WO1998029550A1 - Proteinas recombinantes de fusion del virus del sindrome reproductivo y respiratorio porcino (prrsv) y su empleo en diagnostico - Google Patents

Proteinas recombinantes de fusion del virus del sindrome reproductivo y respiratorio porcino (prrsv) y su empleo en diagnostico Download PDF

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María José RODRIGUEZ GARCIA
Antonio Sanz Fernandez
José Ignacio CASAL ALVAREZ
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Inmunologia Y Genetica Aplicada, S.A.
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Definitions

  • This invention relates, in general, to recombinant proteins suitable for the diagnosis of a porcine pathogen, in particular, to recombinant fusion proteins comprising the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) nucleocapsid protein obtained from both isolates.
  • PRRSV porcine reproductive and respiratory syndrome virus
  • PRRS porcine reproductive and respiratory syndrome
  • PRRSV causes an important pathology in the pig hut characterized by reproductive disorders in sows (abortions, birth of dead or weak piglets), and an increase in perinatal mortality as well as dyspnea and pneumonia in piglets [Terpstra et al., Vet. Quarterly, 13, (1991), 131-136].
  • PRRSV is a covered RNA virus, approximately 62 nm in diameter, whose viral genome comprises a single-stranded RNA and positive polarity about 15 ilobases (kb) in length.
  • the genome contains 8 overlapping open reading (ORF) phases [Meulenberg et al., Virology, 192, (1993), 62-72].
  • the virion contains 6 structural proteins encoded by ORFs 2 to 7 [Meulenberg et al., Virology, 206, (1995), 155-163; van Nieuwstadt et al., J. Virol., 70, (1996), 4767-4772].
  • the 0RF7 encodes the nucleocapsid protein (N protein) that is the most immunogenic protein of PRRSV [Sanz et al., Second Symposium on Aujeszky and PRRS viruses, Copenhagen, Denmark (1995)], making it a good candidate for detection of virus-specific antibodies, and, consequently, for the diagnosis of the disease.
  • PRRSV isolates Two different antigenic groups of PRRSV have been described, corresponding to the American and European isolates.
  • Japanese PRRSV isolates, as well as other Asian isolates are antigenically related to the American isolate.
  • a characteristic example of the European PRRSV isolate is that deposited in the ECACC with the deposit number V93070108 [Spanish patent ES 2,074,950], while a representative example of the American PRRSV isolate is the one identified as VR-2332 [European EP patent 0 529 584].
  • European and American PRRSV isolates have a different genotype [Meng et al., Archives of Virology, 140 (1995), 745-755] with significant antigenic differences [ensvoort et al., J. Vet. Diag. Inves., 4, (1992), 134-138].
  • kits to detect the presence of PRRSV or antibodies that recognize PRRSV specific to the European and American isolated There are kits to detect the presence of PRRSV or antibodies that recognize PRRSV specific to the European and American isolated.
  • the usual methods of diagnosing PRRSV include performing an immuno-peroxidase-based assay (IPMA) or conducting an ELISA-type assay based on alveolar macrophages of pig lung or on antigenic recombinant proteins.
  • IPMA immuno-peroxidase-based assay
  • ELISA-type assay based on alveolar macrophages of pig lung or on antigenic recombinant proteins.
  • IPMA-based techniques are expensive and bloody techniques, requiring the use of alveolar pig lung macrophages from animal slaughter, such macrophages being contaminated or infected with other pathogens (unless gnotobiotic or specific pathogen-free animals are sacrificed , SPF), and are not susceptible to automation as they require a visual inspection by microscope.
  • ELISA techniques based on macrophages require the use of macrophage extracts, so they present the same problems, in that sense, as IPMA-based techniques.
  • the use of antigen in the form of a cell extract requires an internal reference with the same cell extracts but without infecting, in case there is any serum from a field animal with natural reactivity, that is, it has natural antibodies, which could mask the Outcome.
  • PRRSV antigens for example the nucleocapsid protein
  • tissue culture is problematic and expensive.
  • PRRSV recombinant proteins using recombinant baculovirus in permissive cells poses numerous problems since the expression of said proteins in that system is expensive and inefficient, the expressed proteins are insoluble and only a small soluble fraction is recovered. which is the one used in the ELISA.
  • the products of PRRSV ORF 3, 5 and 7 expressed by recombinant baculovirus in insect cells are difficult to purify.
  • an uninfected insect cell reference should be included to rule out natural reactivity.
  • diagnostic methods should be reliable, reproducible, sensitive, simple, cheap, broad spectrum and, advantageously, should use active antigens whose production in unlimited quantities is simple and economical. Additionally, in the case of pathogens that have isolates with genetic, antigenic and pathogenic differences, it is convenient to discriminate between the different isolates.
  • the invention provides recombinant fusion proteins, which comprise the PRRSV nucleocapsid protein obtained from both European and American isolates, useful for the diagnosis of PRRSV.
  • the invention also provides methods and kits for the diagnosis of PRRSV comprising the use of said recombinant fusion proteins.
  • the nucleic acid sequences that essentially encode said recombinant fusion proteins constitute a further object of the present invention.
  • the recombinant fusion proteins object of this invention comprise an amino acid sequence selected from the identified sequences (see section on the LIST OF SEQUENCES) as SEC. ID. N .: 1 and SEC. ID. No. : 2, or an active fragment thereof.
  • active fragment in the sense used in this description, refers to a protein fragment properly recognized by positive sera against PRRSV, that is, a fragment of the PRRSV ORF7 recognized in such a way as to allow discrimination between sera. PRRSV positive and negative.
  • SEC. ID. No. : 1 shows the amino acid sequence corresponding to the nucleocapsid protein of a European PRRSV isolate, specifically that identified as Toledo 4/96 [Example 1], generally referred to as "European isolate” in this description
  • SEC. ID. No. : 2 shows the amino acid sequence corresponding to the nucleocapsid protein of an American isolate, specifically that identified as Canada 14/96 [Example 2], generally referred to as "American isolate” in this description.
  • Recombinant fusion proteins further comprise an amino acid sequence, of variable length and composition, derived from the system chosen for the expression of the recombinant fusion protein, to which the SEC is fused. ID. N .: 1, or SEC. ID. No. : 2, or an active fragment thereof, either directly or through a junction zone formed by a small number of amino acids derived from the genetic manipulation of the recombinant fusion protein expression system.
  • amino acid sequences include all or part of the product of gene 10 of phage T7, glutathione-S-transferase, ⁇ -galactosidase and the product of the malE gene.
  • recombinant fusion proteins consist of an amino acid sequence selected from the SEC. ID. No. : 1 and SEC. ID. No. : 2, or an active fragment thereof, fused to a remainder of 259 amino acids from the T10 phage gene 10 protein through a 4-6 amino acid binding zone.
  • recombinant fusion proteins have the amino acid sequences identified as SEC. ID. No. : 8 or SEC. ID. No. : 9.
  • Recombinant fusion proteins provided by this invention can be obtained by expression of the sequence encoding the PRRSV nucleocapsid protein fused to the sequence encoding another protein or a separate one from it as occurs, for example, with plasmids pET, pGEX , pEx and pMal, which contain the 10 phage T7 gene, the glutathione-S-transferase gene, the ⁇ -galactosidase gene and the malE gene respectively, in a suitable expression system, such as a prokaryotic, by example a microorganism belonging to the genus
  • Escherichia Bacillus, Salmonella, Listeria, Yersinia, etc.
  • the sequence encoding the PRRSV nucleocapsid protein can be obtained from the viral RNA by conventional methods comprising, for example, the synthesis of a copy DNA (cDNA) by reverse transcription and the enzymatic amplification of the nucleic acid fragment it contains.
  • the PRRSV ORF 7 gene through the polymerase chain reaction (PCR) using the appropriate primers.
  • the complete sequence encoding the PRRSV nucleocapsid protein is cloned into a plasmid that is used to transform appropriate host cells.
  • the plasmid with the complete sequence of the PRRSV ORF7 is stabilized by cloning in a suitable cellular system, where the orientation and size of the insert is also checked, and subsequently cloned into the appropriate host cells for expression of the recombinant fusion protein. Any of the commonly used plasmids can be used in the transformation of prokaryotes.
  • the correct expression of the recombinant proteins was analyzed by polyacrylamide gel and sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) electrophoresis and Coomassie blue staining or by immunoblotting, while its antigenicity was determined by an ELISA assay.
  • the complete sequence of the PRRSV ORF7 both from the European isolate and the American isolate, has been cloned into plasmid pET3x, has been stabilized in E cells.
  • coli DH5 where, after checking the orientation and size, it has been extracted and cloned into E cells.
  • coli BL21 for the expression of the corresponding recombinant fusion protein.
  • the recombinant fusion proteins of this invention containing the nucleocapsid protein of either the European isolate or the American PRRSV isolate, have been expressed in E. coli BL21 with very high expression levels when expressed as large fusion proteins [45 or 46 kilodaltons (KDa)] (see Examples 3.4.1 and 4.4.1).
  • KDa 46 kilodaltons
  • Previous attempts to express the PRRSV nucleocapsid protein without fusing to other proteins or fragments thereof, or as small fusion proteins did not allow producing detectable levels of said protein.
