CA2250332A1 - Compositions cellulaires antitumorales exprimant au moins trois transgenes - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une nouvelle composition antitumorale comprenant une population de cellules capables d'exprimer au moins trois gènes thérapeutiques et notamment des gènes immuno-stimulateurs et/ou cytotoxiques. Elle a également pour objet une cellule d'encapsidation exprimant l'interleukine-2 et un vecteur rétroviral exprimant les gènes interféron gamma et thymidine kinase du virus de l'herpès HSV-1 ainsi que leur utilisation thérapeutique pour la prévention et le traitement des cancers.

Description

CA 022~0332 1998-09-23 wo 97/3s99s PCTAFRg7/00521 COMPOSITIONS CELLULAIRES ANTITUMORALES EXPRIMANT AU MOINS TROIS TRANSGENES

La présente invention a pour objet une composition cellulaire pour le traitement ou 15 la prévention de tumeurs chez l'homme ou l'animal. Plus particulièrement, elle comprend une population de cellules capables d'exprimer une combinaison d'au moins trois gènes thérapeutiques à effet antitumoral. L'invention concerne egalement l'utilisalion thérapeutique d'une telle composition dans le domaine de la cancérologie.
~0 Depuis une dizaine d'années, de nombreuses publications font état de la possibilité
d'éliminer les tumeurs ou, à defaut retarder leur progression, par la technique du transfert de gène. Les nombreux essais cliniques mis en piace confirment l'intéret grandissant de la thérapie génique du cancer. La majorité des protocoles emploie25 des vecteurs rétroviraux du fait de leur capacité d'intégration dans les cellules en division, pour transferer un gène a visée antitumorale. Ces derniers ainsi gue les lignées d'encapsidation permettant de les produire sont decrits dans de nombreu~documents de l'état de la technique.

30 Plusieurs approches ont eté considérées, notamment le transfert de gènes immunostimulateurs (immunotherapie) susceptibles d'induire ou activer une CA 022~0332 1998-09-23 WO 97/35995 PCT/F1~97/00521 réponse cellulaire immune à l'égard de la tumeur, de gènes cytoto:;iques conférant une toxicité aux cellules les exprimant et d'anti-oncogènes (gènes suppresseurs de tumeurs ou capables d'inhiber l'activité d'un oncogène). Ces differentes approches sont résumées dans l'état de la techni(lue (voir par exemple Moolten, 1994, Cancer Gene Therapy 1, 279-2S7; Anderson, 1994, Human Gene Therapy ~, 1-2, Vile et Russel, 1994, Gene Therapy 1, 88-g9; Culver et Blaese, 1994, Trends in Genetics 10, 174-178, Zier et al., 1996, Immunology Today, 17, 39-45).

L'immunothérapie est fondée sur le transfert de gènes codant pour les cytokines et molécules co-stimulatrices dans le but de rendre les cellules tumorales plus immunogènes et renforcer la réponse immunitaire antitumorale de l'hôte. Les cytokines ainsi évaluées dans des modèles murins et, pour lesquelles une propriété
antitumorale a été mise en évidence, sont l'interleukine (IL) 2, l'~L-4, l'L-6, 1'L-7, l'L-12, le facteur nécrosant des tumeurs (TNF) de type alpha, le GM-CSF (pour Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) et les interférons (IFN). Des cellules xénogéniques produisant l'L-2 ont ainsi démontré un effet antitumoral (voir la demande européenne EP 0 579 791).

L'approche cytotoxique consiste à accroître spécifiquement la sensibilité des cellules tumorales à une chimiotherapie par transfert d'un gène dit suicide dont le produit est capable de transfortner un précurseur inactif en produit hautement cytotoxique. Le plus employé à ce jour est le gène tk du virus Herpes Simple~c de type 1 (HSV-I) codant pour l'enzyme thymidine kinase (TK) qui a la propriété de convertir l'acyclovir et le ganciclovir en analogues phosphorylés de nucléosides.
Ces nucléotides aberrants sont alors incorporés durant la division cellulaire dans les chaînes d'ADN chromosomiques néoformées, ce qui a pour conséquence une inhibition de la replication genétique et une mort des cellules tumorales en division (Moolten, 1986, Cancer Res. i~6, 5276-5281). Un avantage supplémentaire de cetteapproche est conféré par l'effet de voisinage ( by stander en anglais) qui résu!te d'une propagation des propriétés cytotoxiques aux cellules avoisinantes causant leur destruction (Freeman et al., 1993, Cancer Res. 5~, 5274-52~3). Ainsi, des CA 022~0332 1998-09-23 W O 97/35995 P~ hS7/00521 rétrovirus portant le gène Ik ont été utilisés dans le cadre du traitement de tumeurs cérébrales malignes dans le but de déclencher le suicide cellulaire après administration de ganciclovir (Izquierdo et al., 1996, Gene Therapy ~, 49 ~ -495) Dans la même optique, la demande WO 95/06486 propose l'injection de 5 fibroblastes murins produisant un vecteur rétroviral exprimant le gène cytotoxique.

Enfin, la stratégie anti-oncogène repose sur l'introduction dans ies cellules tumorales d'une copie fonctioMelle d'un gène suppresseur de tumeur (par exemple le gène associé au rétinoblastome ou p53) ou l'inhibition de l'expression des 10 oncogenes par le transfert de gènes codant pour des polynucléotides antisens ou des ribozymes capables de dégrader les ARN messagers des onco~ènes dans le but de reduire ou abolir la prolifération des cellules cancéreuses.

Certains protocoles expérimentaux anticancéreux récents proposent de combiner 15 plusieurs gènes therapeutiques pour obtenir un effet antitumoral synergique (voir par exemple la demande PCTIFR94/00192, Rosenthal et al., 3994, Blood S3, 12~9-1'79~, O'Malley et al., 1996, Cancer Res. ~6, ~737-1741 ~ Lollini et al.~
1995, Human Gene Therapy 6, 743-752). Cependant, vu leur grand nombre et leur diversilé, I'ensemble de ces etudes ne permet pas aujourd'hui de clairement ~0 identifier la rtlolécule ou la combinaison de molécules la mieux adaptée au traitement d'une tumeur donnée.

On a maintenant mis en évidence une composition antitumorale basée sur des cellules génétiquement modifiées pour sécréter de 1'IL-2 et produire des particules 5 rétrovirales exprimant les gènes fk du virus HSV- I et ~FN y . Une telle composition permet d'inhiber ou retarder la prolifération cellulaire en induisant la mort specifique des cellules tumorales, une meilleure présentation des antigènes et une stimulation des cellules immunes de l'hote. La présente invention offre une alternative efficace aux techni~ues de l'art antérieur pour traiter le cancer chez ,0 I'homme ou l'animal.

CA 022',0332 1998-09-23 C'est pourquoi la presente invention a pour obJet une composition antitumorale comprenant une population de cellules permettant l'expression d'au moins trois ~ènes thérapeutiques antitumoraux Par "gènes thérapeutigues antitumoraux", on entend des gènes dont les produits d'expression ont un effet antitumoral, notamment pour accroître l'immunite diriaée specifiquement contre la tumeur et/ou inhiber au moins partiellement la divisioncellulaire. De préférence, il s'agit de gènes codant pour des polypeptides immunostimulateurs de la réponse immunitaire et/ou cytotoxiques. Par 10 "immunostimulateur", on entend tout polypeptide capable d'amplifler la production d'anticorps dirigés contre les cellules et antigènes tumoraux ou de stimuler une réponse immunitaire à médiation cellulaire, en activant les Iymphocytes T, afin de déclencher une réponse cytotoxique ou de type hypersensitivité retardée significative à l'encontre des cellules tumorales. Par15 "cytotoxique", on entend tout polypeptide capable d'induire une mort cellulaire soit directement soit indirec~ement par l'intermédiaire d'une drogue susceptibled'être administrée de manière indépendante.

