WO1998002458A1 - Inhibiteur de differenciation - Google Patents

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WO1998002458A1
WO1998002458A1 PCT/JP1997/002414 JP9702414W WO9802458A1 WO 1998002458 A1 WO1998002458 A1 WO 1998002458A1 JP 9702414 W JP9702414 W JP 9702414W WO 9802458 A1 WO9802458 A1 WO 9802458A1
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WO
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sequence
seq
dna
cells
amino acid
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Application number
PCT/JP1997/002414
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English (en)
French (fr)
Inventor
Seiji Sakano
Akira Itoh
Original Assignee
Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to DE69736109T priority patent/DE69736109T2/de
Priority to CA002260365A priority patent/CA2260365C/en
Priority to EP97930768A priority patent/EP0913404B1/en
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Priority to US10/219,248 priority patent/US7138276B2/en

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel physiologically active substance for suppressing undifferentiated cells from differentiating.
  • Conventional technology
  • erythrocytes protect the body against oxygen transport
  • platelets protect against hemostasis
  • leukocytes and lymphocytes protect against infection.
  • These diverse cells are derived from hematopoietic stem cells in the bone marrow. It has recently been shown that hematopoietic stem cells are stimulated by various site forces in the body and environmental factors to differentiate into various blood cells, osteoclasts, mast cells, and the like.
  • Erythropoietin (EPO) for differentiation into red blood cells
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • platelet for differentiation into megakaryocytes, which are platelet-producing cells.
  • Blood undifferentiated cells are conceptually classified into blood progenitor cells that are destined to differentiate into specific blood lineages and hematopoietic stem cells that have the ability to differentiate into all lineages and have the ability to self-renew.
  • blood progenitor cells can be identified by colony assay, a method for identifying hematopoietic stem cells has not been established.
  • stem cell factor-1 SCF
  • interleukin 3 IL-3
  • GM-CSF granulocyte monocyte colony stimulating factor
  • IL-6 inulin leukin 6
  • IL-11 Yuichi Leukin 1
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • oncoscintin M etc.
  • leukemia cell inhibitory factor has been reported to have the effect of proliferating mouse embryonic stem cells without differentiation, or has no such effect on hematopoietic stem cells / blood progenitor cells.
  • tumor cell growth factor- TGF- ⁇
  • TGF- ⁇ tumor cell growth factor-
  • Notch is a receptor type-1 membrane protein found in Drosophila that is involved in the regulation of neuronal differentiation. Homologs of Nottsu are nematodes (Lin-12) and African frogs ( X 0 tch), mouse (M 0 tch), human (TAN-1), and other invertebrates, found in a wide range of animal species beyond the vertebrate category. You. On the other hand, two species of Drosophila notch were found as ligands of Drosophila notch: Drosophila dedel (De1ta) and Drosophila y ⁇ baeserate (Serrate).
  • Notch ligand homologues have been found in species (Artavanis—Tsakonaseta 1., Science 26, 22, 25-23, 1995). Particularly in humans, the human notch homolog TAN-1 is widely expressed in tissues throughout the body (Elliseneta 1., Ce11 16 6, 649-661, 19). 9 1), and two other notch-related molecules other than TAN-1 have been reported (Artavanis-Tsakonaseta 1., Science 2668, 2225-232, 19). 9 5). In blood cells, TAN-1 expression was observed in CD34-positive cells by the PCR (Polym erase Chain Reaction) method (Milnereta 1., Blood 83, 2, 05 7- 2 0 6 2, 1 9 9 4).
  • EGF repeat sequence is also conserved in other notch homologs, and a similar mechanism has been inferred for ligand binding.
  • DSL Delta-Serrate-Lag-2
  • EGF-like repeat sequence is conserved near the amino acid end, similar to Yuichi Recept (Fig. A rtavanis-T sakonaseta 1.. Science 2 68, 2 25-23, 1995).
  • EGF-like sequence is Trompo 'modulin (Jackma netal., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • LDL low-density lipoprotein receptor Yuichi
  • X—Delta-1 X—Delta-1 is involved in the development of primordial neurons.
  • An object of the present invention is to provide a compound derived from a novel factor that suppresses the differentiation of undifferentiated cells. Means for solving the problem
  • Notch and its ligands not only regulate the differentiation of neurons, but also regulate the differentiation of widely undifferentiated cells.
  • Notch ligands of heterologous species such as the known chicken and alfalga frogs have problems of species specificity and antigenicity. Therefore, it is indispensable to obtain a human-type notch ligand that has not yet been reported.
  • human delta homologs hereinafter referred to as human delta
  • human cerium homologs' hereinafter referred to as human mortar
  • the present inventors have thought that the discovery of is a candidate for an effective drug for controlling the differentiation of undifferentiated cells, and sought to find it.
  • the present inventors analyzed the conserved amino acid sequences of these homologs found in animals other than humans to search for human Notch ligands, and performed PCR by mixed primers of the corresponding DNA sequences. We proceeded to discover the gene.
  • Hiddel and Histrate hereinafter referred to as "Hitdelta-1" and “Hythrate-1", respectively
  • Drosophila delta and Serrate are similar. I thought there was a molecule and tried to find it.
  • the present inventors used a method of searching a gene sequence database. That is, based on the gene sequence of human serine-11 found for the first time by the present inventors (shown together with the amino acid sequence in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing), the gene sequence data was randomly generated by Genebank.
  • Gene fragment data of human cDNA sequence homologous to EST (.Expressed Sequence Tag) using Geneticx / CD (manufactured by Software Development Co., Ltd.) Multiple tall gene fragments (about 200 to 350 b in length) were found. These short gene fragments were cloned by PCR, and using these gene fragments as probes, we attempted to clone longer gene fragments from a human fetal cDNA library or the like. As a result, the gene sequence of the longer gene fragment, which had been separated in this way and whose gene sequence was determined, was compared again with the gene sequence of human cell sequence-1. It was found that a gene having a relatively high homology with toe 1 was isolated, and this molecule was named human selec- tate 12, and the full-length gene was successfully cloned.
  • the present invention contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, or 3.
  • the present invention also relates to polypeptides that have an inhibitory effect on the differentiation of undifferentiated cells, and to those polypeptides other than undifferentiated cells or cerebral nervous system or muscle undifferentiated cells.
  • Polypeptides that are differentiated cells, polypeptides that are undifferentiated cells or blood undifferentiated cells, and polypeptides have the effect of suppressing the proliferation of vascular endothelial cells It relates Ribe peptide, a pharmaceutical composition containing the Poribe peptide relates cell culture medium containing the polypeptide, ⁇ cells or blood It relates to a medium that is an undifferentiated cell. Further, the present invention relates to a DNA encoding a polypeptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3, wherein the DNA comprises 90% of the DNA or the DNA sequence of SEQ ID NO: 4. No. 73 to 1, No. 90 to 325 or No. 90 to No. 3 725.
  • a recombinant DNA body obtained by linking a DNA encoding a polypeptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3 to a vector DNA that can be expressed in a host cell. And cells transformed with these DNAs.
  • the present invention also relates to a method for producing a compound, which comprises culturing cells capable of producing the polypeptide in a medium and collecting the produced compound. ⁇ Antibodies that specifically recognize polypeptides.
  • Intraspecies mutations that have a polypeptide consisting of ⁇ 3 amino acid sequences or are known to occur in nature
  • variants resulting from mutations such as allele mutations and mutations caused by artificially-produced point mutations may be modified according to the present invention as long as the polypeptide of SEQ ID NO: 1, 2 or 3 in the sequence listing does not lose their properties. Included in new compounds. Modifications and substitutions of the amino acids are described in detail in, for example, the application of Bennett et al. (International Publication No. WO96 / 26445) and can be prepared with reference to these.
  • the variant in the present invention relates to a variant associated with such amino acid substitution, and the variant can be defined as an amino acid sequence having 90% or more similarity in the amino acid sequence.
  • the DNA sequence encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3 in the sequence listing is shown in SEQ ID NO: 4 of the sequence listing together with the amino acid sequence.
  • SEQ ID NO: 4 of the sequence listing together with the amino acid sequence.
  • the nucleotide sequence obtained by such degeneracy of the genetic code is also included in the DNA of the present invention.
  • the undifferentiated cells described in the present invention are defined as cells that can be proliferated by a specific stimulus and that can be differentiated into cells having a specific function by a specific stimulus. Includes undifferentiated cells of the tissue system, undifferentiated cells of the cerebral nervous system, undifferentiated cells of the muscular system, undifferentiated cells of the blood system, etc., each of which has the ability to self-renew called stem cells and produces cells of that lineage Includes competent cells.
  • the term “differentiation suppression production” refers to an action of suppressing the autonomous or heterogeneous differentiation of these undifferentiated cells, and more specifically, an action of maintaining an undifferentiated state.
  • undifferentiated cells of the cerebral nervous system can be defined as cells having the ability to differentiate only into brain and nerve cells having a specific function in response to a specific stimulus.
  • Muscle undifferentiated cells are defined as cells that have the ability to differentiate only into muscle cells having a specific function in response to a specific stimulus. Is determined.
  • the undifferentiated blood cells described in the present invention are blood progenitor cells that are committed to differentiate into a specific blood lineage that can be identified by a blood colony assay, and their ability to differentiate into all lineages and autologous cells. It is defined as a cell group including hematopoietic stem cells having replication ability.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is the sequence of the active center excluding the signal peptide of human serrate-2 of the present invention, and the mature amino acid sequence of human seroto-2 of the present invention shown in SEQ ID NO: 3 It corresponds to amino acid Nos. 1 to 217 of the full-length amino acid sequence.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is a sequence of the extracellular domain excluding the signal peptide of human serum-2 of the present invention, and the human amino acid sequence of the present invention shown in SEQ ID NO: 3 is matured. It corresponds to amino acid numbers 1 to 1058 of the full-length amino acid sequence of the type.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is a matured full-length amino acid sequence of human serum-2 of the present invention.
  • the sequence of SEQ ID NO: is the entire amino acid sequence of human serrate-12 of the present invention and the cDNA sequence encoding it.
  • the sequence of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing is the entire amino acid sequence of human serrate-11 used in the present invention and the cDNA sequence encoding it.
  • the left and right ends of the amino acid sequence described in the sequence listing are the amino terminal (hereinafter referred to as N-terminal) and the carboxyl group terminal (hereinafter referred to as C-terminal), respectively.
  • the left and right ends of the nucleotide sequence are the 5 'end and the 3' end, respectively.
  • the following method can be considered for cloning the gene for the human notch ligand.
  • RT—PCR reverse Transcription P It is possible that a fragment of the human Notch ligand gene could be obtained by amplifying the human-derived PCR template by PCR using it as a primer for olym erase Chain Reaction).
