WO1998020150A1

WO1998020150A1 - Procede de preparation d'un compose destine a baisser le taux de cholesterol

Info

Publication number: WO1998020150A1
Application number: PCT/JP1997/004067
Authority: WO
Inventors: Chiaki Saitoh; Hideyo Kumazawa; Kazuo Aisaka; Toru Mizukami; Ryoichi Katsumata; Katsuhiko Ando; Keiko Ochiai; Kozo Ouchi
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Priority date: 1996-11-07
Filing date: 1997-11-07
Publication date: 1998-05-14
Also published as: US6485931B2; US20010005587A1; AU4886097A; US20010034041A1; CA2242301A1; AU737976B2; EP0879892A1; US6312919B1; EP0879892A4

Description

コレステロール低減化物質の製造法技術分野

本発明は、コレステロール低減化物質の製造法及びコレステロール低減化用組成物、並びにそれに使用明する新規コレステロールデヒドロゲナーゼ、

4ーコレステン一 3—オンデヒドロゲ田ナ一ゼ、コプロスタン一 3—オンデヒドロゲナーゼに関する。背景技術

コレステロール含量の高い食品を過剰に摂取することが血清中コレステロールを増大させ、また高コレステロール血清濃度が心疾患の重大な危険因子であることは広く知られている。そこで、食品の品質を劣化させずに食品中のコレステロールを選択的に低減する加工技術が求められている。食品中のコレステロールを低減する技術の中で生化学的な技術としては、微生物によりコレステロールを分解する方法（特開昭 6 3— 2 6 723 1 号公報）が知られているが、副産物を生成し不安全である。またコレステロールをェピコレステロールに酵素変換する方法（WO 93Z2 5 702) が知られている。

B e i t zらによる米国特許第 492 1 7 1 0号明細書には、植物由来のコレステロール還元酵素によりコレステロールをコプロス夕ノールに変換する方法が記載されており、またユウパクテリゥム · スピ一シ一ズ AT C C 2 1 40 8のような細菌由来のコレステロール還元酵素によりコレステロール^コプロス夕ノールに変換する方法が示唆されている。同じく B e i t z らによる米国特許第 5436004号明細書には、上記植物由来の酵素でクリームを処理したときのコレステロールからコプロス夕ノールへの変換率が 0. 0 1 % (第 5欄表 1参照）であることが記載されている。しかし、このような低いコプロス夕ノールへの変換率は到底実用的といえるものではない。

E YS S ENによるイギリス特許第 1 23 7483号明細書には、ラッ卜の糞便から分離されたユウパクテリゥム属細菌がコレステロールをコプロス夕ノールに還元することが記載され、同じく EYS S ENによる B i o c h i m i c a e t B i o p h y s i c a Ac t a, 348 ( 1 974) 2 7 9— 284によると、その細菌が、コレステロールを 4—コレステン一 3—オンを経てコプロス夕ノールに還元することが推定されている。

B e i t zらによる Ap p l i e d M i c r o b i o l o g y a n d B i o t e c h n o l o g y 43 , 887 ( 1 9 9 5 ) には、ユウバクテリゥム属細菌（ATCC 5 1 222 ) がミセル中のコレステロールをコプロス夕ノールへ菌体変換すること、その変換過程において 4ーコレステン一 3—オンと極微量のコプロスタノンを検出したこと、及び上記細菌によるコレステロールの還元のメカニズムはコレステロ一ル還元酵素の純粋な調製物が得られた後に研究されるであろうことが記載されている。

しかし、現在までコレステロールを含有する物質中のコレステロールを、 NAD (P) や NAD (P) Hを補酵素とするコレステロールデヒドロゲナ一ゼ、 4—コレステン一 3—オンデヒドロゲナーゼ、コプロスタン一 3 一オンデヒドロゲナーゼの酵素作用を利用し、 4—コレステン— 3—オン、コプロスタン一 3—オンを経てコプロス夕ノールに変換することが確認されたことはなく、またコレステロールを還元する菌から、コレステロール ■ を含有する物質中のコレステロールを、 4ーコレステン一 3—オン、コプロスタン— 3—オンを経てコプロス夕ノールに変換するそれぞれの酵素が単離されたこともなく、ましてこれらの変換酵素やそれを含む菌体で食品を処理した報告はない。

ノカルディア属、アルカリゲネス属、プロテウス属由来の、至適 pHが

9. 0付近で補酵素として NAD (P) を要求する、コレステロールの定量に用いられるコレステロールデヒドロゲナ一ゼは知られているが（特公平 2— 1 8 0 64号公報）、中性 pHでは活性が低く、食品処理には到底実用的といえるものではない。

ラット糞便から 4ーコレステン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼの取得が試みられたが、急速に失活して精製はできず到底実用的ではない（E u r o p e a n J . o f B i o c h em i s t r y 37, 1 43 ( 1 97 3) ) 。

ホスホリパーゼゃプロテア一ゼゃリパーゼの食品処理がコレステロールォキシダーゼによる変換を促進することが知られているが（特開平 5— 7 63 1 1号公報）、まだコレステロールのコプロス夕ノールへの酵素変換での効果は知られていない。

肉が NAD (H) を含有すること（J o u r n a l o f F o o d S c i e n c e 3 7， 6 1 2 ( 1 9 72 ) ) 、またニコチンアミドが N ADの分解を阻害することは知られている（A c h i v e s o f B i o c h em i s t r y a n d B i o p h i s i c s 1 56, 143 ( 1 97 3 ) ) 。しかし、コレステロールをコプロス夕ノールに酵素変換する場合にニコチンアミドを添加することは知られていない。

食品コレステロールを分解するために、乳酸菌にコレステロールォキシダーゼ遺伝子を導入することは知られている（Ap p l i e d M i c r o b i o l o g y a n d B i o t e c h n o l o g y 3 7, 330 ( 1 992) ) 。

これら酵素の応用例として、前記 B e i t zらによる米国特許第 543 6 0 04号明細書には、植物由来のコレステロール還元酵素を経口投与する血清コレステロ一ル値低下療法が提案されている。またコレステロールを還元する細菌（ATCC 5 1 2 22) を高コレステロール血症ゥサギに経口投与すると血清コレステロール値が低下することが報告されている (L e t t e r s i n Ap p l i e d M i c r o b i o l o g y 20, 1 3 7 ( 1 9 9 5) ) 。

コプロス夕ノールの腸管吸収性が非常に低いことは知られている（Am e r i c a n J . o f P h y s i o l o g y 2 5 1 , G49 5 ( 1 98 6 ) ) ので、コレステロールをコプロス夕ノールに変換することはコレステロール低減法として有効である。ただし食品中のコレステロールを、 4—コレステン一 3—オン、コプロスタン _ 3—オンを経て、コプロス夕ノールに酵素変換してコレステロールを低減するコレステロール低減化物質の実用的な製造法は知られていない。また、その製造法に使用しうる実用的な酵素の製造法も知られていない。発明の開示

本発明の課題は、食品や飼料における、実用的なコレステロール低減化物質の新規製造法を提供することにある。本発明の課題はまた、上記実用的なコレステロール低減化物質の製造法に適した中性 p H領域に至適 p H を有する新規コレステロールデヒドロゲナ一ゼ、弱酸性である肉の pHに至適 p Hを有する新規な 4ーコレステン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼ及びコプロスタン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼ、並びにこれらを含む菌体及び ■■ その処理物を提供することにある。本発明の課題はさらに、上記の 3種類の新規酵素を含有するか、これらの新規酵素を含む菌体を含有する血清コレステロール値を低下せしめるコレステロール低減化用組成物を提供することにある。

本発明者は、上記課題を解決するために、中性 p H領域や弱酸性領域に至適 p Hを有するコレステロール還元変換酵素群を見いだすべく、種（ s p e c i e s ) レベルで 3 0 0種にもわたる放線菌、力ビ、細菌を中心とした保存微生物、また、各種土壌 1 0 0種類から分離した好気性微生物、さらに、ヒト糞便 7試料、ヒト以外の哺乳類 8種の糞便試料、鳥類 9種の糞便試料からの嫌気性微生物等、数多くの微生物をスクリーニングし、また酵素活性検出用培地ゃ菌体の回収法についても鋭意検討した結果、以下に述べる本発明に到達した。

すなわち、本発明は、肉、卵、乳、魚介類及びそれらを含む調理加工食品、又は動物用、家禽用及び養魚用飼料など、コレステロールを含有する物質中のコレステロールを、中性 p H領域に至適 p Hを有するコレステロ一ルデヒドロゲナーゼと、弱酸性領域に至適 p Hを有する 4ーコレステン一 3—オンデヒドロゲナーゼ及びコプロスタン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼの 3種類の酵素又はそれらを含む菌体で処理し、コレステロールをコプロス夕ノールに変換してコレステロールを低減させることを特徴とするコレステロール低減化物の製造方法及びコレステロールの低減化方法に関する。

また、本発明は、ユウパクテリゥム属に属する菌株が生産する、上記中性 p H領域に至適: Hを有するコレステロールデヒドロゲナーゼ、弱酸性領域に至適 P Hを有する 4—コレステン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼ及びコプロスタン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼの 3種類の酵素、これら 3種類 ■ の酵素を含有するコレステロール低減化用組成物、並びにこれら酵素群を産生するユウパクテリゥム属に属する菌体を含有するコレステロール低減化用組成物に関する。

さらに、本発明は、コレステロールを含有する物質中のコレステロールを上記酵素群を利用してコプロス夕ノールに変換する際に、ニコチンアミド、ホスホリパ一ゼとニコチンアミド、又はリン酸イオンを添加することを特徴とするコレステロール低減化物の製造方法及びコレステロールの低減化方法に関する。

以下に本発明のコレステロール低減化物質の製造法を詳細に説明する。

本発明において、コレステロールを含有する物質としては、肉、卵、乳、魚介類又はそれらを含有する調理加工品、ならびに動物用、家禽用及び養魚用飼料などを例示することができるが、コレステロールを含有する物質であればこれら例示したものに限定されるものではない。

本発明において、コレステロ一ルデヒドロゲナ一ゼとは次の反応を行うものをいう。

コレステロール +NAD (P)

→4—コレステン一 3—オン + N AD (P) H また、本発明において、 4—コレステン一 3—オンデヒドロゲナーゼとは次の反応を行うものをいう。

4ーコレステン一 3—オン + NAD (P) H

→コプロスタン一 3—オン + NAD (P) 同じく本発明において、コプロスタン— 3—オンデヒドロゲナ一ゼとは次の反応を行うものをいう。

コプロスタン一 3 _オン + NAD (P) H

—コプロスタノ一ル + NAD (P) ■■ 本発明における、「至適 p H」とは、最大活性値の 8 0 %以上の相対活性値を有する P H領域をいい、かかる p H領域内に p H 7 . 0が含まれる場合を、本発明においては「中性 p H領域に至適 p Hを有する」とした。また、同様に、本発明において「弱酸性領域に至適 p Hを有する」とは、至適 p Hの領域内に p H 5 . 5を含み、酸性側に最大活性値を有する場合をいう。

本発明におけるコレステロ一ルを含有する物質中のコレステロールを、コレステロ一ルデヒドロゲナ一ゼ、 4—コレステン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼ、コプロスタン一 3—オンデヒドロゲナーゼの酵素作用を順次利用して、 4—コレステン一 3—オン、コプロスタン一 3—オンを経てコプロス夕ノールへ変換する方法としては、これら酵素を用いる酵素変換法とこれら酵素活性を有する菌体を用いる菌体変換法のいずれも用いられる。

酵素変換法としては、例えば、上記コレステロールデヒドロゲナ一ゼ、 4—コレステン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼ及びコプロスタン— 3—オンデヒドロゲナ一ゼの酵素活性を有するものをコレステロール含有物質に添加してコレステロ一ルをコプロス夕ノールに変換する方法を挙げることができ、この酵素変換法に使用できる酵素としては、精製された酵素に限らず、酵素活性を有するものであれば精製されていない粗酵素であってもよい。

この酵素変換法を用いる場合は、コレステロ一ルデヒドロゲナ一ゼによる処理と、 4—コレステン— 3—オンデヒドロゲナーゼによる処理と、コプロスタン一 3—オンデヒドロゲナーゼによる処理とを酵素を順次添加する等連続的に行うのが、酵素処理プロセスの簡素化、変換率の向上等実用性の観点から特に望ましい。

