WO1998036076A1 - Proteine antigene modifiee derivant du treponeme pale - Google Patents

Proteine antigene modifiee derivant du treponeme pale Download PDF

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WO1998036076A1
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modified protein
antigen
amino acid
dna
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PCT/JP1998/000605
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Yasuyuki Kuroiwa
Nobuyuki Okazaki
Hiromi Iijima
Yoshiki Nakao
Takeshi Sawazaki
Makoto Mizukami
Yukihiro Nishikawa
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Higeta Shoyu Co., Ltd.
Hitachi Chemical Co., Ltd.
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
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    • G01N2333/44—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from protozoa

Definitions

  • the present invention relates to a modified protein, a DNA encoding the same, a recombinant vector containing the DNA, a transformant containing the recombinant vector, a method for producing the modified protein, a method for measuring an anti-Treponemal pallidum antibody, and
  • the present invention relates to a reagent for measurement, a diagnostic agent for syphilis infection, and a method for producing an anti-Treponemal pallidum antibody.
  • lipoproteins which are complexes of lipids and proteins, are known to remain on cell membranes and function as antigenic proteins in various pathogens.
  • An antibody assay using a fraction containing a lipoprotein derived from a pathogenic bacterium as an antigen is widely used.
  • Treponema's Paridam is known as the causative agent of syphilis.
  • an antibody assay using a cell membrane fraction obtained from the cells of T. pallidum is currently used.
  • Treponema pallidum can grow only in the cells or tissues of infected animals.
  • To obtain the cell membrane fraction of the antigen Treponema pallidum A method has been used in which the bacterium is transmitted to rabbit testes, Treponema pallidum is obtained from the testes, and a cell membrane fraction is obtained from the cells. However, this method did not make it possible to obtain a large amount of antigen.
  • the cell membrane fraction of T. pallidum contains various antigenic proteins, which are lipoproteins.
  • the present invention provides a modified protein that can be secreted from a microorganism, has little protein denaturation, and has excellent production efficiency.
  • the present invention also provides a modified protein having high secretion efficiency in addition to the effects of the present invention.
  • the present invention provides, in addition to the effects of the present invention, a Treponema pallidum antigen
  • the present invention provides a modified protein having the above antigenicity.
  • the present invention provides a modified protein having antigenicity as a T. pallidum-specific antigen in addition to the effects of the present invention.
  • the present invention provides a modified protein having excellent antigenicity as a Treponema pallidum-specific antigen in addition to the effects of the present invention.
  • the present invention provides a modified protein which is a fusion protein having excellent antigenicity as an antigen of various microorganisms in addition to the effects of the present invention. Further, the present invention provides a modified protein which is a fusion protein having excellent antigenicity as a Treponema pallidum-specific antigen in addition to the effects of the present invention.
  • the present invention provides a modified protein having extremely excellent antigenicity as a Treponemal pallidum-specific antigen in addition to the effects of the present invention. Further, the present invention provides a DNA useful for producing a modified protein capable of being secreted from a microorganism.
  • the present invention provides a DNA useful for producing a modified protein having excellent antigenicity as a Treponemal pallidum-specific antigen, in addition to the effects of the present invention.
  • the present invention provides a recombinant vector useful for producing a modified protein that can be secreted from a microorganism.
  • the present invention provides a transformant useful for producing a modified protein capable of being secreted from a microorganism.
  • the present invention provides a transformant which is useful for producing a modified protein having excellent antigenicity as a Treponemal pallidum-specific antigen in addition to the effects of the present invention.
  • the present invention provides a method for producing a modified protein that can be secreted from a microorganism.
  • the present invention provides a simple method for producing a modified protein having excellent antigenicity in addition to the effects of the present invention.
  • the present invention is capable of secreting from a microorganism
  • An object of the present invention is to provide a method for measuring an anti-Treponemal pallidum antibody, which is useful for diagnosing syphilis infection, using a modified protein having antigenicity as an antigen as a Ridham antigen.
  • the present invention provides an anti-Treponemal pallidum antibody useful for diagnosing syphilis infection, which is capable of being secreted from a microorganism and contains a modified protein having antigenicity as a treponema's noridum antigen. Is provided.
  • the present invention provides a diagnostic agent for syphilis infection useful for diagnosing syphilis infection, comprising a modified protein capable of being secreted from a microorganism and having an antigenicity as a Treponema-Noridum antigen as an active ingredient. It is.
  • the present invention provides a method for producing an anti-Treponemal 'palydam antibody which is useful for diagnosing syphilis infection. Disclosure of the invention
  • the present invention relates to the following (1) to (21).
  • the modified protein according to (5) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • microorganism-derived antigen protein is a fusion protein comprising an antigen protein derived from Treponema pallidum and having a molecular weight of about 47 K daltons and / or about 17 K daltons.
  • a transformant into which the gene encoding the modified protein according to any one of (1) to (10) has been introduced is cultured, and the modified protein is produced and accumulated in the culture to obtain the culture.
  • a method for producing a modified protein comprising:
  • a reagent for measuring an anti-Treponemal pallidum antibody comprising the modified protein according to any of (4) to (10) as an antigen.
  • a diagnostic agent for syphilis infection comprising the modified protein according to any one of (4) to (10) as an active ingredient.
  • amino acid sequence at the amino terminal is numbered 1 and the base sequence at the 5 'end is numbered 1.
  • the modified protein of the present invention has an amino acid sequence in which at least one cysteine residue of the protein has been converted to a non-lipid-binding amino acid residue (hereinafter, referred to as amino acid sequence (A)).
  • the protein is not particularly limited, and includes, for example, proteins derived from organisms such as animals, plants, microorganisms, and viruses.
  • examples of the protein include non-secretory proteins, and examples of the non-secretory protein include a membrane protein and a cytoplasmic protein.
  • examples of membrane proteins include various enzymes and various receptors present on cell membranes.
  • the non-secretory proteins include lipoproteins, which are proteins to which lipids are bound.
  • examples of the protein include various antigenic proteins present on the cell membrane.
  • antigenic proteins present on cell membranes include proteins derived from microorganisms, such as Treponema pallidum, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, various hepatitis viruses, human immunodeficiency virus, adult leukemia virus, Examples include antigenic proteins derived from herpes virus, RS virus, rubella virus, varicella virus, mycoplasma, toxoplasma and the like. Examples of the antigenic proteins derived from Treponema pallidum include antigenic proteins having a molecular weight of about 47 K daltons, about 17 K daltons, and about 15 K daltons.
  • antigenic proteins derived from Chlamydia pneumoniae include, for example, And antigenic proteins having a molecular weight of about 39.5 K daltons, about 53 K daltons, and about 70 K daltons.
  • antigenic proteins derived from Chlamydia trachomatis include, for example, a molecular weight of about 39.5 daltons. .5K daltons, about 59.5K daltons and about 75K daltons antigen proteins, and the like.
  • These antigenic proteins may be natural proteins (mature proteins) originally possessed by these microorganisms, It may be a fusion protein obtained by linking two or more modified proteins or antigenic proteins in which the amino acid sequence has been modified.
  • antigenic proteins derived from microorganisms contain a cysteine residue, and a lipid binds to the cysteine residue to form a riboprotein, and the produced antigen protein becomes a cell membrane protein.
  • antigenic proteins produced in cells such as recombinant microorganisms remain in the recombinant cells and become insolubilized in the cells of the producing microorganisms. They tend to form inclusion bodies, denature antigen proteins, and impair the yield of antigen proteins.
  • the modified protein of the present invention has an amino acid sequence (at least one cysteine residue of a natural protein (mature protein)) converted to an amino acid non-binding amino acid residue. A) is preferable.
  • the protein has the amino acid sequence (A) in which the cystine residue located at the amino-terminal side of the natural protein is replaced with a non-lipid-binding amino acid residue. Further, it is preferable that the cysteine residue at the position closest to the amino group terminal of the natural protein has the amino acid sequence (A) converted to a lunar non-binding amino acid residue.
  • the number of cysteine residues to be converted is 2 as long as the resulting modified protein retains the properties of the original protein, for example, as long as it retains antigenicity as Treponema pallidum antigen and can be secreted from microorganisms. It may be more than one.
  • the non-lipid-binding amino acid residue is not particularly limited as long as it is an amino acid residue other than a cysteine residue that binds via a fatty acid to the cell membrane of a microorganism that produces the modified protein.
  • amino acid residues such as glycine, alanine, palin, isoleucine, mouth isine, feniralanine, proline, serine, threonine, aspartic acid, glutamic acid, asparagine, glutamine, histidine, lysine, arginine, tributane and tyrosine. are listed.
  • the side chain is a small and hydrophilic amino acid residue, and examples thereof include alanine, glutamic acid, and serine. Furthermore, from the viewpoint that the antigenicity does not change, More preferably, it is alanine.
  • amino acid sequence (A) may be an antigen derived from Treponema pallidum, as long as the resulting modified protein retains the properties inherent in the original protein, for example, Treponema pallidum antigen.
  • Amino acid residues (for example, 1 to 20 amino acids) may be missing from the protein (for example, the region from the 1st to 50th amino acid of the antigen protein).
  • the modified protein of the present invention may be directly or directly attached to the amino terminal or carboxyl terminal of the amino acid sequence (A).
  • a fusion protein having a structure in which one or more different amino acid sequences are bonded may be used.
  • the modified protein is a fusion protein
  • the original antigen protein constituting the fusion protein may be the same or different, but the obtained fusion protein can retain various antigenicities. It is preferable that at least one of the antigen proteins to be bound has a different antigenicity from other antigen proteins.
  • this fusion protein is used as an antigen, a variety of antigens can be prepared simply by preparing the fusion protein, compared to the case where individual antigen proteins having different antigenicity are prepared and mixed to form an antigen. Since it is possible to obtain an antigen that retains its antigenicity, it is easy to prepare the antigen, and high antigenicity can be expected.
  • the number of antigen proteins constituting the fusion protein is not particularly limited as long as the obtained fusion protein retains the antigenicity of the microorganism used as an antigen.
  • fusion protein obtained using antigenic proteins derived from two or more types of microorganisms is used as an antigen
  • the number of types of microorganisms that can be screened by one antigen can be increased. Diagnosis of which microorganisms are infected can be performed quickly and easily.
  • the length of the intervening amino acid sequence and the type of the constituent amino acids depend on the resulting fusion protein, There is no particular limitation as long as the antigenicity of the microorganism to be used is retained, but it is preferable that the intervening amino acid sequence itself does not retain antigenicity.
  • Such an intervening amino acid sequence includes, for example, isoleucine residue. A polydaricin residue having several to several tens of groups or amino acid residues is exemplified.
  • amino acid sequence (A) examples include those described above.
  • amino acid sequence of the amino acid sequence (A) of the modified protein can be easily and simply purified from the culture supernatant of the microorganism producing the modified protein without requiring a complicated purification step. It is preferable to add an amino acid sequence (B) which is recognized as a signal peptide in a microorganism producing the modified protein to the base terminal side.
  • an amino acid sequence includes, for example, Bacillus brevis (Bacyl). lus brevis) as an amino acid sequence recognized as a signal peptide.
  • a fusion protein comprising the amino acid sequence (B) and the amino acid sequence (A) in a microorganism
  • the fusion protein moves to the vicinity of the cell membrane, where the amino acid sequence (A) is cleaved from the fusion protein by the signal peptide enzyme in the cell membrane and secreted out of the microorganism.
  • the desired modified protein can be efficiently produced without being insolubilized in the cells of the microorganism producing it to form an inclusion body and without denaturation of the protein by remaining in the cells.
  • modified protein of the present invention include, for example, the proteins represented by SEQ ID NOs: 1 to 4.
  • the protein represented by SEQ ID NO: 1 is an antigenic protein derived from Treponema pallidum having a molecular weight of about 47 K daltons, which lacks amino acids 1 to 19 and cysteine residue which is amino acid residue 20. It has a structure in which a group is substituted with an aranine residue. Since this protein produces an antigen-antibody reaction with the serum of syphilis patients, it has antigenicity as Treponema pallidum antigen.
  • the protein represented by SEQ ID NO: 2 is obtained by deleting the first to second amino acid residues of the antigen protein of Treponema 'Paridum fungi having a molecular weight of about 17 K daltons. It has a structure in which the cysteine residue, which is the second amino acid residue, is substituted with an aranine residue. Since this protein produces an antigen-antibody reaction with the serum of syphilis patients, it has antigenicity as Treponema pallidum antigen.
  • the protein represented by SEQ ID NO: 3 is an amino acid residue at the 18th position where amino acids 1 to 17 of the antigenic protein derived from T. pallidum and having a molecular weight of about 15 K daltons are deleted. It has a structure in which a cysteine residue is substituted with an arabin residue. Since this protein produces an antigen-antibody reaction with the serum of syphilis patients, it has antigenicity as Treponema pallidum antigen.
  • the modified protein represented by SEQ ID NO: 4 lacks amino acid residues 1 to 19 of the antigen protein of about 47 K daltons derived from Treponema pallidum, and amino acid residue 20 of amino acid residue 20
  • the cysteine residue is substituted with an arabin residue at the carboxyl-terminal end of the protein.
  • an isoleucine residue one of the antigenic proteins derived from Treponema ′ 21 This is a fusion protein having a structure in which the first amino acid residue is deleted and the protein after the cysteine residue, which is the second amino acid residue, is bound.
  • this protein Since this protein produces an antigen-antibody reaction with the serum of syphilis patients, it has an extremely excellent antigenicity as a Treponema pallidum-specific antigen, and has a molecular weight of about 47 K daltons derived from Treponema pallidum. It has various antigenicities, retaining two antigenicities: antigenicity as an antigenic protein and antigenicity as an antigenic protein with a molecular weight of about 17 K daltons.
  • Methods for producing the modified protein of the present invention include a chemical synthesis method and a gene recombination method.
  • a map Multiple Antigen Peptide, MAP
  • MAP Multiple Antigen Peptide
  • a DNA encoding the modified protein of the present invention is inserted into a vector to prepare a recombinant vector, which is then inserted into a host and transformed.
  • a method of preparing a transformant, culturing the transformant, and using the transformant itself or the culture supernatant is used.
  • Examples of the vector include a plasmid vector and a phage vector.
  • Examples of the host include Bacillus brevis, Bacillus subtilis, Escherichia coli, yeast and the like.
  • the recombinant vector can be prepared by inserting a DNA encoding the modified protein of the present invention (described later) into a plasmid vector, phage vector, or the like that can be replicated in a host cell according to a conventional method. At that time, use a linker if necessary.
  • a plasmid vector a transformant having the recombinant vector to be prepared can be easily screened, and the erythromycin resistance gene and the neomycin resistance can be stably maintained in the host cell. It preferably has a drug resistance gene such as a gene.
  • a plasmid vector includes a promoter sequence, a Shine-Dalgarno sequence (hereinafter, referred to as an SD sequence) and a terminator sequence. It is necessary to own it.
  • plasmid vectors include, for example, plasmids pUC118, pUB110, pNU200, pNU210, pHT926, pNH300, pNH400 and the like.
  • pUC118 and pUB110 can be purchased from Takara Shuzo.
  • pNU200 is described in detail in "Shigezo Udaka, Journal of the Japanese Society of Agricultural Chemistry, Vol. 61, p. 669 (1987)”.
  • pNU210 is described in detail in "Bioindustry, Vol. 9, pp. 100-107 (1992) (B10 INDUSTRY, Vol. 9, p. 100-107 (1992))".
  • the pHT 926 is described in detail in JP-A-6-133782.
  • phage vector for example, gtll phage, gtlO phage and the like can be used. In each case, the recombination vector corresponding to the parent vector used can be obtained.
  • the recombinant plasmid to be prepared is a plasmid capable of expressing DNA encoding the modified protein of the present invention.
  • a method for preparing such a plasmid for example, a method in which the DNA of the present invention is inserted near the promoter sequence and the SD sequence and downstream thereof, or the above-described amino acid sequence (B) that can be expressed is used.
  • a method in which the reading frame is aligned downstream of the DNA to be encoded (that is, in frame) and the DNA encoding the amino acid sequence (A) is inserted (therefore, the modified protein of the present invention obtained in a host is A fusion protein consisting of the amino acid sequence (B) and the amino acid sequence (A)).
  • the amino acid sequence (B) includes, for example, a signal peptide, and the signal peptide includes, for example, a signal peptide derived from Bacillus ′ brevis.
  • recombinant plasmid of the present invention capable of expressing DNA encoding the modified protein of the present invention include, for example, plasmids pNH400 TP47, pNH30 OTP 17, pNH400 TP 47- 17 and the like.
  • the transformant of the present invention can be prepared by inserting the recombinant plasmid into a host.
  • the host is not particularly limited as long as it expresses the DNA of the present invention in the recombinant plasmid.
  • Bacillus brevis Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), yeast, Escherichia coli and the like.
  • Bacillus brevis Bacillus subtilis (Bacillus subtilis)
  • yeast Bacillus subtilis
  • Escherichia coli and the like.
  • plasmids pNH400TP47, pNH30 OTP17 and pNH400TP47-117 are used as recombinant plasmids
  • Bacillus brevis 47 strain Bacillus brevis H102 strain (this strain is the same as Bacillus brevis HPD31 strain) Etc.) can be used.
  • Methods for inserting the recombinant plasmid into the host include, for example, an electroporation method, a protoplast method, a calcium chloride method, and a Tris-PEG (Tris-PEG) method.
  • an electroporation method for example, an electroporation method, a protoplast method, a calcium chloride method, and a Tris-PEG (Tris-PEG) method.
  • Tris-PEG Tris-PEG
  • transformant of the present invention examples include, for example, Bacillus brevis HPD31 strain (Bacillus brevis HPD31 / ⁇ 400 ⁇ 47) into which the plasmid PNH400TP47 has been inserted, and Bacillus Brevis HPD3 1 strain (Bacillusbrevis HPD3 lZpNH30 OTP 17), Bacillus brevis HPD31 strain into which plasmid pNH400TP47-17 has been introduced (Bacill 1 1 usbr evis HPD3 l / pNH400TP47-17), etc. Is mentioned.
  • B acillusbr ev is HPD 31 / p NH 400 TP 47
  • B acillusbr ev is HPD 31 no p NH 300 TP 17
  • B aci 1 1 usbrevis HPD3 lZpNH400TP47-17 was deposited at the National Institute of Bioscience and Biotechnology at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under accession number FERM BP—5642, accession number F ERM BP—5641 and accession number FE RM BP—5763. I have.
  • a method in which the transformant is placed in a medium in which the transformant can grow and shaken or allowed to stand at an appropriate temperature can be used.
  • a medium containing a carbon source and a nitrogen source can be used.
  • the carbon source include sugars and organic acids, and examples of the sugars include glucose, glycerol, starch, dextran, molasses, and the like.
  • the nitrogen source include an organic nitrogen source and an inorganic nitrogen source. Examples of the organic nitrogen source include casein, peptone, meat extract, yeast extract, casamino acid, and glycine. Examples of the source include ammonium sulfate, ammonium nitrate, and the like.
  • auxotrophy add nutrients necessary for its growth to the culture medium.
  • nutrients include, for example, amino acids, vitamins, nucleic acids, salts, and the like.
  • a synthetic medium mainly composed of a sugar and an inorganic nitrogen source can be used.
  • an antibiotic to the medium in order to stably maintain the recombinant plasmid and suppress the growth of a strain that does not have the recombinant plasmid.
  • antibiotics include penicillin, erythromycin, neomycin, chloramphenicol, bacitracin, D-cycloserine, and ampicillin.
  • soybean oil, lard oil, various surfactants and the like may be added to the medium as an antifoaming agent.
  • the pH of the medium is usually 5 to 9, and preferably 6.5 to 7.5, from the viewpoint of the pH at which the transformant can grow.
  • the medium include, for example, TMB medium (peptone 1%, meat extract 0. 5%, yeast extract 0.2%, glucose 1%, M g S 0 4 0. 0 1%, F e S 0 4 0. 0 1%, M n S_ ⁇ 4 0. 0 0 1%, Z n S_ ⁇ 4 0. 0 0 0 1% and containing 1 0 ig / ml erythromycin, and pH 7. 0) force.
  • TMB medium peptone 1%, meat extract 0. 5%, yeast extract 0.2%
  • glucose 1% M g S 0 4 0. 0 1%
  • F e S 0 4 0. 0 1% M n S_ ⁇ 4 0. 0 0 1%
  • Z n S_ ⁇ 4 0. 0 0 0 1% and containing 1 0 ig / ml erythromycin, and pH 7. 0
  • the culture temperature is usually 15 to 42 ° C, and preferably 24 to 37 ° C.
  • the cultivation time varies depending on the type of host, the physical state of the medium (solid or liquid), the cultivation apparatus, the cultivation temperature, etc.Bacillus brevis is used as the host and TMB liquid medium is used as the medium.
  • the culture temperature is 15 to 42 ° C.
  • the culture time is usually 16 to 16 hours, and preferably 24 to 96 hours.
  • the method for producing the modified protein of the present invention by culturing the transformant includes culturing the transformant into which the gene encoding the modified protein has been introduced as described above, and culturing the culture solution and the transformant after the culturing.
  • the modified protein is produced and accumulated in a different culture, the culture is obtained, and the desired modified protein is purified from the culture.
  • a cultured transformant is obtained as a culture, crushed or dissolved to obtain a crushed solution or a lysate, and the modified protein of the present invention is purified from the crushed solution or the lysate.
  • the modified protein of the present invention obtained in the host is a protein in which the signal sequence and the amino acid sequence (A) are fused
  • the signal from the fusion protein is transformed by the signal peptidase of the transformant. Since the sequence is removed and the amino acid sequence (A) is secreted from the transformant, a culture supernatant is obtained as a culture after culturing the transformant, and the culture supernatant of the present invention is obtained from the culture supernatant. It is preferable to use a simple method for purifying the modified protein as the amino acid sequence (A).
  • the yield of the desired modified protein can be improved by using a combination of a culture solution and a purification method from a cultured transformant.
  • Examples of a method for disrupting the transformant include a method for physically disrupting the transformant.For example, a method in which the transformant is suspended in a buffer and irradiated with ultrasonic waves, A method in which the body is kneaded with quartz sand and suspended in a buffer solution can be used.
  • examples of a method for lysing a transformant include a method for lysing the transformant with an enzyme that lyses the cell wall of the transformant and a surfactant, etc.
  • lysozyme can be used as this enzyme and sodium dodecyl sulfate (SDS) can be used as a surfactant.
  • the modified protein of the present invention As a method for purifying the modified protein of the present invention from the obtained crushed solution or lysate, for example, centrifugation of the crushed solution or lysate to remove cell debris, obtaining a supernatant, and obtaining streptomycin sulfate , And centrifuged, thereby removing the phosphoric acid as a precipitate, obtaining a supernatant, adding ammonium sulfate to the supernatant, stirring, and centrifuging to obtain a precipitate.
  • the method can be used.
  • the modified protein of the present invention may be contained in the supernatant, so sampling is performed to confirm the presence of the modified protein of the present invention in the supernatant and the precipitate fraction. It is preferable to keep it.
  • ammonium sulfate is added to the culture supernatant (for example, 25%), stirred, and centrifuged.
  • the method of obtaining the precipitate can then be used.
  • a low-concentration ammonium sulfate is first added (for example, 10%), stirred, centrifuged to obtain a supernatant, and the supernatant is further added with ammonium sulfate.
  • a monium for example, a final concentration of 25%
  • stir, and centrifuge to obtain a precipitate.
  • the obtained precipitate is preferably dissolved in a surfactant-containing aqueous solution from the viewpoint that a modified protein having excellent antigenicity can be obtained.
  • a surfactant-containing aqueous solution for example, a buffer commonly used for protein purification such as a PBS Tris-HCl buffer can be used.
  • the surfactant include SDS, Tween 20, and the like.
  • the concentration of the surfactant in the aqueous solution is preferably 0.05 to 2%, more preferably 0.1 to 1%, and still more preferably 0.5 to 1%. If the concentration is less than 0.05% or more than 2%, the resulting modified protein tends to lose its immunogenicity.
  • the protein is derived from Treponema pallidum, it is possible to obtain a modified protein having excellent antigenicity as Treponema pallidum. It is preferable to dissolve in an agent-containing aqueous solution.