  • RT-PCR primers are prepared from the known DNA sequence information of Genetic known from CR template? Obtaining fragments is possible in principle.
  • the PCR for the DSL sequence was considered first, or the number of combinations of DNA sequences corresponding to the amino acid sequence conserved in this region was enormous.
  • the EGF-like sequence had to be subjected to PCR.
  • the present inventors designed and prepared 50 sets of PCR primers, using the sequence shown in Reference Example 1 as an example, and prepared cDN A from po1yA + RNA of various tissues derived from human.
  • each full-length cDNA was obtained from a human cDNA library using the thus-obtained human 11 gene fragment.
  • the present inventors have already filed a patent application for these contents (International Publication No. WO97 / 19172) .o
  • other ligands exist in addition to this one molecule of human serum. hand Regarding the presence of the ligand, the gene sequence encoding the amino acid sequence of one molecule of human serum, that is, the nucleotide sequence from No.
  • a search for a gene fragment with the highest homology was performed by a method of searching a database of gene sequences.
  • the gene sequence database is EST (Expressed Sequence T), which is a database of gene fragments of the random human cDNA sequence of Genbank (releases 9 and 995). ag) was used as the analysis software, and a gene sequence search 'Software Genex / CD (manufactured by Software Development Co., Ltd.) was used.
  • a commercially available analysis software may be used as the analysis software, and analysis is performed using analysis software attached to each database, for example, BLAST included in Genbank. ⁇ Sen-Yu-I-Ob. Biotechnology-Information, access to the Institute for Chemical Research, Kyoto University, Japan, using WWW (World Wide), electronic mail, etc. for calculation. be able to. Through such an operation, it is possible to obtain the gene sequence information of a gene fragment having a high similarity to the target gene (a length of about 200 to 35 Ob).
  • the gene fragment sequence information thus prepared includes the gene sequence information, as well as information on the clone name of the heredity : f, existing organs and tissues. Since the gene sequence information is close to the raw sequence information of the DNA sequencer, the gene sequence is undecided and described as N, or the genetic information is often incorrect. The information on these gene sequences is not always certain. Based on these genetic information, the region where no N data is available in the gene sequence is considered as the most probable part of the gene sequence information. Identify gene fragments with significant homology (if the gene is about 200b, it is desirable that the similarity of the gene sequence should be about 40% or more). Regarding the gene fragment identified in this way, the-part of the gene can be purchased from the U.S.
  • Genome System if the clone name is known, but since the expression organ is specified, the commercially available expression organ Can be separated from the cDNA by PCR.
  • the gene information found in this manner is partial information, and unless the entire information is obtained, the full-length amino acid that would be encoded by the partial gene is originally homologous.
  • the molecules are not necessarily similar to the molecules used in the search. This information alone cannot provide certainty about the molecule.
  • the present inventors actually prepared a large number of probes having homology and performed ⁇ -cloning with plaque hybridization, but many gene fragments did not encode the target molecule. Was. So while this technique is technically possible,
  • a probe was prepared by PCR for about 50 or more gene fragments showing similarity to human serum 1c DN DN.
  • the gene sequence clones registered in the three Genbanks described in Example 1 (registered Nos. T08853, R50026, R46751), and three kinds of DNA probes prepared based on the above, i.e., described in SEQ ID NOs: 8, 9 and 10 in the sequence listing. This was a gene isolated by ffl using a DNA probe having a sequence or a gene fragment encoding two molecules of human serum.
  • the method is to obtain a gene partially cloned by the above-mentioned method by labeling the gene with an isotope label and various non-isotope labels, and screening the library 1 by a method such as hybridization.
  • the labeling method of the method is, for example, the method of labeling the end using [ 32 P] ⁇ -ATP and T4 polynucleotide kinase, the other method such as the nick translation method or the primer extension method. Labeling methods are available.
  • a method for extending a gene using a 5'-RACE method or a 3'-RACE method without using a library can also clone a full-length gene or clone a longer gene fragment.
  • human-derived methods c Expression of a DNA library by incorporating a DNA library into an expression vector, expressing it in COS-7 cells, etc., and searching for its binding molecule using the receptor Notch protein to screen for the target gene
  • the cDNA of the ligand can also be separated by a technique such as cloning.
  • Expression cloning was performed by the fractionation method using Celso's Yuichi using the binding of polypeptides containing the amino acid sequences of four types of A. thaliana, such as TAN-1, and radioisotope. And detection methods using film and margin.
  • the methods described in the method for obtaining human serrate-12 gene, the various methods described in the present invention, including the PCR method used for cloning human delta-11 and human serate-11 are as follows.
  • a new notch ligand which has not been cloned yet, can be used to obtain a single molecule.
  • the amino acid sequence of human cells 1 and 2 and the gene sequence of human cells PCR can be used to clone some of the conserved regions, or ESTs can be searched for based on human delta-1 and human cerate-2 for cloning in the same manner.
  • the novel Notch ligand family molecule cloned in this way can be used for full-length cloning, expression vector preparation, transformed cell preparation, and tamper reaction, as in the case of the human serum 2 shown in the present invention.
  • Production, antibody production, and biological activity search can be performed, all of which can be expected to suppress cell differentiation
  • the present inventors used these radioisotopes to isolate these three gene fragments.
  • cDNAs thus cloned are joined together as shown in Example 2 to obtain cDNAs encoding the full length of the human serum-2.
  • plasmids incorporating cDNA include E. coli-derived pBR322, PUC18, pUC19, pUC118, and pUC119 (all manufactured by Takara Shuzo).
  • any other substances can be used as long as they can be replicated and propagated in the host.
  • the phage vector into which the cDNA is incorporated for example, Igt10, ⁇ gt1i, etc., and any other phage vector that can be increased in the host can be used. it can.
  • the thus obtained plasmid is introduced into an appropriate host, for example, a bacterium belonging to the genus Escherichia and a bacterium belonging to the genus Bacillus (1 us) using the calcium chloride method or the like.
  • a bacterium belonging to the genus Escherichia include Escherichia coli I 12 HB10, MC106, LE392, and JM109.
  • Examples of the bacterium of the genus Bacillus include Bacillus and Sachiris M114.
  • the phage vector Yuichi was used for the in vitro packaging method (Pr0c.Nat1.Acad.Sci., 71: 2442—, 19778). ) Can be introduced.
  • the full-length precursor amino acid sequence of the gene is composed of the amino acid sequence from the 126th to the 122nd.
  • the signal peptide region is composed of 26 amino acids corresponding to 126th methionine — the 1st proline. It consists of 105-amino acid, which corresponds to 105-glycine from methionine, and its transmembrane domain is 2-amino acid, which corresponds to 105-leucine to 107-tryptophan. It is estimated that the inner part of the cell is composed of threonine at number 1080 and glutamate at number 122.
  • each of these parts is merely a din structure predicted from the amino acid sequence, and the actual form on cells and in solution differs from the above configuration by a small amount. It is also conceivable that the constituent amino acids of each of the above-specified dins may be around 5 amino acids or 10 amino acids.
  • the amino acid sequence at the N-terminus of the ligands EXS2Fc and EXS2FLAG of the present invention purified as described in Example 6 was identified. However, the sequence number in the sequence listing! Is the first amino acid of It is Jeonin. Therefore, at least the signal peptide must be
  • Notchi's ligand family molecules share a common sequence that is evolutionarily conserved. That is, it is an EGF-like sequence that repeats with the DSL sequence. These conserved sequences were deduced from the amino acid sequence of Human Serrate-2 by comparison between Human Serrate-1 and Human Serrate-1. In other words, the DSL sequence corresponded to 43 amino acid residues corresponding to cysteine No. 17 to cysteine No. 214 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • the EGF-like sequence is repeated 16 times, and among the amino acid sequences of SEQ ID NO: ⁇ 4 in the sequence listing, the first EGF-like sequence is from cysteine 217 to cysteine 247, The 2 EGF-like sequence is from 250 cysteine to 278 cysteine, the 3rd EGF ⁇ sequence is from 285 cysteine to 318 cysteine, and the 4th EGF-like sequence is 325 cysteine. From cysteine to 356 cysteine, the fifth EGF-like sequence from cysteine 363 to cysteine 394, and the sixth EGF-like sequence from cysteine 401 to cysteine 43, cysteine 7.
  • the EGF-like sequence is from cysteine 439 to cysteine 4
  • the eighth EGF-like sequence is from cysteine 476 to 507
  • the ninth EGF-like sequence is cysteine 514.
  • 10th EGF-like sequence from 563 cysteine to 607th cysteine
  • 11th EGF-like sequence from 6 cysteine 1 4 cysteine to 645 cysteine
  • No. 12 EGF-like sequence from 652 cysteine to 683 cysteine
  • 13th EGF-like sequence from 690 cysteine to 7 2 cysteine
  • cysteine residues between the 9th EGF-like sequence and the 10th EGF-like sequence There are two cysteine residues, six cysteine residues in the N-terminal direction of the DSL sequence, and sixteen cystine residues in the C-terminal direction of the 16th EGF-like sequence. , And all cysteine residues were conserved at almost the same position as that of human serine-11.
  • the portion to which the ⁇ chain is added is a portion to which N-acetyl-D-glucosamine can bind N-darcoside, and the portion of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing is used.
  • the shallow asparagine groups of No. 127, No. 544, No. 593, No. 726 and No. 132 of the no acid sequence can be found.
  • a portion where serine or threonine residues frequently appear may be considered as a portion for estimating the 0-glycoside bond of N-acetyl-D-galactosamine. It is considered that the protein to which these ⁇ chains have been added is generally more stable to degradation in vivo than the polypeptide itself and has a strong physiological activity.
  • N-acetyl-D-gelcosamine is replaced by N-glucosid-N-acetyl-D-galacto.
  • the present invention also includes polypeptides in which sugar chains such as tosamine are bonded with N-gelcoside or 0-coulcoside. Studies on the binding of P. aeruginosa and its ligands show that the amino acid region required for binding to P. aeruginosa ligands is the N protein of the mature protein from which the signal peptide has been cleaved.
  • a complementary nucleic acid of 12 mer to 16 mer or more, more preferably 18 mer or more, having a partial gene sequence of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing In other words, antisense DNA, RNA, and their methylated, methylphosphorylated, deaminated, or thiophosphorylated derivatives can be used by a method such as hybridization and PCR. I can do it.
  • a similar method can be used to detect homologs of the present gene in other organisms such as mice and to clone the gene.
  • Detection of mRNA expression of this molecule in this way can be applied to diagnosis such as detection of malignant tumors in a normal organ where such expression is not observed.