上記微生物変換法としては、上記コレステロールデヒドロゲナ一ゼ、 4 W ■■ ーコレステン— 3—オンデヒドロゲナ一ゼ、コプロスタン一 3—オンデヒドロゲナーゼ活性の少なくとも一つの酵素活性を有する微生物菌体又はその処理物をコレステロール含有物質に添加してコレステロ一ルをコプロス夕ノールに変換する方法を挙げることができるが、これら酵素活性を併せ有する微生物菌体又はその処理物を用いることが望ましい。また、これら酵素活性を有する組み換え微生物菌体又はその処理物なども使用することができる。

上記酵素活性を有するもの（以下「酵素源」という。）は、通常粉体又は水溶液の形態でコレステロール含有物質に加えられる。また、必要に応じて、 N A D ( P ) 、 N A D ( P ) Hなどの補酵素、ホスホリパ一ゼ、リパ一ゼ、プロテア一ゼなどの酵素、あるいはニコチンアミド、リン酸ィォン等を単独又は組み合わせて酵素源と併用することができる。

肉、例えば牛、豚、羊、鶏の肉の処理においては、酵素源を挽肉に混ぜるか、スライス肉に散布するか、ブロック肉に注入する。また、屠殺前後に血管中に酵素源を注入することもできる。

乳の処理においては、乳に酵素源を添加するか、酵素源を固定化した担体に乳を通過させる。また、乳発酵食品の場合は、乳の発酵時に酵素源を添加することもできる。

卵の処理においては、全卵に酵素源を注入するか、又は割卵して得た卵黄に酵素源を混合する。

また、肉、乳、卵、魚介類を調理する際に、酵素源を添加してもよい。動物用、家禽用、及び養魚用飼料においては、酵素源で処理された飼料原料を用いたり、また飼料を調製する工程で酵素源を配合することができる。

上記酵素処理においては、コプロス夕ノールへの酵素変換が可能な、処理条件（温度、時間、 pH) 、酵素添加量が選ばれ、一般的には反応温度 2〜7 0°C、 pH4〜9で、 0. 5〜 1 X 1 0³時間行われるが、実用性の観点からコレステロールを含有する被処理食品自体の p Hに至適 p Hを有するコレステロール還元酵素を用いることが望ましい。

コレステロールデヒドロゲナーゼ、 4—コレステン— 3—オンデヒド口ゲナーゼ、コプロスタン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼの各酵素の使用量は、食品中コレステロール 1 g当たり 1〜 1 X 1 0⁵単位、好ましくは 1 X 1 0 ²〜 1 X 1 0⁴単位である。

必要に応じて、上記酵素の補酵素である NAD (P) 又は NAD (P) Hを、コレステロール l g当たり l X l O—⁴〜2 X l O gを添加することができる。

必要に応じて、ニコチンアミドを食品中濃度として 0. 0 1〜 5 %となるように添加することもできる。これら補酵素の分解活性が強い肉においては、ニコチンアミドを 0. 1 %以上になるように添加することが好ましい。

必要に応じて、リン酸イオンを 5〜 2 5 mMとなるように添加することもできる。

必要に応じて、ホスホリパーゼをリン脂質 1 g当たり 1〜 1 X 1 0⁵単位、リパーゼを脂質 1 gあたり 1〜 1 X 1 0⁵単位添加することもできる。

本発明の新規酵素としては、具体的にコレステロールデヒドロゲナ一ゼ A、 4ーコレステン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼ A及びコプロスタン— 3 —オンデヒドロゲナ一ゼ Aと、コレステロールデヒドロゲナーゼ8、 4一コレステン— 3—オンデヒドロゲナーゼ B及びコプロスタン一 3—オンデヒドロゲナーゼ Bを挙げることができる。これら酵素の製造方法及び理化学的性質を以下に述べる。新規コレステロ一ルデヒドロゲナーゼ A、 4—コレステン一 3—オンデヒドロゲナーゼ A及びコプロスタン— 3—オンデヒドロゲナーゼ Aを製造するにあたり使用される微生物としては、上記コレステロールデヒドロゲナーゼ A、 4ーコレステン— 3—オンデヒドロゲナ一ゼ A及びコプロス夕ンー 3—オンデヒドロゲナーゼ A生産能を有する微生物であれば如何なるものでもよく、またそれらの微生物の変種もしくは変異株でもよい。コレステロ一ルデヒドロゲナ一ゼ八、 4—コレステン— 3—オンデヒドロゲナーゼ A及びコプロスタン一 3—オンデヒドロゲナーゼ A生産能を有する微生物の具体例として、例えばユウバクテリゥム 'エスピー（E u b a c t e r i um s p . ) C P 2があげられる。

上記ユウバクテリゥム ' エスピー（E u b a c t e r i urn s p . ) C P 2は本発明者が、ライオンの糞便より新たに分離した菌株で、その菌学的性質は下記のとおりである。

なお、本菌株は下記基本培地を用いて嫌気的条件下 3 7°Cで液体静置培養することにより、良好な生育を示すものである。各性質に関する試験はこの条件に従って検討した。

基本培地；カジトン 1 %、酵母エキス 1 %、可溶性デンプン 0. 5 %、ピルビン酸ナトリウム 0. 5 %、チォグリコール酸ナトリウム 0. 0 5 %、塩化カルシウム 0. 0 5 %、レサズリン 0. 000 1 %、レシチン 0 1 % (ρΗ 7. 5 )

(a) 形態的性質

①細胞の形短桿状菌でアーモンド型を呈することもある,

②細胞の大きさ 0. 5〜0. 7 mX O. 7〜 1. 0 zm

③細胞の多形性

④運動性 ·

⑤胞子；無

(b) 培養的性質

好気的あるいは嫌気的条件において、肉汁寒天平板培地及び肉汁液体培地での生育は見られなかった。

本菌株が生育しうる基本培地と培養条件における培養的性質を以下に示す

①基本培地寒天平板培養（ 14日間培養）

1 ) 生育の様相；弱々しい小さなコロニ一を形成

2 ) 色；ぬけるような白色

3) 光沢；有

4) 拡散性色素；無

②基本培地液体培養（3日間培養）

1 ) 表面生育；無

2) 濁度；底辺部に乳白濁状に生育

③基本培地におけるゼラチン穿刺培養

1 ) 生育の状態；良好

2 ) ゼラチンの液化；無

(c ) 基本培地培養における生理学的性質

①グラム染色性；陽性

②硝酸塩の還元；陰性

③脱窒反応；陰性

④ MRテスト；陰性

⑤ VPテスト；陰性

⑥インドールの生成；陰性

⑦硫化水素の生成；陽性 ·■

⑧デンプンの加水分解；陰性

⑨エスクリンの分解；陽性

⑩基本培地よりカジトン 1 %と酵母エキス 1 %とを除去した培地による無機窒素源の利用

1 ) 硝酸塩；陰性

2 ) アンモニゥム塩；陰性

⑪色素の生成；無

⑫ゥレア一ゼ；陰性

⑬ォキシダ一ゼ；陰性

⑭カタラ一ゼ；陰性

⑮生育の範囲

1 ) 生育 p H範囲；

p H 6. 0〜 p H 7. 7 (最適生育 pH 7. 3付近）

2 ) 生育温度範囲；

2 8 °C〜4 4°C、（最適生育温度； 3 5°C付近）

⑯酸素に対する態度；絶対嫌気性

⑰ O— Fテスト（H u g h L e i f s o n法）；陰性

⑱酸及びガスの生成

1 ) L—ァラビノース；酸（無）、ガス（無）

2 ) D—キシロース；酸（無）、ガス（無）

3 ) D—グルコース；酸（有）、ガス（無）

4) D—マンノース；酸（有）、ガス（無）

5 ) D—フラクトース；酸（無）、ガス（無）

6 ) D—ガラクト一ス；酸（有）、ガス（無）

7 ) マルト一ス；酸（無）、ガス（無） 8) シユークロース；酸（無）、ガス（無）

9) ラクトース；酸（無）、ガス（無）

1 0) トレハロース；酸（無）、ガス（無）

1 1 ) D—ソルビト一ル；酸（無）、ガス（無）

1 2) D—マンニトール；酸（無）、ガス（無）

1 3) イノシ卜一ル；酸（無）、ガス（無）

1 4) グリセリン；酸（無）、ガス（無）

1 5) デンプン；酸（無）、ガス（無）

1 6 ) 糖類からの代謝産物；酪酸あるいは酢酸

(d) その他の諸性質；ァニデント（An— I DENT) システムによるテス卜

① α—ダルコシダ一ゼ；陽性

② β 一ダルコシダーゼ；陽性

③アルカリフォスファターゼ；陽性

④ a—ガラクトシダ一ゼ；陽性

⑤フエ二ルァラニンアミノぺプチダーゼ；陰性

⑥アルギニンの分解；陽性

⑦ィンドキシルアセテートの分解；陰性

本菌株は、グラム陽性の絶対嫌気性短桿状細菌で、胞子を形成せず、運動性がなく、力タラ一ゼ、ォキシダーゼ、ゥレアーゼが共に陰性であり、グルコース、ラクト一スから酸を生成し、主な代謝産物は酪酸あるいは酢酸であった。これらの微生物学的性質を有する菌株の分類学的位置について、パージエイズ、マニュアル、ォブ、システマティック、バクテリオ口ジ一 (B e r g e y s Ma n u a l o f S y s t ema t i c B a c t e r i o l o g y v o l . 2、 1 986 ) の記載と照合した結果、本菌株を、 E u b a c t e r i u m属に属する細菌であると同定し、 C P 2菌株をユウバクテリゥム. エスピー C P 2 (E u b a c t e r i u m s p. C P 2) と命名した。本菌株は、平成 8年 4月 1 2日に工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号）に F ERM B P— 5 50 1として寄託されている。

本発明のコレステロールデヒドロゲナーゼ A、 4—コレステン— 3—ォンデヒドロゲナーゼ A、コプロスタン一 3—オンデヒドロゲナーゼ Aを生産する微生物の培養に用いられる培地としては、炭素源、窒素源、無機物などを含有する合成培地又は天然培地のいずれも使用できる。

炭素源としては、例えば可溶性デンプン、ラクトース、ピルビン酸、グルコース、糖蜜などの種々の炭水化物が用いられ、その使用量は、 1〜2 0 gZLが好ましい。

窒素源としては例えば硫酸アンモニゥム、リン酸アンモニゥム、炭酸ァンモニゥム、酢酸アンモニゥムあるいはペプトン、酵母エキス、コーン · スティープ ' リカ一、カゼイン分解物、肉エキスなどの窒素含有有機物などが用いられ、その使用量は、 1〜20 gZLが好ましい。

無機物としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシゥムなどが用いられ、その使用量は 0. 1〜2 gZL程度が好ましい _c レシチンなどの界面活性剤の使用量は 0. 0 1〜 1 gZLが好ましい。また、チォグリコール酸ナトリウムの使用量は 0. l〜 l gZLが好ましい培養は、静置又は攪拌培養を嫌気的条件下で行う。培養温度は、菌が生育し、コレステロールデヒドロゲナ一ゼ八、 4—コレステン一 3 _オンデヒドロゲナ一ゼ八、コプロスタン一 3—オンデヒドロゲナーゼ Aが生成する温度であればよく、好ましくは 3 5〜40°Cである。培養時間は条件により異なるが、コレステロールデヒドロゲナ一ゼ八、 4—コレステン— 3 ·■

—オンデヒドロゲナーゼ A、コプロスタン— 3—オンデヒドロゲナ一ゼ A が最大量に生産される時間まで培養すればよく、通常 5〜 1 0日程度である。

C P 2株が産生するコレステロールデヒドロゲナ一ゼ Aは新規酵素であり、その理化学的性質及び精製法は以下のとおりである。

(a) 作用：次の反応を触媒する。

コレステロ一ル + NAD P→4—コレステン一 3—オン + NAD PH

(b) 基質特異性：

本酵素は 3 iS位に水酸基をもつステロイドに反応し、コレステロールを

1 0 0とした相対活性は 3シトステロ一ル、カンペステロール、スチグマステロールでそれぞれ 38、 74、 30である。

( c ) 至適 p H ： 6. 5〜 7. 8

(d) 安定 pH ： 5. 3〜9. 0

酵素液を各 pH緩衝液で、 37°C、 1 5分間静置し、残存活性を測定し、最大活性値の 50 %以上の pH領域を安定] 3 H範囲とした。（以下同じ）

( e ) 力価の測定：

0. 3 3 %T r i t o nX- 1 0 0を含有する 3mMコレステロ一ルミセル溶液 0. 2m l に、 0. 5 %T r i t o n X— 1 00と 1 mMジチォスレイトール（以下「DTT」という。）を含有する 20 mMピぺラジン -N, N ' —ビス一（2—ェ夕ン硫酸）（以下「 P I P E S」という。）緩衝液（PH 7. 5 ) 0. 3mし 1 0mMのNAD溶液0. 1 m 1を混合し、これに酵素液 0. 0 5m lを加え、 3 7 °Cで 30分間反応後、 0.