  • the recombinant fusion proteins provided by this invention produce inclusion bodies, such proteins can be easily recovered by solubilization with guanidinium chloride.
  • the recombinant proteins of this invention without any further manipulation, except a simple dilution in phosphate buffered saline (PBS), can be used to coat a suitable solid support prior to use for diagnostic purposes.
  • PBS phosphate buffered s
  • PRRSV nucleocapsid protein as a recombinant fusion protein in E. coli takes place at very high levels and can be purified. easily so that this protein is an ideal candidate for the development of methods and kits for the diagnosis of PRRSV.
  • the recombinant fusion proteins provided by this invention are useful as a diagnostic reagent. This hypothesis is confirmed by the fact that monoclonal antibodies that compete efficiently with PRRSV-positive sera, recognize only the complete protein (Examples 3.4.2 and 4.4.2). In addition, the most immunodominant epitope, the one recognized by monoclonal antibodies 1CH5 and 1DH10, is a conformation-dependent epitope that requires the complete sequence of the nucleocapsid protein to be recognized.
  • the invention also provides a method for the diagnosis of PRRSV, in particular, a method for detecting the presence of antibodies that specifically recognize PRRSV, which comprises contacting a biological sample of an animal with a recombinant fusion protein provided by this invention. under conditions that allow the formation of an antigen-antibody complex, and detect the antigen-antibody complex formed.
  • biological sample refers to a sample from an animal, such as blood, serum, plasma, sputum, saliva or any other biological fluid, while the term “animal” includes all mammals, more specifically pigs, sows and piglets.
  • the immunoassay can be, for example, an indirect ELISA or a competition ELISA.
  • the detection of the antigen-antibody complex can be carried out by conventional techniques that include the production of a colored reaction, using, for example, a reagent labeled an enzyme, such as peroxidase, and a suitable substrate.
  • the invention provides a kit for the diagnosis of PRRSV, in particular, a kit for detecting the presence of antibodies that specifically recognize PRRSV in a biological sample of an animal, which includes a recombinant fusion protein provided by this invention and suitable means of detecting the antigen complex. antibody formed comprising the labeled reagent and the appropriate substrate.
  • the diagnostic kit may also contain a positive control and a negative control in order to facilitate the evaluation of the test results by comparison with the results obtained with the standard sample.
  • the ORF7 of said isolate was obtained by means of a reverse transcription reaction (TR) followed by enzymatic amplification by the polymerase chain reaction (PCR) of the serum of the infected animal.
  • TR reverse transcription reaction
  • PCR polymerase chain reaction
  • 100 ⁇ l of serum is added 600 ⁇ l of Chaos buffer [to prepare 100 ml of Chaos buffer 50 g of guanidinium thiocyanate (GSCN) 4.2 M, 2.5 ml of 20% sarcosyl are mixed, 1.25 ml of Tris-HCl, pH: 8.2 M, 99.7 ml of water, filtered through a 0.22 ⁇ filter and 0.7 mol of ⁇ -mercaptoethanol] are added and incubated the whole for 30 minutes at room temperature.
  • GSCN guanidinium thiocyanate
  • RNA is precipitated with 1/10 (volume) of 3M sodium acetate pH: 5.2 and 3 volumes of absolute ethanol, washed with 70% ethanol and the precipitate is dried. RNA is resuspended in 20 ⁇ l of T: E buffer [Tris: EDTA, 10: 1 mM, pH: 7.5].
  • RNA suspension formed 10 ⁇ l of the suspension formed is used.
  • 500 ng of the complementary initiator oligonucleotide, identified as SEC is added to 10 ⁇ l of said RNA suspension.
  • ID. N .: 4 incubating the set for 10 minutes at 65 ° C. The mixture is allowed to cool slowly to room temperature.
  • dNTPs deoxynucleoside triphosphates
  • the amplification products were detected by electrophoresis in a 1% agarose gel stained with ethidium bromide and observed by ultraviolet light ( ⁇ : 300 nm) in a Fotodyne transilluminator.
  • the ORF7 of said isolate was obtained by means of a TR-PCR reaction according to the procedure described in Example 1, but using as oligonucleotide initiator for reverse transcription the one identified as SEC. ID.
  • ORF7 of the European isolate was cloned into plasmid pMTL25 previously digested with Smal and treated with phosphatase, in order to provide BamHI sites compatible with expression vectors.
  • the resulting plasmid was named pPRRSE-ORF7.
  • Plasmid DNA was sequenced according to the method of the dideoxynucleotides [Sanger et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 74, (1977), 5463-5467].
  • the putative amino acid sequence derived from said nucleotide sequence, corresponding to the nucleocapsid protein of the European PRRSV isolate is shown in SEC. ID. No .: 1.
  • the protein sequence analysis was performed with the PC / GENE program and PredictProtein [Rost et al., Meth. Enzymol., 266, (1996), 525-539].
  • Plasmid pET3x containing the complete sequence of the PRRSV nucleocapsid protein was called pET-PRRSVORF7E and was used to transform E cells.
  • coli XLl blue or DH5 competent in order to stabilize the plasmid and check the orientation of the insert.
  • the resulting colonies were tracked by digestion with the appropriate restriction enzymes.
  • the binding sequences of the inserts were sequenced by the dideoxynucleotide method [Sanger et al., Cited supra] using the oligonucleotide shown in SEC. ID. N .: 7 as initiator.
  • BL21 (DE3) pLysS (Studier et al., Cited supra] competent cells were transformed with the plasmid pET-PRRSVORF7E previously prepared in order to express the PRRSV nucleocapsid protein in the form of a fusion protein with the product of gene 10 of phage T7.
  • agar plates with chloramphenicol and ampicillin were used. 3.3 Growth, induction and analysis of transformed E. coli cells.
  • the recombinant protein contains the rest of amino acids derived from the product of gene 10 of T7 (amino acids 1 to 259), a zone of union of 6 amino acids (amino acids 260-265) and the protein sequence of the Complete nucleocapsid of the European isolate of PRRSV (amino acids 266-393).
  • the fusion protein obtained is insoluble although it can be easily solubilized with 4M guanidinium chloride.
  • the purity of the fusion protein obtained after the solubilization step is greater than 80%.
  • Recombinant fusion proteins were transferred to nitrocellulose membranes using the semi-dry transfer technique (Bio-Rad) for 20 minutes at 22 Volts. Then, the membranes were incubated for 1 hour in blocking solution (3% skim milk, 0.05% Tween® 20 in PBS). After blocking, the proteins were reacted with the supernatants of specific monoclonal antibodies against the nucleocapsid protein (identified as 1AC7, 1AG11, 1DA4, 1BD11, 1EB9, 1CH5 and 1DH10) [Second Symposium on Aujeszky and PRRS viruses, Copenhagen, Denmark (1995)] overnight at 4 ° C.
  • 1DH10 defined another antigenic site and recognized a discontinuous epitope that requires the complete nucleocapsid.
  • the reactivity of the monoclonal antibodies was characterized by an indirect ELISA assay under conditions where the protein was closer to its appropriate folding.
  • ELISA 96-well microtiter plates (LabSystem) were coated overnight at 4 ° C with 100 ⁇ l of a 1: 100 dilution of the recombinant fusion protein containing the nucleocapsid protein of the European PRRSV isolate , expressed by E. coli and solubilized with 4 M guanidinium chloride in 0.05 M carbonate buffer, pH 9.6. The plates were then incubated with the undiluted supernatants of the monoclonal antibodies or with double serial dilutions of the animal's serum corresponding for 2 hours at 37 ° C.
  • PRF-E monoclonal antibody Toledo 4/96 1CH5 ++ 1DH10 ++
  • PRF-E recombinant fusion protein containing the nucleocapsid protein of the European PRRSV isolate.
  • Example 4.1 Cloning of the ORF7
  • the procedure described in Example 3.1 was repeated exactly, but using the product resulting from the PCR amplification of Example 2, corresponding to the complete sequence of the 0RF7 of the American isolate, thereby cloning it into the plasmid pMTL25 previously digested with Smal and treated with phosphatase obtained the plasmid called pPRRSC-0RF7.
  • Plasmid DNA was sequenced according to the dideoxynucleotide method [Sanger et al., Cited supra], while the analysis of the amino acid sequence of the protein was performed with the PC / GENE program and PredictProtein [Rost et al., Cited supra].
  • the amino acid sequence of the nucleocapsid protein of the American PRRSV isolate is shown in SEC. ID. N .: 2.
  • Plasmid pET3x containing the complete sequence of the PRRSV nucleocapsid protein was called pET-PRRSVORFC and was used to transform competent E. coli XLl blue or DH5 cells. The resulting colonies were tracked by digestion with the appropriate restriction enzymes. To check the orientation, the sequences Binding inserts were sequenced by the dideoxynucleotide method [Sanger et al., cited supra] using the oligonucleotide shown in SEQ. ID. No. : 7 as initiator.
  • BL21 (DE3) pLysS (Studier et al., Cited supra] competent cells were transformed with the plasmid pET-PRRSVORF7C previously prepared in order to express the PRRSV nucleocapsid protein in the form of a fusion protein with the product of gene 10 of phage T7.
