin.

EXEMPLES
Les constructions décrites ci-dessous sont réalisées selon les techniques générales de génie génétique et de clonage moléculaire, détaillées dans Maniatis et al., (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY) ou selon les recommandations du fabricant lorsqu'on utilise un kit commercial.

Les étapes de clonage mettant en oeuvre des plasmides bactériens sont de préférence réalisées dans la souche E. coli XLl-Blue ou DHSa (Gibco BRL). Les vecteurs M13 sont amplifiés dans la souche E. coli JM110 ou NM522. S'agissant de la réparation des sites de restriction, on procède par remplissage des extrémités 5' protubérantes à l'aide du grand fragment de l'ADN polymérase I d'E. coli (Klenow) ou par digestion par la nucléase S 1 suivi d'un traitement par la Klenow.

Les techniques d'amplification par PCR (Polymérase Chain Reaction) sont connues de l'homme de l'art (voir par exemple PCR Protocols - A guide to methods and applications, 1990, édité par Innis, Gelfand, Sninsky et White, Academic Press Inc).

Dans les exemples qui suivent, on a recours à la lignée cellulaire murine NIH 3T3 (ATCC CRL 1685), la lignée canine MDCK (ATCC CCL 34), la lignée B16 dérivée d'un mélanome murin (ATCC CRL 6322), la lignée P8 15 issue d'un mastocytome murin (ECACC N"870 42 301), la lignée E17 (décrite en détail dans la demande internationale PCT/IB96/00439) et la lignée Pu317 (Miller et Buttore, 1986, Mol. Cell. Biol. 6, 2895-2902). A titre indicatif, la lignée E17 est une lignée d'encapsidation rétrovirale dérivant de la lignée humaine 293 (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72) par transfection de vecteurs exprimant respectivement les gènes gag/pol du virus FMuLV (Friend Murine Leukemia
Virus) de la souche FB29 et le gène env du virus amphotropique 4070au Les cellules sont transfectées selon les techniques standards bien connues de l'homme du métier. On peut citer la technique au phosphate de calcium, mais tout autre protocole peut également être employé, tel que la technique au DEAE dextran,
I'électroporation, les méthodes basées sur les chocs osmotiques, la microinjection ou les méthodes basées sur l'emploi de liposomes.

Quant aux conditions de culture, on utilise en général le milieu DMEM (Dulbecco's
Modified Eagle's Meditini, Gibco BRL) contenant 10 % (voVvol) de sérum de veau foetal (FCS), 3 g/ml de glucose, 2 mM de glutamine, 1 % d'acides aminés non essentiels et 40 llg/ml de gentamycine à l'exception des cellules MDCK et P815 pour lesquelles on emploie le milieu RPMI-1640 contenant 10 % de FCS, 2 mM de glutamine, 1 % d'acides aminés non essentiels et 40 llg/ml de gentamycine. Les cellules transduites par les vecteurs rétroviraux exprimant le gène néo sont cultivées en présence de G4 18 à une concentration finale de 1 mg/ml ou 5 mg/ml.

Les cellules d'encapsidation E17 sont cultivées en présence de l'agent de sélection puromycine(l Fug/ml).

EXEMPLE 1: Construction d'une lignee d encapsidation retrovirale produisant
l'interleukine-2 humaine (hIL-2) (E17-TG5324).

Les séquences codant pour l'h1L-2 sont isolées du vecteur pTG36 (décrit dans le brevet français 85 09480) sous forme d'un fragment PstI, sous-clonées dans le vecteur M13TG130 (Kieny et al., 1983, Gene 26, 91-99) et soumises à une mutagènes dirigée de manière à introduire un site SalI 12 nucléotides en aval du codon stop (trousse de mutagénèse Amersham, RPN 1523). L'ADNc hIL-2 est purifié du vecteur muté par digestion San et inséré dans le site MoI de pBCMGneo (Karasuyama et Melchers, 1988, Eur. J. Immunol. 18, 97-104) situé en 3' et 5' respectivement des signaux d'épissage et de polyadénylation du gène Pglobine de lapin. On obtient pTG5320.

