JP4509780B2 - 改変した細胞結合活性を有するウィルス粒子の調製方法およびその使用 - Google Patents
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Description
(i)第一の細胞結合活性を有するウィルス粒子をコードするウィルス核酸を含むウィルスパッケージング細胞を提供する工程;
(ii)前記ウィルスパッケージング細胞は、また、パッセンジャーペプチド結合部分をコードする核酸を含み;
(iii) パッセンジャーペプチド結合部分がウィルス粒子に導入されて第一の細胞結合活性を改変するように、ウィルス粒子がパッケージング細胞の膜から出芽し、パッセンジャーペプチド結合部分が細胞の膜で供給されるように、前記ウィルス核酸および前記パッセンジャーペプチド結合部分をコードする核酸を発現する工程;
を含む。
i)パッセンジャーペプチド結合部分が結合する支持体を提供すること;
ii)ウィルス粒子の集団を前記支持体に曝すこと;および、任意に、
iii)前記支持体に結合しないウィルス粒子から、前記支持体に結合するウィルス粒子を単離することを含む。
本実施例では、膜結合ポリペプチドをコードするヒト遺伝子をクローニングする方法を明示する。幹細胞増殖因子(SCF)は、静止状態の肝細胞の表面に見出されるc-kit受容体に結合するリガンドである(Hamel and Westphal, 1997)。SCFは、2つの型で存在し、長い可溶性型と短い膜結合型である。2つの型は、異なるmRNAスプライシングから得られる。可溶性型が、エキソン6によってコードされているタンパク質切断部位を有するのに対して、膜結合型は、エキソン6を有しておらず、それ故タンパク質切断部位も有していない(Hamel and Westphal, 1997)。我々は、ウィルス粒子の外被へとリガンドを挿入するための最初の工程として、パッケージング細胞ラインの表面上で、膜結合SCFを発現させることを望んだ。
ヒトの間質細胞ラインL88.5(幹細胞増殖因子(SCF)の膜結合型および可溶型の両方を発現する細胞ライン)は、血液学的に正常な患者の骨髄から増殖させた、シミアンウィルス40(SV40)で形質転換されたヒト間質に由来する(Thalmeier et al., 1994)。これは、SCFの両方のアイソフォーム(膜結合アイソフォームよりも高い割合での可溶性アイソフォーム)を発現し、クローニングのための膜結合SCF(mb-SCF)として用いた。規定どおりに、熱で不活性化した10%の牛胎児血清(FCS;Gibco)を加えたDulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)内で培養した。L88.5は、Dr. Karin Thalmeier (Germany)から頂いた。
細胞がサブコンフルエントであるときに、ヒト細胞ラインL88.5から全RNAを抽出した。RNA操作に用いる溶液は、RNase阻害剤ジエチルピロカルボネート(DEPC)で処理した。0.1%のDEPCを含む溶液を室温で12-16時間放置した。ガラス器具は、DEPC-ddH2O中に2時間浸し、ddH2Oで数回リンスし、オートクレーブした。DNaseおよびRnaseフリー(製造者に認定された)のチップおよびプラスチック器具を、全てのRNA調製のために使用し、リンスはしなかった。電気泳動槽は、洗剤で洗浄し、ddH2Oでリンスし、エタノールで乾かし、3%H2O2中に浸し、DEPC処理ddH2Oで徹底的にリンスした。手袋は、常時着用した。RNA抽出液は、専用のピペットを用いて取り扱う。全RNAは、RNaseフリーの条件で、約5×106細胞から抽出した。簡単に述べると、106細胞当り0.2mlのRNAzolTM B(Biogenesis Limited, Bournemouth, U.K.)中で、細胞を直接溶菌した。10%v/vクロロホルムを添加することによって、RNAを抽出した。サンプルを15分間徹底的に攪拌し、氷上で5分間反応させ、13000rpm、4℃で15分間遠心した。RNAを含む無色の水溶性の上層を取り除き、等量のイソプロパノールの添加によってRNAを沈殿し、4℃で15分間反応させ、13000rpm、4℃で15分間遠心した。RNAペレットを75%エタノールで洗浄し、7500rpm、4℃で15分間遠心して再度ペレットを得た。ペレットを10-15分間風乾させ、滅菌したDEPC処理ddH2Oで溶かした。全RNAの濃度および純度は、260nmおよび280nmの波長での光学濃度(OC)測定によって定量した。1unit(U)のODは、RNAの約40μg/mlに相当する。OD260/280比が1.8および2.0になる場合は、それぞれ、DNAおよびRNAの純度が高いことを示す。抽出したRNAの完全性を、分光光度計およびアガロースゲル電気泳動によって求めた。A260/280比は、3回の異なる実験で一致して2.0であり、3種類のRNA(28S、18Sおよび5S)が、0.8%アガロースゲル電気泳動によって検出することができた。