  • the transformed cells obtained by transfecting Escherichia coli JM109 with the vector pUCSR-2 containing the cDNA encoding the entire amino acid sequence of the human serotolyte 2 of the present invention were obtained from E. coli: JM109. — Deposited as pUC SR-2 at the Research Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry, located at 1-3 1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan
  • the DNA encoding the polypeptide of the present invention has a translation initiation codon at its 5 'end and a translation stop codon at its 3' end. You may do it. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • a promoter is connected upstream. Examples of the vector include the above-mentioned plasmid derived from Escherichia coli, plasmid derived from Bacillus minami, plasmid derived from yeast, or bacterium such as phage or other bacterium and retrovirus, or animal virus such as dexnia virus.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter that is appropriate for the host used for gene expression.
  • tac promoter trp promoter, lac promoter, etc. are preferable. If the host is Bacillus, SP01 promoter, SP02 promoter, etc. When the host is yeast, the PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter A mouth motor is preferred.
  • the DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3 may be used alone, or it may be used to facilitate the detection of the produced polypeptide.
  • a cDNA encoding a known antigen epitope or by adding a cDNA encoding an imnoglobulin Fc in order to form a multimeric structure of the human serum 2; Proteins with special functions can also be produced.
  • the present inventors considered that the expression vectors for expressing extracellular proteins include: 1) Nos.
  • an expression vector for expressing the full-length protein 4) a DNA encoding amino acids 1 to 12 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing; and 5) a DNA encoding the sequence listing.
  • Expression vector p MK] TN eo Were separately connected to each other to prepare a full-length expression vector of human serrate-12.
  • a transformant is produced by using the thus constructed expression plasmid containing the DNA encoding the human serum 1-2.
  • Examples of the host include Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, animal cells, and the like.
  • animal cells include monkey cells, COS-7, Vero, Chinese Hams Yuichi cell CHI, and silkworm cell SF9.
  • each of the above-mentioned five types of expression vectors was separately transfected, and human cells-2 were converted to COS-7 ⁇ (I'd (from RIKEN, Cell Development Bank). It can be manually processed and expressed by RCB () 539), and a transformant transformed by these expression plasmids can be obtained.Furthermore, each transformant can be obtained by a known method in an appropriate medium. By culturing under appropriate culture conditions, various types of human serum cells can be produced.
  • the following method can be used.
  • the cells or cells are collected by a known method, for example, centrifugation, and suspended in an appropriate buffer.
  • a method of disrupting the cells or cells by freeze-thawing or the like and then obtaining a crude extract of the human serum-2 protein by centrifugation or filtration can be used as appropriate.
  • the buffer may contain a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100.
  • the culture solution When secreted into the culture solution, the culture solution is separated from the cells or cells by a known method, for example, a centrifugation method, and the supernatant is collected. Human serum contained in the cell extract or cell supernatant thus obtained
  • the 12 protein can be purified by using a known protein purification method.
  • detection was performed by immunoassay using an antibody against these known antigen epitopes. To proceed with the purification.
  • detection can be performed using the antibody against human serum 12 described in Example 7.
  • a more effective method for purification includes affinity mouth chromatography using an antibody.
  • the antibodies against various human citrates 12 described in Example 7 can be used as the antibodies to be ffl.
  • an antibody against a portion other than the human serum 1-2 such as an antibody against FLAG for FLAG, and a protein for human IgGFc G and Protein A can be used.
  • the physiological function of the purified human serum 12 protein or human serum 12 can be determined by using various cell line, mouse, rat, etc.
  • Various methods of signal transduction within the cell based on the genetic method, and various methods of associating with Notch Receptu Yuichi can be used. The effect can be expected mainly to suppress cell differentiation, and to promote tissue regeneration.
  • Example 8 in undifferentiated cells derived from cord blood enriched with a CD34-positive cell fraction, the suppression of colony formation on undifferentiated blood cells that form colonies in the presence of various cytokines was suppressed. Was found to have activity. Further, as shown in Example 9, the addition of the human serum-2 IgGl chimeric protein to the liquid culture in the presence of the site force-in resulted in the most undifferentiated human blood cells. Significantly reduced the number of LTC—Long—Term Culture—Initiatin ng Cells that are considered differentiated blood stem cells Have the activity to make
  • An inhibitor of proliferation of vascular cells containing a polypeptide having 1 to 3 amino acid sequences, and a disease expected to be effective by inhibiting various angiogenesis (Fo 1 km anand K lagsbru n. S cience 2 3 5, 4 4 2-4 4 7,
  • the present invention also includes therapeutic agents intended for use as such therapeutic agents.
  • a lyophilized product of the polypeptide of the present invention having the above-mentioned form together with an appropriate stabilizer, for example, human serum albumin is dissolved in distilled water for injection at the time of use.
  • an appropriate stabilizer for example, human serum albumin
  • a shape that can be used by suspending is desirable.
  • it can be provided as an injection or a drip prepared at a concentration of 0.1 to 1000 gZm1.
  • the present inventors divided the vials into 1 mg Zm 1 of the compound of the present invention and 5 mg / m 1 of human serum albumin, and retained the activity of the compound for a long time.
  • the in vitro physiological activity of the present invention can be measured in any disease model mouse or This can be achieved by using rats, monkeys, and other animals that exhibit symptoms similar to those of similar diseases as a model, and then examining their physical and physiological functions for recovery and abnormalities.
  • a bone marrow suppression model mouse was prepared by administering a 5-FU anticancer drug, and bone marrow cells and peripheral blood cells of a group in which the compound of the present invention was not administered to the mice and a group in which these mice were administered. It becomes clear by examining the number and physiological functions. Furthermore, when culturing and culturing hematopoietic undifferentiated cells including hematopoietic stem cells outside the body, mouse bone marrow cells were cultured using an incubator or the like, and the compound of the present invention was added at that time.
  • the cells after culture in the group and the group not added are transferred to a lethal irradiation mouse, and the degree of recovery is examined using the survival rate, blood cell count fluctuation, etc. as indicators. Can be done. Of course, these results can be extrapolated to humans, so that effective data can be obtained as an evaluation of the efficacy of the compound.
  • the compound of the present invention when used as a drug, it may be used for the treatment of diseases associated with cell differentiation abnormalities, such as leukemia and malignant tumors. Cell therapy to increase or maintain new functions while preserving the tissue, and treatment to regenerate the tissue without impairing its original function by administering it during regeneration after tissue damage Application is possible.
  • the dosage at that time depends on the form, etc., but it is better to physically administer from 10 g ZK g to 10 mg ZK g.
  • the method described in the Examples wherein the antibody is expressed as a chimeric protein with the Fc portion of human IgG and expressed as a disulfide-bonded multimer at the hinge portion of the antibody. Expression as a chimeric protein expressed at the N-terminus, and reaction of the expressed polypeptide containing the extracellular portion of the human serum with an antibody that specifically recognizes the C-terminal or N-terminal antibody recognition site.
  • a method for forming a multimer can be obtained.
  • a method of expressing a fusion protein with only the hinge region portion of the antibody to form a dimer by a disulfide bond, or any other effect on the activity of the human serum-2 High specific activity of at least dimers composed of fusion proteins designed to express the peptide at the C-terminus, N-terminus, or other site in a form that generates disulfide bonds in a manner that does not cause It is also possible to obtain the multimer type of human serum-2 having the following formula: Further, there is a method of arranging two or more polypeptides containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing in series by genetic engineering to express a multimeric structure.
  • the present invention relates to a compound containing a polypeptide containing an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing in a form having two or more breaks produced by a genetic engineering technique. Even this is included in the present invention.
  • a method of multimerization using a chemical crosslinking agent there is a method of multimerization using a chemical crosslinking agent.
  • N- (Ryoichi-midobutyryloxy) succinimide which cross-links with the thiol group of cystine residue, such as dimethylsulfate imidate dihydrochloride that cross-links lysine residue, amino and amino group
  • cystine residue such as dimethylsulfate imidate dihydrochloride that cross-links lysine residue, amino and amino group
  • a compound containing a polypeptide containing an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing in the form of a dimer or a multimer produced by a chemical crosslinking agent The present invention is also included in the present invention.
  • a ligand is added to a culture vessel by using an amino group or a carboxyl group of human serum 12, using an appropriate spacer, or using the above-mentioned crosslinking agent. Can be covalently bonded. Therefore, SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing having a form existing on the solid surface Polypeptides containing the amino acid sequence of the present invention are also included in the present invention.
  • one of the receptors for example, the fusion protein of the extracellular portion of human serotolyte 2 and human IgG Fc described above is used. If used, the expression of Notch receptor can be detected.
  • Notuts are known to be associated with certain types of leukemia (El) iseneta 1., Ce1166, 649-661, 1991), and therefore A polypeptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 in the Sequence Listing can be used as an in vitro or in vivo diagnostic agent.
  • An antibody that specifically recognizes the human serum-2 can be produced as described in Example 7.
  • PCR—MATE was used The carriers, solutions, and reagents on which the nucleotides and 3'-nucleotides were immobilized were used according to the manufacturer's instructions After completing the prescribed coupling reaction, trichloroacetic acid was used. The oligonucleotide carrier from which the protecting group at the 5 'end was removed was left in a concentrated ammonia solution at room temperature for 1 hour to release the oligonucleotide from the carrier. Anti-nucleic acid The solution was left in a sealed vial for more than 14 hours in a concentrated ammonia solution at 55 at 5.5.
  • oligonucleotide Purification of each of the oligonucleotides from which the carrier and the protecting group were released was performed by Abrad Biosystems. 0 Using a PC cartridge, detritylation was performed with 2% trifluoroacetic acid, and the purified primer was deionized water to a final concentration of 100 pmol / u]. The oligonucleotide was synthesized in the same manner as described below.
  • Amplification by PCR was performed as follows. Using a human fetal brain-derived cDNA mixed solution (QUICK-Clonec DNA, CLONTECH) 11, 10x buffer (500 mM KC and 100 mM Tris-HC) ( ⁇ ⁇ 8.3), 15 mM MgCl 2 , 0.01% gelatin) 5 ⁇ ], dNTP Mixture (Takara Shuzo) 4 ⁇ 1, a sense primer specific to the aforementioned homologue of DLTS 1 (100 pm o 1/1) 5 ⁇ 1 and antisense primer DLTA 2 (100 pm 0 1 /// 1) 51, and Taq DNA polymerase (Amp 1 i Taq: manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) , 5 ⁇ u 1) 0.21 and finally add deionized water to make a total volume of 50 ⁇ ], at 95 ° C for 45 seconds, at 42 ° C for 45 seconds, 7 A cycle consisting of 2 ° C for 2 minutes is defined as one cycle, and this cycle is repeated
  • the DNA-incorporated pCRII was introduced into E. coli OnShotCampetCentsCellsInvitrogen), and ampicillin (Sigma) containing 50 g / m1 was added.
