WO1998044126A1 - MUTATED α-AMYLASES - Google Patents

MUTATED α-AMYLASES Download PDF

Info

Publication number
WO1998044126A1
WO1998044126A1 PCT/JP1998/001464 JP9801464W WO9844126A1 WO 1998044126 A1 WO1998044126 A1 WO 1998044126A1 JP 9801464 W JP9801464 W JP 9801464W WO 9844126 A1 WO9844126 A1 WO 9844126A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amylase
amino acid
mutant
residue
leu
Prior art date
Application number
PCT/JP1998/001464
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yuji Hatada
Kaori Ikawa
Susumu Ito
Kazuaki Igarashi
Hiroshi Hagihara
Yasuhiro Hayashi
Hiroyuki Araki
Katsuya Ozaki
Original Assignee
Kao Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to US09/381,687 priority Critical patent/US6486113B1/en
Application filed by Kao Corporation filed Critical Kao Corporation
Priority to JP54145598A priority patent/JP4126098B2/ja
Priority to DE69840500T priority patent/DE69840500D1/de
Priority to EP98911122A priority patent/EP0985731B1/en
Priority to DK98911122T priority patent/DK0985731T3/da
Publication of WO1998044126A1 publication Critical patent/WO1998044126A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase

Definitions

  • the present invention relates to a liquefied mutant ⁇ -amylase and a gene thereof having an optimum pH on the alkali side and excellent resistance to an oxidizing agent, and particularly useful as an enzyme for a detergent containing an oxidizing agent.
  • a starch amylase may be blended for starch contamination.
  • the detergent contains a surfactant, and the pH of the washing solution is on the alkaline side. Therefore, it is necessary that the amylase to be incorporated in the detergent be Alkyria-amylase.
  • 1 0 and 1 1 is a diagram showing a Mechionin 2 0 2 position Amino acid substitution each mutant ⁇ - Amira one zero of Eta 2 0 2 oxidation resistance was completely purified and expressed in Bacillus subtilis.
  • Alpha The present invention conditions (KA_ ⁇ method), 5 0 mM T ris - HC buffer (0. 1 mM C a C ⁇ 2 presence) (. PH 8 9) given at 5 0 0 mM H 2 ⁇ 2 in time treated after residual presence activity, B: W09 6Z2 3 8 7 3 conditions (W method) described in, yellowtail tools tons one pilot flame Benson buffer (0.
  • Figure 1 2 is a diagram illustrating of H 2 ⁇ 2 oxidation resistance of ARG / Me t 2 0 2 T hr mutation ⁇ - amylase was completely purified and expressed in Bacillus subtilis.
  • FIG. 13 shows a pH-activity curve of a methionine-substituted amino acid-substituted amylase at position 202 expressed in Bacillus subtilis and completely purified.
  • A wild type
  • B Met 202 Thr.
  • FIG. 14 is a temperature-activity curve of a methionine amino acid substitution mutant amylase at position 202 expressed in Bacillus subtilis and completely purified. After reacting for 5 minutes in 5 OmM Tris-HC buffer (pH 8.5) at each temperature, the activity was measured.
  • B Met 202 Leu.
  • the mutant polymerase of the present invention is obtained by mutating a liquefied alkaline amylase.
  • the inventors of the present invention have previously described an example of the raw material liquefied alkaline amylase.
  • the mutated polymerase according to the present invention comprises a liquefied protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in which at least the methionine residue at position 202 is deleted or substituted with any other amino acid residue.
  • the arbitrary other amino acid residue is not particularly limited as long as it is a non-oxidizable amino acid residue, but for example, Thr, I1e, Leu, Ala, Va1 or Ser is preferred.
  • substitution of a non-oxidizing amino acid Me t 2 0 2-position of the present invention is to H 2 0 2 is a strong oxidation agent, resistant even at high concentrations.
  • the very surprising fact is that our raw protein amino acid sequence and that of NCIB 1252 12 (SEQ ID NO: 1) of WO96Z238873 are 95.1% This is the homology of Amino acids differ in only 24 out of a total of 485 amino acids, with 0 in the I, II, ⁇ , and IV regions, which are well conserved in the polymerase family. Therefore, the sequence of the starting polymerase of the present invention is NCI I12513 (W095 / 26397), NCI ⁇ 12289 (DK1271 / 94), Bacillus sp.
  • methionine residues other than the methionine residue at position 202 for example, 9, 10, 105, 116, 208, 261, Deletion of the methionine residues at positions 309, 382, 430 and 440, or substitution with other amino acids does not provide oxidant resistance. No special modification is required.
  • methionine residue at position 202 is substituted with another amino acid, substitution with Thr, Ile, Leu, Ala, Val or Ser is preferred.
  • human amylase in which the arginine residue at position 18 and the glycine residue at position 18 of SEQ ID NO: 1 are deleted has heat resistance (chelant resistance) in addition to oxidant resistance. This is particularly preferred.
  • the amino acid sequence of the wild-type human protease used in the present invention is originally a protein as compared to industrial monoamylases such as B.1 ichenif ormis and B. amylol iquefaciens> B. stearothermophi lus. It has advantageous properties from an engineering point of view, and it is a breakthrough by simply creating a mutated enzyme lacking MET202X (X is any amino acid) and RG. Because of its high antioxidant and heat resistance (chelating agent resistance), a mutant para-amylase having industrially very advantageous properties can be obtained by using these mutations alone or in combination.
  • a DNA encoding a liquefied real-amylase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 can be obtained, for example, according to the method described in JP-A-8-336392.
  • any commonly used method can be used.
  • Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit from Clonetech; Site-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express from TaKaRa It can be performed using a Km Kit or the like.
  • Screening of clones producing oxidant-resistant mutant human amylase is performed by culturing the transformant in a medium containing soluble starch.
  • the chromosome can be isolated from the above-mentioned cells by a conventional method, for example, the method of Saito & Miura (Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629, 1963).
  • Plasmid DNA can be prepared from recombinant Escherichia coli by a conventional method such as Maniatis et al. (Moleculer Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, USA 1982).
  • the nucleotide sequence is determined by the Maxam-Gilbert chemical modification method (Methods Enzymol., 65, 499-559, 1980) or the dideoxynucleotide chain termination method (Sanger et al., Pro Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467, 1977; Smith et al., Nature, London, 321, 674-679, 1986). )
  • the amylase activity of each enzyme was measured by the 3,5-dinitrosalicylic acid method (DNS method). 5 OmM Tris-HC £ Buffer (pH 8.5) After reacting at 40 ° C for 15 minutes in a reaction solution containing soluble starch, determine the reducing sugars generated by the DNS method. was measured by The enzyme titer was defined as the amount of enzyme that produces reducing sugars equivalent to 1 mo ⁇ of glucose per minute. (Protein content determination method)
  • Bovine serum albumin was used as a standard and quantified using the Bio-Rad Protein Assay Kit.
  • aqueous hydrogen peroxide solution prepared in (3) was added to a test tube containing 3 ⁇ , a diluted enzyme solution kept at 4 ° C, and quickly mixed well. After the aqueous peroxide solution was added and the reaction solution was left for a predetermined period of time for a predetermined time, each sample was sampled at 700 / ⁇ and injected into a test tube containing a hydrogenase prepared in (2) to stop the oxidation reaction. After the injection, they were kept on ice until the activity was measured. At the same time, the sample without hydrogen peroxide solution kept at 30 ° C or 40 ° C in (4) also moved to ice.
  • the residual amylase activity of each sample was measured by the DNS method, and the oxidant resistance to hydrogen peroxide was determined.
  • the amylase activity and (i) of the sample without hydrogen peroxide added to ice in (5) were used.
  • the amylase activity of the diluted enzyme solution prepared in) was also measured at the same time.
  • the thus-obtained mutant-amylase of the present invention has extremely high resistance to oxidizing agents and is persistent, and thus is useful as a compounding component for oxidizing agents, detergents containing bleaching agents, starch liquefaction, saccharification compositions, etc. It is.
  • surfactants such as anionic surfactants, amphoteric surfactants, nonionic surfactants, and cationic surfactants which are usually incorporated in detergents; divalent metal ion scavengers (chelating agents); Agents, inorganic salts, recontamination inhibitor, chlorine scavenger, reducing agent, bleach, fluorescent dye solubilizer, fragrance, caking inhibitor, enzyme activator, antioxidant, preservative, pigment, bluish Agents, bleach activators, enzyme stabilizers, phase regulators, and the like.
  • chelating agents agents, inorganic salts, recontamination inhibitor, chlorine scavenger, reducing agent, bleach, fluorescent dye solubilizer, fragrance, caking inhibitor, enzyme activator, antioxidant, preservative, pigment, bluish Agents, bleach activators, enzyme stabilizers, phase regulators, and the like.
  • the form of the cleaning agent can be selected according to the application, and can be, for example, a liquid, a powder, a granule, or the like.
  • the detergent composition of the present invention can be used as a detergent for clothes, a bleaching detergent, a dishwasher detergent, a drain pipe detergent, a denture detergent, etc. It can be suitably used as a detergent, bleaching detergent or detergent for automatic dishwashers.
  • the CTG sequence located at the 7th to 9th positions in the present sequence is at position 202 of the ⁇ -type sequence that anneals with the sequence encoding Leu. This corresponds to the position of the ATG sequence that encodes the Met, and the methionine residue is replaced by a leucine residue by exchanging the sequence from ATG to CTG (hereinafter abbreviated as Met202Leu).
  • mutant monoamylase proteins in addition to Met202 Leu, which are mutated at position 202 of Met to become oxidatively resistant by mutation, and the mutagenic primers used are shown below.
  • ⁇ RG has significantly improved heat resistance and chelator resistance (EDTA, EGTA and zeolite) as compared to the wild-type enzyme.
  • amylase showed a 80% or more higher residual activity even at later Inkyube one bets 1 hour addition, H 2 0 2 concentrations (30, 30 min treatment) conditions increased to 2M Also in the respective mutant ⁇ - amylase will exhibit high residual A mi la chromatography peptidase activity, acquires an extremely high oxidizing-agent-resisting performance It became clear that it was. Containing Meanwhile, in the WOZ 2 3 8 7 3, mosquitoes mutant amylases having improved oxidant resistance are disclosed ⁇ these of 2 0 0 mM Eta 2 ⁇ 2 and the 0.
  • the protein content of the obtained mutant human amylase was measured by the method described above, and its specific activity was calculated. As a result, the wild type was 40000-550, whereas the Met202 Ser power was 700-750, and the Met202 Thr power was 2200.
  • — 2 4 0 0, Met 2 0 2 Val is 1 1 0 0-1 4 0 0, Met 2 0 2 A la is 1 3 5 0— 1 5 0 0, Met 2 0 2 Cys 1 4 5 0-1 6 0 0, Met 2 0 2 I 1 e force 1 6 0 0-1 8 0 0, M et 2 0 2 Leu force 1 6 0 0-2 0 0 0, ⁇ RG Is 350 0-450 0 0, ⁇ RG / M et 200 T hr at 200 0 0-250 0 0.NC IB 1 2 5 1 2.NC IB 1 2 5 1 3 and NC IB Licheniforniis was about 1300 (unit / mg evening).
  • the resulting H 2 ⁇ 2 oxidation-resistant mutant amylase Met 202 Leu and Met 202 Thr are converted to 50 mM T in a bleaching system of lOmM TE AD / 2 0 mM Na B ⁇ 4 ris-HC ⁇ buffer (pH 8.5) 4 (held at TC for 1 hour. After treatment, the residual amylase activity was measured. Wild-type (non-mutated human amylase) was almost completely inactivated. Nevertheless, it maintained 77% activity in Met202Leu and 80% in Met202Thr.
  • subtilis I SW122 4 expressed as a host and recombinant extracellular amylase produced outside the cells Met 202 Leu, Met 202 Ie, Met 202 T hr, Met202VaMet202Cys, Met202A1a, Met202Ser, wild-type human amylase and RGRG were prepared using the above-described method. And refined. When the purified product was subjected to SDS-electrophoresis, it was detected as a single band, and the molecular weight was calculated to be about 55 KDa. The respective yields ranged from 40 to 60%.
  • Fig. 13 shows the results of Met202Thr in various buffer systems, and the pH-activity curves of all buffer systems were almost the same as those of the wild type. showed that.
  • the mutant primary amylase of the present invention has an optimal pH on the alkaline side, has excellent primary amylase activity, has high resistance to oxidizing agents, and is persistent. It is also useful as a component of a detergent or a composition for liquefying and saccharifying starch. 6 I