一本鎖cDNAを、その後、前記した全RNA調製物から調製した。1μgの全RNAを鋳型として使用し、cDNAを産生した。1μgのRNA、10mMのdNTPストック、100pmol/μlのランダムヘキサマー、5×RT(Ist strand)バッファー、0.005MのDTT、2UのMMLV逆転写酵素(Gibco, UK)からなる逆転写酵素反応液を、37℃で1時間反応させた。反応液を、その後、95℃で5分間加熱し、RT酵素を変性させた。反応性生物を使用するまで氷上に置いた、または、-20℃で長期間保存した。
アガロースゲル電気泳動(前記に示した)によってPCR増幅SCFフラグメントを分離し、短波長のUV光(300nm)かで照射して可視化した。膜結合SCFに対応する829bpのフラグメントは、外科用メスを用いて切り取った。製品の取扱説明書に従い、Advantage TM PCR-Pure Kit(Clontech Laboratories-distributed by Cambridge Bioscience, Cambridge, U.K.)を用いて、mb-SCF DNAをゲル精製した。精製したmb-SCF cDNAを含む上清を新しいチューブに移し、分光光度計により収率および純度を求めた。精製したDNAフラグメントの溶液を-20℃で保存した。
pCR2.1 mb-SCFクローンを、The Advanced Biotechnology ventre, Charring Cross Hospitalで配列決定した。正しいmb-SCF配列および向きを示す1つのクローン(クローン2)を、mb-SCFインサートをpREP8発現プラスミドへとサブクローニングするのに用いた。pREP8哺乳類発現プラスミドはInvitrogenから入手した。このプラスミドは、RSVプロモーターを利用してDNA産物を高レベルで構成的に発現するようにデザインされている。そして、望むクローン化遺伝子の発現のための選択マーカーとして、ヒスチジノール耐性遺伝子を有する。この発現プラスミドは、また、プラスミドをエピソームとして複製できるEpstein Barr Nuclear Antigen-1(EBNA-1)遺伝子およびEpstein Barr Virus(EBV)の複製開始点(oriP)を含む。
ヒトmb-SCFポリペプチドをコードするcDNAクローンを単離し、前記の哺乳類の発現ベクターへとクローニングした。その後、我々は、ウィルス粒子の外被へとポリペプチドを挿入するための次の工程として、パッケージング細胞ラインの表面でmb-SCFを発現することを望んだ。
クローンpREP8 mb-SCFをウィルスパッケージング細胞ラインへと形質転換した。このクローンは、哺乳類の発現ベクターへと挿入されたmb-SCFポリペプチドをコードするcDNAを有する。最初の工程として、大容量のプラスミド精製手法を用いて、クローンからプラスミドDNAを抽出した。新たに形成したコロニーから取った細菌を、5mlのLB brothに植菌するのに用いた。適切な抗生物質の存在下で、12-16時間37℃で、220サイクル/分で攪拌しながら、培地を培養し、300mlのLB brothに植菌するのに使用した(large-scale plasmid pREParation)。適切な抗生物質の存在下で、12-16時間37℃で、300サイクル/分で攪拌しながら、培地を培養した。製品の取扱説明書に従って、Qiagen MaxipREPTM DNA Purification systemを用いて大容量のプラスミドDNAを抽出した。
pREP8 mb-SCFプラスミドで安定に形質移入されたレトロウィルスパッケージング細胞について、PCRによりプラスミドを含むか確認した。簡単に言うと、10%FCSおよび2.5mMヒスチジノールを加えたDMEMを含むT25フラスコ内で増殖させたクローンをトリプシン処理した。トリプシン処理した細胞をPBSで二回洗浄し、500μlのPBSで再懸濁した。2μlの細胞懸濁液を、pREPFおよびEBVRプライマーを含む標準的なホットスタートPCR(前記参照)において鋳型として用いた。
人工的に加工したパッケージング細胞により、SCFの細胞表面での発現を検出するために、標準的な間接免疫蛍光アッセイを用いた。安定に形質移入したパッケージング細胞を、ガラスカバースリップ上で増殖させた。細胞が70%コンフルエントになった時、カバースリップをインキュベーターから取り除き、10分間室温でエタノールを用いて、細胞を固定化した。その後、37℃で30分間、1:5の希釈率のc-kitリガンド/幹細胞増殖因子抗体(ヤギ抗ヒトSCF)(R&D Systems)で、細胞を反応させた。カバースリップを10分間PBSで二回洗浄し、抗IgG FiTCコンジュゲート二次抗体で反応させた。カバースリップを10分間PBSで二回洗浄し、10% PBS/90%グリセロールmauntantでガラススライド上でマウントし、Olympus UV顕微鏡下で観察した。人工的に加工したパッケージング細胞は、濃い蛍光染色によってわかるようにSCFポリペプチドを高レベルで発現しているが、人工的に加工していない細胞は蛍光を発しなかった(図5)。抗体の特異性は、また、人工的に加工した細胞上で非免疫のヤギ血清の使用によっても確認され、シグナルを発しなかった。4つの別のクローンの間において、蛍光を発する細胞のシグナル強度や数に違いは見られなかった。
前記のように、ヒトのmb-SCFポリペプチドをコードするcDNAクローンを単離し、哺乳類発現ベクターへとクローニングした。その後、我々は、パッケージ細胞ラインの表面で、mb-SCFを発現させた。次の工程として、我々は、ウィルス粒子が、ウィルス外被の一部としてmb-SCFを含むレトロウィルスパッケージング細胞に由来するかどうかを求めることを望んだ。
