明 細 書
組織繊維化抑制剤 技術分野
本発明は、 アルギニン分解酵素、 アルギニン分解酵素の変異体あるいはそれ らの修飾体を有効成分として含む、 組織の繊維化抑制剤に関する。 また、 本発 明は、 ヒ トアルギナーゼをコー ドする DNA、 ラッ トアルギナーゼをコー ドす る DNA、 該 DN Aを含む組み換えべクタ一、 該ベクタ一を導入した形質転換 体、 並びに該形質転換体を利用して、 アルギナーゼを製造する方法に関する。 背景技術
肝臓 [ハン ドブクス ' デァ ' スピツイ レン ' パソロジェ(Handbuch der Sp eziellen Pathologie), 5, 243 (1930) ] 、 肺 [ブル ジョ ンズ · ホプキン ス ' ホスピタル(Bull. Johns Hopkins Hosp), 74, 177, (1944)] 、 腎臓 [ジャ ーナル ' ォブ ' クリニカルパソロジ一(J. Clin. Pathol. ), 34, 616, (1981)] 、 滕臓 [ツエン トラルブレッ ト ' フィ 'パソロジェ(Zentralblatt fr Patholo gie), 16, 903, (1905)] 、 皮膚 [フィ ジオロジー ' アン ド ' ノ、。ソロジー · ォ ブ .ザ . リ ンフォ ' ベッセル ' システム イン ' リ ンフォ ' ベッセル ' システ ム (Physiology and Pathology or the lymph vessel system. In : Lymph vessel system), Meessen, H. Springer, Berl in- Heidelberg- New York, 1
972年、 239頁] などの組織の繊維化が進行することによって、 前記の器官にお ける各疾患が悪化することが知られている。
肝臓疾患は、 まず急性肝炎が起こり、 それらの一部が慢性化すると慢性肝炎 となり、 長い年月を経て肝硬変に進行する。 それに、 肝癌が合併すれば致命的 となる。
急性肝炎が直らなければ、 慢性肝炎に至るが、 その時には、 肝細胞の連続的 な損傷に伴う再生が見られ、 殆どの場合充分な肝機能を保っている。 そのよう な患者はいつまでも正常な生活を続けられる。
肝炎が持続すると、 一方では、 壊死した肝細胞を貪食するためにマクロファ
—ジが活性化し、 他方では、 伊東細胞と呼ばれる脂肪摂取細胞等が、 繊維芽細 胞に形質転換、 増殖される。 それらの細胞が繊維を増生し、 肝小葉を破壊する 。 それに肝細胞増殖が伴って肝硬変を引き起こし、 その結果肝機能が徐々に低 下して、 肝不全あるいは肝硬変合併症を起こし、 死に至る。
そこで、 肝硬変の予防ができれば、 充分な肝機能を保つ慢性肝炎患者の長期 生存が期待される。 また、 肝癌は主に肝硬変に合併するため、 肝硬変の予防は 、 肝癌予防にもつながる。 そこで、 肝硬変予防は肝疾患において最も望ましい 治療法である。
肝炎は主にウィルス性肝炎とアルコール性肝炎に分類される。 急性ウィルス 性肝炎の 1 0〜 5 0 %は慢性肝炎に移行する。 慢性肝炎の完治法が無いのでほ とんどの患者は、 繊維化が進行し、 肝硬変に至る。 慢性肝炎期に徐々に進行す る肝臓の繊維化は、 主に肝臓の門脈域を中心とした類洞の内皮に存在する伊東 細胞が繊維芽細胞に形質転換、 増殖し、 繊維素を分泌することにより起こる。 すなわち、 肝臓の繊維化には、 伊東細胞が主たる役割を果たしていると理解さ れている。 アルコール性肝炎では脂肪肝に続き、 早期から肝の繊維化が進行す る。 繊維化はウィルス性肝炎と同様に、 おもに伊東細胞の形質転換、 増殖によ る しセミナ一ス ' イ ン · リノ、一 - ティ ン一ス (Semi nars i n L i ver Di sease) , 10巻、 30頁、 1990年] 。
以上の結果より、 伊東細胞の繊維芽細胞への形質転換とそれらの増殖を抑制 することができれば、 肝臓の繊維化は抑制され、 肝硬変や肝癌の発生を抑制す ることができるものと期待される [モレキュラー ' メディシン(Mol ecular Med i c ine), 31, 2, ( 1994) ] 。
肝臓疾患治療法としては、 第一に肝疾患末期に肝を取り替える、 肝臓移植が あげられる。 肝臓移植には、 以下に述べる問題点がある。 a)肝移植の需要に対 して臓器提供者が不足している。 b)移植を受けた場合、 拒絶反応が生じ、 免疫 抑制剤による副作用におかされる。 c)移植には高額の費用がかかる。
第二には、 肝炎ウィルスの感染予防と、 感染後生体内でウィルスを殺す治療 法があげられるが、 新規ウィルスの発生や、 ウィルス自体が突然変異を起こす ことなどがあって、 肝炎の完全な治癒は不可能と考えられている。
現在利用されている肝臓疾患治療薬には、 肝細胞の機能低下を捕ういわゆる 肝機能改善薬、 炎症を沈静化するための抗炎症剤、 あるいは肝癌を治療するた めの抗癌剤などがある。 しかしながら、 肝機能改善薬は対処療法剤であり、 肝 疾患の進行を阻止できるものではない。 また、 抗炎症剤としてはステロイ ド類 が用いられるが非特異的であり、 副作用が強い。
上記以外の肝臓疾患治療薬として、 肝炎で壊死した肝細胞の再生を促進する 治療薬、 もしくは肝硬変への移行を抑制するための肝繊維化抑制薬が望まれて いる。 最近、 肝細胞の再生を促進する物質として肝細胞増殖因子 (HGF) [バイ オケミカル ' アンド 'バイオフィジカル · リサーチ · コミュニケーション(Bio chemical and Biophysical Res. Communications 以下 B. B. R. C.と略記する)
, 122, 1450, (1984)] および肝細胞増殖物質 (W094/21678) などが報告され ている。 また、 肝臓の繊維化抑制薬としては、 繊維を構成するタンパク質であ るコラーゲンの合成阻害剤 (第 3 1回日本肝臓学会総会講演要旨、 1 9 9 5年 、 1 0 1頁) およびコラーゲン原繊維の架橋阻害剤 (第 3 1回日本肝臓学会総 会講演要旨、 1 9 9 5年、 6 2頁) などで検討されているカ'、 臨床試験におけ る有効性を確認するに至っていない。 繊維素を分泌する繊維芽細胞や繊維芽細 胞に形質転換する伊東細胞の形質転換および/または増殖を抑制する物質はこ れまでのところ知られていない。
さらに、 腎臓、 肺、 膝臓、 あるいは皮膚などの組織においても、 繊維化は重 篤な疾患につながるが、 繊維化を抑制する物質もこれまでのところ知られてい ない。
ところで、 これまでに、 アルギナーゼ、 アルギニンディミナーゼなどがアル ギニン分解酵素として知られている。
アルギナ一ゼには肝細胞内で尿素サイクルを担っているアルギナーゼ [J. Bi ol. Chem. 239^ 3808(1994) ] の他に、 ラッ 卜の腎臓および乳腺由来のアルギ ナーゼ [バイオケミカル · メディシン ' アン ド ' メ夕ボリ ック 'バイオロジー (Biochemical Medicine & Metabolic Biology), 51, 156, (1994)] 、 ヒ 卜の 赤血球由来のアルギナ一ゼ [バイオケミカル ' ジャーナル(Biochem. J. ), 175 , 449, (1978)] 、 マウスのマクロファージ由来のアルギナーゼ [B. B. R. C. '20
3 , 1614, (1994)] 等が知られている。
アルギナ一ゼ ©cDNAについてはヒ 卜およびラッ 卜の肝細胞由来のアルギナー ゼのみが知られているが、 これらと他のアルギナ一ゼとの相違については幾つ か報告 [バイオ口ジカル ' ケミストリー ' ホッぺ—セイラー(Biological Chem istry Hoppe-Seyler) 375, 537, (1994)] があるものの明らかではない。 これ までにヒ 卜の肝細胞由来アルギナーゼ遺伝子 [プロシ一ディ ングス ·ォブ .ザ • ナショナル ' アカデミー 'ォブ 'サンエンス · U. S. A. (以下 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.) 84, 412, (1987) ; ヌクレイック . アシッ ド . リサーチ(以下 Nuc leic Acids Res. ), 16, 8789, (1988)] およびラッ トの肝細胞由来アルギナー ゼ遺伝子 [Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.84, 412, (1987) ;ザ ' ジャーナル . ォブ 'バイオロジカル ' ケミストリ一 (以下 J. Biol. Chem.) 262, 6280, (1987 ) ; J. Biol. Chem. 263 , 2245, (1988)] についてクローニングされている。 アルギナ一ゼを生体内投与した際の生物活性としては、 一酸化窒素の産生抑 制 [FEBS Letters, 366, 127, (1995)] 、 肝癌細胞の増殖抑制 [キャンサー . オケミストリ一 . ィォフィジックス(Cancer Biochemistry Biophysics) , 13, (3), 171, (1993)] 、 抗毒素成分との合剤での肝機能改善 (フランス特 許、 FR7722M、 1968年) などが報告されている。 しかし、 アルギナ一ゼの繊 維芽細胞増殖抑制活性、 伊東細胞に対する形質転換および増殖抑制活性、 組織 繊維化抑制活性に関しては報告されていない。
アルギナ一ゼ変異体としては、 アルギナ一ゼ中のヒスチジンを他のァミノ酸 に置換したものが知られている。 このようなァルギナーゼ変異体を発現させて 、 その活性を調べたところ、 特定のヒスチジンが 2価金属との結合部位であり 、 アルギナーゼ活性に重要な役割を果たしていることがわかった [バイオケミ ストリー(以下 Biochemistryと記す) , , 10652, (1994)] 。 し力、し、 アルギ ナーゼ活性、 酵素安定性、 あるいは臓器送達性に優れたアルギナ一ゼ変異体は 報告されていない。
アルギナ一ゼ修飾体としては、 アルギナ一ゼのポリエチレングリコール修飾 体 [Cancer Biochemistry Biophysics, 13, 171, (1993)] 、 マイコプラズマ 由来のアルギニンディ ミナーゼのポリエチレングリコール修飾体 [ジャパ二一
X · ジャ一ナノレ · オフ' · キャンサー · リサ一チ (Japanese Journal of Cancer Research), 84, . 1195, (1993)] などが報告されており、 血中安定性の向上や 抗原性の低下が期待されている。 しかし、 ヒ トアルギナーゼに関する検討は報 告されておらず、 また、 アルギナ一ゼの糖付加体およびアルギナーゼの架橋体 についてもこれまでのところ報告されていない。
肝臓、 腎臓、 肺、 脬臓、 あるいは皮膚などの組織において、 組織が繊維化を 起こすと重篤な疾患につながるが、 組織の繊維化を抑制する物質はこれまでの ところ知られていない。
本発明の目的は、 組織の繊維化において重要な役割を果たす繊維芽細胞へ形 質転換する細胞の形質転換や増殖、 そして繊維芽細胞の増殖を抑制することに よって繊維化を防ぐ物質あるいはその誘導体により組織の繊維化の進行を抑制 すること、 さらには、 血中安定性および臓器送達性の優れた組織繊維化抑制剤 を提供することにある。 発明の開示
本発明者らは、 その組織が繊維化することにより重篤な疾患となる臓器のひ とつである肝臓の繊維化において重要な役割を果たす伊東細胞の繊維芽細胞へ の形質転換、 増殖および繊維芽細胞の増殖を抑制する物質として、 アルギニン 分解酵素、 アルギニン分解酵素の変異体あるいはそれらの修飾体を見い出し、 本発明を完成させるに至った。 すなわち、 本発明は、 アルギニン分解酵素、 ァ ルギニン分解酵素の変異体あるいはそれらの修飾体を有効成分として含む組織 繊維化抑制剤を提供する。 アルギニン分解酵素としてはアルギナ一ゼ、 アルギ ニンディ ミナ一ゼ等が挙げられる。 アルギナ一ゼとしては、 例えば、 ヒ トアル ギナ一ゼ、 ラッ トアルギナ一ゼ等が挙げられ、 これらのアルギナーゼは、 動物 の肝臓より抽出後精製されたアルギナーゼであっても、 遺伝子工学的手法を用 いて製造されたアルギナ一ゼであってもよい。 アルギニン分解酵素の修飾体と しては、 例えばポリエチレングリコール修飾アルギナ一ゼ等が挙げられる。 本 発明の組織繊維化抑制剤は、 肝臓、 腎臓、 肺、 脖臓または皮膚の組織の繊維化 抑制に特に有効である。
また、 本発明は、 配列番号 7の塩基配列からなる DNAもしくは該 DNAと ス ト リ ンジェン トな条件下でハイブリダイズし、 かつ、 繊維化抑制活性を有す るヒ トアルギナーゼをコードする DNAを提供する。 また本発明は、 該 DNA を含む組み換えベクター、 該組み換えベクターを宿主に導入して得られる形質 転換体、 および該形質転換体を培地に培養し、 培養液中にヒ トアルギナーゼを 生成蓄積させ、 該培養物からヒ トアルギナーゼを採取することを特徴とするヒ トアルギナーゼの製造方法を提供する。
また、 本発明は、 配列番号 9の塩基配列からなる DNAもしくは該 DNAと ス ト リ ンジェン 卜な条件下でハイブリダイズし、 かつ、 繊維化抑制活性を有す るラッ トアルギナ一ゼをコードする DNAを提供する。 また本発明は、 該 DN Aを含む組み換えべクタ一、 該組み換えべクタ一を宿主に導入して得られる形 質転換体、 および該形質転換体を培地に培養し、 培養液中に本発明ラッ トアル ギナ一ゼを生成蓄積させ、 該培養物からラッ トアルギナ一ゼを採取することを 特徴とするラッ 卜アルギナ一ゼの製造方法を提供する。 図面の簡単な説明
第 1図は、 肝臓の灌流液を調製する方法を示す。
第 2図は、 肝繊維化グレードの判定基準を示す。 a, b, c, dはそれぞれ肝繊 維化グレード 0、 1、 2、 3の典型的なシリウスレッ ド (Sirius red) F 3 B A染色像である。
第 3図は、 ラッ 卜に四塩化炭素を投与して肝傷害を起こした後、 肝灌流液を in vivoで投与し、 肝繊維化抑制活性を測定した結果を示す。
第 4図は、 肝灌流液の Rat2細胞増殖抑制活性測定における希釈定量法 (dilu t ion assay) の結果を示す。
第 5図は、 ラッ 卜肝灌流液を Mo n o Sカラムクロマトグラフィ一で精製し た際の溶出パターンを示す。
第 6図は、 Mo n o Sカラムクロマトグラフィ一で溶出された Rat2細胞増殖 抑制活性を含む画分をブル一セルロファインカラムクロマトグラフィ一で精製 した際の溶出パターンを示す。
第 7図は、 ブルーセルロファインカラムクロマトグラフィ一で溶出された画 分の Rat2細胞増殖抑制活性を示す。
第 8図は、 ブルーセルロファインカラムクロマトグラフィ一で溶出された Ra t2細胞増殖抑制活性を含む画分をレツ ドセファロ一ス C L一 6 Bカラムクロマ トグラフィ一で精製した際の溶出パターンを示す。
第 9図は、 肝灌流液と精製アルギナーゼによる伊東細胞の形質転換の抑制を 示す。
第 1 0図は、 プラスミ ド pNSの造成工程を示す。
第 1 1図は、 プラスミ ド p N'S-hArglの造成工程を示す。
第 1 2図は、 プラスミ ド p NS-rArglの造成工程を示す。
第 1 3図は、 ラッ トに P B S、 ラッ トァルギナーゼ、 ポリエチレングリコ一 ル修飾ラッ トアルギナ一ゼを投与し、 1、 3、 6および 2 4時間後に採血した 血漿中のアルギニン濃度の測定結果を示す。
第 1 4図は、 ラッ トに P B S、 ポリエチレングリコール修飾ラッ トアルギナ —ゼを投与し、 1、 3、 7、 1 0および 1 4日後に採血した血漿中のアルギニ ン濃度の測定結果を示す。
第 1 5図は、 ラッ トに P B S、 ラッ トアルギナ一ゼ、 P E G修飾ラッ トアル ギナ一ゼを投与し、 1、 3、 6および 2 4時間後に採血した血漿中のアルギナ ーゼ活性の測定結果を示す。
第 1 6図は、 ラッ トに P B S、 P E G修飾ラッ トアルギナ一ゼを投与し、 1 、 3、 7、 1 0および 1 4日後に採血した血漿中のアルギナ—ゼ活性の測定結 果を示す。 発明を実施するための最良の形態
アルギニン分解酵素とは、 アルギニンを分解する酵素である。 アルギニン分 解酵素には、 アルギナーゼ、 アルギニンディミナーゼなどがある。 アルギナー ゼは、 L一アルギニンを L一オル二チンと尿素に加水分解する酵素であり、 脊 椎動物の肝臓や腎臓をはじめ、 植物根や胚芽、 あるいは微生物に広く分布して いる。 ヒ ト体内においては窒素代謝の役割の一部を担っているとされる。 アル
ギニンディミナ一ゼは、 L —アルギニンを L —シトルリンとアンモニアに加水 分解する酵素である。
アルギニン分解酵素は、 肝臓、 腎臓、 肺、 脖あるいは皮膚などの臓器、 好ま しくは肝臓を灌流した溶液、 臓器好ましくは肝臓をホモジナイズし、 不溶物を 遠心分離して得られた抽出液あるいは血清などから単離精製することより得る ことができる。 また、 遺伝子工学的手法を用いても得ることができる。
肝臓、 腎臓、 肺、 膝あるいは皮膚などの臓器、 好ましくは肝臓を灌流した溶 液よりアルギニン分解酵素を調製する方法としては、 生体内より臓器を摘出し 、 適当な緩衝液で灌流する方法があげられる。 以下に肝臓を例にとってアルギ ニン分解酵素の調製法を具体的に説明する。
肝臓の摘出は、 リーらの方法 [サージリ一 ' フォーラム(以下 Surg. Forumと 略記する), 17, 220, (1966) ] に準じて行うことができる。 その他の方法でも 、 肝臓自体と血管系を破損しない方法であれば、 肝臓を摘出できる。 好ましく は、 門脈と肝上部下大静脈に灌流用のカテーテルが挿入されている以外は、 肝 組織に出入りするすべての血管系を閉じ、 灌流の際液漏れが起こらないように 摘出する方法がよい。
肝臓の灌流法としては、 液もれを起こさないように灌流できる方法であれば いかなる方法でもよいが、 好ましくは、 摘出ラッ ト肝臓を 1 0〜 4 0 °C好まし くは 1 5〜 3 0 °C、 最も好ましくは 2 0でで、 3〜 2 0時間、 好ましくは 5〜 1 0時間、 最も好ましくは 6時間放置後、 肝 1 g当たり 1〜 5 0 m 1、 好まし くは 1〜 1 0 mし 最も好ましくは 2 m 1の 1 0〜 4 0 °C、 好ましくは 1 5〜 3 0 °C、 最も好ましくは 2 0 °Cのリンガー(Ri nger)溶液で肝を門脈から灌流す る。 流速は肝 l g当たり、 0 . 1〜 5 m 1 /分、 好ましくは 0 . 5〜2 m l / 分、 最も好ましくは 1 m 1 /分とする。 このようにインビトロ(i n v i tro)で肝 を灌流し、 同じ灌流液で 0〜 5時間、 好ましくは 3 0分の間隔をおいて 1〜 2 0回、 好ましくは 5回灌流した後、 灌流液を回収する。 さらに、 同じ肝をまた 新たなリンガー溶液で上記と同様に灌流することができる。 灌流に用いる溶液 は、 リンガー溶液以外にも、 p Hが中性付近で生理食塩水と同程度の浸透圧を 持つ緩衝液であれば、 肝灌流液の調製に用いることができる。 例えば、 ハンク
ス平衡塩類溶液 (Hank's Balanced Salt Solution) 、 ダルベッコリン酸緩衝 生理食塩溶液 (Dulbecco' s Phosphate- Buffered Saline) 、 アール平衡塩類溶 液 (Earle's Balanced Salt Solution) 、 ゲイ平衡塩類溶液 (Gey' s Balanced Salt Solution) 、 プック生理食塩溶液 (Puck's Saline ) などがあげられる。 臓器、 好ましくは肝臓を適当な水溶液中でホモジナイズし、 不溶物を遠心分 離して得られる抽出液、 あるいは血清からも単離精製を行うことによりアルギ ニン分解酵素を得ることができる。 単離精製については、 溶媒抽出、 有機溶媒 による分別沈殿、 塩析、 透析、 遠心分離、 限外ろ過、 イオン交換クロマトグラ フィ一、 ゲルろ過クロマ トグラフィー、 疎水性クロマ トグラフィー、 ァフィ二 ティークロマトグラフィー、 逆相クロマトグラフィー、 結晶化、 電気泳動など の分離操作を単独あるいは組み合わせて行うことができる。 生体試料からのァ ルギニン分解酵素の精製について、 ラッ トおよびヒ 卜の肝臓から、 陽イオン交 換担体クロマトグラフィー等を用いた方法もある U. Biol. Chem, 239, 3808 , (1964)、 ァ一カイヴス ' バイオケミス ト リ一 ' アン ド ' バイオフィ ジックス (Arch. Biochem. Biophys. ) , 320, 24, (1995)] 。