  • agar plates with chloramphenicol and ampicillin were used.
  • the complete sequence of the recombinant fusion protein is shown in SEC. ID. No. : 9.
  • the recombinant protein contains the rest of amino acids derived from the product of gene 10 of T7 (amino acids 1 to 259), a 4 amino acid binding zone (amino acids 260-263) and the complete nucleocapsid protein sequence of the American isolate of PRRSV (amino acids 264-386).
  • the purification of said protein is carried out according to the methodology described by Mart ⁇ nez-Torrecuadrada et al. [quoted above].
  • the fusion protein obtained is insoluble although it can be easily solubilized with 4M guanidinium chloride.
  • the purity of the fusion protein obtained after the solubilization step is greater than 80% (determined by Coomassie blue staining).
  • Example 3.5 The procedure described in Example 3.5 was followed but in this case using the recombinant fusion protein containing the nucleocapsid protein of the American isolate of PRRSV. The results obtained by ELISA are shown in Table 2. Table 2 Characterization of monoclonal antibodies that specifically recognize the PRRSV nucleocapsid protein
  • PRF-E recombinant fusion protein containing the nucleocapsid protein of the European PRRSV isolate (SEQ ID NO: 8).
  • PRF-C recombinant fusion protein containing the nucleocapsid protein of the American PRRSV isolate (SEQ. ID. NO .: 9).
  • a competition ELISA assay can be performed where the use of the recombinant antigen is combined with the specificity of monoclonal antibodies In general, this test is more specific and more sensitive.
  • 96-well microtiter plates (LabSystem) were coated overnight, at 4 ° C, with 100 ⁇ l (1 ⁇ g / well) of the recombinant fusion protein containing the protein of the nucleocapsid of the European isolate of PRRSV expressed in E. coli (Example 3) solubilized with 4 M guanidinium chloride in 0.05 M carbonate buffer, pH: 9.6. Then, 100 ⁇ l of the serum samples to be evaluated (15 samples, 6 positive and 9 negative), diluted 1/5 in PBS-Tween® 20 0.05%, were added and incubated for 30 minutes at 37 ° C . Without removing the sera, 50 ⁇ l of the peroxidase-labeled 1CH5 monoclonal antibody (1: 5000) was added in the same buffer described above and incubation was continued for an additional 30 minutes.
  • the reaction was detected by adding ABTS as a substrate.
  • the reaction was stopped by the addition of 1% SDS.
  • the optical density of the samples was determined at 405 nm in an ELISA reader (Bio-Tek Instruments, United States). The results obtained are summarized in Table 4.
  • CN is the absorbance value at 405 nm of the negative control and CP that of the positive control.
  • a sample is considered positive if the absorbance value of said sample at 405 nm is less than the cut-off value. Otherwise, the sample is considered negative.
  • pET-PRRSVORF7E The plasmid called pET-PRRSVORF7E, containing the complete nucleotide sequence encoding the nucleocapsid protein (ORF7) of the isolate of PRRSV Toledo 4/96 has been deposited on December 19, 1996 in the Spanish Type Culture Collection (CECT), Burjasot, Valencia (Spain), corresponding to the deposit number CECT 4836.
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Abstract

Las proteínas recombinantes de fusión comprenden la proteína de la nucleocápsida del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), obtenida tanto a partir de un aislado europeo de PRRSV como de un aislado americano, fusionada a una secuencia de aminoácidos derivada del sistema elegido para la expresión de dicha proteína recombinante de fusión bien directamente o bien a través de una zona de unión formada por un número pequeño de aminoácidos. Estas proteínas recombinantes de fusión son adecuadas para su empleo en el diagnóstico de PRRSV.

Description

PROTEÍNAS RECOMBINANTES DE FUSIÓN DEL VIRUS DEL SÍNDROME REPRODUCTIVO Y RESPIRATORIO PORCINO (PRRSV) Y SU EMPLEO EN DIAGNOSTICO
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se refiere, en general, a proteínas recombinantes adecuadas para el diagnóstico de un patógeno porcino, en particular, a proteínas recombinantes de fusión que comprenden la proteína de la nucleocápsida del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) obtenida tanto de aislados europeos como de aislados americanos, y a su empleo en el diagnóstico de PRRSV.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El agente causal del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) es un nuevo arterivirus (PRRSV) aislado por primera vez en Europa [ ensvoort et al., Vet . Quarterly, 13, (1991), 121-130] y posteriormente en los Estados Unidos [Collins et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4, (1992), 117-126].
El PRRSV causa una patología importante en la cabana porcina caracterizada por trastornos reproductivos en cerdas (abortos, nacimiento de lechones muertos o débiles) , y un aumento de la mortalidad perinatal así como disnea y neumonía en lechones [Terpstra et al., Vet. Quarterly, 13, (1991), 131-136].
El PRRSV es un virus RNA con cubierta, de 62 nm de diámetro aproximadamente, cuyo genoma viral comprende un RNA de cadena sencilla y polaridad positiva de unas 15 ilobases (kb) de longitud. El genoma contiene 8 fases de lectura abierta (ORF) solapantes [Meulenberg et al., Virology, 192, (1993), 62-72]. El virión contiene 6 proteínas estructurales codificadas por las ORFs 2 a 7 [Meulenberg et al., Virology, 206, (1995), 155-163; van Nieuwstadt et al., J. Virol., 70, (1996), 4767-4772]. La 0RF7 codifica la proteína de la nucleocápsida (proteína N) que es la proteína más inmunogénica del PRRSV [Sanz et al., Second Simposium on Aujeszky and PRRS viruses, Copenhague, Dinamarca (1995)], por lo que es una buena candidata para la detección de anticuerpos específicos del virus, y, por consiguiente, para el diagnóstico de la enfermedad.
Se han descrito dos grupos antigénicos distintos de PRRSV, que corresponden a los aislados americano y europeo. Los aislados de PRRSV japoneses, así como otros aislados asiáticos están relacionados antigénicamente con el aislado americano. Un ejemplo característico de aislado europeo de PRRSV es el depositado en la ECACC con el número de depósito V93070108 [patente española ES 2.074.950], mientras que un ejemplo representativo de aislado americano de PRRSV es el identificado como VR-2332 [patente europea EP 0 529 584] . Los aislados europeo y americano de PRRSV presentan un genotipo distinto [Meng et al., Archives of Virology, 140 (1995), 745-755] con diferencias antigénicas importantes [ ensvoort et al., J. Vet. Diagn. Inves., 4, (1992), 134-138].
Las diferencias serológicas entre los aislados europeo y americano complican el diagnóstico de la enfermedad ya que en muchas ocasiones no hay reacción cruzada entre los sueros porcinos respectivos (quizás debido a la ausencia de epítopos inmunodominantes lineales). Además, la reciente introducción en Europa de unas vacunas basadas en el aislado americano representa una complicación adicional en el análisis serológico de animales infectados y/o vacunados. Por tanto, es necesario desarrollar un método de diagnóstico que permita discriminar entre ambos aislados tanto en poblaciones individuales como mixtas con el fin de efectuar una distinción precisa en cuanto a la procedencia del virus.
Existen kits para detectar la presencia de PRRSV o de anticuerpos que reconocen PRRSV específicos para los aislados europeo y americano.
Los métodos habituales de diagnóstico de PRRSV comprenden la realización de un ensayo basado en la inmuno- peroxidasa (IPMA) o la realización de un ensayo de tipo ELISA basado en macrófagos alveolares de pulmón de cerdo o en proteínas recombinantes antigénicas.
Las técnicas basadas en la IPMA son técnicas caras y cruentas, requieren el empleo de macrófagos alveolares de pulmón de cerdo procedentes del sacrificio de animales, pudiendo estar dichos macrófagos contaminados o infectados con otros patógenos (salvo que se sacrifiquen animales gnotobióticos o libres de patógenos específicos, SPF) , y no son susceptibles de automatización pues requieren una inspección visual por microscopio. Las técnicas de ELISA basadas en macrófagos requieren el empleo de extractos de macrófagos, por lo que presentan los mismos problemas, en ese sentido, que las técnicas basadas en IPMA. Además, el empleo de antígeno en forma de extracto celular requiere una referencia interna con los mismos extractos celulares pero sin infectar, por si hubiera algún suero de un animal de campo con reactividad natural, es decir, que tuviera anticuerpos naturales, que pudieran enmascarar el resultado.
Las técnicas de ELISA basadas en proteínas recombinantes de PRRSV requieren la producción de antígeno viral en cantidades apropiadas y en forma activa. La producción de antígenos de PRRSV, por ejemplo la proteína de la nucleocápsida, en cultivo de tejidos, es problemática y costosa. Por otra parte, la producción de proteínas recombinantes de PRRSV usando baculovirus recombinantes en células permisivas plantea numerosos problemas ya que la expresión de dichas proteínas en ese sistema es costosa y poco eficiente, las proteínas expresadas son insolubles y tan sólo se recupera una pequeña fracción soluble que es la que se utiliza en el ELISA. Por otra parte, los productos de las ORF 3, 5 y 7 de PRRSV expresados por baculovirus recombinantes en células de insecto son difíciles de purificar. Además, se debe incluir una referencia de células de insecto sin infectar para descartar la reactividad natural.