Phoenixエコトロピック細胞ライン、mb-SCF改変エコトロピッククローン3およびアンホトロピックパッケージング細胞ラインを、ウィルスのLTR、パッケージングシグナルおよびレポーター遺伝子(強化緑色蛍光タンパク質(eGFP))をコードするPINCOプラスミドベクターで、リン酸カルシウムを用いて形質移入した(Grignani et al., 1998)。PINCOベクターは、全長のMoloney murine leukaemia virus LTR、伸長したΨ配列およびCMVプロモーターから構成される転写カセット、および強化緑色蛍光タンパク質(eGFP)のcDNAを含む。レトロウィルスバックボーンに加えて、このベクターは、また、エピソームとしてベクターが複製できるEBV oriPおよびEBNA-1遺伝子を含む。このベクターは、また、Dr Gray Nolan(Stanford University, Leyland, USA)により頂いた。一過的なレトロウィルス上清をピューロマイシン(1μl/ml)の選択前に得た。リン酸カルシウム-DNA混合液を取り除き、完全培地中にパッケージング細胞を一晩回収した後、培地を取り除き5mlの新しい培地に移し、細胞を37℃で培養した。ウィルスを含む上清を24時間後に回収し、0.45μフィルター滅菌し、分注して-70℃で保存した。PINCO形質移入細胞を、更に6週間、1μg/mlのピューロマイシンの選抜条件下で増殖させた。レトロウィルスを、一過性の上清と同じ方法で回収した。
レトロウィルスのタイターを求めるために、形質導入したNIH3T3のフローサイトメトリー解析によって、eGFP受容体遺伝子の発現を解析した。これらの細胞は、すでに研究所で入手でき、レトロウィルスタイターを求めるのに使用されている。この細胞を10%FDSを加えたDMEM中で維持した。3つのレトロウィルスパッケージング細胞ライン(Phoenixアンホトロピック;エコトロピックおよびmb-SCF改変エコトロピック)への一過的なおよび安定的なPINCOベクターの形質移入を、NIH3T3で求めた。NIH3T3(5×104)細胞を24穴プレートへ加えた。1μlから100μlの範囲のレトロウィルス上清、10%の熱不活性化FCSを加えたDMEMおよび8μg/mlのポリブレンを含む感染混合液のうち1mlをそれぞれのウェルに加えた。次の日、感染混合液を取り除き、1mlの新しい培地を加えた。37℃で更に48時間培養した。その後、細胞をトリプシン処理し、PBSで二回洗浄し、Leucopermで固定化した。その後、細胞をフローサイトメトリーを用いて解析し、NIH3T3細胞中のeGFPの発現を求めた。形質移入していないNIH3T3細胞の散乱特性を求め、蛍光強度について、レトロウィルスで形質導入した細胞を比較した。全液量が1mlの感染混合液中(完全培地および8μg/mlのポリブレンを含む)中の1、10、100μlのウィルス上清のタイトレーションによって(それぞれ二連ずつ)、タイターを計算した。蛍光細胞のパーセンテージとして求めたポジティブ細胞の頻度を用いた上清の容積に対してプロットした。グラフの角度がレトロウィルスのタイターを表す。レトロウィルスのタイターを感染粒子(IP)/mlとして表現する。
レトロウィルスを、PINCOレトロウィルスベクタープラスミドを用いて、一過的におよび安定に、人工的に加工したエコトロピックパッケージング細胞、クローン3、人工的に加工していないエコトロピックパッケージング細胞およびアンホトロピックパッケージング細胞から産生させた。PINCOプラスミドでの形質移入後48時間で一過的に形質移入した細胞から、および、ピューロマイシン含有培地中で6週間選択された安定形質移入体から、レトロウィルス上清を回収した。4mlのこれらのウィルス上清を、SW55Tiローター(Beckman)を用いて、30,000rpm、1.5時間4℃で超遠心してペレットを得た。上清を捨て、ペレットのレトロウィルス粒子を50μlのPBSで再懸濁し、-70℃で保存した。
我々は、ウィルスパッケージング細胞ライン内で発現する膜結合ポリペプチドを、その細胞ラインに由来するウィルス粒子の表面外被へと挿入できることを明らかにしてきた。我々は、組み込んだポリペプチドが生物学的活性を保持しているかどうかを求めることを望む。mb-SCFポリペプチドは、静止状態の細胞の細胞表面に見られるc-kit受容体タンパク質に結合することができる(Sehgal et al., 1999)。いったん結合すると、細胞を増殖させることができる(Sehgal et al., 1999)。それゆえ、我々は、改変したウィルス粒子がc-kit受容体を発現する細胞ラインの集団に結合して増殖を誘導することができるか求めた。