En parallèle, un fragment BamHI-HidIII portant le promoteur précoce du virus
CMV (Cytomegalovirus) purifié de pLNCX (Miller et Rosman, 1989,
BioTechniques 7, 98s988) est introduit dans le vecteur p polyIII-I* (Lathe et al.,
1987, Gene 57, 193-201) traité par les mêmes enzymes. On introduit entre les sites
Sali et Bgm situés en aval de ce promoteur, le fragment SalI-BamHI purifié de pTG5320 portant l'intron ss-globine, l'ADNc hIL-2 et le signal de polyadénylation ss-globine. Le vecteur résultant pTG5321 est linéarisé par l'enzyme BamHI et on insère un fragment BamHI-BglII contenant le gène de sélectionpac placé sous le contrôle du promoteur précoce et du signal de polyadénylation du virus SV40. Le vecteur ainsi obtenu est désigné pTG5322.

Enfin, le vecteur pTG5324 (Figure 1) est généré par insertion dans le vecteur précédent linéarisé par BamHI d'un fragment BamHI comprenant les séquences mitochondriale 12 S murine (Luflalla et al., 1985, Som. Cell. Mol. Genet. 11, 223238).

20 g de plasmide pTG5324 sont utilisés pour transfecter les cellules E17 à une densité de 40 à 50 % selon la technique classique du phosphate de calcium. Lejour suivant, les cellules transfectées sont placées en présence de puromycine. Après deux semaines en milieu sélectif, les clones résistants sont repiqués, propagés et congelés en azote liquide en attendant de vérifier leur capacité à sécréter l'hIL-2.

Pour ce faire, on utilise des plaques de culture à 6 puits dans lesquels on ensemence 4x10S cellules à tester. Le jour suivant, le milieu est changé et récolté 24 h plus tard. La quantité d'hIL-2 présente dans les surnageants cellulaires est estimée par
ELISA (R & D Systems Minneapolis, D2050). Environ un quart des clones testés sécrètent des quantités d1L-2 dépassant 2 pg/mU106 cellules/24h. Le clone le plus producteur désigné E17-5324-clone 2 et sécrétant 3 Clg/mV106 cellules/24h d'hIL-2 est retenu pour les études ulténeures.

Dans la mesure où les cellules E17-5324 sont destinées à un usage thérapeutique humam, il est interessant de tester leur capacité de résistance à l'inactivation par le complément humain. Pour ce faire, 5x104 cellules sont mises en culture dans un support approprié. Lejour suivant le milieu est éliminé et les cellules sont exposées à 0,5 ml de sérum humain frais ou inactivé par chauffage (contrôle négatif) prélevé de deux individus différents ou encore du FCS (contrôle négatif). Après 150 min, la culture est poursuivie dans un milieu classique pour 24 h. Les cellules viables sont dénombrées après traitement à la trypsine et coloration au bleu de trypane.

L'expérience est également réalisée en parallèle sur les cellules 293 (lignée dont dérive les cellules E17), la lignée d'encapsidation PA317 et les cellules murines 3T3. Comme attendu, la viabilité de l'ensemble des lignées testées n'est pas affectée par l'exposition au FCS ou au sérum inactivé. Par contre, le traitement par du sérum frais induit la mort des cellules 3T3 et PA317 (viabilité < 0,015 %). Ce phénomène n'est pas observé avec les cellules 29 d'initiation de la transcription). Le gène tk est isolé du vecteur pTK-1 (Spandidos et al., 1982, Exp. Cell. Res. 141, 149-158 ; Wagner, 1981, Proc Natl. Acad. Sci.

USA 78, 1441-1445) et sous-cloné dans le site BamHI de pBR328 (Covarrubias et Bolivar, 1982, Gene 17, 79-82). La région 3' non codante est éliminée par digestion SmaI-XbaI et on introduit un adaptateur SmaI-XbaI résultant de la réassociation des oligonucléotides oTG4322 et oTG4323 (SEQ ID NO: 1 et 2), ce qui permet de reconstituer les 7 derniers codons situés en 3' du site SmaI et de créér un site XbaI 4 paires de bases (pb) après le codon stop. Le gène tk ainsi modifié est alors isolé sous forme d'un fragment Bgm-XbaI de 1191 pb et inséré en aval du promoteur PGK.

Puis on introduit en aval du gène tk le site IRES du virus EMCV pour permettre la réinitiation de la traduction du second cistron de l'ARNm bicistronique. ll est isolé du vecteur IRES-ssgeo (décrit dans la demande internationale WO 94/24301) par digestion XbaI-NcoI. Enfin le gène neo est cloné en aval de la séquence IRES sous forme d'un fragment BgE-SmaI produit à partir de pAG60 (Colbère-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150, 1-14) clivé par ces mêmes enzymes. Le vecteur final pTG9344 est présenté à la Figure 2.