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

明 細 書 変異ひーァミラーゼ 技術分野
本発明は、 アルカリ側に至適 pHを有し、 かつ酸化剤に対して優れた耐性を有し、 特に酸化剤配合洗浄剤用酵素として有用な液化型変異《 -アミラーゼ及びその遺 伝子に関する。 背景技術
洗浄剤には洗浄力を高める目的で種々の酵素が配合されており、 例えば澱粉汚 れに対してはひ一アミラーゼの配合が考えられる。 ところが、 洗浄剤には界面活 性剤が配合されており、 洗浄液の pHはアルカリ側であることから、 洗浄剤に配合 する 一アミラーゼはアル力リ ーアミラ一ゼであることが必要である。
ところで、 最近、 洗浄剤に酸化漂白成分を配合し、 汚れに対する洗浄力だけで なく漂白作用も期待した洗浄剤が上市されている。 このような酸化漂白剤配合洗 浄剤にもひ—アミラーゼを配合することが考えられる。 しかしながら、 通常のひ 一アミラーゼは酸化剤の存在下で失活しゃすく、 酸化漂白剤配合洗浄剤には配合 できなかった。
かかるひ —ァミラ一ゼに酸化剤耐性を付与しょうとする研究がなされている。 すなわち、 WO 94Z025 97には ^ 1 ichenif ormisひ —ァミラ一ゼのメチォ 二ン残基を非酸化性のァ ミ ノ酸、 特にロイ シ ン （L e u ) 、 スレオニン (Th r) 、 グリシン （G l y) に置換することによって酸化剤耐性変異タンパ クを得ており、 また WO 94 / 1 83 1 4及び WO 9 6 / 3048 1には同じ酵 素のメチォニン残基中 1 9 7位と 1 5位に相当する Me tを、 それぞれ特に A l a. I l e、 Th rと L e u、 Th r、 As p、 S e r、 Va l、 I l eに 変える酸化剤耐性と熱安定性が増すと報告されている。 しかしながら、 これらの 変異ひ —アミラーゼは、 いずれも中性〜酸性に至適 pHを有する酵素であり、 洗浄 剤用としては、 より至適 pHの高いアル力リ ひアミラーゼが望まれていた。
一方、 アル力 リ —ア ミ ラ一ゼに対する酸化剤耐性付与技術としては、 WO 9 6 Z 2 3 8 7 3に、 ひ一アミラーゼをコードする S E Q I D No. 1
(NCIB12512) を改変した酸化剤耐性変異ひ ーァミラーゼが報告されているのみ である。 そして、 WO 9 6 / 2 3 8 7 3によれば、 ^ licheniformisの ーァミ ラーゼ等の結果を踏まえ （W094/18314) 、 NC I B 1 2 5 1 2の図 2中の 2 0 2 位に相当する Me tを L e u、 P h e、 A l a、 Th r、 V a S e rに置換 すると、 2 0 OmMの H 202 処理に対して、 酸化剤耐性になると記載されている。 但し、 その酸化耐性は不充分なため、 この変異に加えて、 A r g 1 8 1 と G 1 y
1 8 2位を欠失させて （Suzuki et al. , J. Biol. Chem. , 264, 18933-18938, 1989) 、 さらに安定化したと報告されている。 しかしながら、 このようにして得 られた変異ひ —アミラーゼの酵素活性の半減期 （ t 1/2) は、 前者で 1 0〜2 0 分の範囲、 後者で 1 0〜3 0分の範囲でしかなく、 洗浄剤配合用酵素としては酸 化剤耐性及びその持続性のいずれも満足できるものではない。
従って、 本発明は、 アルカリ側に pHを有し、 持続的かつ強力な酸化剤に耐性を 有する —アミラーゼ、 その遺伝子、 及び当該ひ一アミラーゼを含有する洗浄剤 組成物を提供することを目的とする。 発明の開示
そこで本発明者は液化型アル力リ ひ ーアミラ一ゼの一種で Bacillus sp. SM-A P1378 が生産する酵素 （W094/26881) に着目して種々検討してきたところ、 配列 番号 1のアミノ酸配列のうち少なく とも 2 0 2位又はその相同位のメチォニン残 基を欠失又は任意の他のァミノ酸残基に置換すれば、 従来にない強力かつ持続的 な酸化剤耐性を獲得し、 かつアル力リ側での優れたァミラ一ゼ活性を保持した変 異ひーアミラーゼが得られることを見出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 液化型アルカリひ一アミラーゼを構成する配列番号 1で 示されるアミノ酸配列又は当該配列に対して 9 5. 2 %以上の相同性を有するァ ミノ酸配列における 2 0 2位のメチォニン残基又はその相同位のメチォニン残基 が欠失又は任意の他のァミノ酸に置換されている変異ひ—ァミラーゼを提供する ものである。
また、 本発明は、 この変異ひ—アミラーゼをコードする遺伝子を提供するもの である。
また、 本発明はこの変異ひ一アミラーゼを含有する洗浄剤組成物を提供するも のである。 図面の簡単な説明
図 1〜4は、 Bacillus sp. KSM-AP1378 産生 —アミラーゼ （KSM- AP1378, KAM) の成熟酵素ァミノ酸配列とその他の Bacillus属細菌ひ—アミラ一ゼの成熟酵素ァ ミノ酸配列との相同性を示す図である。 NCIB 12512と NCIB12513 は W095/26397記 載のひ—アミラーゼ、 NCIB12289 は DK94/0353 (DK94-1271) 記載のひ一ア ミラー ゼ、 ίί 707 は Bacillus SP. ϋ 707 の生産するひ—ア ミ ラーゼ、 ΒΑΑ は ^ amylol iquefaciens> BSA は B. stearothermophi lus. BLA iiB. 1 ichenif ormisが それぞれ生産するひ—ァミラ一ゼ。 下記した *印は全てのひ—ァミラーゼで相同 性があることを示している。
図 5はァミ ノ酸欠失 （△ R G) 変異ひ -ァ ミ ラーゼの耐熱性とキレ一 ト剤 (EDTA、 EGTA及びゼォライ ト） 耐性を示す図である。 秦：野生型、 〇： △ RG、 Δ： ARG/Me t 2 0 2 Th r。 Aは耐熱性 （50mM Tris- HC 、 pH 8.5 中で各温度で 30分間処理） 、 B - Dはキレ一ト剤耐性 （50mM Tris - HC£、 pH 8.5 中、 各濃度の各種キレート剤存在下で 30°C、 30分間処理） 。
図 6は、 ひ一アミラーゼ遺伝子への変異導入と変異ひ—ァミラ一ゼ遺伝子の枯 草菌による菌体外高生産の模式図である。
図 7は、 ひ —アミラ一ゼ遺伝子への変異導入と変異ひ —ァミラーゼ遺伝子の枯 草菌による菌体外高生産の模式図である （図 6のつづき） 。 かっこ内の配列解析 の部分は図 6と重複している。
図 8及び図 9は、 枯草菌で発現させて完全精製したメチォニン 2 0 2位のァミ ノ酸置換各変異ひ 一アミラーゼの H202 酸化耐性を示す図である。 A ：本発明 条件下 （ K A〇法） 、 5 0 mM T r i s -HC 緩衝液 （ 0. 1 mM C a C β 2 存在下） （pH8. 5) 中 2 % H2〇2 で所定時間処理した後の残存活性、 B ： W〇 9 6/2 3 8 7 3に記載の条件下 （W法） 、 ブリッ トン—ロビンソン緩衝液 ( 0. 1 mM C a C ^ 2存在下） （pH9. 0 ) 中、 2 0 0 mM H202 で所定時間 比較の為に、 Bには NC I B (12215 W096/23873の SEQ ID No. 1 ) のひ —アミラ ーゼの結果を付記してある （図中、 破線） 。 〇： H202 非存在下で前処理 （対 照） 、 秦：所定濃度の H202 で前処理。
図 1 0及び図 1 1は、 枯草菌で発現させて完全精製したメチォニン 2 0 2位の ァミノ酸置換各変異 α—ァミラ一ゼの Η 202 酸化耐性を示す図である。 Α ：本 発明条件下 （ K A〇法） 、 5 0 mM T r i s - H C 緩衝液 （ 0. 1 mM C a C ^ 2存在下） （pH8. 9 ) 中 5 0 0 mM H2〇2 で所定時間処理した後の残 存活性、 B : W09 6Z2 3 8 7 3に記載の条件下 （W法） 、 ブリ ツ トン一 口ビ ンソン緩衝液 （ 0. I mM C a C _g 2存在下） （ρΗ9 · 0 ) 中、 2 0 0 mMH2O2 で所定時間比較の為に、 Bには NC I B (12215 W096/23873の SEQ IDNo. 1 ) の α—アミラーゼの結果を付記してある （図中、 破線） 。 〇： Η202 非存在下で 前処理 （対照） 、 ·：所定濃度の Η202 で前処理。
図 1 2は、 枯草菌で発現させて完全精製した ARG/Me t 2 0 2 T h r変異 α—アミラーゼの H2〇2 酸化耐性を示す図である。 A :本発明条件下 （KAO 法） 、 5 OmM T r i s — HC ^緩衝液 （ 0. 1 mM C a C £ 2 存在下） （pH 8. 9) 中 5 0 OmM H202 で所定時間処理した後の残存活性、 〇： H2〇2 非 存在下で前処理 （対照） 、 秦：所定濃度の H202 で前処理。