また、 遺伝子組換え技術を利用して、 アルギニン分解酵素、 さらにはアルギ 二ン分解酵素の変異体を得ることができる。
アルギニン分解酵素あるいはアルギニン分解酵素変異体とは、 例えば、 配列 番号 8のアミノ酸配列からなるヒ トアルギナ一ゼ、 配列番号 1 0のアミノ酸配 列からなるラッ トアルギナ一ゼ、 または該ヒ トアルギナ一ゼおよび該ラッ トァ ルギナ一ゼにおいて 1個以上のァミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたァミ ノ酸配列からなり、 かつ繊維化抑制活性を有するものなどが含まれる。
アルギニン分解酵素あるいはアルギニン分解酵素変異体をコードする D N A としては、 例えば、 配列番号 7あるいは配列番号 9の塩基配列からなる DN A もしくは該 D N Aとス ト リ ンジヱ ン トな条件下でハイブリダイズする D N Aな どがあげられる。
配列番号 7あるいは配列番号 9の塩基配列とストリ ンジユン卜な条件下でハ イブリダイズする DN Aとは、 該 DNAにコ一ドされるタンパク質が繊維化抑
制活性を失わない範囲内で、 該塩基配列に置換、 欠失、 挿入あるいは付加など の変異が一力所以上導入された DN Aで、 配列番号 7あるいは配列番号 9記載 の塩基配列を有する DN Aをプローブとして、 コロニー ·ハイブリダイゼ一シ ョン法あるいはプラーク ·ハイプリダイゼーシヨン法 [モレキュラー ' クロ一 ニング: ァ ' ラボラ トリ一 ' マ二ュァノレ(Molecular Cloning, A laboratory m anual)、 第 2版 〔サンブルック(Sambrook)、 フリ ッチ(Fr i tsch) 、 マニアチス (Maniatis)編集、 コ一ルド · スプリング ·ハ一バー ' ラボラ トリー 'プレス(C old Spring Harbor Laboratory Press) 、 1 9 8 9年刊〕 、 以下、 モレキユラ 一 ' クロ一ニング: ァ ' ラボラ トリ一 'マニュアル 第 2版と略記する] によ り得られる DNAを示す。 具体的な方法として、 コロニーあるいはプラーク由 来の DN Aを固定化したフィルターを用いて、 0.7〜1.0 M の NaClの存在下で 、 配列番号 7あるいは配列番号 9の塩基配列を有する DN Aを基質としてラン ダムプライマ一法 [モレキュラー ' クローニング: ァ * ラボラ トリ一 . マニュ アル 第 2版に記載の方法、 あるいは市販のキッ ト、 例えばランダム ' プライ ムド · DNA · ラベリング 'キッ ト (Random Primed DNA Labeling Kit) ベーリ ンガー ·マンハイム (Boehringer Mannheim) 社製などを用いて行なうこと力く できる。 ] により調製したプローブと、 65°Cでハイブリダィゼ一シヨンを行つ た後、 0.1~2倍濃度の S S C溶液 ( 1倍濃度 S S C溶液とは、 150 mM NaCK 15 m クェン酸ナトリゥムよりなる) 中、 65°Cでフィルタ一を洗浄することに より同定できる DN Aを包含する。
アルギニン分解酵素及びアルギニン分解酵素の変異体をコ一ドする DN Aの 調製および発現は、 モレキュラー · クロ一ニング: ァ ' ラボラ トリー . マニュ アル (第 2版) 、 カレント ' プロ トコールズ ' イン 'モレキュラー ·ノくィォロ ジー (Current Protocols in Molecular Biology) 、 サプルメン ト 1-3 4 (Su pplement 1-34) [グリーン 'パブリ シング ' ァソシエイッ ' アン ド ' ウェイ リ一ィンタ一サイエンス(Greene Publishing Associates and Wi ley-Intersci ence)発行、 1987- 1996年版、 以下、 カレン ト 'プロ トコールズ♦ イン · モレキ ユラ— .バイオロジー、 サプルメン ト卜 3 4と略記する]等に記載された方法 によって、 行なうことができる。
アルギニン分解酵素及びアルギニン分解酵素の変異体をコードする DNAは 、 以下の方法に従って調製することができる。
ヒ トあるいはラッ トの組織好ましくは肝臓、 あるいは、 培養細胞株好ましく は肝臓由来の培養細胞株から RN Aを単離し、 RN Aを铸型として c DN Aを 合成し、 該 c DN Aを適当なプラスミ ドベクターに組み込む。 得られた組み換 えべクタ一で宿主細胞を形質転換して c DN Aライブラリーを調製し、 c DN Aライブラリ一よりクローンを選択して、 DNAを調製する。
ヒ トあるいはラッ トの組織好ましくは肝臓、 あるいは、 培養細胞株好ましく は肝臓由来の培養細胞株から RN Aを分離して c DN Aライブラリ一を作製す る工程およびクローニングの工程は、 バイオケミス ト リ一 [Biochemistry, 18, 5294(1977)] 、 特開平 2- 227075あるいは市販の実験書、 例えば、 遺伝子操作実 験法 (高木康敬編、 講談社) 、 遺伝子マニュアル (高木康敬編、 講談社) 、 モ レキユラ一 ' クローニング: ァ ' ラボラ トリー ' マニュアル (第 2版) 等に記 載された方法、 あるいは市販のキッ トを用いて行うことができる。
ヒ トあるいはラッ 卜の組織好ましくは肝臓、 あるいは、 培養細胞株好ましく は肝臓由来の培養細胞株から全 RN Aを調製する方法としては、 チォシアン酸 グァニジン— トリフルォロ酢酸セシウム法 [Methods in Enzymol. , 154, 3(1987 )] 、 また全 RN Αからポリ (A) 4 RN Aを調製する方法としては、 オリゴ
( d T) 固定化セルロースカラム法 [モレキュラー ' クロ一ニング : ァ · ラボ ラ トリ一 'マニュアル (第 2版) ] などがあげられる。 また、 ヒ トあるいはラ ッ 卜の組織好ましくは肝臓、 あるいは、 培養細胞株好ましくは肝臓由来の培養 細胞株から mRN Aを調製するキッ トとして、 ファース ト . トラック . mRNA · アイソレーショ ン ' キッ ト (Fast Track mRNA Isolation lUt;ィンビトロジェ ン社製) 、 クイ ック ' プレップ ' mRNA · ピユリフィケ一シヨ ン ' キッ ト (Quic k Prep mRNA Purification Kit; フアルマシア社製) などがあげられる。
poly (ΑΓ RNA或いは mRN Aからの c D N Aの合成法としては、 モレキユラ 一 · クロ一ニング : ァ . ラボラ ト リ一 ' マニュアル (第 2版) やカレン ト ' プ 口 トコールズ · イン 'モレキュラー 'ノく'ィォロジ一、 サプルメン卜 1- 3 4等に 記載された方法、 あるいは市販のキッ 卜、 例えばスーパ一スクリプト . プリア
ンプリフィケ一シヨ ン · システム ' フォー ' ファース ト ' ス トラン ド ' cDNA · シンセシス [Super Script™ Pre amplification System for First Strand c DNA Synthesis; ライフテクノロジ一ズ社製(Life Technologies)] を用いる方 法などがあげられる。
c DNAライブラリ一作製法としては、 モレキュラー · クローニング: ァ . ラボラ トリー ' マニュアル (第 2版) やカレント 'プロ トコ一ルズ ' イン .モ レキユラ— .バイオロジー、 サプルメント 1-3 4等に記載された方法、 あるい は市販のキッ ト、 例えばス一パースクリプト 'プラスミ ド ' システム ' フォー • cDNA ' シンセシス . アンド ' プラスミ ド · クローニング (Super Script™ P lasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning ライフテクノロジ ーズ社製) やザップ- cDNA ' シンセシス .キッ ト [ZAP_cDNA Synthesis Kit, ストラタジーン (Stratagene) 社製] を用いる方法などがあげられる。
c DN Aライブラリ一からのアルギニン分解酵素をコ一ドする DNAクロー ンは、 例えばォォタケらの報告したラッ トアルギナーゼをコードする DNA [ J. Biol. Chem. 263 , 2245, (1988)] やタキグチらの報告したヒ トアルギナー ゼをコードする DNA [Nucleic Acid Res., 16, 8789, (1988)〕 をプローブ として、 コロニー ·ハイブリダイゼ一ション法あるいはプラーク .ハイブリダ ィゼーシヨン法 [モレキュラー · クロ一ニング: ァ ' ラボラ トリ一 ' マ二ユア ル 第 2版] を用いて選択される。
また、 ォォタケらの報告したラッ トアルギナ一ゼの塩基配列やタキグチらの 報告したヒ トアルギナーゼの塩基配列をもとにプライマーを調製し、 poly(A) + RNAあるいは mRN Aから合成した c DNAや c DNAライブラリ一を铸型と して、 ポリメラ一ゼ ' チェイン ' リアクション (P C R) 法 [モレキユラ一 · クローニング: ァ · ラボラ トリー ' マニュアル (第 2版) 、 カレント ·プロ ト コールズ ' イン . モレキュラー 'バイオロジー、 サプルメント 1- 3 4 ]により アルギニン分解酵素をコ一ドする DN Aを調製することもできる。
ァルギニン分解酵素変異体の D N Aは上記の調製法で得られるアルギニン分 解酵素をコ一ドする DN Aをもとに、 モレキュラー · クローニング: Ύ ' ラボ ラ トリ一 ' マニュアル (第 2版) やカレント 'プロ トコ一ルズ ' イン . モレキ
ユラ— .バイオロジー、 サプルメント 1-3 4等に記載された方法によって得る ことができる。 .
上記方法により選択された c D N Aクローンを、 適当な制限酵素などで切断 後、 pBluescript KS(+) (ストラタジーン社製) 等のプラスミ ドにクローニン グし、 通常用いられる塩基配列解析方法、 例えば Sangerらのジデォキシ法 [Pr oc. Natl. Acad. Sci.,U. S. A. , 74, 5463(1977)] 等によって分析することによ り、 該 DN Αの塩基配列を決定することができる。 塩基配列の分析は、 塩基配 列自動分析装置、 例えば 3 7 3 A · DN Aシークェンサ一 (アプライ ド .バイ ォシステムズ社製) 等を用いて行うことができる。
上記の方法により得られるアルギニン分解酵素及びアルギニン分解酵素の変 異体をコードする DN Aを適当なベクタ一のプロモーター下流に揷入した組換 え体べクタ一を造成し、 それを宿主細胞に導入することにより、 アルギニン分 解酵素及びアルギニン分解酵素の変異体を発現する形質転換体を得ることがで きる。
宿主としては、 細菌、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞など、 目的とする遺伝子を 発現できるものであれば、 いずれでもよい。 細菌としては、 ェシヱリヒア - コ リ (Escherichia coli) 、 バチルス · ズブチリス (Bacillus subti lis) 、 ノく チルス ' アミ 口 リ クエファシネス (Bacillus amyloliquefaciens) 、 ブレビバ 夕テリゥム · フラノくム (Brevibacterium f lavum 、 フ"レ t ノく夕テリウム - ラ ク 卜ファーメ ンタム (Brevibacterium lactof ermentum) 、 コ リネノくクテリゥ ム · グノレ夕 ミ クム (Corvnebacter ium glutami cum; ヽ ミ クロノくクテリゥム · ァ ンモニァフィラム ( icrobacterium ammoniaphi lum) 等のェシエ リ ヒア属、 セ ラチア属、 コリネバクテリウム属、 ブレビバクテリウム属、 シユードモナス属 、 バチルス属等の微生物が例示される。 酵母としては、 サッカロミセス · セレ ビシェ (Saccharomyces cerevisae) 、 シソサッカロ ミセス ' ポンべ (Sc izos accharomyces pombe) 、 クリュイへ口ミセス · ラクチス (Kluyveromyces lact is) 、 ト リ コスポロン ' プルランス (Trichosporon pullulans) 、 シュヮニォ ミセス ' アルビウス (Schwanni omyces alluvius) 等が例示される。 動物細胞 としては、 ヒ トの細胞であるナマルバ細胞、 サルの細胞である C 0 S細胞、 チ
ャィニーズ ·ハムスターの細胞である CHO細胞等が例示される。 昆虫細胞と しては、 Spodoptgra frugiperdaの卵母細胞である S f 9 S f 2 1 [バキュ ロウィルス *ィクスプレツシヨン ·ベクタ一ズ、 ァ · ラボラ トリ一 · マ二ユア ノレ (Baculovirus Expression Vectors A Laboratory Manual)、 オレリー ( Oreilly)、 ミラ一(Miller)、 ルーコゥ(Luckow)著、 ダブリュー 'ェイチ ' フリ 一マン ' アン ド ' · 力ン 0二一 (W. H. Freeman and Company)^ ニューヨーク (New York), 1992年版 (以下、 バキュ口ウィル ' スイクスプレツシヨン 'ベクタ —ズ、 ァ ' ラボラ トリ一 ·マニュアルと略記する) ] 、 Trichoplusia niの卵 細胞であり、 ファーミ ンジェン (Pharmingen) 社から High5として市販されて いる Tn5等が例示される。
アルギニン分解酵素及びアルギニン分解酵素の変異体をコードする D Ν Αを 導入するベクターとしては、 アルギニン分解酵素及びアルギニン分解酵素の変 異体をコードする DN Aを組み込むことができ、 宿主細胞で発現できるもので あればいかなるベクタ一でも用いることができる。
細菌、 例えばェシヱリヒア ' コリ (Escherichia coli) を宿主として用いる 場合には、 プロモータ一、 リボゾーム結合配列、 本発明の DNA、 転写終結配 列、 場合によってはプロモータ一の制御配列より構成されているのが好ましい 発現べグタ一としては、 例えば、 pKYP l 0 (特開昭 58- 110600) p L S A 1 〔ァグリカルチュラル ' アンド ' くィォロジカル · ケミストリ一(Agric . Biol. Chem. ),53, 277, (1989) ] , ρ G Ε L 1 Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 82, 4306 (1985)〕 pNS等が用いられる。
プロモータ一としては、 大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれ を用いてもよい。 例えば、 trpプロモーター (Ptrp) lacプロモータ一 (P1 ac) T 7 lacプロモータ一、 PLプロモータ一、 PRプロモーターなどの、 大 腸菌ゃファージ等に由来するプロモーターが用いられる。 P^ 2_を 2つ直列さ せたプロモータ一 (P^ £X 2) tacプロモータ一のように人為的に設計改変 されたプロモータ一等を用いてもよい。
リボソーム結合配列としては、 シャイン一ダルガノ (Shine- Dalgarno) 配列
(以下、 S D配列と略記する) と開始コ ドンの間を適当な距離 (例えば、 6〜 1 8塩基) に調節して用いることが好ましい。
本発明の組換えべクタ一においては、 本発明の DN Aの塩基配列を宿主での 発現に最適なコ ドンとなるように、 必要に応じて塩基を置換して用いることが 好ましい。
本発明の組換えべクタ一においては、 本発明の DN Aの発現には転写終結配 列は必ずしも必要ではないが、 好適には構造遺伝子の直下に転写終結配列を配 置することが好ましい。
細菌への組換えベクターの導入方法としては、 細菌に DN Aを導入する方法 であれば、 例えば、 カルシウムイオンを用いる方法 [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 69, 2110-2114 (1972)] 、 プロ トプラスト法 (特開昭 63- 2483942) 等、 いずれの方法も用いられる。
酵母を宿主として用いる場合には、 発現べクタ一として、 例えば、 YE p 1 3 (ATCC37115) 、 YE p 2 4 (ATCC37051) 、 YC p 5 0 (ATCC37419) 等が 用いりれる。
プロモーターとしては、 酵母中で発現できるものであればいずれのものを用 いてもよいが、 、 例えば、 へキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモー 夕一、 gal 1 プロモータ一、 gal 10プロモータ一、 ヒートショック蛋白質プロ モーター、 MFal プロモータ一、 CUP 1 プロモータ一等があげられる。
酵母への組換えべクタ一の導入方法としては、 酵母に DNAを導入する方法 であれば、 例えば、 エレク ト口ポレーシヨン法 [Methods. Enzymol. , 194, 182 -187 (1990)] 、 スフヱ口プラスト法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 192 9-1933 (1978)] 、 酢酸リチウム法 [ Bacteriol. , 153, 163-168 (1983)] 等 、 いずれの方法も用いられる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、 発現ベクターとして、 例えば、 ρ Α G Ε 1 0 7 〔特開平 3- 22979; サイ トテクノロジ一(Cytotechnology),さ, 133,(1 990)〕 , p A S 3 - 3 (特開平 2- 227075) , p AMo ERC 3 S c, p c DM 8 〔ネィチヤ一(Nature),^, 840, (1987)] 、 p c DNA I /Amp, p c D NA I (いずれもフナコシ社製) 等が用いられる。
プロモーターとしては、 動物細胞中で発現できるものであればいかなるもの を用いてもよいが、 例えば、 ヒ トサイ トメガロ ' ウィルス (CMV) の IE(imm ediate early) 遺伝子のプロモータ一、 SV40あるいはメタ口チォネインのプロ モータ一等があげられる。 また、 ヒ ト CMVの IE遺伝子のェンハンサーをプロ モータ一とともに用いてもよい。