Il est connu que la réinitiation de la traduction à partir de site IRES est moins efficace que l'initiation à partir d'ARNm coiffés. Pour ce qui est des cellules transduites par les particules issues du vecteur pTG9344, la résistance à l'agent de sélection G418 dépend de l'effioecité de la réinitiation à partir le l'IRES EMCV. En conséquence, lorsque la culture est effectuée en milieu sélectif, seules les cellules produisant de grandes quantités d'ARNm bicistroniques sont amenées à survivre assurant de ce fait un niveau d'expression élevé du gène tk.

EXEMPLE 3: Constructlon du vecteur retroviral pTG9326 contenant llFNy
canin.

Le vecteur pTG9344 comprend un site de restriction unique EcoRI qui permet
I'insertion d'un gène supplémentaire sous la dépendance du promoteur rétroviral LTR5'.

LlFNy canin est cloné à partir de l'ARN cellulaire isolé de lymphocytes T canins stimulés par la concanavaline A. L'ARN cellulaire est reverse-transcrit en mettant en oeuvre l'amorce dégénérée oTG4031 (SEQ ID NO: 3). Le fragment spécifique est amplifié en deux étapes. Tout d'abord un fragment interne est produit à l'aide des amorces oTG4169 et oTG4170 (SEQ ID NO: 4 et 5). Puis, on utilise deux oligonucléotides spécifiques oTG4321 et oTG4319 (SEQ ID NO: 6 et 7) en combinaison avec deux adaptateurs oligo d(T) et amorce pour générer les fragments 5' et 3' selon la méthode RACE (Frohmann et al., 1988, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 85, 8998-9002). Les deux fragments PCR sont clivés par SphI et AfnI avant d'être insérés dans le site SphI de M13TG131 (Kieny et al., 1983, supra) et soumis à une analyse de séquence par les techniques classiques. Les données confirment une séquence identique à celle publiée par Zucker et al. (1992,
J. Interferon Res. 12, 191-194). Le vecteur précédent M13TG8173 est utilisé comme matrice pour isoler par PCR les séquences IFNy à l'aide de deux amorces mutagènes oTG6727 et oTG6788 (SEQ ID NO: 8 et 9) qui permettent d'introduire un site EcoRI en amont et en aval des codons initiateur et stop respectivement. Le produit PCR après coupure par EcoRI est cloné dans le vecteur pTG9344 pour donner pTG9326 (Figure 3).

EXEMPLE 4: Construction du vecteur rétroviral pTG9337 contenant I IFNy
murin.

L'IFNy murin est isolé par PCR sur la base des données de séquence (Gray et
Goeddel, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 5842-5846) à l'aide des amorces oTG7295 et oTG7296 (SEQ ID NO: 10 et 11). Le vecteur rétroviral pTG9337 résulte de l'insertion du fragment d'amplification clivé par EcoRI au sein du site
EcoRI de pTG9344.

EXEMPLE 5: : Construction d'un vecteur retroviral contenant I IFNy humain LlFNy humain est isolé par PCR à partir du vecteur M13TG2437 qui résulte du sous-clonage dans le vecteur M13TG131 de la séquence codante 'FN isolée de pTG23 (Tessier et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12, 7663-7676). On utilise les amorces oTG6147 et oTG4983 (SEQ ID NO: 12 et 13). Le fragment amplifié est traité par la nucléase S1 puis par la Klenow avant d'être cloné dans un vecteur intermédiaire dont il peut être isolé pour être inséré dans le site EcoRI de pTG9344.

EXEMPLE 6: : Construction d'une lignee d'encapsidation secretant l1iIU2 et
produisant le vecteur rétoviral pTG9326.

Les celles E17 sont transfectées par 10,ug de chacun des plasmides pTG9326 et pTG5324 par la méthode au phosphate de calcium et cultivées en milieu sélectif (1 ,ug/ml de puromycine et 1 mg/ml de G418) 24 h après la transfection. Dix à 14 jours plus tard, les cellules résistantes sont sous clonées par dilution limite (mise en culture dans une plaque à 96 puits de 200 CLV puit d'une dilution à une densité de 1,5 cellules par ml). Les clones cellulaires sont récupérés après deux semaines de culture et amplifiés de manière classique. Les clones sont mis en culture à raison de 4x105 cellules. Après un changement de milieu, on récolte le surnageant de culture de 24 h à partir duquel on estime les quantités d'hlL-2 et d'IFNy sécrétées.