Parmi les genes immunostimulateurs utilisables dans le cadre de la présente ~0 invention, on peut envisager les gènes codant pour les cytokines et notamment les interleukines (L), les facteurs de stimulation des colonies (G-CSF, M-CSF et GM-CSF), les interférons (~), les facteurs de nécrose des tumeurs (TNF), les facteurs de co-stimulation tels que les polypeptides B7. 1 et B7.~ et les facteurs activant l'expression des antigènes d'histocompatibilité de classe II.
~5 A l'heure actuelle, 16 interleukines ont é dentifiées. ll est particulièrement difficile de leur attribuer une fonction spe~ dque car elles exercent des effetsplélotropes. Dans le cadre de la présente invention, toutes les interleukines présentent un intérêt, mais on cite plus particulièrement l'IL-~, l'IL-4, l'IL-6, l'IL-30 10, l'IL-l~. Dans ce contexte, l'IL-2 est particulièremen~ préférée. Elle est CA 022~0332 1998-09-23 W 097/3599S PCTA~R97/00521 responsable de la prolitération des Iymphocvtes T aceivés, et, en associa~ion avec l'lFNy, stimule les macrophages, les cellules tueuses naturelles NK (pour Natural ~Ciller en anglais) et les cellules T. De plus, certaines études tendent à
montrer qu'elle a un role chimiotactique pour les Iymphocytes lorsqu'elle est 5 produite au niveau d'une tumeur.

Les interferons possèdent des proprietés antivirales et immunomodulatrices Ils peuvent activer les cellules pha~ocytaires et accroître l'expression des anti~ènes de surface de classe I et II du complexe maieur d'histocompatibilité ~CMH) et stimuler 10 également la cytoto~icité des cellules NK et celles activées par les Iymphokines (LA~C pour Lymphokine Activated Killer en anglais) à l'encontre des cellules tumorales. Bien que les trois classes principales d'lFNs, respectivement cx, ~ et y, présentent un intérêt dans le cadre de la présente invention, on préférera tout particulièrement l'lFN~.
Les facteurs stimulant les colonies interviennent au niveau de la maturation descellules souches hématopoïéliques et leur différentiation en cellules matures dela circulation sanguine. On distingue les GM-CSF, G-CSF et M-CSF (pour Granulocyle-Macrophage, Granulocyte et Macrophage respectivement) selon le 20 stade de maturalion et le type cellulaire sur lequel ces facteurs exercent leur influence .

Pour ce qui est des fac~eurs nécrosant des tumeurs, on distingue le TNF~
produit par les macrophages et le TNF~ produit par les Iymphocytes T. Tous 25 deux sont responsables de l'activité cytotoxique anti-tumorale des macrophages et Iymphocytes et de l'altération tissulaire locale observée dans la réaction inflammatoire.

Parmi les (~ènes cytotoxiques, on peut citer ceux codant pour une thymidine kinase ~0 et, notamrnent la thymidine kinase (TK) du virus Herpes Simplex de type I (HSV-CA 022~0332 1998-09-23 Wo 97/3s995 PCT/FR97tO0521 I ), la cytosine déaminase, le cytochrome P450 2B I, la purine nucléoside phosphorylase codée par le ~ène DeoD d'l~ coli, ia nitroréductase et la ~ -,lucoronidase D'une manière aénérale, ces gènes toxiques sont décrils d~ns la literature (voir par exemple Moollen, 1994, Cancer Gene Therapy l, ~79-~87) Selon un mode de réalisation préféré, les trois gènes thérapeutiques mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention codent pour les polypeptides TK-~ISV1, IL-

2 et IFNy. L'origine des gènes immunostimulateurs est choisie de manière à ce qu'ils soient fonctionnels dans l'hôte à qui la composition antitumorale selon 10 l'invention est destinée S'agissant d'un hôte humain, on retiendra de prét'erence les séquences codante pour l'L-2 et l'IFNy humains.

Les gènes thérapeutiques peuvent être obtenus par clonage, par PCR ou par synthèse chimique selon les techniques convenlionnelles communément en 15 usage. Il peut s'agir de gènes natifs ou dérivés de ces derniers par mutation, délétion, substitution etlou addition d'un ou plusieurs nucléotides. Bien entendu, ils peuvent comprendre les éléments appropriés de régulation de la transcriptionainsi que des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction permettantleur expression. D'une façon générale, on aura recours à une région promolrice ~O fonctionnelle dans les cellules de l'hôte que l'on veut traiter, de préférence dans les cellules humaines. Il peut s'agir de la région promotrice gouvernant naturellement l'expression dudit gène ou d'une région promotrice d'origine différente, par exemple issue de gènes eucaryotes ou viraux. D'autre part, la région promotrice peut être modifiée de manière à contenir des séquences ~5 réguiatrices, par exemple un élément activateur de la transcription (enhancer).

La région promotrice retenue pourra être constitutive ou régulable, et dans ce dernier cas, en réponse à certains signaux cellulaires. ll sera avantageux d'utiliser une région promotrice tissu-spécifique, lorsque la tumeur à ~raiter est ~O issue d'un type cellulaire particulier. D'une manière alternative, l'utilisalion CA 022~0332 1998-09-23 W O 97/3599S PCT~FR97/00521 d'un promoteur répondant à des signaux spécifiquement tumoraux (par exemple répondant à des facteurs surexprimés par les cellules tumorales) peut s'avérer avan~ageuse puisque l'expression sera limitée aux cellules tumorales.

5 De tels promoteurs sont généralement connus de l'homme de l'art. On peut citerrlotammel1t les promoteurs SV40 (Virus Simian 40), PCK (Adra et al., 1987, Gene 60, 6S-74), HMG (Hydroxy-Methyl-Glutaryl-coenzyme A), TK
tThymidine Kinase), les LTRs (Long Terminal Repeat) du RSV (Rous Sarcoma Virus), du Mo-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) et les promoteurs des 10 gènes codant pour les antigènes MHC de classe I qui sont activés par l'l~Ny.
Ces exemples ne sont pas limitatifs.

Dans le cadre de la présente inven~ion, les gènes thérapeutiques peuvent être placés sous le contrôle d'éléments permettant leur expression de façon 1 S indépendante ou commune. En d'autres termes, ils peuvent être exprimés d'unemanière monocistronique ou polycistronique. Dans ce dernier cas, on mettra en oeuvre un élément permettant la réinitiation de la traduclion au niveau du second cistron, par exemple un site interne d'entrée des ribosomes (IRES) bien connu de l'homme de 1'art. A ce jour, Ull certain nombre d'lRES ont élé identifiés ~0 dans la région 5' des ARNm viraux et, notamment, des picornavirus tels que levirus de la pol iom yél ite ( Pel letier et al . , 1 98~ , Mol . Cel l . Biol . 8, 11 03- 111 ~ ) et l'EMCV (Encephalomyocarditis virus; ~ang et al., 1988, J. Virol. 6~, 2636-2643). Il est également possi~le d'employer les IRES décrits dans la demande internationale WO 96/01324.
Par ailleurs. il peut être avantageux que les polypeptides immunostimulateurs soient sécrétes à l'extérieur des cellules composanl la composition antitumorale~ selon l'inventiom Dans ce contexte, les gènes correspondants peuvent égalemen[
inclure une séquence signal. Il peut s'agir de la séquence signal naturelle ou bien 30 d'une séquence hétérologue du moment qu'elle soit fonctionnelle dans ia cellule CA 022~0332 1998-09-23 Wo 97/35995 PCT/FRg7/0052 hôte.