1 m 1のクロ口ホルムを添加してステロールを抽出して反応を停止する。

次に、 T L CZF I Dィァトロスキャンを用いて、反応液中に生成した

4ーコレステン一 3—オンを定量する。対照としてあらかじめ熱失活した · 酵素を用いて同様に反応液中の 4ーコレステン— 3—オンを測定する。 1 分間に 1 ΠΊ Ο 1の 4ーコレステン— 3—オンを生成する酵素活性を 1単位とする。

( f ) 作用適温の範囲：

P H 7. 5、 3 0分間の反応で 40°Cまで温度上昇とともに活性は増大する。

(g) 温度安定性の範囲：

40°C、 1 0分間の加熱処理で処理前の 8 0 %以上の活性を保持する。

(h) 阻害剤、金属イオンの影響：

阻害剤無添加時の酵素活性を 1 00とし、それぞれ ImM p—クロ口マーキュリーフエニルスルホン酸塩（P CMB) 、ョ一ドアセトアミド、エチレンジァミン四酢酸塩（EDTA) を添加し、 pH 7. 5、 3 7°C、 30分間反応した場合の相対活性はそれぞれ 0、 82、 1 0 5である。また、本酵素は、 ImMの塩化鉄、塩化銅の存在下で反応させると無添加の場合にくらべ相対活性はそれぞれ 9 5、 3. 2である。

( i ) 精製法：

培養物を遠心分離して集菌し、この菌体を 2 OmMP I P E S緩衝液

(p H 7. 5、 ImMDTT含有）に懸濁する。超音波処理により菌体を破砕し、さらに 0. 2 %T r i t o nX— 1 00存在下で超音波処理後、遠心分離にて固形分を除去し、粗酵素液を得る。その粗酵素液を 20mM P I P E S緩衝液（p H 7. 5、 1 mMDTT、 0. 2 %T r i t o n X 一 1 00、 1 0 %グリセロール含有）に対して透析した後、同緩衝液で平衡化したブルーセファロ一ス C L— 6 B (フアルマシア製）に吸着させる。次いで食塩濃度を 0〜 3. 0 Mに連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、活性画分を集める。得られた活性画分を同緩衝液に対して透析後、レッドセファロース CL— 6 B (フアルマシア製）に吸着させる。次いで食塩濃度を 0〜3. 0 Mに連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、活性画分を集めて精製標品とする。

( j ) 補酵素：

i3—ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP) を補酵素とする。

(k) 分子量：

S D Sポリアクリルアミド電気泳動法による分子量は、約 57， 500 である。

C P 2株が産生する本発明の 4ーコレステン一 3—オンデヒドロゲナーゼ Aは新規酵素であり、その理化学的性質及び精製法は以下のとおりである。

(a) 作用：次の反応を触媒する。

4—コレステン一 3 _オン + NADH

—コプロスタン一 3—オン + NAD

(b) 基質特異性：

4ーコレステン一 3—オンを 1 00とした相対活性は、テストステロン、プロゲステロン、プログネロンでそれぞれ 0、 4 1、 0である。

( c ) 至適 p H ： 5. 4〜 6. 5

(d) 安定 p H ： 5. 5〜 7. 2

( e ) 力価の測定：

0. 3 3 %T r i t o nX- 1 00を含有する 3mM4—コレステン一 3—オンミセル溶液 0. 2m lに、 0. 5 %T r i t o nX— 1 00と 1 mMDTTを含有する 2 OmMP I P E S緩衝液（pH 7. 5) 0. 3m 1、 1 0mM NADH溶液 0. 1m lを混合し、これに酵素液 0. 0 5 '■ m lを加え、 3 7 °Cで 30分間反応後、 0. 1 m 1 クロ口ホルムを添加してステロールを抽出して反応を停止する。

次に、 TL C/F I Dィァトロスキャンを用いて、反応液中に生成したコプロスタン一 3—オンを定量する。対照としてあらかじめ熱失活した酵素を用いて同様に反応液中のコプロスタン— 3—オンを測定する。 1分間に 1 /xmo 1のコプロスタン— 3—オンを生成する酵素活性を 1単位とする。

( f ) 作用適温の範囲：

P H 6. 0、 3 0分間の反応で 40 °Cまで温度上昇とともに活性は増大する。

(g) 温度安定性の範囲：

(h) 阻害剤、金属イオンの影響：

阻害剤無添加時の酵素活性を 1 00とし、それぞれ lmMP CMB、ョ —ド酢酸、 EDTAを添加し、 pH 7. 5、 3 7 °Cで 3 0分間反応した場合の相対活性はそれぞれ 47、 94、 82である。また、本酵素は、 lm Mの塩化鉄、塩化銅の存在下で反応させると無添加の場合にくらべ相対活性はそれぞれ 1 1 0、 0である。

( i ) 精製法：

(pH 7. 5、 ImMDTT含有）に懸濁する。超音波処理により菌体を破砕し、さらに 0. 2 %T r i t o nX— 1 00存在下で超音波処理後、遠心分離にて固形分を除去し、粗酵素液を得る。その粗酵素液を 2 0mM P I P E S緩衝液（p H 7. 5、 lmMDTT、 0. 2 T r i t o n X 一 1 00、 1 0 %グリセロール含有）に対して透析した後、同緩衝液で平 ·■ 衡化したブル一セファロース C L— 6 B (フアルマシア製）に吸着させる。次いで食塩濃度を 0〜 3. 0 Mに連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、活性画分を集める。得られた活性画分を同緩衝液に対して透析後、リソースカラム（フアルマシア製）に吸着させる。次いで食塩濃度を 0〜 1. 0 Mに連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、活性画分を集めて精製標品とする。

( j ) 補酵素：

還元型 ]3—ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH) を補酵素とする。

(k) 分子量

S D Sポリアクリルアミド電気泳動法による分子量は、約 3 7， 500 である。

C P 2株が産生する本発明のコプロスタン一 3—オンデヒドロゲナーゼ

Aは新規酵素であり、その理化学的性質及び精製法は以下のとおりである。

(a) 作用：次の反応を触媒する。

コプロスタン一 3—オン + NAD PH→コプロス夕ノール +NAD P

(b) 基質特異性：

コプロスタン一 3—オンを 1 00とした相対活性は、 5 α—コレステン— 3—オンで 1 3. 2であった。

( c ) 至適 ρ Η ： 5. 2〜 5. 7

(d) 安定 pH ： 4. 0〜7. 5

( e ) 力価の測定：

0. 33 %T r i t o nX- 1 00を含有する 3 mMコプロスタン一 3 —オンミセル溶液 0. 2m lに、 0. 5 %T r i t o nX— 1 0 0と lm MDTTを含有する 40 mMB r i t t o n -R o b i n s o n緩衝液 ■■

( H 6. 0) 0. 3m l、 1 0 mM NADPH溶液 0. 1 m 1を混合し、これに酵素液 0. 0 5m lを加え、 3 7 °Cで 3 0分間反応後、 0. 1 m 1 クロロホルムを添加してステロールを抽出して反応を停止する。酵素液は等量の活性化画分と混合し 5 で 1 5分間放置した後に使用した。

次に、 TL CZF I Dィァトロスキャンを用いて、反応液中に生成したコプロス夕ノールを定量する。対照としてあらかじめ熱失活した酵素を用いて同様に反応液中のコプロス夕ノールを測定する。 1分間に 1 /xmo 1 のコプロス夕ノールを生成する酵素活性を 1単位とする。

( f ) 作用適温の範囲：

(g) 温度安定性の範囲：

0. 5mMNAD PHの存在下 40°C、 1 0分間の加熱処理で処理前の 80 %以上の活性を保持する。

(h) 阻害剤、金属イオンの影響：

阻害剤無添加時の酵素活性を 1 00とし、それぞれ lmMP CMB、ョ —ド酢酸、 EDTAを添加し、 pH 7. 5、 37°C、 3 0分間反応した場合の相対活性は、それぞれ 4 1、 82、 1 0 1である。また、本酵素は、 ImMの塩化鉄、塩化銅の存在下で反応させると無添加の場合にくらべ相対活性はそれぞれ 1 2、 2. 7である。

( i ) 精製法：

方法 1 ；

培養物を遠心分離して集菌し、この菌体を 2 OmMリン酸クェン酸緩衝液（PH 6. 0、 ImMDTT含有）に懸濁する。超音波処理により菌体を破碎し、さらに 0. 2 %T r i t o nX— 1 00存在下で超音波処理後、遠心分離にて固形分を除去し、粗酵素液を得る。その粗酵素液を 2 OmM P I P E S緩衝液（p H 7. 5、 lmMDTT、 0. 2 %T r i t o n X 一 1 00、 1 0 %グリセロール含有）に対して透析した後、同緩衝液で平衡化したブル一セファロース C L一 6 B (フアルマシア製）を通過させブルーセファロ一ス CL— 6 B非吸着画分を回収し、 20 mMリン酸クェン酸緩衝液（pH 6. 0) ( 0. 5mMNAD PH、 lmMDTT、 0. 2 %T r i t o nX— 1 00、 1 0 %グリセロール含有）で透析した。同緩衝液で平衡化した D E AE— C e 1 1 u 1 o f i n eに吸着させた後、食塩濃度を 0〜 1. 0Mに連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、活性画分を集めて同緩衝液に対して透析した。活性画分をブル一セファロ一ス C L 一 6 Bに吸着させ、非吸着区分を回収した。非吸着区分を 9 5°C、 1 0分間加熱処理して蛋白質を除き活性化画分とした。その後、ブルーセファロースに吸着した活性画分を、食塩濃度を 0〜 1. 0Mに連続的に上昇させた ImMNADPHを含む同緩衝液で溶出した。この活性画分に上記活性化画分を添加し精製標品とする。

方法 2 ；

培養物を遠心分離して集菌し、この菌体を 2 OmMリン酸クェン酸緩衝液（pH 6. 0、 I mMDTT含有）に懸濁する。超音波処理により菌体を破砕し、さらに 0. 2 %T r i t o nX_ 1 00存在下で超音波処理後、遠心分離にて固形分を除去し、粗酵素液を得る。その粗酵素液を 2 OmM リン酸クェン酸緩衝液 A ( p H 6. 0、 l mMDTT、 0. 2 % T r i t o nX— 1 00、 30 %グリセロール含有）に対して透析した後、同緩衝液 Aで平衡化したブルーセファロ一ス CL— 6 B (フアルマシア製）に吸着させる。次いで食塩濃度を 0〜 3. 0 Mに連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、活性画分を集める。得られた活性画分を 2 OmMリン酸クェン酸緩衝液 B ( p H 7. 5、 lmMDTT、 0. 2 %T r i t o nX- 1 0 0、 3 0 %グリセロール含有）に対して透析後、同緩衝液 Bで平衡化した DEAE— C e l 1 u 1 o f i n eに吸着させた後、食塩濃度を 0〜 1. 0 Mに連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、活性画分を集めて同緩衝液に対して透析する。得られた活性画分を同緩衝液 Bに対して透析後、リソ —スカラム（フアルマシア）に吸着させる。次いで食塩濃度を 0〜 1. 0 Mに連続的に上昇させた上記緩衝液 Bを流し活性画分を集めて精製標品とする。

( j ) 補酵素：

還元型 ;3—ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NAD PH) を補酵素とする。

(k) 分子量：

S D Sポリアクリルアミド電気泳動法による分子量は、約 29, 000 である。

次に、新規コレステロールデヒドロゲナ一ゼ8、 4—コレステン— 3— オンデヒドロゲナーゼ B及びコプロスタン— 3—オンデヒドロゲナ一ゼ B の製造法を以下に述べる。

本酵素を作成するにあたり使用される微生物としては、上記コレステロ —ルデヒドロゲナーゼ8、 4—コレステン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼ B 及びコプロスタン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼ B生産能を有する微生物であれば如何なるものでもよく、またこれらの微生物の変種もしくは変異株でもよい。ユウバクテリウム属に属し、コレステロールデヒドロゲナーゼ B、 4ーコレステン一 3—オンデヒドロゲナーゼ8、コプロスタン _ 3— オンデヒドロゲナ一ゼ B生産能を有する微生物の具体例として、例えばュゥバクテリゥム · エスピー（E u b a c t e r i um s p . ) C P 1が ■ あげられる。