Pour ce qui est de lhIL-2, on applique la méthode ELISA (R & D Systems
Minneapolis, D2050) décrite précédemment. LIFNy est dosé par la méthode d'inhibition de l'effet cytopathique du virus VSV (Vesicular Stomatitis Virus souche Indiana, ATCC VR 158) sur la lignée de cellules épithéliales de reins de chien MDCK (Steward II, in The Interferon System, pp 17-19, Springer-Verlag,
NY ; Familletti et al., 1981, Methods Enzymology 78, 387). Brièvement, 3x104 cellules MDCK/puit sont mises en culture dans une plaque de microtitration à 96 puits puis on ajoute des dilutions en série des surnageants obtenus des clones résistants à la puromycine et au G418. Par la suite, les cellules sont exposées à 103 cfu (pour colony forming unit en anglais) de virus VSV et on détermine la cytopathie 24 h plus tard. L'IFNy rend les cellules résistantes à l'infection VSV.

Les résultats sont données en unités arbitraires qui correspondent à l'inverse de la dilution pour laquelle on obtient 50 % de protection. Les cellules contrôles montrent une cytopathie supérieure à 90 %.

Enfin, la production de particules rétrovirales par ces clones est évaluée par infection de 1 à 2x 105 cellules 3T3 permissives. Après 24 h de culture, elles sont exposées pendant 90 min à 200 pI de dilutions de 10 en 10 de surnageant cellulaire à tester et 200 Cll de milieu contenant 16 g/ml de polybrène (Sigma). La culture est poursuivie dans un milieu tout d'abord classique puis sélectif (5 mg/ml de
G418) 24 h après l'infection. Les colonies résistantes après deux semaines sont colorées au crystal violet (0,05 % dans un mélange éthanol 10 % eau 90 %). Le nombre de particules rétrovirales présentes dans le surnageant des clones producteurs peut être calculé à partir du nombre de colonies 3T3 résistantes au
G418. On sélectionne le clone désigné ci-après E17-TG5324 & TG9326 &num;28 qui produit 1 llg/ml/106 cellules/24h dhIL-2, 32 U/ml d"IFNy et 4,5x106 cfu/ml de particules virales.

EXEMPLE 7: : Construction d'une lignée d'encapsidation secretant l'htL-2 et
produisant le vecteur rétoviral pTG9337.

Les cellules E17-5324 sont transfectées par 20 g de plasmide pTG9337 et on sélectionne les clones résistants en milieu G418 (1 mg/ml). Après sous-clonage, on évalue les clones les plus producteurs en terme de sécrétion d'hIL-2, d"IFNy murin et de titre en particules virales. Les méthodes mises en oeuvre sont décrites à l'exemple précédent à l'exception de la technique de dosage de 11FNy murin qui est quantifié par test ELISA (PerSeptive Diagnostics, Cambridge, MA, N 8-6716).

Le clone retenu E17-TG5324 & TG9337 #33 produit 1 Fug/ml/106 cellules/24h d'hLL-2, 60 ng/ml/106 cellules/24h d'IFNy et présente un titre viral de 1,3x106 cfu/ml.

EXEMPLE 8: Transductlon de cellules cibles
On vérifie que les particules virales produites à partir des lignées productrices E17
TG5324 & TG9326 et E17-TG5324 & TG9337 sont capables de transduire des cellules cibles et que l'expression des gènes thérapeutiques n'est pas altérée dans le contexte cellulaire. Cette étude est menée sur une lignée murine établie (cellules 3T3) et sur deux lignées primaires (cellules P3D6M et P3D4M). Ces dernières sont dérivées de mélanomes de chien et soumises à un passage en souris SCID immunodéficientes afin de générer des lignées primaires homogènes. 2x107 cellules au stade passage 5, sont injectées par voie sous-cutanée dans les animaux. Les tumeurs sont prélevées 3 semaines plus tard et les cellules de mélanome sont maintenues en culture dans les conditions classiques.