  • B roth (Takara Shuzo Co., Ltd.) Seed on a semi-solid medium plate, leave at 37 for about 12 hours, randomly select colonies that have appeared, and L-Br 0th liquid containing the same concentration of ampicillin.
  • the pCRII in which the purified PCR product (about 500 bp) with the human serrate primer was incorporated was excised from the vector with EcoRI, and the DNA fragment was purified and recovered from the low melting point agarose gel. The obtained DNA fragment is used for DNA labeling dried m: Amersham). That is, to 25 ng of DNA, add 5 ⁇ 1 of a primer solution and deionized water to make the total volume 33 31, and perform a boiling water bath for 5 minutes.
  • Salmon sperm denatured by SPE solution 5-fold concentration of Denhardt's solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0.5% SDS (sodium dodecyl sulfate), and 10 gZm 1 boiling water bath
  • DNA (manufactured by Sigma) was immersed in a prehybridization solution, shaken at 65 ° C for 2 hours, and then subjected to prehybridization containing the 32 P-labeled probe by the method described above. It was immersed in a hybridization solution having the same composition as that of the hybridization solution, and shaken at 55 ° C for 16 hours to perform hybridization. Next, immerse the filter in SSPE solution containing 0.1% SDS, shake at 55 ° C, wash twice, and further dilute 10-fold SSPE containing 0.1% ⁇ 03. It was immersed in the solution and washed four times at 55 ° C. After the washing, the filter was subjected to autoradiography using an intensifying screen.
  • phage clones were isolated. According to the method of textbooks, clones fa temporary Te to base of these about 1 X 1 0 9 pfu were prepared, purified phage DN A, was digested with restriction enzymes E c 0 RI, similarly It was incorporated into pBluescript (manufactured by Stratagene) digested with EcoRI. The DNA sequences at both ends of these clones were analyzed using a DNA sequencer. Both clones S20 and S20 are clones containing the sequence from No.
  • the three gene fragments which were cloned as shown in Fig. 2, were used for the restriction enzyme Bgl2 site at position 123 and the Acc1 site at position 3943 in the DNA sequence of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
  • the plasmid containing the full-length DNA sequence of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing was connected between EcoRl and Xbal of the PUC18 multi-cloning site, and pUCSR-1 was Produced.
  • the sequence of this gene is shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing together with the amino acid sequence.
  • the gene probe used for screening that is, the gene described in SEQ ID NO: 8, 9, or 10 in the sequence listing was obtained as follows. These sequences correspond to a part of the gene sequences described in Genbank under accession numbers T088553, R50026, and R45751, respectively.
  • the probe having the gene sequence of SEQ ID NO: 8 is ⁇ 1
  • the probe having the gene sequence of SEQ ID NO: 9 is ⁇ 2
  • the probe having the gene sequence of SEQ ID NO: 10 is ⁇ 4. That is, the oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NOs: 13 and 14 in the sequence listing was obtained by PCR using the oligonucleotides having the sequences of SEQ ID NOs: 11 and 12 in the sequence listing by PCR.
  • the gene of SEQ ID NO: 9 was obtained by PCR using primers, and the gene of SEQ ID NO: 10 was obtained by PCR using oligonucleotides having the sequences of SEQ ID NOs: 5 and 16 in the Sequence Listing as primers. Each separated c
  • Human fetal brain-derived cDNA mixed solution (QUICK-Clonec DNA, manufactured by CLONTECHiJ: 1) uses 1 and 10X buffer (500 mM KC1, 100 mM Tris-HC) 1 (pH 8.3), 15 mM MgC1, 0.01% gelatin) 51, d NTPM ixture (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) 4-1, the combination of the above primers 20 pmo1 11 1 and Ta qDNA polymerase (Amp 1 i Taq: 5 UZ 1, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) 0.2 ⁇ 1 is added, and finally, deionized water is added to make the total volume 501, so that 94 1 minute, 55 ° C for 5 minutes, 72 ° C for 3 minutes as one cycle, 40 cycles of this process Was done.
  • QUICK-Clonec DNA Human fetal brain-derived cDNA mixed solution
  • 10X buffer 500 mM KC1, 100 mM Tris
  • LCR containing 50 g / m1 of ampicillin was introduced by gene transfer of pCRII with the DNA incorporated into Escherichia coli OnShotCompetentCel] s (manufactured by Invitrogen ntt).
  • -B roth Seed on a semi-solid medium plate, leave at 37 for about 12 hours, randomly select colonies that have appeared, and L-B roth liquid containing the same concentration of ampicillin. Inoculate in 2 ml of culture medium, shake culture at 37 ° C for about 18 hours, collect the cells, and use Wizard Mini Prep (manufactured by Promega) according to the instructions attached to the medium.
  • the isolated phage clones were 2 clones when using ⁇ 1 as a probe, 6 clones when using ⁇ 2 as a probe, and 4 clones when using ⁇ 4 as a probe. However, all clones isolated from ⁇ 4 were included in clones isolated from ⁇ .
  • the phages all these clones about 1 1 0 9 pfu was prepared and purified file temporary DNA in accordance with the attached instructions using Uiza one gong ⁇ Dapureppu (P r manufactured by 0 mega Corporation), restriction enzymes E
  • the resultant was digested with coRI and incorporated into pB1 ⁇ escript (manufactured by Stratagene) or pUC18 (manufactured by Pharmacia) similarly digested with Ec0RI.
  • the entire DNA sequence of these clones was determined by the DNA sequencer in the same manner as in Reference Example 2, and the same sequence was compared.
  • the # 5 clone was identified as having the DNA sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the # 21 clone is a clone containing the sequence from No. 18 to No. 2 of the DNA sequence of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • the # 86 clone was a clone containing the sequence from No. 2455 to No. 3955 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • the remaining clones were clones that had only a short insert consisting of only those parts whose sequences matched those clones. As a result, comparison with amino acid sequences such as human cerate-1 revealed that a region coding for the amino acid sequence at the N-terminus could not be cloned.
  • a probe having the DNA sequence of SEQ ID NO: 17 in the sequence listing was further prepared, and a second screening was performed to 'clone' the cDNA of the 5 'region.
  • the probe was prepared in the same manner as described in Example 1, by performing PCR on the above # 5 clone using the PCR primers having the DNA sequences of SEQ ID NOS: 18 and 19 in the Sequence Listing and performing PCR. .
  • the library 1 was prepared in the same manner as in the first screening, and the conditions were used in exactly the same manner.
  • the clone isolated in the second screening was 6 clones.
  • Phage of all of these clones about 1 X 1 0 9 pfu was prepared, with the attached instructions using a Wizard lambda prep (P r om ega Co.) Therefore, the phage DNA was purified, digested with the restriction enzyme EcoRI, and incorporated into pUC18 similarly digested with EcoRI. The entire DNA sequence of these clones was determined by DNA sequencer in the same manner as in Reference Example 2, and the same sequence was compared. As a result, clone S43-1 was considered to contain the most 5 'orientation. Was separated. However, this clone was a clone containing the sequence from No. 38 to No. 1538 of the DNA sequence of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • the remaining clones were clones that had been isolated in the first round and clones that had only a short insulator consisting of only the part that matched the sequence already determined in the other clones.
  • no ATG sequence encoding methionine for translation initiation was found in the second screening, and the cDNA sequence in the 5 ′ direction was further cloned by the 5 ′ RACE method.
  • Ning. 5 'RAC E was obtained from human heart-derived Po1yA + RNA (CLONTE CH) using the 5' RACE system kit according to the attached manual using the 5 'RACE system kit. 'Cloning of the cDNA of the gene in the direction' was performed, and the gene sequences Nos. 1 to 37 of the DNA sequence of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing were determined.
  • the DNA sequence of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing that is, the cDNA sequence encoding the full length of human serum-2 was determined.
  • the following PCR was performed and cloned to obtain a 5'-end cDNA which could be ligated with other clones. That is, using the oligonucleotide having the DNA sequence of SEQ ID NO: 20 and the oligonucleotide having the DNA sequence of SEQ ID NO: 21 in the sequence listing, the S431 clone was type III, and the method described in Example 1 was used.
  • the DNA was labeled with 32 P using the above-mentioned DNA labeling kit (Mega Prime DNA labelingstem: Amersham) in the manner described above, Hybridization was performed according to the instruction manual to examine the expression.
  • the length of the expressed mRNA was only about 5 kb.
  • strong expression was observed in the heart, skeletal muscle, thyroid gland, spinal cord, and trachea. Very weak expression was observed in the brain, placenta, kidney, thymus, ovary, stomach, and lymph nodes, and no expression was observed in the lung, liver, spleen, and colon And peripheral blood lymphocytes and bone marrow.
  • human fetal tissues the expression was high in fetal lung, and clear expression was observed in the brain of the fl child and kidney of the baby, but no expression was observed in the fetal liver.
  • a cDNA encoding polypeptides 1 to 105 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing was expressed using the promoter of the SR strain and the neomycin resistance gene.
  • the expression vector was constructed by connecting to Beck Yuichi pMK I TN e 0 (Maruyama et al., 9). That is, the oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 23 in the sequence listing and the sequence of SEQ ID NO: 2 having the DNA sequence described in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing as p-type UCS-2.
  • PCR is performed using the oligonucleotide as a primer according to the above method, the PCR product is ligated to the closing vector pCR1I, the gene sequence of the PCR product is determined, and the DNA sequence of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing is determined.
  • a DNA was prepared in which a stop codon and a restriction enzyme Sal1 site were added to the 3 'end of the gene sequence from No. 296 to No. 3254.
  • the cDNA encoding the protein was ligated to the expression vector pMKITN e0 to prepare an expression vector. That is, an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 23 and an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 25 in the sequence ⁇ with the vector pUCSR-2 having the DNA sequence described in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing as a type II.
  • PCR is performed as a primer according to the above method, the PCR product is ligated to the closing vector pCRII, the gene sequence of the PCR product is determined, and the DNA sequence of SEQ ID NO: 4
  • the gene sequence from 986 to 3254, the DNA sequence encoding the FLA sequence at its 3 'end (the DNA sequence of SEQ ID NO: 22 in the sequence listing), the termination codon and the restriction enzyme Sa1 DNA to which DNA was added was prepared.
  • SEQ ID NO: 4 contains the gene fragment from No. 1 to No. 3254 of the DNA sequence and the gene fragment encoding the FLAG sequence.
  • An expression vector including the FLAG chimeric protein of secreted extracellular human serum 1-2 (hereinafter referred to as EXS 2 FLAG) expression vector pME XS 2 FLAG was prepared.