  • the modified protein of the present invention is obtained by washing the culture supernatant of a transformant with a cation column. It can also be purified by fractionation by mouth chromatography.
  • the DNA encoding the modified protein is defined as a nucleotide sequence obtained by converting the amino acid sequence of the modified protein into a nucleotide sequence according to a triplet code table (1 to 6 nucleotide sequences are assigned to each amino acid). It means the DNA selected from the group of DNA when read.
  • modified proteins of the present invention include those described in the section of the modified proteins, and DNAs encoding the modified proteins also include those having nucleotide sequences corresponding to the amino acid sequences of these modified proteins.
  • DNA encoding the modified protein include, for example, DNA having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 5 to 8.
  • the DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 is a DNA encoding the protein shown in SEQ ID NO: 1.
  • the coding region is the sequence at positions 3 to 276.
  • DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 is a DNA encoding the protein of SEQ ID NO: 2.
  • the coding region is the sequence at positions 3 to 407.
  • DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 is a DNA encoding the protein represented by SEQ ID NO: 3, and the entire nucleotide sequence is a code region.
  • DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 is a DNA encoding the protein of SEQ ID NO: 4. In this nucleotide sequence, the entire coding region is the 3rd to 1655th sequence.
  • DNA encoding the modified protein can be produced by a chemical synthesis method or a genetic recombination method.
  • the chemical synthesis method includes, for example, the phosphoramidite method, which is suitable for the synthesis of DNA consisting of a base sequence having a total length of 100 bases or less, and is synthesized using a commercially available DNA synthesizer. can do.
  • the base sequence is divided into less than 100 bases, DNA fragments consisting of each base sequence are chemically synthesized as described above, these DNA fragments are mixed, and these DNA fragments are mixed using T4-DNA ligase. Concatenate.
  • the DNA fragment of the complementary strand is also synthesized, and when the DNA fragments are paired with each other to generate a protruding end, the protruding end serves as a sticky end, so that the desired DNA is easily obtained. .
  • the genomic DNA of the organism producing the original protein (cDNA if the organism is a eukaryote) is designed as type III, and designed based on the base sequence of the original protein, A method of performing a polymerase chain reaction (PCR) using the prepared primer DNA can be used.
  • the Treponema pallidum can be, for example, a Treponema pallidum Nichols strain, which can be used. Available from Lee Laboratories (USA).
  • the method of obtaining the genomic DNA or cDNA of the organism that produces the original protein is appropriately selected depending on the type of the organism, and is not particularly limited. For example, the method described in the document ⁇ Molecular 'Cloning ⁇ Can be followed.
  • the genomic DNA of Treponema pallidum for example, the cells of Treponema pallidum, is suspended in an aqueous solution containing 1 M sodium chloride, 1 N sodium hydroxide and 2% SDS, boiled, and 0.5 M Tris (pH 7.5. 0) is added for neutralization, phenol extraction, ethanol precipitation, and drying of the precipitate.
  • Tris pH 7.5. 0
  • the method for obtaining this genomic DNA is described in “M.V.Norgard et al., Journal 'ob'Clinical' Microbiology, Vol. 29, pp. 62-69 (1991)” (MV Norgard et al., J Clin. Microbiol., Vol. 29, p. 62-69 (1991)).
  • the nucleotide sequences of antigenic proteins derived from Treponema pallidum are described in the literatures of Weiger et al., Eikens et al., Plessel et al.
  • the base sequence of the primer DNA used in the PCR method is designed based on the base sequence of this antigen protein.
  • the base sequence of this primer DNA is the base sequence corresponding to the amino acid sequence of the antigen protein.
  • cysteine residues in the amino-terminal region of the antigen protein are converted to non-lipid-binding amino acid residues (such as alanine, glutamic acid, and serine residues). It is necessary to design.
  • the primer DNA designed in this manner can be produced by a chemical synthesis method using a commercially available DNA synthesizer.
  • the DNA can be replicated by using genetic recombination or the PCR method described above, so that the genome of the organism that produces the original protein There is no need to re-acquire DNA or cDNA.
  • the modified protein of the present invention can be used as an active ingredient of various diagnostic agents.
  • the protein when the protein is derived from Treponema pallidum, the obtained modified protein is antigenic as Treponema pallidum. It can be used as an active ingredient of a diagnostic drug for syphilis infection.
  • the method for measuring the anti-Treponemal palydam antibody is not particularly limited as long as the modified protein derived from the Treponema pari damus bacterium of the present invention is used as part or all of the antigen.
  • the modified proteins of the present invention can be used alone or in combination of two or more.
  • Examples of the method for measuring the anti-Treponemal 'palydam antibody include an immunoassay using various labels, a latex agglutination method using latex carrier particles, and an immunoturbidimetric method.
  • the modified protein Is physically or immobilized on a carrier to prepare an immobilized antigen, and the immobilized antigen is brought into contact with a sample sample and kept warm for a certain period of time, whereby an anti-treponema pallidum antibody is contained in the sample sample. If there is a force, the antibody binds to the immobilized antigen and an antigen-antibody complex is formed on the carrier, washed once if necessary, and then brought into contact with a labeled antibody against the antibody in the sample sample (in some cases) Alternatively, the specimen sample and the labeled antibody may be contacted at the same time).
  • the labeled antibody is further bound to the complex, and the labeled antibody is also immobilized on the carrier. Then, the amount of the labeled substance bound to the carrier or unlabeled antibody is measured by a measuring method according to the labeled substance, and the presence or amount of the anti-Treponemal pallidum antibody in the sample is determined from the value. Can be.
  • measurement means not only quantitative or semi-quantitative measurement but also qualitative measurement (detection, etc.).
  • the carrier is not particularly limited as long as it can immobilize the antigen.
  • examples include plastic materials such as polystyrene and vinyl chloride, fiber materials such as cellulose, nitrocellulose, and nylon, glass, and silica gel.
  • Inorganic materials such as erythrocytes, ribosomes, polyvinylidene difluoride (PDVF), etc. can be used, and their shapes are microtiter plates, beads, magnetic beads, paper disks, membranes, and yarns. It is preferable to use beads made of polystyrene or a microtiter plate from the viewpoint of the simplicity in which any shape such as is possible, and a microtiter plate made of polystyrene is particularly preferable.
  • a method for physically immobilizing the modified protein on a carrier for example, a method in which the modified protein-containing solution (antigen solution) is brought into contact with the carrier and left overnight at a low temperature (for example, 4 ° C.) is used. be able to.
  • a method for chemically fixing the modified protein to a carrier for example, a method in which the modified protein, a carrier having a carboxyl group on its surface, and carbodiimide are mixed and allowed to stand may be used.
  • Sample samples include, for example, various human liquid components, but human blood, human tears, human pharyngeal swabs, or human urine, which reflect the clinical picture of the sample provider. -
  • Human blood is more preferable, and human serum is more preferable.
  • bovine serum albumin or the like In order to prevent non-specific binding of other antibodies and the like in the sample to the carrier, it is preferable to block the surface of the carrier with bovine serum albumin or the like before adding the sample.
  • Tris containing a surfactant, a phosphate buffer, or the like can be used as the washing liquid.
  • Examples of the labeled antibody include those obtained by labeling an antibody to an antibody (eg, a human antibody) in a sample with various labeling substances.
  • Examples of the antibody to be labeled include an anti-human IgG antibody, an anti-human IgA antibody, an anti-human IgM antibody, and the like, or a partially degraded product thereof (F (ab ′) 2 , Fab, etc.). These can be appropriately used depending on the type of the antibody to be measured.
  • the point of reflection of the clinical image of the sample provider is measured by separately reacting labeled antibodies with different types of antibodies to one sample sample.
  • labeled antibodies having different types of antibodies include a labeled anti-human IgG antibody, a labeled anti-human IgA antibody, a labeled anti-human IgM antibody, and the like.
  • an enzyme for example, an enzyme, a radioisotope, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like can be used.
  • enzymes include malate dehydrogenase (enzyme number 1.1.1.37), glucose-6-phosphate dehydrogenase (enzyme number 1.1.1.49), and glucose oxidase (enzyme number 1.1.3.4).
  • an enzyme in terms of sensitivity, safety, simplicity, and the like.
  • An immunoassay using an enzyme as a labeling substance is usually performed using an enzyme immunoassay (ELISA method). ).
  • enzyme-labeled antibody simple and highly sensitive measurement is possible. It is preferable to use a '-labeled antibody or a horseradish oxidase-labeled antibody, and these enzyme-labeled antibodies are commercially available.
  • a method for measuring an anti-treponema-palidum antibody using the modified protein and using a latex agglutination method includes, for example, immobilizing the modified protein physically or chemically on latex particles (carrier).
  • a method of preparing an immobilized antigen bringing the immobilized antigen into contact with a sample sample, keeping the temperature for a certain period of time, and measuring the turbidity of a mixed solution of the sample sample and the immobilized antigen. By contacting the immobilized antigen with the specimen sample, if an anti-Treponemal pallidum antibody is present in the specimen sample, the antibody binds to the immobilized antigen to form an antigen-antibody complex.
  • the antibody since the antibody has two portions that bind to the antigen, a structure is formed in which the antigen-antibody complex crosslinks each other, and an agglutination reaction occurs. This reaction increases the turbidity of the mixed solution of the specimen sample and the immobilized antigen. The turbidity is measured visually or using an absorption photometer.
  • a method using various other fine particles such as erythrocytes and liposomes instead of latex particles can also be used.
  • the modified protein derived from Treponema pallidum bacteria of the present invention can be used as an antigen in a reagent for measuring an anti-Treponemal pallidum antibody.
  • examples of the reagent for measuring anti-Treponema / palidum antibody using an immunoassay using various labeled substances include, for example, an immobilized antigen immobilized on a carrier, examples of the reagent include separately a labeled antibody that reacts with the antibody to be measured, and examples of the reagent for measuring the anti-Treponemal pallidum antibody using the latex agglutination method include latex particles (carrier). Immobilized antigen.
  • Examples of the carrier and the labeled antibody include those described above.
  • the labeled antibody can be dispersed in a buffer or the like.
  • a labeled anti-human Ig antibody may be used as the labeled antibody. it can.
  • the labeled anti-human Ig antibody include a labeled anti-human IgG antibody, a labeled anti-human IgA antibody, and a labeled anti-human IgM antibody.
  • the labeling antibody used may be only one of these antibodies for one sample sample.However, since the clinical picture of the sample provider is reflected, However, it is preferable to use these three types of labeled antibodies. These labeled antibodies may be prepared separately or in a mixture.
  • reagents are combined with the reagent as needed.
  • other components include, for example, a negative control sample, a positive control sample, a washing solution, and a reaction substrate when the labeling substance is an enzyme or the like.
  • a diluent, a sensitizer, a reaction terminating solution, and the like may be used alone or in combination.
  • the form of the reagent may be, for example, a kit containing the required amount of the above-mentioned components, a bulk of these individual products, etc. Is mentioned.
  • examples of other components include a negative control sample, a positive control sample, a washing solution, and a sensitizer.
  • the sensitizer include serum albumin and polyethylene glycol.
  • the reagent for measuring the anti-Treponemal pallidum antibody is effectively used for diagnosis of syphilis infection.
  • the above reagent can be used as it is.
  • Anti-treponema pallidum antibody is prepared by using modified protein derived from Treponema pallidum of the present invention as an antigen, and using antiserum or isolated anti-Treponemal 'Parida Antibodies can be obtained.
  • an antiserum for example, a method of immunizing an animal such as a heron or a mouse with the antigen and obtaining the serum can be used.
  • a method for isolating and producing anti-Treponemal pallidum antibody includes, for example, immunizing a heron or a mouse with the antigen, fusing spleen cells thereof with myeloma cells to prepare a hybridoma, Select a hybridoma that recognizes the antigen Then, a method of culturing this and obtaining the culture supernatant can be used.
  • an appropriate carrier protein may be bound to the antigen to form an immunogen.
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FIA Freund's incomplete adjuvant
  • myeloma cells for example, P3X63Ag8.653 (ATCC (American Type Culture Collection) CRL-1580) and P3 / NS I / 1 -Ag4-1 (ATCC TIB-18) can be used.
  • animals immunized with the antigen can be used for animals such as rabbits, mice, rats, rabbits, sheep, goats, and chickens, but are not limited to the animal species exemplified here.
  • Antibodies include polyclonal and monoclonal antibodies.
  • antisera and isolated and produced anti-Treponemal pallidum antibodies may be modified with various enzymes, colloids and the like.
  • FIG. 1 is a construction diagram of the plasmid pNH40 OTP47.
  • FIG. 2 is a diagram of a sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoretogram and a Western blot of the modified antigen protein obtained in Example 1.
  • FIG. 3 is a construction diagram of the plasmid pNH30OTP17.
  • FIG. 4 is a diagram of a sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis diagram and a stamp lot of the modified antigen protein obtained in Example 2.
  • FIG. 5 is a construction diagram of the plasmid pNH400TP47-17.
  • FIG. 6 shows dodecyl sulfate of the fused modified protein obtained in Example.
  • FIG. 2 is a diagram of a sodium acid-polyacrylamide gel electrophoresis diagram and a Western blot.
  • Example 1 Production of a modified protein of an antigenic protein having a molecular weight of about 47K daltons derived from Treponema pallidum bacteria, examination of the antigenicity of the modified protein by Western blotting, and detection of anti-Treponema pallidum antibody by ELIS Measurement
  • a recombinant plasmid was prepared according to the procedure shown in FIG.
  • Treponema pallidum Nichols strain purchased from Lee Laboratories (USA), product code: SPRO J-TPURE
  • SPRO J-TPURE Treponema pallidum fungus
  • T. pallidum The genome DNA of T. pallidum was obtained as follows.
  • Treponema pallidum genomic DNA solution 5 ⁇ 10 7 cells of Treponema pallidum were suspended in an aqueous solution containing 1 M sodium chloride, 1 N sodium hydroxide and 2% SDS and boiled for 1 minute. Next, 0.5 M Tris (pH 7.0), 4 times the amount of this aqueous solution, was added and neutralized. Further, phenol was added to obtain an aqueous layer. Ethanol was added to the aqueous layer, centrifuged to obtain a precipitate, and the precipitate was dried. Finally, the precipitate was dissolved in sterile water to prepare a Treponema pallidum genomic DNA solution. This genomic DNA solution is used as type I DNA in the PCR method described below. The aforementioned Weiger et al. Document describes the nucleotide sequence of a DNA encoding an antigenic protein derived from Treponema pallidum and having a molecular weight of about 47 K daltons (the nucleotide sequence represented by S
  • This antigenic protein having a molecular weight of about 47 K daltons is considered to be a cell membrane protein in Treponema pallidum by the following mechanism.
  • trepone a precursor protein containing a signal sequence in the Ma Pali dam cell (SEQ ID NO: 9)
  • the fatty acid present in the cells is thioester bonded to the cysteine residue at position 20 in this precursor protein.
  • the signal peptide present in the cells removes the amino acid sequence at positions 1 to 19 in this precursor protein as a signal sequence, and the bound fatty acids are fixed in the lipid bilayer of the cell membrane.
  • the amino acid sequence after the 20th position (mature protein) in the precursor protein is fixed as a cell membrane protein.
  • this fatty acid is considered to hinder the secretory expression of the antigen protein
  • the cysteine residue at the amino terminus of the mature protein is changed to an alanine residue so that the primer at the amino terminus side is used.
  • SEQ ID NO: 10 The nucleotide sequence of this Bramer DNA is represented by SEQ ID NO: 10.
  • the 4th to 9th sequences are recognition sites for the restriction enzyme PstI, and the 6th to 17th sequences correspond to alanine, glycine, serine, and serine, respectively. This is a base sequence corresponding to each amino acid residue.
  • This primer DNA was chemically synthesized using a DNA synthesizer. This is Primer 47-1.
  • the primer DNA at the carboxyl group end was designed so as to contain the genetic code of the translation termination in the gene and to have a recognition site for the restriction enzyme BamHI immediately after.
  • the nucleotide sequence of this primer DNA is represented by SEQ ID NO: 11.
  • the 4th to 9th sequences are recognition sites for the restriction enzyme BamHI
  • the 10th to 12th sequences are the genetic code for translation completion.
  • This primer DNA was chemically synthesized using a DNA synthesizer. This is Primer 47-2.
  • the constructed plasmid was introduced into Bacillus brevis HPD31 strain by an electric pulse method to obtain a transformant (Bacillus' brevis strain HPD31 carrying plasmid pNH40 OTP47).
  • This transformant has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the accession number FERM BP-5642.
  • TMN agar plate medium 1% peptone, meat extract 0.5%, yeast extract 0.2%, glucose 1%, Mg SO 4 0. 01 %, F e SO 4 0. 01%, M n SO 4 0. 001%, Z n S 0 4 0. 0001%, agar 1.5%, including neomycin 50 g / ml, the medium
  • plasmid pNH400 Bacillus' brevis HPD31 strain carrying TP47 was smeared and cultured at 30 ° C for 48 hours to form a colony.
  • the resulting colony is inoculated into a 500 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of TMN liquid medium (the above-mentioned TMN agar plate medium without agar), cultured at 30 ° C for 2 hours with shaking, and centrifuged. Then, the supernatant was obtained and used as a modified protein-containing fraction of an antigen protein having a molecular weight of about 47 K daltons derived from Treponema or Paridam.
  • CBB Coomassie brilliant blue
  • the remaining gel was immersed in a transfer buffer (aqueous solution containing 0.02 M tris, 0.15 M glycine and 20% ethanol) for 15 minutes to equilibrate. Subsequently, the gel was placed on a nitrocellulose membrane (manufactured by Bio-Rad) that had been equilibrated in the same manner, and the both sides were similarly sandwiched between filter papers that had been equilibrated, and placed in a transfer device (manufactured by Bio-Rad). The protein contained in the gel was transferred onto a nitrocellulose membrane by applying a constant voltage of 100 V for 1 hour.
  • a transfer buffer aqueous solution containing 0.02 M tris, 0.15 M glycine and 20% ethanol
  • BSA bovine serum albumin
  • the obtained nitrocellulose membrane was washed with a washing buffer (0.01M Tris, 0.2M NaCl, 0.05% Tween 20) for 10 minutes. At that time, the washing buffer was replaced with a new one every 2 minutes.
  • the nitrocellulose membrane was cut into books of about 5 mm width for each lane and placed in a grooved reaction vessel. Serum dilution buffer Lml of syphilis patient serum diluted 100-fold with (aqueous solution containing 0.015M Tris, 0.2M NaCl and 0.2% BSA) was placed in a reaction vessel and allowed to react for 2 hours under shaking conditions. . After the reaction, the nitrocellulose membrane was washed with a washing buffer for 35 minutes under shaking conditions.
  • the washing buffer was replaced with a new one once after 15 minutes and then three times every 5 minutes thereafter.
  • the nitrocell mouth membrane was placed in a groove-shaped reaction vessel tank, and 1 ml of a peroxidase-labeled anti-human IgG antibody (manufactured by KPL) diluted 500-fold with a serum dilution buffer was mixed under shaking conditions. For 2 hours. After the reaction, the nitrocellulose membrane was washed for 35 minutes using a washing buffer under shaking conditions. At this time, the washing buffer was replaced once with the first one after 15 minutes, and thereafter three times every 5 minutes thereafter.
  • diaminobenzidine solution (0.05M Tris, 0.9% NaCl solution 2 Om3 1% hydrogen peroxide solution 32 ⁇ l, diaminobenzidine (solution) ) Containing 1 Omg) for 10 minutes. Then, the nitrocellulose membrane was thoroughly washed with distilled water and dried.
  • a brown band was observed at a molecular weight of about 47 K daltons (lane W), and the serum of a syphilis patient was found to have an antigenic protein with a molecular weight of about 47 K daltons derived from Treponema pallidum. The ability to react with the modified protein was confirmed. Judging from the band concentration, the production of the modified protein is considered to be about 1 g / (1 liter of culture solution).
  • the modified protein of the antigen protein having a molecular weight of about 47 K daltons derived from Treponema pallidum and obtained from the present invention specifically reacts with the serum of syphilis patients.
  • This protein solution was diluted with 5 OmM Tris-HCl buffer (pH 8.6) to prepare an antigen solution having a protein concentration of 0.95 ⁇ g / ml and an SDS concentration of 0.02%. 1 was poured into a well (recess) of a microtiter plate and allowed to stand at 4 ° C.
  • the antigen solution was removed by suction, and the wells were washed twice with 250 ⁇ l of a washing solution (phosphate buffered saline (PBS) containing 0.05% Tween 20 and 0.1% NaN 3 ).
  • PBS phosphate buffered saline
  • a blocking solution (a solution obtained by diluting a 10-fold concentrated serum albumin (BSA) solution manufactured by KPL Co., Ltd. with PBS) two times and pouring into a well was added at 37 ° C. After standing for 1 hour, the blocking solution was removed by suction.
  • BSA serum albumin
  • diluent alkaline phosphatase one peptidase labeled with catcher formic antihuman I gG monochrome one monoclonal antibody (manufactured by KPL (Ltd.)) (tris 0. 606 g, MgC 1 2 ⁇ H 2 ⁇ 20.
  • coloring reagent MgC l 2 '6H 2 0 0.
  • the aqueous solution 1 ml of total volume 27 OML containing 1374 g and Jietano Ichiru Amin 141. 9 ml was diluted 5-fold with distilled water, substrate tablets (KPL (strain ), P-Ditrophenyl phosphate (containing 1 Omg) Solution obtained by dissolving 1 tablet) Pour 10 ⁇ l into a well, leave at room temperature for 10 minutes to allow a color reaction, Pour ⁇ 1 into the tube The reaction was stopped, and the absorbance was measured for 405 employees using a microplate reader (manufactured by Tosoh Corporation). The obtained absorbance was 0.425.
  • the anti-Treponemal pallidum antibody in the serum of syphilis patients was measured by ELISA using the modified protein of the antigen protein of molecular weight of about 47 K daltons derived from Treponema pallidum bacteria obtained in the present invention as an antigen. It was shown that it could be done.
  • Example 2 Production of modified protein of antigenic protein derived from Treponema pallidum and having a molecular weight of about 17 K daltons, examination of the antigenicity of the modified protein by Western blotting, and measurement of anti-Treponema pallidum antibody by ELISA
  • a recombinant vector was prepared by the procedure shown in FIG.
  • the aforementioned Akins et al. Document describes the nucleotide sequence of DNA encoding an antigenic protein derived from Treponema pallidum and having a molecular weight of about 17 K daltons (the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12).
  • Trepone is synthesized as a precursor protein containing a signal sequence (major amino acid sequence 1-156 added to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12) in Ma pallidum cells.
  • the fatty acid present in this protein forms a thioester bond with the second cysteine residue in the precursor protein.
  • the first to 21st amino acid sequences in this precursor protein are removed as a signal sequence by the signal peptide present in the cells, and the bound fatty acids are removed from the lipid bilayer of the cell membrane.
  • the second and subsequent amino acid sequences (mature proteins) in the precursor protein are fixed as cell membrane proteins.
  • a primer-DNA at the carboxyl-terminal end was designed so as to include the genetic code of translation termination in the gene and to form a recognition site for the restriction enzyme Hindill immediately thereafter.
  • the nucleotide sequence of this primer DNA is shown in SEQ ID NO: 14.
  • the 4th to 9th sequences are recognition sites for restriction enzyme HindIII, and the 8th to 10th sequences are the genetic code for translation completion.
  • the primer DNA was chemically synthesized using a DNA synthesizer. This is called primer 17-2.
  • Example 1 (1) the chromosomal DNA obtained in Example 1 (1) was used as the DN type DNA, and primer 17-1 and primer 17-2 were used as the primer—DNA. PCR operation was performed.
  • the PCR operation was carried out under the condition that the process consisting of heating for 1 minute, cooling at 54 ° C for 1 minute, and keeping the temperature at 70 ° C for 1 minute was defined as one cycle, and this process was repeated for 25 cycles.
  • the PCR reaction mixture was digested with restriction enzymes SmaI and EcoRI.