Bien entendu, ladite populalion de cellules peut dériver d'une cellule primaire ou lumorale, d'une lignée cellulaire, d'un organe ou peut comprendre un 5 mélange de cellules permettant l'expression des divers gènes thérapeutiques.
Pour illustrer ce mode de réa~isation, on peut avoir recours à un mélange de cellules, par exemple dérivées de la lignée Véro (disponible à l'ATCC), une partie exprimant l'IL2 et une autre partie exprimant l'IFNy, éventuellement combiné à une lignée d'encapsidation rétrovirale permettant la production de 10 virions ou à une population de virus exprimant le gène cytotoxique TK. Bien entendu, d'autres combinaisons peuvent également être envisagées. Par exemple, il est également possible de mettre en oeuvre un mélange cellulaire comprenant une lignée (par exemple Véro) permettant l'expression du gène IL2 et une lignée d'encapsidation rétrovirale permettant la production de particules15 infectieuses comprenant un vecteur rétroviral selon l'invention tel que défini ci-après.

Selon un mode de réalisation particulierement avantageux, la population cellulaire composant la composition antitumorale selon l'invention comprend ou est 20 constituée de cellules d'encapsidation rétrovirale permettant la production de particules infectieuses conlp-ellan~ un vecteur rétroviral. Generalement et pour des raisons de sécurité, le vecteur rétroviral est défectif par délétion ou mutation des gènes viraux gag, pol et e~v et ne peut, de ce fait, se repliquer de manière autonome. Sa propagation nécessite l'apport des polypeptides viraux pour lesquels 25 il est déficient Une cellule d'encapsidation est capable de fournir e~l lJa~2s l'ensemble des polypeptides que le vecteur rétroviral ne peut synthétiser et qui sont nécessaires à la constitution des particules infectieuses. De préférence, les cellules d'encapsidation en usage dans la présente invention sont dérivées d'une lignée d'origine humaine et, notamment, de la lignée 293 Celle-ci peut être générée par30 transfection de vecteurs pannettant l'expression des gènes gag/pol du virus FMuLV

, . . .

CA 022~0332 1998-09-23 W O 9713599S PCT~FRg7/00521 (Friend Murine Leukemia Virus) de la souche FB29 et le gène env du virus ~ amphotropique 4070A. A titre d'exemple, on peut citer la lignée E 17 décrite dans la demande internationale PCTtIB96/00439 dont le contenu est incorpore par ré~ërence .
-Une composition antitumorale préférée selon l'invention comprend une populationde cellules comportant un vecteur permettant l'expression d'un gène codant pour l'IL-2 et permettant la production de particules infectieuses ayant incorporé unvecteur rétroviral exprimant un gène codant pour la thymidine kinase du virus 10 HSV-l et un gène codant pour l'IFNy.

Selon un mode de réaiisation avantageux, la population de cellules en usage dansle cadre de la présente invention est sensible à une drogue permettant son elimination. Dans le cas où elle exprime le gène tk du HSV-I, on peut envisager I 5 d'employer une drogue dérivée de l'acyclovir et, notamment, le ganciclovir. La population de cellules peut en outre exprimer un marqueur de sélection positive,par exemple un gene de résistance à un antibiotique facilitant sa sélection. On peut citer les gènes ~eo (néomycine) conférant une résistance a l'antibiotique G4 I S, c~ fi-(dihydrofolate réductase), paC (puroacetyl transferase) (Morgenstern et Land, ~0 1990, Nucleic Acids Res. lS, 3587-3596), hygromycine B et g~r)f (xanthine phosphoribosyl) .

La présente invention concerne également une cellule d'encapsidation dérivée de la lignée 293 et comprenant:
~5 - les gènes gag/pol du virus FMuLV (Friend Murine Leukemia virus) de la souche FB29 et le gène env du virus amphotropique 4~)70A, et - un vecteur permettant l'expression d'un gène codant pour l'IL-2 Un vecteur approprié peut etre constitué par le vecteur pTG5324 décrit ci-après 30 dans lequel l'expression de 1'IL-2 est dirigée par le promoteur précoce du virus CMV (Cytome~,alovirus) Mais, bien entendu. d'autres vecteurS d'expression CA 022~0332 1998-09-23 wO 97/35g95 PCT/FRg7/00521 - _ - 10 --peuvent etre employés.

La presente invention a é~alement pour objet un vecteur rétroviral carac~érise en ce qu'il comprend de 5' vers 3':
5 - unLTR5', - une région d'encapsidation, - un gène codant pour l'interféron gamma, - un promoteur interne constitutif, - un gène codant pour la thymidine kinase du virus HSV- I, 10 - un site interne d'entrée des ribosomes (IRES), - un gène codant pour un marqueur de selection positive, et - unLTR3'.

Un vecteur selon l'invention peut dériver d'un rétrovirus quelconque. On peut 15 citer à titre d'exemples, les rétrovirus aviaires tels que le virus de l'érythroblastose aviaire (AEV), le virus de la leucémie aviaire (AVL), le virusdu sarcome aviaire (ASV), le virus de la nécrose de la rate (SNV) et le virus dusarcome de Rous (RSV), les rétrovirus bovins, les rétrovirus félins~ les rétrovirus murins tels 4ue le virus de la leucémie murine (MuLV), le virus de ~0 Friend (F-M~V) et le virus du sarcome murin (MSV) et les rétrovirus de prima~e. Cependant, on préfère tout particulièrement avoir recours au virus de la leucémie murine de Moloney (MoMuLV). Les nombreux vecteurs rétroviraux dérivés de ce dernier qui sont décrits dans la littérature, notamment le vec~eur~2 ou un de ses dérivés peuvent être utilisés dans le cadre de la présente ~5 invention.

La présente invention concerne é~Jalement l'utilisation d'une composition antitumorale, d'une cellule d'encapsidation ou d'une vecteur rétroviral selon l'invention, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement ou à la 30 prévention du cancer ou d'une affection cancéreuse chez un homme ou un animal.

CA 022~0332 1998-09-23 W O 97/35995 PCT~R97/00~21 Les cancers qui pourraient etre ainsi traités sont, avantageusemellt, des tumeurs solides telles que les cancers renaux, du sein, du poumon et du coion e~ les mélanomes.

5 Le médicament issu de la présente invention peut être administré selon n'imporle quelle voie générale communément en usage, notamment par voie parentérale telle que la voie systémique, intramusculaire sous-cutanée ou intraperitonéale. D'une manière générale, la voie in~ratumorale est indiquée comme étant particulièrement avantageuse. D'une manière générale, 0 I'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée, une ou plusieurs ~ois après un cert~in délai d'intervalle. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, le médicament comprendra en outre un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Il peut également comprendre un véhicule, un diluant ou un adjuvanl acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Le dosage 15 approprié varie en fonction de différents paramètres, par exemple de la voie d'administration, de l'individu à traiter, de la nature et de la sévérité de l'état tumoral, du type de gènes thérapeutiques employés.

Enfin, la présente invention a également pour objet une méthode de traitement '0 du cancer chez les mammifères, selon laquelle on injec[e à un individu ayant besoin d'un tel traitement, une quantité efficace d'un point de vue pharmaceutique d'une composition antitumorale, d'une cellule d'encapsidation ou d'une vecteur rétroviral selon l'invention 25 La présente invention est illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants dans lesquels:

La Figure I illustre le vecteur pTG53~4 permettant l'expression de PIL-~humaine à partir du promoteur précoce CMV. Il comprend le gène de sélection ,0 pac dirigé par le promoteur SV40.

WO 97/35995 PCT/FRg7/00521 La Figure 2 illustre le vecteur rétroviral pTG9344 comprenant un LTR 5'~ une région d'encapsidation, une cassette d'expression bicistronique "gène t~ du virus HSV-l suivi de l'lRES EMCVet du gène de sélection neo" dirigée par ie promoteur PGK murin.
s La Figure 3 illustre le vecteur rétroviral pTG9326 dérivant du vecteur pTG9344 par insertion du gène codant pour l'lFNy canin.