  • a cDNA encoding the amino acid sequence of the Fc portion below the hinge portion of human 1 gG1 was added to the C-terminal of the polypeptides Nos. 1 to 1055 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 of SEQ ID NO: 2.
  • the cDNA encoding the obtained chimeric protein was ligated to an expression vector, Yuichiichi pM K] TNeo, to prepare an expression vector.
  • Fusion with immunoglobulin Fc protein was prepared by the method of Zett 1 meiss 1 et al. (Zettl me issleta, DNA cell Biol., 9, 34 7-35 4, 199 0 According to), a gene using a genomic DNA containing an intron was used, and the gene was prepared by the PCR method. That is, using human genomic DNA as a template, the gene sequence encoding the human IgGI Fc portion was transformed with the sequence having SEQ ID NO: 28 in the sequence listing with the restriction enzyme BamHI site.
  • PCR was performed using an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 29 in the Sequence Listing as a primer for the nucleotide and restriction enzyme XbaI site, and a band of approximately 4 Kbp was purified.
  • restriction enzymes BamHI and XbaI manufactured by Takara Shuzo
  • the gene was ligated to pB1uescript treated with the same restriction enzymes using T4 DNA ligase and subcloned. After that, the plasmid DNA was purified and sequenced to confirm the gene sequence. It was confirmed that the gene sequence was indeed the genome DNA corresponding to the hinge portion of the human 1 gG1 heavy chain.
  • pBShIgFc An oligonucleotide having a sequence of SEQ ID NO: 23 and an oligonucleotide having a sequence of SEQ ID NO: 26 in a vector pUCSR-2 having a DNA sequence described in SEQ ID NO: 4 of Sequence Listing are shown as a type.
  • a DNA was prepared from the gene sequence from No. 86 to No. 324 to which a restriction enzyme Bgl2 site was added at the 3 ′ end.
  • Approximately 250 bp gene fragment obtained by digesting the pCR vector containing this PCR product as an insulator with the restriction enzymes Ec0RI and Bgl2 encodes the above human 1 gG1FC.
  • PB1uescript containing the gene to be inserted as an insert is ligated to a vector (about 4.3 kbp) digested with restriction enzymes EcoRI and BamHl.
  • the restriction enzymes BamH1 and Bgl2 can be connected because the digested terminal sequence is complementary. This part is not subsequently digested by these restriction enzymes.
  • this vector is digested with restriction enzymes BamHI and Not1, and a 1.5 kbp gene fragment, pUCSR-2, is digested with restriction enzymes EcoRI and BamHI.
  • CDNA was ligated to the expression vector pMKITNeo to prepare an expression vector.
  • a vector having the DNA sequence described in SEQ ID NO: 4 of the Sequence Listing—an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 23 and an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 27 in the Sequence Listing with p UCS-12 as a type II PCR is performed as a primer according to the above method, the PCR product is ligated to the ⁇ -cleaning vector pCRII, the gene sequence of the PCR product is determined, and the nucleotide sequence of the DNA sequence of SEQ ID NO: 4 is determined.
  • the gene sequence from No. 6 to No. 37 25, a DNA sequence encoding the FLAG sequence (the DNA sequence of SEQ ID NO: 22 in the sequence listing), a stop codon and a restriction enzyme Sal1 site are added at the 3 'end. Was prepared.
  • SEQ ID NO: 4 in the sequence listing is the gene fragment from 1 to 3725 of the DNA sequence and the gene encoding the FLAG sequence Expression vector containing the fragment, that is, FLAG chimeric protein of full-length human serum 2
  • the expression vector prepared in Example 4 was transfected into COS-7 cells (available from RIKEN, Cell Development Bank, RCB 0 539).
  • the cells were cultured in a D-MEM (Dulbecco's modified MEM medium, G1BJ0-813 ⁇ 4) 10% FCS before gene transfer.
  • the medium was changed fine fl before opening transgenic, and cultured overnight in a cell number in 5 X 1 0 7 ce 1 1 s / m 1.
  • the cells were prepared as follows. Gene transfer was carried out by an electroporation method using a gene transfer device Gene Pulser manufactured by Bi0-Rad.
  • the above cell suspension was placed in a 500-1 electroporation cell (0.4 mm), added with 20 ⁇ g of the expression vector, and left on ice for 5 minutes. Thereafter, a voltage was applied twice under the conditions of 3 ° F and 450 V, and the two times were left at room temperature for 1 minute. Thereafter, the cells were allowed to stand in ice for 5 minutes, and then the cells were seeded in a cell culture dish having a diameter of 10 cm in which 10 ml of the above medium had been previously dispensed, and cultured in a 5% carbon dioxide incubator.
  • the culture supernatant was removed, and the cells attached to the dish were washed twice with 10 ml of PBS (-), 10 ml of serum-free D-MEM was added, and the cells were further cultured for 4 days.
  • PBS PMEXS 2 FLAG and pMEXS 2 Fc were introduced into the expression vector.
  • the culture supernatant was collected, and the buffer was washed with PBS (-) using Centricon 30 (manufactured by Rykon). And 10-fold concentration.
  • the cells are similarly cultured for 4 days, and then the cells are purified with 10 ml of PBS (-), and the cells are scraped with a cell scraper (Coase Yuichisha). The cells were peeled off, and 1 Oml of PBS (-) was added again, followed by centrifugation at 1500 rpm for 5 minutes for washing.
  • the cell sediment was washed with cell lysis buffer [5 OmM Hepes (pH 7.5), 1% Triton X 100, 10% glycerol, 4 mM EDTA, 50 g / m 1 Ap rotinin, 100 ML eupepti ru 25 uM Pepstatin A, 1 mM PMS F] Suspend in 500 / ⁇ 1, leave on ice for 20 minutes, then 20 minutes at 1500 rpm After centrifugation, the supernatant was removed to obtain a cell extract. Using the samples thus obtained, expression of the FLAG chimeric protein and the immunoglobulin chimeric protein was confirmed by the mouse blotting method.
  • cell lysis buffer 5 OmM Hepes (pH 7.5), 1% Triton X 100, 10% glycerol, 4 mM EDTA, 50 g / m 1 Ap rotinin, 100 ML eupepti ru 25 uM Pepstatin A, 1 mM
  • the obtained cell supernatant concentrate or cell extract was subjected to an electrophoresis tank for SDS-PAGE and a polyacrylamide gel for SDS-PAGE (Glue Ladent Gel 5 to 1) manufactured by ACI Japan. 5%) and SDS-PAGE was performed according to the attached instruction manual.
  • Samples were prepared by adding 2-mercaptoethanol (2-ME) and reducing by heating in a boiling water bath for 5 minutes, or in a non-reducing state without this treatment.
  • the sample buffer and the electrophoresis buffer were prepared according to the attached instruction manual using Reimboam Ichiichi (for high molecular weight) manufactured by am.
  • the acrylic amide gel is applied to a BioFad membrane filter (BioRad).
  • the transfer was performed using a mini-trans-blot cell manufactured by FUJIFILM Corporation.
  • the filter prepared as above was added to Block Ace, TBS—T [20 mM Tris, 1337 mM NaC 1 (pH 7.6), 0.1% Tween 20].
  • Blocking was performed by shaking at ° C.
  • the mouse monoclonal antibody Anti-FLAG M2 Koda And peroxidase-labeled anti-mouse Ig sheep antibody (Amersham) as a secondary antibody.
  • the sugar chain was added to the sugar chain by about 40 Kg larger than the molecular weight expected from the amino acid sequence. Further, a band having a fraction of about 150 K daltons under reducing conditions was detected by Anti-FLAG M2 antibody from the COS cell extract into which the expression vector pMFS2FLAG was introduced. Producing the target protein FS2FLAG was confirmed, and cells transformed with the expression vector pMFS2FLAG were obtained. Similarly, the molecular weight was about 20 K daltons larger than the molecular weight expected from the amino acid sequence, indicating that a sugar chain was added to the extracellular portion.
  • the anti-histoserate-2 mouse monoclonal antibody and the anti-histoserate-2 heron polyclonal antibody described in Example 7 were used as the primary antibodies for the western blotting.
  • a secondary antibody 1 g of a peroxidase-zeoanti mouse anti-mouse antibody (manufactured by Amersham) or a peroxidase-labeled squirrel Ig Ig antibody (manufactured by Amersham) was used as the secondary antibody.
  • the molecular weight was about 20 K daltons larger than the molecular weight expected from the amino acid sequence, and it was considered that a sugar chain was added to the extracellular portion.
  • crushed cells and culture medium of COS-7 cells transfected with pMKITNeo vector were similarly tested, but anti-FLAG antibody and anti-human Ig antibody were tested. However, no band that reacts with the anti-human cell two-tower pile was detected.
  • ⁇ For XS 2 FLAG, pass 2 liter culture supernatant obtained by the method described in Example 5 through a column filled with Anti-FLAG M 2 Affinity Gel (manufactured by Kodak). Thus, the chimeric protein ⁇ was adsorbed to the column by the affinity of the FLAG sequence possessed by the chimeric protein and the An ⁇ i-FLAG antibody of the gel.
  • the column was a 1 Omm inner diameter disposable column (manufactured by Biorad) and the gel was filled with 5 ml.
  • a recirculation circuit consisting of a culture bottle ⁇ a column ⁇ a perister pump-a culture bottle was assembled and circulated at a flow rate of 1 m 1 Z for 72 hours.
  • EXS 2 FLAG purified by the method described in Example 6 was used as an immunogen to immunize rabbits, and after measuring the antibody titer, whole blood was collected, serum was collected, and BioRad Using the Econopack serum IgG purification kit, an anti-histocellate-2 ⁇ sagi polyclonal antibody was purified and prepared according to the attached instruction manual.
  • a mouse monoclonal antibody was prepared using EXS 2 FLAG purified by the method described in Example 6 as an immunogen according to the method described in the written document. That is, the HSFLAG purified as described above was immunized subcutaneously and intradermally with 10 g / mouse of a Ba1b / c mouse (manufactured by Nippon SLC). After the second immunization, blood was collected from the fundus and an increase in the antibody titer in the serum was observed.After the third immunization, the spleen cells of the mouse were removed, and the mouse myeloma cell line P 3 X 63 Ag 8 ( Cell fusion was performed using ATCC TIB 9) and the polyethylene glycol method.
  • Hybridomas were selected in a HAT medium (manufactured by Kuchimoto Immune Biological Laboratory), and a hybridoma strain producing an antibody recognizing the extracellular portion of human cerate in the medium was isolated by enzyme-linked immunosorbent assay. , Hitsele A hybridoma-producing strain that produces a mouse monoclonal antibody that specifically recognizes a protein was established. The culture supernatant of the hybridoma established in this manner was subjected to Falmacia's MabTrap G1I ffl, and an anti-human serum-12 mouse monoclonal antibody was purified according to the attached instruction manual. Purified and prepared.