En general, los métodos de diagnóstico deben ser fiables, reproducibles, sensibles, sencillos, baratos, de amplio espectro y, ventajosamente, deben utilizar antígenos activos cuya producción en cantidades ilimitadas sea sencilla y económica. Adicionalmente, en el caso de patógenos que tienen aislados con diferencias genéticas, antigénicas y patogénicas, es conveniente que permita discriminar entre los distintos aislados.
Los métodos utilizados para el diagnóstico de PRRSV actualmente disponibles no cumplen satisfactoriamente todos los requisitos que se deben exigir a un método de diagnóstico por lo que sigue existiendo la necesidad de disponer de otros métodos para el diagnóstico de PRRSV que solucionen todos o alguno de los problemas mencionados previamente.
La invención proporciona unas proteínas recombinantes de fusión, que comprenden la proteína de la nucleocápsida de PRRSV obtenida tanto de aislados europeos como de aislados americanos, útiles para el diagnóstico de PRRSV. La invención también proporciona métodos y kits para el diagnóstico de PRRSV que comprenden el empleo de dichas proteínas recombinantes de fusión. Las secuencias de ácidos nucleicos que esencialmente codifican dichas proteínas recombinantes de fusión constituyen un objeto adicional de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Las proteínas recombinantes de fusión objeto de esta invención comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias identificadas (véase el apartado relativo a la LISTA DE SECUENCIAS) como SEC. ID. N°.: 1 y SEC. ID. N° . : 2, o un fragmento activo de las mismas. El término "fragmento activo", en el sentido utilizado en esta descripción se refiere a un fragmento proteico reconocido adecuadamente por los sueros positivos frente a PRRSV, es decir, un fragmento de la ORF7 de PRRSV reconocido de tal manera que permita la discriminación entre sueros positivos y negativos a PRRSV.
La SEC. ID. N° . : 1 muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente a la proteína de la nucleocápsida de un aislado europeo de PRRSV, concretamente al identificado como Toledo 4/96 [Ejemplo 1], denominado en general "aislado europeo" en esta descripción, mientras que la SEC. ID. N° . : 2 muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente a la proteína de la nucleocápsida de un aislado americano, en concreto al identificado como Canadá 14/96 [Ejemplo 2], denominado en general "aislado americano" en esta descripción.
Las proteínas recombinantes de fusión comprenden además una secuencia de aminoácidos, de longitud y composición variable, derivada del sistema elegido para la expresión de la proteína recombinante de fusión, al que se fusiona la SEC. ID. N°.: 1, o la SEC. ID. N° . : 2, o un fragmento activo de las mismas, bien directamente o bien a través de una zona de unión formada por un pequeño número de aminoácidos derivados de la manipulación genética del sistema de expresión de la proteína recombinante de fusión. Ejemplos de dichas secuencias de aminoácidos incluyen la totalidad o parte del producto del gen 10 del fago T7, la glutation-S-transferasa, la β-galactosidasa y el producto del gen malE.
En una realización particular de esta invención, las proteínas recombinantes de fusión constan de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre la SEC. ID. N° . : 1 y la SEC. ID. N° . : 2, o un fragmento activo de las mismas, fusionada a un resto de 259 aminoácidos procedentes de la proteína del gen 10 del fago T7 a través de una zona de unión de 4-6 aminoácidos. En una realización particular y preferida de esta invención, las proteínas recombinantes de fusión tienen las secuencias de aminoácidos identificadas como SEC. ID. N° . : 8 o SEC. ID. N° . : 9.
Las proteínas recombinantes de fusión proporcionadas por esta invención pueden obtenerse por expresión de la secuencia que codifica la proteína de la nucleocápsida de PRRSV fusionada a la secuencia que codifica otra proteína o un aparte de ella como ocurre, por ejemplo, con los plásmidos pET, pGEX, pEx y pMal, que contienen el gen 10 del fago T7, el gen de la glutation-S-transferasa, el gen de la β-galactosidasa y el gen malE respectivamente, en un sistema de expresión adecuado, tal como un procariota, por ejemplo un microorganismo perteneciente al género
Escherichia , Bacillus, Salmonella , Listeria , Yersinia , etc.
La secuencia que codifica la proteína de la nucleocápsida de PRRSV puede obtenerse a partir del RNA viral por métodos convencionales que comprenden, por ejemplo, la síntesis de un DNA copia (cDNA) por transcripción inversa y la amplificación enzimática del fragmento de ácido nucleico que contiene el gen de la ORF 7 de PRRSV por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los iniciadores apropiados.
A continuación, la secuencia completa que codifica la proteína de la nucleocápsida de PRRSV se clona en un plásmido que se usa para transformar células hospedadoras apropiadas. En ocasiones, el plásmido con la secuencia completa de la ORF7 de PRRSV se estabiliza mediante clonaje en un sistema celular adecuado, donde además se comprueba la orientación y el tamaño del inserto, y posteriormente se clona en las células hospedadoras apropiadas para la expresión de la proteína recombinante de fusión. Puede utilizarse cualquiera de los plásmidos habitualmente usados en la transformación de procariotas.
La expresión correcta de las proteínas recombinantes se analizó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y tinción con azul de Coomassie o por inmunoblotting, mientras que su antigenicidad se determinó por un ensayo de ELISA.
En una realización particular, la secuencia completa de la ORF7 de PRRSV, tanto del aislado europeo como del aislado americano, se ha clonado en el plásmido pET3x, se ha estabilizado en células de E . coli DH5, de donde, tras comprobar la orientación y el tamaño, se ha extraído y se ha clonado en células de E . coli BL21 para la expresión de la proteína recombinante de fusión correspondiente.
Las proteínas recombinantes de fusión de esta invención, conteniendo la proteína de la nucleocápsida bien del aislado europeo o bien del aislado americano de PRRSV, se han expresado en E . coli BL21 con unos niveles de expresión muy altos cuando se expresan como proteínas de fusión de gran tamaño [45 ó 46 kilodaltons (KDa) ] (véanse los Ejemplos 3.4.1 y 4.4.1). Los intentos previos para expresar la proteína de la nucleocápsida de PRRSV sin fusionar a otras proteínas o fragmentos de las mismas, o como proteínas de fusión pequeñas no permitieron producir niveles detectables de dicha proteína. Aunque las proteínas recombinantes de fusión proporcionadas por esta invención producen cuerpos de inclusión, dichas proteínas se pueden recuperar fácilmente por solubilización con cloruro de guanidinio. Las proteínas recombinantes de esta invención, sin ninguna manipulación adicional, salvo una simple dilución en tampón fosfato salino (PBS) , pueden ser utilizadas para recubrir un soporte sólido adecuado previo a su empleo con fines de diagnóstico.
La expresión de la proteína de la nucleocápsida de PRRSV en forma de proteína recombinante de fusión en E. coli tiene lugar a niveles muy altos y se puede purificar fácilmente por lo que dicha proteína es una candidata ideal para el desarrollo de métodos y kits para el diagnóstico de PRRSV.
Las proteínas recombinantes de fusión proporcionadas por esta invención son útiles como reactivo de diagnóstico. Esta hipótesis se confirma por el hecho de que unos anticuerpos monoclonales que compiten eficientemente con sueros PRRSV-positivos, reconocen solo a la proteína completa (Ejemplos 3.4.2 y 4.4.2). Además, el epítopo más inmunodominante, el reconocido por los anticuerpos monoclonales 1CH5 y 1DH10, es un epítopo dependiente de conformación que requiere la secuencia completa de la proteína de la nucleocápsida a reconocer.
La invención también proporciona un método para el diagnóstico de PRRSV, en particular, un método para detectar la presencia de anticuerpos que reconocen específicamente a PRRSV, que comprende poner en contacto una muestra biológica de un animal con una proteína recombinante de fusión proporcionada por esta invención bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo, y detectar el complejo antígeno- anticuerpo formado. En el sentido utilizado en esta descripción el término "muestra biológica" se refiere a una muestra procedente de un animal, tal como sangre, suero, plasma, esputo, saliva o cualquier otro fluido biológico, mientras que el término "animal" incluye a todos los mamíferos, más concretamente a cerdos, cerdas y lechones.
El inmunoensayo puede ser, por ejemplo, un ELISA indirecto o un ELISA de competición. La detección del complejo antígeno-anticuerpo se puede llevar a cabo mediante técnicas convencionales que incluyen la producción de una reacción coloreada, utilizando, por ejemplo, un reactivo marcado una enzima, tal como peroxidasa, y un sustrato adecuado. Adicionalmente, la invención proporciona un kit para el diagnóstico de PRRSV, en particular, un kit para detectar la presencia de anticuerpos que reconocen específicamente a PRRSV en una muestra biológica de un animal, que incluye una proteína recombinante de fusión proporcionada por esta invención y unos medios de detección adecuados del complejo antígeno-anticuerpo formado que comprenden el reactivo marcado y el sustrato adecuado. El kit de diagnóstico también puede contener un control positivo y un control negativo al objeto de facilitar la evaluación de los resultados del ensayo por comparación con los resultados obtenidos con la muestra patrón.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención aunque no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma.