上記ユウバクテリゥム ' エスピー（E u b a c t e r i um s p. ) C P 1は本発明者が、ヒトの糞便より新たに分離した菌株で、その菌学的性質は下記のとおりである。

なお、本菌株は下記基本培地を用いて嫌気的条件下 3 7 °Cで液体静置培養することにより、良好な生育を示すものである。各性質に関する試験はこの条件に従って検討した。

基本培地；ゥシ脳抽出脂質 1. 2 %、トリプチケース 1. 8 %、酵母ェキス 0. 0 5 %、リン酸 2カリウム 0. 1 3 %、塩化ナトリウム 0. 22 %、コレステロール 0. 0 5 %、 L—シスチン 0. 04 %、チォグリコ一ル酸ナトリウム 0. 0 3 %、寒天 0. 0 5 %メチレンブルー少量、（p H 7. 2 )

(a) 形態的性質

①細胞の形長桿状菌で連鎖状に生育

②細胞の大きさ 0. 3〜0. 5 /xmX 3. 0〜 5. 0 m

③細胞の多形性；無

④運動性；無

⑤胞子；無

(b) 培養的性質

本菌株が生育しうる基本培地と培養条件における培養的性質を以下に示す。

①基本培地寒天平板培養（2 1 日間培養）

1 ) 生育の様相；粉末状コロニーを形成 2 ) 色；白色

3 ) 光沢；無

4 ) 拡散性色素；無

②基本培地液体培養（5日間培養）

1 ) 表面生育；無

2 ) 濁度；生育するが濁度による培地沈殿物との差別は困難

③基本培地におけるゼラチン穿刺培養

1 ) 生育の状態；良好

2 ) ゼラチンの液化；無

( c ) 基本培地培養における生理学的性質

①グラム染色性；陽性

②硝酸塩の還元；陰性

③リトマスミルク；凝固陰性

④ィンドールの生成；陰性

⑤硫化水素の生成；陰性

⑥デンプンの加水分解；陽性

⑦エスクリンの分解；陽性

⑧基本培地よりトリプチケースと酵母エキスとを除去した培地による無機窒素源の利用

1 ) 硝酸塩；陰性

2 ) アンモニゥム塩；陰性

⑨色素の生成；無

⑩ゥレア一ゼ；陰性

⑪ォキシダ一ゼ；陰性

⑫カタラ一ゼ；陰性 ⑬生育の範囲

1 ) 生育] 3 H範囲； p H 5〜 p H 8 (最適生育 p H 7付近）

2 ) 生育温度範囲； 3 3 °C〜4 0 °C、（最適生育温度； 3 4 °C付近）

⑭酸素に対する態度；絶対嫌気性

⑮ O— Fテスト（H u g h L e i f s o n法）；陰性

⑯酸の生成

1 Lーァラビノース；酸（少し有）

2 D—キシロース；酸（有）

3 D _グルコース；酸（有）

4 D —マンノース；酸（有）

5 D —フラクト一ス；酸（少し有）

6 D —ガラクト一ス；酸（有）

7 マルトース；酸（有）

8 シユークロース；酸（少し有）

9 ラクト一ス；酸（有）

1 0 トレハロース；酸（無）

1 1 D―ソルビトール；酸（無）

1 2 D —マンニトール；酸（無）

1 3 イノシトール；酸（無）

1 4 グリセリン；酸（無）

1 5 デンプン；酸（無）

1 6 リボース；酸（有）

1 7 セロビオース；酸（有）

1 8 ラクト一ス；酸（有） ■

1 9) メリビオース；酸（有）

2 0) ラフィノース；酸（有）

2 1 ) サリシン；酸（有）

22 ) アミグダリン酸（有）

2 3) メレチ卜一ス酸（無）

24) ダリコ一ゲン酸（無）

2 5) ィヌリン；酸（無）

2 6) 糖類からの代謝物；酢酸

本菌株は、グラム陽性の絶対嫌気性、長桿状細菌で、胞子を形成せず、運動性がなく、力タラ一ゼ、ォキシダーゼ、ゥレアーゼが共に陰性であり、グルコースから酸を生成し、主な代謝産物は酢酸であった。これらの微生物学的性質を有する菌株の分類学的位置について、パージエイズ、マニュアル、ォブ、システマティック、バクテリオロジー（B e r g e y ' s Ma n u a l S y s t ema t i c o f B a c t e r i o l o g y v o l . 2 1 98 6 ) の記載と照合した結果、本菌株を、 E u b a c t e r i um属に属する細菌であると同定し、 C P 1菌株をユウバクテリゥム ' エスピ一 C P 1 (E u b a c t e r i um s p . C P 1 ) と命名した。本菌株は、平成 8年 4月 1 2日に工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号）に FERM B P— 5 50 0として寄託されている。

本発明のコレステロールデヒドロゲナ一ゼ8、 4—コレステン— 3—ォンデヒドロゲナーゼ8、コプロスタン— 3—オンデヒドロゲナ一ゼ Bを生産する微生物の培養に用いられる培地としては、炭素源、窒素源、無機物などを含有する合成培地又は天然培地のいずれも使用できる。

炭素源としては、例えばグルコース、マルトース、糖蜜などの種々の炭水化物が用いられ、その使用量は、 1〜 2 0 gZLが好ましい。

窒素源としては、例えば硫酸アンモニゥム、リン酸アンモニゥム、炭酸アンモニゥム、酢酸アンモニゥム、あるいはペプトン、酵母エキス、コ一ン ' スティープ ' リカ一、カゼイン分解物、肉エキスなどの窒素含有有機物などが用いられ、その使用量は、 1〜 2 0 gZLが好ましい。ゥシ脳脂質の溶媒（クロ口ホルム：メタノール = 2 ： 1 ) 抽出物の使用量は 1〜2 0 gZLが好ましい。

無機物としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシゥム、リン酸第 1水素カリウムなどが用いられ、その使用量は 0. 1 〜 2 gZL程度が好ましい。またシスチン、チォグリコール酸ナトリウムの使用量は 0. 1〜： L gZLが好ましい。

培養は、静置又は攪拌培養を嫌気的条件下行われる。培養温度は、菌が生育してコレステロールデヒドロゲナーゼ8、 4—コレステン— 3—オンデヒドロゲナーゼ8、コプロスタン— 3—オンデヒドロゲナーゼ Bが生成する温度であればよく、好ましくは 3 5〜40°Cである。培養時間は、条件により異なるが、これらの酵素が最大量に生産される時間まで培養すればよく、通常 3〜 1 0日程度である。

C P 1株が産生する本発明のコレステロールデヒドロゲナーゼ Bは新規酵素であり、その理化学的性質及び精製法は以下のとおりである。

(a) 作用：次の反応を触媒する。

コレステロール + NAD P→ 4—コレステン— 3 _オン + NAD PH

(b) 基質特異性：

本酵素は 3 /3位に水酸基をもつステロイドに反応し、コレステロールを 1 0 0とした相対活性は) 3シトステロール、カンペステロール、スチグマステロールでそれぞれ 67、 50、 3 9である。 ·■

( c ) 至適 p H ： 6. 7〜 7. 7

(d) 安定 pH : 5. 0〜 1 0. 5である。

( e ) 力価の測定：

0. 3 3 %T r i t o nX- 1 00を含有する 3mMコレステロ一ルミセル溶液 0. 2m l に、 1. 0 %T r i t 0 n X— 1 00と 1 mMDTT を含有する 5 OmMリン酸緩衝液（pH 7. 5 ) 0. 3m 1、 1 0 mM

NAD P溶液 0. 1m lを混合し、これに酵素液 0. 0 5m l を加え、 3 7 °Cで 3 0分間反応後、 0. 1 m 1クロ口ホルムを添加してステロールを抽出して反応を停止する。

次に、 TL CZF I Dィァトロスキャンを用いて、反応液中に生成した

4—コレステン一 3—オンを定量する。対照としてあらかじめ熱失活した酵素を用いて同様に反応物の 4ーコレステン— 3—オンを測定する。 1分間に 1 ^mo 1の 4—コレステン— 3—オンを生成する酵素活性を 1単位とする。

( f ) 作用適温の範囲：

pH 7. 5、 30分間の反応で 40°Cまで温度上昇とともに活性は増大する。

( g) 温度安定性の範囲：

40°C, 1 0分間の加熱処理で、処理前の 80 %以上の活性を保持する。

(h) 阻害剤、金属イオンの影響：

阻害剤無添加時の酵素活性を 1 00とし、それぞれ lmMP CMB、ョード酢酸、 EDTAを添加し、 pH 7. 5、 37°C、 30分間反応した場合の相対活性はそれぞれ 0、 98、 1 02である。また、本酵素は、 lm Mの塩化鉄、塩化銅の存在下で反応させると無添加の場合にくらべ相対活性はともに 0である。 ■

( i ) 精製法：

培養物に通気して、泡に吸着した菌体を回収して菌体濃縮する。濃縮液を遠心分離して集菌し、この菌体を 2 OmMリン酸緩衝液（pH 7. 5、

ImMDTT含有）に懸濁する。超音波処理により菌体を破砕し、さらに

1. 0 %T r i t - o nX- 1 0 0存在下で超音波処理後、遠心分離にて固形分を除去して粗酵素液を得る。その粗酵素液に lmMEDTA、 1 m Mョ一ド酢酸、 0. 5mMフエ二ルメチルスルフォニルフロライド（PM S F) を添加して、 2 OmMトリス塩酸緩衝液（pH 7. 5、 1 mMDT T、 1 0 %グリセロール、 lmMEDTA、 ImMョード酢酸、 0. 5m MPMS F含有）に対して透析する。粗酵素液を 0. 2 5 %T r i t o n X— 1 0 0を含む同緩衝液で平衡化したブル一セファロ一ス C L一 6 B

(フアルマシア製）に吸着させる。次いで 1. 0 %T r i t o nX— 1 0 0を含む同緩衝液で脂質成分を溶出後、食塩濃度を 0〜 3. 0Mに連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、活性画分を集める。得られた活性画分を上記緩衝液に対して透析した後、 1. 0 %T r i t o n X— 1 0 0を含む同緩衝液で平衡化した DEAE—セファロースファストフローに吸着させる。次いで食塩濃度を 0〜0. 5 Mに連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、活性画分を集めて精製標品とする。

( j ) 補酵素：

C P 1株が産生する本発明の 4ーコレステン— 3—オンデヒドロゲナ一ゼ Bは新規酵素であり、その理化学的性質及び精製法は以下のとおりである。

(a) 作用：次の反応を触媒する。 ■

4ーコレステン一 3—オン + NADH—コプロスタン一 3—オン + NA

D

(b) 基質特異性：

4—コレステン一 3 _オンを 1 00とした相対活性は、 5—コレステノン一 3—オンで 0である。

( c ) 至適 p H ： 5. 3〜 7. 0

(d) 安定 pH : 5. 2〜8. 0

( e ) 力価の測定：

0. 3 3 %T r i t o nX- 1 00を含有する 3 mM 4—コレステン— 3—オンミセル溶液 0. 2m l に、 1. 0 %T r i t o nX— 1 00と 1 mMDTTを含有する 2 OmMトリス塩酸緩衝液（pH 7. 5) 0. 3 m し l OmMNADH溶液 0. 1m lを混合し、これに酵素液 0. 05m 1を加え、 3 7 °Cで 30分間反応後、 0. 1 m 1クロ口ホルムを添加してステロールを抽出して反応を停止する。

次に、 TL CZF I Dィァトロスキャンを用いて、反応液中に生成したコプロスタン— 3—オンを定量する。対照としてあらかじめ熱失活した酵素を用いて同様に反応物のコプロスタン— 3—オンを測定する。 1分間に 1 /imo 1のコプロスタン一 3—オンを生成する酵素活性を 1単位とする。

( f ) 作用適温の範囲：

P H 7. 5、 30分間の反応で 40°Cまで温度上昇とともに活性は増大する。

(g) 温度安定性の範囲：

3 7°C、 1 0分間の加熱処理で、処理前の 80 %以上の活性を保持する。

(h) 阻害剤、金属イオンの影響：

阻害剤無添加時の酵素活性を 1 00とし、それぞれ l mMP CMB、ョード酢酸、 EDTAを添加し、 pH 7. 5、 37°C、 3 0分間反応した場合の相対活性はそれぞれ 0、 9 9、 1 2 5である。また、本酵素は ImM の塩化鉄、塩化銅の存在下で反応させると無添加の場合に比べ相対活性はそれぞれ 1 0 7、 0である。