図 1 3は、 枯草菌で発現させて完全精製したメチォニン 2 0 2位のァミノ酸 置 換変異ひ—アミラーゼの pH—活性曲線である。 A ：野生型、 B : Me t 2 0 2 Th r。
図 1 4は、 枯草菌で発現させて完全精製したメチォニン 2 0 2位のァミノ酸置 換変異ひ一アミ ラーゼの温度—活性曲線である。 各温度で 5 OmM T r i s - HC 緩衝液 （pH8. 5 ) 中で 5分間反応後、 活性を測定した。 A ：野生型、 B ： Me t 2 0 2 L e u。 発明を実施するための最良の形態
本発明の変異ひーァミラ一ゼは、 液化型アル力リ ひ —アミラ一ゼを変異させて 得られるものであり、 該原料液化型アルカリひ一アミラーゼの例としては、 本発 明者らが先に報告した WO 9 4 / 2 6 8 8 1記載の野生型液化型アル力リひ —ァ ミラーゼ （バチルス エスピー (Bucillus sp. ) KSM- AP 1 3 7 8 (FERM BP - 3048 (原寄託日 1989年 7月 24日） として、 工業技術院生命工学工業技術研究 所 （あて名 ： 〒305- 0046 日本国茨城県つくば巿東一丁目 3号） にブダぺスト条 約に基づいて寄託されている） が举げられる。
本発明の変異ひ ーァミラーゼは、 配列番号 1で示されるァミノ酸配列を有する 液化型ひ —ァミラーゼの少なく とも 2 0 2位のメチォニン残基が欠失又は任意の 他のアミノ酸残基に置換されていればよい。 ここで、 任意の他のアミノ酸残基と しては、 非酸化性のァミ ノ酸残基であれば特に限定されないが例えば T h r、 I 1 e、 L e u, A l a, V a 1又は S e rが好ましい。
配列番号 1の、 2 0 2位のメチォニン残基のみを欠失させるか、 他のアミ ノ酸 に置換した本発明の変異ひ —アミラーゼは、 5 0 OmMという高濃度の H 202 存 在下であっても活性の半減期 （ t 1/2) は数時間に及ぶ （野生型ひ—アミラーゼ の t 】.,2 は約 1 0〜 2 0分） ものであり、 WO 9 6 / 2 3 8 7 3記載の変異ひ一 ァミラ一ゼに比べてその酸化剤耐性及び持続性において格段に優れている。
このように、 本発明の Me t 2 0 2位の非酸化性アミノ酸への置換は強力な酸 化剤である H 202 に対し、 高濃度でも耐性を有する。 大変おどろく事実は、 我 々の原料ひ—ア ミ ラーゼァ ミ ノ酸配列と WO 9 6 Z 2 3 8 7 3の NC I B 1 2 5 1 2 (S E Q I DNo. 1 ) のそれは、 9 5. 1 %の相同性があること である。 ァミノ酸で異なるのは 4 8 5個の全ァミノ酸中 2 4個にすぎず、 ひ —ァ ミラーゼファ ミ リーでよく保存されている I、 II、 ΠΙ、 IV領域においては 0個 である。 従って、 本発明の原料ひ—ァミ ラ一ゼの配列は NC I Β 1 2 5 1 3 (W095/26397) 、 NC I Β 1 2 2 8 9 (DK1271/94) 、 Bacillus sp. ίί 7 0 7、 amylol iquefaciens B. stearothermophi lus. B. lichenifonnisとのそれら では、 それぞれ 8 6. 6 %、 9 4. 7 %、 8 6. 4 %、 6 6. 7 %、 6 8. 6 % 及び 6 8. 9 %であるので、 本発明で用いる原料ひ—アミラーゼのアミノ酸相同 性は配列番号 1のァミノ酸配列に対し 9 5. 2 %以上が好ましい。
さらに、 配列番号 1のひ —アミラ一ゼの場合、 2 0 2位のメチォニン残基以外 のメチォニン残基、 例えば 9、 1 0、 1 0 5、 1 1 6、 2 0 8、 2 6 1、 3 0 9、 3 8 2、 4 3 0及び 4 4 0位のメチォニン残基を欠失、 又は他の了ミノ酸に置換 しても酸化剤耐性は得られないので、 これらのメチォニン残基は特に改変する必 要がない。 また、 2 0 2位のメチォニン残基を他のアミ ノ酸に置換する場合、 Th r、 I l e、 L e u, A l a, Va l又は S e rへの置換が好ましい。
また、 さらに配列番号 1の 1 8 1位のアルギニン残基及び 1 8 2位のグリシン 残基が欠失したひ一アミラーゼは、 酸化剤耐性に加えて、 熱耐性 （キレート剤耐 性） も有するので特に好ましい。
また、 本発明で用いた原料野生型ひ -ァ ミ ラ一ゼのァ ミ ノ酸配列は、 B.1 ichenif ormisや B. amylol iquefaciens> B. stearothermophi lusなどの工業用 一アミラーゼに較べ元々タンパク工学的には有利な性質を有しており、 Me t 2 0 2 X (Xは任意のアミノ酸） と RG欠損変異酵素を創成するだけで、 飛躍的 な抗酸化性と耐熱性 （キレート剤耐性） が付与されるので、 これらの変異の単独、 あるいは組み合わせで工業上、 大変有利な性質を有する変異ひ-アミラーゼが得 られる。
本発明の変異 —ァミラーゼは、 例えば、 配列番号 iのァミノ酸配列をコード する DN Aに部位特異的変異を導入して、 変異ひ一アミラーゼをコードする遺伝 子及びこれを含有するべクタ一プラスミ ドを得、 次いで該プラスミ ドを用いて宿 主を形質転換するか、 染色体相同組換えにより形質転換体を得、 これを培養する ことにより製造される。
まず、 配列番号 1のアミノ酸配列を有する液化型アル力リ ーアミラーゼをコ 一ドする DNAは、 例えば特開平 8 - 3 3 6 3 9 2号記載の方法に従って得るこ とができる。
部位特異的変異の方法としては一般的に行なわれている方法であればいずれも 採用できるが、 例えば Clonetech社の Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit；、 TaKaRa社の Si te - Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km Kit等を用いて行なうことができる。
酸化剤耐性変異ひ —ァミラーゼを産生するクローンのスクリーニングは、 形質 転換体を可溶性澱粉含有培地で培養することにより行なわれる。
次に、 本発明方法を実施するにあたって採用する一般的な方法について説明す る
〔染色体 DNAの抽出法〕
上述の菌体から染色体を分離するには、 常法、 例えば Saito & Miura の方法 (Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 - 629, 1963) に従って行なえば良い。
〔大腸菌へのプラスミ ド DN Aの導入法〕
大腸菌へのプラスミ ド DNA導入はコンビテン トセル （TaKaRa社） を用いて行 なった。 尚、 ァミラ一ゼ活性形質転換体の選択のために固体 L B培地には 0. 6 %のス夕一チアズレ （シグマ社製） を添加した。 〔無細胞抽出液及び培養上清液の調製法〕
目的プラスミ ド DNAを内在した大腸菌をテトラサイクリ ン （ i 5 / g/τηβ) 入りの L B液体培地 （ 5 で 1 5〜2 4時間振とう培養した。 培養液を遠心 し得られた菌体ペレツ トを の 5 OmM Tris-HC (pH8. 0 ) で懸濁し、 菌体 懸濁液に対し超音波処理装置を用いて細胞破砕を行なった。 細胞破砕液を遠心し 得られた上清を無細胞抽出液とした。 また、 培養後の培養液を遠心分離して得ら れる上清液を酵素の測定に供した。
〔プラスミ ド DN Aの調製法〕
組換え大腸菌からのプラスミ ド DN Aの調製は常法により Maniatis等の方法 (Moleculer Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, U. S. A. 1982) を用いることができる。
〔塩基配列の決定〕
塩基配列の決定は、 Maxam- Gilbert の化学修飾法 (Methods Enzymol. , 65， 499-559, 1980) 又はジデォキシヌクレオチド鎖終結法 （Sanger et al. , Pro Natl. Acad. Sci.， U. S. A., 74, 5463-5467, 1977 ； Smith et al. , Nature, London, 321, 674-679, 1986) などを用いて決定することができる。 ）
〔部位特異的変異の導入法〕
Clontech社のプロ ト コ一 ノレ（こ準じて、 Transformer Site— Directed Mutagenesis Kit (2nd version ) や TaKaRaf土の Si te- Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km kit を用いて行なうことができる。
〔ァミラーゼ活性測定法〕
各酵素のアミラーゼ活性は 3， 5—ジニトロサリチル酸法 （DNS法） で測定 した。 5 OmM T r i s - HC £緩衝液 （pH8. 5 ) 中に可溶性澱粉を含む反応 液中、 4 0°Cで 1 5分間の反応を行なった後、 生成した還元糖 DNS法で定量す ることによって測定した。 酵素の力価は 1分間に 1 mo^のグルコースに相当す る還元糖を生成する酵素量を 1単位とした。 〔タンパク含量定量法〕