EJEMPLO 1 Aislamiento de la ORF7 del aislado europeo de PRRSV El aislado de PRRSV identificado como Toledo 4/96, denominado "aislado europeo" en esta descripción, se obtuvo a partir del suero de un animal procedente de una granja situada en Toledo (España) en la que se habían dado casos de abortos, anorexia, hipertermia y problemas respiratorios en lechones.
La ORF7 de dicho aislado se obtuvo por medio de una reacción de transcripción reversa (TR) seguida de amplificación enzimática por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del suero del animal infectado. Para ello, a 100 μl de suero se le añaden 600 μl de tampón Chaos [para preparar 100 mi de tampón Chaos se mezclan 50 g de tiocianato de guanidinio (GSCN) 4,2 M, 2,5 mi de sarcosilo al 20%, 1,25 mi de Tris-HCl, pH: 8, 2 M, 99,7 mi de agua, se filtra a través de un filtro de 0,22 μ y se añaden 0,7 moles de β-mercaptoetanol] y se incuba el conjunto durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añaden 700 μl de una mezcla fenol : cloroformo : alcohol isoamílico (IAA) (25:24:1), se mezcla con ayuda del vortex y se centrifuga a 13.000 r.p.m. durante 10 minutos a 4°C recogiéndose la fase acuosa (aproximadamente 300 μl) . Este proceso de fenolización se repite dos veces. El RNA se precipita con 1/10 (volumen) de acetato sódico 3 M pH: 5,2 y 3 volúmenes de etanol absoluto, se lava con etanol al 70% y el precipitado se seca. El RNA se resuspende en 20 μl de tampón T:E [Tris:EDTA, 10:1 mM, pH : 7,5].
Para la realización de la TR-PCR se utilizan 10 μl de la suspensión formada. Para ello, a 10 μl de dicha suspensión de RNA se le añaden 500 ng del oligonucleótido iniciador complementario, identificado como SEC. ID. N°.: 4, incubándose el conjunto durante 10 minutos a 65°C. La mezcla se deja enfriar lentamente a temperatura ambiente. Posteriormente, se añaden 2 μl de tampón 10X de dilución de la enzima Tth, 4 μl de los desoxinucleósidos trifosfatos (dNTPs) [dATP, dGTP, dCTP y dTTP] , los oligonucleótidos iniciadores, identificados como SEC. ID. N° . : 3 (iniciador directo) y como SEC. ID. N°.: 4 (iniciador inverso), y 1 μl de transcriptasa reversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV) y se lleva a un volumen de 20 μl . La mezcla se incuba durante 1 hora a 42°C y posteriormente se inactiva la transcriptasa reversa por calentamiento a 65°C durante 5 minutos. A continuación se lleva el volumen final de reacción a 100 μl y se añade 1 μl de la DNA polimerasa de Thermus thermofilus [Tfh] (Biotools, España) . La mezcla se calienta a 94 °C durante 3 minutos y posteriormente se realizan 35 ciclos de:
- desnaturalización: 94°C durante 1 minuto; - anillamiento: 60°C durante 1 minuto; y
- elongación: 72°C durante 30 segundos, y una etapa de elongación final de 10 minutos a 72°C.
Operando de esta manera se amplificó el fragmento correspondiente a la ORF7 completa [384 pares de bases (pb) ] del aislado de PRRSV denominado Toledo 4/96 (aislado europeo ) .
Los productos de la amplificación se detectaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio y se observaron por luz ultravioleta (λ: 300 nm) en un transiluminaddor Fotodyne.
EJEMPLO 2 Aislamiento de la ORF7 del aislado americano de PRRSV
El aislado de PRRSV identificado como Canadá 14/96, denominado "aislado americano" en esta descripción, se obtuvo a partir del suero de un animal procedente de una granja canadiense afectada de PRRS .
La ORF7 de dicho aislado se obtuvo por medio de una reacción TR-PCR según el procedimiento descrito en el Ejemplo 1, pero utilizando como oligonucleótido iniciador para la transcripción reversa el identificado como SEC. ID.
N° . : 6, y como oligonucleótidos iniciadores en la PCR los identificados como SEC. ID. N° . : 5 (iniciador directo) y como SEC. ID. N° . : 6 (iniciador inverso) . Operando de la manera indicada se amplificó y se detectó el fragmento correspondiente a la ORF7 completa [369 pares de bases
(pb) ] del aislado PRRSV denominado Canadá 14/96 (aislado americano) .
EJEMPLO 3
Expresión de la proteina recombinante de fusión que comprende la ORF7 del aislado europeo
3.1 Clonan e de la ORF7
El producto resultante de la amplificación por PCR del Ejemplo 1, correspondiente a la secuencia completa de la
ORF7 del aislado europeo se clonó en el plásmido pMTL25 previamente digerido con Smal y tratado con fosfatasa, al objeto de proporcionar sitios BamHI compatibles con los vectores de expresión. El plásmido resultante se denominó pPRRSE-ORF7. El DNA plasmídico se secuenció según el método de los didesoxinucleótidos [Sanger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 74, (1977), 5463-5467]. La secuencia putativa de aminoácidos derivada de dicha secuencia de nucleótidos, correspondiente a la proteína de la nucleocápsida del aislado europeo de PRRSV se muestra en la SEC. ID. N°.: 1. El análisis de la secuencia de la proteína se realizó con el programa PC/GENE y PredictProtein [Rost et al., Meth. Enzymol., 266, (1996), 525-539].
Posteriormente, la secuencia completa que codifica la proteína de la nucleocápsida de PRRSV se subclonó en el plásmido pET3x [Studier et al., Methods Enzymol., 185,
(1990), 60-89] tratado con fosfatasa y digerido con BamHI .
El plásmido pET3x conteniendo la secuencia completa de la proteína de la nucleocápsida de PRRSV se denominó pET- PRRSVORF7E y se utilizó para transformar células E . coli XLl blue o DH5 competentes con el fin de estabilizar el plásmido y comprobar la orientación del inserto. Las colonias resultantes se rastrearon por digestión con las enzimas de restricción apropiadas. Para comprobar la orientación, las secuencias de unión de los insertos se secuenciaron mediante el método de los didesoxinucleótidos [Sanger et al., citado supra ] utilizando el oligonucleótido mostrado en la SEC. ID. N°.: 7 como iniciador.
3.2 Transformación de células de E. coli competentes para la expresión de la proteina recombinante
Tras verificar que la orientación era correcta, se transformaron células BL21 (DE3) pLysS [Studier et al., citado supra ] competentes con el plásmido pET-PRRSVORF7E anteriormente preparado con el fin de expresar la proteína de la nucleocápsida de PRRSV en forma de una proteína de fusión con el producto del gen 10 del fago T7. Para seleccionar las células transformadas se utilizaron placas de agar con cloranfenicol y ampicilina. 3.3 Crecimiento, inducción y análisis de células transformadas de E. coli .
Se crecieron clones de células de E. coli BL21 (DE3) pLysS conteniendo los plásmidos recombinantes pET- PRRSVORF7E y se indujeron con isopropiltiogalactopiranósido
(IPTG) 0,4 mM (Boehringer Mannheim, Alemania) según el método descrito por Martínez-Torrecuadrada et al.
[Virology, 210, (1995), 391-399]. Después de 3 horas de inducción, tiempo suficiente para acumular la proteína sin que tenga lugar una sobreproducción de células que hubieran perdido el plásmido o que fueran improductivas, las células se centrifugaron, se lavaron dos veces con tampón fosfato salino (PBS), se resuspendieron en un volumen final de 500 μl de PBS por 20 mi de cultivo y se usaron por sonicación [Martínez-Torrecuadrada et al., citado supra ] .
3.4 Análisis de las proteínas recombinantes La expresión correcta de las proteínas recombinantes se analizó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y tinción con azul de Coomassie o por inmunoblotting .
3.4.1 SDS-PAGE A cada muestra se le añadió un volumen de tampón de carga (Tris-HCl 10 mM, pH: 6,9, 10% de SDS, 10% de mercaptoetanol, 0,02% de azul de bromofenol y 35% de glicerol) y, posteriormente, se calentaron las muestras a ebullición durante 5 minutos antes de efectuar el análisis sobre un gel de poliacrilamída con 11% de SDS. La detección de las proteínas se realizó por tinción con azul de Coomassie. Se observa una banda intensa correspondiente a una proteína de un tamaño conforme con el peso molecular esperado (46 KDa) y una producción abundante de la proteína recombinante de fusión (0,1 mg/ml) . La secuencia completa de la proteína recombinante de fusión se muestra en la SEC. ID. N°.: 8. La proteína recombinante contiene el resto de aminoácidos derivado del producto del gen 10 de T7 (aminoácidos 1 a 259) , una zona de unión de 6 aminoácidos (aminoácidos 260-265) y la secuencia de la proteína de la nucleocápsida completa del aislado europeo de PRRSV (aminoácidos 266-393).
La purificación de dicha proteína se realiza según la metodología descrita por Martínez-Torrecuadrada et al.