( i ) 精製法：

培養物に通気して、泡に吸着した菌体を回収して菌体濃縮する。濃縮液を遠心分離して集菌し、この菌体を 2 OmMリン酸緩衝液（pH 7. 5、 ImMDTT含有）に懸濁する。超音波処理により菌体を破砕し、さらに 1. 0 %T r i t o n X— 1 00存在下で超音波処理後、遠心分離にて固形分を除去して粗酵素液を得る。その粗酵素液に 1 mMEDTA、 ImM ョード酢酸、 0. 5mMPMS Fを添加して、 2 OmMトリス塩酸緩衝液

( p H 7. 5、 lmMDTT、 1 0 %グリセロール、 lmMEDTA、 1 mMョード酢酸、 0. 5mMPMS F含有）に対して透析する。粗酵素液を 0. 2 5 %T r i t o nX— 1 0 0を含む同緩衝液で平衡化したブルーセファロース CL— 6 B (フアルマシア製）に吸着させる。次いで 1. 0 %T r i t o n X— 1 00を含む同緩衝液で脂質成分を溶出後、食塩濃度を 0〜3. 0 Mに連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、活性画分を集める。得られた活性画分を上記緩衝液に対して透析した後、 1. 0 %T r i t o n X- 1 00を含む同緩衝液で平衡化した D EAE—セファロースファストフローに吸着させる。次いで食塩濃度を 0〜0. 5Mに連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、活性画分を集めて精製標品とする。

( j ) 補酵素：

還元型 ;3—ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH) を補酵素とする。

C P 1株が産生する本発明のコプロスタン— 3—オンデヒドロゲナ一ゼ ■

Bは新規酵素であり、その理化学的性質及び精製法は以下のとおりである。

(a) 作用：次の反応を触媒する。

コプロスタン一 3—オン + NADPH→3プロス夕ノール + NADP

(b) 基質特異性：

コプロスタン一 3—オンを 1 0 0とした相対活性は、 5 α—コレスタン _ 3—オンは 0である。

( c ) 至適 ρΗ ： 5. 4〜7. 6

(d) 安定 pH : 4. 5〜7. 0

( e ) 力価の測定：

0. 3 3 %T r i t o nX- 1 00を含有する 3 mMコプロスタン— 3 —オンミセル溶液 0. 2m lに、 1. 0 %T r i t o nX— 1 0 0と lm MDTTを含有する 2 OmMトリス塩酸緩衝液（pH 7. 5) 0. 3m 1、 1 0 mM NAD溶液 0. 1m l を混合し、これに酵素液 0. 0 5m lを加え、 3 7 °Cで 3 0分間反応後、 0. 1 m 1クロ口ホルムを添加してステロールを抽出して反応を停止する。

次に、 T L CZF I Dィァトロスキャンを用いて、反応液中に生成したコプロス夕ノールを定量する。対照としてあらかじめ熱失活した酵素を用いて同様に反応物のコプロスタノ一ルを測定する。 1分間に l mo 1のコプロス夕ノールを生成する酵素活性を 1単位とする。

( f ) 作用適温の範囲：

P H 7. 5、 3 0分間の反応で 45 °Cまで温度上昇とともに活性は増大する。

(g) 温度安定性の範囲：

45°C, 1 0分間の加熱処理で、処理前の 80 %以上の活性を保持する。

(h) 阻害剤、金属イオンの影響： * 〜阻害剤無添加時の酵素活性を 1 00とし、それぞれ l mMP CMB、ョ —ド酢酸、 EDTAを添加し、 pH 7. 5、 37°C 3 0分間反応した場合の相対活性はそれぞれ 0、 9 5、 1 1 2である。また、本酵素は ImM の塩化鉄、塩化銅の存在下で反応させると無添加の場合にくらべ相対活性はそれぞれ 1 0 5、 0である。

( i ) 精製法：

培養物に通気して、泡に吸着した菌体を回収して菌体濃縮する。濃縮液を遠心分離して集菌し、この菌体を 2 OmMリン酸緩衝液（pH 7. 5、 ImMDTT含有）に懸濁する。超音波処理により菌体を破砕し、さらに 1. 0 T r i t o nX- 1 0 0存在下で超音波処理後、遠心分離にて固形分を除去して粗酵素液を得る。その粗酵素液に 1 mMEDTA、 ImM ョード酢酸、 0. 5mMPMS Fを添加して、 20mMリン酸緩衝液（p H 7. 5、 l mMDTT、 1 0 %グリセロール、 lmMEDTA、 ImM ョード酢酸、 0. 5mMPMS F含有）に対して透析する。粗酵素液を 0. 2 5 T r i t o n X- 1 00を含む同緩衝液で平衡化したブル一セファロース CL一 6 B (フアルマシア製）に吸着させる。次いで 1. 0 %T r i t o nX— 1 00を含む同緩衝液で脂質成分を溶出後、食塩濃度を 0〜 3. 0 Mに連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、活性画分を集める。得られた活性画分を上記緩衝液に対して透析した後、 1. 0 %T r i t o n X— 1 0 0を含む同緩衝液で平衡化した DEAE—セファロースファストフローに吸着させる。次いで食塩濃度を 0〜0. 5Mに連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、活性画分を集めて精製標品とする。

( j ) 補酵素：

還元型 3—ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（N AD PH) を補酵素とする。 ■ 本発明のコレステロール低減化用組成物は、コレステロールデヒドロゲナーゼ、 4—コレステン— 3 _オンデヒドロゲナーゼ及びコプロスタン一

3—オンデヒドロゲナーゼの活性を有するものであれば、これら 3つの酵素を含有する菌体又はその処理物、粗精製酵素、精製酵素等をそのまま用いてもよいが、食品または医薬として許容できる賦形剤とともに錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤等の形態に成型したものでもよい。本発明の低減化用組成物は、食品添加用組成物または飼料添加用組成物として食品中または飼料中のコレステロール量を低減せしめるために添加してもよいし、経口組成物として血清コレステロ一ル値を低下せしめるため経口投与してもよい。本発明のコレステロール低減化用組成物に粗精製酵素、精製酵素を用いる場合は、必要に応じて組成物中にニコチンアミド、リン酸イオンまたはホスホリパーゼを含むように組成物調製するとよい。本発明の経口組成物の剤型は、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、力プセル剤、シロップ剤、腸溶剤、トローチ剤等があげられる。添加または投与の場合には、賦形剤としては、ソルビトール、ラクト一ス、ダルコ一ス、乳糖、デキストリン、澱粉、結晶セルロース等の糖類、炭酸カルシゥム、硫酸カルシウム等の無機物、蒸留水、ゴマ油、トウモロコシ油、オリ —ブ油、綿実油等、一般に使用されているものであればいずれも用いることができる。製剤化する際には、結合剤、滑沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、希釈剤、緩衝剤、抗酸化剤、細菌抑制剤等の添加剤を用いることがでさる。

添加量は、本発明のコレステロール低減化物の製造方法の酵素変換方法又は微生物変換方法に記載した処理量となるようにすればよい。

投与量は、年齢、性別、投与形態、投与回数、剤形等により異なるが、成人を対象とする経口投与投与量は、菌体として 1 X 1 0 ⁷ 〜 1 X 1 0 ¹ ·

² Z細胞/日、好ましくは l X l CT l X l O '¹ /細胞 z日となるように、 3つの酵素としてそれぞれが 3酵素を 1 0〜 1 X 1 0⁵ 単位 Z日、好ましくは 1 X 1 0² 〜 1 X 1 0⁴ 単位 Z日となるようにし、 1〜4回に分けて投与するのが適当である。また、必要に応じて上記制限以外の投与量を用いることもできる。図面の簡単な説明

第 1図は微生物由来の各種コレステロールデヒドロゲナーゼの ρ H 6、 7及び 8における変換酵素活性の測定結果を表す図である。

第 2図はユウパクテリゥムに属する C P 2株と ATC C 5 1 222株に由来するコレステロールデヒドロゲナーゼの至適 pHの測定結果を表す図である。

第 3図はコレステロールデヒドロゲナ一ゼ八、 4ーコレステン一 3—ォンデヒドロゲナ一ゼ A及びコプロスタン— 3—オンデヒドロゲナーゼ Aの至適 p Hの測定結果を表す図である。

第 4図はバブリング法によるユウパクテリゥムに属する C P 1株の濃縮と、培地中のコプロス夕ノールの濃縮の経過を表す図である。

第 5図はコレステロールデヒドロゲナ一ゼ8、 4—コレステン一 3—ォンデヒドロゲナ一ゼ B及びコプロスタン— 3—オンデヒドロゲナーゼ Bの至適 p Hの測定結果を表す図である。

第 6図はリン酸イオンを添加した場合の、コレステロールデヒドロゲナーゼ Bの変換酵素活性の測定結果を表す図である。実施の形態

本発明の特徴を明瞭にするため次に実施例及び比較例を挙げるが、本発 · 明はこの実施例に限定されるものでない。なお、実施例等の中の部数は重量部を表す。実施例 1 (コレステロール還元変換酵素産生微生物のスクリーニング）

中性 P H領域に至適 p Hを有するコレステロール還元変換酵素群を見いだすべく、種（ s p e c i e s ) レベルで 3 00種にもわたる放線菌、力ビ、細菌を中心とした保存微生物、また、各種土壌 1 0 0種類から分離した好気性微生物、さらに、ヒト糞便 7試料、ヒト以外の哺乳類 8種の糞便試料、鳥類 9種の糞便試料からの嫌気性微生物等、数多くの微生物をスクリーニングした。

その結果、以下に示すとおり、糞便から分離した嫌気性微生物において、コレステロ一ルをコプロス夕ノールへ変換するコレステロール還元変換酵素活性を検出した。

基質としてコレステロールを添加している次の 6種類の検出用培地（表

1参照）に各糞便を分注し、培養物の還元変換酵素活性の有無、すなわちコレステロールからコプロスタノ一ルを生成しているかどうかを調べた。

その結果を表 2〜4に示す。表 1中、 CHOLはコレステロールを、 PL はリン脂質をそれぞれ示す。

また、栄養培地 1〜 3の組成はそれぞれ以下のとおりである。

栄養培地 1 ：

トリプチケース 1. 8 %、酵母エキス 0. 0 5 %、リン酸 2カリウム 0. 1 3 %、塩化ナトリウム 0. 22 %、 L—シスチン 0. 04%、チォグリコール酸ナトリウム 0. 03 %、寒天 0. 0 5 % (pH 7. 2 )

栄養培地 2 ：

カジトン 1. 0 %、酵母エキス 1. 0 %、ラクト一ス 0. 5 %、ピルビン酸ナトリウム 0. 5 %、チォグリコール酸ナトリウム 0. 0 5 % (p H 7. 5)

栄養培地 3 ：

L a b— l emc o p owd e r (O x o i d) 0. 24 %、フロテオースペプトン 1. 0 %、酵母エキス 0. 5 %、リン酸 2ナトリウム 0. 4 %、グルコース 0. 1 5 %、可溶性デンプン 0. 0 5 %、シスチン 0. 0 2 %、システィン塩酸塩 0. 0 5 % (p H 7. 6〜7. 8)

【表 1】

No. 添加物

① 栄養培地 1 + 1.2%牛脳脂質

② 栄養培地 1 + 1.2%牛脳脂質 + 5%大豆油

③ 栄養培地 2

④ 栄養培地 2 + 牛脳脂質

⑤ 栄養培地 3 + 5%馬血液

⑥ 栄養培地 3 + 1.2%牛脳脂質 + 5%馬血液

【表 2】培地 NO.

