WO1998046742A2 - Dictyocaulus viviparus antigen zur diagnose des lungenwurmbefalls und zur vakzinierung - Google Patents

Dictyocaulus viviparus antigen zur diagnose des lungenwurmbefalls und zur vakzinierung Download PDF

Info

Publication number
WO1998046742A2
WO1998046742A2 PCT/EP1998/002090 EP9802090W WO9846742A2 WO 1998046742 A2 WO1998046742 A2 WO 1998046742A2 EP 9802090 W EP9802090 W EP 9802090W WO 9846742 A2 WO9846742 A2 WO 9846742A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
seq
dna
glu
cdna
Prior art date
Application number
PCT/EP1998/002090
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO1998046742A3 (de
Inventor
Joachim Hofmann
Karlheinrich Schmid
Annette Pauli
Original Assignee
Hoechst Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Aktiengesellschaft filed Critical Hoechst Aktiengesellschaft
Priority to AU76426/98A priority Critical patent/AU7642698A/en
Priority to EP98924107A priority patent/EP0975757A2/de
Publication of WO1998046742A2 publication Critical patent/WO1998046742A2/de
Publication of WO1998046742A3 publication Critical patent/WO1998046742A3/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43536—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from worms
    • C07K14/4354—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from worms from nematodes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Definitions

  • Dictyocaulus viviparus antigen for the diagnosis of lung worm infestation and for vaccination.
  • the invention relates to an antigen from the adult stages of the lung worm Dictyocaulus viviparus (hereinafter also called D. viviparus or Dictyocaulus) of the bovine, with which one can detect lung worm infestation in cattle immunodiagnostically.
  • D. viviparus Dictyocaulus viviparus
  • the antigen can cause immune protection against D. viviparus.
  • Lungworms are particularly pathogenic and economically important for small and large ruminants.
  • Dictyocaulus is the only lung worm that reaches sexual maturity in cattle. It occurs worldwide where temperate temperatures of 15-20 ° C prevail at least at times.
  • D. viviparus is common in Europe in the large floodplains, rainy coastal areas, but also on alpine pastures (R. Jörgensen (1980) Vet. Parasitol. 7, 153-167; H. Pfeiffer (1976) Vienna. Tierärztl. Mschr. 63 , 54-55). In the Netherlands e.g. Clinical dictyocaulosis was found in over 77% of the calf groups kept on pastures (J. Boch, R. Supperer (1992) Veterinary Parasitology. 4th ed., Parey, Berlin, pp. 294-301).
  • the uptake of the third larvae with the pasture grass causes the disease (dictyocaulosis) in the calf exposed for the first time.
  • the larvae reach the alveoli of the lungs through the bloodstream, which they break through to reach the air-carrying parts of the lungs.
  • Breathing is made considerably more difficult, also by the adult stages leading to obstructions in the upper respiratory tract.
  • Visible consequences of the severe impairment of the general condition reduced weight gain or even weight loss combined with growth retardation. Sometimes the clinical symptoms worsen dramatically and quickly lead to death.
  • Lungworm disease in cattle can be diagnosed on the basis of clinical symptoms (G. Gräfner (1987) Monthly Vet. Med. 42: 178-181) or on the basis of the larvae excreted with the faeces (J. Boch, R. Supperer (1992).
  • These options are particularly suitable for diagnosis on single animals if there is a strong infection, but modern mass animal husbandry requires epidemiological predictions and risk assessments regarding the outbreak of dictyocaulosis in the advanced grazing season based on appropriate diagnostics, ie in surveys many may still weak infected calves are tested with a safe, sensitive method.
  • serological methods suitable A. Bellmer, T. Schnieder, AM Tenter (1989) Proc. 13 th Conf. Wrld Ass.
  • the invention relates to a new, immunogenic, native protein, called DV 17, which was isolated from adult worms of Dictyocaulus viviparus. Its immunogenicity is mainly due to the fact that, after subcutaneous application, it induces an antibody response in cattle, which gives the animal immune protection.
  • This protein can also be used in the ELISA for retrospective immunodiagnosis of dictyocaulosis in cattle.
  • DV 17 is characterized by the following physical properties. The protein is stable in all buffers used. A reduction in the immunoreactivity after freezing (-85 ° C) of the purified antigen could not be determined.
  • DV 17 has an estimated molecular weight of approx. 16500 daltons in SDS polyacrylamide gel (Phastgel 8-25%).
  • the isoelectric point of DV 17 is in the range of 5.3-5.9.
  • proteolysis with endopeptidase Lys C the partial amino acid sequences according to Table 1 were determined. As a biological property, the inhibition of development of Dictyocaulus viviparus in cattle is outstanding after vaccination.
  • the object of the invention is therefore an immunogenic protein with a protective effect, which is isolated from adult worms of the lung worm Dictyocaulus viviparus and which preferably has a molecular weight of 15000-18000 Da, an isoelectric point between 5.3-5.9 and partial amino acid sequences according to Table 1.
  • a preferred object of the invention is a protein which has a molecular weight of 16500 ⁇ 1500 Da and / or an isoelectric point of 5.6.
  • Another object of the invention is a protein, characterized in that it contains the amino acid sequence according to Table 6 (SEQ ID NO .: 30) or parts thereof.
  • Another object of the invention is a method for isolating a protein in which the isolation is carried out with the aid of extraction methods and chromatographic methods known to the person skilled in the art.
  • Another object of the invention is a DNA coding for a protein as described above, preferably a DNA which contains a DNA sequence according to Table 1.
  • Another object of the invention is a DNA, characterized in that it
  • (a) contains a DNA sequence according to Table 6 (SEQ ID NO .: 29) or parts thereof or
  • the invention further relates to a method for isolating said DNA, in which
  • the oligonucleotides produced according to a) are radioactively or non-radioactively labeled and c) from a cDNA bank, produced from Dictyocaulus viviparus, cDNA clones are isolated which hybridize with the hybridization samples produced according to b) under stringent conditions.
  • Another object of the invention is a method for isolating said DNA, in which
  • RNA is used as the template for the PCR reaction, which is first reverse-transcribed in an additional step and the resulting cDNA first strand is used for PCR.
  • Another object of the invention is a recombinant protein containing partial amino acid sequences according to Table 1, which is preferably obtainable by expression of a cDNA obtained as described above in prokaryotes or eukaryotes and purification by methods known to those skilled in the art.
  • the invention also relates to an immunochemical method using the above-described protein from D. viviparus, with which the amount of DV 17-specific antibodies in the blood of cattle is determined by incubating EL 17 plates coated with DV 17 with bovine serum to be examined and any DV 17 / antibody complexes formed by peroxidase-conjugated, polyclonal antibodies and a corresponding color reaction known to the person skilled in the art.
  • Another object of the invention is the use of the above-described protein from D. viviparus as a vaccine, combined with a carrier or adjuvant and, if appropriate, auxiliaries for immunizing cattle against dictyocaulosis.
  • Another object of the invention is a diagnostic kit containing the protein of D. viviparus described above.
  • an object of the invention is a vaccine containing the protein of D. viviparus described above as well as a carrier, an adjuvant and optionally auxiliary substances.
  • Table 3 PCR fragments obtained from DV RACE cDNA using the degenerate primers from Table 2
  • Table 6 cDNA and protein sequence of DV17.