牛血清アルブミ ンを標準として、 Bio- Rad 社の Protein Assay Kit を用いて定 量した。
〔H2Q2酸化耐性度の検定〕
( 1 ) 先ず、 サンプルのアミラーゼ活性を予め測定しておき、 希釈しないで直接 DNS法で測定できるアミラ一ゼ酵素濃度の約 2倍ァミラーゼ酵素濃度まで適当 な緩衝液、 例えば 5 OmM T r i s - HC ^ (pH8. 5又は 8. 9) 緩衝液によ つて希釈しておく。
( 2) 試験管に力タラ一ゼ （ベーリ ンガーマンハイム社， 2 0 mg/τηβ) を 5 a £ 分注しておく （サンプル数 X 5本） 。
( 3 ) 3 0 %過酸化水素水 （和光純薬社） を緩衝液で最終濃度が 2 0 Oii 又は 5 0 OmMとなるように希釈しておく。
( 4 ) スクリユ ーキャップ付き試験管をサンプル数 X 2本用意し、 1本には （ i ) で調製した希釈酵素液を 1 と、 緩衝液 1 を混ぜ合わせた溶液を、 もう 1本に は （ 1 ) で調製した希釈酵素液を 3 ml注入し 3 0 °C又は 4 0°Cに保温した。
( 5 ) ( 3) で調製した過酸化水素水溶液 を 4°Cで保温している希釈酵素液 3 τηβ入りの試験管に添加し素早くよく混ぜ合わせた。 過酸化水溶液を添加してか ら所定時間放置後の反応液を各々 7 0 0 / ^サンプリ ングし （ 2) で用意した力 夕ラーゼ入りの試験管に注入し酸化反応を停止した。 注入後は活性測定まで氷中 に置いておいた。 同時に （ 4) で 3 0°C又は 4 0 °Cに保温中の過酸化水素水無添 加のサンプルも氷中に移動した。
( 6 ) 各々のサンプルの残存アミラーゼ活性を DNS法で測定し、 過酸化水素に 対する酸化剤耐性を求めた。 尚、 3 0 °C又は 4 0ての保温のみでァミラーゼ活性 が低下しないことを確認するために （ 5 ) で氷中に置いた過酸化水素水無添加サ ンプルのァミラ一ゼ活性及び （ i ) で調製した希釈酵素液のァミラ一ゼ活性も同 時に測定した。 かく して得られる本発明変異 —アミラーゼは、 酸化剤に対する耐性が極めて 高く、 かつ持続的であることから酸化剤、 漂白剤を含む洗浄剤、 澱粉液化，糖化 用組成物等の配合成分として有用である。
ここで本発明の洗浄剤には、 上記変異ひ 一アミラーゼ以外に、 さらに、 枝切り 酵素.（例えばプルラナ一ゼ、 イソアミラーゼ、 ネオプルラナーゼなど） 、 ひ —グ ルコシダ一ゼ、 グルコアミラーゼ、 プロテア一ゼ、 セルラーゼ、 リパーゼ、 ぺク チナーゼ、 プロ トぺクチナーゼ、 ぺクチン酸リアーゼ、 パーォキシダーゼ、 ラッ カーゼ及び力夕ラーゼから選ばれる 1種又は 2種以上の酵素を配合することがで きる。
また、 洗浄剤に通常配合されるァニオン界面活性剤、 両性界面活性剤、 ノニォ ン界面活性剤、 カチオン界面活性剤等の界面活性剤 ；二価金属イオン捕捉剤 （キ レー ト剤） 、 アルカ リ剤、 無機塩、 再汚染防止剤、 塩素捕捉剤、 還元剤、 漂白剤、 蛍光染料可溶化剤、 香料、 ケーキング防止剤、 酵素の活性化剤、 酸化防止剤、 防 腐剤、 色素、 青味付け剤、 漂白活性化剤、 酵素安定化剤、 相調節剤等を配合する ことができる。
洗浄剤の形態は、 用途に応じて選択することができ、 例えば液体、 粉末、 顆粒 等とすることができる。 また、 本発明洗浄剤組成物は、 衣料用洗浄剤、 漂白洗浄 斉 ij、 自動食器洗浄機用洗浄剤、 排水管洗浄剤、 義歯洗浄剤等として使用する二と ができるが、 特に衣料用洗浄剤、 漂白洗浄剤又は自動食器洗浄機用洗浄剤として 好適に使用することができる。 実施例
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明はこれら実施例 に何ら限定されるものではない。
実施例 1
( 1 ) 液化型アル力リ ひ —アミラーゼ遺伝子への変異導入。 TaKaRa社の Site - Directed Mutagenesis System Mutan - Super Express Km kit 及び 2 0 2位の Me tのコ ドンを他のァミノ酸のコ ドンに置換し得る変異導入プ ライマ一を用いて、 2 0 2位の Me tをコードするコ ドンに対する変異を行なつ た。
例えば変異導入プライマ一として 5 ' TAC CTTCTGTATGCAGAC ATTGAT 3 ' の 2 4mer を用いると、 本配列中 7〜 9番目に位置する C T G 配列は L e uをコードする配列でァニールする铸型配列の 2 0 2位 Me tをコー ドする ATG配列の位置に相当し、 ATGから CTGへの配列の入れ換わりによ りメチォニン残基がロイシン残基に置き換わることになる （以後 Met202Leu と略
5己する) 。
本発明で Me tの 2 0 2位に変異導入して酸化耐性となって変異ひ一アミラー ゼタンパクは Me t 2 0 2 L e uの他に 5種類あり、 用いた変異導入プライマー を以下に示す。
5 ' TAC CTTXXX*TATGCAGACATTGAT 3 ' Me t 2 0 2 A 1 a GCA
M e t 2 0 2 I 1 e ATC
M e t 2 0 2 S e r TC A
Me t 2 0 2 Th r AC A
M e t 2 0 2 V a 1 GTG
(M e t 2 0 2 C y s TGC)
(*XXXは置換される 3塩基）
変異導入の具体的方法を以下に示す。
①変異導入用プラスミ ドベクタ一 p KF 1 9 Kへのひ—ァミラーゼ遺伝子の導 入
ひ—アミラ一ゼ高生産用プラスミ ド pHS P L AMY 2上の高発現プロモー夕 一領域から液化型 —アミラ一ゼ構造遺伝子を含む 2. 1 kb断片を P CRによつ て増幅しプラスミ ド p K F 1 9 Kの S m a I部位に挿入した （ p K F 1 9 LAMYと命名） 。
②変異導入 P C R
リアクションチューブ （ 0. 5^) に以下の反応液を調製する。 反応液組成は 踌型 DNA (pKF19LAMY) 1 0 ng、 セレクショ ンプライマー 5 pmo 、 リ ン酸化済 み変異導入プライマ一 5 pmo£、 10Xし A PCR ノくッファー II a H、 dNTP混合液 (各 2. 5mM) ίΐ Ά、 TaKaRa LA TaqO.5 £、 計 5 0 _^。 解離 9 4 °C 1分間、 ァニール 5 5 °C 1分間、 伸長 7 2 °C 3分間を 2 5サイクル、 その後 4°C 1 0分間 の条件で P CRを行なった。 P CR断片精製キッ ト （ベ一リ ンガーマンハイム社） によって増幅 DN Aを精製し形質転換に用いた。
③大腸菌 MV 1 1 8 4株への導入と変異の確認
大腸菌 MV 1 1 8 4コンビテン トセル （TaKaRa社） を用い通常のコンビテン ト セル法で P C R産物を大腸菌 MV 1 1 8 4株 (araA(lac-proAB)rpsLthi( Φ 80 lacZAM15)A(srl-recA)306: :TnlO(tetr)F' [traD36proAB+lacIqlacZAM15) へ導 入した。 カナマイシン （ 5 0 a g /τηβ) を含む L B寒天培地 （パク ト トリプトン 1 %、 酵母エキス 0. 5 %、 塩化ナトリウム 1 %、 寒天 1. 5 %) 上に生育して きたコロニー数個からプラスミ ド DNAを調製し、 配列解析を行なって変異を確 ρί^しに ο
( 2 ) 酸化剤耐性変異ひ —アミ ラーゼのスクリーニング
上述の方法で変異ひ -アミラーゼを得る目的で、 先ず、 各形質転換体培養液を 1 2 0 0 0 rpm 1 5分遠心し培養上清を回収した。 各培養上清に最終濃度 2 %と なるように過酸化水素水を添加し 3 0°Cで 3 0分間放置後残存アミ ラーゼ活性を 測定した。 また、 同時に、 過酸化水素水無添加での同条件処理後の各培養上清中 のァミ ラーゼ活性も測定した。
過酸化水素処理後の残存活性を野生型酵素と比較して酸化剤耐性が高いと判断 される変異体として 1 8種が得られた （ 8 5〜 1 0 0 %活性が残存） 。 選択され た形質転換体 1 1種から各々の有するプラスミ ドを調製し配列解析を行なった結 果、 2 0 2位のァミノ酸がメチォニン残基から、 スレオニン残基 （ 2種） 、 セリ ン残基 （ 2種） 、 ノ リ ン残基 （2種） ロイシン残基 （ 1種） 、 イソロイシン残基 ( 3種） 、 又はァラニン残基 （ 1種） に各々置き換わっていることが明らかとな つた。 これらは部位特異変異で得られた酸化耐性変異ひ一アミラーゼと置換され たァミ ノ酸が符号していた。 これらの得られた変異ひ —ァミラーゼ遺伝子又は夕 ンパクを、 それぞれ Me t 2 0 2 T h r , M e t 2 0 2 I l e、 M e t 2 0 2 L e u, M e t 2 0 2 A 1 a, M e t 2 0 2 V a Me t 2 0 2 S e rと命名 した。 Me t 2 0 2 Cy sは、 酵素を完全精製して混液すると白濁して沈澱した。 おそらく、 酵素分子間でジスルフィ ドを結合して不溶化したと思われる。