Les constructions décrites ci-dessous sont réalisées selon les techniques générales de génie génétique et de clonage moléculaire, détaillées dans Maniatis et al., ( 1989~
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) ou selon les recornrnandations du fabricant lorsqu'on utilise un kit commercial.
Les étapes de clonage mettant en oeuvre des plasmides bactériens sont de préférence réalisées dans la souche ~ coli XLI-Blue ou DHSa (Gibco BRL). Les vecteurs Ml3 sont amplifiés dans la souche E. coli JMl 10 ou NM52~. S'agissant de la réparation des sites de restriction, on procède par remplissage des e:~trémites 5' protubérantes à l'aide du grand fragment de l'ADN polymérase I d'L. coli (lClenow) ou par digestion par la nucléase S1 suivi d'un traitement par la Klenow Les techniques d'amplification par PCR (Polyrnérase Chain Reaction) sont connuesde l'homme de l'a~t (voir par exemple PCR Protocols - A guide to methods and applications, 1990, édité par Innis, Gelfand, Sninsky et White, Academic Press 2 5 Inc).

Dans les exemples qui suivent7 on a recours à la lignée cellulaire murine NIH 3T3 (ATCC CRL 1685), la lignée canine MDCK (ATCC CCL 34), la lignée B16 dérivée d'un mélanome murin (ATCC CRL 6322), la lignée P815 issue d'un mastocytome murin (ECACC N~870 42 301), la lignée E17 (décrite en détail dans CA 022~0332 1998-09-23 WO 97/35995 PCT~R97/00521 la demande internationale PCT/IB96/00439) et la lignée PA317 (i\~liller et Buttimore, 1986, Mol. Cell. Biol. 6, 2895-2902). A titre indicatif, la lignée E 17 est une lignée d'encapsidation rétroviraie dérivant de la lignee humaine 293 (Grahamet al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72) par transfection de vecteurs exprimant S respectivement les gènes gag/pol du virus FMuLV (Friend Murine Leu~emia Virus) de la souche FB29 et le gène env du virus amphotropique 4070A. Les cellules sont transfectees selon les techniques standards bien connues de l'homme du métier. On peut citer la technique au phosphate de calcium, mais tout autre protocole peut également être employé, tel que la technique au DEAE dextran, l'électroporation, les méthodes basées sur les chocs osmotiques, la microinjection ou les méthodes basées sur l emploi de liposomes.

Quant aux conditions de culture, on utilise en général le milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco BRL) contenant 10 % (voUvol) de sérum de veau foetal (FCS), 3 g/ml de glucose, 2 mM de glutamine, I % d'acides amines non essentiels et 40 !lg/ml de gensamycine à l'exception des cellules MDCK et P~ t 5pour lesquelles on emploie le milieu RPMI-1640 contenant 10 % de FCS, 2 mM
de glutamine, I % d'acides arninés non essentiels et 40 ,ug/ml de ~entamycine. Les cellules transduites par les vecteurs rétroviraux exprimant le gene néo sont cultivées en présence de G418 à une concentration finale de I mg/ml ou 5 mg/ml.
Les cellules d'encapsidation E 17 sont cultivées en présence de l'a~ent de sélection puromycine (1 ~/ml).

EXEMPLE 1: Construction d'une li~née d'encapsidation rétrovirale produisant I'interleukine-2 humaine (hlL-2) (E]7-TG5324).

Les sequences codant pour l'hIL-2 sont isolées du vecteur pTG36 (décri~ dans le brevet francais 85 09480) sous forme d'un fragment P~ll, sous-clonées dans le vecteur M13TG130 (Kienv et al., 1983, Gene 'G, 91-99) et soumises à une 30 mutagénèse dirigée de manière à introduire un site SalI 12 nucléotides en aval du codon stop (trousse de mutagénèse Amersham, RPN 1523). L'ADNc hIL-~ est WO 97135995 PCT/~97/00521 purifié du vecleur muté par digestion S~ll et inséré dans le site .'~/~(J1 de pBCMGneo (Karasuyama et Melchers, 19887 Eur. J. Immunol. 1~', 97-104) situe en 3' et 5' respectivement des signaux d'épissage et de polyadénylation du ~,ène ~-globine de lapin. On obtient pTG5320.
s En parallèle, un fra~ment BamHI-~i/7dIII portant le promoteur précoce du virus CMV (Cytomegalovirus) purifié de pLNCX (Miller et Rosman, 1989, BioTechniques 7, 980-988) est introduit dans le vecteur p polyIIl-l* (Lathe et al, 19~7, Gene ~7, 193-201) traité par les memes enzymes. On introduit entre les sites 0 SalI et Bgl~I situés en aval de ce promoteur, le fragment SalI-BamH~ purifié de pTG5320 portant l'intron ~-globine, l'ADNc hlL-2 et le signal de poiyadénylation~-globine. Le vecteur résultant pTG5321 est linéarisé par l'enzyme Ba~JtHI et oninsère un fragment BamHI-BglJI contenant le gène de sélection pac placé sous le contrôle du promoteur précoce et du signal de polyadénylation du virus SV40. Le 15 vecteur ainsi obtenu est designé pTG5322.

Enfin, le vecteur pTG5324 (Figure 1) est généré par insertion dans le vecteur précédent linéarisé par BamHI d'un fragment BamH~ comprenant les séquences mitochondriale 12 S murine(Luf'tailaetal., 19~5, Som. Celi. Mol. Genet. Il, 2~,-~0 738).

70 ~g de plasmide pTG5324 sont utilisés pour transfecter les cellules E 17 à unedensité de 40 à 50 ~/O selon la tecimique classique du phosphate de calcium. Le jour suivant, les cellules transfectées sont placées en présence de puromycine. Après25 deux semaines en milieu sélectif, les clones résistants sont repiqués, propagés et congeiés en azote liquide en attendant de vérifier leur capacité a sécréter l'hIL-2.
Pour ce faire, on utilise des plaques de culture à 6 puits dans lesquels on ensemence ~x 10' cellules à tester. Le jour suivant, le milieu est change et recolté 2~ 1- plus tard. La quantité d'hIL-2 presente dans les surnageants cellulaires est estimee par 30 ELISA (R&D Systems Minneapolis, D2050). Environ un quart des clones testés sécrètent des quantités d'L-2 dépassant 2 ~lg/ml/106 cellules/24h. Le clone le plus -- . . .

CA 022~0332 1998-09-23 W O 97/35995 PCT~FR97/00521 producteur désigné E 17-5324-clone 2 et sécrétant 3 ~g/ml/ I o6 cellules/24h d'hIL-7 est retenu pour les études ultérieures.

Dans la mesure ou les cellules E 17-5324 sont destinées a un usaae thérapeutiqueS humain, il est interessant de tester leur capacité de résistance à l'inactivation par le complément humain. Pour ce faire, Sxl0~ cellules sont mises en culture dans un support approprié. Le jour suivant le milieu est éliminé et les ceilules sont exposées à 0,5 ml de sérum humain frais ou inactivé par chauffage (contrôle negatif) prélevé
de deux individus différents ou encore du FCS (contrôle négatif). Après 150 min,10 la culture est poursuivie dans un milieu classique pour 24 h. Les cellules viables sonl denombrées après traitement a la trypsine et coloration au bleu de trypane.L'expérience est égaJement réalisée en parallèle sur les cellules 293 (lignée dont derive les cellules E17), la lignée d'encapsidation PA317 et les cellules murines 3T3. Cornme attendu, la viabilité de l'ensemble des lignées testées n'est pas a~ectée 15 par l'exposition au FCS ou au sérum inactivé. Par contre, le traitement par du sérum frais induit la mort des celluies 3T3 et PA317 (viabilité ' 0,015 %). Ce phénomene n'est pas observé avec les cellules 293 (viabilité de S0 et 100 % selon le sérum) ni avec les cellules E 17-5324 (viabilite de 75 et 70 %).