  • Chromatographically separated protein fractions obtained from homogenized, adult lungworms were further separated using SDS polyacrylamide gel electrophoresis and immobilized on Immobilon P membranes (semidry blotting).
  • the lung worm-specific protein DV 17 was then detected with the specific infection sera and further purified using a reverse phase HPLC column.
  • the purity of the protein fraction was checked in silver-colored SDS polyacrylamide gels (phast gels).
  • the BCA protein assay was used to determine the protein concentration in electrophoretically pure DV 17 fractions and to freeze them at -85 ° C. Helminthennaive cattle were vaccinated twice with a defined amount of purified DV 17.
  • the cattle were challenged with L3 larvae of Dictyocaulus viviparus 1 week after the second vaccination. Animals that were not vaccinated served as controls. 4 weeks after the challenge, the cattle were slaughtered, the number of adult worms determined in the lungs and the length of the male and female worms measured. As The reduction in the number of adult worms compared to the non-vaccinated control was defined as a measure of immune protection.
  • the PCR conditions are to be determined in preliminary tests using any method known to those skilled in the art.
  • Example 2 Obtaining adult lungworms
  • 6-month-old, helminthennaive cattle were orally infected with 5000 third larvae of Dictyocaulus viviparus; the following day, the animals received the same dose of infection.
  • the cattle were slaughtered 28 days after infection and after the section adult worms are collected from the lungs.
  • the worms were then washed 3 times with phosphate-buffered saline, weighed and stored at -85 ° C until working up.
  • the concentrated Superdex 75 prep grade fraction was mixed in a 1: 2 ratio with reduced SDS buffer; 40 ⁇ l of each / sample well was applied to an SDS Excel gel (Pharmacia).
  • the electrophoresis was carried out in the Multiphor II chamber (from Pharmacia) under standardized running conditions (600 V, 50 mA, 30 W, running time: 90 min).
  • the electrophoretically separated proteins were transferred to Immobilon P membranes by means of "semidry blotting" (Tovey ER, Baldo BA. Electrophoresis.
  • bovine normal serum was incubated (Dilution 1:20 used) After washing 3 times with TBS + 0.05% Tween 20, the blot film was incubated with a biotin-labeled goat anti-bovine IgG (H + L) antibody (1: 500; Pierce) for 1 hour After washing three times (TBS + 0.05% Tween 20), the mixture was incubated for 1 hour with the enzyme conjugate biotin-streptavidin-alkaline phosphatase (1: 2500; Pierce). The substrate development was carried out using the Biorad substrate kit leads.
  • the protein was further purified by means of HPLC.
  • a Nucleosil C 18 5U column from Alltech was used (150 mm x 4.6 mm).
  • the protein was eluted using a linear buffer gradient (buffer A: ultrapure water + 0.1% trifluoroacetic acid (TFA); buffer B: acetonitrile + 0.1% TFA).
  • 500 ⁇ l of the fraction concentrated in Example 4 were diluted 1: 2 with buffer A and then injected into the column. The flow rate was 0.5 ml / min. The gradient elution was started 5 minutes after injection and ended 10 minutes later. A retention time of 14 min was measured for DV 17.
  • Example 7 Purity detection and molecular weight determination
  • the fraction purified by HPLC with a retention time of 14 min was treated with an SDS-polyacrylamide gel (Phast SDS-Gel 8-25%) in the phast system (Fa. Pharmacia) analyzed under standardized conditions.
  • the "Silver Stain SDS-PAGE Standards, low range” kit from Biorad was used as the molecular weight marker.
  • DV 17 was visualized by means of silver staining after electrophoresis (Silverstain Kit, from Pharmacia).
  • the molecular weight determination was carried out using a video densitometer (Molecular analyst, from Biorad) using the "Profile analyst II" evaluation program. A molecular weight of 16,500 ⁇ 1,500 daltons was calculated for DV 17.
  • DV 17 isolated according to Example 6 was diluted with ultrapure water and applied to prefabricated focusing gels (IEF Phastgels pH 3-10, Pharmacia). The focus in the phast system was carried out under standardized conditions. In order to determine the isoelectric point of DV 17, marker proteins with a defined, isoelectric point (pH 3.5 - 9.3 from Pharmacia) were carried along. The result was an isoelectric point from 5.3 to 5.9.
  • DV 17 (40 ⁇ g) isolated and enriched according to Example 6 was cleaved with the aid of endopeptidase Lys C and the resulting peptides were purified using a C 18 reserve phase HPLC. 7 peptides were sequenced at the N-terminal. The seven partial amino acid sequences according to Table 1 were identified.
  • Example 11 ELISA for the serological detection of a dictyocaulosis
  • ELISA plates (Maxisorb from Nunc) were coated with a concentration of 5 ⁇ g DV 17 / ml PBS; the reaction volume was 100 ul per well. After incubation for 1 hour at 37 ° C., the plates were washed 3 times in an ELISA washer, the washing volume per well was 200 ⁇ l. Ultrapure water + 0.1% Tween 20 was used as the washing solution. Unspecific binding sites were blocked by incubation (3 hours at room temperature) with a proteolytic mixture of gelatin (Boehringer Mannheim). The incubation was carried out on a microtiter plate shaker at a shaking frequency of 300 rpm.
  • D. viriparus total RNA was isolated by means of "DYNABEADS” (DYNABEADS mRNAdirekt hit, DYNAL). 400 ng of these were precipitated with ethanol and used as a template for a RACE (re-amplification of cDNA ends; Frohmann et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998-9002) cDNA synthesis, the "Marathon cDNA Amplification Kit” (Clontech) was used. The cDNA adapter-specific primers from the kit mentioned and the "Expand Long Template PCR System” (Boehringer Mannheim) were used. Conditions: 600 nM from each primer; 1, 75mM MgCI 2 , 400mM dNTPs, 392ng Taq Start Antibody (Clontech), 0.35U DNA Polymerase Mix. The temperature profile was as follows:
  • the amplified DV17 RACE cDNA was diluted 1:20 in Tris-Glycine buffer (from the Marathon cDNA Amplification Kit) for use as a template in PCR reactions.
  • a region of the DV17 cDNA sequence was PCR amplified from the RACE cDNA using degenerate primers whose sequences were obtained from the peptide sequences of the purified antigen.
  • the primers were provided with restriction enzyme sites in such a way that the subsequent subcloning of the PCR fragments obtained was facilitated.
  • the primers used are listed in Table 2. Five DNA fragments were obtained after 2 rounds of PCR in a PE 9600 Thermal Cycler (Perkin Elmer) (500 nM of each primer; 0.1 vol PCR buffer; 200 mM dNTP's; 1.25 units of the Ampli Taq Gold (Perkin Elmer The following temperature profile was available:
  • the RACE reactions contained concentrations of 600 nM of each primer; 0.2 ul of diluted, amplified DV17 RACE cDNA; 0.1 vol of PCR buffer I; 200 ⁇ M dNTPs and 1.25 U Ampli Taq Gold.
  • the temperature profile was the same as in the PCR reaction with the non-degenerate primers except that the annealing temperature was 60 ° C and the samples were left at 72 ° C for 360 s in the last cycle.
  • 2 PCR fragments were obtained (Table 5). After RACE, the fragments were gel purified, subcloned and sequenced using a T7 promoter sequencing primer (Promega; sequence: TAATACGACTCACTATAGGG, SEQ ID NO .: 31).
  • GTN GCN GAR CAY YTN AAR SEQ ID NO .: 12
  • A055 / 1001 A055 / 1004 180 Yes
  • A055 / 1001 A055 / 1005 480 No.
  • A055 / 1002 A055 / 1004 150 Yes
  • A055 / 1002 A055 / 1005 470 Yes
  • A055 / 1003 A055 / 1005 400 Yes * determined by gel electrophoresis
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • MOLECULE TYPE Protein
  • CHARACTERISTICS
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein immunogenes Protein (DV 17) aus dem Lungenwurm Dictyocaulus viviparus mit protektiver Wirkung, Verfahren zu dessen Isolierung, Verfahren zur Isolierung der zugehörigen DNA-Sequenz, Herstellung des Proteins auf gentechnologischem Wege, Verwendung des Proteins in Diagnostik-Kits und als Vakzine.