mb-SCFを発現するレトロウィルス粒子が特異的にc-kit発現細胞に結合するかを調べるために、抗SCFモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーにより明らかにしたように、レトロウィルス結合実験を行った。高レベルのc-kit(SCFの受容体)を発現すると報告されていることから、ヒトの巨核芽球性白血病細胞ライン、Mo7eをレトロウィルス標的実験に用いた。Mo7e細胞を、20%のFCSおよび10ng/mlのGM-CSFを加えたRPMIで維持した。Mo7e細胞を、100μlのレトロウィルス上清と、32℃で1時間培養した。細胞を冷PBSで二回洗浄した。その後、100μlのモノクローナル抗体、83A25を、4℃で1時間、細胞と反応させた。これらの細胞を冷PBSで二回洗浄した。最後に、細胞を、FITC-コンジュゲート-ラット抗マウスIgG抗体と反応させた。その後、細胞を冷PBSで二回洗浄し、フローサイトメトリーで解析した。
mb-SCFタンパク質を含むレトロウィルス粒子の生物学的活性を、標準的な市販の増殖アッセイ、CellTiter 96(登録商標) AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega)を用いて求めた。Mo7e細胞をPBSで二回洗浄し、20%FCSを加えたRPMIで再懸濁した。再懸濁した培地の90μl当りまたは70μl当り5000の細胞を、96穴丸底マイクロタイタープレートへと分注した。Phoenixエコトロピックmb-SCF細胞ラインに由来するレトロウィルス上清(前記で調製した)の10μlまたは30μlを、96穴丸底プレートに加えて、細胞懸濁液の全体容量を100μlとした。増殖アッセイのためのポジティブアッセイは、100ng/mlの精製したリコンビナントヒトSCFの使用を含む。ネガティブコントロールは、サイトカインを含まず、または、Phoenixエコトロピック細胞に由来するウィルス上清を含む。8枚の同一のプレート(それぞれの濃度を3連で行った)を用意し、1枚のプレートは、準備して2時間後のバックグラウンド増殖活性のためのアッセイである。
前記実施例によって、本発明の方法を、ウィルス粒子へと生物活性パッセンジャーペプチド結合部分を組み込むのに使用することができることが示された。ここで、我々は、このようなウィルス粒子が、パッセンジャーペプチド結合部分によって結合している標的細胞を形質導入することができることを示す。
レトロウィルスベクタープラスミド、PINCO
Phoenixエコトロピック細胞ライン(アンホトロピックおよびエコトロピック)からレトロウィルスを得るのに使用されるレトロウィルスベクターは、PINCOと呼ばれている(Grignani et al., 1998; Kinsella and Nolan, 1996)。PINCOベクターは、全長のMoloney murine leukaemia virus LTR、伸長したΨ配列およびCMVプロモーターから構成される転写カセット、および強化緑色蛍光タンパク質(eGFP)のcDNAを含む。レトロウィルスバックボーンに加えて、このベクターは、また、エピソームとしてベクターが複製できるEBV oriPおよびEBNA-1遺伝子を含む。このベクターは、また、Dr Gray Nolan(Stanford University, Leyland, USA)により頂いた。
一次細胞
通常の末梢血幹細胞(PBPC)
通常の個体由来のG-CSF誘導末梢血管は、Stem Cell Laboratory, Hammersmith Hospitalから得た。これらの細胞は、サインしたインフォームドコンセントおよび研究倫理委員会の承認が必要である。
これらの細胞は、すでに研究所にて入手でき、レトロウィルスタイターを求めるのに使用された。これらも、10%FCSを加えたDMEMで維持した。
TF-1細胞ライン、ヒトの赤白血病細胞ラインを、10%FCSおよび1ng/ml GM-CSFを加えたRPMIで維持した(Kitamura et al., 1989)。ヒトの巨核芽球白血病細胞ライン、Mo7eを、20%FCSおよび10ng/ml GM-CSFを加えたRPMIで維持した。ヒトの巨核芽球白血病、LAMA-84を、10%FCSを加えたRPMIで維持した。これらの細胞ラインは、高レベルのc-kit(SCFの受容体)を発現すると報告されているので、レトロウィルス標的試験に使用した。Mo7e細胞も、レトロウィルス粒子のmb-SCFの生物活性を明らかにするために、増殖活性に用いた。Mo7eおよびLAMA-84細胞ライン(Lee et al., 2001; Miyazawa et al., 1995; Seigneurin et al., 1987)は、Dr. Junia Meloから頂いた。TF-1細胞ラインは、研究所で入手できた。
感染効率(MOI)を、NIH3T3細胞でのレトロウィルスタイターに基づいて計算し、少なくとも2のMOIで、レトロウィルス標的試験を行った。MOIが1であることは、標的細胞当り1つの感染レトロウィルス粒子を表す。レトロウィルス、DMEM中の10%FCSおよび8μg/mlポリブレンを含む感染混合液を、37℃、5%CO2 in airで、25,000個の標的細胞と24時間培養した。培地を取り除き、新しい培地で置き換え、37℃、5%CO2 in airで、48時間更に培養した。その後、標的細胞をPBSで二回洗浄し、固定化し、フローサイトメトリーで解析した。