  • the plasmid pUB110 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was digested with restriction enzymes EcoRI and PvuII, and this digest was mixed with the digests of the aforementioned restriction enzymes SmaI and Ec0RI. Add 20 ⁇ l of solution A and 5 t1 of solution contained in the Takara DNA Religion Kit (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and incubate at 16 ° C for 30 minutes to perform the ligation reaction. This was performed to obtain a plasmid pNH300, and the plasmid pNH300 was digested with restriction enzymes HindIII and PstI.
  • This digest was mixed with the H_P fragment and subjected to the same ligation reaction using the kit to construct a plasmid pNH300TP17 having a size of about 4.2 kbp.
  • the constructed plasmid was introduced into Bacillus brevis HPD31 strain by the electric pulse method to obtain a transformant (Bacillus brevis strain HPD31 containing plasmid pNH30OT17).
  • This transformant has been deposited with the National Institute of Biotechnology and Industrial Technology under the accession number F ERM BP-5641.
  • Example 2 The same operation as in Example 1 (3) was carried out except that the Bacillus brevis strain HPD31 containing the above-mentioned plasmid PNH300 TP17 was used as the transformant. A fraction containing the modified protein of the K dalton antigen protein was obtained.
  • the modified protein of the antigen protein having a molecular weight of about 17 K daltons derived from Treponema pallidum obtained in the present invention specifically reacts with the serum of syphilis patients.
  • Example 2 (3) The same operation as in Example 1 (7) was performed except that the culture supernatant obtained in Example 2 (3) was used as the culture supernatant.
  • a 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.6) and a small amount of SDS were used.
  • the protein concentration is 0.
  • An antigen solution having a 308 concentration of 0.02% was prepared.
  • the ELISA using the modified protein of the antigen protein having a molecular weight of about 17 K daltons derived from Treponema pallidum obtained in the present invention as an antigen The results showed that the anti-Treponemal pallidum antibody in the serum of syphilis patients can be measured.
  • Example 3 Anti-Treponema by ELISA using a mixture of a modified protein of an antigenic protein having a molecular weight of about 47 K dalton and a modified protein of an antigenic protein having a molecular weight of about 1 K dalton derived from Treponema pallidum Measurement of palydam antibody
  • Example 2 While gently stirring the culture supernatant obtained in Example 1 (3), add ammonium sulfate to a concentration of 25%, stir at 4 ° C overnight, and further stir at 37 ° C for 1 hour. , And centrifuged at 10,000 X g for 30 minutes to obtain a precipitate.
  • the obtained precipitate was suspended in 5 OmM Tris-HCl buffer (pH 8.6) containing 25% ammonium sulfate and centrifuged under the above conditions to wash the precipitate, and this washing operation was performed twice. A small amount of resulting precipitate of buffer (50 mM Tris-monohydrochloride buffer solution containing 1% SDS (P H8. 6 )) and dissolved to obtain a protein lysate.
  • Example 2 (3) the culture supernatant obtained in Example 2 (3) was fractionated by cation column chromatography, and a fraction containing a modified protein of an antigen protein having a molecular weight of about 17 K daltons was obtained using the Western plot. did.
  • Example 1 (7) protein lysates and the modified protein-containing fraction were mixed, and the number of moles of protein contained in the solution was combined with that of the antigen solution used in Example 1 (7) to obtain a 50 mM tris containing 1% SDS.
  • Example 4 Production of a modified protein fused with an antigen protein having a molecular weight of about 47 K daltons and an antigen protein having a molecular weight of about 17 K daltons derived from Treponema pallidum, and a modified protein fused by Western blotting Examination of Antigenicity and Measurement of Anti-Treponemal 'Paridum Antibody by ELISA
  • This natural antigen protein having a molecular weight of about 47 K daltons is considered to be a cell membrane protein in Treponema pallidum by the following mechanism.
  • a precursor protein containing a signal sequence in Treponema pallidum cells (the amino acid sequence of the ⁇ -434th amino acid sequence that is added to the base sequence shown in SEQ ID NO: 9), and then present in the cells.
  • Fatty acids are thioester linked to the 20th cysteine residue in this precursor protein.
  • the signal peptide removes the 1st to 19th amino acid sequences in this precursor protein as a signal sequence, and the bound fatty acids are fixed in the lipid bilayer of the cell membrane.
  • the amino acid sequence (mature protein) after the 20th position in the precursor protein is fixed as a cell membrane protein.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 was designed as a primer DNA at the carboxyl group end.
  • the fourth to ninth sequences are recognition sites for restriction enzyme Bg1II.
  • the primer DNA was chemically synthesized using a DNA synthesizer. This is designated as Primer 47—1 7—2.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19 was designed as a primer-DNA at the terminal side of the amino group.
  • the fourth to ninth sequences are recognition sites for restriction enzyme BgIII.
  • This primer DNA was chemically synthesized using a DNA synthesizer. This is designated as Primer 1—47—3.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 20 was designed as a primer DNA at the carboxyl terminal side. No. 4 to 9 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20
  • the sequence of the eye is the recognition site for the restriction enzyme XhoI.
  • the primer DNA was chemically synthesized using a DNA synthesizer. This is designated as Primer 47—1 7—4.
  • the obtained PCR reaction solution was digested with restriction enzymes BglII and Xhol to obtain a Bglll-Xhol fragment (405 bp).
  • Plasmid pNH400 [described in J. Bacteriol., Vol. 177, pp. 745-749 (1995)], J. Bacteriol., Vol. 177, pp. 745-749 (1995)] Digested with I and XhoI, and digested with the PstI-Kp ⁇ I fragment (654 bp;), Kpnl-Bgin fragment (593 bp) and Bg1II-XhoI. The I fragment (405 bp) was mixed, and the A solution 201 and 5 ⁇ l of Takara DNA ligation kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) were added. The mixture was incubated for 30 minutes to carry out a ligation reaction to construct a plasmid pNH400TP47-17 having a size of about 5.8 kbp.
  • the resulting colony was inoculated into a 500 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of TMN liquid medium (medium from which the agar was removed from the TMN agar plate medium), cultured with shaking at 30 ° C for 2 days, and the culture was centrifuged. Get the supernatant, Treponema Paridam
  • the modified protein-containing fraction was obtained by fusing the antigen protein having a molecular weight of about 47 K dalton and the antigen protein having a molecular weight of about 17 K dalton.
  • CBB Coomassie Brilliant Blue
  • a brown band was observed at a molecular weight of about 64 K daltons (Lein W), and the serum of a syphilis patient had an antigen of about 47 K daltons derived from Treponema pallidum. It was confirmed that the protein reacted with the modified protein fused with the antigen protein having a molecular weight of about 17K dalton. Judging from the band density, the fusion protein production is considered to be about 0.2 gZ (1 liter of culture solution). On the other hand, the same operation was performed using healthy human serum instead of syphilitic patient serum, but no band was observed, confirming that the fusion protein did not react with healthy human serum.
  • the antigenic protein derived from T. pallidum fungi obtained by the present invention and having a molecular weight of about 47 K daltons and the modified protein obtained by fusing the antigen protein having a molecular weight of about 17 K daltons specifically react with the serum of syphilis patients. It was shown that.
  • Example 4 (3) While gently stirring the culture supernatant obtained in Example 4 (3), add ammonium sulfate so that the concentration becomes 10%, stir at 4 ° C overnight, and further stir at 37 ° C for 1 hour. Then, the mixture was centrifuged at 10, OOOX g for 30 minutes to obtain a supernatant. To the obtained supernatant, add ammonium sulfate to a further 25%, stir at 4 ° C for 1 hour, stir at 37 ° C for 1 hour, and centrifuge at 10,000 X g for 30 minutes. To obtain a precipitate.
  • the obtained precipitate was suspended in 5 OmM tris-monohydrochloride buffer (PH8.6) containing 25% ammonium sulfate and centrifuged under the above conditions to wash the precipitate, and this washing operation was performed twice.
  • the resulting precipitate was dissolved in a small amount of a buffer (5 OmM Tris-HCl buffer (pH 8.6) containing 1% SDS) to obtain a protein solution.
  • the protein solution was diluted with 5 OmM Tris-HCl buffer (pH 8.6) to prepare an antigen solution having a protein concentration of 1.25 g / ml and an SDS concentration of 0.02%.
  • the ELISA using the modified protein obtained by fusing the antigen protein having a molecular weight of about 47 K dalton and an antigen protein having a molecular weight of about 17 K dalton derived from Treponema pallidum obtained in the present invention as an antigen was performed. It was shown that the anti-Treponemal pallidum antibody in the serum of syphilis patients can be measured.
  • Example 4 This indicates that the modified protein of the present invention obtained in Example 4 has an extremely high level of antigenicity as compared with the respective antigen proteins derived from Treponema pallidum and their mixtures. .
  • the anti-Treponemal pallidum antibody is produced using the modified protein of the present invention as an antigen, for example, as follows.
  • P3X63 Ag8.653 was cultured in RPMI 1640 medium containing 10% (v / v) fetal calf serum, and 37 ° C, 5% (v / v) to passages in the C0 2 presence.
  • RPMI 1640 medium containing 10% (v / v) fetal calf serum, and 37 ° C, 5% (v / v) to passages in the C0 2 presence.
  • 0.1 mM of 8-azaguanine 0.5 ig / ml of MC-210 (mycoplasma remover, manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) and 10% (v / v)
  • MC-210 mycoplasma remover, manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.
  • 10% (v / v) Incubate for 1 week in RPMI 1640 medium containing fetal calf serum, then in normal medium for the following 1 week.
  • 200 ⁇ l of the suspension of the modified protein of the present invention having a protein concentration of 270 Mg / ml is centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes, and 200 ⁇ l of PBS is added to the precipitate and resuspended.
  • 200 ⁇ l of Freund's complete adjuvant is added to form an emulsion, and inject 1501 subcutaneously on the back of the mouse (this is referred to as day 0).
  • a suspension of 100 ⁇ 1 of the above modified protein with a protein concentration of 270 Mg / ral was injected intraperitoneally into mice, and on the 69th day, A suspension of the modified protein at a concentration of 800 g / ml (50 ⁇ l) was injected into the abdominal cavity of the mouse on day 92, and 100 ⁇ l of the suspension was injected on day 92.
  • a suspension of the modified protein at a concentration of 800 g / ml (50 ⁇ l) was injected into the abdominal cavity of the mouse on day 92, and 100 ⁇ l of the suspension was injected on day 92.
  • HAT medium so that the myeloma cell concentration is 3.3 x 1 O ml, suspend the cells, and use a Pasteur pipette to add 2 drops to the wells of a 96-well plastic culture vessel. Dispense. After culturing at 36 ° C in a 5% (vZv) carbon dioxide atmosphere, add 1 to 2 drops of HAT medium to the wells after 1 day, 1 day and 14 days.
  • the above modified protein was added to 0.05 M sodium bicarbonate buffer (pH 9.6) containing 0.02% (w / v) azide soda so that the protein concentration was 1 to 10 g / ml. suspended, dialyzed against the 0. 02% NaN 3 containing 0. 05 M sodium bicarbonate buffer (pH 9. 6), then, the protein concentration was diluted to 1 ⁇ 1 ⁇ / zg / ml solution Transfer 50 ⁇ l to a 96-well EIA plate made of vinyl chloride.
  • Antibody production is confirmed by the same method as in "Screening of antibody-producing cells". Only single cell colonies are present in the wells, which produce antibodies that react with the modified protein of the present invention, and cells that grow rapidly are recovered from the wells, and subsequently recovered in a 24-well plastic culture vessel. Proliferate. Further, the same cloning operation is repeated to obtain a hybridoma that produces an anti-Treponemal pallidum antibody. This is cultured, and an anti-Treponemal pallidum antibody is produced from the culture supernatant. The invention's effect
  • the modified protein of the present invention can be secreted from microorganisms, has little protein denaturation, and has excellent production efficiency.