Description

Dictyocaulus viviparus Antigen zur Diagnose des Lungenwurmbefalls und zur Vakzinierung.
Die Erfindung betrifft ein Antigen aus den adulten Stadien des Lungenwurms Dictyocaulus viviparus (im folgenden auch D. viviparus oder Dictyocaulus genannt) des Rindes, mit dem man immundiagnostisch Lungenwurmbefall bei Rindern nachweisen kann. In einer Vakzine kann das Antigen Immunschutz gegen D. viviparus hervorrufen.
Lungenwürmer haben insbesondere bei kleinen und großen Wiederkäuern eine große pathogene und wirtschaftliche Bedeutung. Dictyocaulus ist der einzige beim Rind Geschlechtsreife erlangende Lungenwurm. Er kommt weltweit dort vor, wo zumindest zeitweise gemäßigte Temperaturen von 15-20°C herrschen. Endemisch ist D. viviparus in Europa in den großen Flußauen, regenreichen Küstengebieten aber auch auf alpinen Almen verbreitet (R . Jörgensen (1980) Vet. Parasitol. 7, 153-167; H. Pfeiffer (1976) Wien. Tierärztl. Mschr. 63, 54-55). In den Niederlanden wurde z.B. bei über 77 % der auf Weiden gehaltenen Kälbergruppen klinische Dictyokaulose festgestellt (J. Boch, R. Supperer (1992) Veterinärmedizinische Parasitologie. 4. Aufl., Parey, Berlin, S. 294-301 ).
Die Aufnahme der dritten Larven mit dem Weidegras verursacht beim erstmals exponierten Kalb die Erkrankung (Dictyokaulose). Die Larven erreichen auf dem Blutweg die Alveolen der Lungen, die sie durchbrechen, um in die luftführenden Teile der Lunge zu gelangen. Dabei werden Läsionen erzeugt, die als Eintrittspforte für bakterielle Sekundärinfektionen dienen; die Vermehrung von Bakterien und anderer mikrobieller Erreger führt zu begrenzten oder generalisierten Lungenentzündungen mit allen möglichen Folgeerscheinungen wie Lungenödem und Herzversagen (T. Schnieder, A. Bellmer, F.-J. Kaup (1989) Wien. Tierärztl. Mschr. 76: 372-476). Die Atmung wird, auch durch die in den oberen Atmungswegen zu Obstruktionen führenden adulten Stadien, erheblich erschwert. Sichtbare Folgen der starken Beeinträchtigung des Allgemeinbefindens sind verminderte Gewichtszunahmen oder gar Gewichtsverluste verbunden mit Wachstumsverzögerungen. Bisweilen verschlimmem sich die klinischen Symptome dramatisch und führen rasch zum Tod.
Die Lungenwurmerkrankung der Rinder kann anhand der klinischen Symptomatik (G. Gräfner (1987) Monatsh. Vet. med. 42: 178-181 ) oder anhand der mit dem Kot ausgeschiedenen Larven diagnostiziert werden (J. Boch, R. Supperer (1992). Diese Möglichkeiten eignen sich vor allem für die Diagnose am Einzeltier, wenn eine starke Infektion vorliegt. Zu der modernen Massentierhaltung werden jedoch, basierend auf einer geeigneten Diagnostik, epidemiologische Voraussagen und Risikoeinschätzungen bezüglich des Ausbruchs einer Dictyokaulose in der fortgeschrittenen Weidesaison benötigt; d.h. in Surveys müssen viele, möglicherweise noch schwach infizierte Kälber mit einer sicheren, sensiblen Methode untersucht werden. Hierzu sind serologische Methoden geeignet (A. Bellmer, T. Schnieder, A.M. Tenter (1989) Proc. 13th Conf. Wrld Ass. Adv. Vet. Parasit., S. 33, Berlin, 07.-11.08.1989). In Dictyocaulus viviparus identifizierte, isoliert und teilweise rekombinant dargestellte Antigene werden zur Serodiagnostik genutzt. Für die Heilbehandlung der Dictyokaulose können gegen adulte und juvenile Stadien wirksame Medikamente eingesetzt werden (z.B. Levamisol®, (Pro) Benzimidazole, Netomin®, Ivermectin®). Diese Präparate sind hochwirksam und können somit durch akute Lungenwurmerkrankungen bedingte Ausfälle meist verhindern (H. Mehlhom, D. Düwel, W. Raether (1993) Diagnose und Therapie der Parasitosen von Haus-, Nutz- und Heimtieren. 2. Aufl. Gustav Fischer Verlag, S. 223-227). Bei einer prophylaktischen/metaphylaktischen Behandlung lassen die Wirkstoffe aufgrund ihrer radikalen Wirksamkeit möglicherweise die Auseinandersetzung des Parasiten mit dem Immunsystem des Wirtes und somit die Ausbildung und Aufrechterhaltung einer belastbaren (Teil) Immunität nicht zu. Die Tiere sind dann einer Infektion im zweiten Weidejahr ungeschützt ausgesetzt (COBS, D.E., S.R. Pitt, J. Förster, M.T. Fox (1987) Res. Vet. Sei. 43: 273-275). Deshalb wird in letzter Zeit aus epidemiologischer Sicht immer häufiger eine Immunisierung der Kälber der ersten Weidesaison gefordert, entweder durch geringgradige subklinische Infektion oder durch Vakzinierung. Zur Zeit steht nur eine Lebendvakzine in Form röntgenattenuierter Larven zur Verfügung, die Grundimmunität hervorruft, die durch weitere natürliche Infektion aufrecht erhalten werden muß (Mehlhorn H., et al., (1993)). Bei ungenügender Nachimmunisierung über natürliche Infektion kommen gelegentlich bei plötzlicher, starker Exposition Durchbrüche mit Husten und Erkrankungen vor. Da die Vakzine selbst im Kühlschrank nur etwa 3 Wochen haltbar ist, muß sie sorgfältig aufbewahrt und rasch eingesetzt werden. Dieses Procedere verbietet einen „flächendeckenden" Einsatz; die Vakzine bleibt deshalb in erster Linie speziellen Endemiegebieten vorbehalten. Aufgrund der mangelnden Stabilität und Qualität ist die Entwicklung definierter Vakzinen (Subunitvakzine) erforderlich. Es stellte sich nun die Aufgabe, die aufgeführten Nachteile der derzeitigen Vakzinierungsmethode durch Bereitstellung eines neuen, vorteilhaften Impfstoffes zu beseitigen. Diese Aufgabe wurde durch die vorliegende Erfindung gelöst.
Die Erfindung betrifft ein neues, immunogenes, natives Protein, genannt DV 17, welches aus adulten Würmern von Dictyocaulus viviparus isoliert wurde. Seine Immunogenität begründet sich vor allem dadurch, daß es nach subcutaner Applikation im Rind eine Antikörperantwort induziert, die dem Tier Immunschutz verleiht. Ferner kann dieses Protein im ELISA zur retrospektiven Immundiagnose der Dictyokaulose im Rind verwendet werden. DV 17 ist durch folgende physikalische Eigenschaften charakterisiert. Das Protein ist beständig in allen verwendeten Puffern. Eine Verminderung der Immunreaktivität nach Tiefgefrierung (-85°C) des gereinigten Antigens konnte nicht festgestellt werden. Für Antigen DV 17 wurde unter Verwendung eines HPLC-Systems und einer Nucleosil C 18-Säule (150 mm x 4.6 mm; 5 u) eine Retentionszeit von 14 min. gemessen (Gradientenelution bestehend aus Aqua dest / 0.1 % TFA (= 0 % B) und Acetonitril / 0.1 % TFA (= 100 % B)). DV 17 hat im SDS-Polyacrylamidgel (Phastgel 8-25 %) ein geschätztes Molekulargewicht von ca. 16500 dalton. Der isoelektrische Punkt von DV 17 liegt im Bereich von 5.3-5.9. Letztlich wurden nach Proteolyse mit Endopeptidase Lys C die Teilaminosäuresequenzen gemäß Tabelle 1 ermittelt. Als biologische Eigenschaft ist die Entwicklungshemmung von Dictyocaulus viviparus im Rind nach Vakzination herausragend.
Die Erfindung hat daher zum Gegenstand ein immunogenes Protein mit protektiver Wirkung, welches aus adulten Würmern des Lungenwurms Dictyocaulus viviparus isoliert wird und welches bevorzugt ein Molekulargewicht von 15000-18000 Da, einen isoelektrischen Punkt zwischen 5.3-5.9 und Aminosäureteilsequenzen gemäß Tabelle 1 aufweist.
Ein vorzugsweiser Gegenstand der Erfindung ist ein Protein, welches ein Molekulargewicht von 16500 ± 1500 Da und / oder einen isoelektrischen Punkt von 5.6 hat.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz gemäß Tabelle 6 (SEQ ID NO.: 30) oder Teile davon enthält.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung eines Proteins bei dem die Isolierung mit Hilfe von dem Fachmann bekannten Extraktionsmethoden und chromatographischen Methoden durchgeführt wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine DNA, kodierend für ein Protein wie oben beschrieben, vorzugsweise eine DNA, die eine DNA-Sequenz gemäß Tabelle 1 enthält.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie
(a) eine DNA-Sequenz gemäß Tabelle 6 (SEQ ID NO.: 29) oder Teile davon enthält oder
(b) unter stringenten Bedingungen mit einer DNA-Sequenz gemäß (a) hybridisiert. Ferner ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Isolierung der genannten DNA, bei welchem
a) degenerierte Oligonukleotide, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Tabelle 1 oder Teile davon hergestellt werden,
b) die gemäß a) hergestellten Oligonukleotide radioaktiv oder nicht-radioaktiv markiert werden und c) aus einer cDNA-Bank, hergestellt aus Dictyocaulus viviparus, cDNA-Klone isoliert werden, die mit den nach b) hergestellten Hybridisierungs-proben unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung der genannten DNA, bei welchem
a) PCR-Primer, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Tabelle 1 oder Teile davon oder enthaltend eine Oligo-dT-Sequenz hergestellt werden,
b) mit den so erzeugten PCR-Primeren aus einer cDNA-Bank, hergestellt aus Dictyocaulus viviparus, PCR-Fragmente generiert werden,
c) welche kloniert und nach gängigen Methoden analysiert werden und
d) zur Vervollständigung der cDNA-Sequenz durch Hybridisierungsverfahren wie oben beschrieben an Stelle der degenerierten Oligonukleotide verwendet werden.
Das zuletzt beschriebene Verfahren kann auch so abgewandelt werden, daß für die PCR-Reaktion als Matrize RNA benutzt wird, die in einem zusätzlichen Schritt zunächst revers transkribiert und der so entstandene cDNA-Erststrang zur PCR verwendet wird. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein rekombinantes Protein, enthaltend Aminosäureteilsequenzen gemäß Tabelle 1 , welches vorzugsweise durch Expression einer wie oben beschrieben erhaltenen cDNA in Prokaryonten oder Eukaryonten und Aufreinigung nach dem Fachmann bekannten Methoden erhältlich ist.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein immunchemisches Verfahren unter Verwendung des oben beschriebenen Proteins von D. viviparus, mit welchem die Menge an DV 17 spezifischen Antikörpern im Blut von Rindern bestimmt wird, indem man mit DV 17 beschichtete ELISA-Platten mit zu untersuchendem Rinderserum inkubiert und gegebenenfalls gebildete DV 17 / Antikörper-komplexe durch Peroxidase-konjugierte, polyklonale Antikörper und eine entsprechende, dem Fachmann bekannte Farbreaktion nachweist.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des oben beschriebenen Proteins von D. viviparus als Vakzine, verbunden mit einem Carrier oder Adjuvans und ggf. Hilfsstoffen zur Immunisierung von Rindern gegen Dictyokaulose.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist ein Diagnostik-Kit, enthaltend das oben beschriebene Protein von D. viviparus.
Schließlich ist ein Gegenstand der Erfindung eine Vakzine, enthaltend das oben beschriebene Protein von D. viviparus sowie einen Carrier, ein Adjuvans sowie ggf. Hilfsstoffe.
Die Erfindung wird nun anhand von Beispielen näher erläutert, ohne darauf beschränkt zu sein. Die Tabellen sind wie folgt beschrieben:
Tabelle 1 : Teilaminosäuresequenzen des isolierten und angereicherten DV 17- Proteins aus Dictyocaulus viviparus und die daraus ableitbare degenerierte Nukleotidsequenz. Abkürzungen: N = A, G, C, T; Y = T, C; H = A, C, T; R = A, G; M = A, C Tabelle 2: Degenerierte Primer, die zur Amplifizierung von DV17 DNA dienen, Abkürzungen siehe Beschreibung zu Tabelle 1
Tabelle 3: PCR-Fragmente, die von DV RACE cDNA erhalten worden sind, unter Benutzung der degenerierten Primer aus Tabelle 2
Tabelle 4: Genspezifische Primer aus RACE-Experimenten zur Erzeugung von DV17 cDNA mit vollständigem 3'-Ende des Moleküls
Tabelle 5: DV17 cDNA-Fragmente erhalten durch RACE
Tabelle 6: cDNA und Protein-Sequenz von DV17.
Für die Identifizierung von Protein DV 17 wurden Normalseren und Infektionsseren von Rindern verwendet, die mit gastrointestinalen Nematoden wie Ostertagia ostertagi und Cooperia oncophora sowie dem Lungenwurm Dictyocaulus viviparus infiziert waren.
Chromatographisch aufgetrennte Proteinfraktionen gewonnen aus homogenisierten, adulten Lungenwürmern wurden mit Hilfe der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese weiter aufgetrennt und auf Immobilon P-Membranen immobilisiert (Semidry- Blotting). Das lungenwurmspezifische Protein DV 17 wurde anschließend mit den spezifischen Infektionsseren detektiert und mittels Umkehrphasen-HPLC-Säule weiter aufgereinigt. Die Reinheit der Proteinfraktion wurde in silber-gefärbten SDS- Polyacrylamidgelen (Phastgele) überprüft. Mittels BCA-Proteinassay wurde die Proteinkonzentration in elektrophoretisch reinen DV 17-Fraktionen bestimmt und bei -85°C tiefge-froren. Helminthennaive Rinder wurden 2 mal mit jeweils einer definierten Menge von gereinigtem DV 17 vakziniert. Die Rinder wurden 1 Woche nach der zweiten Vakzination mit L3-Larven von Dictyocaulus viviparus belastet (Challenge). Nicht vakzinierte Tiere dienten als Kontrolle. 4 Wochen nach dem Challenge wurden die Rinder geschlachtet, in der Lunge die Anzahl adulter Würmer bestimmt und die Länge der männlichen und weiblichen Würmer gemessen. Als Maß für den Immunschutz wurde die Reduktion der Anzahl adulter Würmer im Vergleich zur nicht vakzinierten Kontrolle definiert.
„Stringente Bedingungen" in Zusammenhang mit DNA-Hybridisierung bedeutet in der vorliegenden Anmeldung 6xSSC, 68°C.
Die PCR-Bedingungen sind nach jedem Fachmann bekannten Methoden in Vorversuchen zu bestimmen.
Beispiel 1 : Herstellung von Infektionsseren
Helminthennaive Rinder im Alter von 6 Monaten wurden mit unterschiedlichen Dosen von dritten Larven verschiedener Nematodenspezies (Dictyocaulus viviparus, Ostertagia ostertagi, Cooperia oncophora) infiziert. Die Infektions-dosen betrugen in der Dictyocaulus-Gruppe 2500, 1250 und 500 Larven / Rind; je Dosis wurden 3 Tiere verwendet. Für die Ostertagia-Gruppe wurden Infektionsdosen von 70 000, 30 000 und 15 000 Larven / Rind gewählt. Neben einer nicht infizierten Gruppe (= Negativkontrolle) wurde zusätzlich eine gemischte Gruppe mitgeführt, in der jedes Rind mit 2 500 Dictyocaulus Larven, 10 000 Ostertagia Larven und 10 000 Cooperia Larven infiziert wurde. An den Tagen DO (= Tag der Infektion), D +21 , D +40, D +56, D +70, D +84, D +98 und D +112 wurden von jedem Rind Serumproben gewonnen, die aliquotiert bei -25°C aufbewahrt wurden. Die Seren wurden zur Identifizierung des Dictyocaulusantigens DV 17 in elektrophoretisch, chromatographisch aufgetrennten Proteinfraktionen sowie zur Beurteilung der Spezifität verwendet.
Beispiel 2: Gewinnung adulter Lungenwürmer
6 Monate alte, helminthennaive Rinder wurden mit jeweils 5000 dritten Larven von Dictyocaulus viviparus oral infiziert; am darauffolgenden Tag erhielten die Tiere die gleiche Infektionsdosis. 28 Tage nach der Infektion wurden die Rinder geschlachtet und nach der Sektion adulte Würmer aus den Lungen gesammelt. Die Würmer wurden anschließend 3x mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen, gewogen und bei -85°C bis zur Aufarbeitung gelagert.
Beispiel 3: Extraktion von DV 17 aus adulten Lungenwürmern