Les cellules cibles sont mises en culture à raison de I à 2x105 cellules par puit et, le jour suivant, infectées par 0,5 ml de surnageant de culture des cellules productrices préalablement filtré à travers une membrane de 0,45 llm. On laisse l'infection se poursuivre pendant I à 2 h puis les cellules sont remises dans du milieu frais. Habituellement, on effectue deux cycles de transduction dans la même journée et les cellules transduites sont cultivées en présence de G4 18 (5 mg/ml).

Le milieu est changé tous les trois jours jusqu'à l'apparition de colonies résistantes dont on évalue leur sensibilité au ganciclovir. Les essais mettent en oeuvre 5x106 cellules qui sont placées le jour suivant leur mise en culture, en présence de ganciclovir à des concentrations comprises entre 0 et 1000 pM. La viabilité des cellules est déterminée après une semaine par le test au bleu de trypane. Le nombre de cellules dénombré dans les puits dans lesquels la culture a été effectuée en absence de ganciclovir représente le 100 %. Les résultats indiquent que les trois types de cellules cibles transduites par les particules issues des vecteurs rétoviraux pTG9326 et pTG9337 ainsi que les lignées productrices correspondantes sont sensibles au ganciclovir. En d'autres termes, leur viabilité est affectée en présence de doses faibles de ganciclovir (LD50 c'est à dire la concentration de ganciclovir pour laquelle on obtient 50 % de viabilité, inférieure à 0,1 ,uM) alors que les cellules non transduites résistent à des concentrations beaucoup plus élevées (il50 au delà de 10 pM). Ces résultats montrent que le niveau d'expression du gène tk dans les cellules tumorales transduites est suffisamment élevé pour les rendre sensibles à des doses de gancoclovir non toxiques pour les cellules normales.

EXEMPLE 9: Effet de voisinage.

On vérifie la capacité des particules virales de vecteur pTG9344 à induire un effet cytotoxique de voisinage dans les cellules transduites. Dans un premier temps, les cellules primaires P3D6M sont transduites par les particules virales pTG9344 et les cellules infectées sont sélectionnées en présence de G418 (1 mg/ml). Puis, on réalise une co culture contenant des cellules P3D6M non transduites et un certain pourcentage de la culture transduite (respectivement 0, 10, 30, 50, 80 et 100 %).

La co-culture est maintenue 7 jours en présence de Ganciclovir (1 llM) et la viabilité des cellules est estimée par coloration au bleu de trypane. On indique que cette concentration est choisie de manière à être toxique pour les cellules transduites qui expriment la thymidine kinase (3 % de cellules survivantes pour ressai 100 %) alors qu'elle n'affecte pas ou peu la viabilité des cellules n'exprimant pas le gène suicide (86 % de cellules survivantes pour l'essai 0 %). Pour ce qui est des essais de culture, le ganciclovir exerce un effet toxique notable même à un faible pourcentage de cellules transduites. Une réduction drastique de la viabilité est dà observée lorsque le mélange cellulaire ne contient que 10 % de cellules transduites (18 % de cellules survivantes pour l'essai 10 % et 5 % pour l'essai 30%). Ces résultats indiquent que le vecteur pTG9344 exprime une quantité suffisante de TK pour induire la cytotoxicité de la cellule infectée et propager cet effet aux cellules non transduites avoisinantes.

EXEMPLE 10 : induction de l'expression des antigènes MHC de classe I et II
dans les cellules transduites.

Cette étude est destinée à vérifier la fonctionnalité des gènes IFNy portés par les vecteurs pTG9326 et pTG9337. Un des effets biologiques de l'IFNy est d'induire l'expression des antigènes MHC de classe I et II.

Les cellules P8 15 (mastocytome murin) et B16 (mélanome murin) sont transduites par le vecteur pTG9344 (tk-leo) à titre de témoin négatif ou pTG9337 (IFNy murin tkeo) et on détermine la présence d'antigènes de classe I et H à la surface des cellules infectées par les techniques classiques d'immunofluorescence et de cytométrie de flux (FACS). Les antigènes MHC de classe H présents à la surface des cellules P8 15 et B16 sont mis en évidence par un anticorps anti-souris couplé au FITC (pour Fluorescein isothiocyanate) (Pharmingène, San Diego, CA). Pour la détection des antigènes de classe I, on utilise un anticorps anti-H2kb (Pharmingen) pour les cellules B16 et anti-H2kd (Pharmingen) pour les cellules
P815.