EXEI~/rPLE 7: Constn~ction du vecteur rétroviral pTG9344 Le vecteur rétroviral pTG9344 permet l'expression d'une manière bicistroniclue d'un gene cytotoxique, en l'occurence le gène tk de HSV- I et du gène de sélection positive neo. Le vecteur de base est pLXSP qui dérive de pLXSN (Miller et Rosman, 1989, supra). On introduit en aval de la région d'encapsidation le promoteur PGK obtenu du plasmide PKI-l (Adra et al., 1987, Gene 60, 65-74) sous forme d'un fragment ~coR~-Psll (positions -517 à -20 par rapport au site d'initiation de la transcription). Le gene Ik est isolé du vecteur pTK- I (Spandidos et al., 19S2, E:Yp. Cell. Res. l~l, 149-15S, Wagner, 1981, Proc Natl Acad. Sci USA 7S, 1441-1445) et sous-cloné dans le siteBamHI de pBR32S (Covarrubias et Bolivar, 19S'7, Gene 1/, 79-82~. La région 3' non codante est éliminee par CA 022~0332 1998-09-23 W O 97/35995 PCT~FR97/00521 digestion SmaI-~Y~QI et on introduit un adaptateur Smal-.Yb~71 résultant de la réassociation des oli~gonucleotides oTG4322 et oTG4373 (SEQ ID NO: I et ~), ce qui permet de reconstituer les 7 derniers codons situés en 3' du site ~)1nl et de créér un site Xbal 4 paires de bases (pb) apres le codon stop. Le ~ène tk ainsi 5 modifié est alors isolé sous forme d'un fragment BglII-Xbal de 1 191 pb et insére en aval du promoteur PGK.

Puis on introduit en aval du gène tk le site IRES du virus EMCV pour permettre la réinitiation de la traduction du second cistron de l'ARNm bicistronique. Il est isolé du vecteur [RES-~geo (décnt dans la demande internationale WO 94/~43~1) par di;,estion XbaI-NcoI. Enfin le gène neo est cloné en aval de la séquence IRES
sous forme d'un fragment Bgm-SmaI produit à partir de pAG60 (Colbère-Garapin eta~., 1981,J.Mol.Biol. 1~0, 1-14)clivéparcesmêmesenzymes. Levecteurfinal pTG9344 est présenté à la Figure 2.
Il est connu que la réinitiation de la traduction à partir de site IRES est moins efficace que l'initiation à partir d'ARNm coiffés. Pour ce qui est des cellules transduites par les particules issues du vecteur pTG9344, la resistance à l'agent de selection G418 dépend de l'efficacité de la réinitiation à partir le l'IRES E~vlCV. En ~0 conséquence, lorsque la culture est effectuée en milieu sélectif, seules les cellules produisant de grandes quantités d'ARNm bicistroniques sont amenées a survivre assurant de ce fait un niveau d'expression élevé du gène tl;

E~CEMPLE 3: Construction du vecteur rétroviral pTG93~6 contenant l'lF~'v canin .

Le vecteur pTG9344 comprend un site de restriction unique ~cor~ qui permet l'insertion d'un gène supplémentaire sous la dépendance du promoteur rétroviral LTR S' L'IFNy canin est cloné à partir de l'ARN cellulaire isolé de Iymphocytes T canins stimulés par la concanavaline A. L'ARN cellulaire est reverse-transcrit en mettant en oeuvre l'amorce dégénérée oTG4031 (SEQ ID NO: 3). Le fra~ment spécifique est amplifié en deux étapes. Tout d'abord un fragment interne est produit à l'aide des amorces oTG4169 et oTG4170 (SEQ ID NO: 4 et 5) Puis, on utilise deux oli~onuciéotides specifi(lues oTG4321 et oTG4319 (SEQ ID NO: 6 et 7) en combinaison avec deux adaptateurs oligo d(T) et amorce pour ~énérer les fragments 5' et 3' selon la méthode RACE (Frohmann et al., 1988, Proc. Nati.
Acad. Sci. USA 85, 8998-9002). Les deux fragments PCR sont clivés par $>hl et AJ~II avant d'être insérés dans le site SphI de M13TG131 (Kieny et al., 1983, supra) et soumis à une analyse de séquence par les techniques classiques. Les donnees confirment une sé~luence identique à celle publiée par Zucl;er et al. (199~, J. lnterferon Res. I ~, 191 - 194) Le vecteur précédent M 13TG8173 est utilisé
comme matrice pour isoler par PCR les séquences IFN~ à l'aide de deu.c amorces m~lt~Pèn~s oTG6727 et oTG6788 (SEQ ID NO: 8 et 9) qui permettent d'introduire un site EcoR~ en amont et en aval des codons initiateur et stop respectivement. Le produit PCR après coupure par ~;coR~ est clone dans le vecteur pTG9344 pour donner pTG9326 (Figure 3).

EXEMPLE 4 Construction du vecteur rétroviral pTG9337 contenant l'TF~v murin.

L'IFNy murin est isolé par PCR sur ia base des données de séquence (Gray et Goeddel, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA ~0, 5842-5846) à l'aide des amorces oTG729S et oTG7296 (SEQ ID NO: 10 et 11). Le vecteur rétroviral pTG9337 ~5 résulle de l'insertion du fra~ment d'amplificaIion clivé par EcoRI au sein du site EcoR~ de pTG9344.

EXEMPLE 5: Construction d'un vecteur rétroviral contenant l'lF~v humain L'IFNy humain est isolé par PCR à partir du vecteur M13TG2437 qui résulte du sous-clonage dans le vecteur M13TG131 de la sé~uence codante IFN isolée de CA 022~0332 1998-09-23 W O 97/35995 PCT~R97/0052i pTG23 (Tessier et al., 19S4, Nucleic Acids Res. 1~, 766~-7676). On utilise les amorces oTG6147 et oTG49S3 (SEQ ID NO: 12 et 13). Le f'ragment amplifié est traité par la nucléase S I puis par la Klenow avant d'être cloné dans un vecteL~r intermédiaire dont il peut etre isole pour etre inséré dans le site f ~Rl de pTG9344.

EXEMPLE 6: Construction d'une lignée d'enca~sidation secrétant l'hlL-2 et produisant le vecteur rétoviral pTG9326.

Les cellules E17 sont transfectees par 10~1g de chacun des plasmides pTG9326 et pTGS324 par la méthode au phosphate de calcium et cultivées en milieu sélectif g/ml de puromycine et I mg/ml de G4 18) 24 h apres la transfection. Dix à 14 jours plus tard, les cellules résistantes sont sous clonées par dilution limite (mise en culture dans une plaque à 96 puits de 200 111/ puit d'une dilution à une densité
de 1,5 cellules par ml). Les clones cellulaires sont récupérés après deux semaines de culture et amplifiés de manière classique. Les clones sont mis en culture à raison de ~,x10j cellules. Après un changement de milieu, on récolte le surnageant de culture de 24 h à partir duquel on estime les quantités d'hIL-2 et d'lFNy secretées.