2倍多い産生細胞を用いて、共培養による非接着性造血細胞ラインの形質導入を行った。レトロウィルス産生細胞を、コンフルエントに達するまで増殖させ、トリプシン処理し、2000radsで照射した。細胞を、コンフルエントを維持したまま、6穴マイクロタイタープレートへと再度入れ、37℃、5%CO2 in airで、16-18時間培養した。細胞をPBSで注意深く洗浄し、ログ増殖期(5×104)の標的細胞(TF-1)を、全容量が2mlで加えた。残存する産生細胞活性を制御するために、標的細胞が存在しない擬似形質導入を並行して行った。細胞を、37℃、5%CO2 in airで、24時間培養した。非接着性の細胞を取り除き、新しい6穴マイクロタイタープレートに入れ、ベクターのレポーター遺伝子のアッセイの前に、コンタミした産生細胞の接着を容易にするために、37℃、5%CO2 in airで、更に8時間培養した。その後、非接着性の細胞を新しい培地で再懸濁し、37℃、5%CO2 in airで、48時間培養した。その後、標的細胞をPBSで二回洗浄し、固定化し、フローサイトメトリーによって解析した。
単核細胞の分離
防腐剤フリーのヘパリンを含む、骨髄細胞を、Hank’s Buffered Salt Solution(Gibco)で1:4に希釈した。希釈したサンプルを、Lymphoprep(Nyegaard)上で層状にし、1800rpmで30分間遠心した。単核細胞(MNC)をインターフェースから取り除き、Hank’s Buffered Salt Solution中で、1800rpmで10分間遠心して二回洗浄した。3%酢酸で希釈して任意のコンタミした赤血球を溶菌した後、血球計数器チャンバーを用いて、MNCをカウントした。
製品の取扱説明書に従って、MiniMacsTM system(Miltenyi Biotec)を用いて、MHCからCD+34細胞を分離した。簡単に言うと、MNCを、108のMNC当り500μlで、0.5%ヒト血清アルブミン(Immuno AG)および5mM EDTAとともにカルシウムおよびマグネシウムフリーのPBSを含むバッファーで再懸濁した。100μlの試薬A1(IgGをブロック)およびA2(QBEND/10-CD34を認識するマウスIgG)を細胞に加え、15分間4℃で培養した。細胞を5mlのバッファーで洗浄し、108のMNC当り400μlのバッファーで再懸濁した。100μlの試薬B(試薬A2を認識するコロイド状の超常磁性MACSマイクロビーズ)を細胞に加え、15分間4℃で培養し、前記の洗浄を行った。細胞を500μlのバッファーで再懸濁し、その後、磁石を設置したプレパックのMiniMacsTMカラム(タイプMS)に加え、細胞をパスさせた。標識されたCD34+細胞は、磁石によりカラム内に保持される。500μlのバッファーを加えて、パスさせることによって、これらの細胞を4回洗浄した。カラムを磁石から取り外し、ポジティブ細胞を1mlのバッファーで溶出させた。これらの細胞を、血球計測器を用いてカウントし、FITCをコンジュゲートした、CD34分子の異なるエピトープを認識するHPCA2抗体(Beckton Dickinson)でサンプル細胞を染色することによって純度を求め、FACS解析した。サンプルの純度は、常に約90%であった。
CD+34細胞の形質導入を開始する前の日に、アンホトロピックレトロウィルス外被およびレトロウィルスゲノム(pBabeNeo; Morgenstern and Land, 1990)を含む、安定なAM-12レトロウィルス産生細胞ラインを、2×105細胞/ウェルの濃度で、6穴プレートに加え、10%FDSを加えたDMEMで維持した。形質導入の日に、産生細胞ラインの培地を、10%FCSおよび8μg/mlの濃度のプロタミンスルフェート(トランスウェル添加後に、最終的に4μg/mlになるように釣り合わせた)を加えた、2.5mlの新しいDMEMで置き換えた。0.4μm膜(Costar)を有する24mmトランスウェルを各ウェルに挿入した。CD34+(105)精製細胞を、Iscoves Modified Dulbecco’s Eagles Medium(Gibso)中の30%SCF(MycoplexTM PAA)およびサイトカインミックス(50ng/mlのIL-3、100ng/mlのSCF、10ng/mlのGM-CSF)2.5mlで、再懸濁し、挿入したトランスウェルへと移した。以下に示すCFU-GMの増殖のために、細胞を集める前に、形質導入工程を48時間行い、G418選択が有りまたは無しの半固体培地(メチルセルロース)中で培養した。
CFU-GMアッセイ
CD34+形質導入細胞をトランスウェルから取り除き、Hank’s Buffered Saline Solutionで洗浄した。これらの細胞を、300μlのCFU-GMミックス(50ng/mlのSCF、1ng/mlのGM-CSF、10ng/mlのIL-3および100ng/mlのG-CSFを含む)および1.5mg/mlのG418を加えた3mlのメチルセルロース(MC, Methocult H4230, Stem Cell Technologies)中で培養した。細胞をMC中でよく攪拌した後、35mm直径のペトリディッシュ(Nunclon(登録商標))(1ml/dish)に入れた。そのディッシュを、次々と、150mmの細菌用のペトリディッシュ中に、蒸発による培養培地のロスを少なくするために、滅菌水を含む35mmペトリディッシュ(蓋をしない)とともに置いた。培地を、37℃、加湿した5%CO2 in airで培養した。顕微鏡を挿入したLeica DM1Lを用いて、培養7日めで、50より多い細胞のCFU-GMコロニーをスコア付けした。