[citado supra ] . La proteína de fusión obtenida es insoluble aunque puede solubilizarse fácilmente con cloruro de guanidinio 4 M. La pureza de la proteína de fusión obtenida tras la etapa de solubilización es superior al 80%
(determinado por tinción con azul de Coomassie) .
3.4.2 Análisis por inmunoblot
Las proteínas recombinantes de fusión se transfirieron a membranas de nitrocelulosa utilizando la técnica de transferencia semi-seca (Bio-Rad) durante 20 minutos a 22 Voltios. A continuación, las membranas se incubaron durante 1 hora en solución de bloqueo (3% de leche en desnatada, 0,05% de Tween® 20 en PBS). Después del bloqueo, se hicieron reaccionar las proteínas con los sobrenadantes de unos anticuerpos monoclonales específicos frente a la proteína de la nucleocápsida (identificados como 1AC7, 1AG11, 1DA4, 1BD11, 1EB9, 1CH5 y 1DH10) [Second Simposium on Aujeszky and PRRS viruses, Copenhague, Dinamarca (1995)] durante toda la noche a 4°C. Al cabo de dos lavados con PBS-Tween® 20, el anticuerpo unido se detectó con IgG anti¬ ratón conjugada a peroxidasa (Pierce) diluida 1:2.000 en el tampón de bloqueo. Para revelar el color se añadió 4-cloro- 1-naftol (0,5 mg/ml) (SIGMA) , 17% (v/v) de metanol, y 0,015% de peróxido de hidrógeno en PBS. La reacción se paró añadiendo agua destilada a las membranas. Los anticuerpos porcinos se detectaron utilizando la Proteína A marcada con peroxidasa (SIGMA) siguiendo el mismo protocolo. Los resultados obtenidos confirman que los anticuerpos monoclonales 1AC7, 1AG11 y 1DA4 reconocen la proteína recombinante de fusión que contiene la proteína de la nucleocápsida del aislado europeo de PRRSV por inmuno- blotting.
Se han observado, por inmunoblotting, 3 patrones diferentes de reactividad con los anticuerpos monoclonales, lo que es indicativo de la existencia de 3 sitios antigénicos en la proteína de la nucleocápsida de PRRSV. La región reconocida por los anticuerpos monoclonales 1AC7, 1AG11 y 1DA4 está bien conservada entre los distintos aislados de PRRSV. Los anticuerpos monoclonales 1BD11 y 1EB9 reaccionaron con la proteína de la nucleocápsida completa y podían reconocer tanto un epítopo discontinuo como un epítopo localizado en el sitio de restricción de
EcoNI . Finalmente, los anticuerpos monoclonales 1CH5 y
1DH10 definían otro sitio antigénico y reconocían un epítopo discontinuo que requiere la nucleocápsida completa.
Debido a que el análisis por inmunoblot indicaba la presencia de, al menos, dos epítopos discontinuos, la reactividad de los anticuerpos monoclonales se caracterizó por un ensayo ELISA indirecto bajo condiciones en las que la proteína estuviera más próxima a su plegamiento apropiado .
3.5 ELISA Placas de microtitulación de 96 pocilios (LabSystem) se recubrieron, durante toda la noche, a 4°C, con 100 μl de una dilución 1:100 de la proteína recombinante de fusión conteniendo la proteína de la nucleocápsida del aislado europeo de PRRSV, expresada por E. coli y solubilizada con cloruro de guanidinio 4 M en tampón carbonato 0,05 M, pH 9,6. A continuación, las placas se incubaron con los sobrenadantes sin diluir de los anticuerpos monoclonales o con diluciones seriadas dobles del suero del animal correspondiente durante 2 horas a 37°C. Después de lavar, las placas se incubaron con los conjugados con peroxidasa, de anticuerpos IgG anti-ratón (1:1000) o de proteína A (1:5000) en el mismo tampón que el descrito previamente. La reacción se detectó añadiendo 2 , 2 ' -azino-di [etil] - benzotiazolina [ABTS] (Sigma) como sustrato y se paró por adición de SDS al 1%. La densidad óptica de las muestras se determinó a 405 nm en un lector de ELISA (Bio-Tek Instruments, Estados Unidos). Los resultados obtenidos por ELISA se muestran en la
Tabla 1.
Tabla 1 Caracterización de anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente la proteina de la nucleocápsida de PRRSV
Anticuerpo PRF-E monoclonal Toledo 4/96 1CH5 ++ 1DH10 ++
1BD11 +++
1EB9 +++
1DA4 +++
1AG11 +++ 1AC7 +++
++: > 1,0 unidades de absorbancia (405 nm) +++: > 2,0 unidades de absorbancia (405 nm) PRF-E: proteína recombinante de fusión que contiene la proteína de la nucleocápsida del aislado europeo de PRRSV.
Como puede apreciarse en la Tabla 1, todos los anticuerpos monoclonales reaccionaban con la proteína recombinante de fusión expresada por E. coli . Estos datos confirman que los anticuerpos monoclonales 1CH5 y 1DH10 reconocen un epítopo discontinuo y requieren que la nucleocápsida permanezca parcialmente plegada. Como se esperaba, el resto de los anticuerpos monoclonales dio el mismo patrón de reactividad que el obtenido por inmunoblotting lo que confirma la presencia de otros dos epítopos .
EJEMPLO 4 Expresión de la proteina recombinante de fusión que comprende la ORF7 del aislado americano
4.1 Clonaje de la ORF7 Se repitió exactamente el procedimiento descrito en el Ejemplo 3.1, pero utilizando el producto resultante de la amplificación por PCR del Ejemplo 2, correspondiente a la secuencia completa de la 0RF7 del aislado americano, con lo que al clonarlo en el plásmido pMTL25 previamente digerido con Smal y tratado con fosfatasa se obtuvo el plásmido denominado pPRRSC-0RF7. El DNA plasmídico se secuenció según el método de los didesoxinucleótidos [Sanger et al., citado supra ] , mientras que el análisis de la secuencia de aminoácidos de la proteína se realizó con el programa PC/GENE y PredictProtein [Rost et al., citado supra ] . La secuencia de aminoácidos de la proteína de la nucleocápsida del aislado americano de PRRSV se muestra en la SEC. ID. N°.: 2.
Posteriormente, la secuencia completa que codifica la proteína de la nucleocápsida de PRRSV se subclonó en el plásmido pET3x [Studier et al., Methods Enzymol., 185,
(1990), 60-89] tratado con fosfatasa y digerido con BamHI . El plásmido pET3x conteniendo la secuencia completa de la proteína de la nucleocápsida de PRRSV se denominó pET- PRRSVORFC y se utilizó para transformar células E. coli XLl blue o DH5 competentes . Las colonias resultantes se rastrearon por digestión con las enzimas de restricción apropiadas. Para comprobar la orientación, las secuencias de unión de los insertos se secuenciaron mediante el método de los didesoxinucleótidos [Sanger et al., citado supra ] utilizando el oligonucleótido mostrado en la SEC. ID. N° . : 7 como iniciador.
4.2 Transformación de células de E. coli competentes para la expresión de la proteína recombinante
Tras verificar que la orientación era correcta, se transformaron células BL21 (DE3) pLysS [Studier et al., citado supra ] competentes con el plásmido pET-PRRSVORF7C anteriormente preparado con el fin de expresar la proteína de la nucleocápsida de PRRSV en forma de una proteína de fusión con el producto del gen 10 del fago T7. Para seleccionar las células transformadas se utilizaron placas de agar con cloranfenicol y ampicilina.
4.3 Crecimiento, inducción y análisis de células transformadas de E. coli .
Se crecieron clones de células de E. coli BL21 (DE3) pLysS conteniendo los plásmidos recombinantes pET- PRRSVORF7C y se indujeron con IPTG 0,4 mM (Boehringer Mannheim, Alemania) según el método descrito por Martínez- Torrecuadrada et al. [citado supra ] . Al cabo de 3 horas de inducción, las células se centrifugaron, se lavaron dos veces con tampón fosfato salino (PBS), se resuspendieron en un volumen final de 500 μl de PBS por 20 mi de cultivo y se usaron por sonicación [Martínez-Torrecuadrada et al., citado supra ] .
4.4 Análisis de las proteínas recombinantes
4.4.1 SDS-PAGE
Siguiendo el protocolo descrito en el Ejemplo 3.4.1, se observó una banda intensa correspondiente a una proteína de un tamaño conforme con el peso molecular esperado (45 KDa) y una producción abundante de la proteína recombinante de fusión (0,1 mg/ml) . La secuencia completa de la proteína recombinante de fusión se muestra en la SEC. ID. N° . : 9. La proteína recombinante contiene el resto de aminoácidos derivado del producto del gen 10 de T7 (aminoácidos 1 a 259) , una zona de unión de 4 aminoácidos (aminoácidos 260- 263) y la secuencia de la proteína de la nucleocápsida completa del aislado americano de PRRSV (aminoácidos 264- 386) .
La purificación de dicha proteína se realiza según la metodología descrita por Martínez-Torrecuadrada et al. [citado supra ] . La proteína de fusión obtenida es insoluble aunque puede solubilizarse fácilmente con cloruro de guanidinio 4 M. La pureza de la proteína de fusión obtenida tras la etapa de solubilización es superior al 80% (determinado por tinción con azul de Coomassie) .