Pour ce qui est de l'hIL-2, on applique la méthode ELISA (R&D Systems Minneapolis, D2050) décrite précédemment. L'IFNy est dosé par la méthode d'inhibition de l'effet cytopathique du virus VSV (Vesicular Stomatitis Virus souche Indiana, ATCC VR 158) sur la lignée de cellules épithéliales de reins de chien 1~DCK (Steward II, in The l~lterfe~0~1 System, pp 17-19, Springer-Verlag, ?5 ~ y ; Familletti et al., 1981, Methods Enzymology 78, 387). Brièvement, 3xl0~
cellules MDCK/puit sont mises en culture dans une plaque de microtitration à 96 puits puis on ajoute des dilutions en série des surnageants obtenus des clones résistants à la puromycine et au G418. Par la suite, les celiules sont exposées à 10i cfu (pour colony formin~ unit en an~lais) de vir~ls VSV et on détermine la cytopathie 24 h plus tard. L'lFNy rend les cellules résistantes à l'infection VSV
Les résullats sont données en unités arbitraires qui correspondent à l'inverse de la W O 97/35995 PCT~FR97/00521 dilution pour laquelle on obtient ~0 % de protection. Les cellules controles montrent une cytopathie supérieure à 90 %.

Enfin, la production de particules retrovirales par ces clones est évaluée par infection de I à 2x 105 cellules 3T3 permissives. Après 24 h de culture, elles sont exposées pendant 90 rnin à 200 ~,11 de dilutions de 10 en 10 de surna~eant cellulaire à tester et 200 ,ul de milieu contenant 16 ~lg/ml de polybrène (Sigma). La culture est poursuivie dans un milieu tout d'abord classique puis sélectif (j mg/ml de G418) 24 h après l'infection Les colonies résistantes après deux semaines sont colorees au crystal violet (0,05 % dans un mélange éthanol 10 % eau 90 %). Le nombre de particules rétrovirales présentes dans le surnageant des clones producteurs peut être calculé à partir du nombre de colonies 3T3 résistantes au G41S. On sélectionne Ze clone désigné ci-apres E17-TG5324&TG9326 ~2~ qui produit I ~lg/ml/106 cellules/24h d'hLL-2, 32 U/ml d"IFNy et 4,5x106 cfu/ml de particules virales.

EXEI~/fPLE 7: Construction d'une li~née d'encapsidation secrétant l'h[L-2 et produisant le vecteur rétoviral pTG9337.

Les cellules E17-5324 sont transfectées par 20 llg de plasmide pTG93~7 et on sélectioMe les clones résistants en rnilieu G418 ( I mg/ml). Après sous-clona;,e, on évalue les clones les plus producteurs en terme de sécrétion d'hrL-2, d"[FNy murin et de titre en particules virales. Les méthodes mises en oeuvre sont décrites à
l'exemple précédent à l'exception de la technique de dosage de l'IFNy murin qui est quantifié par test ELISA (PerSeptive Diagnostics, Cambridge, MA, N~ S-6716).
Le clone retenu E~7-TG5324&TG9337 #33 produit I ~ug/ml/106 cellules/24h d'hIL-2, 60 n~lml/10~ cellules/24h d'IFNy et présente un titre viral de 1 ~;10"
cfu/ml 30 EXEMPLE S Transduction de cellules cibles On vérifie que les particules virales produites à partir des lignées productrices E 17-TG5324&TG93~6 et E17-TG53~4&TG9337 sont capables de transduire des cellules cibles et que l'e~pression des gènes thérapeutiques n'est pas altérée dans le conte,xte cellulaire. Cette étude est menée sur une lignée n-urine établie (cellules 3T3) et sur deux lignées pnmaires (cellules P3D6M et P3D4M). Ces dernieres sont dérivées de mélanomes de chien et soumises à un passage en souris SCID
irrlmunodéficientes afin de générer des lignées primaires homogenes. 2x 107 cellules au stade passage 5, sont in~ectées par voie sous-cutanée dans les animaux. Les tumeurs sont prélevées 3 semaines plus tard et les cellules de mélanome sont l 0 maintenues en culture dans les conditions classiques.

Les cellules cibles sont mises en culture à raison de 1 à 2x 10' cellules par puit et, le jour suivant, infectées par 0,5 ml de surnageant de culture des cellules productrices préalablement filtré à travers une membrane de 0,45 ~m. On laisse I ~ l'infection se poursuivre pendant I à 2 h puis les cellules sont remises dans du milieu frais.3~abituellement, on effectue deux cycles de transduction dans la même journée et les cellules transduites sont cultivées en présence de G415 (5 mglml)Le milieu est changé tous les trois jours jusqu'à l'apparition de colonies résistantes dont on évalue leur sensibilité au ganciclovir. Les essais mettent en oeuvre 5X106 cellules qui sont placées le jour suivant leur mise en culture, en présence de ~ranciclovir à des concentrations comprises entre 0 et 1000 ,uM. La viabilité des cellules est déterrninée après une semaine par le test au bleu de trypane. Le nombre de cellules dénombré dans les puits dans lesquels la culture a été effectuée en absence de ganciclovir représente le 100 %. Les résultats indiquent que les trois types de cellules cibles transduites par les particules issues des vecteurs rétoviraux pTG9326 et pTG9337 ainsi que les lignées productrices correspondantes sont sensibles au ganciclovir. En d'autres termes, leur viabilité est affectée en présence de doses faibles de ganciclovir (LD50 c'est à dire la concentration de ganciclovir pour laquelle on obtient 50 % de viabilité~ inférieure à 0,1 IlM) alors que les ,0 cellules non transduites résistent a des concentrations beaucoup plus élevees (LD50 au delà de 10 ,uM). Ces résultats montrent que le niveau d'expression du oene 1' ... .. .

Wo 97/35995 PCT~97/OOS21 - ~ I

dans les cellules tumorales transduites est suf~samment élevé pour les rendre - sensibles à des doses de ~ancoclovir non toxiques pour les cellules normales.

EXEMPL~ 9: Effet de voisinage.
s On verifie la capacité des particules virales de vecteur pTG9344 à induire un effet cytotoxique de voisinage dans les cellules transduites. Dans un premier temps, les cellules p,.,l,ailes P3D6M sont transduites par les particules virales pTG9344 et les cellules infectées sont sélectionnées en présence de G418 (I mg/ml) Puis, on réalise une co-culture contenant des cellules P3D6M non transduites et un certain pourcentage de la culture transduite (respectivement O, 10, 30, SO, ~O et 100 %).
La co-culture est maintenue 7 jours en présence de Ganciclovir (I ~lM) et la viabilité des cellules est estimée par coloration au bleu de trypane. On indique que cette concentration est choisie de manière à etre toxique pour les cellules I j transduites qui expriment la thymidine kinase (3 % de cellules survivantes pour llessai 100 %) alors qu'elle n'affecte pas ou peu la viabilité des cellules n'exprimant pas le gene suicide (~6 % de cellules survivantes pour l'essai O %). Pour ce qui est des essais de co-culture, le ganciclovir exerce un effet toxique notable meme à un faible pourcentage de cellules transduites. Une réduction drastique de la viabilité
~O est déjà observée lorsque le mélange cellulaire ne contient que 10 % de cellules transduites (18 % de cellules survivantes pour l'essai 10 % et S % pour l'essai 30%). Ces résultats indiquent que le vecteur pTG9344 exprime une quantité
snffic~nte de TK pour induire la cytotoxicité de ~a cellule infectée et propager cet effet au~ cellules non transduites avoisinantes.
EXEMPLE 10: Induction de l'expression des antigènes ~lHC de classe I et rl dans les cellules transduites.

Cette étude est destinée à vérifier la fonctionnalité des gènes IFNy portés par les vecteurs pTG9326 et pTG9337. Un des effets biologiques de l'IFNy est d'induire l'expression des antigènes ~fHC de classe I et II.