Après l'infection et maintien en milieu sélectif ( G4 18 5 mg/ml) pendant environ deux semaines, les cellules sont détachées par action de 10 mM d'EDTA dans un tampon phosphate salin (PBS) et lavées à deux reprises dans la tampon suivant (PBS, 1 % de sérum albumine bovine, 0,1 % de gammaglobuline humaine, 10 mM d'EDTA et 0,02 % d'azide de sodium). 1xi06 cellules sont incubées pendant 45 min, à 4 C et à l'obscurité en présence de 200 1ll d'une dilution au 1:50 de chacun des anticorps cités ci-dessus ou à titre de témoin négatif en absence d'anticorps ou en présence d'un anticorps non spécifique (anti-CD8 de souris). Après lavage, les cellules sont fixées (formaldéhyde 2 % dans du tampon PBS) et analysees par
FACS (cytomètre Becton Dickinson, San Jose, CA).

Les résultats indiquent que l'expression des antigènes MHC de classe I à la surface des cellules murines cancéreuses B16 et P815 (80 % pour les cellules P815 et 95 % pour les cellules B16) est fortement induite par le transfert du vecteur pTG9337 montrant que ce dernier exprime un IFNy fonctionnel. En revanche, les cellules Pus15 et B16 transduites par le vecteur pTG9344 ne présentent aucune fluorescence (0 %). De plus, l'intensité de fluorescence des cellules transduites exprimant 1IFNy est environ 30 à 40 fois supérieure à celle obtenue avec les cellules non traitées.

Ainsi, le grand nombre de cellules positives pour les antigènes de classe I et l'intensité de l'expression à la surface de ces cellules dus à l'expression de llFNy devraient contribuer à une meilleure reconnaissance des cellules effectrices immunes en vue d'éliminer les cellules cancéreuses. L'expression des MHC de classe II est faiblement induite.

Une expérience similaire est entreprise sur les cellules primaires canines P3D6M infectées par le vecteur pTG9326 (IFNy canin-tk-neo) ou, à titre de témoins négatifs, pTG9344 (pas d'expression d'IFNy) et pTG9337 (expression de llFNy murin). Les antigènes MMC de classe I et II sont respectivement mis en evidence par les anticorps monoclonaux H58A reconnaissant les molécules anti-H2kk et
TH14B dirigé contre l'equivalent allélique DR de plusieurs espèces dont le chien (VRMD Inc, Pullman, WA) (Davis et al., 1987, Vet. Immunol. Immunopathol. 15, 337-376). L'immunocoloration est réalisée comme décrit ci-avant à la différence qu'aprés rincubation avec la solution d'anticorps, les cellules sont mises en présence de 200 pI de tampon de lavage contenant une dilution au 1:256 d'un anticorps de lapin anti-immunoglobuline G de souris conjugué au FITC. Après 45 min de contact à 4 C et dans l'obscurité, les cellules sont lavées, fixées et la présence des antigènes de classe I et II évaluée par FACS.

Les résultats indiquent que l'expression des antigènes MMC de classe I et II est fortement induite à la surface de plus de 95 % des cellules primaires cancéreuses
P3D6M transduites par le vecteur pTG9326. L'intensité de fluorescence des cellules transduites exprimant l'WNy est environ 25 fois supérieure pour les MHC
I et 300 fois supérieure pour les MMC II à celle obtenue avec les cellules non traitées. Aucune induction ne se produit dans les cellules P3D6M transduites par les vecteurs pTG9344 et pTG9337.

EXEMPLE 11 : Evaluation in vivo
Les cellules murines B16 sont transduites par les vecteurs pTG9344 et pTG9337 ou à titre de contrôle négatifpar un vecteur rétroviral exprimant le gène marqueur
LacZ codant pour la p-galactosidase (pTG5391). Les cellules infectées sont sélectionnées en présence de G418 pendant 14 jours, trypsinées et resuspendues à une densité de 2x107 cellules/ml dans du tampon PBS. 100 1ll de cette suspension sont injectés de manière sous-cutanée à des souris immunocompétentes B6/D2 génération F1. Deuxjours après et ceci pendant les 6 jours qui suivent, les animaux reçoivent une injection intrapéritonéale de ganciclovir (100 mglkgfjour) et on examine le nombre de tumeurs et leur taille jusqu'à 44 jours après l'implantation.