NO. 哺乳類 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥

1 クマ

2 キリン

3 シマウマ

4 ゾゥ

5 ライオン +

6 チ一夕—

7 コアラ

8 パク 3】

NO. ヒ卜 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥

1 ヒ卜 1 +

2 ヒ卜 2

3 ヒ卜 3

4 ヒ卜 4

5 ヒ卜 5

6 ヒ卜 6

7 ヒ卜 7 ·

【表 4

表 2 〜 4からもわかるように、ヒト試料 1 (栄養培地 1 ) 、ライオン (栄養培地 4 ) 、ベニイロフラミンゴ（栄養培地 3 ) 及びシジユウカラ (栄養培地 2 ) の 4種の糞便における培養物から、還元変換酵素活性を有する微生物の生育を検出し、ヒトの糞便試料 2 〜 7、ライオン以外のクマ、キリン等の哺乳動物の糞便試料及びフラミンゴとシジユウカラを除くダチョゥ、ツル等の鳥類の糞便試料からはその酵素活性を検出することができなかった。このように、特定の種の動物の特定の糞便から、それも特定の培地においてのみ還元変換酵素活性を検出することができた。実施例 2 (中性 p H領域に至適 p Hを有する酵素の選抜）

コレステロールからコプロスタノ一ルへの変換活性を検出したヒ卜試料 1、ライオン、ベニイロフラミンゴ及びシジユウカラの 4種の糞便における培養物、並びに、前記 B e i t zらによる Ap p l i e d M i c r o b i o l o g y a n d B i o t e c h n o l o g y 43， 88 7 ( 1 9 9 5 ) に記載されているユウバクテリゥム属細菌 AT C C 5 1 22 2の培養物を、それぞれ超音波処理してその菌体を破砕した（なお、 B e i t zらによる米国特許第 492 1 7 1 0号明細書に記載されているユウバクテリゥム ' スピ一シーズ AT C C 2 1 408は、 AT C Cより入手することができなかった。）。この破砕物中の変換活性画分をブルーセファロースに吸着後溶出して、コレステロール変換系のコレステロールデヒド口ゲナ一ゼ活性画分を採り、 pH 6、 pH 7及び pH 8でその活性を測定した結果を図 1に示す。

図 1からもわかるように、ライオン由来の C P 2株からのコレステロ一ルデヒドロゲナーゼ八、及びヒト試料 1由来の。 P 1株からのコレステロ一ルデヒドロゲナ一ゼ Bは、中性 p H領域である p H 7付近で最大活性を示し、他のものはアル力リ pH領域である p H 8付近で最大活性を示していた。このように、中性 p H領域に至適 p Hを有するコレステロールデヒドロゲナ一ゼは現在まで知られておらず、新規酵素である。実施例 3 (ユウパクテリゥム s p. C P 2の菌体製造）

カジトン（D i f c o社製） 20 g、酵母エキス（D i f c o社製） 2 0 g、可溶性デンプン 1 0 g、ピルビン酸ナトリウム 1 0 g、チォグリコール酸ナトリウム l g、塩化カルシウム l g、レシチン（シグマ社タイプ 4 S) 0. 2 gを脱イオン水 2 Lに溶解し、 pHを 7. 5に調整し、 3 L 三角フラスコに分注した。この培地を温度 1 20 で 1 5分間殺菌した後、 C P 2株を接種し、温度 3 7 °Cで 7日間嫌気的静置培養した。培養終了後培養液 2 Lを遠心分離して得られた 8. 5 gの沈殿物を菌体含有物とした。実施例 4 (ユウパクテリゥム s p. C P 2の菌体抽出物の製造）

実施例 3で得られた菌体含有物を、 30m lの 40 mM B r i t t o n - R o b i n s o n緩衝液（pH 6. 5 ) に懸濁し、その菌体懸濁液を超音波破砕機で 60W、 1 0分間処理して菌体抽出物を得た。実施例 5 (コレステロールデヒドロゲナ一ゼ Aの製造）

実施例 4で得られた菌体抽出物を、 lmMDTT、 0. 2 %T r i t o nX- 1 00の存在下 30秒間超音波処理後、遠心分離にて固形分を除去して粗酵素液を得た。その粗酵素液を 20 mMP I P E S緩衝液（pH 7. 5、 l mMDTT、 0. 2 T r i t o nX- 1 00, 1 0 %グリセ口一ル含有）に対して透析した後、同緩衝液で平衡化したブルーセファロ一ス CL— 6 B (フアルマシア製）に吸着させた。次いで食塩濃度を 0〜3. 0Mに連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、活性画分を集めた。得られた活性画分を同緩衝液に対して透析後、レツドセファロ一ス CL— 6 B

(フアルマシア製）に吸着させた。次いで食塩濃度を 0〜3. 0Mに連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、活性画分を集めて精製標品とした。本精製標品の比活性は、 4. 49単位ノ mg蛋白質であり、収率は、 37. 4 %であった。

なお、本精製標品を SD Sポリアクリルアミドゲル電気泳動後、銀染色キット（第一化学株式会社製）で染色したところ、分子量約 58， 800 の位置に単一のバンドが確認された。比較例 1 (コレステロールデヒドロゲナ一ゼの至適 p H)

実施例 3記載の培地に、 ATC C 5 1 222株と C P 2株を各々接種し、温度 37°Cで 7日間嫌気的静置培養した。培養終了後培養液を遠心分離して得られた菌体含有物を、 50 m 1の 40 mMB r i t t o n - R o b i n s o n緩衝液（pH 6. 5) に懸濁し、その菌体懸濁液を超音波破砕機で 60W、 1 0分間処理して菌体抽出物を得た。この菌体抽出物から実施例 3記載の方法によりコレステロールデヒドロゲナーゼの精製標品を得た。

これらの酵素の種々の P Hにおける相対活性値を図 2に示す。図 2からもわかるように、肉、卵黄、乳の P Hである中性側に至適 p Hを持つ C P 2株のコレステロールデヒドロゲナ一ゼは、アル力リ側に至適 pHを持つ ATCC 5 1 222株のコレステロールデヒドロゲナ一ゼょり食品処理に優れている。実施例 6 (4—コレステン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼ Aの製造）

実施例 4で得られた菌体抽出物を、 lmMDTT、 0. 2 %T r i t o nX- 1 0 0の存在下 30秒間超音波処理後、遠心分離にて固形分を除去して粗酵素液を得た。その粗酵素液を 20 mMP I P E S緩衝液（pH 7. 5、 lmMDTT、 0. 2 %T r i t o nX— 1 00、 1 0 %グリセロール含有）に対して透析した後、同緩衝液で平衡化したブルーセファロ一ス C L - 6 B (フアルマシア製）に吸着させた。次いで食塩濃度を 0〜3. 0Mに連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、活性画分を集めた。得られた活性画分を同緩衝液に対して透析後、リソースカラム（フアルマシア製）に吸着させた。次いで食塩濃度を 0〜 1. 0 Mに連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、活性画分を集めて精製標品とした。本精製標品の比活性は、 3. 3 1単位 Zmg蛋白質であり、収率は、 40. 1 %であった。

なお、本精製標品を SD Sポリアクリルアミドゲル電気泳動後、銀染色キット（第一化学株式会社製）で染色したところ、分子量約 37, 500 の位置に単一のバンドが確認された。実施例 7 (コプロスタン— 3—オンデヒドロゲナーゼ Aの製造）

実施例 4で得られた菌体抽出物を、 lmMDTT、 0. 2 %T r i t o n X- 1 0 0の存在下 30秒間超音波処理後、遠心分離にて固形分を除去して粗酵素液を得た。その粗酵素液を 2 OmMP I P E S緩衝液（pH 7. 5、 lmMDTT、 0. 2 %T r i t o nX- 1 0 0 1 0 %グリセ口一ル含有）に対して透析した後、同緩衝液で平衡化したブルーセファロース C L - 6 B (フアルマシア製）を通過させブル一セファロ一ス C L _ 6 B 非吸着画分を回収し、 2 OmMリン酸クェン酸緩衝液（pH 6. 0) (0. 5mMNAD PH、 l mMDTT、 0. 2 % T r i t o n X— 1 00、 1 0 %グリセロール含有）で透析した。同緩衝液で平衡化した DE AE— C e l 1 u 1 o f i n eに吸着させた後、食塩濃度を 0〜 1. 0 Mに連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、活性画分を集めて同緩衝液に対して透析し、次に活性画分をブルーセファロース C L一 6 Bに吸着させ、非吸着区分を回収した。非吸着区分を 9 5°C、 1 0分間加熱処理して蛋白質を除き活性化画分とした。その後 ImMNADPHを含む食塩濃度を 0〜3. 0 Mに連続的に上昇させた上記緩衝液で溶出を行い、活性画分を集めて上記活性化画分を添加し精製標品とした。本精製標品の比活性は 4. 5 1単位 /mg蛋白質であり、収率は、 1 9. 0 %であった。実施例 8 (コプロスタン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼ Aの製造）

実施例 3で得られた菌体含有物を 3 0m 1の 2 OmMリン酸クェン酸緩衝液（PH 6. 0、 ImMDTT) に懸濁し、その菌体懸濁液を超音波破砕機（BRANSON SON I F I ER Mo d e l . 2 50 ) で 1 2 0W、 5分間処理して菌体抽出物を得た。この菌体抽出物を、 ImMDT T、 0. 2 %T r ί t ο η X— 1 00の存在下、 30秒間超音波処理後、遠心分離にて固形分を除去して粗酵素液を得た。その粗酵素液を 2 OmM リン酸クェン酸緩衝液 A (pH 6. 0、 lmMDTT、 0. 2 %T r i t o n X— 1 00、 30 %グリセロール含有）に対して透析した後、同緩衝液 Aで平衡化したブル一セファロ一ス C L一 6 B (フアルマシア製）に吸着させた。次いで食塩濃度を 0〜3. 0 Mに連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、活性画分を集めた。得られた活性画分を 2 OmMリン酸クェン酸緩衝液 B ( p H 7. 5、 lmMDTT、 0. 2 T r i t o nX- 1 0 0、 30 %グリセロール含有）同緩衝液に対して透析後、同緩衝液 Bで平衡化した D E AE _ C e 1 1 u 1 o f i n eに吸着させた後、食塩濃度を 0〜 1. 0 Mに連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、活性画分を集めて同緩衝液に対して透析した。得られた活性画分を同緩衝液 Bに対して透析後、リソースカラム（フアルマシア）に吸着させた。次いで食塩濃度を 0 〜 1. 0Mに連続的に上昇させた緩衝液 Bを流し活性画分を集めて精製標品とした。本精製標品の比活性は 4. 90単位 Zmg蛋白質であり、収率は 9. 5 %であった。

なお、本精製標品を SD Sポリアクリルアミド電気泳動後、銀染色キット（第一化学株式会社製）染色したところ、分子量約 29， 00 0の位置に単一バンドが確認された。実施例 9 (ライオン由来の C P 2株からの酵素系の至適 pH)

次に、ライオン由来の C P 2株からの酵素系が肉処理において特に優れていることを示す。この酵素系はコレステロールデヒドロゲナーゼから 4 ーコレステン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼ、コプロスタン一 3—オンデヒドロゲナーゼと至適 p Hが順次低下し、かつコレステロールデヒドロゲナ —ゼの至適 p Hが中性領域にあり、 4ーコレステン— 3—オンデヒドロゲナ一ゼ及びコプロスタン— 3—オンデヒドロゲナーゼの至適 p Hが肉の p Hである弱酸性領域の p H 5. 5〜6. 5の範囲にある。したがって、この酵素系を用いて肉処理を行うと、肉中のコレステロールから 4—コレステン— 3—オン及びコプロスタン一 3—オンという中間体の蓄積なしにコプロス夕ノールへ連続的に変換できる。これら酵素の至適 p Hの測定結果を図 3に示す。実施例 1 0 (肉の熟成期間におけるコプロス夕ノールへの酵素変換）屠殺 6時間後の牛肉 1 0 gをミンチとし、実施例 5で得られたコレステロールデヒドロゲナーゼ（0. 2単位 Zg肉）、実施例 6で得られた 4— コレステン一 3 _オンデヒドロゲナーゼ（ 0. 2単位 Zg肉）と実施例 7 で得られたコプロスタン— 3—オンデヒドロゲナーゼ（0. 2単位 Zg肉）を添加混合して、 5°Cで 7日間熟成させた。混合時に 2 0 %ニコチンアミド水溶液を 0. 5m l添加した肉、ホスホリパーゼ D (2単位ノ8肉）添加した肉、及び両者を添加した肉についても 5°Cで 7日間熟成させた。熟成終了後、肉を凍結乾燥し、 2 5m 1の抽出溶媒（クロロフオルム：メタノール =2 ： 1) で脂質成分を抽出した。得られた抽出試料は、ガスクロマトグラフ（GLサイエンス社製 T C一 1 7 0 1カラム φ 0. 2 5 ^mx 3 0 m) を用いてステロ一ル変換産物量を定量した。得られた肉中コレステロ一ルのコプロス夕ノールへの変換率を測定した結果を表 5に示す。表 5中、 P L— Dはホスホリパーゼ Dを、 COPはコプロス夕ノールをそれぞれ示す。

表 5からもわかるように、変換酵素の添加のみではコプロス夕ノールへの変換は観察できなかったが、ニコチンアミドの添加、ニコチンアミドとホスホリパ一ゼ Dの両者の添加で変換率は相乗的に上昇した。

【表 5】

実施例 1 1 (肉加工中のコプロス夕ノールへの酵素変換）

屠殺 6時間後の牛肉 1 0 gをミンチとし、さらにホモジネートした。この肉ホモジネートに実施例 4記載の菌体抽出物を混合し、 3 7 °Cで 2時間加温した。添加量はコレステロールデヒドロゲナーゼ Aとして（0 . 2単位 Z g肉）、 4—コレステン一 3 —オンデヒドロゲナーゼ Aとして（0 .