10 g gefrorene Wurmmasse wurde bei Raumtemperatur aufgetaut und anschließend mit 40 ml 0.025 M Tris-HCI-Lösung pH 7.4 + 2 mM Pefabloc® im Gewebehomogenisator homogenisiert. Zur Entfernung grober Gewebe-bestandteile wurde das Homogenat bei 3010 g und 4°C 15 min zentrifugiert und das Pellet verworfen. Der Überstand wurde bei 4°C für 20 min bei 39 800 g zentrifugiert und der Überstand unter den gleichen Bedingungen 10 min rezentrifugiert. Der klare Überstand wurde nach Filtration mit 1.2 μm-Filtem in 1 Liter phospatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) über Nacht bei 4°C dialysiert (cut off der Dialysemembran 8000).
Beispiel 4: Präparative Gelfiltration
Der dialysierte Überstand wurde bei 39 800 g 15 min zentrifugiert und der klare Überstand im Pharmacia-FPLC-System mittels präparativer Gelfiltrationssäule (Säulentyp XK 16 / 60; Trennmedium: Superdex 75 prep grade, Säulenvolumen: 124 ml) aufgetrennt. Zur Elution wurde PBS pH 7.4 verwendet. Die Fraktionen mit den Retentionsvolumina 65 - 75 ml wurden gesammelt und mit Ultrafiltrationsmodulen (cut off 3000) aufkonzentriert. Mit einem amplifizierten Western Blot wurde Protein DV 17 nachgewiesen. Beispiel 5: Western Blot-Analyse
Die aufkonzentrierte Superdex 75 prep grade-Fraktion wurde im Verhältnis 1 :2 mit reduziertem SDS-Puffer gemischt; davon wurden jeweils 40 μl / Probenvertiefung auf ein SDS-Excelgel (Fa. Pharmacia) aufgetragen. Die Elektrophorese wurde in der Multiphor Il-Kammer (Fa. Pharmacia) unter standardisierten Laufbedingungen (600 V, 50 mA, 30 W, Laufzeit: 90 min) durchgeführt. Die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine wurden mittels „Semidry-Blotting" (Tovey ER, Baldo BA. Electrophoresis. 8, 1987, 384-387) auf Immobilon P-Membranen transferiert (Transferbedingungen: 45 min, konstante Stromstärke 0.8 mA / cm2) und nach einer 24 stündigen Blockphase mit 3 %igem Rinderserumalbumin in Tris gepufferter Kochsalzlösung (TBS) mit einem Dictyocaulus-spezifischem Immunserum (gewonnen am D +40, siehe Beispiel 1 ) in einer Verdünnung von 1 :20 1 Stunde inkubiert. Als Negativ-kontrolle wurde Rindernormalserum (Verdünnung 1 :20 verwendet). Nach 3 maligem Waschen mit TBS + 0.05 % Tween 20 wurde die Blotfolie mit einem Biotin-markierten Ziege anti Rind IgG (H+L) Antikörper (1 :500; Fa. Pierce) für 1 Stunde inkubiert. Nach 3-maligem Waschen (TBS + 0.05 % Tween 20) erfolgte eine 1 stündige Inkubation mit dem Enzymkonjugat Biotin-Streptavidin- Alkalische Phosphatase (1 :2500; Fa. Pierce). Die Substratentwicklung wurde mit dem Substratkit der Fa. Biorad durchgeführt.
Beispiel 6: Umkehrphasen - HPLC
Nach der immunologischen Identifizierung von DV 17 in den präparativen Gelfiltrationsfraktionen wurde das Protein mittels HPLC weiter aufgereinigt. Zu diesem Zweck wurde eine Nucleosil C 18 5U-Säule der Firma Alltech verwendet (150 mm x 4.6 mm). Das Protein wurde mit Hilfe eines linearen Puffergradienten eluiert (Puffer A: Reinstwasser +0.1 % Trifluoressigsäure (TFA); Puffer B: Acetonitril + 0.1 % TFA). 500 μl der in Beispiel 4 aufkonzentrierten Fraktion wurden mit Puffer A 1 :2 verdünnt und dann in die Säule injiziert. Die Flußrate betrug 0.5 ml / min. Die Gradientenelution wurde 5 min nach Injektion gestartet und 10 min später beendet. Für DV 17 wurde eine Retentionszeit von 14 min gemessen. Beispiel 7: Reinheitsnachweis und Molekulargewichtsbestimmung
Die mittels HPLC aufgereinigte Fraktion mit einer Retentionszeit von 14 min wurde mit einem SDS-Polyacrylamidgel (Phast SDS-Gel 8-25 %) im Phastsystem (Fa. Pharmacia) unter standardisierten Bedingungen analysiert. Als Molekulargewichtsmarker wurde der „Silver Stain SDS-PAGE Standards, low range"-Kit der Fa. Biorad verwendet. DV 17 wurde nach der Elektrophorese mittels Silberfärbung sichtbar gemacht (Silverstain Kit, Fa. Pharmacia). Die Molekulargewichtsbestimmung wurde mit einem Videodensitometer (Molecular analyst, Fa. Biorad) mittels Auswertungsprogramm „Profile analyst II" durchgeführt. Für DV 17 wurde ein Molekulargewicht von 16 500 ± 1 500 dalton berechnet.
Beispiel 8: Bestimmung des isoelektrischen Punktes
Gemäß Beispiel 6 isoliertes DV 17 wurde mit Reinstwasser verdünnt und auf vorgefertigte Fokussiergele (IEF Phastgele pH 3 - 10, Fa. Pharmacia) aufge-tragen. Die Fokussierung im Phastsystem erfolgte unter standardisierten Bedingungen. Zwecks Bestimmung des isoelektrischen Punktes von DV 17 wurden Markerproteine mit definiertem, isoelektrischem Punkt (pH 3.5 - 9.3 Fa. Pharmacia) mitgeführt. Es ergab sich ein isoelektrischer Punkt von 5.3 - 5.9.
Beispiel 9: Aminosäuresequenzanalyse
Gemäß Beispiel 6 isoliertes und angereichertes DV 17 (40 μg) wurde mit Hilfe von Endopeptidase Lys C gespalten und die resultierenden Peptide mit einer C 18- Reserve Phase HPLC aufgereinigt. 7 Peptide wurden N-terminal ansequenziert. Es wurden die sieben Teilaminosäuresequenzen gemäß Tabelle 1 identifiziert.
Beispiel 10: Nachweis eines protektiven Effekts von DV 17
5 Monate alte, helminthennaive Bullenkälber (Stallaufzucht, koproskopischer Nachweis negativ) wurden mit jeweils 50 μg gereinigtem, nativem DV 17 subcutan vakziniert. 4 Wochen später erfolgte eine Boostervakzination mit 45 μg Antigen / Rind. Die Tiere wurden 1 Woche nach der 2. Vakzination mit jeweils 2 x 1000 L3- Larven von Dictyocaulus viviparus belastet (= Challenge). Nicht vakzinierte Tiere dienten als Kontrolle. 35 Tage nach dem Challenge wurden die Tiere geschlachtet und in der Lunge die Anzahl adulter Würmer bestimmt; gleichzeitig wurde die Länge intakter männlicher und weiblicher Würmer gemessen. In der vakzinierten Gruppe wurde eine um 80 % reduzierte Anzahl adulter Würmer gefunden. Adulte Würmer aus der vakzinierten Gruppe waren im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant kleiner (Reduktion 33 %).
Beispiel 11 : ELISA zum serologischen Nachweis einer Dictyokaulose
ELISA-Platten (Maxisorb der Fa. Nunc) wurden mit einer Konzentration von 5 μg DV 17 / ml PBS beschichtet; das Reaktionsvolumen betrug 100 μl pro Vertiefung. Nach einer Inkubation von 1 Stunde bei 37°C wurden die Platten 3 mal im ELISA washer gewaschen, das Waschvolumen pro Vertiefung betrug 200 μl. Als Waschlösung wurde Reinstwasser +0.1 % Tween 20 verwendet. Unspezifische Bindungsstellen wurden durch Inkubation (3 Stunden bei Raumtemparatur) mit einem proteolytischem Gemisch von Gelatine (Fa. Boehringer Mannheim) blockiert. Die Inkubation erfolgte auf einem Mikrotiterplatten-Schüttler bei einer Schüttelfrequenz von 300 rpm. Nach 3-maligem Waschen wurden die Vertiefungen mit einer 1 :200- Verdünnung spezifischer Infektions- und Kontrollseren beschickt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Als Nachweisantikörper wurde nach 3-maligem Waschen Peroxidase-konjugierte, polyklonale Kaninchenantikörper gegen bovines IgG (Fc-Fragment spezifisch; Fa. Dianova) in einer Verdünnung von 1 :10 000 verwendet; die Inkubation dauerte 30 min. Die Platten wurden anschließend 4 mal gewaschen und dann mit Substratlösung inkubiert (Zusammensetzung: 5 ml 10-fach konzentrierter ABTS-Puffer + 45 ml Reinstwasser + 1 Tablette ABTS (* 50 mg ABTS). Die Substratentwicklung erfolgte bei Raumtemperatur und wurde im ELISA- Reader alle 10 min bei 414 nm überwacht. Dictyocaulus-spezifische Antikörper waren im ELISA frühestens 28 Tage nach einer Lungenwurminfektion nachweisbar. Beispiel 12: Klonierung und Sequenzierung des DV17 Antigens