  • an affinity column was prepared.
  • the affinity one column was prepared using Pharmacia's CNBr-activated Separose 4B according to the attached instruction manual. The force-pulling efficiency was 99.6%.
  • a column having a size of 2 cm x 1 cm was prepared from 2 ml of the gel.
  • a cell culture supernatant containing EXS 2 was prepared for this column by the method described in Example 5, and the concentrated solution was flowed at a rate of 2 Om 1 Zhr, and then PBS (-) was added at the same rate for 15 times. The mixture was washed by washing with m1 and finally eluted with 0.1 M sodium acetate and 0.5 M NaC1 (PH 4.0). Aliquot this eluate by 1 ml and add 1 M to each fraction.
  • Tris-HC1 (pH 9.5) was added by 2001 to neutralize.
  • Example 8 the purified protein was subjected to SDS-PAGE under reducing conditions, silver staining and Western blotting were performed to estimate molecules. As a result, a band of about 140 kDalton was detected. Therefore, the monoclonal antibody can be used for waste blotting, and the affinity column can be used to purify human citrate-12.
  • Example 8 the monoclonal antibody can be used for waste blotting, and the affinity column can be used to purify human citrate-12.
  • CD34-positive cells were cultured in a serum-free semi-solid medium in the presence of EXS2FC and existing cytochromes to form colonies. The increase or decrease of cells was observed.
  • Human cord blood or human normal bone marrow blood CD34 positive cells are cord blood or adult Normal bone marrow blood is treated with silica solution (manufactured by IH Immune Institute for Immunology) according to the attached instructions, and then low-density cell fraction (specific gravity centrifugation using Ficoll Pack (manufactured by Pharmacia, Sweden)). Comb 077 g / m 1) was separated from the fractionated mononuclear cells.
  • CD34 positive cells were separated using Dynabeads-450CD34 and DETACHABEADSCD34, manufactured by Dyna 1 of Norway, in accordance with the attached instruction manual. After separation, the purity was stained with FITC-labeled anti-CD34 antibody HPCA2 (Becton Ducktonson, USA), and assayed using the company's flow cytometer (FAC SC alibur). It was used after confirming that it had the above purity.
  • the CD3-positive cells separated in the same manner as above or 400 cells or uniformly suspended so as to be present in 1 ml of the following medium, spread on a 35-mn dish (Falcon Tsuji, USA), ° C ⁇ 5% CO2, 5% Oxygen, 90% Nitrogen, 100% Humidity in a CO2 incubator in a CO2 incubator for 2 weeks and then measuring the formed blood cell colonies with an inverted microscope did.
  • the medium used for the culture was 2% Deionized Bovine Serum Albumin (BSA, manufactured by Sigma, USA) in Hiichi medi urn (manufactured by G.BC.
  • the site force conditions were as follows: lOOng gZm l-Heat SCF, lOngGZml-Hit IL-3, 100 11 £ / 111 1 Ht 1 _6, 2 U / m 1 E po (Manufactured by Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. in Japan) and 10 ng gZm 1 human G—CSF (manufactured by Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. in Japan).
  • the results are shown in the first section.
  • cord blood CD34-positive cells were subjected to liquid culture in blood-free medium for 2 weeks in the presence of EXS 2 Fc and existing cytotoxicity. Changes in LTC-IC, which is considered to be the most undifferentiated blood cell group, were observed.
  • Cord blood mononuclear cell CD34 positive cells isolated by the method described in Example 8 were From 2000 to 20000 cells were cultured in the following medium for 2 weeks, and the difference in the number of LTC-ICs in the three experimental plots: the pre-culture plot, the EXS 2 Fc-presence plot, and the comparison plot was examined .
  • the medium used for the liquid culture was 2% BSA, 10 g Zm 1 human insulin, 200 g ⁇ 1 transfuninline, 40 g Zm 1 low-density lipop Medium supplemented with 0 — 5 M2—mercaptoethanol and 100 ng / ml 1 human SCF, 100 ng / ml human IL-3, 100 ng / ml human IL-6 EXS 2 Fc was added thereto at 1 ⁇ g / m 1, and the same concentration of the above-mentioned human 1 g G 1 was added to the control.
  • the bone marrow mononuclear cells not treated with the silylation solution obtained in Example 8 were treated with 1 to 210 7 cells of 1 M hydrocortisone (manufactured by Nippon Apsion Co., Ltd., Japan) in an LTC medium ( My e 10 Cu 1 t, 5 ml T-Cell flask (manufactured by Falcon, USA) at 37 ° C, 5% CO 2, 1 ml in 5 ml T Cell Cell Techno ogies, Canada Culture in a CO 2 incubator under a 0% humidity atmosphere until the stromal cell formation as the adherent cell layer reaches 80% or more of the bottom area, and then trypsin EDTA solution (Cosmo Bio Japan) ).
  • 1 M hydrocortisone manufactured by Nippon Apsion Co., Ltd., Japan
  • LTC medium My e 10 Cu 1 t, 5 ml T-Cell flask (manufactured by Falcon, USA) at 37 ° C, 5% CO 2,
  • co-culture was performed at 16 ml for one dilution step.
  • the culture medium was the medium used to form the stoma, and the culture was performed for 5 weeks in a CO2 incubator under the conditions of 37%, 5% CO2, 100% humidity and ambient atmosphere. . After culturing, the cells were collected in both 1-well and floating cells and adherent cells, and a-medi un ⁇ O.
  • the vascular endothelial cells are composed of normal human aortic vascular endothelial cells manufactured by Kurabo Industries, Japan and normal humans. Fourth subcultured cells of each of the pulmonary artery vascular endothelial cells were used. Cells were seeded at the time of tertiary culture on a 96-well plate for tissue culture (manufactured by Falcon, USA) at a number of 500 cells per well.
  • the vascular endothelial cell count was determined by the method developed by Borenfreund and Puerner (Journa 1 of T issue Culture Methods 9 (1), 7-1 9, 198 4), namely the neutra Neural red based on the fact that 1 red (3-am i ⁇ ⁇ -7-dimethy 1 am i ⁇ ⁇ -2 -methylphenazinehydrochloride) is accumulated only in living cells through the plasma membrane and into the lithosome.