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、 動物細胞に DN Aを導入 する方法であれば、 例えば、 エレク ト口ポレーシヨン法 [Cytotechnology. 3 , 133(1990)] 、 リ ン酸カルシウム法 (特開平 2- 227075) 、 リボフヱクシヨン 法 [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 84, 7413 (1987)] 等、 いずれの方法も用 いられる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、 例えば力レン ト · プロ トコールズ · イン ' モレキュラー · バイオロジー、 サプルメ ン ト 1-3 4、 バキュロウィルス • ィクスプレツシヨン -ベク夕一ズ、 ァ ' ラボラ トリー 'マニュアル等に記載 された方法によって、 タンパク質を発現することができる。 すなわち、 以下に 述べる組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入 して昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得たのち、 さらに組換えウィルス を昆虫細胞に感染させ、 タンパク質発現昆虫細胞を取得する。
遺伝子導入べクタ一としては、 例えば、 pVL1392、 pVL1393、 pBlueBacIII ( いずれもィンビトロジェン社製) 等が用いられる。
バキュロウィルスとしては、 例えば、 夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスであ るァゥ トグラファ · カリフォルニカ · ヌク レア一 ' ポリへドロシス ' ウイルス (Autographa cal i f orni ca nuclear polyhedrosi s virus)などか用いりれ る o
組換えウィルスを調製するための、 昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入べク ターと上記バキュロウィルスの共導入方法としては、 例えば、 リ ン酸カルシゥ ム法 (特開平 2- 227075) 、 リボフヱクシヨン法 [Pro Natl. Acad. Sci. , US A, 84, 7413 (1987) ] 等が用いられる。
遺伝子の発現方法としては、 直接発現以外に、 分泌生産、 融合タンパク質発 現等が開発されており、 いずれの方法も用いることができる。 例えば、 モレキ
ユラ— . クロ一ニング: ァ . ラボラ トリー . マニュアル (第 2版) に記載され ている方法に準じて行うことができる。
酵母、 動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、 ェキソあるいは ェンドグリコシダ一ゼによる糖あるいは糖鎖が付加されたアルギニン分解酵素 あるいはアルギニン分解酵素の変異体を得ることができる。
なお、 アルギニン分解酵素あるいはその変異体をコ一ドする D N Aを組み込 むためのプラスミ ドベクタ一としては、 アルギニン分解酵素あるいはその変異 体をコ一ドする D N Aを組み込めるプラスミ ドベクタ一であればいかなるもの でも用いることができ、 例えば、 アルギニン分解酵素であるヒ トアルギナ一ゼ の発現プラスミ ドベクタ一である pNS- hArglや、 ラッ トアルギナ一ゼの発現プ ラスミ ドベクタ一である pNS- rArglがあげられる。 プラスミ ドベクタ一 pNS- hAr glを含む大腸菌である Escher i ch i a col i BL21/pNS-hArglとプラスミ ドベクタ 一 pNS-rArglを含む大腸菌である Escher i chi a coj_i BL21/pNS-rArgl は、 平成 8年 7月 2 4日付で工業技術院生命工学工業技術研究所 (日本国茨城県つくば 巿東 1丁目 1番 3号) にそれぞれ FERM BP- 5605および FERM BP- 5606として寄託 されている。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、 培養物中にアルギニ ン分解酵素あるいはアルギニン分解酵素の変異体を生成蓄積させ、 該培養物か ら採取することにより、 アルギニン分解酵素あるいはアルギニン分解酵素の変 異体を製造することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、 宿主の培養に用いられる通常 の方法に従って行われる。
大腸菌あるいは酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する 培地としては、 微生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 形 質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、 合成培地のいずれを 用いてもよい。
炭素源としては、 グルコース、 フラク トース、 スクロース、 糖蜜、 デンプン 、 デンプン加水分解物等の炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 ェタノ —ル、 プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸 アンモニゥム、 _りん酸ァンモニゥム等の無機酸もしくは有機酸のァンモニゥム 塩またはその他の含窒素化合物の他、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コー ンスチープリカ一、 カゼイン加水分解物、 大豆粕および大豆粕加水分解物、 各 種発酵菌体またはその消化物等が用いられる。
無機物としては、 りん酸第一カリウム、 りん酸第二カリウム、 りん酸マグネ シゥム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナ ト リウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫 酸銅、 炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、 通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下、 1 5 ~ 4 0 °Cで 1 6〜 9 6時間行う。 培養期間中、 p Hは 3. 0〜 9. 0に保持する 。 p Hの調整は、 無機または有機の酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム 、 アンモニアなどを用いて行う。
培養中は必要に応じて、 アンピシリンゃテトラサイクリン等の抗生物質を培 地に添加してもよい。
プロモータ一として誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換 した微生物を培養するときには、 必要に応じてィンデユーザーを培地に添加し てもよい。 例えば、 lac プロモータ一を用いた発現ベクターで形質転換した微 生物を培養するときにはィソプロピル一 j5— Όーチォガラク トピラノシド ( I P TG) 等を、 trp プロモータ一を用いた発現ベクターで形質転換した微生物 を培養するときにはインドールアクリル酸 ( I AA) 等を培地に添加してもよ い。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に 使用されている R PM 1 1 6 4 0培地、 E a g l eの MEM培地またはこれら 培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。 培養は、 通常 5 %二酸化 炭素存在下、 3 5〜3 7 °Cで 3〜7日間行い、 培養中は必要に応じて、 カナマ ィシン、 ぺニシリ ン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に 使用されている T刚- FH培地 [ファーミ ンジヱン (Pharmingen) 社製] 、 Sf900I ISFM [ライフテクノロジ一ズ (Life Technologies) 社製] 、 ExCell400、 ExC
el l405 [いずれも JRHバイオサイエンシーズ (JRH B i osci ences) 社製] 等が 用いられる。 培養は、 2 5〜 3 0°Cで 1〜4日間行い、 培養中は必要に応じて、 ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
アルギニン分解酵素あるいはアルギニン分解酵素の変異体が、 細胞内に溶解 状態で発現した場合または細胞内に不溶体を形成した場合には、 培養終了後、 細胞を遠心分離し、 水系緩衝液にけん濁後、 超音波法、 フレンチプレス法など により細胞を破砕し、 その遠心分離上清にアルギニン分解酵素あるいはアルギ 二ン分解酵素の変異体を回収する。
さらに、 細胞内に不溶体を形成した場合には、 不溶体をタンパク質変性剤で 可溶化後、 タンパク質変性剤を含まないあるいはタンパク質変性剤の濃度が夕 ンパク質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、 或いは透析し、 タンパク質の 立体構造を形成することができる。
アルギニン分解酵素あるいはアルギニン分解酵素の変異体あるいはそれらの 糖あるいは糖鎖付加体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、 培養上清に アルギニン分解酵素あるいはアルギニン分解酵素の変異体あるいはそれらの糖 あるいは糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。 単離精製については 、 溶媒抽出、 有機溶媒による分別沈殿、 塩析、 透析、 遠心分離、 限外ろ過、 ィ オン交換クロマ トグラフィー、 ゲルろ過クロマ トグラフィー、 疎水性クロマ ト グラフィー、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィー、 逆相クロマトグラフィー、 結晶化、 電気泳動などの分離操作を単独あるいは組み合わせて行うことができ る。
精製後のタンパク質は新生化学実験講座、 第 1巻タンパク質 I I、 一次構造 ( 千谷晃一ら、 東京化学同人) に記載されている方法に従って一次構造解析する ことができる。 例えば自動ァミノ酸配列分析装置を用いて N末端ァミノ酸配列 を決定したり、 卜リプシン等のプロテア一ゼによってタンパク質を加水分解後 に得られたぺプチド断片を質量分析装置や自動ァミノ酸配列分析装置を用いて 了ミノ酸配列を決定することができる。 決定したアミノ酸配列は P IR-ィンタ一 ナショナル ' プロテイン · シークェンス · データベース(P IR- Internat i onal P ro te i n Sequence Database; Lプロテイ ン · ァ テンティ フィケイシヨ ン · リ
ソース(Pro te i n I dent i f i cat i on Resource)] 等のプロテインデータべ一ス内 のァミノ酸配列と相同性検索を行うことにより帰属できる。
アルギニン分解酵素あるいはアルギニン分解酵素の変異体を糖、 糖鎖、 多価 化糖複合体あるいは高分子物質などで修飾することもできる。
糖、 糖鎖あるいは多価化糖複合体の修飾体の調製方法には、 糖タンパク質と して動物細胞、 昆虫細胞、 酵母細胞等により生産する方法や、 あらかじめ糖、 糖鎖あるいは多価化糖複合体を調製し、 酵素的あるいは化学的に付加する方法 などがあげられる。
糖および糖鎖を調製する方法としては、 化学合成による方法、 多糖を分解す る方法、 糖タンパク質から糖鎖を遊離し必要に応じて特定の構造の糖あるいは 糖鎖を精製する方法等がある。 また、 多価化糖複合体を調製する方法としては 、 糖あるいは糖鎖をォリゴあるいはポリ リジン等の多価化担体に結合する方法 がある [ジャーナル ' ォブ ' ドラッグ - ターゲッティ ング (以下 J. Drug Targ e t t i ngと略記する), 3, 111, (1995) ] 。
得られた糖、 糖鎖、 あるいは多価化糖複合体は糖転移酵素等を利用して付加 することもできる。 また、 例えば、 ジァゾカップリング法、 イソチオシァネ一 トカップリ ング法、 グァニジネーション法、 アミジネーション法等を利用して 付加することもできる。 ジァゾカツプリ ング法およびイソチオシァネ一トカツ プリ ング法では、 タンパク質のチロシン、 フヱニルァラニンのベンゼン環ゃヒ スチジンのィミダゾ一ル基に結合できる。 グァニジネーション法およびァミ ジ ネ一ション法ではリジン側鎖のァミノ基ゃタンパク質 N末端のァミノ基に結合 できる [J. Drug Targe t t i ng, 3, 111, (1995)] 。
高分子物質としては、 抗原性、 毒性が低いものであればいかなるものでもよ い。 例えば、 ポリエチレングリ コール、 デキス トラン、 カルボキシメチルセル ロース、 アルブミ ン、 ガンマ一グロブリ ン、 ポリアミノ酸、 スチレンマレイン 酸共重合体、 抗体等があげられる (医薬品の開発第 1 3巻薬物送達法、 広川書 店、 1 9 8 9年) 、 (稲田祐ニ編、 タンパク質ハイブリ ツ ド—ここまできた化 学修飾一、 共立出版、 1 9 8 7年) 。
高分子物質あるいは多価化糖複合体の修飾方法としては、 酸アミ ド結合法、
チォアミ ド結合法、 エステル結合法、 ジスルフィ ド結合法、 ジァゾ結合法、 ァ ルキル化法.、 トリアジン環を介した結合法、 イソ尿素結合法、 イ ミ ドカルボン 酸結合法、 力ルバミル酸結合法等が開発されており (稲田祐ニ編、 タンパク質 ハイブリ ッ ド一ここまできた化学修飾一、 共立出版、 1 9 8 7年) 、 (千畑一 郎編、 固定化生体触媒、 講談社、 1 9 8 6年) 、 (大野素徳、 金岡祐一、 崎山 文夫、 前田浩著、 蛋白質の化学修飾ぐ上〉ぐ下〉、 瓜谷郁三、 志村憲助、 中村 道徳、 船津勝編、 生物化学実験法 1 2、 学会出版センター、 1 9 8 1年) 、 い ずれの方法も用いることができる。 また、 高分子物質とアルギニン分解酵素を 架橋剤を介して上記の結合法により結合することもできる (千畑一郎編、 固定 化生体触媒、 講談社、 1 9 8 6年) 、 (大野素徳、 金岡祐一、 崎山文夫、 前田 浩著、 蛋白質の化学修飾く上〉 <下〉、 瓜谷郁三、 志村憲助、 中村道徳、 船津 勝編、 生物化学実験法 1 2、 学会出版センタ一、 1 9 8 1年) 。
さらに、 糖修飾した高分子物質をアルギニン分解酵素あるいはアルギニン分 解酵素の変異体に結合することもできる。
アルギニン分解酵素あるいはアルギニン分解酵素の変異体はいかなる方法で 分子間架橋してもよい。 例えば、 千畑一郎編、 固定化生体触媒、 講談社 ( 1 9 8 6年) に記載されている方法に準じて行うことができる。
アルギニン分解酵素、 その変異体およびそれらの修飾体は、 生体組織の繊維 化を抑制するのに有効である。 アルギニン分解酵素、 アルギニン分解酵素の変 異体あるいはそれらの修飾体を医薬として使用する際には、 各種注射剤、 経皮 粘膜投与剤、 経口剤等の各種投与形態が可能であり、 該投与形態に応じた種々 の剤形で使用される。 投与剤形としては、 例えば静脈内注射、 筋肉内注射、 皮 下注射、 皮内注射等用の注射剤、 懸濁注射剤、 凍結乾燥などの用時溶解型注射 剤、 座剤、 経鼻剤等の経粘膜投与剤、 あるいは錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 懸 濁液等の経口剤をあげることができる。 これらの剤形の製剤化には、 通常知ら れた方法が適用され、 目的に応じて医薬品として許容される保存剤、 安定化剤 、 抗酸化剤、 賦形剤、 結合剤、 崩壊剤、 湿潤剤、 滑沢剤、 着色剤、 芳香剤、 矯 味剤、 剤皮、 懸濁化剤、 乳化剤、 溶解補助剤、 緩衝剤、 等張化剤、 塑性剤、 界 面活性剤、 無痛化剤等を含有させてもよい。
使用する製剤用担体としては、 例えば、 水、 注射用蒸留水、 生理食塩水、 グ ルコース、 フラク トース、 白糖、 マンニッ ト、 ラク ト一ス、 デンプン、 セル口 —ス、 メチルセルロース、 カルボキシメチルセルロース、 ヒ ドロキシプロピル セルロース、 グリセリ ン、 マンニ トール、 キシリ トール、 ソルビトール、 グル クロン酸、 ヒアルロン酸、 へパリ ン、 キチン、 キ トサン、 グリ シン、 ァラニン 、 プロリ ン、 セリ ン、 システィ ン、 ァスパラギン酸、 グルタ ミ ン酸、 リ ジン、 アルギニン、 ヒ ト血清アルブミ ン、 ヒ 卜血清グロブリ ン、 コラーゲン、 ゼラチ ン、 アルギン酸、 タルク、 クェン酸ナ ト リウム、 炭酸カルシウム、 リ ン酸水素 カルシウム、 ステアリ ン酸マグネシウム、 尿素、 シリ コーン樹脂、 ソルビタン 脂肪酸エステル、 グリセリ ン脂肪酸エステル、 ァスコルビン酸、 アルファー ト コフユロール等があげられる。
投与量は、 投与形態、 患者の年齢、 体重、 症状等により異なるが、 通常、 0. 01 /z g〜10 g Z60 k g Z日が適当である。
アルギニン分解酵素、 その変異体およびそれらの修飾体についての繊維芽細 胞増殖抑制活性の測定方法としては、 肝臓の伊東細胞あるいは伊東細胞が形質 転換した繊維芽細胞と同様の挙動をすると考えられる細胞を用いた方法が好ま しい。 具体的には、 ラッ ト胎児繊維芽細胞およびラッ ト繊維芽細胞株 Rat2を用 いた測定方法を示す。
ラッ ト胎児繊維芽細胞の調製は、 次のように行う。 交配後 10日前後の妊娠し た S Dラッ 卜より胎児を無菌的に摘出したのち、 頭部と肢部を除外した部分に ついて洗浄、 細かくはさみで切断した組織片より繊維芽細胞を回収する。 さら に、 遠心分離して赤血球を除去した後培地を加え、 0. 5〜20 X 10 5個細胞/ ml好 ましくは 2 X 10 5個細胞 /mlの細胞懸濁液とし、 37°C、 5%二酸化炭素条件下で培 養を行う。 継代については、 細胞増殖の程度によって 1〜7日好ましくは 3〜 5 曰に一度行う。
繊維芽細胞増殖抑制活性測定には、 2〜10代好ましくは 3 ~ 6代継代した繊 維芽細胞を使用する。 培養器から培地を除き、 付着した細胞を 10〜40°C好まし くは 37°Cの PBS等の等張中性緩衝液で洗浄後、 デイスパーゼ グレー ド i KD i sp ase grade l l)溶液 [ベ一リ ンガ一 マンノヽィム(Boehr i nger, Mannhe im)社製]
処理で細胞を単離したのち培地を加えて細胞懸濁液を調製する。
繊維芽細胞増殖抑制活性測定には、 いかなる容器も用いることができるカ^ 好ましくはテラサキプレートを用いる。 以下に、 テラサキプレートを用いた測 定例を示す。 1 ゥエルに 100〜500細胞好ましくは 3 0 0細胞を入れ、 それに試 料溶液を l〜50 z 1好ましくは 5 1加える。 対照実験では試料溶液の代わり にリンガー溶液等の等張中性緩衝液を添加する。 5 %二酸化炭素条件下、 24〜 120時間好ましくは 7 2時間培養し、 培養後、 上記のテラサキプレートを PBS等 の等張中性緩衝液で洗浄し、 メタノールで細胞を固定する。 乾燥後、 ギムザ溶 液で染色し、 細胞数を数えたのち、 次式を用いて、 増殖抑制率を算出する。
I R (%) = { (C -T) /C] X 1 0 0 ここで、 I R :増殖抑制率
C :試料溶液の代わりにリ ンガー溶液を添加したときの細胞数 T :試料溶液を添加したときの細胞数
を表す。
前述したラッ 卜胎児繊維芽細胞を用いた増殖抑制活性測定は感度が不充分で あり操作も煩雑であることから、 より高感度な測定法としてラッ ト繊維芽細胞 である Rat2細胞を用いた増殖抑制活性測定方法を確立した。 以下に、 その方法 を述べる。
ラッ 卜繊維芽細胞株である Rat2 (ATCC CRL-1764) の培養は、 10% 牛血清を 含むイーグル MEM培地 [Science, 130, 432, (1959) ] を用いて、 5 %二 酸化炭素存在下、 37°Cで行った。