A titre de témoins, on utilise des souris traitées en parallèle par des cellules non transduites et des souris dans lesquelles ont été implantées des cellules transduites mais qui ne sont pas traitées par le ganciclovir (GC). Comme résumé dans le tableau suivant, au total 5 groupes de 10 animaux ont été constitués.

<tb>

groupe <SEP> lignée <SEP> cellulaire <SEP> traitement <SEP> nombre <SEP> de <SEP> souris <SEP> sans <SEP> tumeur
<tb> <SEP> injectée <SEP> Ganciclovir <SEP> jour <SEP> 21 <SEP> | <SEP> jour <SEP> 30 <SEP> jour <SEP> 34 <SEP> jour <SEP> 44
<tb> <SEP> 1 <SEP> B16 <SEP> +GC <SEP> o <SEP> ~a <SEP> a <SEP> -. <SEP>
<tb>

<SEP> 2 <SEP> B1STG5391 <SEP> (beta <SEP> +GC <SEP> O <SEP> a <SEP> a <SEP> a
<tb> <SEP> Gai)
<tb> <SEP> 3 <SEP> B16-TG9344(TK- <SEP> +GC <SEP> 10 <SEP> 3 <SEP> i <SEP> <SEP>
<tb> <SEP> Noe) <SEP>
<tb> <SEP> 4 <SEP> B16-TG9337 <SEP> +GC <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 9 <SEP> 9
<tb> <SEP> (IFN@@@@-TK-Neo) <SEP>
<tb> <SEP> 5 <SEP> B16-TG9337 <SEP> -GC <SEP> O <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> <SEP> (IFN@@@-TK-Neo) <SEP>
<tb> "souns mortes ou sacrifiées en raison de la taille importante des tumeurs.

La comparaison des groupes 4 et 5 tous deux résultant de l'implantation de cellules transduites par le vecteur pTG9337 mais traités ou non par le ganciclovir, montre clairement l'effet de ce dernier sur le dévelopement des tumeurs. Par ailleurs, les souris dans lesquelles ont été implantées les cellules transduites par un vecteur exprimant des gènes thérapeutiques (pTG9344 et pTG9337) ne développent pas de tumeurs avant le 25ièmejour (groupes 3 et 4) alors que les animaux n'ayant reçu aucun vecteur (groupe 1) ou un vecteur non thérapeutique (groupe 2) sont décimés bien avant le 2iième jour. De plus, l'avantage de combiner l'action de plusieurs gènes thérapeutiques ressort clairement de cette analyse. En effet, l'expression du gène tk seul ralentit le développement tumoral (groupe 3) alors que la grande majorité (9/10) des animaux ayant reçu les cellules B16-9337 (expression concomittante des gènes tk et IFNy) ne présentent aucune tumeur plus de 44 jours post-implantation. Ces données indiquent que la combinaison de l'effet immunostimulateur de l'IFNy et des effets cytotoxiques de la thymidine kinase et du ganciclovir réduit d'une manière drastique la fréquence des tumeurs.

LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: Transgene S.A.

(B) RUE: 11 rue de Molsheim
(C) VILLE: Strasbourg
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 67082
(G) TELEPHONE: (33) 88 27 91 00
(H) TELECOPIE: (33) 88 27 91 11
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Nouvelles compositions antitumorales
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 13
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 26 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: olgonucleotide de synthese oTG4322
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GGAGATGGGG GAGGCTAACT GAAACT 26 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG4323
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
CTAGAGTTTC AGTTAGCCTC CCCCATCTCC 30 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 22 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG4031
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
NGATGCTCTC CGGCCYTCGA AA 22 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG4169
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
AAGAATTCTT RGAHATTTKG ARGAAYTGG 29 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG4170
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
AAGAATTCRT GCAYCACTYK GATGAGYTC 29 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 26 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG4321
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
ACCTGCAGAT CGTTCACAGG AATTTG 26 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 32 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG4319
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: TGGAATTCTC TACTTGAAAC TGTTTGACAA CT 32 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 22 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG6727
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
CTTCGGCCGA ATTCTCTGAA AC 22
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG6788
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
TCAAATATTG AATTCAGGAT GACC 24
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 22 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG7295
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: CTGCGGCCGA ATTCTGAGAC AA 22 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG7296
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
CTTATTGGGA GAATTCCTTC C 21 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG6147
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: TCGGAAACGA TGAAATATAC A 21 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG4983
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUEN

Claims (17)

Revendications

1. Composition antitumorale comprenant une population de cellules permettant

l'expression d'au moins trois gènes thérapeutiques antitumoraux.