Mittels "DYNABEADS" (DYNABEADS mRNAdirekt hit, DYNAL) wurde D. viriparus Gesamt RNA isoliert. 400 ng davon wurden mit Ethanol präzipitiert und als Matrize für eine RACE (Re-Amplification of cDNA ends; Frohmann et al., 1988, Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 85:8998-9002) cDNA-Synthese benutzt, wobei der "Marathon cDNA Amplification Kit" (Clontech) verwendet wurde. Es wurden die cDNA Adapterspezifischen Primer aus dem genannten Kit und das "Expand Long Template PCR System" (Boehringer Mannheim) verwendet. Bedingungen: 600 nM von jedem Primer; 1 ,75mM MgCI2, 400 mM dNTPs, 392 ng Taq Start Antibody (Clontech), 0,35 U DNA Polymerase Mix. Das Temperaturprofil war wie folgt:
Zyklus 1 92°C 120 s
60°C 60 s
68°C 360 s
Zyklen 2-30 92°C 60 s
60°C 60 s
68°C 360 s
Die amplifizierte DV17 RACE cDNA wurde 1 :20 in Tris-Glycin Puffer (aus dem Marathon cDNA Amplification Kit) zur Benutzung als Matrize in PCR-Reaktionen verdünnt.
Eine Region der DV17 cDNA-Sequenz wurde ausgehend vonder RACE-cDNA mittels PCR amplifiziert, wobei degenerierte Primer benutzt wurden, deren Sequenzen aus den Peptidsequenzen des gereinigten Antigens erhalten wurden. Die Primer wurden dabei so mit Restriktionsenzymschnittstellen versehen, daß die spätere Subklonierung der erhaltenen PCR-Fragmente erleichtert wurde. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 2 aufgelistet. Fünf DNA-Fragmente wurden erhalten nach 2 Runden PCR in einem PE 9600 Thermal Cycler (Perkin Eimer) (500 nM eines jeden Primers; 0,1 Vol PCR-Puffer; 200 mM dNTP's; 1 ,25 Einheiten der Ampli Taq Gold (Perkin Eimer). Folgendes Temperaturprofil lag vor:
Zyklus 1 92°C 600 s
Zyklen 2-31 94°C 40 s
55°C 40 s
72°C 60 s
Vier der Fragmente (siehe Tabelle 3) wurden in genügend großen Ausbeuten erhalten, um gelgereinigt und mit Hilfe der zur Herstellung benutzten Primer sequenziert zu werden.
Ein Alignment der erhaltenen Sequenzdaten unter Verwendung des Programms "Geneworks" (IntelliGenetics) ergäbe zwei Contigs. Zusammengenommen enthielten diese 5 oder 6 unzweideutige Peptidsequenzen.die vom nativen Antigen erhalten wurden. Nicht-degenerierte (genspezifische) Primer (siehe Tabelle 4), die aus diesen Sequenzdaten erhalten wurden, wurden in RACE-Experimenten mit den Marathon cDNA-Adaptor-spezifischen Primern benutzt, um DNA-Fragmente zu erhalten, die das 3'-Ende des cDNA-Moleküls darstellen.
Die RACE-Reaktionsansätze enthielten Konzentrationen von 600 nM eines jeden Primers; 0,2 μl von verdünnter, amplifizierter DV17 RACE cDNA; 0,1 Vol an PCR- Puffer I; 200 μM dNTPs und 1 ,25 U Ampli Taq Gold. Das Temperaturprofil war dasselbe wie in der PCR-Reaktion mit den nicht-degenerierten Primem außer daß eine Annealing Temperatur von 60°C vorlag und die Proben im letzten Zyklus für 360 s bei 72°C belassen wurden. Mit den genspezifischen Primem ergaben sich 2 PCR-Fragmente (Tabelle 5). Nach der RACE wurden die Fragmente gelgereinigt, subkloniert und unter Verwendung eines T7 Promotor Sequenzierungs Primers (Promega; Sequenz: TAATACGACTCACTATAGGG, SEQ ID NO.: 31 ) sequenziert.
Ein Alignment mit den Sequenzen dieser Fragmente und von den Fragmenten, die mit den nicht-degenerierten Primem erhalten wurden, wurde durchgeführt (Geneworks) und ist in Tabelle 6 dargestellt.
Tabelle 1
1 5
Ser Glu Ser Leu Tyr Glu Lys (SEQ ID NO.: 1 )
TCN GAR UCN YTN TAY GAR AAR (SEQ ID NO.: 8)
1 5
Met Met Asp Asn Phe Val Lys (SEQ ID NO.: 2)
ATG ATG GAY AAY TTY GTN AAR (SEQ ID NO.: 9)
1 5 10
Tyr Lys Asp Glu Asn Glu Phe Met Asp Ala
TAY AAR GAY GAR AAY GAR TTY ATG GAY GCN
14
Leu Lys Gin Lys (SEQ ID NO.: 3)
YTN AAR CAR AAR (SEQ ID NO.: 10) 1 5 10
4. Tyr Asp lle Pro Glu Gin Tyr Arg Glu lle TAY GAY ATH CCN GAR CAR TAY MGN GAR ATH
15 20 lle Pro Gin Asn Val Ala Glu His Leu Lys (SEQ ID NO.: 4)
ATH CCN CAR AAY GTN GCN GAR CAY YTN AAR (SEQIDNO.: 11)
1 5 10
5. Asp Ala lle Glu Lys Tyr Glu Asp lle Pro GAY GCN ATH GAR AAR TAY GAR GAY ATH CCN
15 20
Glu Gin Tyr Arg Glu lle lle Pro Gin Asn
GAR CAR TAY MGN GAR ATH ATH CCN CAR AAY
25
Val Ala Glu His Leu Lys (SEQ ID NO. 5)
GTN GCN GAR CAY YTN AAR (SEQ ID NO.: 12)
1 5 10
6. Phe His Ala Glu Leu Leu Ala Gly lle Lys TTY CAY GCN GAR YTN YTN GCN GGN ATH AAR
15
Pro Ser Leu Glu Glu Leu Lys Lys (SEQ ID NO.: 6)
CCN TCN YTN GAR GAR YTN AAR AAR (SEQ ID NO : 13) 1 5 10
Gin Phe Pro lle Leu Thr Ser Val Phe Ser CAR TTY CCN ATH YTN ACN TCN GTN TTY TCN
14 (SEQ ID NO.: 7) Asn Glu Glu Lys (SEQIDNO.: 14) AAY GAR GAR AAR
Tabelle 2
Oligo Orientierung DNA/Aminosäuresequenz
A055/1001 sense CCG GAA TTC GAY GCN ATN GAR AAR TAY GA
(SEQIDNO.: 15) EcoRI D A I E K Y E
(SEQ ID NO.: 16)
A055/1002 sense CGC GGA TCC GAR ATN ATN CCN CAR AAY GT
(SEQIDNO.: 17) BamHI E l I P Q N V
(SEQIDNO.: 18)
A055/1003 sense CCG GAA TTC TAY AAR GAY GAR AAY GAR TT
(SEQIDNO.: 19) EcoRI Y K D E N E F
(SEQ ID NO.: 20) A055/1004 antisense AAAA CTG CAG NGC RTC CAT RAA YTC RTT YTC
(SEQIDNO.: 21) Pstl A D M F E N E
(SEQ ID NO.: 22) A055/1005 antisense AAAA CTG CAG YTTYTC YTC RTT RCT RAA NAC
(SEQ ID NO.: 23) Pstl K E E N S F V
(SEQ ID NO.: 24)
Tabelle 3
Primer Kombination ungefährte Fragment-Größe (bp)* sequenziert
A055/1001 :A055/1004 180 Ja
A055/1001 :A055/1005 480 Nein
A055/1002:A055/1004 150 Ja
A055/1002:A055/1005 470 Ja
A055/1003:A055/1005 400 Ja * bestimmt durch Gelelektrophorese
Tabelle 4
A075/1001 GAC ATG CAT GTA GAC GCA CTT GGA GAA GAG GC
(SEQ ID NO.: 25) Nsil V D A L G E E A
(SEQ ID NO.: 26) A108/1001 CCG GAA TTC CCT GAA CAG TAC AGA GAG ATC ATT CCA
(SEQ ID NO.: 27) EcoRI P E Q Y R E I I P
(SEQI ID NO.: 28) Tabelle 5
Primer Kombination* Fragment Größe (bp) Klonierungsvektor (Promega) A075/1001.AP1 342 pGEM7Zf- A108/1001: AP 1 541 pGEM3Z
*AP1 ist der Marothon cDNA-Adapter-spezifische Primer
Tabelle 6
TGGAGAARTA CGAAGATATT CCTGAACAGT ACAGAGAGAT CATTCCACAA
E K Y E D I P E Q Y R E I I P Q AACGTGGCCG AGCATTTAAA ATCGATAACT GAGGAAGAGA AAAAAGTGCT N V A E H L K S I T E E E K K V L CAAAGAATTT GTTAAAGACT ATGCAAAATA CAAAGATGAA AATGAGTTCA K E F V K D Y A K Y K D E N E F M TGGACGCATT AAAGCAAAAA TCTGAAAGCC TTTATGAGAA AGCTAAAAAA
D A L K Q K S E S L Y E K A K K CTTCAAGATT TGCTGAAATC AAAAGTAGAC GCACTTGGAG AAGAGGCAAA L Q D L L K S K V D A L G E E A K ACAATTTGTG ATGAAGCTTA TCGCTGAGGC TCGTAAATTC CACGCAGAGC Q F V M K L I A E A R K F H A E L TACTGGCCGG CATCAAACCA TCGCTAGAAG AACTAAAAGC CGTCGCTAAA
L A G I K P S L E E L K A V A K AAGCATATTG AAGAGTTTGA GAAGTTATCA GATGCAGCTA AAGATGATTT K H I E E F E K L S D A A K D D F CAAAAAGCAA TTCCCTATCC TCACATCCGT GTTCAGCAAT GAAAAAGCAA K K Q F P I L T S V F S N E K A K AGAAAATGAT GGACAACTTT GTGAAAAATT AAAGTTGTAT GATTTGCAGG K M M D N F V K N (SEQ ID NO.: 30)
(63 "ON 01 D3S) OV WWWWW
WWWWW WWWWW VWWVWOl IVWIIOIW VIVWOIVIV
02 Z0/86da/XOd ZfrZ,9fr/86 OΛV SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Hoechst Aktiengesellschaft
(B) STRASSE: -
( C) ORT : Frankfurt
(D) BUNDESLAND: -
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: 65926
(G) TELEPHON: 069-305-3005 (H) TELEFAX: 069-35-7175 (I) TELEX: 41234700 ho d
(ii) ANMELDETITEL: Dictyocaulus viviparus Antigen zur Diagnose des Lungenwurmbefalls und zur Vakzinierung
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 30
(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
Ser Glu Ser Leu Tyr Glu Lys
1 5
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
( B ) LAGE : 1..7
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
Met Met Asp Asn Phe Val Lys 1 5 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..14
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
Tyr Lys Asp Glu Asn Glu Phe Met Asp Ala Leu Lys Gin Lys 1 5 10
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..20
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
Tyr Asp lle Pro Glu Gin Tyr Arg Glu lle lle Pro Gin Asn Val Ala 1 5 10 15
Glu His Leu Lys 20
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 26 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..26