4単位 Z g肉）、コプロスタン— 3 —オンデヒドロゲナーゼ Aとして（0 .

4単位 Z g肉）であった。混合時に 2 0 %ニコチンアミド水溶液を 0 . 5 m 1添加した肉を同様に加工した。

加工終了後、実施例 1 0の方法に従い、得られた標品のコプロスタノ一ルへの変換率を測定した。得られた肉中コレステロ一ルのコプロスタノ一ルへの変換率を測定した結果を表 6に示す。

表 6からもわかるように、酵素源の添加のみで、肉中コレステロールのコプロス夕ノールへの酵素変換が認められた。ニコチンアミド添加するとさらに変換率は上昇した

【表 6】

実施例 1 2 (肉加工品中のコレステロールの菌体変換）

市販牛肉 1 0 gをフ一ドカッターで肉ペーストとした後、実施例 3記載の C P 2株の菌体を 0. 5 7 g混合した。この混合物を 3 7 °Cで 20時間発酵させ加工肉を得た。加工終了後、実施例 1 0記載の方法に従い、得られた標品のコプロス夕ノールへの変換率を測定した。得られた肉中のコレステロールのコプロス夕ノールへの変換率は 82. 3 %であった。実施例 1 3 (乳中コレステロールの菌体変換）

市販牛乳 1 0m 1 に実施例 3記載の C P 2株の菌体を 0. 42 g混合し, 3 7°Cで 2 0時間発酵させ加工乳を得た。加工終了後、実施例 1 0記載の方法に従い、得られた標品のコプロス夕ノールへの変換率を測定した。得られた肉のコプロス夕ノールへの変換率は 64. 4 %であった。実施例 14 (卵中コレステロールの菌体変換）

1 0 %卵黄水溶液 1 0m lに実施例 3記載の C P 2株の菌体を 0. 42 g混合し、 37°Cで 20時間発酵させ加工卵を得た。加工終了後、実施例 1 0記載の方法に従い、得られた標品のコプロス夕ノールへの変換率を測定した。得られた卵中コレステロールのコプロス夕ノールへの変換率は 2 7. 8 %であった。実施例 1 5 (ユウパクテリゥム ' エスピー C P 1の菌体製造）

市販のゥシ脳をホモジネ一卜して凍結乾燥し、 3倍量の抽出溶媒（クロ口ホルム：メタノール = 2 : 1 ) で 3回抽出した後、溶媒を除去して脂質抽出物を得た。收率は乾燥重量で 5 1. 9 %であった。

このゥシ脳脂質抽出物 4 8 g、トリプチ力一ゼ（B B L社製） 7 2 g、酵母エキス（D i f c o社製） 2 g、塩化ナトリウム 8. 8 g、リン酸水素二力リウム 5 · 2 g、 Γ\りトァガー（D i f c o社製） 2 g、 L一シスチン 1. 6 g、コレステロール 2 g、チォグリコ一ル酸ナトリウム 1. 2 gを脱イオン水 4 Lに溶解し、 p Hを 7. 2に調整して 2本の 3 L三角フラスコに分注した。この培地を温度 1 2 0°Cで 1 5分間後殺菌後、 C P 1 株を接種し、温度 3 7 °Cで 5日間嫌気的攪拌培養した。

培養物からの C P 1株菌体の回収を通常の菌体回収法である遠心分離によって行ったが、 C P 1株菌体は不溶性脂質に吸着し凝集するため比重が低下しかつ不均一となり回収することができなかった。菌体が不溶性脂質に吸着することから、菌体表面が疎水的であることが示唆されたので、菌体をバブリング（B u b b l i n g) 法により疎水的な空気に吸着させて回収した。すなわち、カラムに充填した培養物の下方から泡を吹き込み、上端より菌体が濃縮された泡の部分を回収した。この操作を数回繰り返し行うことによって菌体濃縮物を得ることができた。菌体濃縮物が得られたかどうかは、泡の部分からの試料液と泡の部分を回収した残存試料液とを超音波破碎機で 6 0W、 1 0分間処理して得た菌体抽出物の 4ーコレステン— 3—オンデヒドロゲナーゼ Bの活性を測定することにより確認するこ ■ とができる。 2回パブリングしたときの結果を図 4に示す。図 4から C P 1株菌体の回収に、バブリング法が有効なことがわかる。実施例 1 6 (ユウパクテリゥム 'エスピー C P 1株によるコレステロールデヒドロゲナ一ゼ8、 4—コレステン _ 3—オンデヒドロゲナーゼ8、コプロスタン一 3—オンデヒドロゲナーゼ Bの製造）

実施例 1 5で得られた菌体濃縮物を遠心分離して、得られた菌体を 20 mMトリス塩酸緩衝液（pH 7. 5、 1 mMジチオスレィトール含有）に懸濁する。超音波処理により菌体を破枠し、さらに 1. 0 %T r i t o n X- 1 00存在下で超音波処理後、遠心分離にて固形分を除去し、粗酵素液を得る。その粗酵素液に 1 mMEDTA、 ImMョ一ド酢酸、 0. 5m MPMS Fを添加して、 2 OmMトリス塩酸緩衝液（pH 7. 5、 ImM ジチオスレイト一ル、 1 0 %グリセロール、 ImM EDTA、 ImMョード酢酸、 0. 5mM PMS F含有）に対して透析する。粗酵素液を同緩衝液で 4倍に希釈後、 0. 2 5 %T r i t o n X— 1 0 0を含む同緩衝液で平衡化したブル一セファロース C L _ 6 B (フアルマシア製）に吸着させる。次いで 1. 0 %T r i t o nX— 1 00を含む同緩衝液で脂質成分を溶出後、食塩濃度を 0〜3. 0Mに連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、活性画分を集める。得られた各活性画分を上記緩衝液に対して透析した後、 1. 0 %T r i t o nX— 1 00を含む同緩衝液で平衡化したリソース（フアルマシア製）に吸着させる。次いで食塩濃度を 0〜0. 5M に連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、各活性画分を集めて精製標品とする。

精製標品の、コレステロールデヒドロゲナーゼ Bの比活性は 0 · 1 1 6 単位 Zmg蛋白質で、収率は、 32. 1 %であり、 4—コレステン— 3— ■ オンデヒドロゲナーゼ Bの比活性は 1. 24単位 111 _§蛋白質で、収率は、 6 5. 2 %であり、コプロスタン— 3—オンデヒドロゲナ一ゼの比活性は 0. 835単位 Zmg蛋白質で、収率は 54. 8%であった。また、これら酵素の至適 p Hの測定結果を図 5に示す。実施例 1 7 (コレステロールデヒドロゲナーゼ Bのリン酸による活性化）コレステロ一ルデヒドロゲナ一ゼ Bによる変換反応はリン酸イオンによつて著しく活性化される。リン酸イオン源としては、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウム、リン酸 3ナトリウム等を使用することができ、リン酸 3ナトリゥムを用いたときの結果を図 6 に示す。このことからコレステロ一ルデヒドロゲナーゼ Bを用いたコレステロールからコプロス夕ノールへの変換においてはリン酸イオンの添加が望ましいことがわかる。実施例 1 8 (ユウバクテリゥム s p. C P 1株の酵素を用いた肉中コレステロールの酵素変換）

屠殺 6時間後の牛肉 1 0 gをミンチとし、実施例 1 5記載の各酵素と 0. 0 5 gリン酸ナトリウムを添加し、 3 7 °Cで 2時間加温した。添加量はコレステロールデヒドロゲナ一ゼ B (0. 2単位 Zg肉）、 4—コレステン一 3 _オンデヒドロゲナーゼ B (0. 2単位 Zg肉）、コプロスタン— 3 一オンデヒドロゲナ一ゼ B (0. 2単位 /g肉）であった。混合時に 20

%ニコチンアミド水溶液を 0. 5m l添加する肉も加工した。

加工終了後、実施例 1 0の方法に従い、得られた標品のコプロス夕ノールへの変換率を測定した。得られた肉中コレステロ一ルのコプロスタノ一ルへの変換率を測定した結果を表 7に示す。表 7からもわかるように、酵素の添加のみで、肉中コレステロールのコプロス夕ノールへの酵素変換が認められた。また、ニコチンアミド添加するとさらに変換率は上昇した。

【表 7】

実施例 1 9

次の処方で常法により錠剤（ 1錠あたり 300 mg) を製造する,

C P 1株の乾燥菌体（ 1 X 1 0¹ "細胞） 1 0 m g

乳糖 230 m g

コーンスターチ 3 0 m g

合成ゲイ酸アルミニウム 1 2mg

カルボキシメチルセルロースカルシウム 1 5mg

ステアリン酸マグネシウム 3mg 実施例 2 0

次の処方で常法により錠剤（ 1錠あたり 300 mg) を製造する, C P 2株の乾燥菌体（ 1 X 1 0¹ °細胞） 1 0 m g

乳糖 1 90 m g

コーンスターチ 7 0 m g

合成ケィ酸アルミニウム 1 2mg ■ カルボキシメチルセルローゥム 1 5 m g

ステアリン酸マグネシウム 3 m g 実施例 2 1

次の処方でハードカプセル剤（ 1カプセルあたり 70 0 mg) を製造する。

コレステロールデヒドロゲナーゼ A (実施例 5記載の精製標品）

1 0 Omg

4—コレステン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼ A

(実施例 6記載の精製標品）

1 50 m g

コプロスタン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼ A

(実施例 8記載の精製標品） 1 00 m g

乳糖 230 m g

コーンスターチ 1 00 m g

ヒドロキシプロピルセルロース 2 Omg

コレステロ一ルデヒドロゲナ一ゼ八、コプロスタン— 3—オンデヒドロゲナ一ゼ Aそれぞれ 1 0 Omg及び 4—コレステン— 3—オンデヒドロゲナーゼ A 1 5 Omgに、乳糖 230 m g並びにコーンスターチ 1 0 Omg を添加して混合し、これにヒドロキシプロピルセルロース 2 Omgの水溶液を添加して練合する。次いで、押し出し造粒機を用いて、常法により顆粒を製造する。この顆粒をゼラチンハードカプセルに充填することにより，ハ一ドカプセル剤を製造する。実施例 22 .■ 次の処方で常法により散剤（ 1包あたり 1 0 0 O m g ) を製造する。

コレステロールデヒドロゲナ一ゼ B (実施例 1 5記載の精製標品）

1 0 0 m g

4—コレステン一 3—オンデヒドロゲナーゼ B

(実施例 1 5記載の精製標品）

1 5 0 m g

コプロスタン— 3—オンデヒドロゲナーゼ B

(実施例 1 5記載の精製標品） 1 0 0 m g

ニコチンアミド 5 0 m g

乳糖 4 3 0 m g

コーンスターチ 1 7 O m g 産業上の利用分野

本発明によれば、肉等のコレステロール含有物質の性状を損なうことなく、物質中のコレステロールを選択的に腸管吸収性の低いコプロスタノ一ルに変換してコレステロール濃度を低減させることができる。

また、本発明の新規酵素を含む菌体の組成物を経口投与して小腸でコレステロールをコプロス夕ノールに変換してコレステロールの吸収を阻害して、血清コレステロール値を低下させることができる。

Claims

請求の範囲

1 . コレステロールを含有する物質中のコレステロールを、コレステロ一ルデヒドロゲナ一ゼ、 4—コレステン— 3—オンデヒドロゲナ一ゼ、コプロスタン _ 3—オンデヒドロゲナ一ゼの酵素作用を利用して、 4ーコレステン一 3—オン、コプロスタン一 3—オンを経てコプロス夕ノールに変換して、コレステロールを低減させることを特徴とするコレステロ一ル低減化物の製造方法。

2 . コレステロールを含有する物質中のコレステロールを、コレステロールデヒドロゲナーゼ、 4—コレステン— 3—オンデヒドロゲナーゼ、コプロスタン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼで連続的に処理し、コレステロ —ルをコプロス夕ノールに変換してコレステロールを低減させることを特徴とするコレステロール低減化物の製造方法。

3 . コレステロールを含有する物質中のコレステロールを、コレステロ一ルデヒドロゲナーゼ、 4—コレステン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼ、コプロスタン一 3—オンデヒドロゲナーゼを含む菌体で処理し、コレステロールをコプロス夕ノールに変換してコレステロールを低減させることを特徴とするコレステロール低減化物の製造方法。

4 . コレステロールデヒドロゲナ一ゼが、中性 p H領域に至適 p H を有するコレステロ一ルデヒドロゲナーゼであることを特徴とする請求項 1、 2又は 3記載のコレステロール低減化物の製造方法。

5 . 4—コレステン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼ及びコプロスタン一 3—オンデヒドロゲナーゼが、共に弱酸性 p H領域に至適 p Hを有する 4—コレステン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼ及びコプロスタン— 3—オンデヒドロゲナーゼであることを特徴とする請求項 1〜4のいずれか記載のコレステロール低減化物の製造方法。 O 98/20150 PCT/JP97/04067, 一..