( 3 ) 大腸菌で発現させた培養液を遠心分離して得られた変異ひ -ァミ ラーゼ (上清） を 6 0 %硫安で沈澱させて、 透析した後、 DEAE— To y o p e r 1 6 5 0 Sのカラムの非吸着部分を濃縮した標品について、 酸化剤 （H202) 耐性 を確認した結果、 M e t 2 0 2 C y sを除く変異 α—ァミ ラーゼは、 5 0 mM T r i s - H C ^緩衝液 （pH 8. 5 ) 中で 1〜 3 %の^12〇2 存在下で 3 0 °C- 3 0分間処理した後でも 7 5 %以上の残存活性があった。
(4 ) 同様にして適当な下記のプライマ一を用いてその他のメチォニン残基、 す なわち 9、 1 0 5、 1 1 6、 3 8 2及び 4 3 0位の Me tを適当なァミノ酸に置 換した。
Me ΐ 9 L e υ ： 5 ' AC GAATGGG AC C
TT 3 '
Me t l 0 5 I l e : 5 ' GGGGATGTC
AGGT 3 '
Me t l l 6 A s p : 5 '
GGTG 3 '
Me t 3 8 2 L e u : 5 ' GGTGTTCCTTCG AATT 3 '
Me t 4 3 0 I l e : 5 ' C G ATGG
GC C A 3 '
これらのアミノ酸置換については、 無作為のアミノ酸にすると、 立体構造障害 から正常タンパク構造をとりえなかったり、 とりえても活性発現阻害が考えられ たので、 ^ licheniformisのひーァミラーゼのァミ ノ酸配列と相当するァミノ酸 を選択した （図 1〜図 6参照） 。 また、 特表平 8 - 5 0 0 2 4 3号によれば、 ^ stearothermophi lus由来液化型 α -Ύミラーゼの 2 0 2位及び 2 0 8位のメチォ ニン残基の一方若しくは両方の置換体が安定化すると記載されており、 W09 6
/ 2 3 8 7 8においても NC I Β 1 2 5 1 2 一アミラーゼでも同様の記載があ るので変異プライマ一として
Me t 2 0 8 Ty rを調製した。
ところで公知の Suzuki et al. (J. Biol. Chem. , 264, 18933-18938, 1989) の 報告、 すなわち特異的なアルギニンーグリシンの 2アミ ノ酸欠失が我々のひーァ ミラーゼでも再現されれば、 酸化剤耐性のみならず、 熱安定性が上昇することが 期待される。 そこで、 野生型の当該ひ— Ύミ ラーゼ遺伝子及び M e t 2 0 2 Th r変異を有するひ —アミラーゼ遺伝子の、 Suzukiらの報告に相当する 1 8 1 位アルギニンと 1 8 2位グリシンを、 以下の変異導入プライマ一を用いて欠失さ せることによって、 2種類の欠失変異ひ—アミラーゼ （以下それぞれ、 ARG及 び ARGZMe t 2 0 2 Th rと略する） を創製した。
△ RG : 5 ' AAAATATATAAATTC (AG A) (GGT) AC C G
GAAAGGCATGGGACTGG 3 ' (力ッコ内は除いた塩基を 示す）
前記の変異プラスミ ドを大腸菌で発現させた後精製し、 H202 に対する酸化 耐性を調べた結果を表 1に示す。 表 1
*
残存活性 （％)
変異ァミラ一ゼ H2 02処理濃度 （％)
0 1.0 2.0 3.0
野生型 100 18.8 4.9 4.1
Met9Leu 100 15.6 4.5 3.4
Metl05Leu 100 14.8 5.2 4.1
Metll6Asp 100 20.1 5.3 4.0
Met382Leu 100 19.7 4.9 3.9
Met430Leu 100 18.5 5.6 5.2
Met208Tyr 100 19.1 5.2 4.3
Met202Leu (対照) 100 90 86 78
△ RG (対照） 100 19 4.4 2.9
ARG/Met202Thr 100 95 93 92
*50mM Tris- HC^ (ρΗ8·5)で 30°C、 30分間 H202で前
処理した。 それぞれ、 H202 無添加系の活性を
100%として相対値で示した。 表 1から明らかなように M e t 9 L e u、 Me t l 0 5 I l e、 Me t l l 6 A s p、 M e t 3 8 2 L e u、 M e t 4 3 0 I 1 e、 M e t 2 0 8 T y r と
△ RGのいずれも非変異酵素 （野生型酵素） と同等の酸化耐性しかなく、 全く酸 化剤耐性が無いことがわかる。 一方、 高い酸化剤耐性を示した M e t 2 0 2 T h r に△ R G変異を導入した△ R G/M e t 2 0 2 T h rの場合、 対照 した Me t 2 0 2 L e uと同様の高い酸化剤耐性を示した。 さらに、 本酵素及び
△ RGの場合、 野生型酵素と比べ飛躍的に熱耐性とキレート剤耐性 （EDTA、 EGTA及びゼォライ ト） が向上していることが、 図 5より明らかである。
( 5) 上記の如く して得られた 7種類の高濃度 H2〇2 酸化耐性変異ひーァミラ —ゼの大量培養を行なった。 変異遺伝子を ^ subtilis I SW 1 2 1 4株 （ uA 8 metB5 hsd l) にプロ トプラスト法 （Chang & Cohen, Mol. Gen. Genet. , 168, 111-115, 1979 ) により形質転換し （図 6及び図 7参照） 、 コーンスティープリ カー， 4 % ; トリプトース， 1 % ； 肉エキス， 1. 0 % ； リ ン酸第 1 カリゥ厶， 0. 1 %, Mg S〇4, ΝΗ2〇， 0. 0 1 %， マル ト 一ス 2 % ; C a C ^ 2, 0. 1 % ; テトラサイクリ ン， 1 5 を含有する液体培地で 3 (TCで 3日 間、 坂口フラスコ中で培養した。 得られた培養上清液を硫安分画 （〜 6 0 %飽和） して l OmM T r i s— HC ^緩衝液 （pH7. 5 ； 2 mM C a C 2を含む） で 一昼夜透析した。 透析後、 同じ緩衝液で平衡化した DE AE— Toyopearl カラム に添着させ、 通過させた後、 この溶液を上述の緩衝液で平衡化した C M - Toyopearlカラムに添着すると吸着し、 N a C で連続勾配によって、 目的の酵 素が溶出された。 この溶出液を PM— 1 0 メンブランフィルタ一 （アミコン社） 上で濃縮した後、 上述の緩衝液で透析することによつて完全精度標品が得られた。 得られた標品の全てが、 S D S—電気泳動 （Laemmli, Nature, London, 227, 680-685, 1970 ) で単一バンドを与え、 分子量も全て約 5 5 KD aと決定された。 得られた各変異ひ 一アミラーゼの完全精製標品を 2 % (588mM) の H 202を含 む 5 OmMトリス緩衝液 （pH8. 5 ) 中、 3 0 °Cでインキュベートした後、 残存す るアミラーゼ活性を測定することによって、 酸化剤耐性度を検定した （KAO 法） 。 その結果、 図 8〜図 1 2に示すように野生型ひ—アミ ラーゼや ARGの活 性は速やかに低下したが、 各変異ひ —アミラーゼは 1時間のィンキュベ一ト後に 於いても 8 0 %以上の高い残存活性を示した。 また、 H202濃度を 2Mまで高め た条件 （30で、 30分処理） に於いても、 各変異 α—アミ ラーゼは高い残存ア ミ ラ ーゼ活性を発揮し、 極めて高い酸化剤耐性能を獲得していることが明らかになつ た。 一方、 WOZ 2 3 8 7 3に於いて、 酸化剤耐性が向上した変異アミラーゼが 開示されているカ^ これらは 2 0 0 mMの Η2〇2と 0. 1 mM C a C ^ 2を含 む 5 0 millプリ ッ トン緩衝液 （pH9. 0 ) 中、 4 0 °C、 2 0分間の処理 （W法） に よって 4 3〜2 0 %の残存活性を示すとされている。 本発明の変異ひーァミラー ゼの酸化剤耐性度をこの W法を用いて検定したが、 1時間の処理後にも 8 0 %以 上の残存活性を示し （図 8〜図 1 2) 、 W0/ 2 3 8 7 3の変異酵素に比べて極 めて高い酸化剤耐性を獲得していることが明らかになった。
得られた変異ひ —ァミラーゼのタンパク含量を前記の方法により測定し、 その 比活性を算出した。 その結果、 野生型が 4 0 0 0 - 5 5 0 0であるのに対し、 M e t 2 0 2 S e r力 7 0 0 — 7 5 0、 M e t 2 0 2 T h r力く 2 2 0 0 — 2 4 0 0、 Me t 2 0 2 V a lが 1 1 0 0 - 1 4 0 0、 M e t 2 0 2 A l aが 1 3 5 0— 1 5 0 0、 Me t 2 0 2 C y sが 1 4 5 0 - 1 6 0 0、 Me t 2 0 2 I 1 e力 1 6 0 0 - 1 8 0 0、 M e t 2 0 2 L e u力べ 1 6 0 0 — 2 0 0 0、 △ R Gが 3 5 0 0 - 4 5 0 0、 Δ R G/M e t 2 0 2 T h rで 2 0 0 0 - 2 5 0 0. NC I B 1 2 5 1 2. NC I B 1 2 5 1 3及び NC I B 1 2 2 8 5が 4 0 0 0 - 4 5 0 0. licheniforniisが約 1 3 0 0 (それぞれ単位/ mg夕ンパ ク） であった。