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
Asp Ala lle Glu Lys Tyr Glu Asp lle Pro Glu Gin Tyr Arg Glu lle 1 5 10 15 lle Pro Gin Asn Val Ala Glu His Leu Lys 20 25 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 18 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..18
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
Phe His Ala Glu Leu Leu Ala Gly lle Lys Pro Ser Leu Glu Glu Leu 1 5 10 15
Lys Lys
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..14
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
Gin Phe Pro lle Leu Thr Ser Val Phe Ser Asn Glu Glu Lys 1 5 10
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: exon
(B) LAGE: 1..21
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8: TCNGARUCNY TNTAYGARAA R 21
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 9: (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: exon
(B) LAGE: 1..21
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9: ATGATGGAYA AYTTYGTNAA R 21
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 42 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: exon
(B) LAGE: 1..42
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10: TAYAARGAYG ARAAYGARTT YATGGAYGCN YTNAARCARA AR 42
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 60 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: exon
(B) LAGE: 1..60
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11: TAYGAYATHC CNGARCARTA YMGNGARATH ATHCCNCARA AYGTNGCNGA RCAYYTNAAR 60
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 78 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: exon
(B) LAGE: 1..78
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12: GAYGCNATHG ARAARTAYGA RGAYATHCCN GARCARTAYM GNGARATHAT HCCNCARAAY 60 GTNGCNGARC AYYTNAAR 78
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 54 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: exon
(B) LAGE: 1..54
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13: TTYCAYGCNG ARYTNYTNGC NGGNATHAAR CCNTCNYTNG ARGARYTNAA RAAR 54
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 42 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: exon
(B) LAGE: 1..42
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14: CARTTYCCNA THYTNACNTC NGTNTTYTCN AAYGARGARA AR 42
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 29 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: exon ( B ) LAGE : 1. .29
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15: CCGGAATTCG AYGCNATNGA RAARTAYGA 29
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..7
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
Asp Ala lle Glu Lys Tyr Glu 1 5
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 17:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 29 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: exon
(B) LAGE: 1..29
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17: CGCGGATCCG ARATNATNCC NCARAAYGT 29
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 18:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE : 1..7
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18: Glu lle lle Pro Gin Asn Val 1 5
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 19:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 29 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: exon
(B) LAGE: 1..29
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19: CCGGAATTCT AYAARGAYGA RAAYGARTT 29
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 20:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..7
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:
Tyr Lys Asp Glu Asn Glu Phe 1 5
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 21:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 31 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: exon
(B) LAGE: 1..31
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21: AAAACTGCAG NGCRTCCATR AAYTCRTTYT C 31 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 22:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..7
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:
Ala Asp Met Phe Glu Asn Glu 1 5
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 23:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 31 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: exon
(B) LAGE: 1..31
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23: AAAACTGCAG YTTYTCYTCR TTRCTRAANA C 31
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 24:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..7
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:
Lys Glu Glu Asn Ser Phe Val 1 5
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 25:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 32 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: exon
(B) LAGE: 1..32
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25: GACATGCATG TAGACGCACT TGGAGAAGAG GC 32
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 26:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..8
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:
Val Asp Ala Leu Gly Glu Glu Ala 1 5
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 27:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: exon
(B) LAGE: 1..36
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27: CCGGAATTCC CTGAACAGTA CAGAGAGATC ATTCCA 36
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 28:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein ( ix ) MERKMALE :
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..9
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:
Pro Glu Gin Tyr Arg Glu lle lle Pro 1 5
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 29:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 560 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: exon
(B) LAGE: 1..562
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:
TGGAGAARTA CGAAGATATT CCTGAACAGT ACAGAGAGAT CATTCCACAA AACGTGGCCG 60
AGCATTTAAA ATCGATAACT CAGGAAGAGA AAAAAGTGCT CAAAGAATTT GTTAAAGACT 120
ATGCAAAATA CAAAGATGAA AATGAGTTCA TGGACGCATT AAAGCAAAAA TCTGAAAGCC 180
TTTATGAGAA AGCTAAAAAA CTTCAAGATT TGCTGAAATC AAAAGTAGAC GCACTTGGAG 240
AAGAGGCAAA ACAATTTGTG ATGAAGCTTA TCGCTGAGGC TCGTAAATTC CACGCAGAGC 300
TACTGGCCGG CATCAAACCA TCGCTAGAAG AACTAAAAGC CGTCGCTAAA AAGCATATTG 360
AAGAGTTTGA GAAGTTATCA GATGCAGCTA AAGATGATTT CAAAAAGCAA TTCCCTATCC 420
TCACATCCGT GTTCAGCAAT GAAAAAGCAA AGAAAATGAT GGACAACTTT GTGAAAAATT 480
AAAGTTGTAT GATTTGCAGG ATATGAAATA AATGTTAAAT TGAAAAAAAA AAAAAAAAAA 540
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AG 562
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 30:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 159 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..159 (xi) SΞQUENZBΞSCHRΞIBUNG: SEQ ID NO: 30:
Glu Lys Tyr Glu Asp lle Pro Glu Gin Tyr Arg Glu lle lle Pro Gin 1 5 10 15
Asn Val Ala Glu His Leu Lys Ser lle Thr Glu Glu Glu Lys Lys Val 20 25 30
Leu Lys Glu Phe Val Lys Asp Tyr Ala Lys Tyr Lys Asp Glu Asn Glu 35 40 45
Phe Met Asp Ala Leu Lys Gin Lys Ser Glu Ser Leu Tyr Glu Lys Ala 50 55 60
Lys Lys Leu Gin Asp Leu Leu Lys Ser Lys Val Asp Ala Leu Gly Glu 65 70 75 80
Glu Ala Lys Gin Phe Val Met Lys Leu lle Ala Glu Ala Arg Lys Phe 85 90 95
His Ala Glu Leu Leu Ala Gly lle Lys Pro Ser Leu Glu Glu Leu Lys 100 105 110
Ala Val Ala Lys Lys His lle Glu Glu Phe Glu Lys Leu Ser Asp Ala 115 120 125
Ala Lys Asp Asp Phe Lys Lys Gin Phe Pro lle Leu Thr Ser Val Phe 130 135 140
Ser Asn Glu Lys Ala Lys Lys Met Met Asp Asn Phe Val Lys Asn 145 150 155