  • the absorbance at 540 nm was measured using an NR reagent set (NJ-2000) manufactured by Nippon Internet Japan Co., Ltd., using an NR reagent set manufactured by CRAVO CORPORATION based on the principle of the method.
  • the human serum-2 of the present invention has a function ffl for controlling the differentiation of undifferentiated cells, and can be used as a new cell differentiation regulator.
  • Organism name human
  • Organism name human
  • OZZ S 012 usv s o io "10 s q sAo [ ⁇ 3 ⁇ 41V nio sAq S 3 nio ⁇ Aq [o dj ⁇
  • H SAQ ⁇ is sAq S I dj ⁇ AIQ dsy dsy SAQ B (V
  • OJd dsy OJd ⁇ 9 ⁇ s people 3 dsy usv OJJ usy ⁇ dsy SAQ naq nio n
  • Organism name human
  • Val Asp Glu lie Asn Gly Tyr Arg Cys Ser Cys Pro Pro Gly Arg Ala
  • I9i IVV 101 900 WO VV 101 010 13D VVO OVV 301 OVO 9VV 390 01V 091
  • GAGTGTGCAC CTGGCTTCGC GGGGCCTGAC TGCCGCATCA ACATCGACGA GTGCCAGTCC 60 TCGCCCTGTG CCTACGGGGC CACGTGTGTG GATGAGATCA ACGGGTATCG CTCTAGCTGC 120 CCACCCGCCC GAGCCGGCCC CCGGTCCCAG GAACTGATCG GGTTCGGGAG ATCCTGCTGG 180 sequence
  • GCATCAACTG CCATATCAAC
  • GGCCGGCATT 120 GCGAGCTGGA
  • GCCCCTGCCA CAGCGGCT CTCGCC CGTC GCTCCGCT CGCT CGCT

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Description

明細書 分化抑制剤 発明の (gする技術分野
本発明は、 未分化钿 の分化を抑制するための新規生理活性物質に関するもの である。 従来の技術
ヒ 卜の血液、 リ ンパ液中には多種類の細胞かあり、 それぞれか重要な役割を担 つている。 例えば、 赤血球は体内での酸素運搬を、 血小板は止血作用を、 白血球 ゃリ ンパ球は感染を防御している。 これらの多様な細胞は骨髄中の造血幹細胞に 由来する。 造血幹細胞は体内の種々のサイ 卜力インや環境要因によって刺激され て、 各種血液細胞、 破骨細胞、 肥満細胞などに分化することが近年明らかにされ てきた。 このサイ ト力インとして、 赤血球への分化についてはエリスロポエチン (E PO) 、 白血球への分化については顆粒球コロニー刺激因子 （G - C S F) か、 血小板産生細胞である巨核球への分化については血小板増殖因子 （mp 1 リ ガン ド） か発見されて、 fjii者 2つは現在すでに臨床応用がなされている。 血液未分化細胞に関して、 特定の血液系列に分化することが運命づけられた血 液前駆細胞とすべての系列への分化能と自己複製能を有する造血幹細胞に概念的 に分類されている。 血液前駆細胞に関してコロニーアツセィによって同定が可能 であるが、 造血幹細胞の同定方法は確立されていない。 これらの細胞に関して、 ステ厶セルファ クタ一 （SC F) やインタ一ロイキン 3 ( I L - 3 ) 、 顆粒球単 球コロニー刺激因子 （GM—C S F) 、 イン夕一ロイキン 6 ( I L— 6) 、 イン 夕一ロイキン 1 ( I L一 1 ) 、 顆粒球コロニー刺激因子 （G— CSF) 、 オンコ ス夕チン Mなどが細胞の分化増殖を促すことが報告されている。 骨髄移植療法に代替される造血幹細胞移植療法や遺伝子治療への応用のため、 造血幹細胞を体外で増幅することが検討されている。 しかし、 この細胞を 1:記の ようなサイ トカインを用いて体外で増殖培養させると、 造血幹細胞が本来存じて いる多分化能および自己複製能が徐々に失われ、 5週間培養後には特定の系列に のみ分化する血液前駆細胞へと変化し、 造血幹紬胞の特徴の一つである多分化能 が失われることが報告されている （R i c e e t a 1. , B l o o d 8 6 , 5 1 2 - 5 2 3, 1 9 9 5) 。 血液前駆細胞の増殖には単独のサイ 卜カインのみでは効果が十分でなく、 複数 のサイ トカインの共同作用 （シナジー） か重要であることが明らかになつている c 二のことから造血幹細胞の特徴を維持したまま増殖させるためには、 血液未分化 細胞を増殖、 分化させるサイ トカインと共に分化を抑制するサイ ト力ィンか必要 であると考えられている。 しかし、 -般に紬胞の增殖や分化を促進するサイ ト力 インが多数 IIいだされているのに対して、 細胞の分化を抑制するサイ トカインは 少数しか見いだされていない。 例えば、 白血病細胞阻害因子 （L I F) はマウス 胚幹細胞を分化させずに増殖させる作用が報告されているか、 造血幹紬胞ゃ血液 前駆細胞に対し、 そのような作用は有していない。 また、 腫瘍細胞増殖因了- (T G F- β) は多様な細胞に対して増殖抑制の作用をするか、 造血幹紬胞や血液前 駆細胞に対する作用は一定の見解が得られていない。 血液細胞のみならず、 未分化細胞、 特に幹細胞に関しては組織再生に強く関与 すると考えられている。 これらの組織再生、 並びに各組織の未分化紬胞を増幅さ せることは成書 （吉里勝利著 再生一甦るしくみ、 1 9 9 6、 羊土社） を参考に することからその幅広い用途を知ることができる。
ノ ッチ （No t c h) はショウジヨウバエで発見された神経細胞の分化制御に 関わるリセプ夕一型膜蛋白質であり、 ノ ツチのホモログは線虫 （L i n— 1 2) 、 アフ リカッ ガエル （ X 0 t c h ) 、 マウス （M 0 t c h ) 、 ヒ ト （TAN— 1 ) などの無脊椎動物、 脊椎動物の分類を越えた広い動物種から見いだされてい る。 一方、 ショウジヨウバエノッチのリガン ドとしてショウジヨウバエデル夕 （D e 1 t a ) およびショウジ yゥバエセレイ ト （S e r r a t e) の 2つが見いださ れており、 リセプ夕一のノ ッチと同様に広い動物種からノッチリガン ドホモログ が見いだされている （A r t a v a n i s— T s a k o n a s e t a 1. , S c i e n c e 2 6 8, 2 2 5 - 2 3 2, 1 9 9 5) 。 特にヒ トに関して、 ヒ トノッチホモログである TAN— 1は、 幅広く体中の組 織に発現されており （E l l i s e n e t a 1. , C e 1 1 6 6, 6 4 9 - 6 6 1 , 1 9 9 1 ) 、 また TAN— 1以外に 2つのノ ツチ類縁分子が存在する ことが報告されている （A r t a v a n i s— T s a k o n a s e t a 1. , S c i e n c e 2 6 8， 2 2 5 - 2 3 2, 1 9 9 5 ) 。 血液細胞においては PCR (P o l ym e r a s e C h a i n R e a c t i o n ) 法にて C D 3 4陽性細胞に TAN- 1の発現が認められている （M i l n e r e t a 1. , B l o o d 8 3, 2 0 5 7 - 2 0 6 2, 1 9 9 4 ) 。 しかしながら、 ヒ トに 関して、 ノ ッチのリガン ドと考えられるヒ トデル夕、 ヒ トセレイ トの遺伝子のク ローニングの報告はない。 ショウジヨウバエノ ツチについて、 そのリガンドとの結合性が詳細に調べられ 、 ノ ッチの細胞外部分に 3 6ある E p i d e rma l G r ow t h F a c t o r (E G F) 様操り返しアミノ酸配列のうち 1 1番目と 1 2番目の繰り返し配 列を結合領域として、 リガンドと C a+ +を介して結合し得ることが示された （文 献の F e h o n e t a 1. , C e l l 6 1 , 5 2 3— 5 3 4, 1 9 9 0お よび R e b a y e t a 1. , C e l l 6 7， 6 8 7— 6 9 9, 1 9 9 1お よび特表平 7 - 5 0 3 1 2 3号公報） 。 他種のノ ツチホモログについても E G F 繰り返し配列は保存されており、 リガンドとの結合に関して同様の機構が類推さ れている。 リガン ドにおいても、 ァミノ酸末端の近くに DS L (D e l t a— S e r r a t e - L a g - 2 ) と呼ばれるァミ ノ酸配列とリセプ夕一と同様に E G F様繰り 返し配列が保存されている （A r t a v a n i s - T s a k o n a s e t a 1. . S c i e n c e 2 6 8, 2 2 5 - 2 3 2, 1 9 9 5 ) 。 EG F様配列は トロンポ'モジュ リ ン （J a c kma n e t a l . , P r o c. Na t l . A c a d. S c i . USA 8 3, 8 8 3 4 - 8 8 3 8, 1 9 8 6 ) や低密度リポ 蛋白質 ( L D L) リセプ夕一 （R u s s e l l e t a 1. , C e l l 3 7 ， 5 7 7 - 5 8 5. 1 9 8 4 ) および血液凝固因子 （F u r i e e t a 1. , C e l l 5 3, 5 0 5 - 5 1 8, 1 9 8 9 ) で見いだされ、 細胞外での凝集 や接着に重要な役割を果たすと考えられている。 ショウジヨウバエデル夕の脊椎動物のホモログはニヮ トリ （ C—デル夕— 1 ) とァっリカツメガエル （X—デルター 1 ) か見いだされており、 X—デルター 1 は原始ニューロンの発生に X 0 t c hを介して作用することが報告されている （ H e n r i q u e e t a 】 . ， Na t u r e 3 7 5, 7 8 7 - 7 9 0, 1 9 9 5および Ch i t n i s e t a 1. , Na t u r e 3 7 5, 7 6 1 - 7 6 6, 1 9 9 5 ) o 一方、 ショウジョゥバエセレィ トの脊椎動物のホモログ'はラッ 卜ジャグド （ J a g g e d) が見いだされている （C l a i r e e t a l . , C e l 】 8 0 , 9 0 9 - 9 1 7, 1 9 9 5 ) 。 この報告によれば、 ラッ トジャグ 'ドの mRN Aは胎仔ラッ 卜の脊髄に検出される。 またラッ トノッチを強制的に過剰発現させ た筋芽細胞株とラッ トジャグ'ド発現細胞株の共培養により、 この筋芽細胞株の分 化が抑制されることが見いだされているか、 ラッ トノ ツチを強制発現させていな い筋芽細胞株に対してはラッ トジャグ'ドが作用しないことが見いだされている。 これらの報告から、 ノ ツチおよびそれに対するリガンドは神経細胞の分化制御 に関係していると考えられているか、 一部筋芽細胞を除き、 血液細胞を含む他の 細胞、 特にプライマリ—な細胞への作 fflに関しては全く不明であった。 発明が解決しょうとする課題
上記のように未分化細胞に関して、 それらの特徴を保ったまま増殖させる方法 は完成されていない。 この最大の原因は未分化細胞の分化を抑制する因子が十分 に見いだされていないことにある。 本発明の課題は、 未分化細胞の分化を抑制す る新規な因子に由来する化合物を提供することにある。 課題を解決するための手段