2. Composition antitumorale selon la revendication 1, caractérisée en ce que les

gènes thérapeutiques codent pour des polypeptides immunostimulateurs et/ou

cytotoxiques.

3. Composition antitumorale selon la revendication 2, caractérisée en ce que le

polypeptide immunostimulateur est sélectionné parmi le groupe constitué par

l'interleukine (ILf2,11L4,11L-6,11L-10,11L-12, les facteurs de stimulation des

colonies (CSF) de type granulocyte (G-CSF), de type granulocyte macrophage

(GMSF), l'interféron alpha, l'interféron gamma, les facteurs de costimulation

et, notamment, les polypeptides B7.1 et B7.2 et les facteurs activant l'expression

des antigènes d'histocompatibilité de classe II.

4. Composition antitumorale selon la revendication 2, caractérisée en ce que le

polypeptide cytotoxique est sélectionné parmi le groupe constitué par parmi une

thymidine kinase et, notamment la thymidine kinase (TK) du virus Herpes

Simplex de type I (HSV-1), la cytosine déaminase, le cytochrome P450 2B1, la

purine nucléoside phosphorylase d'E. coli, la nitroréductase et la ss-

glucoronidase.

5. Composition antitumorale selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisée en

ce que ladite population de cellules permet l'expression des gènes codant pour

les polypeptides TK-HSV1, IL-2 et IFN gamma.

6. Composition antitumorale selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en

ce que ladite population de cellules est une lignée d'encapsidation rétrovirale

permettant la production de particules infectieuses comprenant un vecteur

rétroviral.

7. Composition antitumorale selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite

population de cellules est d'origine humaine.

8. Composition antumorale selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite

population de cellules dérive de la lignée 293.

9. Composition antitumorale selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisée en

ce que ladite population de cellules comprend les gènes gag/pol du virus

FMuLV (Friend Murine Leukemia Virus) de la souche FB29 et le gène errv du

virus amphotropique 4070A.

10. Composition antitumorale selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisée en

ce que ladite population de cellules comprend un vecteur permettant l'expression

d'un gène codant pour l'IL-2 et permet la production de particules infectieuses

comprenant un vecteur rétroviral permettant l'expression d'un gène codant pour

la thymidine kinase du virus HSV- 1 et d'un gène codant pour l'interféron gamma.

élimination.

ce que ladite population de cellules est sensible à une drogue permettant son

11. Composition antitumorale selon l'une des revendications I à 10, caractérisée en

12. Composition antitumorale selon la revendication 11, caractérisée en ce que ladite

drogue est un dérivé de l'acyclovir et, notamment, le ganciclovir.

13. Composition antitumorale selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en

ce que ladite population de cellules permet en outre l'expression d'un marqueur

de sélection positive.

14. Cellule d'encapsidation dérivée de la lignée 293 et comprenant: - les gènes gag pol du virus FMuLV (Friend Murine Leukemia Virus) de la

souche FB29 et le gène e:l du virus amphotropique 4070A, et - un vecteur permettant l'expression d'un gène codant pour l'lL-2.

15. Vecteur rétroviral caractérisé en ce qu'il comprend de 5' vers 3':

- un LTR 5',

- une région d'encapsidation,

- un gène codant pour l'interféron gamma,

- un promoteur interne constitutif,

- un gène codant pour la thymidine kinase du virus HSV-I,

- un site interne d'entrée des ribosomes (IRES),

- un gène codant pour un marqueur de sélection positive, et -un LTR 3'.

16. Utilisation d'une composition antitumorale selon l'une des revendications I à 13.

homme ou un animal.

traitement ou à la prévention du cancer ou d'une affection cancéreuse chez un

selon la revendication 15, pour la fabrication d'un médicament destiné au

d'une cellule d'encapsidation selon la revendication 14 ou d'un vecteur rétroviral

17. Utilisation selon la revendication 16, selon laquelle ladite composition

antitumorale est destinée à etre administrée par voie intratumorale.