4.4.2 Análisis por inmunoblot Se siguió el procedimiento descrito en el Ejemplo 3.4.2., pero usando en este caso la proteína recombinante de fusión conteniendo la proteína de la nucleocápsida del aislado americano de PRRSV.
Los resultados obtenidos muestran que los anticuerpos monoclonales 1AC7, 1AG11 y 1DA4, específicos para la proteína de la nucleocápsida del aislado europeo de PRRSV, reconocen también la proteína recombinante de fusión que contiene la proteína de la nucleocápsida del aislado americano de PRRSV por inmunoblotting.
4.5 ELISA Se siguió el procedimiento descrito en el Ejemplo 3.5 pero utilizando en este caso la proteína recombinante de fusión conteniendo la proteína de la nucleocápsida del aislado americano de PRRSV. Los resultados obtenidos por ELISA se muestran en la Tabla 2. Tabla 2 Caracterización de anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente la proteina de la nucleocápsida de PRRSV
Anticuerpo PRF-C monoclonal Canadá 14/96
1CH5 +/- 1DH10 1BD11 1EB9
1DA4 ++
1AG11 ++
1AC7 ++
-: < 0,2 unidades de absorbancia (405 nm)
+/-: 0,2-0,4 unidades de absorbancia (405 nm) ++ : > 1,0 unidades de absorbancia (405 nm) PRF-C: proteína recombinante de fusión que contiene la proteína de la nucleocápsida del aislado americano de PRRSV.
EJEMPLO 5 Diagnóstico de PRRSV por un ELISA indirecto
Se analizó la reactividad de una colección de 8 sueros de campo procedentes de cerdos de distintas localizaciones geográficas europeas por medio de un ELISA indirecto según la metodología previamente descrita, utilizando como antígenos las proteínas recombinantes de fusión conteniendo la proteína de la nucleocápsida bien del aislado europeo (PRF-E) o bien del aislado americano (PRF-C) obtenidas según los Ejemplos 3 y 4 respectivamente. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 3. Como puede apreciarse, la proteína de la nucleocápsida de PRRSV expresada en E. coli como proteína recombinante de fusión fue reconocida por una colección completa de sueros positivos para PRRSV determinado por ELISA.
Tabla 3 Valoración de sueros de cerdo por ELISA indirecto
Antigeno utilizado Suero PRF-E PRF-C a) Positivos
1036-9 1,534 1,348 1036-2 1,449 0,611
3 Comp 1,898 0,705
12 Comp 1,662 0,775
1032-68 1,619 0,518
1036-1 1,856 0,320 b) Negativos
1032-67 0,330 0,361
PRRSC- 0,207 0,366
[Valores determinados por absorbancia a 405 nm] PRF-E: proteína recombinante de fusión que contiene la proteína de la nucleocápsida del aislado europeo de PRRSV (SEC. ID. N°. : 8) .
PRF-C: proteína recombinante de fusión que contiene la proteína de la nucleocápsida del aislado americano de PRRSV (SEC. ID. N°. : 9) .
Como puede apreciarse, se observa una reacción más específica y mayoritaria frente a la PRF-E, lo que permite la identificación de animales positivos a PRRSV así como distinguir el origen del aislado viral.
EJEMPLO 6 Diagnóstico de PRRSV por un ELISA de competición
Alternativamente al ensayo de ELISA indirecto se puede realizar un ensayo de ELISA de competición donde se combina el uso del antígeno recombinante con la especificidad de los anticuerpos monoclonales. En general, este ensayo es más específico y más sensible.
Para la realización del ELISA de competición, se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocilios (LabSystem) durante toda la noche, a 4°C, con 100 μl (1 μg/pocillo) de la proteína recombinante de fusión que contiene la proteína de la nucleocápsida del aislado europeo de PRRSV expresada en E. coli (Ejemplo 3) solubilizada con cloruro de guanidinio 4 M en tampón carbonato 0,05 M, pH: 9,6. A continuación, se añadieron 100 μl de las muestras de suero a evaluar (15 muestras, 6 positivas y 9 negativas) , diluidas 1/5 en PBS-Tween® 20 0,05%, y se incubaron durante 30 minutos a 37°C. Sin retirar los sueros, se añadieron 50 μl del anticuerpo monoclonal 1CH5 marcado con peroxidasa (1:5000) en el mismo tampón descrito con anterioridad y se continuó la incubación durante 30 minutos más.
La reacción se detectó añadiendo ABTS como sustrato. La reacción se paró por adición de SDS al 1%. La densidad óptica de las muestras se determinó a 405 nm en un lector de ELISA (Bio-Tek Instruments, Estados Unidos) . Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 4.
Tabla 4 Valoración de muestras de campo por ELISA de competición
Sueros •A405 Sueros A405
Positivos Negativos
C19 0,492 1984-1996 PPA1 1,399
C45 0,107 PPA3 1,607
C58 0,130 5 1,646
270 0,710 18 1,476
273 0,559 30 1,276
ING-CP 0,074 MAT Gil 1,534
POOL N 1,704
LECHON 1,555
ING-CN 1,571
El valor del punto de corte (Cut-off) se determinó mediante la fórmula siguiente
Cut-off: CN [CN - CP) x 0,5
donde CN es el valor de la absorbancia a 405 nm del control negativo y CP el del control positivo.
Se considera que una muestra es positiva si el valor de la absorbancia de dicha muestra a 405 nm es menor del valor del cut-off. En caso contrario, la muestra se considera negativa.
Los sueros se habían tipificado previamente por medio de un ensayo de referencia basado en la inmunoperoxidasa (IPMA) [WO 92/21375] .
En conclusión, los resultados de los Ejemplos 5 y 6 ponen de manifiesto la capacidad de las proteínas recombinantes de fusión proporcionadas por esta invención para el diagnóstico indirecto de PRRSV, por detección de anticuerpos frente al virus. DEPOSITO DE MICROORGANISMOS
El plásmido denominado pET-PRRSVORF7E, conteniendo la secuencia nucleotídica completa que codifica la proteína de la nucleocápsida (ORF7) del aislado de PRRSV Toledo 4/96 ha sido depositado el 19 de diciembre de 1996 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) , Burjasot, Valencia (España) , correspondiéndole el número de depósito CECT 4836.
LISTA DE SECUENCIAS
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
(i) SOLICITANTE:
(A) NOMBRE: INMUNOLOGÍA Y GENÉTICA APLICADA, S.A.