CA 022~0332 1998-09-23 W O 97/35995 PCT~Rg7/00521 - 2_-Les cellules P8 15 (mastocytome murin) et B 16 (mélanome murin) sont transduitespar le vecteur pTG9344 (tk-o~o) à titre de témoin negatif ou pTG9i37 (IFNy murin-~k-~l~o) et on détermine la présence d'antiaènes de classe I et Il à la sur~ce des cellules infectées par les techniques classiques d'immunofluorescence et de 5 cytometrie de flux (FACS). Les anti~,ènes ~fHC de classe II presents à la surface des cellules P8 15 et B 16 sont mis en évidence par un anticorps anti-souris couplé
au FITC (pour Fluorescein isothiocyanate) (Pharmingène, San Diego, CA). Pour la détection des antigènes de classe I, on uti]ise un anticorps anti-H21;b (Pharminaen) pour les cellules B16 et anti-H2kd ~Pharmingen) pour les cellules 10 P815.

Apres l'infection et maintien en milieu sélectif ~ G4 18 5 mg/ml) pendant environ deux semaines, les cellules sont detachées par action de 10 rnM d'EDTA dans un tampon phosphate salin (PBS) et lavées à deux reprises dans la tampon suivant 15 (PBS, I % de sé~um albumine bovine, 0,1 % de gammaglobuline humaine, 10 mM
d'EDTA et 0,02 % d'azide de sodium). 1X106 cellules sont incubées pendant 4S
min, a 4~C et à l'obscurité en présence de 200 Ill d'une dilution au 1:50 de chacun des anticorps cités ci-dessus ou à titre de témoin nég~tif en absence d'anticorps ou en presence d'un anticorps non spécifique (anti-CD8 de souris). .~près lava=,~ les ~0 cellules sont fi:cées (formaldéhyde ~ % dans du tampon PBS) et analysees par FACS (cytomètre Becton Dickinson, San Jose, CA).

Les résultats indiquent que l'expression des antigènes MHC de classe I à la surface des cellules murines cancéreuses B 16 et P8 15 (80 % pour les cellules P8 15 et 95 ~5 % pour les cellules 1316) est fortement induite par le transfert du vecteur pTG9337 montrant que ce dernier exprime un IF~Ny fonctionnel. En revanche, les cellu: ~sP8 15 et B 16 transduites par le vecteur pTG9344 ne présentent aucune fluorescence (O ~/c) De plus, l'intensité de fluorescence des cellules transduites exprimant l'lF~iy est environ 30 à 40 fois supérieure à celle obtenue avec les cellules non ~raitées.
30 Ainsi, le grand nombre de cellules positives pour les antigènes de classe I et l'intensité de l'expression à la surface de ces cellules dus a l'expression de l'~Fl~y W O 97/35995 PCT~FRg7/00521 -~3-devraient contribuer à une meilleure reconnaissance des cellules et~ectrices immunes en vue d'éliminer les cellules cancereuses. I 'expression des M~lC de classe ll est faiblement induite 5 Une expérience similaire est entreprise sur les cellules primaires canines P3D6M
infectées par le vecteur pTG9326 (IFN~ canin-lk-~7eo) ou, à titre de témoins négatifs, pTG9344 (pas d'expression d'IFNy) et pTG9337 (expression de l'IFNy murin). Les antigènes MHC de classe l et 1I sont respectivement mis en evidence par les anticorps monoclonaux H58A recorln~iss~nt les molécules anti-H~kl' et 10 THl4E3 dirigé contre l'equivalent allélique DR de plusieurs espèces dont le chien (VRMD Inc, Pullman, WA) (Davis et al., 1987, Vet. Immunol. Immunopathol. 1~, 337-376). L'immunocoloration est réalisée comme décrit ci-avant à la différence qu'après l'incubation avec la solution d'anticorps, les cellules sont mises en présence de 200 Ill de tampon de lavage contenant une dilution au 1:256 d'un anticorps de15 lapin anti-immunoglobuline G de souris conjugué au FITC. Apres 45 min de contact à 4~C et dans l'obscurite, les cellules sont lavées, fixées et la présence des anti(~enes de classe I et II évaluée par FACS.

Les résultats indicluent que l'expression des antigènes MHC de classe l et ll est ~0 fortement induite a la surface de plus de 95 % des cellules primaires cancéreuses P3D6M transduites par le vecteur pT(:i9326. L'intensité de fluorescence des cellules transduites exprimant l'IF:Ny est environ 25 fois supérieure pour les MHC
I et 300 fois superieure pour les MHC II à celle obtenue avec les cellules non traitees. Aucune induction ne se produit dans les cellules P3D6M transduites par ~5 les vecteurs pTG9344 et pTG9337.

EXEMPLE 1 1 : Evaluation i~l vivo Les cellules murines B16 sont transduites par les vecteurs pTG9344 et pTG93~7 30 ou à titre de controle né~atif par un vecteur rétroviral exprimant le (rène mar~ueur LacZ codanl pour la ~-galactosidase (pTG5391). Les cellules infectées sont CA 022~0332 1998-09-23 W O 97135995 PCTn~R97/00521 _ -~4-selectionnees en presence de G41g pendant 14 jours trypsinées et resuspendues a une densité de 2x 10' cellules/ml dans du tampon PBS. 100 1ll de cette suspension sont injectes de manière sous-cutanée à des souris immunocompétentes B6/D2 génération Fl . Deux jours après et ceci pendant les 6 jours qui suivent, les animaux 5 rec,oivent une injection intrapéritonéale de ganciclovir (100 mg/i;~/jour) et on examine le nombre de tumeurs et leur taille jusqu'à 44 jours après l'implantation.
A titre de temoins, on utilise des souris traitées en parallèle par des cellules non transduites et des souris dans lesquelles ont été implantées des cellules transduites mais qui ne sont pas traitées par le ganciclovir (GC). Comme resumé dans le 10 tableau suivant, au total S groupes de 10 animaux ont été constitués.

groupe lignée cellulairetraitement nombre de souris sans ~umeur injectée Ganciclovir jour ~ I jo~lr 30 jour 31jour ~11 B16 +GC o d B 1 6-TG~3') 1 (beta+GC 0 d _~ _~
Gal) I 5 , B 1 6-TG93~(TK- +GC 10 3 1 0 Neo) 4 B16-TG9337 +GC 10 9 9 '~
(IFN,0""5-TK-Nco) B 1 6-TG')3 3 7 -GC () () () O
(IFNs~"",5-TK-Nco) ~ souris mortes ou sacrifiées en raison de la taille importante des tumeurs.

20 La comparaison des groupes 4 et 5 tous deux résultant de l'impiantation de cellules transduites par le vecteur pTG9337 mais traités ou non par le ~anciclovir, montre clairement l'e~et de ce dernier sur le dévelopement des tumeurs Par ailleurs lessouris dans lesquelles ont été implantées les cellules transduites par un vec~eur exprimant des ~ènes thérapeutiques (pTG9344 et pTG93-7) ne développent pas ''5 de tumeurs avant le 7Sième jour (groupes 3 et 4) alors que les animaux n'ayant recu aucun vecteur (groupe I ) ou un vecteur non thérapeutique (groupe 2) sont décimés W 097/3S995 PCT~R97/00521 ~5 _ bien avant le ~ lième jour. De plus, I'avantage de combiner i'action de plusieurs - gènes thérapeuti(lues ressort clairement de cette analyse. En effet, I'expression du g,ène Ik seul ralentit le déveioppement tumoral (groupe 3) alors ~ue la (~rande majorité (9/10) des animaux ayant reçu ies cellules B16-9337 (expression concomittante des gènes Jk et ~Ny) ne présentent aucune tumeur plus de 44 jours post-implantation. Ces données indiquent gue la combinaison de l'e~'et immunostimul~tellr de l'IFNy et des effets cytotoxiques de la thymidine l;inase et du ganciclovir réduit d'une manière drastique la fréquence des tumeurs.