実施例 2
得られた H2〇2 酸化耐性変異ァミラ一ゼ Me t 2 0 2 L e uと Me t 2 0 2 Th rを l OmM TE AD/2 0 mM N a B〇 4 の漂白系で 5 0 mM T r i s— HC ^緩衝液 （pH8. 5 ) 中、 4 (TCで 1時間保持した。 処理後の残存アミラー ゼ活性を測定したところ、 野生型 （非変異ひ—アミラーゼ） 力 \ ほぼ完全失活し たにもかかわらず、 Me t 2 0 2 L e uで 7 7 %、 Me t 2 0 2 Th rで 8 0 % の活性を保持していた。
実施例 3
造粒化した Me t 2 0 2 Th rを A社の超コンパク ト洗剤中に 5 %
配合した後、 4 0°C相対湿度 8 0 %の保存庫で 4週間保存した。 造粒品をひろい 出し、 2mMの C a C £ 2 を含む 5 OmM T r i s— H C 緩衝液 （pH 8. 5 ) に 溶解した後、 遠心分離 （ 1 2 0 0 O x g, 2 0分間） して得られる上清液の残存 ァミラーゼ活性を測定した。 野生型と Me t 2 0 2 T h rの処理前の比活性をそ れぞれ 1 0 0とした場合、 残存活性は、 前者で 5 5 %、 後者で 8 8 %であった。 実施例 4
subtilis I SW 1 2 1 4を宿主として発現させ、 菌体外に生産された組換 えひ 一アミラーゼ、 Me t 2 0 2 L e u、 Me t 2 0 2 I 1 e、 M e t 2 0 2 T h r、 M e t 2 0 2 V a M e t 2 0 2 C y s , M e t 2 0 2 A 1 a , Me t 2 0 2 S e r , 野生型ひ 一アミラ一ゼ及び△ R Gを前記の手法を用いて精 製した。 その精製品について SDS—電気泳動を行なうと、 それぞれ単一バン ド として検出され、 分子量は約 5 5 KD aと算出された。 それぞれの収率は 4 0〜 6 0 %の範囲であった。
参考例 1
得られた酸化剤耐性変異ひ —アミラーゼの pH—活性曲線を、 ブリ ッ トン一 口ビ ンソン広域緩衝液と、 各種類を組み合わせた緩衝系 （各々 5 OmM) で調べた。 そ の一例として、 各種緩衝液系での Me t 2 0 2 Th rの結果を図 1 3に示したが、 いずれの緩衝系を用いてもその pH—活性曲線は野生型のそれとほぼ同じ型を示し た。
参考例 2
得られた酸化剤耐性変異ひ —アミラーゼ Me t 2 0 2 Th rの温度—活性曲線 を 5 OmM T r i s — HC ^緩衝液 （pH8. 5 ) 中で調べた （反応時間は 5分 間） 。 その結果の一例を図 1 4に示す。 産業上の利用可能性
本発明の変異ひ 一アミラーゼは、 至適 pHがアルカリ側にあり、 優れたひ 一アミ ラーゼ活性を有し、 酸化剤に対する耐性が高く、 かつ持続するので、 特に漂白剤 や酸化剤の配合された洗浄剤や澱粉液化 ·糖化用組成物の配合成分として有用で ある。 6 I
J'U dJi gjv djx s人 9qj usy J9S S!H JM1 usv ^io SJV ^19 ojd 9Md
O 9SI 081 dsv 3Md sAq jqx dJi ¾iv n{Q 9]i J¾ J nio A 10 s d\\ nio uio
m 0Z\ 911 us § -IV usv J9S V usy ί¾Λ nio ί¾Λ ^IV usy Ι¾Λ nio ^ΜΙ 19
0Π 901 001 dsv ¾IV o O sAi SIH usy ϊ¾Λ Ι^Λ dsy Aio Ι¾Λ "19 911
96 06 98
IO usv usv sAq naq JQS J¾ Ι¾Λ ¾IV UIO つ uio S SJ J¾
08 A 0丄 99
AIO J'U sAq j i SJV Λ ^Ml 。 sAq uio usy aqd i "^l dsy
09 55 OS
J i n9 dsv J ¾IV Aio JAi Aio dsv usy uio S 3 sAq
oi7 gg
dJi ^IV OJd OJd an dJi 1¾Λ ^IV J 911 o sAq J9S sAq naq usy
08 92 02
¾1V ¾1V dsv dsy §JV N31 usy 丄 SIH usy A]g dsy usy OJJ Π9
3ΐ Οΐ 9
s!H dJi nio ^ d ^io } ^j^ J¾ Ajo usy JMl Λ usv SIH SIH
、 ^ :
m ： 一 a。H 翊
9 8
Figure imgf000021_0001
f9fiO/86df/X3d 9Z W86 OW 145 150 155 160
His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gin Ser Arg Gin Leu Gin Asn Lys
165 170 175
He Tyr Lys Phe Arg Gly Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190 lie Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp He Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val lie Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr
210 215 220
Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg t le Asp Ala Val Lys His 225 230 235 240 lie Lys Tyr Ser Tyr Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr
245 250 255
Thr Gly Lys Pro Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu
260 265 270
Ala Ala lie Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Trp Asn His Ser Val
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly
290 295 300
Gly Tyr Phe Asp Met Arg Asn lie Leu Asn Gly Ser Val Val Gin Lys 305 310 315 320
His Pro lie His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gin Pro
325 330 335
Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Gin Ser Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
Tyr Ala Leu lie Leu Thr Arg Glu Gin Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr 355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly lie Pro Thr His Gly Val Pro Ser Met Lys Ser
370 375 380
Lys lie Asp Pro Leu Leu Gin Ala Arg Gin Thr Tyr Ala Tyr Gly Thr 385 390 395 400
Gin His Asp Tyr Phe Asp His His Asp lie He Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asp Ser Ser His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr lie Met Ser Asp
420 425 430
Gly Pro Gly Gly Asn Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys His Lys Ala Gly
435 440 445
Gin Val Trp Arg Asp He Thr Gly Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr He
450 455 460
Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Thr Val Asn Gly Gly Ala Val Ser 465 470 475 480
Val Trp Val Lys Gin
485