  • Another modified protein of the present invention exhibits the effect of the above-described modified protein of the present invention, and is excellent in secretion efficiency.
  • Still another modified protein of the present invention has the effects of the above-described modified protein of the present invention, and further has antigenicity as a Treponema pallidum antigen.
  • Still another modified protein of the present invention has the effects of the above-described modified protein of the present invention, and has excellent antigenicity as a Treponema pallidum-specific antigen.
  • Still another modified protein of the present invention has the effects of the above-described modified protein of the present invention, and further has extremely excellent antigenicity as a Treponema pallidum-specific antigen.
  • the DNA of the present invention is useful for producing a modified protein that can be secreted from a microorganism.
  • Another DNA of the present invention exerts the effects of the above-described DNA of the present invention, and is useful for producing a modified protein having excellent antigenicity as a Trepone-ma pallidum-specific antigen.
  • the recombinant vector of the present invention is useful for producing a modified protein that can be secreted from a microorganism.
  • the transformant of the present invention is useful for producing a modified protein that can be secreted from a microorganism.
  • Another transformant of the present invention exhibits the effects of the above transformant of the present invention and is useful for producing a modified protein having excellent antigenicity as a Treponema pallidum-specific antigen.
  • the method for producing a modified protein of the present invention is useful for producing a modified protein that can be secreted from a microorganism.
  • Another method for producing a modified protein of the present invention has the effects of the above-described method for producing a modified protein of the present invention, and is useful for a simple production of a modified protein having excellent antigenicity.
  • the assay method for anti-Treponemal pallidum antibody of the present invention is useful for diagnosis of syphilis infection.
  • the reagent for measuring an anti-Treponemal pallidum antibody of the present invention is useful for diagnosis of syphilis infection.
  • the diagnostic agent for syphilis infection of the present invention is useful for diagnosis of syphilis infection.
  • the method for producing an anti-Treponemal pallidum antibody of the present invention is useful for diagnosis of syphilis infection.
  • Tyr Lys lie Thr Asn Val Lys Val His Gly Met Lys Phe Val Pro Val 145 150 155 160
  • Sequence type nucleic acid
  • CTGCAGGCTC GTCTCATCAT GAGACGCACT ATGGCTATGC GACGCTAAGC TATGCGGACT 60 ACTGGGCCGG GGAGTTGGGG CAGAGTAGGG ACGTGCTTTT GGCGGGTAAT GCCGAGGCGG 120 ACCGCGCGGG GGATCTCGAC GCAGGCATGT TCGATGCAGT TTCTCGCGCA ACCCACGGGC 180 ATGGCGCGTT CCGTCAGCAA TTTCAGTACG CGGTTGAGGT ATTGGGCGAA AAGGTTCTCT 240 CGAAGCAGGA GACCGAAGAC AGCAGGGGAA GAAAAAAGTG GGAGTACGAG ACTGACCCAA 300 GCGTTACTAA GATGGTGCGT GCCTCTGCGT CATTTCAGGA TTTGGGAGAG GACGGGGAGA 360 TTAAGTTTGA AGCAGTCGAG GGTGCAGTAG CGTTGGCGGA TCGCGCGAGT TCCTTCATGG 420 TTGACAGCGA GGAATACAAG ATTACGA
  • ATGGGTTCGA TCGGTTTAAA GGTTCAGGGC CGGGATACTA CAGGCTGACT TTGATTGCGA 960
  • Sequence type nucleic acid
  • CTGCAGTCTC GTGCACAACC GTGTGTCCGC ACGCCGGGAA GGCCAAAGCG GAAAAGGTAG 60 AGTGCGCGTT GAAGGGAGGT ATCTTTCGGG GTACGCTACC TGCGGCCGAT TGCCCGGGAA 120 TCGATACGAC TGTGACGTTC AACGCGGATG GCACTGCGCA AAAGGTAGAG CTTGCCCTTG
  • ATGGGTTCGA TCGGTTTAAA GGTTCAGGGC CGGGATACTA CAGGCTGACT TTGATTGCGA 960
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid

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Description

明細二
改変トレポネ一マ ·パリダム由来抗原蛋白質
発明の技術分野
本発明は、 改変タンパク質、 それをコードする D NA、 その D N Aを含む組換 えべクタ一、 その組換えベクターを含む形質転換体、 改変タンパク質の製造法、 抗トレポネーマ ·パリダム抗体の測定法及び測定用試薬、 梅毒感染診断薬並びに 抗トレポネーマ ·パリダム抗体の製造法に関する。 発明の背景技術
生体には、 様々なタンパク質が含まれている。
中でも、 脂質とタンパク質の複合体であるリポタンパク質は、 各種病原菌にお いて、 細胞膜に留まって抗原タンパク質として機能することが知られており、 こ れらの病原菌感染の検査や診断においては、 これらの病原菌由来のリポタンパク 質を含有する画分を抗原とする抗体測定法が広く利用されている。
例えば、 トレポネ一マ 'パリダム菌は梅毒の原因菌として知られている。 この 菌の感染の検査や診断においては、 現在、 トレポネーマ ·パリダム菌の菌体から 得られた細胞膜画分を抗原とする抗体測定法が利用されている。
トレポネーマ ·パリダム菌は感染している動物の細胞又は組織内でしか生育で きないため、 抗原であるトレポネ一マ 'パリダム菌の細胞膜画分を得るために、 これまでは、 トレポネ一マ 'パリダム菌をうさぎの睾丸に感染させ、 この睾丸か らトレポネーマ ·パリダム菌を取得し、 さらにこの菌体から細胞膜画分を取得す る方法が使用されてきた。 しかしながら、 この方法では大量に抗原を得ることが できなかった。 トレポネーマ ·パリダム菌の細胞膜画分には、 種々の抗原タンパク質が含まれ ており、 これらはリポタンパク質となっている。 これまで、 分子量約 4 7 Kダル トン、 約 1 7 Kダルトン及び約 1 5 Kダルトンの抗原タンパク質が存在すること が知られており、 これらの抗原タンパク質のアミノ酸配列やそれをコードする塩 基配列も既に報告されている （エル ·ェム · ウェイゲルら、 インフエクシヨン - アンド 'イミュニティ一、 60巻、 1568- 1576頁（1992年） （L. M.Weigel et al. , Infect. I腿 un. ， Vol. 60, p. 1568- 1576(1992) )、 ディ 'アール 'エイキンスら、 インフエクシヨン 'アンド 'イミュニティ一、 61巻、 1202- 1210頁（1993年） （D. R. Akins et al. , Infect. I匪 η· ， Vol.61, p. 1202 - 1210(1993) )、 ビー ·ケィ · プレセルら、 モレキュラー 'ミクロバイオロジー、 4巻、 1371-1379頁（1990年）） (B. K. Purecel l et al . , Mol. Microbiol. , Vol.4, p. 137卜 1379(1990) )。そして、 これらの文献には、 遺伝子組換え技術を用いて、 分子量約 4 7 Kダルトン、 約 1 7 Kダルトン及び約 1 5 Kダルトンの抗原タンパク質を、 それぞれ、 ダルタチォ ン一 S—トランスフェラ一ゼとの融合タンパク質として発現させたことが記載さ れている。
しかしながら、 リポタンパク質であるこれらの抗原タンパク質は、 菌体外に放 出されにくいため、 これらの抗原タンパク質を容易に大量に製造することは、 こ れまで実現されていなかった。
また、 近年、 これらの病原菌感染に対する抗体測定法の感度の向上が強く望ま れており、 抗原タンパク質を、 単独で又はダルタチオン一 S—トランスフェラ一 ゼとの融合タンパク質として発現させただけであるこれらの技術は、 このような 要求を十分に満たすものではなかった。 発明力解決しょうとする課題
本発明は、 微生物からの分泌が可能で、 タンパク変性の少ない、 生産効率に優 れる改変タンパク質を提供するものである。
また、 本発明は、 上記本発明の効果に加え、 分泌効率が高い改変タンパク質を 提供するものである。
さらに、 本発明は、 上記本発明の効果に加え、 トレポネーマ ·パリダム抗原と しての抗原性を有する改変タンパク質を提供するものである。
さらに、 本発明は、 上記本発明の効果に加え、 卜レポネーマ ·パリダム特異的 抗原としての抗原性を有する改変タンパク質を提供するものである。
さらに、 本発明は、 上記本発明の効果に加え、 トレポネーマ ·パリダム特異的 抗原として優れた抗原性を有する改変タンパク質を提供するものである。
さらに、 本発明は、 上記本発明の効果に加え、 各種微生物の抗原としての優れ た抗原性を有する融合タンパク質である改変タンパク質を提供するものである。 さらに、 本発明は、 上記本発明の効果に加え、 トレポネーマ ·パリダム特異的 抗原としての優れた抗原性を有する融合タンパク質である改変タンパク質を提供 するものである。
さらに、 本発明は、 上記本発明の効果に加え、 トレポネ一マ ·パリダム特異的 抗原として極めて優れた抗原性を有する改変タンパク質を提供するものである。 さらに、 本発明は、 微生物からの分泌が可能な改変タンパク質の製造に有用で ある D N Aを提供するものである。
さらに、 本発明は、 上記本発明の効果に加え、 トレポネ一マ ·パリダム特異的 抗原として優れた抗原性を有する改変タンパク質の製造に有用である D N Aを提 供するものである。
さらに、 本発明は、 微生物からの分泌が可能な改変タンパク質の製造に有用で ある組換えべクタ一を提供するものである。
さらに、 本発明は、 微生物からの分泌が可能な改変タンパク質の製造に有用で ある形質転換体を提供するものである。
さらに、 本発明は、 上記本発明の効果に加え、 トレポネ一マ ·パリダム特異的 抗原として優れた抗原性を有する改変タンパク質の製造に有用である形質転換体 を提供するものである。
さらに、 本発明は、 微生物からの分泌が可能な改変タンパク質の製造法を提供 するものである。
さらに、 本発明は、 上記本発明の効果に加え、 抗原性に優れる改変タンパク質 の簡便な製造法を提供するものである。
さらに、 本発明は、 微生物からの分泌が可能であり、 かつ、 トレポネーマ -パ リダム抗原として抗原性を有する改変タンパク質を抗原として用いる、 梅毒感染 の診断に有用な抗トレポネーマ ·パリダム抗体の測定法を提供するものである。 さらに、 本発明は、 微生物からの分泌が可能であり、 かつ、 トレポネ一マ ' ノ リダム抗原として抗原性を有する改変タンパク質を含有してなる、 梅毒感染の診 断に有用な抗トレポネーマ ·パリダム抗体の測定用試薬を提供するものである。 さらに、 本発明は、 微生物からの分泌が可能であり、 かつ、 トレポネーマ - ノ リダム抗原として抗原性を有する改変タンパク質を有効成分とする、 梅毒感染の 診断に有用な梅毒感染診断薬を提供するものである。
さらに、 本発明は、 梅毒感染の診断に有用な抗トレポネーマ 'パリダム抗体の 製造法を提供するものである。 発明の開示
本発明は、 下記 （1 ) 〜 （2 1 ) に関する。
( 1 ) タンパク質の少なくとも 1個のシスティン残基が脂質非結合性ァミノ酸残 基に変換されたアミノ酸配列を有する改変タンパク質。
( 2 ) タンパク質のァミノ基末端に一番近い位置のシスティン残基が脂質非結合 性アミノ酸残基に変換されたアミノ酸配列を有するものである前記 （ 1 ) 記載の 改変タンパク質。
( 3 ) 脂質非結合性ァミノ酸残基が、 ァラニン残基、 グルタミン酸残基及びセリ ン残基からなる群から選択されるものである、 前記 （1 ) 又は （2 ) 記載の改変 タンパク質。
( 4 ) タンパク質がトレポネーマ 'パリダム菌に由来する抗原タンパクである前 記 （1 ) 〜 （3 ) のいずれかに記載の改変タンパク質。
( 5 ) タンパク質が、 トレポネーマ .パリダム菌の分子量約 4 7 Kダルトン又は 約 1 7 Kダルトンの抗原タンパク質である前記 （4 ) 記載の改変タンパク質。
( 6 ) 配列番号 1で示されるアミノ酸配列を有する前記 （5 ) 記載の改変タンパ ク質。
( 7 ) 配列番号 2で示されるアミノ酸配列を有する前記 （5 ) 記載の改変タンパ ク質。 (8) 微生物由来の抗原タンパク質を 2個以上連結させてなる融合タンパク質で ある前記 （1) 〜 （7) 記載の改変タンパク質。
(9) 微生物由来の抗原タンパク質がトレポネーマ ·パリダム菌由来の分子量約 47 Kダルトン及び 又は約 17 Kダルトンの抗原タンパク質からなる融合タン パク質である前記 （8) 記載の改変タンパク質。
(10) 配列番号 4で示されるアミノ酸配列を有する前記 （8) 又は （9) 記載 の改変タンパク質。
(1 1) 前記 （1) 〜 （10) のいずれかに記載の改変タンパク質をコードする D N A若しくはそれに相補的な D N A。
(12) 配列番号 5、 6又は 8で示される塩基配列を有する前記 （1 1) 記載の DNA。
(13) 前記 （1 1) 又は （12) に記載の DNAを含む組換えべクタ一。
(14) 前記 （13) 記載の組換えベクターを含む形質転換体。
(1 5) FERM BP— 5641、 FERM B P— 5642又は F E RM BP— 5763として寄託されている請求項 14記載の形質転換体。
(16) 前記 （1) 〜 （10) のいずれかに記載の改変タンパク質をコードする 遺伝子を導入した形質転換体を培養し、 培養物中に改変タンパク質を生成蓄積さ せ、 この培養物を取得することを特徴とする改変タンパク質の製造法。
(17) 取得された培養物の培養上清に硫酸アンモニゥムを添加し、 遠心分離し て沈殿を取得し、 この沈殿を界面活性剤含有水溶液に溶解させることを特徴とす る前記 （16) 記載の改変タンパク質の製造法。
(18) 前記 （4) 〜 （10) のいずれかに記載の改変タンパク質を抗原として 用いることを特徴とする抗トレポネーマ ·パリダム抗体の測定法。
(19) 前記 （4) 〜 （10) のいずれかに記載の改変タンパク質を抗原として 含有してなる抗トレポネーマ ·パリダム抗体の測定用試薬。
(20) 前記 （4) 〜 （10) のいずれかに記載の改変タンパク質を有効成分と する梅毒感染診断薬。
(21) 前記 （4) 〜 （10) のいずれかに記載の改変タンパク質を抗原として 用いることを特徴とする抗トレポネーマ ·パリダム抗体の製造法。 以下、 本発明を詳細に説明する。
なお、 配列表において、 アミノ酸配列は、 アミノ基末端のアミノ酸を 1番 し、 塩基配列は、 5 ' 末端の塩基を 1番としている。
改変タンパク質
本発明の改変タンパク質は、 タンパク質の少なくとも 1個のシスティン残基が 脂質非結合性アミノ酸残基に変換されたアミノ酸配列 （以下、 アミノ酸配列（A) という） を有するものである。
本発明において、 タンパク質は、 特に限定されるものではなく、 例えば、 動物、 植物、 微生物、 ウィルス等の生物に由来するタンパク質が挙げられる。
また、 細胞外への分泌性の観点から、 タンパク質としては、 例えば、 非分泌性 タンパク質が挙げられ、 非分泌性タンパク質としては、 例えば、 膜タンパク質、 細胞質内タンパク質等が挙げられる。 膜タンパク質としては、 例えば、 細胞膜に 存在する各種酵素や各種レセプタ一等が挙げられる。 なお、 非分泌性タンパク質 の中には、 脂質が結合しているタンパク質であるリポタンパク質も含まれる。 さらに、 抗原性の観点から、 タンパク質としては、 例えば、 細胞膜に存在する 各種抗原タンパク質が挙げられる。
細胞膜に存在する各種抗原タンパク質としては、 微生物に由来するタンパク質 カ挙げられ、 例えば、 トレポネーマ 'パリダム、 クラミジァ 'ニューモニエ、 ク ラミジァ ' トラコマティス、 各種肝炎ウィルス、 ヒト免疫不全ウィルス、 成人白 血病ウィルス、 ヘルぺスウィルス、 R Sウィルス、 風疹ウィルス、 水痘ウィルス、 マイコプラズマ、 トキソプラズマ等に由来する抗原タンパク質が挙げられる。 トレポネーマ .パリダム由来の抗原タンパク質としては、 例えば、 分子量約 4 7 Kダルトン、 約 1 7 Kダルトン及び約 1 5 Kダルトンの抗原タンパク質等が挙 げられ、 クラミジァ 'ニューモニエ由来の抗原タンパク質としては、 例えば、 分 子量約 3 9 . 5 Kダルトン、 約 5 3 Kダルトン及び約 7 0 Kダルトンの抗原タン パク質等が挙げられ、 クラミジァ · トラコマティス由来の抗原タンパク質として は、 例えば、 分子量約 3 9 . 5 Kダルトン、 約 5 9 . 5 Kダルトン及び約 7 5 K ダルトンの抗原タンパク質等が挙げられる。 これらの抗原タンパク質は、 これら の微生物が本来有する天然タンパク質 （成熟タンパク質） であってもよいし、 そ のアミノ酸配列が改変された改変タンパク質又は抗原タンパク質を 2個以上連結 させてなる融合タンパク質であってもよい。
これらの微生物由来の抗原タンパク質の中には、 システィン残基を含み、 かつ、 そのシスティン残基に脂質が結合してリボタンパク質となり、 産生された抗原タ ンパク質が細胞膜タンパク質となるものがある。 遺伝子組換え技術を用いてこれ らの抗原タンパク質を生産する場合、 組換え微生物等の細胞内で産生された抗原 タンパク質が、 組換え細胞内に留まることより、 産生する微生物の細胞内で不溶 化して封入体を形成し、 抗原タンパクの変性を来たしたり、 抗原タンパク質の収 率を損なう傾向がある。
そこで、 微生物からの分泌が可能となる点から、 本発明の改変タンパク質は、 天然タンパク質 （成熟タンパク質） の少なくとも 1個のシスティン残基力 旨質非 結合性アミノ酸残基に変換されたアミノ酸配列 (A) を有するものであることが 好ましい。
また、 脂質結合性の点から、 天然タンパク質のアミノ基末端側に位置するシス ティン残基が脂質非結合性アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列 (A) を有す るものであることがより好ましく、 さらに、 天然タンパク質のアミノ基末端に一 番近い位置のシスティン残基が月旨質非結合性アミノ酸残基に変換されたアミノ酸 配列 (A) を有するものであることが好ましい。
また、得られる改変タンパク質が元のタンパク質に備わっている特性、例えば、 トレポネーマ ·パリダム抗原としての抗原性を保ち、 かつ、 微生物から分泌可能 である限リ、 変換されるシスティン残基の数は 2個以上となってもよい。
前記脂質非結合性アミノ酸残基としては、 改変タンパク質を産生する微生物の 細胞膜に脂肪酸を介して結合するシスティン残基以外のアミノ酸残基であれば特 に制限されない。 例えば、 グリシン、 ァラニン、 パリン、 イソロイシン、 口イシ ン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 スレオニン、 ァスパラギン酸、 グル タミン酸、 ァスパラギン、 グルタミン、 ヒスチジン、 リジン、 アルギニン、 トリ ブトファン、 チロシン等のアミノ酸残基が挙げらる。 分泌効率の観点から、 側鎖 が小さく親水性であるアミノ酸の残基であることが好ましく、 ァラニン、 グルタ ミン酸、 セリン等が挙げられる。 さらに、 抗原性が変化しないという観点から、 ァラニン等であることがより好ましい。
さらに、 得られる改変タンパク質が元のタンパク質に備わっている特性、 例え ば、 トレポネ一マ ·パリダム抗原としての抗原性を保っている限り、 アミノ酸配 列 （A) は、 トレポネーマ ·パリダム菌由来の抗原タンパク質の中 （例えば、 前 記抗原タンパク質の 1〜5 0番目のアミノ酸までの領域） からアミノ酸残基 （例 えば、 1〜2 0個） が欠落したものであってもよい。
また、 得られる改変タンパク質が上記各種特性を保ち、 かつ、 微生物から分泌 可能である限り、 本発明の改変タンパク質は、 アミノ酸配列 （A) のアミノ基末 端側又はカルボキシル基末端側に、 直接又は介在アミノ酸配列を介し、 抗原性が 失われない限り、 別のアミノ酸配列が 1個以上結合した構造を有する融合タンパ ク質であってもよい。 例えば、 トレポネ一マ ·パリダム菌由来の 4 7 Kダルトン 抗原の配列とトレポネーマ ·パリダム菌由来の 1 7 Kダルトン抗原の配列を連結 した融合タンパク質力挙げられる。改変タンパク質が融合タンパク質である場合、 その融合タンパク質を構成する元の抗原タンパク質は同一であっても異なってい てもよいが、 得られる融合タンパク質が多様な抗原性を保持することができる点 から、 結合する抗原タンパク質の中の少なくとも 1個は他の抗原タンパク質と異 なった抗原性を有するものであることが好ましい。 この融合タンパク質を抗原と して利用する場合、 異なった抗原性を有する個々の抗原タンパク質をそれぞれ調 製し、 混合して抗原とする場合と比べ、 その融合タンパク質を調製するだけで多 様な抗原性を保持する抗原を得ることができるので、 抗原の調製が容易となり、 また、 高い抗原性も期待できる。
融合タンパク質を構成する抗原タンパク質の個数は、 得られる融合タンパク質 が、 使用する微生物の抗原としての抗原性を保持する限り、 特に制限されるもの ではない。
また、 2種類以上の微生物に由来する抗原タンパク質を用いて得られた融合タ ンパク質を抗原として使用した場合、 1つの抗原によってスクリ一ニングできる 微生物の種類を多くすることができるので、 被験者がどの微生物に感染している かの診断を、 迅速に、 また、 容易に行うことができる。
介在ァミノ酸配列の長さと構成ァミノ酸の種類は、得られる融合タンパク質が、 使用する微生物の抗原としての抗原性を保持する限り、 特に制限されるものでは ないが、 介在アミノ酸配列自体が抗原性を保持しないことが好ましく、 このよう な介在アミノ酸配列としては、 例えば、 イソロイシン残基やアミノ酸残基の数が 数個〜数十個であるポリダリシン残基力挙げられる。
アミノ酸配列 （A) の配列としては、 前述したものが挙げられる。
さらに、 得られる改変タンパク質を、 その改変タンパク質を生産させる微生物 の培養上清から複雑な精製工程を必要とせず簡便に、 精製することができる点か ら、 改変タンパク質のアミノ酸配列 （A) のァミノ基末端側に、 その改変タンパ ク質を生産させる微生物においてシグナルペプチドとして認識されるアミノ酸配 列 （B ) を付加することが好ましく、 このようなアミノ酸配列としては、 例えば、 バチルス . ブレビス (Baci l lus brevis) においてシグナルペプチドとして認識 されるアミノ酸配列が挙げられる。
アミノ酸配列 （B ) とアミノ酸配列 (A) を連結させて、 目的とする改変タン パク質を生産させる場合、 まず、 微生物の中でアミノ酸配列 （B) とアミノ酸配 列 （A) からなる融合タンパク質が作製され、 この融合タンパク質が細胞膜付近 まで移動し、 細胞膜中にあるシグナルべプチダ一ゼによりこの融合タンパク質か らアミノ酸配列 （A) 力切り離されて微生物の外に分泌される。 それにより、 得 られる目的の改変タンパク質が、 それを産生する微生物の細胞内で不溶化して封 入体を形成し、 細胞に留まることによるタンパク質の変性を受けることなく、 効 率よく生産できる。
本発明の改変タンパク質の具体例としては、 例えば、 配列番号 1〜4で示され るタンパク質が挙げられる。
配列番号 1で示されるタンパク質は、 トレポネーマ ·パリダム菌由来の分子量 約 4 7 Kダルトンの抗原タンパク質の 1〜 1 9番目のアミノ酸残基が欠落し、 2 0番目のァミノ酸残基であるシスティン残基がァラ二ン残基に置換された構造を 有するものである。 このタンパク質は梅毒患者血清との間で抗原抗体反応を生じ ることから、 トレポネーマ ·パリダム抗原としての抗原性を有する。
配列番号 2で示されるタンパク質は、 トレポネーマ 'パリダム菌由来の分子量 約 1 7 Kダルトンの抗原タンパク質の 1〜2 1番目のアミノ酸残基が欠落し、 2 2番目のァミノ酸残基であるシスティン残基がァラ二ン残基に置換された構造を 有するものである。 このタンパク質は梅毒患者血清との間で抗原抗体反応を生じ ることから、 トレポネ一マ ·パリダム抗原としての抗原性を有する。
配列番号 3で示されるタンパク質は、 トレポネ一マ ·パリダム菌由来の分子量 約 1 5 Kダルトンの抗原タンパク質の 1〜 1 7番目のアミノ酸残基が欠落し、 1 8番目のァミノ酸残基であるシスティン残基がァラ二ン残基に置換された構造を 有するものである。 このタンパク質は梅毒患者血清との間で抗原抗体反応を生じ ることから、 トレポネ一マ ·パリダム抗原としての抗原性を有する。
配列番号 4で示される改変タンパク質は、 トレポネーマ ·パリダム菌由来の分 子量約 4 7 Kダルトンの抗原タンパク質の 1〜 1 9番目のァミノ酸残基が欠落し、 2 0番目のァミノ酸残基であるシスティン残基がァラ二ン残基に置換されたタン パク質のカルボキシル基末端側に、 イソロイシン残基を介し、 トレポネーマ 'ノ リダム菌由来の分子量約 1 7 Kダルトンの抗原タンパク質の 1〜2 1番目のアミ ノ酸残基が欠落し、 2 2番目のアミノ酸残基であるシスティン残基以後のタンパ ク質が結合した構造を有する融合タンパク質である。 このタンパク質は梅毒患者 血清との間で抗原抗体反応を生じることから、 トレポネーマ ·パリダム特異的抗 原として極めて優れた抗原性を有し、 さらに、 トレポネーマ ·パリダム菌由来の 分子量約 4 7 Kダルトンの抗原タンパク質としての抗原性と分子量約 1 7 Kダル トンの抗原タンパク質としての抗原性の 2つの抗原性を保持するという多様な抗 原性を有する。