(B) CALLE: Hermanos García Noblejas, 41
(C) CIUDAD: Madrid
(D) PROVINCIA: Madrid
(E) PAÍS: España
(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : 28037
(G) TELEFONO: (91) 368 05 01 (H) FAX: (91) 408 75 98
(ii) TITULO DE LA INVENCIÓN:
PROTEÍNAS RECOMBINANTES DE FUSIÓN DEL VIRUS DEL SÍNDROME REPRODUCTIVO Y RESPIRATORIO PORCINO (PRRSV) Y SU EMPLEO EN DIAGNOSTICO
(iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 9
(iv) FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
(A) TIPO DE SOPORTE: Floppy disk
(B) ORDENADOR: IBM PC compatible
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (OEP)
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 1:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 128 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) NUMERO DE CADENAS:
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
(vi) ORIGEN:
(A) ORGANISMO: PRRSV
(B) CEPA: EUROPEA
(C) AISLADO INDIVIDUAL: TOLEDO 4/96
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
Met Ala Gly Lys Asn Gln Ser Gln Lys Lys Lys Lys Ser Ala Ala Pro 1 5 10 15
Met Gly Asn Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu Lys Gln Leu Leu Gly Ala 20 25 30 Met lie Lys Ser Gln Arg Gln Gln Pro Arg Gly Gly Gln Ala Lys Lys 35 40 45
Lys Lys Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Ala Glu Asp Asp lie 50 55 60
Arg His His Leu Thr Gln Thr Glu Arg Ser Leu Cys Leu Gln Ser lie 65 70 75 80
Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Ala Ser Leu Ser Ser Ser
85 90 95
Gly Lys Val Ser Phe Gln Val Glu Phe Met Leu Pro Val Ala His Thr 100 105 110
Val Arg Leu lie Arg Val Thr Ser Thr Ser Ala Ser Gln Gly Ala Ser 115 120 125
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 2:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 123 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) NUMERO DE CADENAS:
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
(vi) ORIGEN:
(A) ORGANISMO: PRRSV
(B) CEPA: AMERICANA
(C) AISLADO INDIVIDUAL: CANADÁ 14/96
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
Met Pro Asn Asn Thr Gly Arg Gln Gln Lys Lys Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15
Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys lie lie Ala Gln 20 25 30
Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 50 55
Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60
His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser lie Gln 65 70 75 80
Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly
85 90 95 Arg lie Ser Tyr Ala Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110
Arg Leu lie Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 3:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 21 bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) NUMERO DE CADENAS: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: Acido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: DNA sintético
(iii) HIPOTÉTICA: NO
(iv) ANTISENTIDO: NO
(vi) ORIGEN:
(A) ORGANISMO: PRRSV
(B) CEPA: EUROPEA
(C) AISLADO INDIVIDUAL: TOLEDO 4/96
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3: CCTCGTCAAG TATGGCCGGT A 21
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 4:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 23 bases
(B) TIPO: Acido nucleico
(C) NUMERO DE CADENAS: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: Acido nucleico
(A) DESCRIPCIÓN: DNA sintético (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: SI
(vi) ORIGEN:
(A) ORGANISMO: PRRSV
(B) CEPA: EUROPEA
(C) AISLADO INDIVIDUAL: TOLEDO 4/96
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4: GACTGTCAAA TTAGCTTGCA CCC 23
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 5:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 21 bases
(B) TIPO: Acido nucleico
(C) NUMERO DE CADENAS: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: Acido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: DNA sintético
(iii) HIPOTÉTICA: NO
(iv) ANTISENTIDO: NO
(vi) ORIGEN:
(A) ORGANISMO: PRRSV
(B) CEPA: AMERICANA
(C) AISLADO INDIVIDUAL: CANAD 14/96
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5: TAAATATGCC AAATAACACC G 21
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 6:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 18 bases
(B) TIPO: Acido nucleico
(C) NUMERO DE CADENAS: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: Acido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: DNA sintético
(iii) HIPOTÉTICA: NO
(iv) ANTISENTIDO: SI
(vi) ORIGEN:
(A) ORGANISMO: PRRSV
(B) CEPA: AMERICANA
(C) AISLADO INDIVIDUAL: CANADÁ 14/96
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6: CCATCATGAG GGTGATCC 18
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 20 bases
(B) TIPO: Acido nucleico
(C) NUMERO DE CADENAS: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: Acido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: DNA sintético
(iii) HIPOTÉTICA: NO
(iv) ANTISENTIDO: NO
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7: CTATCCGCAA CGTTATGGGC 20
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 8:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 393 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) NUMERO DE CADENAS:
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
(vi) ORIGEN:
(A) ORGANISMO: PRRSV
(B) CEPA: EUROPEA
(C) AISLADO INDIVIDUAL: TOLEDO 4/96
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8:
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Thr Asn Gln Gly Lys 1 5 10 15
Gly Val Val Ala Ala Gly Asp Lys Leu Ala Leu Phe Leu Lys Val Phe 20 25 30
Gly Gly Glu Val Leu Thr Ala Phe Ala Arg Thr Ser Val Thr Thr Ser 35 40 45
Arg His Met Val Arg Ser lie Ser Ser Gly Lys Ser Ala Gln Phe Pro 50 55 60
Val Leu Gly Arg Thr Gln Ala Ala Tyr Leu Ala Pro Gly Glu Asn Leu 65 70 75 80
Asp Asp Lys Arg Lys Asp lie Lys His Thr Glu Lys Val lie Thr lie
85 90 95 Asp Gly Leu Leu Thr Ala Asp Val Leu lie Tyr Asp lie Glu Asp Ala 100 105 110
Met Asn His Tyr Asp Val Arg Ser Glu Tyr Thr Ser Gln Leu Gly Glu 115 120 125
Ser Leu Ala Met Ala Ala Asp Gly Ala Val Leu Ala Glu lie Ala Gly 130 135 140
Leu Cys Asn Val Glu Ser Lys Tyr Asn Glu Asn lie Glu Gly Leu Gly 145 150 155 160
Thr Ala Thr Val lie Glu Thr Thr Gln Asn Lys Ala Ala Leu Thr Asp
165 170 175
Gln Val Ala Leu Gly Lys Glu lie lie Ala Ala Leu Thr Lys Ala Arg 180 185 190
Ala Ala Leu Thr Lys Asn Tyr Val Pro Ala Ala Asp Arg Val Phe Tyr 195 200 205
Cys Asp Pro Asp Ser Tyr Ser Ala lie Leu Ala Ala Leu Met Pro Asn 210 215 220
Ala Ala Asn Tyr Ala Ala Leu lie Asp Pro Glu Lys Gly Ser lie Arg 225 230 235 240
Asn Val Met Gly Phe Glu Val Val Glu Val Pro His Leu Thr Ala Gly
245 250 255
Gly Ala Gly Ser Pro Thr Ser Ser Ser Met Ala Gly Lys Asn Gln Ser 260 265 270
Gln Lys Lys Lys Lys Ser Ala Ala Pro Met Gly Asn Gly Gln Pro Val 275 280 285
Asn Gln Leu Cys Gln Leu Leu Gly Ala Met lie Lys Ser Gln Arg Gln 290 295 300
Gln Pro Arg Gly Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Pro Glu Lys Pro His 305 310 315 320
Phe Pro Leu Ala Ala Glu Asp Asp lie Arg His His Leu Thr Gln Thr
325 330 335
Glu Arg Ser Leu Cys Leu Gln Ser lie Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly 340 345 350
Ala Gly Thr Ala Ser Leu Ser Ser Ser Gly Lys Val Ser Phe Gln Val 355 360 365 Glu Phe Met Leu Pro Val Ala His Thr Val Arg Leu He Arg Val Thr 370 375 380
Ser Thr Ser Ala Ser Gln Gly Ala Ser 385 390
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 9:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 386 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) NUMERO DE CADENAS: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
(vi) ORIGEN:
(A) ORGANISMO: PRRSV
(B) CEPA: AMERICANA
(C) AISLADO INDIVIDUAL: CANADÁ 14/96
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9:
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Thr Asn Gln Gly Lys 1 5 10 15
Gly Val Val Ala Ala Gly Asp Lys Leu Ala Leu Phe Leu Lys Val Phe 20 25 30
Gly Gly Glu Val Leu Thr Ala Phe Ala Arg Thr Ser Val Thr Thr Ser 35 40 45
Arg His Met Val Arg Ser He Ser Ser Gly Lys Ser Ala Gln Phe Pro 50 55 60
Val Leu Gly Arg Thr Gln Ala Ala Tyr Leu Ala Pro Gly Glu Asn Leu 65 70 75 80
Asp Asp Lys Arg Lys Asp He Lys His Thr Glu Lys Val He Thr He
85 90 95
Asp Gly Leu Leu Thr Ala Asp Val Leu He Tyr Asp He Glu Asp Ala 100 105 110
Met Asn His Tyr Asp Val Arg Ser Glu Tyr Thr Ser Gln Leu Gly Glu 115 120 125
Ser Leu Ala Met Ala Ala Asp Gly Ala Val Leu Ala Glu He Ala Gly 130 135 140
Leu Cys Asn Val Glu Ser Lys Tyr Asn Glu Asn He Glu Gly Leu Gly 145 150 155 160 Thr Ala Thr Val He Glu Thr Thr Gln Asn Lys Ala Ala Leu Thr Asp
165 170 175
Gln Val Ala Leu Gly Lys Glu He He Ala Ala Leu Thr Lys Ala Arg 180 185 190
Ala Ala Leu Thr Lys Asn Tyr Val Pro Ala Ala Asp Arg Val Phe Tyr 195 200 205
Cys Asp Pro Asp Ser Tyr Ser Ala He Leu Ala Ala Leu Met Pro Asn 210 215 220
Ala Ala Asn Tyr Ala Ala Leu He Asp Pro Glu Lys Gly Ser He Arg 225 230 235 240
Asn Val Met Gly Phe Glu Val Val Glu Val Pro His Leu Thr Ala Gly
245 250 255
Gly Ala Gly Asp Pro Leu Gly Met Pro Asn Asn Thr Gly Arg Gln Gln 260 265 270
Lys Lys Lys Lys Gly Asp Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met 275 280 285
Leu Gly Lys He He Ala Gln Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro 290 295 300
Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu 305 310 315 320
Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln
325 330 335
Leu Cys Leu Ser Ser He Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr 340 345 350
Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly Arg He Ser Tyr Ala Val Glu Phe Ser 355 360 365
Leu Pro Thr His His Thr Val Arg Leu He Arg Val Thr Ala Ser Pro 370 375 380
Ser Ala 385

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una proteína recombinante de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína de la nucleocápsida de PRRSV.
2. Una proteína según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias identificadas como SEC. ID. N° . : 1 y SEC. ID. N°.: 2, o un fragmento activo de las mismas.
3. Una proteína según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre la SEC. ID. N°.: 1 y la SEC. ID. N° . : 2, o un fragmento activo de las mismas, fusionada a un resto de 259 aminoácidos procedentes de la proteína del gen 10 del fago T7.
4. Una proteína según la reivindicación 3, en la que la secuencia de aminoácidos seleccionada entre la SEC. ID.
N° . : 1 y la SEC. ID. N° . : 2, o un fragmento activo de las mismas, está fusionada al resto de 259 aminoácidos procedentes de la proteína del gen 10 del fago T7 por medio de una zona de unión de 4 a 6 aminoácidos.
5. Una proteína según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre la SEC. ID. N°.: 8 y la SEC. ID. N° . : 9.
6. Una secuencia de ácido nucleico que esencialmente codifica una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Método para el diagnóstico de PRRSV que comprende poner en contacto una muestra biológica de un animal con una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo y detectar el complejo formado.
8. Kit para el diagnóstico de PRRSV que comprende una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
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