Claims

請 求 の 範 囲
1. 液化型アル力リ ひ —アミラーゼを構成する配列番号 1で示されるアミノ酸 配列又は当該配列に対して 9 5. 2%以上の相同性を有するァミノ酸配列におけ る 2 0 2位のメチォニン残基又はその相同位のメチォニン残基が欠失又は任意の 他のァミノ酸に置換されている変異ひ —ァミラーゼ。
2. 任意の他のァミノ酸残基が、 Th r、 I l e、 L e u、 A l a、 Va l又 は S e rである請求項 1記載の変異ひーァミラーゼ。
3. 配列番号 1の 2 0 2位のメチォニン残基が欠失又は任意の他のァミ ノ酸残 基に置換されており、 かつ 1 8 1位のアルギニン残基及び 1 8 2位のグリ シン残 基が欠失したものである請求項 1又は 2記載の変異ひ —ァミラーゼ。
4. 請求項 1〜 3のいずれか 1項記載の変異ひ一了ミラ一ゼをコ一ドする遺伝 子。
5. 請求項 1〜 3のいずれか 1項記載の変異ひ一アミラーゼを含有する洗浄剤 組成物。
PCT/JP1998/001464 1997-03-31 1998-03-31 MUTATED α-AMYLASES WO1998044126A1 (en)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/381,687 US6486113B1 (en) 1997-03-31 1997-03-31 Mutant α-amylases
JP54145598A JP4126098B2 (ja) 1997-03-31 1998-03-31 変異α−アミラーゼ
DE69840500T DE69840500D1 (de) 1997-03-31 1998-03-31 Mutierte alpha-amylasen
EP98911122A EP0985731B1 (en) 1997-03-31 1998-03-31 Mutated alpha-amylases
DK98911122T DK0985731T3 (da) 1997-03-31 1998-03-31 Muterede alfa-amylaser

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP9/80299 1997-03-31
JP8029997 1997-03-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1998044126A1 true WO1998044126A1 (en) 1998-10-08

Family

ID=13714403

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1998/001464 WO1998044126A1 (en) 1997-03-31 1998-03-31 MUTATED α-AMYLASES

Country Status (8)

Country Link
US (1) US6486113B1 (ja)
EP (1) EP0985731B1 (ja)
JP (1) JP4126098B2 (ja)
CN (1) CN1197969C (ja)
DE (1) DE69840500D1 (ja)
DK (1) DK0985731T3 (ja)
ES (1) ES2320602T3 (ja)
WO (1) WO1998044126A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6743616B2 (en) 2000-10-11 2004-06-01 Kao Corporation Highly productive alpha-amylases
JP2010521987A (ja) * 2007-03-23 2010-07-01 ダニスコ・ユーエス・インク、ジェネンコー・ディビジョン 成熟アミラーゼ蛋白へのｎ末端導入によるアミラーゼ産出の増加
EP1637596B1 (en) * 1994-03-29 2011-05-18 Novozymes A/S Alkaline bacillus amylase
DE102004047777B4 (de) 2004-10-01 2018-05-09 Basf Se Alpha-Amylase-Varianten mit erhöhter Lösungsmittelstabilität, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung
WO2022071451A1 (ja) 2020-10-02 2022-04-07 花王株式会社 α－アミラーゼ変異体
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001240473A1 (en) * 2000-03-08 2001-09-17 Novozymes A/S Variants with altered properties
US20020155574A1 (en) * 2000-08-01 2002-10-24 Novozymes A/S Alpha-amylase mutants with altered properties
DE10138753B4 (de) * 2001-08-07 2017-07-20 Henkel Ag & Co. Kgaa Wasch- und Reinigungsmittel mit Hybrid-Alpha-Amylasen
CN1313608C (zh) * 2004-01-18 2007-05-02 中国科学院微生物研究所 一种碱性α－淀粉酶及其编码基因与生产方法
CA2854912A1 (en) * 2004-07-05 2006-01-12 Novozymes A/S Alpha-amylase variants with altered properties
DE102004047776B4 (de) 2004-10-01 2018-05-09 Basf Se Gegen Di- und/oder Multimerisierung stabilisierte Alpha-Amylase-Varianten, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung
DE102006038448A1 (de) 2005-12-28 2008-02-21 Henkel Kgaa Enzym-haltiges Reinigungsmittel
MX2009009378A (es) 2007-03-09 2009-09-22 Danisco Us Inc Genencor Div Variantes de alfa-amilasa de especies de bacillus alcalifilico, composiciones que comprenden las variantes de alfa-amilasa, y metodos de uso.
CN106661563A (zh) * 2014-06-12 2017-05-10 诺维信公司 氧化稳定的α‑淀粉酶变体
EP3891264A1 (en) * 2018-12-03 2021-10-13 Novozymes A/S LOW pH POWDER DETERGENT COMPOSITION