改変タンパク質の製造法
本発明の改変タンパク質を製造する方法としては、 化学合成法や遺伝子組換え 法がある。
化学合成法としては、 例えば、 マップ （Multiple Antigen Peptide、 MA P ) 法があり、 3 0個以下のァミノ酸配列からなるタンパク質の合成に適しておリ、 市販のペプチド合成機を使用して合成することができる。 タンパク質はマップ法 によリ繰リ返す形で合成することができる。
遺伝子組換え法としては、 例えば、 本発明の改変タンパク質をコードする D N Aをベクターに揷入して組換えべクタ一を作製し、 それを宿主に揷入して形質転 換体を作製し、 その形質転換体を培養し、 その形質転換体自体又は培養上清を利 用する方法が挙げられる。
本発明の改変タンパク質をコードする DN Aについては後述する。
ベクターとしては、 例えば、 プラスミドベクター、 ファージベクタ一等が挙げ られる。
宿主としては、 例えば、 バチルス · ブレビス（Bacillus brevis)菌、 枯草菌、 大腸菌、 酵母菌等が挙げられる。
以下、 組換えベクターの作製法、 形質転換体の作製法及びその形質転換体を用 いた改変タンパク質の製造法について詳しく説明する。
組換えべクタ一は、 本発明の改変タンパク質をコードする DNA (後述） を、 常法に従って宿主細胞の中で複製可能なプラスミドベクタ一やファージベクター 等に挿入して作製することができる。 その際、 必要に応じ、 リンカ一を使用する。 プラスミドベクターとしては、 作製する組換えべクタ一を保有する形質転換体を 容易にスクリーニングでき、 また、 宿主細胞の中で組換えべクタ一を安定に保持 させる点から、 エリスロマイシン耐性遺伝子、 ネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤 耐性遺伝子を保有するものであることが好ましい。
また、 後述するように、 本発明の改変タンパク質を製造することができる点か ら、 プラスミドベクタ一としては、 プロモータ一配列、 シャインーダルガルノ配 列 （以下、 SD配列という） 及びターミネータ一配列を保有するものであること が必要である。
プラスミドベクタ一の具体例としては、 例えば、 プラスミド pUC l 18、 p UB 1 10、 pNU200、 pNU210、 pHT926、 pNH300、 pN H400等が挙げられる。 pUC 1 18、 pUB 1 10は宝酒造 (株)から購入す ることができる。 pNU200については、 「鵜高重三、 農芸化学会誌、 61 巻、 669頁（1987年)」 に詳細に記載されている。 pNU2 10については、 「バイオ インダストリ一、 9巻、 100- 107頁（1992年）（B 10 INDUSTRY, Vol.9, p.100-107(1 992))」 に詳細に記載されている。 pHT 926については特開平 6— 1337 82号公報に詳細に記載されている。 pNH300については後述の実施例で詳 しく述べる。 PNH400については 「ジャーナル'ォブ 'バクテリォロジ一、 177 巻、 745-749頁（1995年）（J. Bacteriol., Vol.177, p.745-749(1995)) J に 詳細に記載されている。
また、 ファージベクタ一としては、 例えば、 え gtll ファ一ジ、 え gtlO ファー ジ等を利用することができる。 いずれも、 用いた親ベクターに対応する組換えべ クタ一力得られる。
遺伝子組換え法を用いて本発明の改変タンパク質を製造する場合、 作製する組 換えプラスミドは、 本発明の改変タンパク質をコードする DN Aが発現可能なプ ラスミドであることが必要である。 このようなプラスミドを作製する方法として は、 例えば、 プロモータ一配列及び SD配列の近くであってそれらの下流に本発 明の DNAを揷入する方法、 発現可能である前記アミノ酸配列 （B) をコードす る DNAの下流に、 読み取り枠を揃え （即ち、 in frame で)、 前記アミノ酸配列 (A) をコードする DNAを揷入する方法 （従って、 宿主内で得られる本発明の 改変タンパク質は、 アミノ酸配列 （B) とアミノ酸配列 （A) からなる融合タン パク質となる） 等が挙げられる。 アミノ酸配列 （B) としては、 例えば、 シグナ ルペプチド等が挙げら、 シグナルペプチドとしては、 例えば、 バチルス ' ブレビ ス菌由来のシグナルべプチド等が挙げられる。
本発明の組換えプラスミドであって、 かつ、 本発明の改変タンパク質をコード する DN Aが発現可能であるプラスミドの具体例としては、 例えば、 プラスミド pNH400 TP47, pNH30 OTP 17, p NH 400 T P 47 - 17等 が挙げられる。
組換えプラスミド作製の一般的手法は、 「サムブロック他編集、モレキュラー - クロ一ニング 第 2版 （コールド ·スプリング ·ハーバ一 ·ラボラトリー） （198 9年)」 (J.Samblook et al. , Molecular Cloning 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、 以下、 本文献を文献" モレキュラー 'クロ一ニン グ" という） に記載されている。
本発明の形質転換体は、 前記組換えプラスミドを宿主に挿入して作製すること ができる。
宿主としては、 組換えプラスミド中の本発明の DNAが発現するものであれば 特に限定されるものではなく、 例えば、 バチルス ·ブレビス、 バチルス ·サチル ス (枯草菌)、 酵母、 大腸菌等が挙げられる。 いずれの微生物についても、 形質転 換体内で生産された本発明の改変タンパク質力分解されにくい点から、 タンパク 質分解酵素非生産株を使用すること力好ましい。 組換えプラスミドとして前記プ ラスミド pNH400TP47、 pNH30 OTP 17, pNH400TP47 一 17を使用する場合は、 例えば、 バチルス ·ブレビス 47株、 バチルス ·ブレ ビス H 102株（本菌株は、 バチルス ·ブレビス HPD 31株と同一菌株である） 等を使用することができる。
組換えプラスミドを宿主に挿入する方法としては、 例えば、 電気パルス（Elect roporation)法、 プロトプラスト（Protoplast)法、 塩化カルシウム法、 トリス— PEG(Tris-PEG)法等が挙げられ、 宿主の種類によって適宜選択されるが、 宿主 としてバチルス · ブレビスを使用する場合は、 効率及び簡便性の点から、 電気パ ルス法を用いることが好ましい。
組換えプラスミドを利用して形質転換体を作製する一般的手法は、 文献〃 モ レキユラ一 · クロ一ニング〃 に記載されており、 前記バチルス · ブレビス 47 株及びバチルス ·ブレビス H 102株を宿主とした形質転換体の作製法は、 例え ば、 「高橋ら、 ジャーナル 'ォブ ·バクテリオ口ジ一、 156巻、 1130- 1134頁、 19 83年（Takahashi et al.， J. Bacteriol., Vol.156, p.1130- 1134(1983))」、 「高 木ら、 ァグリカルチュラル ·バイオロジカル 'ケミストリ一、 53 巻、 3099-3100 頁、 1989年（Takagi et al., Agric. Biol. Chem. , Vol.53, p.3099- 3100(198 9))J 等に詳細に記載されている。
本発明の形質転換体の具体例としては、 例えば、 前記プラスミド PNH400 TP 47が揷入されたバチルス · ブレビス HPD 31株 （Ba c i l l u s b r e v i s HPD3 1/ρΝΗ400ΤΡ47), プラスミド pNH300T P 17が揷入されたバチルス ·ブレビス H P D3 1株 （B ac i l l u s b r e v i s HPD3 lZpNH30 OTP 17)、 プラスミド p NH 400 T P 47- 17が揷入されたバチルス ·ブレビス HPD 31株 （B a c i 1 1 u s b r ev i s HPD3 l/pNH400TP47- 17) 等が挙げられる。
B a c i l l u s b r ev i s H P D 31 /p NH 400 T P 47、 B a c i l l u s b r ev i s H P D 31ノ p NH 300 T P 17及び B a c i 1 1 u s b r e v i s HPD3 lZpNH400TP47— 17は、 それぞ れ、 受託番号 FERM BP— 5642、 受託番号 F ERM BP— 5641及 び受託番号 F E RM BP— 5763として工業技術院生命工学工業技術研究所 に寄託されている。
形質転換体の培養は、 例えば、 その形質転換体が成長しうる培地に形質転換体 を入れ、 適温で振とう又は静置する方法が使用できる。
培地としては、 炭素源及び窒素源が含有されるものが使用できる。 炭素源とし ては、 例えば、 糖、 有機酸等が挙げられ、 糖としては、 例えば、 グルコース、 グ リセロール、 澱粉、 デキストラン、 糖蜜等が挙げられる。 窒素源としては、 例え ば、 有機窒素源、 無機窒素源等が挙げられ、 有機窒素源としては、 例えば、 カゼ イン、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 カザミノ酸、 グリシン等が挙げられ、 無機窒素源としては、 例えば、 硫酸アンモニゥム、 硝酸アンモニゥム等が挙げら れる。
また、 形質転換体が栄養要求性を示す場合は、 その生育に必要な栄養物質を培 地に添加する。 このような栄養物質としては、 例えば、 アミノ酸、 ビタミン類、 核酸、 塩類等が挙げられる。
培地としては、 例えば、 糖と無機窒素源を主体とする合成培地を使用すること ができる。
培地として固体培地を使用する場合は、 さらに寒天を添加する。
また、 組換えプラスミドを安定に保持させ、 組換えプラスミドを保有しない株 の成育を抑制する点から、 培地に抗生物質を添加することが好ましい。 このよう な抗生物質としては、 例えば、 ペニシリン、 エリスロマイシン、 ネオマイシン、 クロラムフエニコ一ル、 バシトラシン、 D—サイクロセリン、 アンピシリン等が 挙げられる。
更に、 必要により、 消泡剤として、 大豆油、 ラード油及び各種界面活性剤等を 培地に添加してもよい。
培地の pHは、 形質転換体が生育可能な p Hの観点から、 通常、 5〜 9とされ、 6. 5〜7. 5とすることが好ましい。
培地の具体例としては、 例えば、 TMB培地（ペプトン 1 %、 肉エキス 0. 5 %、 酵母エキス 0 . 2 %、 グルコース 1 %、 M g S 04 0 . 0 1 %、 F e S 04 0 . 0 1 %、 M n S〇 4 0 . 0 0 1 %、 Z n S〇 4 0 . 0 0 0 1 % 及びエリスロマイシン 1 0 ig/mlを含有、 pH 7 . 0 ) 力挙げられる。
培養温度は、 例えば、 宿主としてバチルス ·ブレビスを使用する場合は、 通常、 1 5〜4 2 °Cであり、 2 4〜 3 7 °Cとすることが好ましい。 培養時間は、 宿主 の種類、 培地の物理的状態 （固体又は液体)、 培養装置、 培養温度等によって異 なるが、 宿主としてバチルス · ブレビスを、 培地として TM B液体培地を、 それ ぞれ使用し、 培養温度が 1 5〜4 2 °Cである場合、 培養時間は、 通常、 1 6〜 1 6 6時間であり、 2 4〜 9 6時間とすることが好ましい。
形質転換体を培養して本発明の改変タンパク質を製造する方法としては、 上記 のように改変タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、 培 養後の培養液および形質転換体からなる培養物中に改変タンパク質を生成蓄積さ せ、 この培養物を取得し、 培養物から目的の改変タンパク質を精製する。
例えば、 改変タンパク質を製造する方法としては、 培養した形質転換体を培養 物として取得し、 破砕又は溶解して破砕液又は溶解液とし、 その破砕液又は溶解 液から本発明の改変タンパク質を精製する方法が挙げられる。
また、 宿主内で得られる本発明の改変タンパク質がシグナル配列と前記アミノ 酸配列 (A) との融合されたタンパク質となっているため、 形質転換体のシグナ ルぺプチダーゼによリ融合タンパク質からシグナル配列が除去され、 前記アミノ 酸配列 (A) が形質転換体から分泌されるので、 形質転換体の培養後の培養物と して、 培養上清を取得し、 その培養上清から本発明の改変タンパク質をアミノ酸 配列 (A) として精製する簡便な方法を使用することが好ましい。
なお、培養物として、培養液及び培養した形質転換体からの精製方法を併用し、 目的の改変タンパク質の収率を向上することもできる。
形質転換体を破砕する方法としては、 例えば、 形質転換体を物理的に破砕する 方法が挙げられ、 例えば、 形質転換体を緩衝液に懸濁してこれに超音波を照射す る方法、 形質転換体を石英砂と混練し、 これを緩衝液に懸濁する方法等挙げられ る。 一方、 形質転換体を溶解する方法としては、 例えば、 形質転換体の細胞壁を 溶解する酵素と界面活性剤等で形質転換体を溶解する方法が挙げられ、 形質転換 体の宿主が大腸菌の場合は、 この酵素としてリゾチームを、 界面活性剤としてド デシル硫酸ナトリウム （S D S ) を使用することができる。
得られた破砕液又は溶解液から本発明の改変タンパク質を精製する方法として は、 例えば、 前記破砕液又は溶解液を遠心分離して細胞残渣を除去し、 上清を取 得し、 ストレプトマイシン硫酸塩を添加して撹拌し、 遠心分離し、 これによリ核 酸を沈殿物として除去し、 上清を取得し、 この上清に硫酸アンモニゥムを添加し て撹拌し、 遠心分離して沈殿を取得する方法を使用することができる。 なお、 最 後の遠心分離においては、 本発明の改変タンパク質が上清に含まれていることも あるので、 サンプリングして、 上清と沈殿の画分における本発明の改変タンパク 質の有無を確認しておくことが好ましい。
また、 形質転換体の培養後の培養上清から本発明の改変タンパク質を精製する 方法としては、 例えば、 この培養上清に硫酸アンモニゥムを添加し （例えば、 2 5 %)、 撹拌し、 遠心分離して沈殿を取得する方法を使用することができる。 そ の際、 夾雑物を除去するため、 最初に低濃度の硫酸アンモニゥムを添加し （例え ば、 1 0 % )、 撹拌し、 遠心分離して上清を取得し、 この上清にさらに硫酸アン モニゥムを添加し （例えば、 最終濃度 2 5 % )、 撹拌し、 遠心分離して沈殿を取 得することが好ましい。
取得された沈殿は、 抗原性に優れる改変タンパク質を取得することができる点 から、 界面活性剤含有水溶液に溶解させることが好ましい。 水溶液としては、 例 えば、 P B Sゃトリス—塩酸緩衝液等のタンパク質の精製に通常使用される緩衝 液を利用することができる。 界面活性剤としては、 例えば、 S D S、 T w e e n 2 0等が挙げられる。 また、 水溶液中の界面活性剤の濃度は、 0 . 0 5〜2 %が 好ましく、 0 . 1〜 1 %がより好ましく、 0 . 5〜 1 %がさらに好ましい。 この 濃度が 0 . 0 5 %未満であつたり 2 %を超えると、 得られた改変タンパク質の抗 原性が損なわれる傾向にある。 特に、 タンパク質がトレポネーマ ·パリダム菌に 由来するものである場合、 トレポネ一マ ·パリダム菌としての抗原性に優れる改 変タンパク質を取得することができる点から、 取得された沈殿を上記濃度の界面 活性剤含有水溶液に溶解させることが好ましい。
また、 本発明の改変タンパク質は、 形質転換体の培養上清を陽イオンカラムク 口マトグラフィ一で分画して精製することもできる。
細胞残渣の除去、 ストレプトマイシン硫酸塩を添加する核酸の除去及び硫酸 アンモニゥムを添加するタンパク質の取得等の具体的方法は、 文献〃 モレキュ ラ— .クローニング" に記載されている。
改変タンパク質をコードする D N A
本発明において、 改変タンパク質をコードする D NAとは、 改変タンパク質の アミノ酸配列をトリプレット暗号表 （それぞれのアミノ酸に対して、 1〜6通り のヌクレオチド配列が割リ当てられている） に従ってヌクレオチド配列に読み替 えたときの D N A群から選ばれる D N Aをいう。
本発明の改変タンパク質としては、 前記改変タンパク質の項で説明したものが 挙げられ、 改変タンパク質をコードする D NAも、 これらの改変タンパク質のァ ミノ酸配列に対応したヌクレオチド配列のものが挙げられる。
改変タンパク質をコードする D N Aの具体例としては、 例えば、 配列番号 5〜 8で示される塩基配列を有する D N Aが挙げられる。
配列番号 5で示される塩基配列を有する D NAは、 配列番号 1で示されるタン パク質をコードする D NAである。 この塩基配列の中で、 コード領域は 3〜1 2 7 6番目の配列である。
配列番号 6で示される塩基配列を有する D N Aは、 配列番号 2で示されるタン パク質をコードする D N Aである。 この塩基配列の中で、 コード領域は 3〜4 0 7番目の配列である。
配列番号 7で示される塩基配列を有する D N Aは、 配列番号 3で示されるタン パク質をコードする D NAであり、 この塩基配列の全体がコ一ド領域である。 配列番号 8で示される塩基配列を有する D N Aは、 配列番号 4で示されるタン パク質をコードする D NAである。 この塩基配列の中で、 全コード領域は 3〜1 6 5 5番目の配列である。
改変タンパク質をコードする D N Aは、 化学合成法か遺伝子組換え法で作製す ることができる。
化学合成法としては、 例えば、 ホスホアミダイト法があり、 全長が 1 0 0塩基 以下の塩基配列からなる D N Aの合成に適しておリ、 市販の D N A合成機で合成 することができる。
全長が 100塩基よりも長い DNAを作製するためには、 後述の遺伝子組換え 法を利用することもできる力 次のようにしても作製することができる。
即ち、 塩基配列を 100個未満の塩基に区切り、 それぞれの塩基配列からなる DNA断片を上記のように化学合成し、 これらの DNA断片を混合し、 T4— D NAリガーゼを用いてこれらの DNA断片を連結する。 その際、 相補鎖の DNA 断片も合成し、 DN A断片同士を対合させたときに突出末端が生じるようにする と、 突出末端が粘着末端の役割を果たし、 目的の DN Aが得られやすい。
遺伝子組換え法としては、 例えば、 元のタンパク質を産生する生物のゲノム D NA (生物が真核生物である場合は cDNA) を錡型として、 元のタンパク質の 塩基配列を元にして設計され、 作製されたプライマ一 DNAを利用してポリメラ —ゼ'チェイン' リアクション （PCR)法を行う方法を使用することができる。 元のタンパク質を産生する生物がトレポネーマ ·パリダム菌である場合、 トレ ポネーマ ·パリダム菌としては、 例えば、 トレポネーマ ·パリダム ·ニコルス株 (Treponema pallidum; Nichols strain)を使用することができ、この株は、 リー · ラボラトリーズ (Lee Laboratories)社 (米国）から購入することができる。
元のタンパク質を産生する生物のゲノム DNAや c DNAの取得法は、 その生 物の種類によって適宜選択され、 特に制限されるものではなく、 例えば、 文献〃 モレキュラー 'クローニング〃 に記載されている方法に従うことができる。
トレポネーマ ·パリダム菌のゲノム DNA 、 例えば、 トレポネ一マ ·パリダ ム菌の菌体を 1M 塩化ナトリウム、 1N 水酸化ナトリウム及び 2% SDS 含有水溶液に懸濁し、 煮沸し、 0. 5 M トリス （pH7. 0) を添加して中和し、 フエノール抽出し、 エタノール沈殿処理を行い、 この沈殿を乾燥させて得ること ができる。 このゲノム DN Aの取得法は、 「ェム ·ブイ · ノルガードら、 ジャー ナル 'ォブ 'クリニカル ' ミクロバイオロジー、 29巻、 62- 69頁（1991年）」 （M. V. Norgard et al., J. Clin. Microbiol., Vol.29, p.62-69(1991)) に詳細に記 載されている。
トレポネーマ ·パリダム菌由来の抗原タンパク質の塩基配列は前述したように ウェイゲルらの文献、 エイケンスらの文献、 プレセルらの文献等に記載されてお リ、 P C R法に使用されるプライマ一 D N Aの塩基配列はこの抗原タンパク質の 塩基配列を元にして設計される力 このプライマー D NAの塩基配列は、 抗原タ ンパク質のアミノ酸配列に対応させた塩基配列にするのではなく、 抗原タンパク 質のアミノ基末端領域にあるシスティン残基が脂質非結合性アミノ酸残基 （ァラ ニン残基、 グルタミン酸残基、 セリン残基等） に変換されるように設計すること が必要である。 このように設計されたプライマ一 D N Aは市販の D N A合成機を 用レ、た化学合成法により製造することができる。
なお、 P C R法を用いて D N Aを複製させる方法の一般的手法は文献〃 モレ キユラ一 'クロ一ニング〃 に記載されている。
一旦、 改変タンパク質をコードする D NAが取得されると、 遺伝子組換え法や 前述した P C R法を利用することによって、 その D N Aを複製させることができ るので、 元のタンパク質を産生する生物のゲノム D N Aや c D NAを再度取得す る操作は不要である。
本発明の改変タンパク質は、各種診断薬の有効成分として利用することができ、 特に、 タンパク質がトレポネーマ ·パリダム菌に由来するものである場合、 得ら れる改変タンパク質はトレポネーマ ·パリダム菌としての抗原性を有するので、 梅毒感染診断薬の有効成分として利用することができる。
改変タンパク質を抗原として用いる抗トレポネーマ ·パリダム抗体の測定法及び 測定用試薬並びに改変タンパク質を有効成分とする梅毒感染診断薬
抗トレポネーマ ·パリダム抗体の測定法は、 本発明のトレポネーマ ·パリダム 菌に由来する改変タンパク質を抗原の一部又は全部として用いる限り、 特に制限 されない。 なお、 本発明の改変タンパク質は、 単独に、 又は複数種組合わせ使用 することができる。
抗トレポネーマ 'パリダム抗体の測定法としては、 例えば、 各種標識物を利用 した免疫測定法、 ラテックス担体粒子を用いたラテックス凝集法、 免疫比濁法等 を利用することができる。
以下、 各種標識物を利用した免疫測定法について詳しく説明する。
前記改変タンパク質を用い、 各種標識物を利用した免疫測定法を用いて抗トレ ポネーマ ·パリダム抗体を測定する方法としては、 例えば、 前記改変タンパク質 を物理的又はィ匕学的に担体に固定化して固定化抗原を作成し、 この固定化抗原を 検体試料と接触させて一定時間保温し、 これにより、 検体試料中に抗トレポネー マ ·パリダム抗体力存在する場合はその抗体が前記固定化抗原と結合して抗原抗 体複合体が担体上に形成され、 必要により一旦洗浄し、 次いで検体試料中の前記 抗体に対する標識抗体を接触させる （場合によリ、 検体試料と標識抗体を同時に 接触させても良い） 方法を使用することができる。
前記抗原抗体複合体が形成されていると、 これにさらに標識抗体が結合し、 標 識抗体も担体上に固定化されることになる。 その後、 担体上に結合した標識抗体 又は結合しない標識抗体上の標識物量を標識物に応じた測定方法により測定し、 その値から検体試料中における抗トレポネーマ ·パリダム抗体の存在又はその量 を求めることができる。
なお、 本発明において、 「測定」 は定量的又は半定量的な測定だけでなく、 定 性的な測定 （検出等） も意味する。
担体としては、 抗原を固定することができるものであれば特に制限されるもの ではないが、 例えば、 ポリスチレン、 塩化ビニール等のプラスチック材料、 セル ロース、 ニトロセルロース、 ナイロン等の繊維材料、 ガラス、 シリカゲル等の無 機材料、 赤血球、 リボソーム、 ポリビニリデンジフルオライド （P D V F ) など を用いることができ、 その形状は、 マイクロタイタープレート、 ビーズ、 磁^ ビ —ズ、 ぺ一パ一ディスク、 膜、 糸などのあらゆる形が可能である力^ 簡便である 点からポリスチレン製のビーズ又はマイクロタイタープレートを使用することが 好ましく、 ポリスチレン製のマイクロタイタ一プレートが特に好ましい。
前記改変タンパク質を物理的に担体に固定化する方法としては、 例えば、 前記 改変タンパク質含有溶液 （抗原液） を担体と接触させ、 低温 （例えば、 4 °C) で一晩放置する方法を使用することができる。
また、 前記改変タンパク質を化学的に担体に固定する方法としては、 例えば、 前記改変タンパク質、 表面にカルボキシル基を有する担体及びカルポジイミドを 混合して放置する方法等を利用することができる。
検体試料としては、 例えば、 ヒトの各種液体成分が挙げられるが、 検体提供者 の臨床像が反映される点から、 ヒト血液、 ヒト涙、 ヒト咽頭ぬぐい液又はヒト尿 -
等力好ましく、 ヒト血液がより好ましく、 その中でもヒト血清がさらに好ましい。 なお、 検体試料中の他の抗体等が担体に非特異的に結合するのを防止するため に、 検体試料の添加前に、 牛血清アルブミン等で担体の表面をブロッキングして おくことが好ましい。
洗浄液としては、 例えば、 界面活性剤を含むトリス又はリン酸緩衝液等を利用 することができる。
標識抗体としては、 検体試料中の抗体 （例えば、 ヒト抗体） に対する抗体を各 種標識物質で標識したものが挙げられる。 標識される抗体としては、 例えば、 抗 ヒト I gG抗体、 抗ヒト I gA抗体、 抗ヒト I gM抗体等又はこれらの部分分解 物 （F(ab' )2、 F ab等） 等が挙げられ、 これらは測定対象とする抗体の種 類に応じて適宜使い分けられる。
検体提供者の臨床像が反映される点から、 前記検体試料中の抗体に対する標識 抗体を接触させる工程において、 一つの検体試料に対して、 抗体の種類が異なる 標識抗体を別々に反応させて測定することが好ましい。 抗体の種類が異なる標識 抗体としては、 例えば、 標識化抗ヒト I gG抗体、 標識化抗ヒト I gA抗体、 標 識化抗ヒト I gM抗体等が挙げられる。
標識抗体に用いる標識物質としては、 例えば、 酵素、 放射性同位元素、 蛍光物 質、 発光物質等が利用できる。 酵素としては、 例えば、 マレートデヒドロゲナー ゼ （酵素番号 1.1.1.37)、 グルコース一 6—リン酸脱水素酵素 （酵素番号 1.1.1. 49)、 グルコースォキシダ一ゼ （酵素番号 1.1.3.4)、 西洋ヮサビバ一ォキシダー ゼ （酵素番号 1.11.1.7)、 アセチルコリンエステラーゼ （酵素番号 3.1.1.7)、 ァ ルカリフォスファタ一ゼ（酵素番号 3.1.3.1)、 ダルコアミラーゼ（酵素番号 3.2. 1.3)、 リゾチーム （酵素番号 3.2.1.17)、 /3-ガラクトシダーゼ （酵素番号 3.2. 1.23) などが挙げられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレセイン （Fluore seine) 等が利用できる。
これらの標識物質の中では、 感度、 安全性、 簡便性等の点から、 酵素を用いる ことが好ましく、 標識物質として酵素を使用する免疫測定法は、 通常、 酵素免疫 測定法 （EL I SA法） と呼ばれる。
酵素標識抗体としては、 簡易で高感度な測定が可能であることから、 アルカリ '—ゼ標識抗体又は西洋ヮサビバ一ォキシダ一ゼ標識抗体を用いるこ とが好ましく、 これらの酵素標識抗体は市販されている。
なお、 抗体と標識物を結合させるために、 抗体と標識物の間にピオチン （Biot in)、 アビジン （Avidin)、 ストレプトアビジン （Streptoavidin)、 ディゴキシゲ ニン （Digoxigenin) 等の化学物質を介在させてもよい。
また、 前記改変タンパク質を用い、 ラテックス凝集法を利用して抗トレポネー マ -パリダム抗体を測定する方法としては、 例えば、 前記改変タンパク質を物理 的又は化学的にラテックス粒子 （担体） に固定化して固定化抗原を作成し、 この 固定化抗原を検体試料と接触させて一定時間保温し、 検体試料と固定化抗原の混 合溶液の濁度を測定する方法が挙げられる。 固定化抗原を検体試料と接触させる ことにより、 検体試料中に抗トレポネーマ ·パリダム抗体が存在する場合はその 抗体が前記固定化抗原と結合して抗原抗体複合体が形成される。 その際、 抗体に は抗原と結合する部分が 2箇所存在するため、 抗原抗体複合体が互いに架橋する 構造が形成され、 凝集反応が発生する。 この反応により、 検体試料と固定化抗原 の混合溶液の濁度が増加するので、 この濁度を目視により又は吸収光度計を用い て測定する。
なお、 ラテックス凝集法の変法として、 ラテックス粒子の代わりに、 赤血球や リポソ一ム等の他の各種微粒子を使用する方法も利用することができる。
本発明のトレポネーマ ·パリダム菌に由来する改変タンパク質は、抗原として、 抗トレポネーマ ·パリダム抗体の測定用試薬に利用することができる。