Claims

Patentansprüche
1. Immunogenes Protein DV 17 mit protektiver Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein aus adulten Würmern des Lungenwurms Dictyocaulus viviparus isoliert wird.
2. Protein, gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Protein ein Molekulargewicht von 15 000 - 18 000 Dalton, einen isoelektrischen Punkt zwischen 5.3 und 5.9 und Aminosäureteilsequenzen gemäß Tabelle 1 aufweist.
3. Protein, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Protein ein Molekulargewicht von 16 500 ± 1 500 Dalton hat und einen isoelektrischen Punkt von 5.6 hat.
4. Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz gemäß Tabelle 6 (SEQ ID NO.: 30) oder Teile davon enthält.
5. Verfahren zur Isolierung eines Proteins, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung mit Hilfe von Extraktionsmethoden und chromatographischen Methoden durchgeführt wird.
6. DNA, kodierend für ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
7. DNA, gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine DNA-Sequenz gemäß Tabelle 1 enthält.
8. DNA gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie
(a) eine DNA-Sequenz gemäß Tabelle 6 (SEQ ID NO.: 29) oder Teile davon enthält, oder (b) unter stringenten Bedingungen mit einer DNA-Sequenz gemäß (a) hybridisiert.
9. Verfahren zur Isolierung einer DNA gemäß Anspruch 6 , 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß
a) degenerierte Oligonukleotide, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Tabelle 1 oder Teile davon hergestellt werden,
b) die hergestellten Oligonukleotide radioaktiv oder nicht-radioaktiv markiert werden und
c) aus einer cDNA-Bank, hergestellt aus Dictyocaulus viviparus, cDNA- Klone isoliert, die mit den nach b) hergestellten Hybridisierungs-proben unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
10. Verfahren zur Isolierung einer DNA gemäß Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß
a) PCR-Primer, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Tabelle 1 oder Teile davon oder enthaltend eine Oligo-dT-Sequenz, hergestellt werden,
b) mit den so erzeugten PCR-Primeren aus einer cDNA-Bank, hergestellt aus Dictyocaulus viviparus, PCR-Fragmente generiert werden,
c) welche kloniert und nach gängigen Methoden analysiert werden und
d) zur Vervollständigung der cDNA-Sequenz durch Hybridisierungs- verfahren gemäß Anspruch 8 an Stelle der degenerierten Oligonukleotide das gemäß Punkt b) erhaltene PCR-Fragment verwendet wird.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß für die PCR- Reaktion als Matrize RNA benutzt wird, die in einem zusätzlichen Schritt zunächst revers transkribiert und der so entstandene Erststrang zur PCR verwendet wird.
12. Protein, erhältlich durch Expression einer nach einem der Ansprüche 9 bis 11 erhaltenen cDNA in Prokaryonten oder Eukaryonten und anschließende Aufreinigung.
13. Immunchemisches Verfahren zur Bestimmung der Menge von DV 17 spezifischen Antikörpern im Blut von Rindern unter Verwendung eines Proteins, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß mit DV 17 beschichtete ELISA-Platten mit zu untersuchendem Rinderserum inkubiert werden und gegebenenfalls gebildete DV 17 / Antikörperkomplexe mit Peroxidase-konjugierten, polyklonalen Antikörpern und einer Farbreaktion nachgewiesen werden.
14. Verwendung eines Proteins, gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4 oder 12 als Vakzine verbunden mit einem Carrier oder Adjuvans und ggf. Hilfsstoffen zur Immunisierung von Rindern gegen Dictyokaulose.
15. Diagnostik-Kit enthaltend ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1 - 4 oder 12.
16. Vakzine, enthaltend ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1 - 4 oder 12 sowie einen Carrier, ein Adjuvans sowie ggf. Hilfsstoffe.
PCT/EP1998/002090 1997-04-15 1998-04-09 Dictyocaulus viviparus antigen zur diagnose des lungenwurmbefalls und zur vakzinierung WO1998046742A2 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU76426/98A AU7642698A (en) 1997-04-15 1998-04-09 (dictyocaulus viviparus) antigen for the diagnosis of lungworm disease and for vaccination
EP98924107A EP0975757A2 (de) 1997-04-15 1998-04-09 Dictyocaulus viviparus antigen zur diagnose des lungenwurmbefalls und zur vakzinierung

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19715586.3 1997-04-15
DE19715586A DE19715586A1 (de) 1997-04-15 1997-04-15 Dictyocaulus viviparus Antigen zur Diagnose des Lungenwurmbefalls und zur Vakzinierung

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO1998046742A2 true WO1998046742A2 (de) 1998-10-22
WO1998046742A3 WO1998046742A3 (de) 1999-01-21

Family

ID=7826500

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP1998/002090 WO1998046742A2 (de) 1997-04-15 1998-04-09 Dictyocaulus viviparus antigen zur diagnose des lungenwurmbefalls und zur vakzinierung

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP0975757A2 (de)
AR (1) AR012404A1 (de)
AU (1) AU7642698A (de)
DE (1) DE19715586A1 (de)
WO (1) WO1998046742A2 (de)
ZA (1) ZA983098B (de)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0785253A1 (de) * 1996-01-19 1997-07-23 Hoechst Aktiengesellschaft Dictyocaulus viviparus Antigen zur Diagnose des Lungenwurmbefalls und zur Vakzinierung

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0785253A1 (de) * 1996-01-19 1997-07-23 Hoechst Aktiengesellschaft Dictyocaulus viviparus Antigen zur Diagnose des Lungenwurmbefalls und zur Vakzinierung

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRITTON C. ET AL.: "EXTENSIVE DIVERSITY IN REPEAT UNIT SEQUENCES OF THE CDNA ENCODING THE POLYPROTEIN ANTIGEN/ALLERGEN FROM THE BOVINE LUNGWORM DICTYOCAULUS VIVIPARUS" MOLECULAR AND BIOCHEMICAL PARASITOLOGY, Bd. 72, Nr. 1/02, 1995, Seiten 77-88, XP000671080 *
BRITTON C. ET AL.: "STAGE-SPECIFIC SURFACE ANTIGENS OF THE CATTLE LUNGWORM DICTYOCAULUS VIVIPARUS" PARASITE IMMUNOLOGY, Bd. 15, Nr. 11, November 1993, Seiten 625-634, XP000670251 *
DE LEEUW W. A. AND CORNELISSEN J. B. : "Identification and isolation of a specific antigen with diagnostic potential from Dictyocaulus viviparus." VETERINARY PARASITOLOGY, Bd. 39, Nr. 1-2, 1991, Seiten 137-147, XP002078798 *
KENNEDY M W ET AL: "THE DVA-1 POLYPROTEIN OF THE PARASITIC NEMATODE DICTYOCAULUS VIVIPARUS" JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Bd. 270, Nr. 33, 18. August 1995, Seiten 19277-19281, XP002029740 *
SCHNIEDER T.: "DICTYOCAULUS VIVIPARUS: ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF A RECOMBINANT ANTIGEN WITH POTENTIAL FOR IMMUNODIAGNOSIS" INTERNATIONAL JOURNAL OF PARASITOLOGY, Bd. 22, Nr. 7, November 1992, Seiten 933-938, XP000670250 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO1998046742A3 (de) 1999-01-21
DE19715586A1 (de) 1998-10-22
AU7642698A (en) 1998-11-11
EP0975757A2 (de) 2000-02-02
AR012404A1 (es) 2000-10-18
ZA983098B (en) 1998-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69333110T2 (de) Mit dem cytotoxin von helicobacter pylori assoziiertes, immunodominantes antigen verwendbar in impfstoffen und zur diagnose
DE69839060T2 (de) Vegi, ein inhibitor der angiogenese und des tumorwachstums
US5840695A (en) Ectoparasite saliva proteins and apparatus to collect such proteins
DE69432231T2 (de) Peptide mit antithrombotischer aktivität und verfahren zu ihrer herstellung
DE60036619T2 (de) Identifizierung und molekulare charakterisierung von protein, die in den speicheldrüsen von zecken exprimiert werden
DE69735439T2 (de) Mutanten von streptococcaltoxin c und verfahren zu deren anwendung
DE69837507T2 (de) Humanes Hedgehog-Protein
DE69931518T2 (de) Chimäres Gen, das für die antigenischen Determinaten von vier Proteinen aus L. Infantum kodiert
DE69732630T2 (de) Vasoaktive, aminbindende moleküle
EP0785253A1 (de) Dictyocaulus viviparus Antigen zur Diagnose des Lungenwurmbefalls und zur Vakzinierung
AU676828B2 (en) Antigens protective against (echinococcus granulosus) infection and vaccines containing such antigens
DE19617940A1 (de) Nebenhoden-spezifisches Rezeptorprotein und dessen Verwendung
WO1998046742A2 (de) Dictyocaulus viviparus antigen zur diagnose des lungenwurmbefalls und zur vakzinierung
US8343504B2 (en) Methods of administering IGBPMA to treat type 1 hypersensitivity
DE4419264B4 (de) Antigen, um Menschen und Tieren eine schützende Immunität gegen Wurminfektionen zu verleihen
DE60307987T2 (de) Galectin aus milben
DE60131962T2 (de) Verfahren und zusammensetzungen zum nachweis von taenia solium larven mittels eines klonierten antigens
US7166693B2 (en) Ectoparasite saliva proteins
DE60320425T2 (de) Ostertagia-impfstoff
DE19851294C1 (de) Ischämie/reperfusionsinduzierbare DNAs und Proteine
WO1998045428A1 (de) Fanconi-gen ii
DE10305082A1 (de) MIA-2 Protein
AU664054B2 (en) Flystrike antigen and vaccine and method for preparation
EP3497206A1 (de) Infektiöse bronchitis (ib)-virus varianten und diesbezügliche zusammensetzungen, verwendungen und verfahren
DE19835910C1 (de) Gen isoliert auf dem kurzen Arm des menschlichen Chromosoms 17

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AU BR CA IL JP NZ US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
AK Designated states

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AU BR CA IL JP NZ US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1998924107

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09403092

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1998924107

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 1998543467

Format of ref document f/p: F

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: CA

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1998924107

Country of ref document: EP