Rat2細胞の細胞数は、 細胞の増殖性を定量的に検出することが可能な方法で あれば測定することができる。 例えば、 モスマン(Mosmann)によって確立され た MT T法 [ジャーナル ' ォブ ' ィムノロジカル ' メ ソッ ド(J. Immunol. Met hods), 65, 55, (1983)] 、 卜リチウムチミジンなどのラジオアイソ トープで 標識された化合物の細胞内への取り込みを測定する方法、 細胞数を数える方法 、 細胞内のある特定の酵素活性を測定する方法などが挙げられる。 ここでは、 MTT法を用いて細胞数を定量し、 試料の細胞増殖抑制活性を測定する方法に
ついて述べる。
コンフルェン ト状態に増殖した Rat2細胞を、 洗浄、 消化させて、 個々の細胞 が接着面から剥離した段階で、 2〜 2 0 %好ましくは 10% 牛血清を含むィ一グ ル MEM培地を加え、 ァクチナーゼ Eの酵素消化反応を止める。 遠心操作後、 2〜2 0 %好ましくは 10% 牛血清を含むイーグル MEM培地を用いて、 0.2〜2 0X 105 個 Zm 1好ましくは 1.2X 105 個/ m 1に調製し、 細胞培養用の 96ゥヱ ルプレー トに 25〜 2 0 0 1 Zゥエル好ましくは 1 0 0 1 /ゥエルで分注す る。 Rat2細胞に、 試料を添加し、 5 %二酸化炭素存在下、 37°Cで 24〜120時間 好ましくは 72時間培養する。
その後、 1〜 1 0 mg/m 1好ましくは 5 mg/m 1 MTT試薬を含む P B Sを 1〜 1 0 0 1 ダウエル好ましくは 1 0 〃 1 Zゥエルで添加し、 更に 1 〜 8時間好ましくは 4時間培養した。 その後、 0.01-0.5N好ましくは 0. 0 4 N塩酸を含むィソプロパノール溶液を 5〜 2 0 0 1 /ゥエル好ましくは 1 5 0 ju 1 /ゥエルで添加し、 生成したホルマザン色素を溶解する。 溶解したホ ルマザン色素の 5 4 0 nmにおける吸光度を測定することで、 細胞数を定量す また、 形態学的には、 伊東細胞の繊維芽細胞への形質転換を指標として測定 することもできる。
伊東細胞の調製法としては、 力ヮダらの方法 [ョ一口ビアン ' ジャーナル ' ォブ 'バイオケミストリ一(以下 Eur. J. Biochem.と略記する) , 213, 815, ( 1993)] などがあげられるが、 伊東細胞を効率よく単離できれば、 いかなる方 法でもよい。
2〜2 0 %好ましくは 10% 牛血清を含むダルべッコ MEM培地 [ヴアイォロ ジ一(Virology), 8, 396, (1959)] で、 0.5〜10xl05 個 Zゥェル好ましくは 1 .7X105 個/ゥエルに調製した伊東細胞を、 細胞培養用の 12ゥヱルプレー卜に 1〜 4 m 1 /ゥエル好ましくは 2 m 1 /ゥエルで分注し、 5 %二酸化炭素存在 下、 37°Cで 2日間培養後、 培地を抜き取り、 試料を含む培地 1〜 4 m 1 Zゥェ ル好ましくは 2ml Zゥエルを加えた。 更に 5 %二酸化炭素存在下、 37°Cで 2 ~ 6日間好ましくは 4 日間培養後、 再び、 培地を抜き取り、 試料を含む培地 2 m
1 Zゥエルを加え、 更に 3 〜 1 0 日間好ましくは 7日間培養する。 また、 培養 期間中における伊東細胞の形態の変化を光学顕微鏡下で観察した。 その他の方 法でも、 繊維芽細胞への形質転換およびその増殖が観察できる培養方法であれ ば用いることができる。
さらに、 肝硬変動物モデルを用いて、 肝繊維化抑制活性を測定することもで きる。
肝硬変動物モデルとしては、 リ— [セラピエボクサ(Therap i ewoche) , 33, 5 1, ( 1983) ] の方法に準じて四塩化炭素モデルを作製することができる。 以下 に作製方法を示す。
まず、 肝硬変誘発物質としては、 四塩化炭素を 10〜705¾(v/v)好ましくは 5 0 %ォリブ油希釈したものを用いる。 四塩化炭素は、 0 . 4 5 111の濾過膜で滅 菌し、 オリブ油はメジユーム瓶に密閉した上で、 また、 薬品調製時に使用した 器具についても高圧蒸気滅菌 (121°C、 1. 2気圧、 20分間) 処理する。 希釈に際 しては、 ガラス製注射筒に各薬剤を分取し、 連結針で薬剤入りの 2注射筒を連 結し、 1 〜 1 0 0回好ましくは 5 〜 6 0回、 最も好ましくは 5 0回ボンビング して均質溶液を得る。 調製は、 用時あるいは週 1回とし褐色バイアル瓶に密栓 して冷暗所に保存する。
使用動物は、 SD系 ·雄性ラッ ト (体重 1 5 0 〜 3 0 0 g好ましくは 2 0 0 〜 2 5 0 g ) を購入し、 約 1 〜 2週間の馴致飼育の後に、 被検試料投与群および 対照群に分ける。
ラッ 卜への四塩化炭素調製溶液の投与方法としては、 ジェチルエーテルの吸 入麻酔処理後、 麻酔下で上腿部筋肉内に体重 1 k gあたり 0 . 5 〜 2 m 1好ま しくは 0 . 5 〜 1 . 0 m 1をプラスチック注射筒を用いて投与し、 投与間隔は 、 週 1 〜 7回、 好ましくは週 2 〜 3回とし、 4 〜 8週間、 好ましくは 6週間投 与する。
上記で作製した肝硬変動物モデルを用いて、 肝繊維化抑制活性を測定する。 あらかじめジェチルエーテルによる吸入麻酔処理を施し、 (四塩化炭素の投与 日はそれに引き続いて) 、 陰茎静脈叢内に 1匹あたり 0 . 1 〜 5 m 1、 好まし くは 1 〜 3 m 1、 最も好ましくは 2 m 1の被検試料あるいは対照群としてリ ン
ガ一溶液等をディスポ一ザブルプラスティ ック注射筒を用いて投与する。 また 、 投与期間は、 -四塩化炭素投与開始後 2〜4週間目、 好ましくは 3週間目より 、 4〜8週間目、 好ましくは 6週間目までとし、 投与間隔は、 1〜7日に 1回 、 好ましくは 1〜 2日に 1回、 最も好ましくは毎日とする。
投与実験終了後、 ラッ ト解剖にて肝臓を摘出し、 組織切片をホルマリ ン固定 して、 膠原 ·弹性繊維の両者を特異的に染め出すために、 へマトキシリン 'ェ ォジン (Hematoxy l i n · Eos i n, HE) とファストグリーン · シリウスレッ ド(Fas t -green - S i r i us red, FS) あるいはシリウスレッ ド F 3 B A染色法で染色を 行う。 繊維はシリウスレツ ドで赤色に染色されるため、 繊維化の進展度によつ て、 下記のように 4グレードの判断基準を設けて、 各個体の肝繊維化グレード を判定する。
グレード 0 :新しいコラーゲン生成が全くない。
グレード 1 : コラーゲン生成が始まる。
グレード 2 :門脈域間のコラーゲン生成が完成している。 グレード 3 :肝硬変を起こしている。
本発明を以下の実施例により、 さらに具体的に説明する。 これらの実施例は 説明のためのものであり、 本発明の範囲を限定するものではない。 実施例 1
肝臓、 腎臓、 肺、 滕あるいは皮膚などの臓器、 好ましくは肝臓を灌流液中、 あるいは、 ホモジナイズして不溶物を遠心分離して得られた抽出液中もしくは 血清中から得られた、 肝繊維化抑制活性、 繊維芽細胞増殖抑制活性、 および伊 東細胞形質転換抑制活性を有する物質がアルギニン分解酵素であることを以下 に示す。
1 . 肝灌流液の調製
肝臓の摘出は、 リーらの方法 [Surg. Forum, Π, 220, (1966) ] に準じて行つ た。
体重 2 5 0〜 2 7 0 gの雄 S Dラッ 卜 [ツエントラルティ一ルツ一ク 卜(Zen tral t i erzuch t)社製] に、 エーテル麻酔を施した。 麻酔後、 ラッ ト腹部を 7 0
%エタノールで洗って、 よく消毒した。 このラッ トをクリーンベンチ内に移し 、 皮膚を正中線に沿って下腹部を開切し、 さらに、 腹腔部は背部付近まで剝皮 した。 腹腔も正中線に沿って皮膚同様切開した。 内臓が露出したら、 腸を向か つて右側に寄せ、 濡れたガーゼで肝臓を横隔膜へ寄せることで、 門脈を十分に 露出させた。 縫合糸を門脈の回りに通し、 ループを作成した。 肝臓下の下大静 脈の回りにも、 門脈と同様縫合糸でループを作成した。 ハサミで門脈の末梢側 を垂直に半切し、 2 0 °Cのリンガー溶液を通液したカテーテルを挿入した。 縫 合糸で門脈を強く結び、 カテーテルを固定した。 その後直ちに、 肝臓下の下大 静脈を切断し脱血させると同時に、 2 0 °Cの 30mlのリ ンガ一溶液を 1 0 m 1ノ 分の流速で灌流することで肝臓の血液を洗い流した。 次に、 肝臓下の下大静脈 を、 縫合糸で強く結ぶことで閉じ、 肝上部下大静脈を切開し、 別に用意した力 テ一テルを挿入した後、 縫合糸で強く結び、 挿入したカテーテルを固定した。 このように、 肝灌流のルートを作製後、 肝臓につながつているその他すベての 血管を、 縫合糸を用いて閉じ、 肝臓自身を傷つけないように注意して摘出した 。 以上の概略について、 第 1図に示した。
続いて肝細胞に虚血による障害を施した。 一般的に肝の保存は、 2 0 °Cで 2 〜 3時間は耐えうるので、 その 2倍に相当する 6時間放置することとした。 こ れは、 後述の 4に示すように、 6時間虚血時の繊維芽細胞増殖抑制活性が、 最 も強かったためである。 肝臓 1 g当たり 2 m 1の 2 0 °Cのリンガ一溶液で肝臓 を門脈から灌流する。 流速は生体内での肝臓の血流量に合わせ、 肝臓 1 g当た り 1 m 1 /分とした。 上記の灌流法で、 同じ灌流液で 3 0分間隔をおいて計 5 回灌流し、 回収した灌流液を LP1 ~5と命名した。 さらに、 同じ肝臓に肝臓 1 g 当たり 2 m 1の新しいリンガ一溶液で 3 0分間隔をおいて計 5回灌流し、 回収 した灌流液を LP6〜10と命名した。 その後、 さらに同じ肝臓に肝臓 1 g当たり 2 m 1の新しいリンガー溶液で 3 0分間隔をおいて計 5回灌流し、 回収した灌 流液を LP1 1〜15と命名した。 これらの肝灌流液 LP1〜5、 LP6〜10および LP1 1 ~ 1 5について以下 2 . に示した方法で、 肝繊維化抑制活性を 3 . に示した方法で 繊維芽細胞増殖抑制活性を、 7 . に示した方法で伊東細胞形質転換抑制活性を それぞれ測定した。
2. 肝硬変動物モデルにおける肝繊維化抑制活性測定
( 1 ) 肝硬変動物モデルの作製
肝硬変誘発物質として四塩化炭素 (メルク社製) をォリブ油 (DAB9社製) で 50%(v/v)に希釈したものを用いた。 四塩化炭素に関しては、 0. 4 5 zm濾過 膜 (コースター社製) で濾過滅菌し、 オリブ油はメジユーム瓶に密閉した上で 、 高圧蒸気滅菌 (121°C、 1.2気圧、 20分) 処理した。 また、 以下の薬品調製時 に使用した器具はすべて高圧蒸気滅菌済とした。 希釈に際しては、 2 0 m l先 端ルアーロック付きガラス製注射筒に各薬剤を分取し、 連結針で薬剤入りの 2 注射筒を連結し、 5 0回ボンビングして均質溶液を得た。 調製は、 週 1回とし 褐色バイアル瓶に密栓して冷暗所に保存した。
使用動物は、 SD系 '雄性ラッ ト [ツエン トラルティールツ一ク ト(Zentralti erzucht)社製、 体重 2 2 0〜2 4 0 g] を購入し、 約 1週間の馴致飼育の後に 、 肝灌流液投与群およびリンガー溶液投与群として肝灌流液 LP1〜5投与群には 41匹、 LP6~10投与群には 37匹、 LP11〜15投与群には 1 5匹、 リ ンガー溶液投 与群には 43匹を使用した。
ジェチルェ一テルの吸入麻酔処理後、 麻酔下で上腿部筋肉内に体重 1 kgあた り l m l ( 0. 5 m 1四塩化炭素/ kg) を 1 m 1先端ルアーロック付プラスチ ック注射筒 [ブラウン ' メルスンゲン ' ァ一ゲー(Braun elsungen AG)製] を用いて投与した。 投与間隔は、 毎週火 ·金曜日の週 2回とし、 6週間投与し
/ >— o
( 2 ) 肝灌流液およびリンガ一溶液の投与方法
投与前にジェチルエーテルの吸入麻酔処理後 (四塩化炭素の投与がある火 . 金曜日は投与後) 、 陰茎静脈叢内に 1匹あたり 2 m 1の肝灌流液あるいはリン ガー溶液を 2. 0 m 1デイスポーザブルブラスティ ック注射筒 (ブラウン - メ ルスンゲン ' ァーゲ一製) を用いて投与した。 投与間隔は、 四塩化炭素投与開 始後 3週間目より 6週間目まで毎日とした。
(3) 剖検および処理方法
最後の四塩化炭素投与から 3日目にラッ トを屠殺して、 ラッ 卜解剖にて肝臓 を摘出し、 肝臓の各葉から 2〜 3 mmの厚さの切片をホルマリ ンで固定化後 1
週間目に、 肝臓の病理組織切片に関して、 膠原 ·弾性繊維の両者を特異的に染 め出すために、 へマトキシリン 'ェォジン (Hematoxylin · Eosin, HE) とシリ ウスレツ ド (Sirius red) F 3 B A染色法で染色を実施した。 繊維化の進展度 によって、 下記のように 4グレードに分類した。
グレード 0 :新しいコラーゲン生成が全くない。
グレード 1 : コラーゲン生成が始まる。
グレード 2 :門脈域間のコラーゲン生成が完成している。 グレード 3 :肝硬変を起こしている。
典型的な染色像を第 2図に示した。 第 2図中、 a, b, c, dはそれぞれ肝繊維 化グレード 0、 1、 2、 3の典型的なシリウスレッ ド (Sirius red) F 3 B A 染色像である。 これを肝繊維化グレード判断基準とし、 各個体の肝繊維化グレ 一ドを判定した。
肝灌流液 LP1~5、 LP6〜10および LP11〜15投与群およびリンガ一溶液投与群 の肝繊維化グレードを第 3図に示す。 リンガ一溶液を投与した対照群の肝硬変 (grade3)の程度に比較して、 LP6〜10の投与群では肝硬変が強く抑制されてい る (grade3の棒を比較) 。 すなわち、 LP6〜10に、 肝硬変を防ぐ強い効果をが 認められた。
3. ラッ ト胎児繊維芽細胞増殖抑制活性の測定
( 1 ) ラッ ト胎児繊維芽細胞の調製
繊維芽細胞は交配後 10日前後の妊娠した S Dラッ ト 1匹の胎児 5匹から採取 した。 妊娠したラッ 卜の腹部を 70%エタノールで消毒した後、 エーテル麻酔に かけた。 これ以後の操作はすべて無菌的に行った。 開腹後、 子宮を取り出し、 シャーレに置いた。 クリーンベンチの中で子宮から少なくとも 5匹の胎児を取 り出し、 頭部と肢部を除外してその残りを PBS [フローラボラ トリーズ(Flow Laboratories)製] で 2回洗って細かくはさみで切った。 その組織片を 100mlの 三角フラスコに入れ、 10mlの ト リプシン溶液 [0.25% バイオクローム(Biochro m)製] を加え、 37°Cで 5分間、 マグネッ ト管 [IKA—コンビマーク(IKA— combim ag),ルコ ' ヤンケ ' アン ド · クンケル(Rco Janke & KunkeO] で回した後 、 得た上清をビーカに移し、 培地 {10%胎児子牛血清 (フローラボラ トリーズ
製) 、 2mMいグルタ ミ ン [ベ一リ ンガーマンハイム (Boehringer, Mannheim) 製] 、 1 %ペニシリ ン—ス トレプトマイシン [へキス ト(Hoechst,AG)製] を含 む MEM培地 (フローラボラ トリーズ製) } 20mlを添加してトリプシン処理を 停止した。 残りの組織片には、 またトリプシン溶液を加え、 同じ操作を 4回繰 り返してできるだけ多くの繊維芽細胞を回収した。
( 2 ) 初代培養
このようにして調製した細胞懸濁液を 1, OOOrpmで 10分間遠心分離し、 上清を 除き、 その後、 37°Cの PBSで 2回洗浄して、 赤血球を除いた。 残った細胞に培 地を加え、 2 X105 個細胞/ mlの細胞懸濁液とし、 これを 10mlずつ培養器 [フ アルコン(Falcon)製 3013E, 25mm2 style,べク トン 'ディ ックネス(Becton Dickiness)] に入れ、 5%二酸化炭素条件下に 37°Cで培養した。
(3) 繊維芽細胞の継代
培養器の中の培地を除き、 付着した細胞を 37°Cの 6mlの PBSで 3回洗浄後、 5ml のトリプシン溶液を添加し細胞層を浸した。 5分後に 10mlの培地を加え、 トリ プシン処理を停止し、 細胞懸濁液を調製し、 1, OOOrpmで遠心分離した。 その上 清を除き、 残った細胞に培地を加え、 2 X105 個細胞/ mlの細胞懸濁液とし、 これを 10mlずつ培養器に入れ、 5%二酸化炭素条件下に 37°Cで培養した。 培地は 3日に一度交換し、 継代は細胞増殖の程度によって 3〜 5日に一度行った。
(4 ) 繊維芽細胞増殖抑制活性の測定
繊維芽細胞増殖抑制活性測定には、 3〜 6代継代した繊維芽細胞を使用した 。 培養器から培地を除き、 付着した細胞を 37°Cの 6mlの PBSで 3回洗浄後、 5mlの Diapase gradell溶液 (ベ一リ ンガーマンハイム社製) を添加し細胞層を浸し た。 10〜30分後に細胞が単離されたら 10mlの培地を加え、 Dispase処理を停止 し、 細胞懸濁液を調製し、 1, OOOrpmで 10分間遠心分離した。 その上清を除き、 残った細胞に培地を加え、 6 X104 個細胞/ mlの細胞懸濁液とした。 この時ト リパンブル一染色により生細胞の割合が 9 7 %以上であることを確認した。 増殖抑制活性測定にはテラサキプレートを使用した。 1ゥヱルに 3 0 0細胞 U \培地を入れ、 それに試料溶液を 5 1加えた。 ¾検試料としては、 肝 灌流液 LP1〜5、 LP6〜10、 し Pll〜15およびこれらをリ ンガー溶液で表 1に示した
割合に希釈した溶液を用いた。 対照実験では試料溶液の代わりにリンガ一溶液 を添加した。 5 二酸化炭素条件下、 7 2時間培養した。
( 5 ) 細胞の固定と染色
7 2時間培養後、 テラサキプレートを 2回 PBSで洗浄し、 10分間メタノールで 細胞を固定した。 20分間空気で乾燥し、 繊維芽細胞を蒸留水で 1 0倍に希釈し たギムザ溶液で 20分間染色し、 細胞数を数えたのち、 次式を用いて、 増殖抑制 率を算出した。
I R ( %) = ( ( C - T ) / C ) X 1 0 0 ここで、 I R :増殖抑制率
C :試料溶液の代わりにリンガー溶液を添加したときの細胞数 T :試料溶液を添加したときの細胞数
結果を第 1表に示す。
第 1表
IR (%)
希釈率 (%) LP1-5 LP6-10 LP11-15
2.5 51.40± 8.14 72.22 ±6.72 49.66 ±6.09
5 90.86 ±4.08 95.07 ±4.00 75.94 ±5.96
10 99.77 ±0.23 100.00±0.00 87.94 ±5.48
20 100.00 ±0.00 100.00±0.00 99.95 ±0.51
40 100.00 ±0.00 100.00 ±0.00 100.00 ±0.00
100 100.00 ±0.00 100.00 ±0.00 100.00 ±0.00 肝灌流液 LP1〜5、 LP6〜10および LP11〜15はともにラッ ト胎児由来の繊維芽 細胞増殖抑制活性を示した。 さらに、 灌流液を 100%, 40%, 20% , 10% , 5 % , 2. 5%に希釈した後に、 繊維芽細胞増殖抑制活性を測定すると、 LP6〜10が最 も強い増殖抑制活性を示した。 また、 この結果は、 i n V roでのラッ 卜胎児 由来の繊維芽細胞増殖抑制活性と i n v i voでの肝繊維化抑制活性が相関するこ とを示しており、 繊維芽細胞増殖抑制活性を指標に肝繊維化抑制因子を探索す ることの妥当性を示唆している。
4 . 肝灌流液調製時の虚血時間の検討
繊維芽細胞増殖抑制活性の回収に最適な虚血時間を検討した。 実施例 1の 1 のように体重 250〜270 gの雄 S Dラッ 卜の肝を取り出し、 20。Cに 0、 3、 6、 あ るいは 9時間放置後、 リ ンガー溶液を用いて LP1〜5、 LP6~10および LP11〜15を 調製し、 実施例 1の 3で述べた胎児性繊維芽細胞の増殖抑制活性を実施例 1の 3 ( 5 ) に示した計算式を用いて I Rを算出した。 その結果を第 2表に示した 第 2表