測定方法により試薬の構成要素は異なるが、 ±記各種標識物を用いた免疫測定 法を利用した抗トレポネーマ ·パリダム抗体の測定用試薬としては、 例えば、 担 体に固定された固定化抗原と、 測定しょうとする抗体に反応する標識抗体とが 別々に含まれる試薬が挙げられ、 また、 前記ラテックス凝集法を利用する抗トレ ポネーマ ·パリダム抗体の測定用試薬としては、 例えば、 ラテックス粒子 （担体） に固定された固定化抗原が挙げられる。
担体や標識抗体としては前記したものが挙げられる。
標識抗体は緩衝液等に分散させておくことができる。
前記試薬において、 標識抗体としては標識化抗ヒト I g抗体を使用することが できる。 標識化抗ヒト I g抗体としては、 例えば、 標識化抗ヒト I g G抗体、 標 識化抗ヒト I g A抗体及び標識化抗ヒト I g M抗体が挙げられる。 使用する標識 抗体は、 一つの検体試料に対して、 これらの抗体のいずれか 1種類のみであって もよいが、 検体提供者の臨床像が反映される点から、 一つの検体試料に対して、 これらの 3種類の標識抗体を使用すること力好ましい。これらの標識抗体は、別々 に用意されていても混合物となっていてもよい。
前記試薬には、 必要に応じてその他の成分が組み合わされる。 例えば、 上記各 種標識物を利用した免疫測定法に用いられる測定試薬の場合、 その他の成分とし ては、 例えば、 陰性対照試料、 陽性対照試料、 洗浄液、 標識物質が酵素等の場合 における反応基質、 希釈液、 増感剤、 反応停止液などが挙げられ、 これらは単独 で又は組み合わせて用いられ、 試薬の形態としては、 例えば、 上記成分が必要量 同封されたキット、 これらの単品のバルクなどが挙げられる。
また、 前記ラテックス凝集法に用いられる測定試薬の場合、 その他の成分とし ては、 例えば、 陰性対照試料、 陽性対照試料、 洗浄液、 増感剤などが挙げられる。 なお、 この増感剤としては、 例えば、 ゥシ血清アルブミンやポリエチレングリコ —ル等が挙げられる。
前記抗トレポネーマ ·パリダム抗体の測定用試薬は、 梅毒感染の診断に有効に 利用される。
また、上記改変タンパク質を有効成分とする梅毒感染診断薬としては、例えば、 上記試薬をそのまま利用することができる。
改変タンパク質を抗原として用いる抗トレポネーマ ·パリダム抗体の製造法 抗トレポネーマ ·パリダム抗体は、 本発明のトレポネ一マ ·パリダム菌に由来 する改変タンパク質を抗原とし、 抗血清又は単離された抗トレポネーマ 'パリダ ム抗体として得ることができる。
抗血清を製造する方法としては、 例えば、 前記抗原でゥサギやマウス等の動物 を免疫し、 その血清を取得する方法が使用できる。
また、 抗トレポネーマ ·パリダム抗体を単離製造する方法としては、 例えば、 前記抗原でゥサギやマウス等を免疫し、 その脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させて ハイプリドーマを作製し、 その中から前記抗原を認識するハイプリドーマを選択 し、 これを培養し、 その培養上清を取得する方法が使用できる。 抗原性を高める ため、 必要に応じ、 前記抗原に適当なキャリアタンパク質を結合させて免疫原と してもよい。
免疫時に使用するァジュバントは種々のものが利用できるが、 フロイントの完 全アジュバント （FCA) やフロインドの不完全アジュバント （F I A) が好ま しい。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 P3X63Ag8. 653 (ATCC (Americ an Type Culture Collection) CRL- 1 580) や P 3/NS I /1 -Ag 4— 1 (ATCC T I B— 18) を使用することができる。 また、 抗原を免疫 する動物としては、 ゥサギ、 マウス、 ラット、 ゥシ、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリ等 力 吏用できるが、 ここに例示された動物種に限定されるものではな 、。
抗原として本発明のトレポネーマ ·パリダム菌に由来する改変タンパク質を使 用すること以外は、 動物を免疫して抗体を得る公知の一般的手法に従い、 抗トレ ポネ一マ 'パリダム抗体を製造することができる。 抗体としてはポリクロ一ナル 抗体及びモノクローナル抗体がある。
なお、 これらの抗血清や単離製造された抗トレポネーマ ·パリダム抗体は、 各 種酵素、 コロイド等で修飾されてもよい。
得られた抗血清や単離製造された抗トレポネーマ ·パリダム抗体は、 梅毒感 染の診断に有効に利用される。 図面の簡単な説明
図 1は、 プラスミド pNH40 OTP 47の構築図である。
図 2は、 実施例 1で取得した改変抗原タンパク質についてのドデシル硫酸ナト リゥム—ポリアクリルアミドゲル電気泳動図及びウェスタンブロットの図である。 図 3は、 プラスミド pNH 30 OTP 17の構築図である。
図 4は、 実施例 2で取得した改変抗原タンパク質についてのドデシル硫酸ナト リウム—ポリアクリルァミドゲル電気泳動図及びゥエスタンプロットの図である。 図 5は、 プラスミド pNH400TP47— 17の構築図である。
図 6は、 実施例 で取得した融合された改変タンパク質についてのドデシル硫 酸ナトリウム—ポリアクリルアミドゲル電気泳動図及びウェスタンブロットの図 である。 実施例
以下、 実施例により本発明を詳細に説明する。
〔実施例 1〕 トレポネーマ ·パリダム菌由来の分子量約 47Kダルトンの抗原タ ンパク質の改変タンパク質の製造、 ウェスタンブロット法によ ό改変タンパク質 の抗原性の検討並びに EL I S Αによる抗トレポネーマ ·パリダム抗体の測定
( 1 ) トレポネーマ ·パリダム菌由来の分子量約 47 Kダルトンの抗原タンパク 質の改変タンパク質を発現する組換えプラスミドの作製
図 1に示される手順で組換えプラスミドを作製した。
トレポネーマ ·パリダム菌として、 トレポネーマ ·パリダム ·ニコルス株 (Tre ponema pallidum Nichols strain) (リー · ラホラトリース (Lee Laboratoriesリ社 (米国）から購入、 商品コード： SPRO J— TPURE)を使用した。
前述したェム ·ブイ ·ノルガードらの文献に記載された方法に従い、 次のよう にしてトレポネ一マ ·パリダム菌のゲノム DN Aを取得した。
トレポネーマ .パリダム菌の菌体 5 X 107個を、 1M 塩化ナトリウム、 1 N 水酸化ナトリウム及び 2% SDSを含有する水溶液に懸濁し、 1分間煮沸 した。 次に、 この水溶液の 4倍量の 0. 5M トリス （pH7. 0) を添加して中 和した。 さらに、 フエノールを添加して水層を取得し、 この水層にエタノールを 添加し、 遠心分離して沈殿を取得し、 この沈殿を乾燥させた。 最後にこの沈殿を 滅菌水に溶解し、 トレポネーマ ·パリダム菌のゲノム DN A溶液とした。 このゲ ノム D N A溶液は、 後述する PCR法において錶型 DNAとして使用される。 前述したウェイゲルらの文献には、 トレポネーマ ·パリダム菌由来の分子量約 47 Kダルトンの抗原タンパク質をコードする DNAの塩基配列が記載されてい る （配列番号 9で示される塩基配列)。
この分子量約 47 Kダルトンの抗原タンパク質は、 トレポネーマ .パリダム菌 において次のような機構で細胞膜タンパクになると考えられる。 まず、 トレポネ —マ ·パリダム菌体内でシグナル配列を含む前駆体タンパク質 （配列番号 9で示 される塩基配列に併記される 1〜434番目のアミノ酸配列） として合成され、 続いて、 菌体内に存在する脂肪酸がこの前駆体タンパク質における 20番目のシ スティン残基とチォエステル結合する。 そして、 菌体内に存在するシグナルぺプ チダ一ゼによりこの前駆体タンパク質における 1〜 1 9番目のアミノ酸配列がシ グナル配列として除去され、 さらに、 結合した脂肪酸が細胞膜の脂質 2重層中に 固定され、 これにより、 前駆体タンパク質における 20番目以降のアミノ酸配列 (成熟タンパク質） が細胞膜タンパク質として固定される。
この脂肪酸が抗原タンパク質の分泌発現の障害となると考えられることから、 脂肪酸の結合を防ぐ目的で、 成熟タンパク質のァミノ基末端のシスティン残基が ァラニン残基になるように、 アミノ基末端側のプライマ一 DNAを設計した。 こ のブラィマー D N Aの塩基配列は配列番号 1 0で示される。 この配列番号 1 0で 示される塩基配列のうち、 4〜 9番目の配列は制限酵素 P s t Iの認識部位であ り、 6〜 1 7番目の配列は、 順にァラニン、 グリシン、 セリン、 セリンの各アミ ノ酸残基に対応する塩基配列である。 このプライマ一 DNAを D N A合成機で化 学合成した。 これをプライマ一 47— 1とする。
一方、 遺伝子中の翻訳終了の遺伝暗号を含み、 かつ、 その直後に制限酵素 B a mH Iの認識部位が出来るように、 カルボキシル基末端側のプライマー DNAを 設計した。 このプライマ一 DNAの塩基配列は配列番号 1 1で示される。 この配 列番号 1 1で示される塩基配列のうち、 4〜 9番目の配列は制限酵素 B amH I の認識部位であり、 1 0〜1 2番目の配列は翻訳終了の遺伝暗号である。 このプ ライマ一 DNAを DNA合成機で化学合成した。. これをプライマ一 47— 2とす る。
そして、 錡型 DNAとして前記トレポネ一マ 'パリダム菌の染色体 DNAを用 い、 水 6 2 μ l、 錡型DNA 1 μ 1、 T a qポリメラ一ゼ緩衝液 1 0 μ 1、 1. 2 5mM dNTP (dATP、 dCTP、 dGTP及び dTTPの等 モル混合液） 1 6 μ 1、 2 0 pmo 1 e/β \ プライマ一47— 1の水溶 液 5 μ 1、 20 pmo 1 e/μ 1 プライマ一47 _ 2の水溶液 5 μ 1及 び T a qポリメラーゼ 1 μ 1 ( 5 u n i t ) を混合し、 9 6°〇で0. 5分間 の加熱後、 94 °Cで 1分間の加熱、 54 °Cで 1分間の冷却及び Ί 0 °Cで 1分間 の保温からなる工程を 1サイクルとしてこの工程を 25サイクル繰返す条件で P CRの操作を行った。 得られた反応液の一部を制限酵素 P s t I及び Kp η Iで 消化し、 残りを制限酵素 Kp n Iと B amH Iでそれぞれ消化し、 P s t I— K p n l断片 （654b p) と Kp n l— B amH I断片 （624b p) を得た。 プラスミド pNH400 [ジャーナル .ォブ.バクテリオ口ジ一、 177巻、 74 5-749 頁（1995 年）（J. Bacteriol., Vol.177, p.745- 749(1995))に記載] を制限 酵素 P s t I及び B amH Iで消化し、 この消化物と、 前記 P s t l— Kp n l 断片 （654 b p) 及び Kp n I _B amH I断片 （624b p) を混合し、 さ らに、 T ak a r a DN Aライゲーシヨンキット（宝酒造 (株)製）に含まれる A 液 20 1及び B液 5 / 1を添加し、 1 6°Cで 30分間保温してライゲ一ショ ン反応を行い、 大きさが約 5. 4 k b pのプラスミド pNH400 TP47を構 築した。
(2) プラスミド pNH400TP47を含む形質転換体の作製
電気パルス法を用い、 構築したプラスミドをバチルス · ブレビス HPD3 1株 に導入し、 形質転換体 （プラスミド pNH40 OTP 47を保持するバチルス ' ブレビス HPD3 1株） を得た。 この形質転換体は、 受託番号 FERM BP— 5642として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
(3) 改変タンパク質の製造
1 2 1°C、 5分間オートクレープ滅菌した TMN寒天平板培地 （ペプトン 1 %、 肉エキス 0. 5%、 酵母エキス 0. 2%、 グルコース 1 %、 Mg S O 4 0. 01 %、 F e S O 4 0. 01 %、 M n S O 4 0. 001 %、 Z n S 04 0. 0001 %、 寒天 1. 5%、 ネオマイシン 50 g/ml を含む、 pH 7. 0の培地） に、 プラスミド pNH400 TP 47を保持するバチルス 'ブレ ビス HPD 3 1株を塗抹し、 30°C、 48時間培養し、 コロニーを形成させた。 生じたコロニーを、 TMN液体培地 （前記 TMN寒天平板培地から寒天を除いた 培地） 100ml を入れた 500ml 容三角フラスコに接種し、 30°C、 2曰間振 盪培養し、 培養液を遠心分離し、 上清を取得し、 トレポネ一マ ，パリダム菌由来 の分子量約 47 Kダルトンの抗原タンパク質の改変タンパク質含有画分とした。
(4) 改変タンパク質含有画分の SDS_ポリアクリルアミドゲル電気泳動 前記 （ 3 ) で得られた培養上清とサンプル処理液 (0. 0625M トリス塩 酸 （ρΗ6· 8)、 2% SDS、 10% グリセロール、 5% 2—メルカプト エタノ一ル及び 0. 001 % プロモフエノ一ルブルーの混合液） を等容量でよ く混合し、 100°Cで 5分間加熱処理し、 これを検体とした。
ァクリルァミド濃度 10 %から 20 %のポリアクリルァミドグラジェントゲル (第一化学薬品社製、 商品名：マルチゲル 1 0Z20) を用い、 検体 10 μ 1 をゲルに添加し、 泳動緩衝液 (25 OmM グリシン及び 0. 1 % S D Sを含 む 25mM トリス緩衝液、 pH8. 3) を用い、 電流 40 mAで S D S—ポリア クリルアミドゲル電気泳動を行った。 なお、 試料泳動レーンは 2本使用し、 また、 分子量マーカ一も同時に泳動させた。
(5) 改変タンパク質の確認
電気泳動終了後、分子量マーカ一と試料泳動レーン 1本を含むゲルを切り出し、 クーマシ一ブリリアントブルー （CBB) で染色操作を行った。
その結果、 図 2に示されるように、 分子量約 47 Kダルトンの位置に青色のバ ンドが認められ （レーン C)、 前記培養上清中に分子量約 47 Kダルトンのタン パク質が含まれていることが確認された。
(6) ウェスタンブロット法による改変タンパク質の抗原性の検討
一方、 残リのゲルを転写用緩衝液 （ 0. 02 M トリス、 0. 15 M グリシ ン及び 20%エタノールを含む水溶液） に 15分間浸し、 平衡化させた。 続いて、 同様にして平衡ィヒしたニトロセルロース膜 （バイオラッド社製） の上にゲルを載 せ、 平衡ィ匕した濾紙で両面を同じく挟み、 転写装置 （バイオラッド社製） に設置 し、 100 Vの定電圧を 1時間かけ、 ゲル中に含まれるタンパク質をニトロセル ロース膜上に転写した。 転写後、 1 %牛血清アルブミン （以下、 BSAと略す） 溶液 （KPL社製、 商品名： BS A希釈/ブロッキング用 10倍濃縮液） にニト ロセルロース膜を浸し、 4°Cで 1晚静置した。
得られたニトロセルロース膜を、 洗浄用緩衝液 （0. 015M トリス、 0. 2M NaC l、 0. 05% T w e e n 20 ) で 10分間洗浄した。 その際、 2分毎に洗浄用緩衝液を新しいものに取り替えた。 ニトロセルロース膜を各レー ン毎に約 5 mm幅の册状に切り、 溝状の反応容器槽に入れた。 血清希釈用緩衝液 (0. 01 5M トリス、 0. 2M NaC l及び0. 2% BSAを含む水溶 液） で 100倍に希釈した梅毒患者血清 lml を反応容器槽に入れ、 振とう条件 下で 2時間反応させた。 反応後、 洗浄用緩衝液を用い、 ニトロセルロース膜を振 とう条件下で 35分間洗浄した。 その際、 この時洗浄用緩衝液を最初は 1 5分後 に 1回、 その後は 5分毎に 3回新しいものに取り替えた。 続いてニトロセル口一 ス膜を溝状の反応容器槽に入れ、 血清希釈用緩衝液で 500倍に希釈したペルォ キシダ一ゼ標識抗ヒト I gG抗体 （KPL社製） lml と、 振とう条件下で 2時 間反応させた。 反応後、 洗浄用緩衝液を用い、 ニトロセルロース膜を振とう条件 下で 35分間洗浄した。 この時洗浄用緩衝液を最初は 1 5分後に 1回、 その後は 5分毎に 3回新しいものに取り替えた。 洗浄後、 ニトロセルロース膜を用時調製 したジァミノベンチジン溶液 （0. 05M トリス、 0. 9% NaC l溶液 2 Om 3 1 % 過酸化水素液 32 μ 1、 ジァミノベンチジン （溶液） 1 Omg を含む） に 10分間浸した。 そして、 ニトロセルロース膜を蒸留水でよく洗浄し、 乾燥させた。
その結果、 図 2に示されるように、 分子量約 47 Kダルトンの位置に褐色のバ ンドが認められ （レーン W)、 梅毒患者血清がトレポネーマ ·パリダム菌由来の 分子量約 47 Kダルトンの抗原タンパク質の改変タンパク質と反応すること力 ¾| 認できた。 なお、 バンドの濃さから判断して、 改変タンパク質の生産量は約 1 g / (培養液 1リットル） であると考えられる。
一方、 梅毒患者血清の代わりに健常人血清を使用して同様な操作を行ったが、 バンドは認められず、 前記改変タンパク質が健 人血清とは反応しないこと力 s確 認、できた。
以上から、 本発明で得られたトレポネーマ ·パリダム菌由来の分子量約 47 K ダルトンの抗原タンパク質の改変タンパク質が梅毒患者血清と特異的に反応する ことが示された。
(7) EL I S Aによる抗トレポネーマ 'パリダム抗体の測定
前記 （3) で得られた培養上清をゆるやかに撹拌しながら、 25%となるよう に硫酸アンモニゥムを添加し、 4°Cで一晩撹拌し、 さらに 37°Cで 1時間撹拌 し、 1 0， 000 X gで 30分間遠心分離して沈殿を取得した。 得られた沈殿 を、 25%硫酸アンモニゥムを含む 5 OmM トリス—塩酸緩衝液 （pH 8. 6) に懸濁して前記条件で遠心分離して沈殿を洗浄し、 この洗浄操作を 2回行った。 得られた沈殿を少量の緩衝液 （ 1 % S D Sを含む 50 mM トリス—塩酸緩衝液 (pH8. 6)) に溶解してタンパク質溶解液を得た。
このタンパク質溶解液を 5 OmM トリスー塩酸緩衝液 (pH8. 6)で希釈し、 タンパク質濃度が 0. 95 ^g/ml で SD S濃度が 0. 02%である抗原液を調 製し、 その 100 1をマイクロタイタ一プレートのゥエル （くぼみ） に注ぎ、 4 °Cでー晚静置した。
抗原液を吸引除去し、 ゥエルを 250 μ 1の洗浄液 （0. 05%Twe e n 20及び 0. 1 %N aN3を含むリン酸緩衝生理食塩水 （PB S)) で 2回洗浄 した。
続いて、 ブロッキング液 （KPL (株)製 10倍濃縮ゥシ血清アルブミン （BS A) 溶液を PB Sで 2倍に希釈して得られた溶液） 250 μ 1をゥエルに注ぎ、 37°Cで 1時間静置した後、 前記ブロッキング液を吸引除去した。
そして、 前記洗浄液で 200倍に希釈した梅毒患者血清 100 t 1をゥエル に注ぎ、 37°Cで 1時間静置した後、 前記血清を吸引除去し、 ゥエルを 250 1の前記洗浄液で 3回洗浄した。
さらに、 アルカリフォスファタ一ゼで標識されたャギ抗ヒト I gGモノクロ一 ナル抗体 （KPL (株)製） を希釈液 （トリス 0. 606 g、 MgC 12 · H2 〇 20. 3 rag, N aN3 0. 1 g、 B S A 5 g、 Twe e n 20 50 μ 1、 ャギ血清 0. 3ml及びダリセリン 1 Omlを含む全量 10 Omlの水溶液、 HC 1で pH8. 0に調整） で 1000倍に希釈した溶液 （二次抗体溶液） 10 Ομ ΐをゥエルに注ぎ、 37 °Cで 1時間静置した後、 この二次抗体溶液を吸引 除去し、 ゥエルを 250 μ 1の前記洗浄液で 3回洗浄した。
最後に、 発色試薬 （MgC l 2 ' 6H20 0. 1374 g及びジエタノ一ル ァミン 141. 9ml を含む全量 27 Omlの水溶液 1 ml を蒸留水で 5倍に希釈 し、 基質錠剤 （KPL (株)製、 p—二トロフエニルフォスフェート 1 Omg含有） 1錠を溶解して得られた溶液） 10 Ομ 1をゥエルに注ぎ、 室温で 10分間放 置して発色反応させた後、 3Ν NaOH 25 μ 1をゥエルに注いで発色反 応を停止させ、 マイクロプレートリーダ一 （（株）東ソ一製） で 4 0 5雇 の吸光 度を測定した。 得られた吸光度は 0 . 4 2 5であった。
これにより、 本発明で得られたトレポネ一マ ·パリダム菌由来の分子量約 4 7 Kダルトンの抗原タンパク質の改変タンパク質を抗原として用いた E L I S Aに より、 梅毒患者血清中の抗トレポネーマ ·パリダム抗体を測定できることが示さ れた。
〔実施例 2〕 トレポネーマ ·パリダム菌由来の分子量約 1 7 Kダルトンの抗原 タンパク質の改変タンパク質の製造、 ウェスタンブロット法による改変タンパク 質の抗原性の検討並びに E L I S Aによる抗トレポネーマ ·パリダム抗体の測定
( 1 ) トレポネーマ ·パリダム菌由来の分子量約 1 7 Kダルトンの抗原タンパク 質の改変タンパク質を発現する組換えべクタ一の作製
図 3に示される手順で組換えべクタ一を作製した。
前述したエイキンスらの文献には、 トレポネーマ ·パリダム菌由来の分子量約 1 7 Kダルトンの抗原タンパク質をコードする D N Aの塩基配列が記載される (配列番号 1 2で示される塩基配列)。
この分子量約 1 7 Kダルトンの抗原タンパク質は、 トレポネーマ ·パリダム菌 において次のような機構で細胞膜タンパクになると考えられる。 まず、 トレポネ —マ ·パリダム菌体内でシグナル配列を含む前駆体タンパク質 （配列番号 1 2で 示される塩基配列に併記される 1〜 1 5 6番目のアミノ酸配列）として合成され、 続いて、 菌体内に存在する脂肪酸がこの前駆体タンパク質における 2 2番目のシ スティン残基とチォエステル結合する。 そして.、 菌体内に存在するシグナルぺプ チダ一ゼによリこの前駆体タンパク質における 1〜2 1番目のアミノ酸配列がシ グナル配列として除去され、 さらに、 結合した脂肪酸が細胞膜の脂質 2重層中に 固定され、 これにより、 前駆体タンパク質における 2 2番目以降のアミノ酸配列 (成熟タンパク質） が細胞膜タンパク質として固定される。
この脂肪酸が抗原タンパク質の分泌発現の障害となると考えられることから、 脂肪酸の結合を防ぐ目的で、 成熟タンパク質のァミノ基末端のシスティン残基が ァラニン残基になるように、 アミノ基末端側のプライマ一 D NAを設計した。 こ のブライマ一 D N Aの塩基配列は配列番号 1 3で示される。 この配列番号 1 3で 示される塩基配列のうち、 4〜9番目の配列は制限酵素？ 8 Iの認識部位であ リ、 6〜1 4番目の配列は、 順にァラニン、 パリン、 セリンの各アミノ酸残基に 対応する塩基配列である。このプライマー DNAを DNA合成機で化学合成した。 これをプライマ一 1 7— 1とする。
一方、 遺伝子中の翻訳終了の遺伝暗号を含み、 かつ、 その直後に制限酵素 H i n dill の認識部位が出来るように、 カルボキシル基末端側のプライマ一 DNA を設計した。 このプライマ一 DNAの塩基配列は配列番号 1 4で示される。 この 配列番号 1 4で示される塩基配列のうち、 4〜9番目の配列は制限酵素 H i n d III の認識部位であり、 8〜 1 0番目の配列は翻訳終了の遺伝暗号である。 この プライマー DNAを DNA合成機で化学合成した。 これをプライマー 1 7— 2と する。
錡型 DN Aとして実施例 1 ( 1 ) で取得された染色体 DN Aを用い、 プライマ —DN Aとしてプライマ一 1 7— 1及びプライマー 1 7— 2を用い、 実施例 1 ( 1 ) と同様にして PCRの操作を行った。
得られた PC R反応液を制限酵素 H i n d I I Iと P s t Iで消化し、 H i n d I I I— P s t I断片 （405 b p) を得た （この断片を H— P断片という）。 プラスミド PNU 2 1 0 [山形秀夫ら、 蛋白質核酸酵素、 37巻、 258-268頁（1 992 年）] 1 0 μ gを錶型 DNAとし、 このプラスミドに存在するバチルス . ブ レビスの細胞壁タンパク質 （MWP) の遺伝子 [山形ら、 ジャーナル ·ォブ 'バ クテリオロジ一、 169巻、 1245- 1289頁（1987年） (Yamagata, H. , et al, J. Bac teriol., Vol. 169, p.1245-1289(1987))] のプロモータ一の一部、 MWPのシ グナル配列及びマルチクロ一ニンダサイトが増幅されるように、 配列番号 1 5で 示されるアミノ基末端側プライマー DNA及び配列番号 1 6で示されるカルボキ シル基末端側プライマ一 DNAを設計し、 これらのプライマ一 DNAを DNA合 成機で合成した。
次に、 錡型 DNAとして前記プラスミド p NU 2 1 0 1 / 1、 水 6 2 μ 1、 T a qポリメラ一ゼ緩衝液 1 0 1、 1. 2 5 mM dNTP (d AT P、 dCTP、 （10丁？及び(111丁？の等モル混合液） 1 6 1、 20 pm o 1 e/ 1 アミノ基末端側プライマ一 DNAの水溶液 5 μ 1、 2 0 pm o 1 / n 1 力ルポキシル基末端側プライマ一 D N Aの水溶液 5 ^ 1及び T a qポリメラ一ゼ 1 1 ( 5 u n i t ) を混合し、 9 6°0で0. 5分間の 加熱後、 94 °Cで 1分間の加熱、 54 °Cで 1分間の冷却及び 7 0 °Cで 1分間の 保温からなる工程を 1サイクルとしてこの工程を 2 5サイクル繰返す条件で PC Rの操作を行い、 得られた PC R反応液を制限酵素 Sm a Iと E c o R Iで消化 した。
一方、 プラスミド pUB l 1 0 ((株)宝酒造製） を制限酵素 E c o R Iと Pv u I Iで消化し、 この消化物と前記制限酵素 Sma Iと E c 0 R Iの消化物を混 合し、 T a k a r a DNAライゲ一シヨンキット（宝酒造 (株)製）に含まれる A 液 2 0 μ 1及び Β液 5 t 1を添加し、 1 6°Cで 3 0分間保温してライゲ一ショ ン反応を行ってプラスミド pNH 300を取得し、 さらに、 このプラスミド pN H 300を制限酵素 H i n d I I Iと P s t Iで消化した。
この消化物を、 前記 H_P断片と混合し、 前記キットを用いて同様にライゲ一 シヨン反応を行い、 大きさが約 4. 2 k b pのプラスミド pNH 300 TP 1 7 を構築した。
(2) プラスミド pNH30 O TP 1 7を含む形質転換体の作製
電気パルス法を用い、 構築したプラスミドをバチルス ·ブレビス HPD 3 1株 に導入し、 形質転換体 （プラスミド pNH 30 O TP 1 7を含むバチルス ·ブレ ビス H P D 3 1株） 得た。 この形質転換体は、 受託番号 F E RM BP- 564 1として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
(3) 改変タンパク質の製造
形質転換体として前記プラスミド PNH300 TP 1 7を含むバチルス ·ブレ ビス HPD 3 1株を用いた以外は実施例 1 (3) と同様の操作を行い、 トレポネ —マ ·パリダム菌由来の分子量約 1 7 Kダルトンの抗原タンパク質の改変タンパ ク質含有画分を取得した。
(4) 改変タンパク質含有画分の S D S—ポリアクリルァミドゲル電気泳動 培養上清として上記実施例 2 (3) で得られたものを使用した以外は実施例 1
(4) と同様の操作を行った。
(5) 改変タンパク質の確認 電気泳動終了後、 実施例 1 (5) と同様にして、 分子量マーカ一と試料泳動レ —ン 1本を含むゲルを切り出し、 クーマシ一ブリリアントブルー （CBB) で染 色操作を行った。
その結果、 図 4に示されるように、 分子量約 1 7 Kダルトンの位置に青色のバ ンドが認められ （レーン C)、 前記培養上清中に分子量約 17 Kダルトンのタン パク質が含まれていることが確認された。
(6) ウェスタンブロット法による改変タンパク質の抗原性の検討
実施例 1 (6) と同様にしてウェスタンプロットを行った。
その結果、 図 4に示されるように、 分子量約 17 Kダルトンの位置に褐色のバ ンドが認められ （レーン W)、 梅毒患者血清がトレポネーマ ·パリダム菌由来の 分子量約 17 Kダルトンの抗原タンパク質の改変タンパク質と反応することが確 認できた。 なお、 バンドの濃さから判断して、 改変タンパク質の生産量は約 1 g / (培養液 1リットル） であると考えられる。
一方、 梅毒患者血清の代わりに健常人血清を使用して同様な操作を行ったが、 バンドは認められず、 前記改変タンパク質が健常人血清とは反応しないことが確 認できた。
以上から、 本発明で得られたトレポネーマ■パリダム菌由来の分子量約 17 K ダルトンの抗原タンパク質の改変タンパク質が梅毒患者血清と特異的に反応する こと力示された。
(7) EL I S Aによる抗トレポネ一マ ·パリダム抗体の測定
培養上清として前記実施例 2 (3) で得られた培養上清を使用した以外は前記 実施例 1 (7) と同様の操作を行った。 ここで、 抗原液中に含まれるタンパク質 のモル数を実施例 1 (7) で使用された抗原液の場合と合わせるため、 50mM トリス—塩酸緩衝液 （pH 8. 6) と少量の SDSを用い、 タンパク質濃度が 0.