CA 02250332 l998-09-23 W O 97/35995 PCT~R97/00521 LISTE DE SEQUENCES
(l) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: Transgene S.A.
~B) RUE: ll rue de Molsheim (C) VILLE: Strasbourg (E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 67082 (G) TELEPHONE: (33) 88 27 9l 00 (H) TELECOPIE: (33) 88 27 9l ll (ii) TITRE DE L' INVENTION: Nouvelles compositions antitumorales (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: l3 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #l.0, Version Xl.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: l:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 26 paires de bases i8) TYPE: aclde nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (lii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: olgonucleotide de synthese oTG~322 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: l:

~2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(~) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique . . . . .. .

(C) NOMLRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii~ TYPE DE MOLECULE: ADN ( génomique) (lil) HYPOTHETIQUE: NON

(ill) ANTI-SENS: OUI

(vi) ORIGINE:

(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG4323 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2 ~2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
~i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 22 palres de bases (B) TYPE: acide nucléique (C~ NOMFRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN ( génomique) (ill) HYPOTHETIQUE: NON
(lil) ANTI-SENS: OUI
v~) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucieotlde de synthese ~TG~031 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 palres de bases (~) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE Dr BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ii) TYPE DE MOLECULE: ADN ( génomique) ~iii) HYPOTHETIQUE: NON

(iii) ANTI-SENS: NON

CA 022~0332 1998-09-23 W O 97t35995 PCT~Rg7tO0~21 (vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG4169 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: 1 inéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN ( génomique) (lil) HYPOTHETIQUE: NON
~iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORI&INE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG4170 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
AAGAATTCRT GCAYCACTY~ GATGAGYTC 29 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 26 paires de bases (B) TYPE: aclde nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D~ CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN ( génomique) (lii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG432 (~i) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:

~2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:

W O 97/35995 PCT~FR97/00~21 9 _ ~1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 32 paires de bases (B) TYPE: aclde nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: slmple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN ( génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG4319 (:~i) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:

~2) INEORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 22 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) HYPOTHETIQUE: NON
(li~) ANTI-SENS: NON
( Vl ) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG67~7 ( Y~i ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
CTTCGGCCGA ATTCTCTGAA AC ~2 (2) IN-ORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9:
( ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: aclde nuclélque (C) NOMaRE DE BRINS: slmple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) ( L i~~ HYPOTHETIQUE: NON

. .. .. .

CA 022~0332 l998-09-23 _ - -30-(ili) ANTI-SENS: OUI
( V l) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotlde de synthese oTG6788 (~i) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 22 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (li) TYPE DE MOLECULE: ADN ( génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG7295 (Y.i) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: ll:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (ii~) ~YPOTHETIQUE: NON
( l~/ ANTI-SENS: OUI
~Vl) 02IGINE:
~C) INDIVIDUEL ISOLE: cligonucleotide de synthese oTG729 ~ ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: ll:

_ . .

CA 022~0332 1998-09-23 W O 97/35995 PCT~R97/00521 ~2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12:
(1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases (~) TYPE: acide nuclélque (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON

(iii) ANTI-SENS: NON

(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG6147 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (11) TYPE DE MOLECULE: ADN (~énomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oliqonucleotide de synthese oTG4983 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:

_

Claims (20)

Revendications

1. Composition antitumorale comprenant une population de cellules, caractérisée en ce que ladite population de cellules permet l'expression d'au moins trois gènes thérapeutiques antitumoraux et comprend un mélange de cellules permettant l'expression desdits gènes thérapeutiques antitumoraux.

2. Composition antitumorale selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite population de cellules comprend un mélange de cellules dérivées de la lignée Véro.

3. Composition antitumorale selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite population de cellules est d'origine humaine.

4. Composition antitumorale selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite population de cellules dérive de la lignée 293.

5. Composition antitumorale selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ladite population de cellules comprend les gènes gagipol du virus FMuLV
(Friend Murine Leukemia Virus) de la souche FB29 et le gène env du virus amphotropique 4070A.

6. Composition antitumorale selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la dite population de cellules comprend un lignée d'encapsidation rétrovirale permettant la production de particules infectieuses renfermant un vecteur rétroviral.

7. Composition antitumorale selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que les gènes thérapeutiques codent pour des polypeptides immunostimulateurs et/ou cytotoxiques.

8. Composition antitumorale selon la revendications 7, caractérisée en ce que lepolypeptide immunostimulateur est sélectionné parmi le groupe constitué par l'interleukine (IL)-2, I'IL-4, I'IL-6, I'IL-10, I'IL-12, les facteurs de stimulation des colonies (CSF) de type granulocyte (G-CSF), de type granulocyte macrophage (GM-CSF), l'interféron alpha, l'interféron gamma, les facteurs de costimulation, notamment, les polypeptides B7 1 et B7 2, et les facteurs activant l'expression des antigènes d'histocompetibilité de classe II.

9. Composition amitumorale selon la revendication 7, caractérisée en ce que le polypeptide cyctoxique est sélectionné permi le groupe constitue par une thymidine kinase, notamment la thymidine kinase (TK) du virus Herpes Simplex de type I (HSV-I), une cytosine deaminase, le cytochrome P450 2B1, la purine nucléoside phosphorylase d'E. coli, la nitroréductase et la .beta.-glucoronidase.

10. Composition antitumomale selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que ladite population de cellules permet l'expression des gènes codant pour les polypeptides TK-HSV-1, IL-2 et IFN gamma.

11. Composition antitumorale selon la revendication 10, caractérisée en ce que ladite population de cellules comprend un vecteur permettant l'expression d'un gène codant pou l'IL-2 et une lignée d'encapisdation retrovirale permettant la production de particules infectieuses comprenant un vecteur retroviral permettant l'expression d'un gène codant pour la thymidine kinase du virus HSV-1 et d'un gène codant pour l'interteron gamme.

12. Composition antitumorale selon l'une des revendications 2 et 10, caractérisés en ce que ladite population de cellules comprend un mélangé de cellules dérivées de lalignée Vero, une partie permettant l'expression de gène IL-2 et l'autre partie premettant l'expression du gène IFN-.gamma..

13. Composition antiumorale selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'elle est en outre combinée a une lignée d'encapsidation retrovirale permettant la production de particules infectieuses ou a des particules infectieuses comprenant un vecteur retroviral permettant l'expression du gène TK-HSV-1

14. Composition antitumorale selon l'une des revendications 1 a 13, caractérisé en ce que ladite population de cellules est sensible a une drogue permettant son élimination.

15. Composition antitumorale selon la revendication 14, caractérisée en ce que ladite drogue est un dérivé de l'acyclovir et, notamment, le ganciclovir.

16. Composition antitumorale selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que ladite population de cellules permet en outre l'expression d'un marqueur de sélection positive.

17. Composition antitumorale selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite lignée d'encapsidation dérive de la lignée 293 et comprend - les gènes gag/pol du virus FMulV (Friend Murine Keukemia Virus) de la souche FB29 et le gène env du virus amphotropique 4070A, et -un vecteur permettant l'expression d'un gène codant pour l'IL-2.

18. Composition antitumorale selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit vecteur rétroviral est caractérisée en ce qu'il comprend de 5' vers 3';
- un LTR 5', - une région d'encapsidation, - un gène codant pour l'interféron gamma, - un promoteur interne constitutif, - un gène codant pour la thymidine kinase du virus HSV-1, - un site interne d'entrée des ribosomes (IRES), - un gène codant pour un marqueur de sélection positive, et - un LTR 3'.

19. Utilisation d'une composition antitumorale selon l'une des revendications 1 à 18 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention du cancer ou d'une affection cancéreuse chez un homme ou un animal.

20. Utilisation selon la revendication 19, selon laquelle ladite composition antitumorale est destinée à être administrée par voie intratumorale.