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994002597A1 (en) * 1992-07-23 1994-02-03 Novo Nordisk A/S MUTANT α-AMYLASE, DETERGENT, DISH WASHING AGENT, AND LIQUEFACTION AGENT
WO1994026881A1 (en) 1993-05-19 1994-11-24 Kao Corporation LIQUEFYING ALKALINE α-AMYLASE, PROCESS FOR PRODUCING THE SAME, AND DETERGENT COMPOSITION CONTAINING THE SAME
WO1995026397A1 (en) 1994-03-29 1995-10-05 Novo Nordisk A/S Alkaline bacillus amylase
JPH08506491A (ja) * 1993-02-11 1996-07-16 ジェネンカー インターナショナル，インコーポレイティド 酸化安定性アルファ−アミラーゼ
WO1996023873A1 (en) 1995-02-03 1996-08-08 Novo Nordisk A/S Amylase variants
JPH08336392A (ja) 1995-06-14 1996-12-24 Kao Corp 液化型アルカリα−アミラーゼ遺伝子

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6093562A (en) * 1996-02-05 2000-07-25 Novo Nordisk A/S Amylase variants
WO1996030481A1 (en) 1995-03-24 1996-10-03 Genencor International, Inc. An improved laundry detergent composition comprising amylase

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994002597A1 (en) * 1992-07-23 1994-02-03 Novo Nordisk A/S MUTANT α-AMYLASE, DETERGENT, DISH WASHING AGENT, AND LIQUEFACTION AGENT
JPH08506491A (ja) * 1993-02-11 1996-07-16 ジェネンカー インターナショナル，インコーポレイティド 酸化安定性アルファ−アミラーゼ
WO1994026881A1 (en) 1993-05-19 1994-11-24 Kao Corporation LIQUEFYING ALKALINE α-AMYLASE, PROCESS FOR PRODUCING THE SAME, AND DETERGENT COMPOSITION CONTAINING THE SAME
WO1995026397A1 (en) 1994-03-29 1995-10-05 Novo Nordisk A/S Alkaline bacillus amylase
WO1996023873A1 (en) 1995-02-03 1996-08-08 Novo Nordisk A/S Amylase variants
JPH08336392A (ja) 1995-06-14 1996-12-24 Kao Corp 液化型アルカリα−アミラーゼ遺伝子

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GRAY G. L., ET AL.: "STRUCTURAL GENES ENCODING THE THERMOPHILIC ALPHA-AMYLASES OF BACILLUS STEAROTHERMOPHILUS AND BACILLUS LICHENIFORMIS.", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 166., no. 02., 1 May 1986 (1986-05-01), US, pages 635 - 643., XP002910153, ISSN: 0021-9193 *
JOERGENSEN P. L., ET AL.: "CLONING OF A CHROMOSOMAL ALPHA-AMYLASE GENE FROM BACILLUS STEAROTHERMOPHILUS.", FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, WILEY-BLACKWELL PUBLISHING LTD., GB, vol. 77., 1 January 1991 (1991-01-01), GB, pages 271 - 275., XP002910152, ISSN: 0378-1097, DOI: 10.1016/0378-1097(91)90564-Q *
See also references of EP0985731A4 *
TSUKAMOTO A., ET AL.: "NUCLEOTIDE SEQUENCE OF THE MALTOHEXAOSE-PRODUCING AMYLASE GENE FROM AN ALKALOPHILIC BACILLUS SP. #707 AND STRUCTURAL SIMILARITY TO LIQUEFYING TYPE ALPHA-AMYLASES.", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, ACADEMIC PRESS INC. ORLANDO, FL, US, vol. 151., no. 01., 29 February 1988 (1988-02-29), US, pages 25 - 31., XP002910151, ISSN: 0006-291X, DOI: 10.1016/0006-291X(88)90554-2 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1637596B1 (en) * 1994-03-29 2011-05-18 Novozymes A/S Alkaline bacillus amylase
US6743616B2 (en) 2000-10-11 2004-06-01 Kao Corporation Highly productive alpha-amylases
US7297527B2 (en) 2000-10-11 2007-11-20 Kao Corporation Highly productive α-amylases
DE102004047777B4 (de) 2004-10-01 2018-05-09 Basf Se Alpha-Amylase-Varianten mit erhöhter Lösungsmittelstabilität, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung
JP2010521987A (ja) * 2007-03-23 2010-07-01 ダニスコ・ユーエス・インク、ジェネンコー・ディビジョン 成熟アミラーゼ蛋白へのｎ末端導入によるアミラーゼ産出の増加
WO2022071451A1 (ja) 2020-10-02 2022-04-07 花王株式会社 α－アミラーゼ変異体
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

Also Published As

Publication number Publication date
DE69840500D1 (de) 2009-03-12
ES2320602T3 (es) 2009-05-25
CN1197969C (zh) 2005-04-20
DK0985731T3 (da) 2009-04-20
US6486113B1 (en) 2002-11-26
EP0985731A4 (en) 2000-12-27
EP0985731A1 (en) 2000-03-15
EP0985731B1 (en) 2009-01-21
CN1251613A (zh) 2000-04-26
JP4126098B2 (ja) 2008-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3025627B2 (ja) 液化型アルカリα−アミラーゼ遺伝子
WO1998044126A1 (en) MUTATED α-AMYLASES
FI106315B (fi) Menetelmä entsyymien stabiilisuuden parantamiseksi sekä stabiloidut entsyymit
AU682863C (en) Oxidatively stable alpha-amylase
US20080026976A1 (en) Highly productive alpha-amylases
EP0407225A1 (en) Enzymes and enzymatic detergent compositions
JP2000197491A (ja) 枯草菌／大腸菌シャトルベクター
US5658871A (en) Microbial lipase muteins and detergent compositions comprising same
KR19980702783A (ko) 아밀라제를 포함하는 개선된 세탁 세제 조성물
US20090226961A1 (en) Mutant alpha-amylases
CZ163995A3 (en) VARIANTS OF CUTINASES WITH ADJUSTED COMPATIBILITY TO ANIONIC WETTING AGENTS, PRODUCTION PROCESS FOR SAID CUTINASE VARIANTS, BY MICRO-ORGANISMS TREATED rDNA, POLYNUCLEOTIDES-CONTAINING SEQUENCE OF NUCLEOTIDES ENCODING THE CUTINASE VARIANTS, VECTORS OF RECOMBINANT DNA CAPABLE OF CONTROL GENE EXPRESSION FOR SAID CUTINASE VARIANTS, AND ENZYMATIC DETERGENTS CONTAINING THE CUTINASE VARIANTS
JPH05507283A (ja) プロテアーゼ及びインヒビターを含む洗浄剤並びにそれに利用する新規なるインヒビター
JP2004000122A (ja) アルカリプロテアーゼ
WO2022071451A1 (ja) α－アミラーゼ変異体
JP2004057195A (ja) 変異アルカリプロテアーゼ
JP4220611B2 (ja) 変異α−アミラーゼ
JP7510309B2 (ja) α－アミラーゼ変異体
JP2006174841A (ja) 変異プルラナーゼ
JP2009254361A (ja) プラスミドベクター
JP4417532B2 (ja) 変異α−アミラーゼ
JP4495789B2 (ja) 変異プルラナーゼ
WO2023120594A1 (ja) アミラーゼ配合洗浄剤組成物
JP5666816B2 (ja) 変異アルカリセルラーゼ

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 98803821.8

Country of ref document: CN

AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CN JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09381687

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1998911122

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1998911122

Country of ref document: EP