Figure imgf000036_0001
で308濃度が0. 02 %である抗原液を調製した。
そして、 実施例 1 (7) と同様にして発色反応後の反応液の 405nmの吸光 度を測定した。 得られた吸光度は 0. 828であった。
これにより、 本発明で得られたトレポネーマ ·パリダム菌由来の分子量約 17 Kダルトンの抗原タンパク質の改変タンパク質を抗原として用いた EL I SAに より、 梅毒患者血清中の抗トレポネーマ ·パリダム抗体を測定できることが示さ れた。
〔実施例 3〕 トレポネーマ ·パリダム菌由来の分子量約 47 Kダルトンの抗原タ ンパク質の改変タンパク質及び分子量約 1 Ί Kダルトンの抗原タンパク質の改変 タンパク質の混合物を用いた、 EL I SAによる抗トレポネーマ 'パリダム抗体 の測定
実施例 1 (3) で得られた培養上清をゆるやかに撹拌しながら、 25%となる ように硫酸アンモニゥムを添加し、 4°Cで一晩撹拌し、 さらに 37°Cで 1時間 撹拌し、 1 0， 000 X gで 30分間遠心分離して沈殿を取得した。 得られた 沈殿を、 25%硫酸アンモニゥムを含む 5 OmM トリスー塩酸緩衝液 （pH 8. 6) に懸濁して前記条件で遠心分離して沈殿を洗浄し、 この洗浄操作を 2回行つ た。 得られた沈殿を少量の緩衝液 （ 1 % S D Sを含む 50 mM トリス一塩酸緩 衝液 (PH8. 6)) に溶解してタンパク質溶解液を得た。
一方、 実施例 2 (3) で得られた培養上清を陽イオンカラムクロマトグラフィ —で分画し、 前記ウェスタンプロットを用いて分子量約 1 7Kダルトンの抗原タ ンパク質の改変タンパク質含有画分を取得した。
これらのタンパク質溶解液と改変タンパク質含有画分を混合し、 液中に含まれ るタンパク質のモル数を実施例 1 (7)で使用された抗原液の場合と合わせ、 1 % SDSを含む 50mM トリスー塩酸緩衝液 （pH 8. 6) を用いてタンパク質濃 度が 1. 25 g/ml で SDS濃度が 0. 02 %である抗原液を調製した。 そし て、 実施例 1 (7) と同様の操作を行い、 発 反応後の反応液の 405nm の吸 光度を測定した。 得られた吸光度は 0. 925であった。
〔実施例 4〕 トレポネーマ ·パリダム菌由来の分子量約 47 Kダルトンの抗原 タンパク質及び分子量約 1 7 Kダルトンの抗原タンパク質の融合された改変タン パク質の製造、 ウェスタンブロット法による融合された改変タンパク質の抗原性 の検討並びに EL I S Aによる抗トレポネーマ 'パリダム抗体の測定
( 1 ) トレポネーマ ·パリダム菌由来の分子量約 47 Kダルトンの抗原タンパク 質及び分子量約 1 Ί Kダルトンの抗原タンパク質の融合された改変タンパク質を 発現する組換えプラスミドの作製 図 5に示される手順で組換えプラスミドを作製した。
トレポネ一マ■パリダム菌として、 トレポネーマ ·パリダム ·ニコルス株 poneraa pallidum； Nichols strainバリー ' ラボラトリース (Lee Laboratories) 社 (米国）から購入、 商品コード： SPRO J—TPURE)を使用した。
前述したェム · ブイ · ノルガードらの文献に記載された方法に従い、 次のよう にしてトレポネ一マ ·パリダム菌のゲノム DNAを取得した。
トレポネーマ ·パリダム菌の菌体 5 X 107個を、 1M 塩化ナトリウム、 1 N 水酸化ナトリウム及び 2% SDSを含有する水溶液に懸濁し、 1分間煮沸 した。 次に、 この水溶液の 4倍量の 0. 5M トリス （pH7. 0) を添加して中 和した。 さらに、 フエノールを添加して水層を取得し、 この水層にエタノールを 添加し、 遠心分離して沈殿を取得し、 この沈殿を乾燥させた。 最後にこの沈殿を 滅菌水に溶解し、 トレポネ一マ ·パリダム菌のゲノム DNA溶液とした。 このゲ ノム DN A溶液は、 後述する P C R法において錡型 D N Aとして使用される。 前述したウェイゲルらの文献には、 トレポネーマ ·パリダム菌由来の分子量約 47 Kダルトンの天然の抗原タンパク質をコードする DN Aの塩基配列が記載さ れる （配列番号 9で示される塩基配列)。
この分子量約 47 Kダルトンの天然の抗原タンパク質は、 トレポネーマ ·パリ ダム菌において次のような機構で細胞膜タンパクになると考えられる。 まず、 ト レポネーマ ·パリダム菌体内でシグナル配列を含む前駆体タンパク質 （配列番号 9で示される塩基配列に併記される :！〜 434番目のアミノ酸配列） として合成 され、 続いて、 菌体内に存在する脂肪酸がこの前駆体タンパク質における 20番 目のシスティン残基とチォエステル結合する。 そして、 菌体内に存在するシグナ ルぺプチダ一ゼによりこの前駆体タンパク質における 1〜 19番目のアミノ酸配 列がシグナル配列として除去され、 さらに、 結合した脂肪酸が細胞膜の脂質 2重 層中に固定され、 これにより、 前駆体タンパク質における 20番目以降のァミノ 酸配列 （成熟タンパク質） が細胞膜タンパク質として固定される。
この脂肪酸が抗原タンパク質の分泌発現の障害となると考えられることから、 脂肪酸の結合を防ぐ目的で、 成熟タンパク質のアミノ基末端のシスティン残基が ァラニン残基になるように、 アミノ基末端側のプライマ一 DNAを設計した。 こ のプライマー D N Aの塩基配列は配列番号 1 7で示される。 この配列番号 1 Ίで 示される塩基配列のうち、 4〜 9番目の配列は制限酵素 P s t Iの認識部位であ る。 このプライマ一 DNAを DNA合成機で化学合成した。 これをプライマ一 4 7 - 1 7 - 1とする。
一方、 配列番号 1 8で示される塩基配列をカルボキシル基末端側のプライマ一 DNAとして設計した。 この配列番号 1 8で示される塩基配列のうち、 4〜9番 目の配列は制限酵素 B g 1 II の認識部位である。 このプライマ一 DNAを DN A合成機で化学合成した。 これをプライマ一 47— 1 7— 2とする。
そして、 錡型 DN Aとして前記実施例 1 ( 1 ) で取得されたトレポネーマ 'パ リダム菌の染色体 DNAを用い、 水 6 2 1、 錡型 DNA \ β \ , T a q ポリメラ一ゼ緩衝液 1 0 μ 1、 1. 2 5 mM dNTP (dATP、 d CT P、 d GT P及び d TT Pの等モル混合液） 1 6 μ 1、 20 p m ο 1 e/β 1 プライマ一 47— 1 7— 1の水溶液 5 μ 1、 2 0 pmo 1 e/ 1 プ ライマ一 47— 1 7— 2の水溶液 5 μ 1及び T a qポリメラ一ゼ Ι μ ΐ (5 u n i t ) を混合し、 96 °Cで 0. 5分間の加熱後、 94 °Cで 1分間の加熱、 54°Cで 1分間の冷却及び 7 0°Cで 1分間の保温からなる工程を 1サイクルと してこの工程を 25サイクル繰返す条件で PC Rの操作を行った。 得られた反応 液の一部を制限酵素 P s t I及び Kp n Iで消化し、 残りを制限酵素 Kp η Iと B g 1 II でそれぞれ消化し、 P s t l —Kp n l断片 （6 54 b p) と Kp n I —B g 1 II断片 (593 b p) を得た。
一方、 前述したエイキンスらの文献には、 トレポネーマ 'パリダム菌由来の分 子量約 1 7 Kダルトンの天然の抗原タンパク質をコードする DN Aの塩基配列が 記載される （配列番号 1 2で示される塩基配列)。
そこで、 配列番号 1 9で示される塩基配列をァミノ基末端側のプライマ一 DN Aとして設計した。 この配列番号 1 9で示される塩基配列のうち、 4〜9番目の 配列は制限酵素 B g I II の認識部位である。 このプライマ一 DNAを DNA合 成機で化学合成した。 これをプライマ一47— 1 7— 3とする。
また、 配列番号 20で示される塩基配列をカルボキシル基末端側のプライマ一 DNAとして設計した。 この配列番号 20で示される塩基配列のうち、 4〜9番 目の配列は制限酵素 Xh o Iの認識部位である。 このプライマ一 DNAを DNA 合成機で化学合成した。 これをプライマ一 47— 1 7— 4とする。
そして、 前記铸型 DNA、 プライマ一 47— 1 7— 3及びプライマ一 47— 1 7 — 4を用い、 前述した方法と同様にして P C Rの操作を行った。
得られた PCR反応液を制限酵素 B g 1 II と Xh o Iで消化し、 B g l ll— Xh o I断片 （40 5 b p) を得た。
プラスミド pNH400 [ジャーナル 'ォブ.パクテリォロジ一、 177巻、 74 5-749 頁（1995年）（J. Bacteriol., Vol.177， p.745- 749(1995))に記載] を制限 酵素 P s t I及び Xh o Iで消化し、 この消化物と、 前記 P s t I -Kp η I断 片 （6 54 b p；)、 Kp n l—B g i n 断片 （59 3 b p) 及び B g 1 II-Xh o I断片 （40 5 b p) を混合し、 さらに、 T a k a r a DNAライゲ一ショ ンキット（宝酒造 (株)製）に含まれる A液 2 0 1及び Β液 5 μ 1を添加し、 1 6°Cで 30分間保温してライゲ一シヨン反応を行い、 大きさが約 5. 8 k b p のプラスミド pNH400TP47— 1 7を構築した。
(2) プラスミド pNH400 TP47— 1 7を含む形質転換体の作製 電気パルス法を用い、 構築したプラスミドをバチルス 'ブレビス HPD 3 1株 に導入し、 形質転換体 （プラスミド pNH400 TP47— 1 7を保持するバチ ルス . ブレビス HPD 3 1株） を得た。 この形質転換体は、 受託番号 FERM BP— 57 6 3として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
(3) 改変タンパク質の製造
1 2 1°C、 5分間ォ一トクレーブ滅菌した TMN寒天平板培地 （ペプトン 1 %、 肉エキス 0. 5%、 酵母エキス 0. 2%、 グルコース 1 %、 Mg S 〇4 0. 0 1 %、 F e SO4 0. 0 1 %、 Mn S〇4 0. 00 1 %、 Z n S 〇4 0. 000 1 %、 寒天 1. 5%、 ネオマイシン S O g/ml を含む、 pH 7. 0の培地）に、プラスミド pNH400TP47— 1 7を保持するバチルス - ブレビス HPD 3 1株を塗抹し、 30°C、 4 8時間培養し、 コロニーを形成さ せた。 生じたコロニーを、 TMN液体培地 （前記 TMN寒天平板培地から寒天を 除いた培地） 1 00ml を入れた 500ml 容三角フラスコに接種し、 30°C、 2 日間振盪培養し、 培養液を遠心分離し、 上清を取得し、 トレポネ一マ ·パリダム 菌由来の分子量約 47 Kダルトンの抗原タンパク質及び分子量約 17 Kダルトン の抗原タンパク質の融合された改変タンパク質含有画分とした。
(4) 改変タンパク質含有画分の S D S—ポリアクリルァミドゲル電気泳動 培養上清として上記実施例 4 (3) で得られたものを使用した以外は実施例 1
(4) と同様の操作を行った。
前記 （3) で得られた培養上清とサンプル処理液 （0. 0625M トリス塩 酸 （pH6. 8)、 2% SDS、 10% グリセロール、 5% 2—メルカプト エタノ一ル及び 0. 001 % ブロモフエノールブルーの混合液） を等容量でよ く混合し、 100°Cで 5分間加熱処理し、 これを検体とした。
ァクリルァミド濃度 10 %から 20 %のポリアクリルァミドダラジェントゲル
(第一化学薬品社製、 商品名：マルチゲル 10ノ20) を用い、 検体 10 μ 1 をゲルに添加し、 泳動緩衝液 （ 250 mM グリシン及び 0. 1 % S D Sを含 む 25mM トリス緩衝液、 H8. 3) を用い、 電流 40 mAで S D S—ポリア クリルアミドゲル電気泳動を行った。 なお、 試料泳動レーンは 2本使用し、 また、 分子量マーカ一も同時に泳動させた。
(5) 改変タンパク質の確認
電気泳動終了後、分子量マ一カーと試料泳動レーン 1本を含むゲルを切り出し、 クーマシーブリリアントブルー （CBB) で染色操作を行った。
その結果、 図 6に示されるように、 分子量約 64 Kダルトンの位置に青色のバ ンドが認められ （レーン C)、 前記培養上清中に分子量約 64 Kダルトンのタン パク質が含まれていることが確認された。
(6) ウェスタンブロット法による改変タンパク質の抗原性の検討
実施例 1 (6) と同様にしてウェスタンプロットを行った。
その結果、 図 6に示されるように、 分子量約 64 Kダルトンの位置に褐色のバ ンドが認められ （レ一ン W)、 梅毒患者血清がトレポネーマ ·パリダム菌由来の 分子量約 47 Kダルトンの抗原タンパク質及び分子量約 17Kダルトンの抗原タ ンパク質の融合された改変タンパク質と反応することが確認できた。 なお、 バン ドの濃さから判断して、 融合タンパク質の生産量は約 0. 2 gZ (培養液 1リツ トル） であると考えられる。 一方、 梅毒患者血清の代わリに健常人血清を使用して同様な操作を行ったが、 バンドは認められず、 前記融合タンパク質が健常人血清とは反応しないことが確 認できた。
以上から、 本発明で得られたトレポネ一マ ·パリダム菌由来の分子量約 47 K ダルトンの抗原タンパク質及び分子量約 17 Kダルトンの抗原タンパク質の融合 された改変タンパク質力梅毒患者血清と特異的に反応することが示された。
(7) EL I S Aによる抗トレポネーマ .パリダム抗体の測定
前記実施例 4 (3) で得られた培養上清をゆるやかに撹拌しながら、 10%と なるように硫酸アンモニゥムを添加し、 4°Cで一晩撹拌し、 さらに 37°Cで 1 時間撹拌し、 10， O O OX gで 30分間遠心分離して上清を取得した。 得ら れた上清に、 さらに 25%となるように硫酸アンモニゥムを添加し、 4°Cで一 晚撹拌し、 37°Cで 1時間撹拌し、 10， 000 X gで 30分間遠心分離して 沈殿を取得した。 得られた沈殿を、 25%硫酸アンモニゥムを含む 5 OmM ト リス一塩酸緩衝液（PH8. 6)に懸濁して前記条件で遠心分離して沈殿を洗浄し、 この洗浄操作を 2回行った。 得られた沈殿を少量の緩衝液 （ 1 % S D Sを含む 5 OmM トリス—塩酸緩衝液 (pH8. 6)) に溶解してタンパク質溶解液を得た。 このタンパク質溶解液を 5 OmM トリス—塩酸緩衝液（pH 8. 6)で希釈し、 タンパク質濃度が 1. 25^g/ml で SDS濃度が 0. 02%である抗原液を調 製した。
そして、 実施例 1 (7) と同様にして発色反応後の反応液の 405nmの吸光 度を測定した。 得られた吸光度は 2. 107であった。
これにより、 本発明で得られたトレポネ一マ ·パリダム菌由来の分子量約 47 Kダルトンの抗原タンパク質及び分子量約 17 Kダルトンの抗原タンパク質の融 合された改変タンパク質を抗原として用いた EL I SAにより、 梅毒患者血清中 の抗トレポネーマ ·パリダム抗体を測定できることが示された。
実施例 3及び実施例 4の結果から明らかなように、 抗原として分子量約 47K ダルトンの抗原タンパク質の改変タンパク質及び分子量約 17 Kダルトンの抗原 タンパク質の改変タンパク質の混合物を用いた場合の EL I S Aの測定値が 0. 925であったのに対し、 抗原として分子量約 47 Kダルトンの抗原タンパク質 及び分子量約 1 7 Kダルトンの抗原タンパク質の融合された改変タンパク質を用 いた場合の E L I S Aの測定値は 2. 1 07であり、 著しく高かった。
このことから、実施例 4で得られた本発明の改変タンパク質は、トレポネ一マ - パリダム菌由来のそれぞれの抗原タンパク質及びそれらの混合物と比べ、 極めて 高レ、抗原性を有すること力示された。
〔実施例 5〕 改変タンパク質を抗原として用いる抗トレポネーマ ·パリダム抗体 の製造
抗トレポネーマ ·パリダム抗体は、本発明の改変タンパク質を抗原として用い、 例えば、 次のようにして製造される。
(A) 骨髄腫細胞株の培養及び継代
骨髄腫細胞株は P 3 X63 Ag 8. 653 (ATCC CRL— 1 580) を 1 0% (v/v) 牛胎児血清を含む RPM I 1 640培地で培養し、 37°C、 5% (v/v) C02存在下で継代する。 細胞融合に供する 2週間前に、 0. 1 3mMの 8—ァザグァニン、 0. 5 ig/ml の MC— 21 0 (マイコプラズマ除 去剤、 大日本製薬 (株)製） 及び 1 0% (v/v) 牛胎児血清を含む RPMI 1 6 40培地で 1週間培養し、 その後の 1週間は通常の培地で培養する。
(B) マウスの免疫
タンパク質の濃度が 270 Mg/ml の本発明の改変タンパク質の懸濁液 200 μ 1を、 1 2000 rpmで 10分間遠心分離し、 沈殿に 200μ 1の PB Sをカロ え、 再懸濁する。 これに 200 μ 1のフロイントコンプリートアジュバントを 加え、 ェマルジヨンとし、 その 1 50 1をマウスの背中の皮下に注射する （こ の曰を 0日目とする）。 14曰目、 34日目及び 49曰目に、 タンパク質の濃度 が 270 Mg/ral の上記改変タンパク質の懸濁液 1 00^ 1をマウスの腹腔内に 注射し、 更に、 69日目にタンパク質の濃度が 800 g/ml の上記改変タンパ ク質の懸濁液 50 μ し 92日目に同懸濁液 1 00μ 1 をマウスの腹腔内に注 射し、 95日目に脾臓を取り出し、 細胞融合に供する。
(C) 細胞融合
上記脾臓から得られる脾細胞 1 08個に対して骨髄腫細胞 1 07個を丸底ガラ スチューブにとり、 よく混合し、 140 Orpmで 5分間遠心分離し、 上清を除去 し、 細胞を更によく混合する。 予め 37 °Cに保温してある 30% (w/v) ポ リエチレングリコ一ルを含む RPM I 1640培地 0. 4ml を加え、 30秒間 放置する。 70 Orpmで 6分間遠心分離した後、 RPM I 1640培地 10mlを 加え、 ポリエチレングリコールがよく混ざるようにガラスチューブをゆつくリ回 転させ、 140 Orpmで 5分間遠心分離し、 上清を完全に除去し、 沈殿に 5mlの HAT培地を加え、 5分間放置する。 更に 10〜20ml の HAT培地を加え、
30分間放置し、 骨髄腫細胞濃度が 3. 3 X 1 O ml となるように HAT培地 を加えて細胞を懸濁させ、 パスツールピペットを用い 96ゥエルプラスチック製 培養容器のゥエルに 2滴ずつ分注する。 5% (vZv)炭酸ガス雰囲気下、 36°C で培養し、 1日後、 つ日後及び 14日後にゥエルに HAT培地を 1〜 2滴加える。
(D) 抗体生産細胞のスクリーニング
上記改変タンパク質をタンパク質濃度が 1〜 10 g/ml となるように 0. 0 2% (w/v) ァジィ匕ソ一ダ含有 0. 05 M重炭酸ソ一ダ緩衝液 (pH9. 6 ) に 懸濁し、 0. 02%NaN3含有 0. 05 M重炭酸ソーダ緩衝液 （pH 9. 6) に 対して透析し、 その後、 タンパク質濃度が 1〜1 Ο/zg/ml となるように希釈し た液を、 塩化ビニル製 96ゥエル E I A用プレートのゥエルに 50 μ 1とり、
4 °Cで一晩放置し、 抗原を吸着させる。 上澄みを除去し、 ゥエルに 0. 02% (wZv) ツイ一ン 20を含む P B S 1 50 μ 1を加え、 3分間放置し、 その 後除去 '洗浄する。 洗浄操作を更に 1回行なった後、 ゥエルに 1% (ν/ν) 牛 血清アルブミンを含む PB S 100 Μ 1を加え、 4 °Cでー晚以上放置し、 プロ ッキングを行なう。 牛血清アルブミンを含む PB Sを除いた後、 0. 02% (w /v) ツイーン 20を含む PBSで同様に 2回洗浄後、 ゥエルに融合細胞の培養 上清を 50 x l加え、 室温で 2時間放置する。 0. 02% (w/v) ツイーン 20を含む P B Sで同様に 3回洗浄後、 ゥエルに 25ng/ml のペルォキシダ一ゼ 標識化ャギ抗マウス I gG抗体を 50 μ 1加え、 室温で 2時間放置する。 0. 02% (w/v) ツイ一ン 20を含む PB Sで同様に 3回洗浄後、 ゥエルに A B TS溶液 （KPL社製） を 50μ 1加え、 室温で 1 5分〜 1時間放置して発色 反応させ、 96ゥエル E I Αプレート用光度計で 405nmの吸光度を測定する。 そして陽性のゥエル中の細胞をそれぞれパスツールピぺッ卜で回収し、 24ゥェ ルプラスチック製培養容器に移し、 H A T培地 l〜2 ml を加え、 同様に培養す る。
( E ) 限界希釈法によるクロ一ニング
2 4ゥエルプラスチック製培養容器で増殖させた 2株の融合細胞の細胞濃度を 測定し、 細胞数が 2 0個/ ml となるようそれぞれを H T培地で希釈する。 別に H T培地に懸濁した 4〜 6週齢のマウス胸腺細胞を 9 6ゥエルプラスチック製培養 容器に 1〜2 X 1 0 5個 ゥエルとリ、 これに上記の融合細胞 （細胞濃度が 2 0 個/ ml ) を 5 0 μ ΐ /ゥヱルずつ加え、 5 % ( ν Ζ ν ) 炭酸ガス雰囲気下、 3 6 °C で培養し、 その 1日後、 7日後及び 1 4日後に H T培地を 1〜2滴 ウエルカロえ る。 細胞の増殖が見られたゥエルの培養上清を 5 0 μ 1回収し、 上記 （D ) の
「抗体生産細胞のスクリ一ニング」 と同様の方法で抗体の生産を確認する。 ゥエル中に単一の細胞コロニーしか存在せず、 本発明の改変タンパク質と反応す る抗体を生産するもので、 かつ増殖が早い細胞をゥエルから回収し、 引き続き 2 4ゥエルプラスチック製培養容器で増殖させる。 更に、 同様のクローニング操作 を繰り返し、 抗トレポネーマ ·パリダム抗体を産生するハイプリドーマを取得す る。 これを培養し、 その培養上清から抗トレポネーマ ·パリダム抗体を製造する。 発明の効果
本発明の改変タンパク質は、 微生物からの分泌が可能で、 タンパク変性が少な く、 生産効率に優れる。
本発明の別の改変タンパク質は、 上記本発明の改変タンパク質の効果を奏し、 さらに、 分泌効率に優れる。
本発明のさらに別の改変タンパク質は、 上記本発明の改変タンパク質の効果を 奏し、 さらに、 トレポネ一マ ·パリダム抗原としての抗原性を有する。
本発明のさらに別の改変タンパク質は、 上記本発明の改変タンパク質の効果を 奏し、 さらに、 トレポネ一マ ·パリダム特異的抗原としての抗原性を有する。 本発明のさらに別の改変タンパク質は、 上記本発明の改変タンパク質の効果を 奏し、 さらに、 トレポネーマ ·パリダム特異的抗原として優れた抗原性を有する。 本発明のさらに別の改変タンパク質は、 上記本発明の改変タンパク質の効果を 奏し、 さらに、 各種微生物の抗原としての優れた抗原性を有する。
本発明のさらに別の改変タンパク質は、 上記本発明の改変タンパク質の効果を 奏し、 さらに、 トレポネーマ ·パリダム特異的抗原としての優れた抗原性を有す る。
本発明のさらに別の改変タンパク質は、 上記本発明の改変タンパク質の効果を 奏し、 さらに、 トレポネ一マ ·パリダム特異的抗原として極めて優れた抗原性を 有する。
本発明の D N Aは、 微生物からの分泌が可能な改変タンパク質の製造に有用で ある。
本発明の別の D NAは、 上記本発明の D N Aの効果を奏し、 さらに、 トレポネ —マ ·パリダム特異的抗原として優れた抗原性を有する改変タンパク質の製造に 有用である。
本発明の組換えべクタ一は、 微生物からの分泌が可能な改変タンパク質の製造 に有用である。
本発明の形質転換体は、 微生物からの分泌が可能な改変タンパク質の製造に有 用である。
本発明の別の形質転換体は、 上記本発明の形質転換体の効果を奏し、 さらに、 トレポネーマ ·パリダム特異的抗原として優れた抗原性を有する改変タンパク質 の製造に有用である。
本発明の改変タンパク質の製造法は、 微生物からの分泌が可能な改変タンパク 質の製造に有用である。
本発明の別の改変タンパク質の製造法は、 上記本発明の改変タンパク質の製造 法の効果を奏し、 さらに、 抗原性に優れる改変タンパク質の簡便な製造に有用で ある。
本発明の抗トレポネーマ ·パリダム抗体の測定法は、 梅毒感染の診断に有用で ある。
本発明の抗トレポネーマ ·パリダム抗体の測定用試薬は、 梅毒感染の診断に有 用である。
本発明の梅毒感染診断薬は、 梅毒感染の診断に有用である。 本発明の抗トレポネーマ ·パリダム抗体の製造法は、 梅毒感染の診断に有用 である。
配列表
配列番号： 1
配列の長さ ： 415
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
Ala Gly Ser Ser His His Glu Thr His Tyr Gly Tyr Ala Thr Leu Ser
1 5 10 15
Tyr Ala Asp Tyr Trp Ala Gly Glu Leu Gly Gin Ser Arg Asp Val Leu
20 25 30
Leu Ala Gly Asn Ala Glu Ala Asp Arg Ala Gly Asp Leu Asp Ala Gly
35 40 45
Met Phe Asp Ala Val Ser Arg Ala Thr His Gly His Gly Ala Phe Arg
50 55 60
Gin Gin Phe Gin Tyr Ala Val Glu Val Leu Gly Glu Lys Val Leu Ser 65 70 75 80
Lys Gin Glu Thr Glu Asp Ser Arg Gly Arg Lys Lys Trp Glu Tyr Glu
85 90 95
Thr Asp Pro Ser Val Thr Lys Met Val Arg Ala Ser Ala Ser Phe Gin
100 105 110
Asp Leu Gly Glu Asp Gly Glu l ie Lys Phe Glu Ala Val Glu Gly Ala
115 120 125