形質導入効率
各CD+34形質導入実験の効率を、1.5mg/mlの濃度のG418を含む培地中で、14日間培養後に生存したCFU-GMコロニーの割合から計算した。以下に、より簡単に記載する。
実験データを図11から17に示す。全てのデータは、対応するアンホトロピックパッケージング細胞ライン(すなわちPhoenixアンホトロピックパッケージング細胞)にパッケージングされた同じウィルスベクターから得られるものと比較して、形質導入効率として表した。
実施例1および2において、ウィルス粒子へと組み込まれるペプチドをコードするcDNAをヒト細胞ラインからクローニングし、ウィルスパッケージング細胞ライン内で発現させた。当然、ウィルス粒子内へ1つより多いペプチドを組み込むことは可能である。
例えば、以下の手法を使用して、ウィルス粒子へと抗体フラグメントを組み込むことができる。
HMFG1およびHu HMFG1のVH重鎖およびVκ軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、WO 94/10323の図15に示され、Verhoeyen et al (1993) Immunology 78, 364-370で与えられている。両方ともリファレンスによって本出願に組み込まれる。
本発明のウィルス粒子による、静止状態の標的細胞の形質導入を容易にするという能力は、以下のようにテストされる。
以下の実施例は、遺伝子運搬のための、本発明のウィルス粒子を使用する方法を記載する。ウィルス粒子は、パッセンジャーペプチド結合部分を発現するウィルスパッケージング細胞に由来する。以下に示す実験は、例えば、幹細胞ペプチド結合部分を組み込んだウィルス粒子が、in vivoで、遺伝子運搬ベクターとして機能するかを調べるために、行うことができる。明らかに、実験に用いる組織は、ウィルス粒子が標的とする細胞タイプに依存して変えることができる。
本発明のウィルス粒子の組合せで形質移入した細胞を、PBSで洗浄し、室温で10分間PBS中の0.1%グルタルアルデヒドで固定化し、その後、PBSで二回洗浄し、X-gal溶液(5mM K3Fe(CN)6, 5mM K4Fe(CN)6:3H2O, 2mM MgCl2, 200μg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド(N-N-ジメチルホルムアミド中))で、20-24時間室温で反応させる。細胞中のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子産物の発現は、顕微鏡で、インジゴブルー色として検出できる。
解剖後直後の、マウスに由来する全組織をPBSで洗浄し、1%ホルムアルデヒド、0.2%グルタルアルデヒド、2mM MgCl2、5mM EDTA、0.02% NP-40からなる溶液で固定化する。1時間後に、PBSで洗浄することによって、余分な固定剤を取り除き、PBS中の染色剤(5mM K3Fe(CN)6, 5mM K4Fe(CN)6:3H2O, 2mM MgCl2, 0.02% NP-40, 1mg/ml X-gal[5-ブロモ-4-クロロ-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド;Promega, Madison Wisc, USA])と、暗黒下で一晩サンプルを反応させる。全ての手順は、室温で行う。サンプルを低パワー光の顕微鏡で調べ、全組織内の青色に染色した領域をスコア付けし、その代わりに確認のために、切片(1-2mm)を染色組織領域から切り取り、高倍率で観察するすることができる。
以下の実施例により、中枢神経系の細胞へと遺伝子を運搬するために、本発明のウィルス粒子を使用する方法を記載する。ウィルス粒子は、中枢神経系の細胞に特異的に結合することができるパッセンジャーペプチド結合部分を発現するウィルスパッケージング細胞に由来する。用いることができるペプチドの例は、この業界の当業者に知られており、例えば、AMPAおよびNMDA受容体に対する抗体(Pickard et al., 2000)またはアルファ(2A)-アドレノレセプター(Hurt, et al., 2000)である。
PINCOおよびpBabe MLVレトロウィルスに基づくレトロウィルスベクターを使用する前述の実施例に対して、この方法は、ただ単に本発明の例示を目的とし、本発明を制限することを意味しない。以下は、パッセンジャーペプチド結合部分を有するウィルス粒子を産生するための、本発明の方法に使用できる他のウィルスベクターの例である。
本発明の前記したウィルス粒子は、経口投与および非経口投与(例えば、皮下投与または筋内投与)を含む任意の一般的な方法によって投与することができる。投与の好ましい方法は、ウィルス粒子はエアロゾルとして産生される、鼻孔吸入スプレー方法による。このような方法は、遺伝治療薬を肺上皮細胞へと効果的に伝達する方法として、嚢胞性繊維症の遺伝子治療において使用されている。治療は、治療期間にわたる一回の投与または複数回の投与からなる。
本発明のウィルス粒子を単独で投与することができるが、1つまたは複数の許容できる担体とともに、医薬調合物として与えることが好ましい。担体は、本発明のウィルス粒子と相性が良く、受容者に有害でないという意味で、「許容できる」必要がある。一般的に、担体は、滅菌して発熱性物質を含まない水または生理食塩水である。