IR (Ψο)
試料 希釈率 (%) 虚血時間 (hr)
0 3 6 9
LP1-5 2.5 0.0±0.0 21.0±5.0 51.4±8.1 1.8±1.2
5.0 0.3 ±0.4 41.2±6.6 90.9±4.1 20.4±4.8
LP6-10 2.5 0.0 ±0.0 26.4 ±5.4 72.2±6.7 22,1 ±5.3
5.0 0.9±0.6 50.5±7.6 95.1 ±4.0 89.1±3.1
LP11-15 2.5 0.0土 0.0 13.8±4.8 49.7 ±6.1 2.1 ±1.4
5.0 0.3士 0.3 38.1士 8.7 75.9 ±6.0 14.2±3.6
虚血時間が 0時間で傷害されていない肝の灌流液には全く抑制活性が見られ なかった。 一方 6時間虚血後の肝灌流液からの繊維芽細胞増殖抑制活性の回収 が一番多かった。 したがって、 虚血時間を 6時間とした。
5. ラッ ト繊維芽細胞株 Rat2における肝灌流液中の細胞増殖抑制活性の測定 肝灌流液中の細胞増殖抑制活性の測定を行うにあたっては、 ラッ 卜の胎児繊維 芽細胞以外に、 ラッ 卜繊維芽細胞である Rat2細胞も用いてその増殖抑制を指標 として行った。
( 1 ) 繊維芽細胞の調製
Rat2細胞 (ATCC CRL-1764) の培養については、 10% 牛血清 [ハイクローン ラボラ トリーズ(Hyclone し aboratories)社製] を含むイーグル MEM培地 [Sc ience, 130, 432, (1959)] を用い、 5 %二酸化炭素存在下、 37°Cで行った
( 2 ) 肝灌流液中の細胞増殖抑制活性の測定
Rat2細胞の細胞数は、 細胞の増殖性を定量的に検出することが可能な方法で
あればどのような測定方法でもよいが、 ここでは、 MTT法を用いた細胞数の 定量を行い、 肝.灌流液 LP6〜10中の細胞増殖抑制活性を測定した。
コンフルェン ト状態に増殖した Rat2細胞を、 P B Sで洗浄後、 0.0015Uァクチ ナーゼ E (科研製薬株式会社製) および 0.02% EDTAを含む P B Sを加え消化し た。 消化が進み個々の細胞が接着面から剝離した段階で、 10% 牛血清を含むィ —グル MEM培地を加え、 ァクチナーゼ Eの酵素消化反応を止めた。 遠心操作 後、 10% 牛血清を含むイーグル MEM培地を用いて、 1.2 X 105 個 Zmlの細胞 濃度に調製し、 細胞培養用の 96ゥヱルプレー卜に 1 0 0 ^ 1 Zゥエルで播種し た。 Rat2細胞を播種したゥエルに、 肝灌流液 LP6〜10を添加し、 5 %二酸化炭 素存在下、 37°Cで 72時間培養した。
Rat2細胞を 72時間培養後、 5 mg/m l MT T試薬を含む P B Sを 1 0〃 1 /ゥエルで添加し、 更に 4時間培養した。 その後、 0. 0 4 N塩酸を含むィ ソプロパノール溶液を 1 5 0 ILL 1 /ゥエルで添加し、 生成したホルマザン色素 を溶解した。 溶解したホルマザン色素の 5 4 0 nmにおける吸光度を測定する ことで、 細胞数を定量した。
第 4図に、 実施例 1の 1で調製した肝灌流液 LP6〜10の Rat2細胞の細胞増殖 に及ぼす効果について、 上記方法で測定した結果を示した。 調製した肝灌流液 LP6〜10は、 濃度依存的に繊維芽細胞である Rat2細胞の増殖を抑制した。 IC50 は約 1 %であった。
6. 肝灌流液 LP6〜10からの Rat2細胞増殖抑制活性物質の単離と構造解析 肝灌流液 LP6〜10からの Rat2細胞増殖抑制活性物質の単離は以下の方法で行つ 実施例 1の 1で得た肝灌流液 LP6〜10 4 0 m lをシームレスセルロース膜 [ビスカース セールス社(Viskase Sales Corp. )製) を使用して 1 Lの 1 0 mMリン酸緩衝液 (p H 7. 0 ) に対して透析を行った。 透析液をマイレクス G V (ミ リポア社製) を用いてフィルターろ過後、 Mo n o Sカラムクロマト グラフィ一を下記の条件 1で行った。
条件 1 :
カラム : Mo n o S ( 1 0Z 1 0) ( 1 0 X 1 0 0mm, フアルマシア)
溶離液: A液 ( 1 0 mMリン酸緩衝液、 p H7.0)
B液.( 1 0 mMリ ン酸緩衝液、 PH7.0、 1.0M塩化ナトリウム) 流速: 2 ml/分
溶出 : B液 0%から 30%までの直線濃度勾配溶出 144ml
タンパク質の溶出は 2 8 0 nmの吸収でモニターした。 溶出液はフラクショ ンコレクターで回収し、 各画分については実施例 1の 5で述べた方法により Ra t2細胞増殖抑制活性を測定した。 その結果を第 5図に示した。 横軸 85m 1 より 勾配溶出を開始した。 斜線のボックスは Rat2細胞増殖抑制活性の主画分を示す 増殖抑制活性を示した第 5図中の斜線の入った棒で示した画分については、 色素ァフィ二ティー担体ブル一セル口ファイン (チッソ社製) を充塡したカラ ムにより、 条件 2に示す方法でさらにクロマトグラフィ一を行った。
条件 2 :
カラム : ブルーセルロフアイン充塡カラム ( 1 0 X 1 0 0 mm)
溶離液: A液 ( 2 0 mMリ ン酸緩衝液、 pH 7. 5、 0. 1 mM塩化ニッケ ル)
B液 ( 2 0 mMリ ン酸緩衝液、 p H 7. 5、 1. 0 M塩化ナトリウ ム、 0. 1 mM塩化二ッゲル)
C液 ( 2 0 mMリ ン酸緩衝液、 p H 7. 5、 1. 0 M塩化ナトリウ ム、 6 0ジエチレングリ コール、 0. I mM塩化ニッケル)
流速: 0. 1 5 mlZ分
溶出 : A液 47.5 mlで試料をカラムに吸着し、 B液 40 mlで洗浄後、 B液 10 0 から C液 100%への直線濃度勾配溶出 32ml
タンパク質の溶出は 2 8 0 nmの吸収でモニターし、 その結果を第 6図に示 した。 第 6図中の斜線の入った棒で示した画分は、 Rat2細胞増殖抑制活性を示 した画分である。 溶出液はフラク ショ ンコレクタ一で回収し、 各画分について は上述シームレスセルロース膜を使用して上記 A液に対して透析後、 実施例 1 の 5で述べた方法により Rat2細胞増殖抑制活性を測定した。 その結果を第 7図 し 7こ o
增殖抑制活性を示した第 6、 7図中の画分 IVについては、 セン トリブレップ - 1 0 (アミコン社製) を用いて膜濃縮後、 色素ァフィ二ティー担体レツ ドセ ファロ一ス C L— 6 B (ファルマンァ社製) を充塡したカラムにより、 条件 3 に示す方法でさらにクロマトグラフィーを行った。
条件 3 :
カラム : レツ ドセファロ一ス C L— 6 B充塡カラム ( 5 X 5 0 mm) 溶離液: A液 (2 0 mMリ ン酸緩衝液、 p H7.5、 0. I mM塩化ニッケル ) 3 ml
B液 ( 2 0 mMリ ン酸緩衝液、 p H7.5、 1. 0 M塩化ナ ト リウム 、 0. 1 mM塩化二ッゲル) 3 ml
流速: 0. 0 3 ml/分
溶出 : A液から B液への直線濃度勾配溶出
タンパク質の溶出は 2 8 0 nmの吸収でモニターした。 溶出液はフラクショ ンコレクタ一で回収し、 各画分については実施例 1の 5で述べた方法により Ra t2細胞増殖抑制活性を測定した。 その結果を第 8図に示した。 横軸 3.9m lよ り勾配溶出を開始した。 斜線のボックスは Rat2細胞増殖抑制活性の主画分を示 す。 第 8図中の斜線の入った棒で示した画分を精製標品とした。
以上の精製法により Rat2細胞増殖抑制活性物質を約 5 0 g得た。 なお精製 標品をメルカプトエタノール還元下、 S D S—ポリアク リルアミ ド電気泳動で 分析したところ、 分子量 3 9、 4 0. 5、 4 1キロダルトンの 3本のバンドが 銀染色により検出された。
精製標品の構造決定は以下の方法により行った。
S D S—ポリアク リルアミ ド電気泳動上の 3本のバンドをそれぞれ切り出し 、 4 M尿素存在下、 0. 1 Mト リス塩酸緩衝液、 p H 9. 0中、 リ ジルェン ド ぺプチダーゼ (和光純薬製) により 3 7°C、 8時間酵素消化を行った。 酵素消 化により得られたぺプチド断片は逆相カラムクロマ卜グラフィ一により分離し 、 プロティンシーケンサ一 P P S Q- 1 0 (島津製作所製) によりァミノ酸配 列を決定した。 その結果、 3本いずれのバンドからも同一のァミノ酸配列が得 られた。 その配列を配列番号 1および 2に示した。 決定したアミノ酸配列を夕
ンパク質データベースで検索した結果、 配列番号 1および 2のペプチドは、 そ れぞれラッ トアルギナ一ゼ [J. Biol. Chem., 63, 2245,(1988), Proc. Natl. Acad . Sci.U. S. A. , 84, 412, (1987), J. Biol. Chem, 262, 6280, (1987)] の N末端から 4 2 - 6 1残基および 1 7 3〜 1 9 1残基に相当するアミノ酸配列に一致してい た。 以上の結果から精製標品はラッ トアルギナーゼであると同定した。
7. 伊東細胞の単離および伊東細胞形質転換抑制活性の測定
伊東細胞の単離は、 力ヮダらによって行われた方法 [Eur. J. Biochem., 213 , 815, (1993)] に従って行った。
単離した伊東細胞を、 1 0 %牛血清を含むダルベッコ MEM培地 [Virology , 8, 396, (1959)] を用いて、 1.7X105 個 Zゥエルの細胞濃度に調製し、 細 胞培養用の 1 2穴プレート (コ一スター社製) に 2 m 1 /ゥエルで播種した。 5 %二酸化炭素存在下、 3 7 °Cで 2日間培養後、 培地を交換し、 実施例 1の 1 で調製した肝灌流液 LP6- 10を終濃度 5 %、 あるいは実施例 1の 6で精製したラ ッ トアルギナーゼを終濃度 1 μ gZm 1添加した培地を 2 m 1 Zゥエルで加え た。 5 %二酸化炭素存在下、 3 7 °Cで更に 4日間培養した時点で、 再び、 培養 開始後 2日目に行った上述方法と同じ方法で培地交換を行い、 更に 7 日間培養 を続けた。 この培養期間中における伊東細胞の形態の変化を光学顕微鏡下で観 察した。
第 9図に、 培養開始後 2、 6、 1 3 日目の伊東細胞の形態の変化を示した。 1 0 %牛血清を含むダルベッコ MEM培地で培養した伊東細胞は、 培養期間が 進むに従って繊維芽細胞様に形質転換する現象が観察された。 一方、 終濃度 5 %の肝灌流液、 および終濃度 1 fi g/m 1精製ラッ 卜アルギナーゼを添加した 場合には、 細胞内に脂肪粒をもつ伊東細胞の形態は保たれ、 形質転換は観察さ れず、 これら添加物によって、 伊東細胞の繊維芽細胞への形質転換が阻害され
8. アルギナーゼの伊東細胞形質転換抑制活性の測定
アルギナーゼの伊東細胞形質転換抑制活性は以下の方法により確認した。 実 施例 1の 6で得たラッ トアルギナ一ゼおよびゥシ肝アルギナーゼ (シグマ社製 ) をそれぞれ約 1 n g/m 1および 8 0 n g/ 1の濃度で、 実施例 1の 7 と
同様に伊東細胞の培養液に添加した。 その結果、 試料添加 1 2日後においても 伊東細胞の繊維茅様細胞への形質転換は観察されなかった。
9. 生体試料からのアルギナ一ゼの調製
実施例 1の 1 と同様に、 体重 2 5 0 ~ 2 7 0 gの雄 S Dラッ ト 4 8匹を用意 した。 ジェチルェ一テルの麻酔下に開腹し、 門脈にカテーテルを挿入して 2 0 °Cのリンガー溶液 2 0 m 1を門脈から注入した。 その時に肝上部の下大静脈を 切ってリ ンガー溶液が出るようにし、 肝を無血状態にした。 その後、 肝に出入 りする血管の周辺の組織をはがし、 門脈と肝上部下大静脈だけを残して残りは 皆閉じ、 肝臓を摘出後、 Shimkeらの方法 [J. Biol. Chem., 239, 3808, (1964年 )] に従い、 アセ トン沈殿、 熱処理、 エタノール沈殿を行った。 得られた肝抽 出液をマイレクス GV (ミ リポア社) を用いてフィルターろ過後、 レッ ドセフ ァロース C L— 6 Bカラムクロマトグラフィ一を下記の条件 Aで行った。
条件 A :
カラム : レツ ドセファロース C L— 6 B充塡カラム ( 2 5 X 2 0 0 mm) 溶離液: A液 ( 2 0 mMリ ン酸緩衝液、 pH7.5、 0. I mM塩化マンガン ) 250ml
B液 ( 2 0 mMリ ン酸緩衝液、 p H7.5、 1. 0 M塩化ナ ト リウム 、 0. 1 mM塩化マンガン) 250ml
流速: 1. 6 7 m l /分
溶出 : A液から B液への直線濃度勾配溶出
タンパク質の溶出は 2 8 0 n mの吸収でモニターした。 溶出液はフラクショ ンコレクタ一で回収し、 各画分についてはガーガンタ(Garganta)とボンド(Bon d)の報告したアルギナ一ゼ活性測定法 [アナリティカル ·バイオケミス ト リー (Analytical Biochemistry), 154, 388, (1986)] に従って評価した。
アルギナ一ゼ活性を示した画分については、 陽イオン交換担体を充填した力 ラムにより、 条件 Bに示す方法でさらにクロマトグラフィーを行った。
条件 B :
カラム : ハイロー ド S P—セファロ—ス HP CH i L o a d S P— S e p h a r o s e HP) ( 1 6/ 1 0 ) ( 1 6 X 1 0 0 mm、 フアルマシア)
溶離液: A液 ( 1 0 mMリ ン酸緩衝液、 p H 7 . 0 )
B液 ( 1 0 mMリン酸緩衝液、 p H 7. 0 、 1 . 0 M塩化ナトリウ ム)
流速: 3 m 1 Z分
溶出 : B液 0%から 30 までの直線濃度勾配溶出 360 ml
タンパク質の溶出は 2 8 0 n mの吸収でモニタ一した。 溶出液はフラクショ ンコレクターで回収し、 各画分については上記で述べた方法によりアルギナ一 ゼ活性を測定した。 以上の精製によりアルギナ一ゼを約 3 O mg得た。
1 0 . 生体試料から精製したラッ トアルギナ一ゼの肝硬変動物モデルにおける 肝繊維化抑制活性
( 1 ) 肝硬変動物モデルの作製
肝硬変誘発物質として四塩化炭素 (関東化学一 Merck社製、 原子吸光分析用
、 純度 99.9%、 Lot.No.605H1013) をォリブ油 (日興製薬社製、 日本薬局方
Lot. No.244257) で 70% (v/v) に希釈したものを用いた。 四塩化炭素に関 しては、 0. 4 5 m濾過膜 (コースター社製、 S T A R、 カタログ No.811
2) で濾過滅菌し、 オリブ油はメジユーム瓶に密閉した上で、 高圧蒸気滅菌 (1
21 °C、 1.2 気圧、 2 0分) 処理した。 また、 以下の薬品調製時に使用した器 具はすべて高圧蒸気滅菌済とした。 希釈に際しては、 20ml先端ルアーロック付 きガラス製注射筒 (夏目製作所製) に各薬剤を分取し、 連結針で薬剤人りの 2 注射筒を連結し、 5 0回ボンビングして均質溶液を得た。 調製は、 週 1回とし 褐色バイアル瓶に密栓して冷暗所に保存した。
使用動物は、 SD系 ·雄性ラッ ト [日本エス ' エル ' シ一社製、 体重 2 2 0 〜 2 4 0 g] を購入し、 約 1週間の馴致飼育の後に、 PBS投与群として 1 1匹、 実施例 1の 9で示した方法により取得した生体試料由来精製ラッ トアルギナー ゼ投与群として、 6 0 gZ匹/日および、 2 0 0 ^ g /匹 Z日、 各 1 3匹を 使用した。
ジェチルェ一テルの吸入麻酔処理後、 麻酔下で上腿部筋肉内に体重 1 kgあた り l m l ( 0 . 7 m 1四塩化炭素/ kg) を 1 m 1先端ルアーロック付プラスチ ック注射筒 (夏目製作所製) を用いて投与した。 投与間隔は、 毎週火 ·金曜日
の週 2回とし、 6週間投与した。
( 2 ) 肝灌流液およびリンガー溶液の投与方法
投与前にジェチルエーテルの吸入麻酔処理後 (四塩化炭素の投与がある火 · 金曜日は投与後) 、 陰茎静脈叢内に一匹あたり 0. 5111 1の? 83ぁるぃは生 体試料由来精製ラッ 卜アルギナ一ゼ 1 2 0 g/m 1或いは 2 0 0 〃 g/m 1 を含む P B Sを 2. 5 m 1デイスポーザブルブラスティ ック注射筒 (テルモ社 製) を用いて投与した。 投与間隔は、 四塩化炭素投与開始後 3週間目より 6週 間目まで毎日とした。
(3) 部検および処理方法
最後の四塩化炭素投与から 3 日目にラッ トを屠殺して、 ラッ ト解剖にて肝臓 を摘出し、 肝臓の各葉から 2〜 3 mmの厚さの切片をホルマリンで固定化後 1 週間目に、 肝臓の病理組織切片に関して、 膠原 ·弾性繊維の両者を特異的に染 め出すために、 へマトキシリ ン 'ェォジン (Hematoxylin · Eosin, HE) 染色法 とファス トグリーン ' シリウスレツ ド (Fast green、 Sirius red, FS) 染色法 で染色を実施した。 繊維化の進展度によって、 下記のように 4グレードに分類 した。
グレード 0 :新しいコラーゲン生成が全くない。
グレード 1 : コラーゲン生成が始まる。
グレード 2 :門脈域間のコラーゲン生成が完成している。
グレード 3 :肝硬変を起こしている。
第 2図に示した各グレードにおける典型的な繊維染色像を、 肝繊維化グレー ド判断基準とし、 各個体の肝繊維化グレードを判定した。
P B S投与群、 生体試料由来精製ラッ トアルギナーゼ (6 0 gZ匹/日お よび、 2 0 0 ; gZ匹/日) 投与群の肝繊維化グレードを第 3表に示す。 生体 試料由来精製ラッ トアルギナ一ゼ (2 0 0 g/匹 日) 投与群において、 肝 硬変が抑制されている。
第 3表
発生率 (%)
被検群 匹数 グレ―ド ■1
"P B S¾¥IT 11 27.3 72.7 生体試料由来精製
ラッ トアルギナ一ゼ 13 30.7 69.3 投与群(60 g/匹/曰)
生体試料由来精製
ラ ッ トアルギナ一ゼ 13 7.7 38.5 53.8 投与群(200/ ^/匹/日)
実施例 2
繊維化抑制活性を有するアルギニン分解酵素を大量調製するために、 以下に 示す遺伝子組み換え法によるアルギニン分解酵素の調製を行った。
1. 発現べクタ一 p N Sの造成: (第 1 0図参照)
ノバジヱン(Novagen)社より購入した pET-llaの Ndelサイ トとタ一ミネーター の間に Sailサイ トを導入した発現べクタ一を造成するため、 pET-llaの BamHIサ ィ トを切断し、 平滑末端とした後、 Ndelサイ トとの間に、 Sailサイ トを含む合 成リンカーを挿入した。
pET- 11a (ノバジヱン社製) 2 gを 20mMトリス— HCl(pH8.5), 10mM MgC , lOOmM KC1, lmMジチオスレィ トール (以下 DTTと省略) からなる緩衝液 (以 下これを K緩衝液と略記する) 20^1に溶解し、 10単位の BamHl (宝酒造社製 、 以下、 特に断らないかぎり制限酵素は宝酒造社製のものを使用) を加え、 37 てで 2時間消化反応を行なった。 エタノール沈殿後、 30i の DNAポリメラ一ゼ I緩衝液 [50mM卜リス— HCKPH7.5), lOm MgCh, 0. ImM dATP (デォキシァ デノ シン 3 リ ン酸) , 0. ImM dCTP (デォキンシチジン 3 リ ン酸) , 0. ImM dGTP (デォキングァノ シン 3 リ ン酸) , 0. ImM TTP (チミ ジン 3 リ ン酸) ] に溶か し、 6単位の大腸菌 DNAポリメラ一ゼ I ♦ クレノー断片 (宝酒造社製) を加え 、 37°Cで 60分間反応させ、 BamHI 消化によって生じた 5' 突出末端を平滑末端 に変えた。 該反応液をァガロースゲル電気泳動に供した後、 約 5.7kbの DNA断片 を回収した。