Val Ala Leu Ala Asp Arg Ala Ser Ser Phe Met Val Asp Ser Glu Glu
130 135 140
Tyr Lys l ie Thr Asn Val Lys Val His Gly Met Lys Phe Val Pro Val 145 150 155 160
Ala Val Pro His Glu Leu Lys Gly l ie Ala Lys Glu Lys Phe His Phe
165 170 175 if
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SSI： $„ 厘 z： ^ u \V 01 SO DJ 9L09£/86 OAV 配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
Ala Ser Phe Ser Ser l ie Pro Asn Gly Thr Tyr Arg Ala Thr Tyr Gin
1 5 10 15
Asp Phe Asp Glu Asn Gly Trp Lys Asp Phe Leu Glu Val Thr Phe Asp
20 25 30
Gly Gly Lys Met Val Gin Val Val Tyr Asp Tyr Gin His Lys Glu Gly
35 40 45
Arg Phe Lys Ser Gin Asp Ala Asp Tyr His Arg Val Met Tyr Ala Ser
50 55 60
Ser Gly He Gly Pro Glu Lys Ala Phe Arg Glu Leu Ala Asp Ala Leu 65 70 75 80
Leu Glu Lys Gly Asn Pro Glu Met Val Asp Val Val Thr Gly Ala Thr
85 90 95
Val Ser Ser Gin Ser Phe Arg Arg Leu Gly Arg Ala Leu Leu Gin Ser
100 105 110
Ala Arg Arg Gly Glu Lys Glu Ala l ie I le Ser Arg
115 120 124 配列番号： 4
配列の長さ ： 551
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
Ala Gly Ser Ser His His Glu Thr His Tyr Gly Tyr Ala Thr Leu Ser 1 5 10 15 09 usy aiy usy Ι¾Λ dsy sn 9i¾ Say SIH n\ OfZ 2Z 0 Z ZZ 13 dsy BIV S^V sAq ng JEA ¾IV ¾IV dsy J9S ^10 Qqj
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Thr Val Arg Tyr Asp Tyr Tyr Gly Asp Asp Ala Ser Tyr Thr Asn Leu
260 265 270
Met Ala Ser Tyr Gly Thr Lys His Ser Ala Asp Ser Trp Trp Lys Thr
275 280 285
Gly Arg Val Pro Arg l ie Ser Cys Gly l ie Asn Tyr Gly Phe Asp Arg
290 295 300
Phe Lys Gly Ser Gly Pro Gly Tyr Tyr Arg Leu Thr Leu He Ala Asn 305 310 315 320
Gly Tyr Arg Asp Val Val Ala Asp Val Arg Phe Leu Pro Lys Tyr Glu
325 330 335
Gly Asn l ie Asp l ie Gly Leu Lys Gly Lys Val Leu Thr l ie Gly Gly
340 345 350
Ala Asp Ala Glu Thr Leu Met Asp Ala Ala Val Asp Val Phe Ala Asp
355 360 365
Gly Gin Pro Lys Leu Val Ser Asp Gin Ala Val Ser Leu Gly Gin Asn
370 375 380
Val Leu Ser Ala Asp Phe Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Glu Val 385 390 395 400
Arg Phe Lys Glu Phe Gly Ser Val Arg Ala Lys Val Val Ala Gin l ie
405 410 415
Cys Val Ser Cys Thr Thr Val Cys Pro His Ala Gly Lys Ala Lys Ala
420 425 430
Glu Lys Val Glu Cys Ala Leu Lys Gly Gly l ie Phe Arg Gly Thr Leu
435 440 445
Pro Ala Ala Asp Cys Pro Gly l ie Asp Thr Thr Val Ser Ser Thr Arg
450 455 460
Met Ala Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Leu Ala Leu Glu Lys Lys Ser Ala 465 470 475 480 Pro Ser Pro Leu Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Met Val Arg Glu Asp Gly
485 490 495
l ie Val Glu Leu Ser Leu Val Ser Ser Glu Gin Ser Lys Ala Pro Hi s
500 505 510
Glu Lys Glu Leu Tyr Glu Leu l ie Asp Ser Asn Ser Val Arg Tyr Met
515 520 525
Gly Al a Pro Gly Ala Gly Lys Pro Ser Lys Glu Met Ala Pro Phe Tyr
530 535 540
Val Leu Lys Lys Thr Lys Lys
545 550 551 配列番号： 5
配列の長さ ： 1286
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D NA
配列
CTGCAGGCTC GTCTCATCAT GAGACGCACT ATGGCTATGC GACGCTAAGC TATGCGGACT 60 ACTGGGCCGG GGAGTTGGGG CAGAGTAGGG ACGTGCTTTT GGCGGGTAAT GCCGAGGCGG 120 ACCGCGCGGG GGATCTCGAC GCAGGCATGT TCGATGCAGT TTCTCGCGCA ACCCACGGGC 180 ATGGCGCGTT CCGTCAGCAA TTTCAGTACG CGGTTGAGGT ATTGGGCGAA AAGGTTCTCT 240 CGAAGCAGGA GACCGAAGAC AGCAGGGGAA GAAAAAAGTG GGAGTACGAG ACTGACCCAA 300 GCGTTACTAA GATGGTGCGT GCCTCTGCGT CATTTCAGGA TTTGGGAGAG GACGGGGAGA 360 TTAAGTTTGA AGCAGTCGAG GGTGCAGTAG CGTTGGCGGA TCGCGCGAGT TCCTTCATGG 420 TTGACAGCGA GGAATACAAG ATTACGAACG TAAAGGTTCA CGGTATGAAG TTTGTCCCAG 480 TTGCGGTTCC TCATGAATTA AAAGGGATTG CAAAGGAGAA GTTTCACTTC GTGGAAGACT 540 CCCGCGTTAC GGAGAATACC AACGGCCTTA AGACAATGCT CACTGAGGAT AGTTTTTCTG 600 CACGTAAGGT AAGCAGCATG GAGAGCCCGC ACGACCTTGT GGTAGACACG GTGGGTACCG 660 TCTACCACAG CCGTTTTGGT TCGGACGCAG AGGCTTCTGT GATGCTGAAA AGGGCTGATG 720
GCTCTGAGCT GTCGCACCGT GAGTTCATCG ACTATGTGAT GAACTTCAAC ACGGTCCGCT 780
ACGACTACTA CGGTGATGAC GCGAGCTACA CCAATCTGAT GGCGAGTTAT GGCACCAAGC 840
ACTCTGCTGA CTCCTGGTGG AAGACAGGAA GAGTGCCCCG CATTTCGTGT GGTATCAACT 900
ATGGGTTCGA TCGGTTTAAA GGTTCAGGGC CGGGATACTA CAGGCTGACT TTGATTGCGA 960
ACGGGTATAG GGACGTAGTT GCTGATGTGC GCTTCCTTCC CAAGTACGAG GGGAACATCG 1020
ATATTGGGTT GAAGGGGAAG GTGCTGACCA TAGGGGGCGC GGACGCGGAG ACTCTGATGG 1080
ATGCTGCAGT TGACGTGTTT GCCGATGGAC AGCCTAAGCT TGTCAGCGAT CAAGCGGTGA 1140
GCTTGGGGCA GAATGTCCTC TCTGCGGATT TCACTCCCGG CACTGAGTAC ACGGTTGAGG 1200
TTAGGTTCAA GGAATTCGGT TCTGTGCGTG CGAAGGTAGT GGCCCAGTAG AAGAGGGGTG 1260
TCCTATCCCG TGTGTCTTAA GGATCC 1286 配列番号： 6
配列の長さ ： 416
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
CTGCAGTCTC GTGCACAACC GTGTGTCCGC ACGCCGGGAA GGCCAAAGCG GAAAAGGTAG 60 AGTGCGCGTT GAAGGGAGGT ATCTTTCGGG GTACGCTACC TGCGGCCGAT TGCCCGGGAA 120 TCGATACGAC TGTGACGTTC AACGCGGATG GCACTGCGCA AAAGGTAGAG CTTGCCCTTG 180
AGAAGAAGTC GGCACCTTCT CCTCTTACCT ATCGCGGTAC GTGGATGGTA CGTGAAGACG 240
GAATTGTCGA ACTCTCGCTT GTGTCCTCGG AGCAATCGAA GGCACCGCAC GAGAAAGAGC 300
TGTACGAGCT GATAGACAGT AACTCCGTTC GCTACATGGG CGCTCCCGGC GCAGGAAAGC 360
CTTCAAAGGA GATGGCGCCG TTTTACGTGC TCAAAAAAAC AAAGAAATAG AAGCTT 416 配列番号： 7
配列の長さ： 372
Figure imgf000056_0001
CACGTAAGGT AAGCAGCATG GAGAGCCCGC ACGACCTTGT GGTAGACACG GTGGGTACCG 660
TCTACCACAG CCGTTTTGGT TCGGACGCAG AGGCTTCTGT GATGCTGAAA AGGGCTGATG 720
GCTCTGAGCT GTCGCACCGT GAGTTCATCG ACTATGTGAT GAACTTCAAC ACGGTCCGCT 780
ACGACTACTA CGGTGATGAC GCGAGCTACA CCAATCTGAT GGCGAGTTAT GGCACCAAGC 840
ACTCTGCTGA CTCCTGGTGG AAGACAGGAA GAGTGCCCCG CATTTCGTGT GGTATCAACT 900
ATGGGTTCGA TCGGTTTAAA GGTTCAGGGC CGGGATACTA CAGGCTGACT TTGATTGCGA 960
ACGGGTATAG GGACGTAGTT GCTGATGTGC GCTTCCTTCC CAAGTACGAG GGGAACATCG 1020
ATATTGGGTT GAAGGGGAAG GTGCTGACCA TAGGGGGCGC GGACGCGGAG ACTCTGATGG 1080
ATGCTGCAGT TGACGTGTTT GCCGATGGAC AGCCTAAGCT TGTCAGCGAT CAAGCGGTGA 1140
GCTTGGGGCA GAATGTCCTC TCTGCGGATT TCACTCCCGG CACTGAGTAC ACGGTTGAGG 1200
TTAGGTTCAA GGAATTCGGT TCTGTGCGTG CGAAGGTAGT GGCCCAGATC TGTGTCTCGT 1260
GCACAACCGT GTGTCCGCAC GCCGGGAAGG CCAAAGCGGA AAAGGTAGAG TGCGCGTTGA 1320
AGGGAGGTAT CTTTCGGGGT ACGCTACCTG CGGCCGATTG CCCGGGAATC GATACGACTG 1380
TGAGTTCAAC GCGGATGGCA CTGCGCAAAA GGTACGAGCT TGCCCTTGAG AAGAAGTCGG 1440
CACCTTCTCC TCTTACCTAT CGCGGTACGT GGATGGTACG TGAAGACGGA ATTGTCGAAC 1500
TCTCGCTTGT GTCCTCGGAG CAATCGAAGG CACCGCACGA GAAAGAGCTG TACGAGCTGA 1560
TAGACAGTAA CTCCGTTCGC TACATGGGCG CTCCCGGCGC AGGAAAGCCT TCAAAGGAGA 1620
TGGCGCCGTT TTACGTGCTC AAAAAAACAA AGAAATAGCT CGAG 1664 配列番号： 9
配列の長さ ： 1332
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic D NA
配列
GTG AAA GTG AAA TAC GCA CTA CTT TCT GCC GGA GCG CTG CAG TTG TTG 48 Val Lys Val Lys Tyr Ala Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu Gin Leu Leu
1 5 10 15 93
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S0900/86df/XDd 9/,09£/86 OA Phe Asp Arg Phe Lys Gly Ser Gly Pro Gly Tyr Tyr Arg Leu Thr Leu
325 330 335
ATT GCG AAC GGG TAT AGG GAC GTA GTT GCT GAT GTG CGC TTC CTT CCC 1056 He Al a Asn Gly Tyr Arg Asp Val Val Al a Asp Val Arg Phe Leu Pro
340 345 350
AAG TAC GAG GGG AAC ATC GAT ATT GGG TTG AAG GGG AAG GTG CTG ACC 1104 Lys Tyr Glu Gly Asn l ie Asp l i e Gly Leu Lys Gly Lys Val Leu Thr
355 360 365
ATA GGG GGC GCG GAC GCG GAG ACT CTG ATG GAT GCT GCA GTT GAC GTG 1 152 l i e Gly Gly Al a Asp Al a Glu Thr Leu Met Asp Al a Al a Val Asp Val
370 375 380
TTT GCC GAT GGA CAG CCT AAG CTT GTC AGC GAT CAA GCG GTG AGC TTG 1200 Phe Al a Asp Gly Gin Pro Lys Leu Val Ser Asp Gin Al a Val Ser Leu
385 390 395 400
GGG CAG AAT GTC CTC TCT GCG GAT TTC ACT CCC GGC ACT GAG TAC ACG 1248 Gly Gin Asn Val Leu Ser Al a Asp Phe Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Thr
405 410 415
GTT GAG GTT AGG TTC AAG GAA TTC GGT TCT GTG CGT GCG AAG GTA GTG 1296 Val Glu Val Arg Phe Lys Glu Phe Gly Ser Val Arg Al a Lys Val Val
420 425 430
GCC CAG TAG AAG AGG GGT GTC CTA TCC CGT GTG TCT 1332 Al a Gin End Lys Arg Gly Val Leu Ser Arg Val Ser
435 440 444 配列番号： 10
配列の長さ ： 36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
TAGCTGCAGG CTCGTCTCAT CATGAGACGC ACTATG 36 配列番号： 11
配列の長さ ： 36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
AAAGGATCCT TAAGACACAC GGGATAGGAC ACCCCT 36 配列番号： 12
配列の長さ ： 468
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic D N A
配列
ATG AAA GGA TCT GTC CGC GCG CTG TGC GCG TTC CTT GGT GTT GGA GCG 48 Met Lys Gly Ser Val Arg Ala Leu Cys Ala Phe Leu Gly Val Gly Ala
1 5 10 15
CTC GGT AGC GCT TTG TGT GTC TCG TGC ACA ACC GTG TGT CCG CAC GCC 96 Leu Gly Ser Ala Leu Cys Val Ser Cys Thr Thr Val Cys Pro His Ala
20 25 30
GGG AAG GCC AAA GCG GAA AAG GTA GAG TGC GCG TTG AAG GGA GGT ATC 144 Gly Lys Ala Lys Ala Glu Lys Val Glu Cys Ala Leu Lys Gly Gly l ie
35 40 45 TTT CGG GGT ACG CTA CCT GCG GCC GAT TGC CCG GGA ATC GAT ACG ACT 192 Phe Arg Gly Thr Leu Pro Al a Al a Asp Cys Pro Gly l ie Asp Thr Thr
50 55 60
GTG ACG TTC AAC GCG GAT GGC ACT GCG CAA AAG GTA GAG CTT GCC CTT 240 Val Thr Phe Asn Al a Asp Gly Thr Al a Gin Lys Val Glu Leu Al a Leu
65 70 75 80
GAG AAG AAG TCG GCA CCT TCT CCT CTT ACC TAT CGC GGT ACG TGG ATG 288 Glu Lys Lys Ser Al a Pro Ser Pro Leu Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Met
85 90 95
GTA CGT GAA GAC GGA ATT GTC GAA CTC TCG CTT GTG TCC TCG GAG CAA 336 Val Arg Glu Asp Gly l i e Val Glu Leu Ser Leu Val Ser Ser Glu Gin
100 105 110
TCG AAG GCA CCG CAC GAG AAA GAG CTG TAC GAG CTG ATA GAC AGT AAC 384 Ser Lys Al a Pro Hi s Glu Lys Glu Leu Tyr Glu Leu l i e Asp Ser Asn
115 120 125
TCC GTT CGC TAC ATG GGC GCT CCC GGC GCA GGA AAG CCT TCA AAG GAG 432 Ser Val Arg Tyr Met Gly Al a Pro Gly Ala Gly Lys Pro Ser Lys Glu
130 135 140
ATG GCG CCG TTT TAC GTG CTC AAA AAA ACA AAG AAA 468 Met Al a Pro Phe Tyr Val Leu Lys Lys Thr Lys Lys
145 150 155 156 配列番号： 13
配列の長さ ： 32
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D NA
配列 AAACTGCAGT CTCGTGCACA ACCGTGTGTC CG 32 配列番号： 14
配列の長さ ： 32
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
AAAAAGCTTA TTTCTTTGTT TTTTTGAGCA CG 32 配列番号： 15
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
AAACCCGGGA ATATACTAGA GATTTTTAAC 30 配列番号： 16
配列の長さ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
AAAGAATTCA AGCTTGAGCT CCTCGAG 27 配列番号： 17
配列の長さ ： 36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D NA
配列
TAGCTGCAGG CTCGTCTCAT CATGAGACGC ACTATG 36 配列番号： 18
配列の長さ ： 36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
AAAAGATCTT TAAGACACAC GGGATAGGAC ACCCCT 36 配列番号： 19
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
AAAAGATCTG TGTCTTCGTG CACAACCGTG 30 配列番号： 20
配列の長さ ： 33 配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D NA
配列
AAACTCGAGC TATTTCTTTG TTTTTTTGAG CAC 33

Claims

請求の範囲
1 . タンパク質の少なくとも 1個のシスティン残基が脂質非結合性ァミノ酸残基 に変換されたアミノ酸配列を有する改変タンパク質。
2 . タンパク質のアミノ基末端に一番近い位置のシスティン残基が脂質非結合性 アミノ酸残基に変換されたアミノ酸配列を有するものである請求項 1記載の改変 タンパク質。
3 . 脂質非結合性アミノ酸残基が、 ァラニン残基、 グルタミン酸残基及びセリン 残基からなる群から選択されるものである、 請求項 1又は 2記載の改変タンパク
4 . タンパク質がトレポネーマ ·パリダム菌に由来する抗原タンパクである請求 項 1〜3のいずれかに記載の改変タンパク質。
5 . タンパク質が、 トレポネーマ ·パリダム菌の分子量約 4 7 Kダルトン又は約 1 7 Kダルトンの抗原タンパク質である請求項 4記載の改変タンパク質。
6 .配列番号 1で示されるァミノ酸配列を有する請求項 5記載の改変タンパク質。
7 .配列番号 2で示されるァミノ酸配列を有する請求項 5記載の改変タンパク質。
8 . 微生物由来の抗原タンパク質を 2個以上連結させてなる融合タンパク質であ る請求項 1〜 7記載の改変タンパク質。
9 . 微生物由来の抗原タンパク質がトレポネーマ .パリダム菌由来の分子量約 4 7 Kダルトン及び 又は約 1 7 Kダルトンの抗原タンパク質からなる融合タンパ ク質である請求項 8記載の改変タンパク質。
1 0 . 配列番号 4で示されるアミノ酸配列を有する請求項 8又は 9記載の改変タ ンパク質。
1 1 . 請求項 1〜 1 0のいずれかに記載の改変タンパク質をコードする D NA若 しくはそれに相補的な D NA。
1 2 . 配列番号 5、 6又は 8で示される塩基配列を有する請求項 1 1記載の D N
A。
1 3 . 請求項 1 1又は 1 2に記載の D NAを含む組換えベクター。
1 4 . 請求項 1 3記載の組換えべクタ一を含む形質転換体。
1 5. FERM BP_ 5641、 FERM B P— 5642又は F E RM B P— 5763として寄託されている請求項 14記載の形質転換体。
16. 請求項 1〜10のいずれかに記載の改変タンパク質をコードする遺伝子を 導入した形質転換体を培養し、 培養物中に改変タンパク質を生成蓄積させ、 この 培養物を取得することを特徴とする改変タンパク質の製造法。
17. 取得された培養物の培養上清に硫酸アンモニゥムを添力卩し、 遠心分離して 沈殿を取得し、 この沈殿を界面活性剤含有水溶液に溶解させることを特徴とする 請求項 16記載の改変タンパク質の製造法。
18. 請求項 4〜10のいずれかに記載の改変タンパク質を抗原として用いるこ とを特徴とする抗トレポネーマ ·パリダム抗体の測定法。
19. 請求項 4〜10のいずれかに記載の改変タンパク質を抗原として含有して なる抗トレポネーマ ·パリダム抗体の測定用試薬。
20. 請求項 4〜10のいずれかに記載の改変タンパク質を有効成分とする梅毒 感染診断薬。
21. 請求項 4〜10のいずれかに記載の改変タンパク質を抗原として用いるこ とを特徴とする抗トレポネーマ ·パリダム抗体の製造法。
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