以下の調合AおよびBを、ポビドン溶液とともに、成分の湿式造粒によって調製し、その後、ステアリン酸マグネシウムを加えて圧縮する。
当該調合物は、ポビドン溶液とともに成分(以下)の湿式造粒によって調製され、その後、ステアリン酸マグネシウムを添加し、圧縮する。
調合A
カプセル調合物は、前記実施例Cの調合Dの成分を混合し、2つの部分を有するハードゼラチンのカプセルに満たすことによって調製する。調合B(以下)を同様に調製する。
以下の放出を制御したカプセル調合物は、エクストルーダーを用いて成分a、b、cを押し出し、その後、球形にし乾燥させて調製する。乾燥したペレットを、その後、放出制御膜(d)でコートし、2つの部分を有するハードゼラチンのカプセルに満たす。
(Remington:The Science and Practise of Pharmacy, 19th ed., The Philadelphia College of Pharmacy and Science, ISBN 0-912734-04-3を参照せよ)
Cleland (1997), Pharm. Biotechnol. 10:1-43, Lee (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 11:81-84, Cleland et al. (2001) J. Control. Release 72:13-24およびTakeuchi et al. (2001) Adv. Drug. Delic. Rev. 47:39-54に記載されたもののような、ミクロスフィア調合物用いても、本発明のウィルス粒子を伝達することができる。
本発明のウィルス粒子は、Ansel (1999) Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Lippincott Williams and Wilkinsに記載されているように、微粉化した粒子を伝達する乾燥粉末用定量吸入器により、吸入によって伝達することができる。
本発明のウィルス粒子は、Ansel (1999) Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Lippincott Williams and Wilkinsに記載されているように、非CFC高圧ガスを使用した、微粉化した粒子を伝達する適した定量吸入器により、吸入によって伝達することができる。
Claims (40)
- 改変した細胞結合活性を有するウィルス粒子を調製する方法であって、
(i)第一の細胞結合活性を有するウィルス粒子をコードするウィルス核酸を含むウィルスパッケージング細胞を供給すること;
(ii)前記ウィルスパッケージング細胞が、パッセンジャーペプチド結合部分をコードする核酸も含むこと(ただし、前記パッセンジャーペプチド結合部分は、キメラまたは融合ペプチドではない);
(iii)前記ウィルス核酸およびパッセンジャーペプチド結合部分をコードする核酸を発現し、第一の細胞結合活性を改変するために、前記パッセンジャーペプチド結合部分がウィルス粒子へと組み込まれるように、パッセンジャーペプチド結合部分が細胞の膜で供給され、ウィルス粒子がパッケージング細胞の膜から出芽すること;
を含むウィルス粒子を調製する方法。 - 前記ペプチド結合部分が、細胞の外側の原形質膜で供給される、請求項1に記載の方法。
- 前記ウィルス粒子がレトロウィルスベクターに由来する、請求項1または2に記載の方法。
- 前記パッセンジャーペプチド結合部分が細胞増殖因子である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増殖因子が、膜結合幹細胞因子である、請求項4に記載の方法。
- 前記パッセンジャーペプチド結合部分が、抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ペプチド結合部分が、標的細胞に特異的な表面抗原を認識する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ペプチド結合部分が、標的細胞に特異的な細胞表面受容体およびそのリガンドを含む結合ペアのメンバーの少なくとも一部である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウィルスパッケージング細胞ラインが、標的細胞内でまたは標的細胞上で活性である生物活性物質を供給するために発現することができる付加的な核酸を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物活性物質が、病気または疾患の予防および/または治療および/または診断において使用される、請求項9に記載の方法。
- 前記生物活性物質が、直接または間接的な細胞毒性機能を有する、請求項9に記載の方法。
- 前記生物活性物質が、リシン;腫瘍壊死因子;インターロイキン-2;インターフェロン-ガンマ;リボヌクレアーゼ;デオキシリボヌクレアーゼ;シュードモナスエキソトキシンA;およびカスパーゼのうちのいずれか1つである、請求項11に記載の方法。
- 前記生物活性物質が、比較的に非毒性のプロドラッグを細胞毒性ドラッグへと変換することができる酵素である、請求項9に記載の方法。