回収した DNA断片は 20〃 1の 50mMトリス— HC1(PH7.5), lOmM gCl2, lOOmM N aCl, ImM DTTからなる緩衝液 (以下これを H緩衝液と略記する) に溶解し、 10単位の Ndelを加え 37°Cで 1時間消化反応を行ない、 ァガロースゲル電気泳動 [0.7%ァガロース、 TAE緩衝液 (ImM EDTA) を含む 40mMト リスアセテー ト緩 衝液 (PH8.0) 以下、 すべてァガロースゲル電気泳動には TAE緩衝液を用いた] に供した後、 約 5.7kbの DNA断片を回収した。
また別に、 平滑末端に変えた BamHl 切断部位と Ndel切断部位を連結するため 、 配列番号 3および 4に示した DNAリンカ一 [SNS-01(29mer)および SNS- 02(31m er)と称する] をアプライ ド ·バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製 38 OA · DNA合成機を用いて合成した。
上記で得られた、 pET-lla由来の BamHI-Ndel断片(5.7kb) 0. を 50mM ト リス- HC1(PH7.8), lOmM MgCh, 10mM DTT, ImMアデノシン 3 リン酸 (以下 ATP と略記する) および 25/ g/ml牛血清アルブミ ン (以下 BSAと略記する) からな る液 (以下 T4リガーゼ緩衝液と略記する) 9 / 1に溶解し、 上記 DN Aリンカ一 を 0.01〃gと T4DNAリガーゼ [ニュー 'イングランド ·バイオラボ(New England BioLab)社製] 2, 000単位を加えて、 16°Cで 16時間結合反応を行なった。
該反応液を用いて大腸菌 HB101株 [ジーン(Gene), 2_, 7 5 ( 1 9 7 7 ) ] をコ一ェンらの方法 [Pro Natl. Acad. Sci. U S A, 6 9, 2 1 1 0 ( 1 9 7 2 ) ] (以下、 大腸菌の形質転換にはこの方法を用いる) によって形質転換 し、 アンピンリ ン耐性株を得た。 この形質転換株から公知の方法 [Nucleic Ac ids Res., 丄, 1 5 1 3 ( 1 9 7 9 ) ] (以下プラスミ ドの単離は特別の記載 が無い限りこの方法を用いる) に従ってプラスミ ドを単離した。 得られたブラ スミ ドの構造は制限酵素消化により確認した。 このプラスミ ドを pNSと称す。 上記の形質転換株からキイアジヱン (Qiagen) 社製のプラスミ ド調製キッ ト である〉 plasmidく midi kit ( 商品番号 12143)を用いてプラスミ ドを調製した o 取得したプラスミ ドはエタノール沈殿後、 l /g/〃l になるように 10mMトリ ス— HCKPH8.0), ImM EDTA (エチレンジァミン 4酢酸ナトリウム) からなる 緩衝液 (以下、 これを TE緩衝液と略記する) に溶解した。
2. ヒ 卜アルギナ一ゼの製造
( 1 ) ヒ ト肝臓からのアルギナ一ゼ cDNAのクロ一ン化とヒ トアルギナーゼ発 現プラスミ ドの造成 (第 1 1図参照)
ヒ ト肝臓組織より抽出された全 RNAを铸型とし、 オリゴ dTをプライマーと して 1本鎖 cDNAを合成した。 この 1本鎖 cDNAを铸型として、 完全長のヒ トアル ギナーゼをコ一ドする遺伝子部分をポリメラーゼ ' チヱイン ' リアクション ( Polymerase Chain Reaction;以下 P C Rと略記する) 法を用いて調製し、 実 施例 2の 1で造成した分泌発現べクタ一 pNSに組み込んだ。
ヒ ト肝臓組織より、 常法 [Biochemistry, , 5294 (1977) 〕 に従い抽出さ れた全 RNA 5〃gから、 1本鎖 cDNA合成キッ 卜であるスーパ一スクリプト TM (以 下 SuperScriptTMと記す) [ギブコ(G1BC0) BRL社製] を用いて、 オリゴ dTを プライマ一として 1本鎖 cDNAを合成した。 上記で得た 1本鎖 cDNAの 0.2%を P CRの铸型として使用した。
P C R用のプライマーとしては、 配列番号 5および 6に示す 2種の合成 DN A [SSA-03 (44raer) および SSA- 04 (36mer) と称する]をアプライ ド 'バイオ システムズ社製 3 8 0 A · DN A合成機を用いて合成した。
SSA-03には Ndelサイ トカ SSA- 04には Sal Iサイ 卜がそれぞれ導入されるよう に設計されているため、 P C Rで増幅された DN A断片は Ndelと Sailで切断し た後に、 pNSの Ndelサイ トと Sailサイ ト間に組み込むことができる。 P CRは 、 ジーンアンプ TM DNAアンプリ フィケ一シヨ ン ' リア一ジェン ト · キッ 卜 · ゥ ィズ ' アンプリタック τΜリコンビナント · タック · DNA ポリメラ一ゼ (以下 Ge neAmp™ DNA Am l if ication Reagent Kit with Ampl iTaq™ Recombinant Taq DNA Polymerase と記す) (宝酒造社製) を用いて行なった。 反応液の調製は キッ 卜の方法にしたがって行ない、 パーキンエルマ一 · シータス DN Aサ一マ ルザイクラ一 (PERKIN ELMER CETUS DNA Thermal Cycler) (宝酒造社製) を 用いて、 9 4°CZ30秒、 6 5 °CZ 1分、 7 2 °C/ 2分のインキュベーショ ンを 3 0サイクル行なった後、 さらに 7 2 °Cで 7分間ィンキュベ一トした。 反応終 了後、 クロロホルム抽出およびエタノール沈澱を行なった。
上記のエタノール沈殿による沈殿物を、 H緩衝液 30^1に溶解し、 20単位の N delおよび 20単位の Sailを加え、 37°Cで 2時間消化反応を行なった。 該反応液
を 1 %ァガロースゲル電気泳動後、 約 l.Okbの DNA断片を回収した。 pNS2 gを H 衝液 30〃1 に溶解し、 20単位の Ndelと 20単位の Mlulを加え 、 37°C 2時間消化反応を行なった。 該反応液を 1 %ァガロースゲル電気泳動後 、 約 0.8kbの DNA断片を回収した。
pNS2 gを H緩衝液 30 1 に溶解し、 20単位の Mlulと 20単位の Sailを加え 、 37°C 2時間消化反応を行なった。 該反応液を 0.7%ァガロースゲル電気泳動 後、 約 4.8kbの DNA断片を回収した。
上記で得た、 P CRで増幅した DNA由来の Nde卜 Sail断片(l.Okb) 0. l/ g と pNS由来の Ndel- Mlul断片(0.8kb) 0.02 z gと Mlu卜 Sal I断片(4.8kb) 0.1 を T 4 リガ一ゼ緩衝液 9 1に溶解し、 T4DNAリガーゼ 400単位を加えて、 16°C で 16時間結合反応を行なつた。
該反応液を用いて大腸菌 XLlBlue株 (ス トラタジーン社製) をコーェンらの 方法によって形質転換し、 アンピシリン耐性株を得た。 この形質転換株から公 知の方法に従ってプラスミ ドを単離し、 その構造を制限酵素消化により確認し た。 このプラスミ ドを pNS- hArglと称す。
上記で得た、 プラスミ ド pNS- hArglの塩基配列は、 アプライ Κ ·バイオシス テムズ社の塩基配列決定キッ 卜 [タック · ダイデォキシ ΤΜターミネータ一 .サ ィクル . シークェンシング . キッ ト(Taq DyeDeoxy™ Terminator Cycle Seque ncing Kit), 以下同様] を用いて決定した。 決定した塩基配列は、 配列番号 7 に示した。 その結果、 本実施例でクロ一ニングされた遺伝子は、 配列番号 8に 示す 322ァミノ酸からなるタンパク質をコ一ドしており、 このアミノ酸配列は タキグチら [Nucleic Acids Res. , 16, 8789, (1988年)] によって報告されて いるヒ トアルギナ一ゼと一致することが明らかになった。
(2) 大腸菌によるヒ トアルギナ一ゼの発現
実施例 2の 1で造成したプラスミ ドベクタ一 pNS- hArglを大腸菌 B L 2 1株 にコーェンらの方法によって形質転換し、 アンピシリ ン耐性株 Escherichia co BL21/pNS-hArg を得た。 3 0 0 m 1のバッフル付き三角フラスコに L-ブロ ス U0g バク ト ト リプトン、 5g ィ一ス トェクス トラク ト [以上、 ギフコ(DIF C0)社製] 、 5g NaCl/lL H20) 2 0 m 1を入れ、 高圧蒸気滅菌 (121°C、 1.2
気圧、 20分) 後、 濾過滅菌したアンピンリ ン溶液を最終濃度 100/ig/mlとなる ように添加し、 形質転換体である Escherichia coli BL21/pNS- hArgを植菌後、 37°Cで 8時間振とう培養 (220rpm) した。 3本の 1 Lのバッフル付き三角フラ スコに、 それぞれ、 いブロス 2 5 0 m lを入れ、 高圧蒸気滅菌 (121°C、 1.2気 圧、 20分) 後、 濾過滅菌したアンピシリ ン溶液を最終濃度 100 ig/mlとなるよ うに添加した。 上記の 2 0 m 1の培養液から 2. 5 m lをそれぞれ添加後、 37 °Cで 1 5時間振とう培養 (220rpm) した。 さらに、 3 0 Lのジャー培養機(丸 菱バイオェンジ社製 MSJ- N2型 30L)に 0.5 グリセロールを含む M9培地 (1.514 % Na2HP04'12H20, 0.3¾KH2P04, 0.5¾NaCl, 0.1¾NH4C1, 0.2 極東ペプトン, 0.246g/L MgS04, 8mg/L ビタミ ン Bl, 990 g/L FeSO" 880〃 g/L ZnSO 3 93 / g/L CuSO" 72 z g/L MnSO 8S g/L Na2B404, 37 / g/L (NH4)6 o 702. ) 15Lを入れ、 高圧蒸気滅菌 (121°C、 1.2気圧、 20分) 後、 濾過滅菌した アンピシリ ン溶液を最終濃度 100 g/mlとなるように添加し、 上記の 2 5 0 m
1 の培養液 3本分を添加した。 37°Cで通気攪拌培養 (4 5 0 r p m、 1 v vm ) し、 OD 6 0 0が 0.8に到達した時点で発現誘導剤であるイソプロピル一 3 —D—チォガラク 卜ピラノシド (Isopropyト/? - D-thiogalactopyranoside) (以 下、 I P TGと略記する) を最終濃度 0. ImMとなるように添加し、 ヒ トアル ギナ一ゼの発現を誘導した。 発現誘導後 4時間で培養を終了し、 培養液を遠心 分離し、 1 6 8 g (湿潤重量) の菌体を得た。
( 3 ) 大腸菌由来ヒ 卜アルギナーゼの精製
上記、 実施例 2の 2 ( 2 ) で得た培養菌体からのヒ トアルギナーゼの精製は 以下の方法で行った。
以下のヒ トアルギナーゼの精製操作は全て 0〜4°Cで行った。 得られた培養菌 体 1 6 8 g (湿潤重量) を、 6 0 0 m l の P B Sに懸濁後、 マン トンガウリ ン 破砕機 (同栄商事社製) を用い、 200kg/cm2 で 1回、 500kg/cm2 で 4回大腸菌 を破砕した。 (この操作も氷冷下で行うが、 1回の破砕で液温が上がるので、 4 °C以下に冷却してから次の破砕を行った。 ) こうして得られた破砕液を 10, 0 OO r pmで 4 0分間遠心分離し、 上清に同量の 8 0 %飽和硫酸アンモニゥムを 含む P B Sを加え、 3時間放置し、 硫安沈殿を行った。 さらに 10, 000 r p mで
4 0分間遠心分離し、 上清を疎水性相互作用クロマトグラフィーで精製した。 疎水性相互作用クロマトグラフィ一は下記の条件^で行った。
条件 :
カラム : フヱニルセファロース ファース トフ口一 (以下 Pheny卜 Sepharose F ast Flowと称す) (low subti tution) (ファルマシァ、 5 0 x 2 4 0 mm) 溶出液: A液 (P B S、 p H 7. 2、 4 0 %飽和硫酸アンモニゥム) 1 L
B液 (P B S、 p H 7. 2) 1 L
流速: 4 7 0 mlZ時間
溶出 : A液から B液の直線濃度勾配溶出
溶出液は 4 5 m 1ずつ分画し、 各画分をメルカプトエタノール還元下の SD S—ポリアクリルアミ ド電気泳動で分析し、 分子量 3 8キロダルトン付近のヒ トアルギナ一ゼのバンドを含む画分を集め、 Phenyl- Sepharoseヒ トアルギナ一 ゼ画分とした。
Pheny卜 Sepharoseヒ トアルギナ一ゼ画分 1 7 5 0 mlをシームレスセルロース 膜 (V i s k a s e S a l e s C o r p. ) を使用して 6 0 Lの 1 0 mM リ ン酸緩衝液 (P H 7. 0) に対して透析を 2回 (12時間、 3時間) 行った。 透 析液を陽イオン交換クロマ トグラフィ一で精製した。 陽イオン交換クロマ トグ ラフィ一は下記の条件 で行った。 陽イオン交換クロマ卜グラフィ一には逆浸 透精製水システム (ダイセル化学工業社製、 MOLSEP, SYSTEM BX-SU) で作製し たパイロジヱンフ リ一水を使用した。
条件 6 :
カラム : SP—セファロース ファース トフ口一 (以下 SP- Sepharose Fast Flow と記す) (フアルマシア、 5 0 x 2 0 0 nra0
溶出液: Α液 ( 1 0 mMリン酸緩衝液、 p H 7. 0 ) 1 L
B液 ( 1 0 mMリン酸緩衝液、 p H 7. 0, 0. 5 M塩化ナトリウム
) 1 し
流速: 4 0 0 mlZ時間
溶出 : A液から B液の直線濃度勾配溶出
溶出液は 4 2 m lずつ分画し、 各画分をメルカプトエタノール還元下の S D
S—ポリアクリルァミ ド電気泳動で分析し、 分子量 3 8キロダル卜ン付近のヒ トアルギナ一ゼ©バン ドを含む画分を集め、 SP- Sepharoseヒ トアルギナ一ゼ画 分とした。
SP-Sepharoseヒ トアルギナ一ゼ画分は 1 3 6 0 m gのタンパク質を含み、 ヒ トアルギナ一ゼの純度は 9 0 %以上であった。 また、 ガーガン夕(Garganta)お よびボンド(Bond)の報告したアルギナーゼ活性測定法 (Analytical Biochemis try、154、 388-394、 1986年) に従ってアルギナ一ゼ活性を測定したところ、 1 9 9 O UZm lであった。 なお、 タンパク質量は、 バイオーラッ ド(BI0 - RAD) 社のプロティンァッセィキッ トを用いてゥシ血清アルブミ ン換算した値である さらに、 実施例 1の 6に示した方法によりラッ ト繊維芽細胞 R a t— 2の增 殖抑制活性を測定したところ、 ヒ トアルギナ一ゼ 1.5〃g/mlにおいて、 LP6〜10 を 1.25%添加したときと同等の増殖抑制活性が観察された。
3. ラッ トアルギナ一ゼの製造
( 1 ) ラッ ト肝臓からのアルギナ一ゼ cDNAのク口―ンィヒとラッ トアルギナ一 ゼ発現ブラスミ ドの造成 (第 1 2図参照)
ラッ ト肝臓組織よりポリ A(polyA) RNAを抽出し、 オリゴ d Tをプライマ一 として 1本鎖 cDNAを合成した。 この 1本鎖 cDNAを铸型として、 完全長のラッ ト アルギナーゼをコ一ドする遺伝子部分をポリメラ一ゼ · チヱイ ン · リアクショ ン (Polymerase Chain Reaction; P C R) 法を用いて調製し、 実施例 2の 1 で造成した分泌発現べクタ— PNSに組み込んだ。
ラッ ト肝臓組織 1 gより、 polyA RNA抽出キッ トであるファース ト トラック
(Fast Track; インビトロジヱン社製) を用いて、 約 50〃gの polyA RNAを取 得した。 具体的試薬および方法は、 キッ 卜に付与されているプロ 卜コールに従 つた。
上記で得た polyA RNA 50 /gのうち 1 ^ gより、 1本鎖 cDNA合成キッ トであ る SuperScriptTM(GIBCO BRし社製)を用いて、 オリゴ dTをプライマーとして 1 本鎖 cDNAを合成した。 上記で得た 1本鎖 cDNAの 1 0 %を P C Rの铸型として使 用した。
P CR用のプライマーとして、 配列番号 1 1および 1 2に示す合成 DNA [S SA-07 (44mer) および SSA- 08 (36mer) ]をアプライ ド 'バイオシステムズ社 3 8 0 A · DNA合成機を用いて合成した。
SSA-07には Ndelサイ 卜が、 SSA-08には Sal Iサイ 卜がそれぞれ導入されるよ うに設計されているため、 P C Rで增幅された DN A断片は Ndelと Sailで切断 した後に、 pNSの Ndelサイ トと Sailサイ ト間に組み込むことができる。 P C R は、 GeneAmpTM DNA Amplification Reagent Kit with Ampl iTaq™ Recombinan t Taq DNA Polymerase (宝酒造社製) を用いて行なった。 反応液の調製はキ ッ 卜の方法にしたがって行ない、 PERKIN ELMER CETUS DNA Thermal Cycler ( 宝酒造社製) を用いて、 9 4 °CZ30秒、 6 5 °C/ 1分、 7 2 °CZ 2分のインキ ュべ一シヨンを 3 0サイクル行なった後、 さらに 7 2 で 7分間ィンキュベー 卜した。 反応終了後、 クロ口ホルム抽出およびエタノール沈澱を行なった。 上記のエタノール沈殿による沈殿物を、 H緩衝液 30 zlに溶解し、 20単位の N delおよび 20単位の Sailを加え、 37°Cで 2時間消化反応を行なった。 該反応液 を 1 %ァガロースゲル電気泳動後、 約 1. Okbの DNA断片を回収した。
PNS2 gを H緩衝液 30 / 1 に溶解し、 20単位の Ndelと 20単位の Mlulを加え 、 37°C 2時間消化反応を行なった。 該反応液を 1 %ァガロースゲル電気泳動後 、 約 0.8kbの DNA断片を回収した。
pNS 2 を H緩衝液 30 21 に溶解し、 20単位の Mlulと 20単位の Sailを加え 、 37°C 2時間消化反応を行なった。 該反応液を 0.7%ァガロースゲル電気泳動 後、 約 4.8kbの DNA断片を回収した。
上記で得た、 P C Rで増幅した DN A由来の Nde卜 Sail断片(1. Okb) QA/ag と pNS由来の Ndel-Mlul断片(0.8kb) 0.02 gと Mlul- Sal I断片(4.8kb) OA g を T 4 リガ一ゼ緩衝液 9〃1に溶解し、 T4DNAリガーゼ 400単位を加えて、 16°C で 16時間結合反応を行なつた。
該反応液を用いて大腸菌 XUBlue株 (ストラタジーン社製) をコ一ェンらの 方法によって形質転換し、 アンピシリン耐性株を得た。 この形質転換株から公 知の方法に従ってプラスミ ドを単離し、 その構造を制限酵素消化により確認し
た。 このプラスミ ドを pNS- rArglと称す。
上記で得た、 プラスミ ド pNS- rArglの塩基配列は、 アプライ ド 'バイオシス テムズ社の塩基配列決定キッ ト (Taq DyeDeoxy™ Terminator Cycle Sequenci ng Kit) を用いて決定した。 決定した塩基配列は、 配列番号 9に示した。 その 結果、 本実施例でクローニングされた遺伝子は、 配列番号 1 0に示す 323アミ ノ酸からなるタンパク質をコードしており、 このアミノ酸配列はォォタケら [ J. Biol. Chem. , 263, 2245(1988)] によって報告されているラッ トアルギナー ゼと一致することが明らかになった。
(2) 大腸菌によるラッ トアルギナーゼの発現