6. コレステロールを含有する物質が、肉、卵、乳、魚介類及びそれらを含む調理加工食品、又は動物用、家禽用及び養魚用飼料であることを特徴とする請求項 1〜 5のいずれか記載のコレステロール低減化物の製造方法。

7. コレステロ一ルを含有する物質に、ニコチンアミド、ホスホリパーゼ、リン酸イオンから選ばれる群の 1種又は 2種以上を添加することを特徴とする請求項 1〜 6のいずれか記載のコレステロール低減化物の製造方法。

8. 下記の作用を有し、中性 pH領域に至適 pHを有するコレステ口一ルデヒドロゲナ一ゼ。

コレステロール + NAD (P)

→4ーコレステン一 3—オン + NAD (P)H

9. ユウパクテリゥム属に属する菌株が生産する請求項 8記載のコレステロ一ルデヒドロゲナ一ゼ。

1 0. ユウパクテリゥム属に属する菌株が、ユウバクテリウム * ェスピー（E u b a c t e r i urn s p. ) CP 1又は C P 2である請求項 9記載のコレステロ一ルデヒドロゲナ一ゼ。

1 1. 下記の作用を有し、弱酸性領域に至適 pHを有する 4ーコレステン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼ。

4ーコレステン一 3—オン + NAD (P) H

→コプロスタン一 3—オン + NAD (P)

1 2. ユウパクテリゥム属に属する菌株が生産する請求項 1 1記載の 4—コレステン— 3—オンデヒドロゲナ一ゼ。

1 3. ユウパクテリゥム属に属する菌株が、ユウバクテリウム ' ェスピー（E u b a c t e r i urn s p . ) CP 1又は C P 2である請求項 1 2記載の 4ーコレステン一 3—オンデヒドロゲナーゼ。

1 4. 下記の作用を有し、弱酸性領域に至適 p Hを有するコプロスタン一 3—オンデヒドロゲナーゼ。

コプロスタン一 3—オン + NAD (P) H

→コプロスタノ一ル + NAD (P)

1 5. ユウバクテリゥム属に属する菌株が生産する請求項 1 4記載のコプロスタン— 3 _オンデヒドロゲナ一ゼ。

1 6. ユウパクテリゥム属に属する菌株が、ユウバクテリウム * ェスピ一（E u b a c t e r i urn s p. ) C P 1又は C P 2である請求項 1 5記載のコプロスタン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼ。

1 7. コレステロールを含有する物質中のコレステロールを酵素作用を利用してコプロス夕ノールに変換する際に、ニコチンアミドを添加することを特徴とするコレステロール低減化物の製造方法。

1 8. コレステロールを含有する物質中のコレステロールを酵素作用を利用してコプロス夕ノールに変換する際に、ホスホリパーゼとニコチンアミドを添加することを特徴とするコレステロール低減化物の製造方法

1 9. コレステロールを含有する物質中のコレステロールを酵素作用を利用してコプロス夕ノールに変換する際に、リン酸イオンを添加することを特徴とするコレステロール低減化物の製造方法。

2 0. コレステロールを含有する物質が肉、卵、乳、魚介類及びそれらを含む調理加工食品、又は動物用、家禽用及び養魚用飼料である請求項 1 7、 1 8又は 1 9記載のコレステロール低減化物の製造方法。

2 1. ユウバクテリウム · エスピー C P 2 (F E RM B P— 5 5 0 1 ) を含有するコレステロール低減化用組成物。

2 2. ユウバクテリゥム 'エスピー C P 1 (FERM B P— 5 5 O 98/20150 PCT/JP97/04067 * 〜'■

00) を含有するコレステロール低減化用組成物。

23. ユウバクテリゥム ' エスピー C P 2 (FERM B P— 5 5 0 1 ) 。

24. ユウバクテリゥム ' エスピー C P 1 (FERM B P— 5 5 00 ) o

2 5. 下記の理化学的性質を有するコレステロールデヒドロゲナ一ゼ A ：

(a) 作用：次の反応を触媒する

コレステロ一ル + NAD P→4—コレステン一 3—オン + NAD PH ；

(b) 基質特異性：コレステロール、）3シトステロール、カンペステロ一ル及びスチグマステロールに作用する；

(c ) 至適 p H ： 6. 5〜 7. 8 ；

(d) 安定 pH ： 5. 3〜9. 0 ；

(e) 作用適温の範囲： pH 7. 5、 30分間の反応で 40°Cまで温度上昇とともに活性は増大する；

( f ) 温度安定性の範囲： 40°C、 1 0分間の加熱処理で処理前の 80 % 以上の活性を保持する；

(g) 阻害剤、金属イオンの影響： p—クロロマ一キュリーフエニルスルホン酸塩（P CMB) 、銅イオンの存在下で活性が阻害される；

(h) 補酵素： ]3—ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NA DP) 。

26. 下記の理化学的性質を有する 4—コレステン一 3—オンデヒドロゲナーゼ A：

(a) 作用：次の反応を触媒する

4ーコレステン一 3—オン + NADH—コプロスタン一 3—オン + NA O 98/20150 PCT/JP97/04067 » 〜■■

D ；

(b) 基質特異性： 4ーコレステン一 3—オン及びプロゲステロンに作用し、テストステロン及びプログネロンに作用しない；

( c ) 至適 p H ： 5. 4〜 6. 5 ；

(d ) 安定 p H ： 5. 5〜 7. 2 ；

(e) 作用適温の範囲： pH 6. 0、 30分間の反応で 40°Cまで温度上昇とともに活性は増大する；

( f ) 温度安定性の範囲： 40° (：、 1 0分間の加熱処理で処理前の 80 % 以上の活性を保持する；

(h) 補酵素：還元型 i3—ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NA DH) 。

27. 下記の理化学的性質を有するコプロスタン— 3—オンデヒド口ゲナ一ゼ A ：

(a) 作用：次の反応を触媒する

コプロスタン _ 3—オン + NADPH→ プロス夕ノール +NADP ；

(b) 基質特異性：コプロスタン— 3—オンに作用し、 5 α—コレステン

- 3一オンにわずかに作用する；

( c ) 至適 ρ Η ： 5. 2〜 5. 7 ；

(d) 安定 pH : 4. 0〜7. 5 ；

( f ) 温度安定性の範囲： 0. 5mMNAD PHの存在下、 40° (：、 1 0 分間の加熱処理で処理前の 80 %以上の活性を保持する； (g) 阻害剤、金属イオンの影響： P—クロロマーキュリーフエニルスルホン酸塩（P CMB) 、鉄イオン、銅イオンの存在下で活性が阻害される

(h) 補酵素：還元型 i3—ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸 (N AD P H) 。

28. 下記の理化学的性質を有するコレステロールデヒドロゲナーゼ B ：

(a) 作用：次の反応を触媒する

コレステロール +NADP→4—コレステン一 3—オン + NADPH ;

(b) 基質特異性：コレステロール、シトステロール、カンペステロ —ル及びスチグマステロールに作用する；

( c ) 至適 p H ： 6. 7〜 7. 7 ；

(d) 安定 p H ： 5. 0〜 1 0. 5 ；

( f ) 温度安定性の範囲： 40°C、 1 0分間の加熱処理で、処理前の 80 %以上の活性を保持する；

(g) 阻害剤、金属イオンの影響： P—クロロマーキュリーフエニルスルホン酸塩（P CMB) 、鉄イオン、銅イオンの存在下で活性が阻害される

(h) 補酵素：；3—ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NA D P)

2 9. 下記の理化学的性質を有する 4ーコレステン一 3—オンデヒド口ゲナ一ゼ B ：

(a) 作用：次の反応を触媒する 4ーコレステン一 3—オン + NADH

→コプロスタン一 3—オン +NAD ； (b) 基質特異性： 4—コレステン— 3—オンに作用し、 5—コレステノン— 3—オンに作用しない；

( c ) 至適 pH ： 5. 3〜7. 0 ；

(d) 安定 pH ： 5. 2〜8. 0 ；

( e ) 作用適温の範囲： p H 7. 5、 30分間の反応で 40 °Cまで温度上昇とともに活性は増大する；

( f ) 温度安定性の範囲： 3 7°C、 1 0分間の加熱処理で、処理前の 80 %以上の活性を保持する；

(h) 補酵素：還元型 /3—ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NA DH)

30. 下記の理化学的性質を有するコプロスタン一 3—オンデヒド口ゲナ一ゼ B ：

(a) 作用：次の反応を触媒する

コプロスタン一 3—オン + NADPH—コプロスタノ一ル + NADP ;

(b) 基質特異性：コプロスタン一 3—オンを 1 0 0とした相対活性は、 5ひーコレスタン一 3—オンは 0である。

( c ) 至適 p H ： 5. 4〜 7. 6 ；

(d) 安定 p H ： 4. 5〜 7. 0 ；

( e ) 作用適温の範囲： p H 7. 5、 30分間の反応で 4 5 °Cまで温度上昇とともに活性は増大する；

( f ) 温度安定性の範囲： 45°C、 1 0分間の加熱処理で、処理前の 8 0 %以上の活性を保持する；

(h) 補酵素：還元型 ]3—ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸 (NAD P H)

3 1. コレステロールを含有する物質中のコレステロールを、コレステロールデヒドロゲナ一ゼ、 4ーコレステン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼ、コプロスタン一 3—オンデヒドロゲナーゼの酵素作用を利用して、 4 —コレステン一 3—オン、コプロスタン一 3—オンを経てコプロスタノ一ルに変換して、コレステロールを低減させることを特徴とするコレステロールの低減化方法。

3 2. コレステロールを含有する物質中のコレステロールを、コレステロ一ルデヒドロゲナ一ゼ、 4ーコレステン— 3—オンデヒドロゲナーゼ、コプロスタン一 3—オンデヒドロゲナーゼで連続的に処理し、コレステロールをコプロスタノ一ルに変換して、コレステロ一ルを低減させることを特徴とするコレステロールの低減化方法。

3 3. コレステロールを含有する物質中のコレステロールを、コレステロールデヒドロゲナ一ゼ、 4ーコレステン— 3—オンデヒドロゲナーゼ、コプロスタン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼを含む菌体で処理し、コレステロールをコプロス夕ノールに変換して、コレステロールを低減させることを特徴とするコレステロールの低減化方法。

34. コレステロールデヒドロゲナーゼが、中性 pH領域に至適 p Hを有するコレステロ一ルデヒドロゲナーゼであることを特徴とする請求項 3 1、 3 2又は 3 3記載のコレステロールの低減化方法。

3 5. 4—コレステン— 3—オンデヒドロゲナ一ゼ及びコプロス夕ン— 3—オンデヒドロゲナーゼが、共に弱酸性 p H領域に至適 p Hを有する 4ーコレステン— 3—オンデヒドロゲナーゼ及びコプロスタン一 3—ォンデヒドロゲナ一ゼであることを特徴とする請求項 3 1〜 3 4のいずれか記載のコレステロールの低減化方法。

3 6 . コレステロールを含有する物質が、肉、卵、乳、魚介類及びそれらを含む調理加工食品、又は動物用、家禽用及び養魚用飼料であることを特徴とする請求項 3 1〜 3 5のいずれか記載のコレステロール低減化方法。

3 7 . コレステロールデヒドロゲナ一ゼ、 4ーコレステン一 3—ォンデヒドロゲナ一ゼ及びコプロスタン一 3—オンデヒドロゲナ一ゼを含有するコレステロール低減化用組成物。