- 前記細胞活性物質が、シトシンデアミナーゼまたはチミジンキナーゼのいずれかである、請求項13に記載の方法。
- 前記改変した細胞結合活性により、ウィルス粒子を標的細胞へと結合させることができる、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的細胞が哺乳類の細胞である、請求項15に記載の方法。
- 前記標的細胞がヒトの細胞である、請求項15に記載の方法。
- 前記標的細胞が静止状態の細胞である、請求項15に記載の方法。
- 前記標的細胞がヒトの造血幹細胞である、請求項15に記載の方法。
- 前記標的細胞が癌細胞である、請求項15に記載の方法。
- 前記標的細胞が哺乳類のT細胞である、請求項15に記載の方法。
- 請求項1から21のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、改変された生物結合活性を有するウィルス粒子であって、前記改変した生物結合活性が、キメラ状のウィルスの外被ポリペプチド以外のペプチドによって付与されるウィルス粒子。
- 請求項1から22のいずれか一項に記載の方法によって得られる改変した細胞結合活性を有するウィルス粒子。
- (1) 標的細胞に対して改変した結合活性を有する、請求項22または23に記載のウィルス粒子を、標的細胞タイプを含む細胞の集団に曝して、ウィルス粒子に結合させ;
(2)その後、標的細胞に結合したウィルス粒子を、細胞集団から分離し;
(3)任意に、ウィルス粒子を、その後で、標的細胞から除去する;
大集団の細胞から濃縮された標的細胞タイプの集団を調製する方法。 - 請求項1から21のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるウィルス粒子の集団に由来する、パッセンジャーペプチド結合部分を組み込んだウィルス粒子のタイターを増す方法であって、
i)パッセンジャーペプチド結合部分が結合する支持体を供給すること;および
ii)前記支持体にウィルス粒子の集団を曝すこと;および、任意に、
iii)前記支持体に結合しないウィルス粒子から支持体に結合するウィルス粒子を単離すること;
を含む、ウィルス粒子のタイターを増す方法。 - パッセンジャーペプチド結合部分を組み込んだウィルス粒子を増幅した、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるウィルス粒子の調製物であって、タイターが少なくとも105ifu/mlであるウィルス粒子を有する調製物。
- 更に医薬的に許容できる賦形剤および/または担体を含む、請求項26に記載の調製物。
- 病気まはた疾患の診断および/または予防および/または治療のための医薬品の製造における、請求項22または23に記載のウィルス粒子、または請求項26または27に記載のウィルス粒子の調製物の使用。
- 関節炎の予防および/または治療のための医薬品の製造における、請求項22または23に記載のウィルス粒子、または請求項26または27に記載のウィルス粒子の調製物の使用。
- 前記ウィルス粒子が、パッセンジャーペプチド結合部分として、CD5に結合する結合分子を組み込んでいる、請求項29に記載の使用。
- 前記ウィルス粒子が、パッセンジャーペプチド結合部分として、膜結合幹細胞因子を組み込んでいる、請求項29に記載の使用。
- 癌の診断および/または予防および/または治療のための医薬品の製造における、請求項22または23に記載のウィルス粒子、または請求項26または27に記載のウィルス粒子の調製物の使用。
- 前記癌が卵巣癌である、請求項32に記載の使用。
- 前記ウィルス粒子が、パッセンジャーペプチド結合部分として、膜結合幹細胞因子を組み込んでいる、請求項32または33に記載の使用。
- 前記ウィルス粒子が、OPCMLポリペプチドをコードする遺伝子を含む、請求項32から34のいずれか一項に記載の使用。
- 請求項22または23に記載のウィルス粒子、または請求項26または27に記載のウィルス粒子の調製物を含む遺伝子運搬用組成物。
- 請求項32から35のいずれか一項に記載のウィルス粒子、または請求項26または27に記載のウィルス粒子の調製物を含む欠陥遺伝子を有する哺乳類を治療するための医薬組成物であって、in vivoで骨髄へと移植することによって、または、血液へと注入することによって、病気または疾患を診断および/または予防および/または治療するための生物活性物質をコードする核酸物質が、細胞集団のゲノムへと挿入される、組成物。
- ワクチンの製造における、請求項22または23に記載のウィルス粒子、または請求項26または27に記載のウィルス粒子の調製物の使用。
- 哺乳類のT細胞に抗原性ペプチドを提示するのに使用するための調製物の製造における、請求項22または23に記載のウィルス粒子、または請求項26または27に記載のウィルス粒子の調製物の使用。
- 請求項10から23のいずれか一項に記載のウィルス粒子、または請求項26または27に記載のウィルス粒子の調製物、および医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物。
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