実施例 2の 3 ( 1 ) で造成したプラスミ ドベクタ一 pNS- rArglを大腸菌 B L 2 1株にコ一ェンらの方法によって形質転換し、 アンピシリ ン耐性株 Escheric hia coli BL21ノ pNS_rArglを得た。 3 0 0 m 1のバッフル付き三角フラスコに L -ブロス 2 0 m lを入れ、 高圧蒸気滅菌 (121°C、 1.2気圧、 20分) 後、 濾過滅 菌したアンピンリ ン溶液を 100〃 g/mlとなるように添加し、 形質転換体である旦 scherichia coli BL21/pNS_hArglを植菌後、 37°Cで 8時間振とう培養 (220rpm ) した。 1 Lのバッフル付き三角フラスコに、 いブロス 1 2 5 m 1を入れ、 高 圧蒸気滅菌 (121°C、 1.2気圧、 20分) 後、 濾過滅菌したアンピシリ ン溶液を最 終濃度 100 g/mlとなるように添加した。 上記の 2 0 m 1の培養液から 1. 2 5 m 1を添加後、 37°Cで 1 5時間振とう培養 (220rpm) した。 さらに、 5 しの ジャ一培養機(ミツヮバイオシステム社製、 KMJ- 5C- 6U型)に 0.5%グリセロール を含む M9培地 2.5Lを入れ、 高圧蒸気滅菌 (121°C、 1.2気圧、 20分) 後、 濾過 滅菌したアンピシリ ン溶液を最終濃度 100 g/mlとなるように添加し、 上記の 1 2 5 m lの培養液を添加した。 37°Cで通気攪拌培養 ( 6 0 0 r p m、 1 v v m) し、 OD 6 0 0力 0.8に到達した時点で発現誘導剤である I PTGを最終 濃度 0. ImMとなるように添加し、 ヒ トアルギナ一ゼの発現を誘導した。 発現 誘導後 4時間で培養を終了し、 培養液を遠心分離し、 2 0 g (湿潤重量) の菌 体を得た。
(3) 大腸菌由来ラッ トアルギナ一ゼの精製
上記、 実施例 2の 3 (2) で得た培養菌体からのラッ トアルギナーゼの精製 は以下の方法で行った。
以下のラッ トアルギナーゼの精製操作は全て 0〜4°Cで行った。 得られた培 養菌体 2 0 g (湿潤重量) から、 8 gを秤取り、 4 0 m 1の P B Sに懸濁後、 超音波破砕機 [ブランソン(BRANSON)社製、 SONIFIER, CELL DISRUPTOR 200, フラッ トチップ、 アウ トプッ トレベル 1 0 ] で 1 0秒間、 3回大腸菌菌体を破 砕した。 (この操作も氷冷下で行うカ^ 1回の破砕で液温が上がるので、 4°C 以下に冷却してから次の破碎を行った。 ) こうして得られた破砕液を 15, 000 r pmで 2 0分間遠心分離し、 上清に同量の 8 0 %飽和硫酸アンモニゥムを含む P B Sを加え、 3時間放置し、 硫安沈殿を行った。 さらに 15, OOOrpmで 2 0分 間遠心分離し、 上清を疎水性相互作用クロマトグラフィーで精製した。 疎水性 相互作用クロマトグラフィ一は下記の条件!^で行った。
条件《:
カラム : Phenyl— Sepharose Fast Flow (low subti tution) (ファノレマシァ、 1 0 x 1 3 0 mm)
溶出液: A液 (P B S、 p H 7. 2, 4 0 %飽和硫酸ァンモニゥム) 2 5 m l
B液 (P B S、 p H 7. 2) 2 5 m l
流速: 1 0 mlZ時間
溶出 : A液から B液の直線濃度勾配溶出
溶出液は 5 m 1ずつ分画し、 各画分をメルカプトエタノ一ル還元下の S D S 一ポリアクリルァミ ド電気泳動で分析し、 分子量 3 8キロダルトン付近のラッ トアルギナ一ゼのバンドを含む画分を集め、 Phenyl- Sepharoseラッ トアルギナ ーゼ画分とした。
Pheny卜 Sepharoseラッ トアルギナ一ゼ画分 2 0 mlをシームレスセルロース 膜 (V i s k a s e S a l e s C o r p. ) を使用して 2. 5 Lの 1 0 m
Mリン酸緩衝液 (p H 7. 0 ) に対して透析を 2回 (12時間、 3時間) 行った。 透析液を陽イオン交換クロマトグラフィ一で精製した。 陽イオン交換クロマ卜 グラフィ一は下記の条件!^で行った。 陽イオン交換ク口マトグラフィ一には逆
浸透精製水システム (ダイセル化学工業社製、 MOLSEP, SYSTEM BX-SU) で作製 したパイロジェンフリー水を使用した。
条件^:
カラム : SP_Sepharose Fast Flow (フアルマシア、 2 5 x 1 0 0 mm)
溶出液: A液 ( 1 0 mMリン酸緩衝液、 P H7.0) 150m 1
B液 ( 1 0 mMリン酸緩衝液、 ρ Η7· 0, 0. 5 Μ塩化ナトリウム) 15
0m 1
流速: 5 0 mlZ時間
溶出 : A液から B液の直線濃度勾配溶出
溶出液は 1 0 m lずつ分画し、 各画分をメルカプトエタノール還元下の S D S—ポリアクリルァミ ド電気泳動で分析し、 分子量 3 8キロダルトン付近のラ ッ トアルギナ一ゼのバンドを含む画分を集め、 SP
- Sepharoseラッ トアルギナ一ゼ画分とした。
SP- Sepharoseラッ トアルギナ一ゼ画分は 2 3 m gのタンパク質を含み、 ラッ ト アルギナ一ゼの純度は 9 0 %以上であった。 また、 実施例 2の 2 ( 3 ) と同様 の方法によりアルギナ一ゼ活性を測定したところ、 1 4 6 O U/m lであった なお、 タンパク質量は、 バイオ—ラッ ド(BIO- RAD)社のプロテインアツセィ キッ トを用いてゥシ血清アルブミ ン換算した値である。
さらに、 実施例 1の 6に示した方法によりラッ ト繊維芽細胞 R a t — 2の増 殖抑制活性を測定したところ、 ラッ トアルギナ一ゼ 1.5 zg/mlにおいて、 LP6- 1 0を 1.25%添加したときと同等の増殖抑制活性が観察された。 実施例 3
1. 注射剤
常法により、 次の組成からなる注射剤を調製した。
実施例 2の 2で得られたヒ トアルギナ一ゼ 2 5mgをリ ン酸緩衝生理食塩水 ( P B S) 溶液 8 0 mlに溶解し、 ポリソルベー ト 8 0 (和光純薬社製) を 2 mg、 ヒ ト血清アルブミ ン (シグマ社製) 1 0 0mg, Mn C 1 2 1. 2 61^ぉょび0 —マンニトール 1. 5 gを加え、 P B Sで容量を 1 0 0mlにした。 得られた溶
液を 0 . 2 2 i mのディスポ一ザブル製メンブランフィルターを用いて無菌濾 過後、 ガラスバイアルに 2 mlずつ無菌的に充塡して、 注射剤 ( 1バイアルあた り活性成分 0 . 5 mgを含有する) を得た。
アルギナーゼ 0. 5mg
ポリソルべ一ト 8 0 0. 04mg
ヒ ト血清アルブミ ン 2. Omg
D—マンニト一ル 30mg
M n C 1 0. 0252mg
N a C 1 16mg
K C 1 0. 4mg
N a 2 H P 0 · 1 2水和物 5. 8mg
2. 0ml
2 . 注射剤
常法により、 次の組成からなる注射剤を調製した。
実施例 2の 2で得られたヒ 卜アルギナ一ゼ 2 5 を? 8 S溶液 8 0 mlに溶解 し、 ポリソルべ一ト 8 0 (和光純薬社製) を 2 mgおよび D—マンニトール 1 . 5 gを加え、 P B Sで容量を 1 0 0 mlにあわせた。 得られた溶液を 0 . 2 2 〃 mのディスポ一ザブル製メンブランフィルターを用いて無菌濾過後、 ガラスバ ィアルに 2 mlずつ無菌的に充塡して、 注射剤 ( 1バイアルあたり活性成分 0 . 5 mgを含有する) を得た。
アルギナ一ゼ 0. 5mg
ポリソルべ一ト 8 0 0. 04mg
D—マンニ トール 30mg
N a C 1 16mg
K C 1 0. 4mg
K H 2 P 0 4 0. 4mg
N a H P 0 4 · 1 2水和物 5. 8mg
2. 0ml
3. 注射剤
常法により、 次の組成からなる注射剤を調製した。
実施例 2の 2で得られたヒ トアルギナーゼ 2 511^を? 83溶液8 Omlに溶解 し、 Mn C 1 21.26mgを加え、 P B Sで容量を 1 0 0 mlにあわせた。 得られた 溶液を 0. 2 2 amのディスポーザブル製メンブランフィルターを用いて無菌 濾過後、 ガラスバイアルに 2 mlずつ無菌的に充塡して、 注射剤 ( 1バイアルあ たり活性成分 0. 5 mgを含有する) を得た。
アルギナ一ゼ 0.5mg
Mn C 1 0.0252mg
N a C 1 16mg
KC 1 0.4mg
N a H P 0 1 2水和物 5.8mg
全量 2.0ml
4. 注射剤
常法により、 次の組成からなる注射剤を調製した。
実施例 2の 2で得られたヒ トアルギナーゼ 2 51^を? 83溶液8 0 mlに溶解 し、 P B Sで容量を 1 0 0mlにあわせた。 得られた溶液を 0. 2 2 mのディ スポ一ザブル製メ ンブランフィルタ一を用いて無菌濾過後、 ガラスバイアルに 2 mlずつ無菌的に充塡して、 注射剤 ( 1バイアルあたり活性成分 0. 5mgを含 有する) を得た。
アルギナーゼ 0.5mg
N a C 1 16mg
KC 1 0.4mg
KH2 P04 0.4mg
N a 2 H P 0 · 1 2水和物 5.8mg
2.0ml 実施例 4
1. ポリエチレングリコール (以下, P EGと略記する) 修飾ラッ トアルギナ —ゼの製造
以下の試験では実施例 2の 2 (3) で記載したパイロジェンフリー水を使用 した。
実施例 2の 3の方法に従って調製したラッ トアルギナ一ゼ 7 0 7 mgを、 セ ルロースアセテート膜 (ザルトリウス社製、 Sartolab P20 plus) でろ過滅菌 後、 条件ひに記載の条件で陽イオン交換クロマトグラフィーを行い、 タンパク 質溶液中のパイ口ジヱンレベルを低下させた。
条件ひ
カラム : ハイロー ド S Pセファロ一ス HP (H i L o a d S P S e p h a r o s e H P、 ファルマシァ、 2 6 X 1 0 0 mm)
溶出液 A : ( 1 0 mMリン酸緩衝液、 p H 7. 5 ) 1 2 5m l
溶出液 B : (1 0 mMリン酸緩衝液、 pH 7. 5、 0. 2 5 M塩化ナトリウム
) 1 2 5 m l
流速: 4 6 8 m l 時間
溶出 : A液から B液への直線濃度勾配溶出
温度: 4 °C
H i L o a d S P S e p h a r'o s e HPカラムからのラッ トアルギナ一ゼ の溶出は 2 8 0 nmの吸収でモニタ一した。
得られたラッ トアルギナ一ゼ 5 1 5 mgを含むタンパク質溶液を終濃度 0. 1 mM塩化マンガン含有 5 0 mMリン酸緩衝液 (pH 7. 3) 1 0 7. 5 m l となるように調製した。 この溶液にジメチルスルホキシド 1 8 m lに溶解した メ トキシポリエチレングリコールプロピオン酸 N—ヒ ドロキシスクシンィ ミ ド エステル (SHEARWATER POLYMERS社、 米国、 平均分子量約 5, 0 0 0 ) 4. 5 5 gを加え、 4 °Cで 1時間 3 0分攪拌した。 さらに反応液 に 1 Mェタノ一ルァミ ン 3. 2 m lを加えて反応を停止させた。
反応停止液は限外ろ過膜 (セン トリブレップ- 1 0、 ミ リポア社) で 5 0 m 1に濃縮した後、 条件 に記載の条件でゲル濾過クロマトグラフィーを行ない 、 未反応 P EG修飾試薬などを除去した。
条件 3
カラム : セフアク リル S_ 2 0 0 (フアルマシア、 5 X 4 2 cm) およびセフ アクリル S- 2 0 0 (フアルマシア、 5 X 8 7 c m) を直列に連結して使用 溶離液: (P B S、 p H 7. 2、 0. I mM塩化マンガン) 3 L
流速: 2 5 2 mL/時間
温度: 4。C
セフアクリル S- 2 0 0カラムからの P E G修飾ラッ トアルギナーゼの溶出 は 2 8 0 nmの吸収でモニタ一した。
得られた P E G修飾ラッ トアルギナーゼは 4 7 8 mgのタンパク質を含み、 純度は 9 5 %以上であった。 なお P EG修飾ラッ トアルギナ一ゼのタンパク質 量は 2 8 O nmの吸収で測定し、 実施例 2の 3 (3 ) に記載の方法でタンパク 質濃度を定量したラッ トアルギナ一ゼ標品の 2 8 0 nmにおける吸収で換算し た。
またマトリ ックス支援レーザ一解離イオン化飛行時間型質量分析計 (B r u k e r社、 R e f l e x) を用いて P E G修飾ラッ トアルギナ一ゼの分子量を 測定したところ、 分子量 7 4, 0 0 0ダルトンをピークとするシグナルを得た さらに実施例 2の 2 (3) と同様の方法によりアルギナーゼ活性を測定した ところ、 2 3 5 8 U/m 1であった。 また実施例 1の 6に示した方法によりラ ッ 卜繊維芽細胞 R a t - 2の増殖抑制活性を測定したところ、 P E G修飾ラッ 卜アルギナ一ゼ 1. 5 g/m 1において、 LP6-10を 1. 2 5 %添加したとき と同等の増殖抑制活性が観察された。
2. P EG修飾ラッ トアルギナ一ゼのラッ ト体内血中動態
PEG修飾ラッ トアルギナ一ゼをラッ 卜に投与した際の血中アルギナ一ゼ活性 および血中アルギニン濃度の経時的な変動について調べた。
( 1 ) 投与方法
使用動物は、 SD系 ·雄性ラッ ト (日本エス · エル · シ一社製、 体重 220〜240 G) を購入し、 約 1週間の馴化飼育後に供試した。 投与サンプルとしては実施例 2の 3で得られたラッ トアルギナ一ゼ、 実施例 4の 1で得られた P EG修飾ラ
ッ トアルギナ一ゼ、 および陰性対照群として 0. 1 mM塩化マンガンを含む P B Sを使用した—。 ラッ トアルギナ一ゼと P EG修飾ラッ トアルギナーゼはタン パク質濃度が 2 0 0 g/m 1になるよう 0. 1 mM塩化マンガンを含む P ίΒ Sを用いて調整した。 ジェチルェ一テルの吸入麻酔処理後、 各投与サンプルを 陰茎静脈叢内に 1匹あたり 0.5mlの投与容量で 2.5mlディスポーザブルプラステ ィ ック注射筒(テルモ社製)を用いて投与した。
( 2 ) 採血の間隔および方法
経時的変化を確認するための採血は、 1, 3, 6および 24時間もしくは 1, 3, 7, 10 および 14日後に同一個体から行った。 採血は極力動物に対する影響が無い方法 とし、 尾静脈から 1回、 1匹あたり 0.3mlとした。 ラッ トを保定用トラップ (夏 目製作所製) に保持し、 尻尾のみが自由に動かせる状態とし、 デイスポーザブ ル注射針(テルモ製、 23 XI")を注射筒接続部から切断したものを尾静脈に刺入 し、 その断端から滴下する静脈血を抗凝固剤として 5%EDTA*2K溶液 10 1の入 つたサンプルチューブ (エツペン ドルフ製、 容量 1.5ml) に受けた。 軽く転倒 混和して、 凝血していないことを確認してから、 毎分 3000回転で 10分間遠心分 離して血漿を得た。 なお、 血漿サンプルは分析時まで- 80°Cで凍結保存し、 融 解後架状物を除去するために毎分 3000回転で 10分間遠心分離を行ってから用い た。
( 3 ) 血中アルギニン濃度測定
実施例 4の 2 (2) で得られたラッ ト血漿 5 1を用い、 Cohenと Michaudの 方法 [Anal. Biochem., 211, 279, (1993)]に従い、 6-aminoquinolyl-N-hydro xysuccinimidyl carbamate (日本ウォーターズ社) で誘導体化してアミノ酸 分析を行った。
P B S投与対象群、 ラッ 卜アルギナ一ゼ投与群、 PEG修飾ラッ トアルギナ ーゼ投与群それぞれの血中アルギニン濃度の測定結果を第 1 3図と第 1 4図に 示す。 P EG修飾ラッ トアルギナ一ゼ投与により、 ラッ ト血中アルギニン濃度 の持続的な抑制効果が観察された。
( 4 ) 血中アルギナーゼ活性測定
実施例 4の 2 ( 2 ) で得られたラッ ト血漿中のアルギナーゼ活性は、 Baston
eらの方法 [Anal . B i ochem., 191, 384, (1990)]に基づいて測定した。 即ち、 アルギナーゼによって基質アルギニンが加水分解されて生成するオル二チンを 了ミノ酸分析により定量し、 3 7 で 1分間あたりに 1 〃m o 1のオル二チン を生成するアルギナーゼの活性を 1 Uと定義した。 なお生成したオル二チンの 定量は実施例 4の 2 ( 3 ) で記載したァミノ酸分析法で測定した。
P B S投与対象群、 ラッ トアルギナ一ゼ投与群、 P E G修飾ラッ トアルギナ一 ゼ投与群それぞれの血中アルギナーゼ活性の測定結果を第 1 5図と第 1 6図に 示す。 第 1 5図および第 1 6図から血中半減期を算出すると、 ラッ トアルギナ ーゼが 1時間、 P E G修飾ラッ トアルギナーゼが 4 5時間であった。 このよう に P E G修飾アルギナーゼは生体内での安定性が改善され、 アルギナ一ゼの作 用を長期にわたって持続させることが可能であった。 産業上の利用可能性
本発明の組織繊維化抑制剤により、 肝臓、 腎臓、 肺、 膝臓および皮膚等の組 織の繊維化を抑制することが可能となった。 また、 本発明の組織繊維化抑制剤 は、 優れた血中安定性および臓器送達性を有する。
配 列 表
配列番号: 1
配列の長さ : 2 0
配列の型: アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー :直鎖状
配列の種類:ペプチド
起源
生物名 : ラッ ト
組織名 :肝臓
配列:
Glu Thr Glu Tyr Asn Val Arg Asp His Gly Asp Leu Ala Phe Val Asp
1 5 10 15
Val Pro Asn Asp
20 配列番号: 2
配列の長さ : 1 9
配列の型: アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー :直鎖状
配列の種類:ぺプチド
起源
生物名 : ラッ ト
組織名 :肝臓
配列:
Asp 〖le Val Tyr lie Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr
1 5 10 15 lie lie Lys
配列番号: 3
配列の長さ : 29
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー :直鎖状
配列の種類:他の核酸、 合成 DNA
配列:
GATAAGCTTG GGCTGCAGGT CGACTTACA 29 配列番号: 4
配列の長さ : 31
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー :直鎖状
配列の種類:他の核酸、 合成 DNA
配列:
TATGTAAGTC GACCTGCAGC CCAAGCTTAT C 31 配列番号: 5
配列の長さ : 34
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー :直鎖状
配列の種類:他の核酸、 合成 DNA
配列:
GGAATTCCAT ATGAGCGCCA AGTCCAGAAC CATA 34 配列番号: 6
配列の長さ : 36
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー :直鎖状
配列の種類:他の核酸、 合成 DNA
配列:
CCGGGTCGAC TTACTTAGGT GGGTTAAGGT AGTCAA 36 配列番号: 7
配列の長さ : 9 6 9
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類: DN A
起源
生物名 : ヒ ト
組織名 :肝臓
配列:
ATG AGC GCC AAG TCC AGA ACC ATA GGG ATT ATT GGA GCT CCT TTC TCA 48 Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr lie Gly lie lie Gly Ala Pro Phe Ser
1 5 10 15
AAG GGA CAG CCA CGA GGA GGG GTG GAA GAA GGC CCT ACA GTA TTG AGA 96 Lys Gly Gin Pro Arg Gly Gly Val Glu Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg
20 25 30
AAG GCT GGT CTG CTT GAG AAA CTT AAA GAA CAA GAG TGT GAT GTG AAG 144 Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys Glu Gin Glu Cys Asp Val Lys
35 40 45
GAT TAT GGG GAC CTG CCC TTT GCT GAC ATA CCT AAT GAC AGT CCC TTT 192 Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp He Pro Asn Asp Ser Pro Phe
CAA ATT GTG AAG AAT CCA AGG TCT GTG GGA AAA GCA AGC GAG CAG CTG 240
Gin He Val Lys Asn Pro Arg Ser Val Gly Lys Ala Ser Glu Gin Leu
65 70 75 80
GCT GGC AAG GTG GCA GAA GTC AAG AAG AAT GGA AGA ATC AGC CTG GTG 288
Ala Gly Lys Val Ala Glu Val Lys Lys Asn Gly Arg lie Ser Leu Val
85 90 95
CTG GGC GGA GAC CAC AGT TTG GCA ATT GGA AGC ATC TCT GGC CAT GCC 336
Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala lie Gly Ser lie Ser Gly His Ala
100 105 110
AGG GTC CAC CCT GAT CTT GGA GTC ATC TGG GTG GAT GCT CAC ACT GAT 384
Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val lie Trp Val Asp Ala His Thr Asp
115 120 125
ATC AAC ACT CCA CTG ACA ACC ACA AGT GGA AAC TTG CAT GGA CAA CCT 432 lie Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser Gly Asn Leu His Gly Gin Pro
130 135 140
GTA TCT TTC CTC CTG AAG GAA CTA AAA GGA AAG ATT CCC GAT GTG CCA 480
Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys Gly Lys He Pro Asp Val Pro
145 150 155 160
GGA TTC TCC TGG GTG ACT CCC TGT ATA TCT GCC AAG GAT ATT GTG TAT 528
Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys lie Ser Ala Lys Asp lie Val Tyr
165 170 175
ATT GGC TTG AGA GAC GTG GAC CCT GGG GAA CAC TAC ATT TTG AAA ACT 576 lie Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr lie Leu Lys Thr
180 185 190
CTA GGC ATT AAA TAC TTT TCA ATG ACT GAA GTG GAC AGA CTA GGA ATT 624
Leu Gly lie Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Arg Leu Gly lie
195 200 205
GGC AAG GTG ATG GAA GAA ACA CTC AGC TAT CTA CTA GGA AGA AAG AAA 672
6 o
Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys 210 215 220
AGG CCA ATT CAT CTA AGT TTT GAT GTT GAC GGA CTG GAC CCA TCT TTC 720 Arg Pro l ie Hi s leu Ser Phe Asp Val Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe 225 230 235 240
ACA CCA GCT ACT GGC ACA CCA GTC GTG GGA GGT CTG ACA TAC AGA GAA 768 Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu
245 250 255
GGT CTC TAC ATC ACA GAA GAA ATC TAC AAA ACA GGG CTA CTC TCA GGA 816 Gly Leu Tyr l i e Thr Glu Glu H e Tyr Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly
260 265 270
TTA GAT ATA ATG GAA GTG AAC CCA TCC CTG GGG AAG ACA CCA GAA GAA 864 Leu Asp l i e Met Glu Val Asn Pro Ser leu Gly Lys Thr Pro Gl u Glu
275 280 285
GTA ACT CGA ACA GTG AAC ACA GCA GTT GCA ATA ACC TTG GCT TGT TTC 912 Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val Ala He Thr Leu Ala Cys Phe
290 295 300
GGA CTT GCT CGG GAG GGT AAT CAC AAG CCT ATT GAC TAC CTT AAC CCA 960 Gl y Leu Ala Arg Gl u Gl y Asn Hi s Lys Pro l i e Asp Tyr Leu Asn Pro 305 310 315 320
CCT AAG TAA 969 Pro Lys 配列番号: 8
配列の長さ : 3 2 2
配列の型: アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー :直鎖状
配列の種類:ペプチド
Z 9
06ΐ S8T 081
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S6 06 98
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Leu Gly lie Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Arg Leu Gly lie
195 200 205
Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys
210 215 220
Arg Pro lie His Leu Ser Phe Asp V l Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe 225 230 235 240
Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu
245 250 255
Gly Leu Tyr lie Thr Glu Glu lie Tyr Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly
260 265 270
Leu Asp lie Met Glu Val Asn Pro Ser Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu
275 280 285
Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val Ala He Thr Leu Ala Cys Phe
290 295 300
Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys Pro He Asp Tyr Leu Asn Pro 305 310 315 320
Proし ys 配列番号: 9
配列の長さ : 9 7 2
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー :直鎖状
配列の種類: DNA
起源
生物名 : ラッ ト
組織名 :肝臓
配列:
9
ojj 八 ds\ OJJ aqj sAq A^Q SAI riai nio sA na na aiij ¾iv 八 08 V33 VIO IVO VOO Oil 9VV VOO VVV 010 VVO OVV 013 010丄丄丄 300010 ο^ΐ ssi οετ
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922 330 3V3 00010131V OOV VOO 11V VOO 01V 10V 3V3 OVO VOO 100 013
S6 06 98
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882 01001010V 31V VDV VOO IVV OVV OVO 30V OVO 030 VIO 010130丄 08 S丄 QL 99 nai ui3 nig usy ¾IV sAq AIQ ι¾Λ J3S 3JV OJJ USV sAq Ι¾Λ 311 uio
0X3 OVO VVO IVV 330 VVV VOO 010131003 VOO OVV OVV 010 LLV VVO
09 SS OS
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ZQl 丄丄丄 333 OOV 0V9 IVV 300 310 IVO 010111300013 IVO 000 OVO OVO
Of' SS
3 JV m usv J^l ni9 sAq naq sAq nio Λ nai ^io ¾iv sA VOV 010 IVV 0V1 OVO VOV VVO VVV 113 OVV OVD 010 013 300130 VVV
08 92 z
3JV naq ^iv ¾1V 0Jd sA \ \ Aio A]93JV OJd uio Aio sAq
96 OOV VII OO VOO 300100 VVV OVO V19900 VOO VOO 133 OVO VOO OVV
ST 01 S ΐ
J3S a d 0Jd ¾iv Ai 311 811 "19 311 0Jd s^l OJJ sA J9S J3S ¾3N
8 131 Oil 133 000 VOO 01V LLV OVO VIV 333 OVV VOO OVV 00130V OXV
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145 150 155 160
GGA TTC TCC TGG GTG ACC CCC TGC ATA TCT GCC AAG GAC ATC GTG TAC 528
Gl y Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys l ie Ser Ala Lys Asp l ie Val Tyr
165 170 175
ATC GGC TTG CGA GAT GTG GAC CCT GGG GAA CAC TAT ATA ATA AAA ACT 576
H e Gl y Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Gl u Hi s Tyr l i e He Lys Thr
180 185 190
CTG GGC ATT AAG TAT TTC TCA ATG ACT GAA GTG GAC AAG CTG GGA ATT 624
Leu Gly l ie Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Lys Leu Gly l i e
195 200 205
GGC AAA GTG ATG GAA GAG ACC TTC AGC TAC CTG CTG GGA AGG AAG AAA 672
Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Phe Ser Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys
210 215 220
AGG CCC ATT CAC CTG AGT TTT GAT GTT GAT GGA CTG GAC CCA GTA TTC 720
Arg Pro l ie Hi s Leu Ser Phe Asp Val Asp Gly Leu Asp Pro Val Phe
225 230 235 240
ACC CCG GCT ACG GGC ACA CCC GTT GTG GGA GGC CTA TCT TAC AGA GAA 768
Thr Pro Ala Thr Gl y Thr Pro Val Val Gl y Gly Leu Ser Tyr Arg Glu
245 250 255
GGT CTC TAC ATC ACA GAA GAA ATT TAC AAG ACA GGG CTA CTT TCA GGA 816
Gly Leu Tyr l i e Thr Glu Glu l i e Tyr Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gl y
260 265 270
CTA GAT ATC ATG GAA GTG AAC CCA ACT CTT GGG AAG ACA CCA GAG GAG 864
Leu Asp l i e Met Glu Val Asn Pro Thr Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu
275 280 285
GTG ACT CGT ACT GTG AAC ACG GCA GTG GCG TTG ACC TTG TCT TGT TTT 912
Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val Ala Leu Thr Leu Ser Cys Phe
290 295 300
GGA ACG AAA CGG GAA GGT AAT CAT AAG CCA GAG ACT GAC TAC CTT AAA 960
Gly Thr Lys Arg Glu Gly Asn His Lys Pro Glu Thr Asp Tyr Leu Lys 305 310 315 320
CCA CCG AAA TAA 972 Pro Pro lys 配列番号: 1 0
配列の長さ : 3 2 3
配列の型: アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー :直鎖状
配列の種類:ぺプチド
起源
生物名 : ラッ ト
組織名 :肝臓
配列:
Met Ser Ser Lys Pro Lys Pro lie Glu lie lie Gly Ala Pro Phe Ser
1 5 10 15
Lys Gly Gin Pro Arg Gly Gly Val Glu Lys Gly Pro Ala Ala Leu Arg
20 25 30
Lys Ala Gly Leu Val Glu Lys Leu Lys Glu Thr Glu Tyr Asn Val Arg
35 40 45
Asp His Gly Asp Leu Ala Phe Val Asp Val Pro Asn Asp Ser Pro Phe
50 55 60
Gin He Val Lys Asn Pro Arg Ser Val Gly Lys Ala Asn Glu Gin Leu 65 70 75 80
Ala Ala Val Val Ala Glu Thr Gin Lys Asn Gly Thr lie Ser Val Val
85 90 95
Leu Gly Gly Asp His Ser Met Ala He Gly Ser lie Ser Gly His Ala
100 105 110
Arg Val His Pro Asp Leu Cys Val lie Trp Val Asp Ala His Thr Asp
115 120 125
lie Asn Thr Pro Leu Thr Thr Ser Ser Gly Asn Leu His Gly Gin Pro
130 135 140
Val Ala Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys Gly Lys Phe Pro Asp Val Pro 145 150 155 160
Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys lie Ser Ala Lys Asp lie Val Tyr
165 170 175
He Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr lie lie Lys Thr
180 185 190
Leu Gly He Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Lys Leu Gly lie
195 200 205
Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Phe Ser Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys
210 215 220
Arg Pro lie His Leu Ser Phe Asp Val Asp Gly Leu Asp Pro Val Phe 225 230 235 240
Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Ser Tyr Arg Glu
245 250 255
Gly Leu Tyr He Thr Glu Glu lie Tyr Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly
260 265 270
Leu Asp lie Met Glu Val Asn Pro Thr Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu
275 280 285
Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val Ala Leu Thr Leu Ser Cys Phe
290 295 300
Gly Thr Lys Arg Glu Gly Asn His Lys Pro Glu Thr Asp Tyr Leu Lys 305 310 315 320
Pro Pro Lys 配列番号: 1 1
配列の長さ : 34
配列の型:核酸.
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸、 合成 D N A
配列:
GGAATTCCAT ATGAGCTCCA AGCCAAAGCC CATA 34 配列番号: 1 2
配列の長さ : 3 6
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー :直鎖状
配列の種類:他の核酸、 合成 D N A
配列:
CCGGGTCGAC TTATTTCGGT GGTTTAAGGT AGTCAG 36