本発明者らはノッチおよびそのリガン ドが神経細胞の分化制御のみならず、 広 く未分化な細胞の分化制御を行なうとの仮説を立てた。 しかしヒ 卜へ臨床応用す る際、 既知のニヮ トリ型、 ァフリ力ッメガエル型などの異種の生物種のノ ッチリ ガン ドでは種特異性、 抗原性の問題がある。 このため未だ報告のないヒ ト型のノ ッチリガン ドを取得することは不可欠である。 ヒ ト型ノ ツチ （T A N— 1 ) の推 定上のリガン ドであるヒ トデルタホモログ （以下ヒ トデルタと呼称する） 及びヒ トセレイ トホモログ' （以下ヒ トセレイ 卜と呼称する） か存在し、 これらの発見は 未分化細胞の分化制御に有効な医薬品の候補となると本発明者らは考えその発見 に努めた。 本発明者らはヒ トノ ッチリガン ドの探索のため、 ヒ 卜以外の動物で発見されて いるこれらのホモログの保存されたァミノ酸配列を解析し、 対応する D N A配列 の混合プライマ一による P C Rによってこの遺伝子を発見すべく進めた。 そして 、 鋭意研究の結果、 新規ヒ 卜デルタ、 ヒ トセレイ トのアミノ酸配列をコードする c D N Aの単離に成功し、 この c D N Aを用いて蛋白質の発現系を作製し、 タン パクを精製し、 生理活性を見いだし、 既に特許出願を行った （国際公開番号 W O 9 7 Z 1 9 1 7 2 ) 。 更に、 本発明者らは脊椎動物においては前記の特許出願のヒ トデル夕、 ヒ トセ レイ ト （以下各々 ヒ トデルター 1、 ヒ トセレイ 卜— 1 と呼称する） 以外にショゥ ジヨウバエデルタ、 セレイ ト類似分子があると考え、 その発見に努めた。 その方法として、 本発明者らは遺伝子配列のデーターベース上を検索する手法 を用いた。 すなわち、 本発明者らが初めて見いだしたヒ トセレイ ト一 1の遺伝子 配列 （配列表の配列番号 5にアミ ノ酸配列と共に示す） を基に、 遺伝子配列デー 夕一べ一ス G e n b a n kのランダムなヒ ト c DN A配列の遺伝子断片のデータ —ベースである E ST (.E x p r e s s e d S e q u e n c e T a g) を遺 伝子配列検索ソフ トウエア G e n e t y x/CD (ソフ 卜ウェア開発社製） を用 いてホモロジ一の高い遺伝子断片 （ 2 0 0から 3 5 0 b程度の長さ） を複数個見 いだした。 これらの短い遺伝子断片を P CRにてクローニングし、 これらの遺伝子断片を プローブとして、 ヒ ト胎児 c D N Aライブラリーなどからよりこれらより長い遺 伝子断片のクローニングを試みた。 その結果、 この様にして分離され、 遺伝子配 列を決定したより長い遺伝子断片の遗伝子配列を再度ヒ トセレイ ト - 1 の遗伝了- 配列と比較を行なったところ、 その中からヒ トセレイ トー 1 と比較的高いホモ口 ジーを有する遺伝子が単離されていることが明らかとなり、 この分子をヒ トセレ イ ト一 2と命名し、 全長の遺伝子クローニングを行い、 成功した。
更に、 この全長遺伝子クローニンク"を行ったセレイ トー 2の発現べクターを各 種構築し、 ついでこれらの蛋白質の精製法を確立し、 精製を行い単離した。 また 、 該ヒ トセレイ 卜— 2を免疫原として抗体を作製し、 精製法を確立し、 血液来分 化細胞に対する作用を確認し、 本発明を完成した。 すなわち、 本発明は配列番号 1、 2もしくは 3に記載のアミノ酸配列を含有す るポリべプチドに関し、 これらポリべプチドが未分化細胞の分化抑制作用を有す るポリペプチドに関する。 さらに、 これらのポリペプチドに関し、 未分化細胞か 脳神経系または筋肉系未分化細胞以外の未分化細胞であるポリべプチド、 また、 未分化細胞か血液未分化細胞であるポリべプチド、 更にポリべプチドが血管内皮 細胞の増殖を抑制する作用を有するポリべプチドに関し、 該ポリべプチドを含有 する医薬組成物、 該ポリペプチドを含有する細胞培養培地に関し、 該紬胞か血液 未分化細胞である培地に関する。 さらに本発明は、 配列番号 1、 2もしくは 3に記載のアミ ノ酸配列を含有する ポリべプチドをコ一ドする DN Aに関し、 これら DN Aか配列番号 4に記載の D NA配列の 9 0番から 73 1番、 9 0番から 3 25 4番もしくは 9 0番から 3 7 2 5番にあたる配列を有する DN Aに関する。 更に配列番号 1、 2もしくは 3に 記載のァミ ノ酸配列を含有するポリべプチドをコ一 ドする DN Aと宿主細胞中で 発現可能なべク夕一 DNAと連結してなる組換え DNA体に関し、 さらにこれら DN A体により形質転換された細胞に関する。 また本発明は、 さらにこれら該ポリべプチドを生産し得る細胞を培地にて培養 し、 産生された化合物を採取する化合物の製造方法に関し、 さらに配列番号 1〜 3のいずれかのァミノ酸配列を冇するポリべプチドを特異的に認識する抗体に関 する。 以下、 本発明を詳細に説明する。
遺伝子操作に必要な c DN Aの作製、 ノーザンプロッ トによる発現の検討、 ハ ィブリダィゼーシヨ ンによるスク リ一ニング、 組換え D N Aの作製、 D N Aの塩 基配列の決定、 c DNAライブラリ一の作製等の一連の分子生物学的な実験は通 常の実験書に記載の方法によって行うことができる。 前記の通常の実験書として は、 例えば、 Ma n i a t i sらの編集した Mo 1 e c u 1 a r C l o n i n g, A l a b o r a r t o r y ma n u a l , 1 9 8 9, E d s. , S am b r o o k, J . , F r i t s c h, E . F . , a n d a n i a t i s , T . ， C o l d Sp r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y P r e s sを挙げることができる。 本発明の新規化合物は少なく とも配列表の配列番号！〜 3のアミ ノ酸配列から なるポリべプチドを有するか、 自然界で生じることが知られている生物種内変異 、 ァレル変異等の突然変異及び人為的に作製可能な点変異による変異によって生 じる改変体も、 配列表の配列番号 1 、 2または 3のポリペプチドがそれらの性質 を失わない限り本発明の新規化合物に含まれる。 そのアミノ酸の改変、 置換に関 しては例えば B e n n e t t らの出願 （国際公開番号 W O 9 6 / 2 6 4 5 ) など に詳しく記載されており、 これらを参考にして作製することができる。 本発明で の改変体とはこのようなァミ ノ酸置換に伴う改変体に関し、 その改変体がァミ ノ 酸配列において 9 0 %以上の類似性を有するァミ ノ酸配列と規定できる。 また、 配列表の配列番号 1 〜 3のァミ ノ酸配列からなるポリぺプチドをコ一ド する D N A配列については配列表の配列番号 4にァミ ノ酸配列とともに示した。 これらの遺伝子配列に関し、 アミ ノ酸レベルの変異かなく とも、 自然界から分離 した、 染色体 D N A、 または c D N Aにおいて、 遺伝コードの縮重により、 その D N Aがコードするァミ ノ酸配列を変化させることなく D N Aの塩基配列が変異 した例はしばしば認められる。 また、 5 ' 非翻訳領域及び 3 ' 非翻訳領域はポリ ぺプチドのアミ ノ酸配列の規定には関与しないので、 それらの領域の D N A配列 は変異しやすい。 このような遺伝コードの縮重によって得られる塩基配列も本発 明の D N Aに含まれる。 本発明で記載する未分化細胞とは、 特定の刺激によって増殖可能な細胞であり 、 かつ特定の刺激によって特定の機能を有する細胞に分化可能な钿胞と規定され 、 これらの中には皮慮組織系の未分化細胞、 脳神経系の未分化細胞、 筋肉系の未 分化細胞、 血液系の未分化細胞などが含まれ、 各々幹細胞といわれる自己複製能 力を有しかつその系統の細胞を生み出す能力を有する細胞を含む。 また、 分化抑 制作用とは、 これらの未分化細胞が自律的もしくは他律的に分化する現象を抑制 する作用であり、 具体的には未分化な状態を維持する作用である。 また、 脳神経 系未分化細胞とは、 特定の刺激に伴い、 特定の機能を有する脳、 神経の細胞にの み分化する能力を有する細胞と規定できる。 また、 筋肉系未分化細胞とは特定の 刺激に伴い、 特定の機能を有する筋肉細胞にのみ分化する能力を有する細胞と規 定される。 また、 本発明で記載する血液未分化細胞とは、 血液コロニーアツセィ で同定が可能な特定の血液系列に分化することか運命づけられた血液前駆細胞お よび全ての系列への分化能と自己複製能を有する造血幹細胞を含む細胞群と規定 される。 配列表において、 配列番号 1のアミノ酸配列は、 本発明のヒ トセレイ ト— 2の シグナルべプチドを除いた活性中心の配列であり、 配列番号 3に示した本発明の ヒ トセレイ ト— 2の成熟型全長ァミ ノ酸配列のァミノ酸番号 1番から 2 1 7番に 相当している。 配列番号 2のァミ ノ酸配列は、 本発明のヒ トセレイ 卜— 2のシグ ナルぺプチドを除いた細胞外ドメィンの配列であり、 配列番号 3に示した本発明 のヒ トセレイ ト— 2成熟型全長ァミ ノ酸配列のァミ ノ酸番号 1 番から 1 0 5 8番 に相当している。 配列番号 3のァミ ノ酸配列は、 本発明のヒ トセレイ 卜— 2の成 熟型全長ァミノ酸配列である。 配列番号 の配列は本発明のヒ トセレイ ト一 2の 全アミ ノ酸配列及びそれをコードしている c DNA配列である。 また、 配列表の 配列番号 5の配列は本発明で使用したヒ トセレイ ト一 1の全ァミ ノ酸配列及びそ れをコードしている c DN A配列である。
なお、 配列表に記載されたァミ ノ酸配列の左端及び右端はそれぞれァミ ノ基末 端 （以下 N末と呼称する） 及びカルボキシル基末端 （以下 C末と呼称する） であ り、 また塩基配列の左端及び右端はそれぞれ 5 ' 末端及び 3' 末端である。 ヒ トノ ツチリガンドの遺伝子をクローニングするために次の方法が考え得る。 ヒ トノッチリガンドは生物の進化の過程で一部のァミノ酸配列が保存されている ことから、 保存されたアミノ酸配列に対応した DN A配列を設計し、 RT— PC R (R e v e r s e T r a n s c r i p t i o n P o l ym e r a s e C h a i n R e a c t i o n ) のプライマーとして利用し、 ヒ ト由来の P C R テンプレー トを PCR反応によつて増幅することにより、 ヒ トノ ッチリガン ド遺 伝子の断片が得られる可能性かある。 またヒ ト以外の生物のノ ツチリガン ドホモ 口グ'の既知 D N A配列情報から RT— PCRプライマーを作製し、 その生物の P C Rテンプレートから既知遺伝？断片を取得することは原理的に可能である。 ヒ トノ ッチリ ガン ド断片取得を B的として PC Rを行うに当たって、 DS L配 列に対する PC Rがまず考えられたか、 この領域に保存されたアミノ酸配列に対 応ずる DN A配列の組み合わせは膨大であり、 P C Rブライマ一設計か無理であ つたため、 E G F様配列を P C Rの対象としなければならなかった。 先述のよう に多数の分子に E G F樣配列は保存されているため、 断片取得及び同定は極めて 困難であった。 本発明者らは参考例 1に示した配列を例とする 5 0組の P CRプ ライマーを設計、 作製し、 ヒ ト由来の様々な組織の p o 1 y A+ RNAから作製 した c DN Aを P C Rテンプレートとして各々 PC Rを行い、 各 1 0種類以上の P C R產物をサブクローニンケ'し、 合計 5 0 0種以上のシークェンスを行し、、 鋭 , 努力の結果、 ヒ トセレイ トー 1の目的とする配列を有するクローンを 1種類同 定できた。 すなわち参考例 1のごとく、 得られた P C R産物をクローニング'ベク タ一にク ローニングし、 この P CR産物を含む組換えプラスミ ドを用いて宿主紬胞を形 ¾ 変換し、 組換えプラスミ ドを含む宿主細胞を大量培養し、 組換えプラスミ ドを精 製 '単離し、 クローニング'ベクタ一に揷入された PC R産物の DN A配列を調べ 、 各々について既知の他種セレイ トホモログのアミ ノ酸配列と比較し、 ヒ 卜セし ィ 卜 - 1の配列を有すると思われる遺伝子断片の取得に努めた。 その結果、 配列 表の配列番号 5に記載の DN A配列の 1 2 7 2番から 1 7 3 7番と同--の配列、 すなわちヒ トセレイ ト— 1の c DN Aの一部を含む遺伝子断片を見いだした。 次 に、 参考例 2に示したごとく、 こうして得られたヒ トセレイ ト一 1遺伝子断片を 用いて、 ヒ 卜 c DNAライブラリ一から各々の全長 c DNAを得た。 本発明者ら はこれらの内容について既に特許出願を行った （国際公開番号 WO 9 7/ 1 9 1 7 2) o 本発明においてはこのヒ トセレイ 卜一 1分子以外に、 他のリガンドが存在して いると考え、 そのリガン ドの存在に関して、 ヒ トセレイ ト一 1分子のアミ ノ酸配 列をコードしている遺伝子配列、 すなわち配列表の配列番号 5の塩基配列の 4 0 9番から 4 0 6 2番の遺伝子配列に対して、 これとホモロジ一の高い遺伝子断片 の探索を遺伝子配列のデータ一ベース上を検索する手法にて行った。 具体的には 遺伝子配列デ一ターベースとしては G e n b a n k (リ リース 9 し 1 9 9 5 ) の ンダムなヒ ト c DN A配列の遗伝子断片のデータ一ベースである E S T (E x p r e s s e d S e q u e n c e T a g ) を解析ソフ トウェアとして遺伝 子配列検索'ノフ トウエア G e n e t y x/CD (ソフ 卜ウェア開発社製） を用い て行った。 すなわち、 近年、 DNAシーケンス技術が向上し、 ゲノム DNAや c DNAの ライブラリーをランダムにシーケンスし、 ヒ ト、 線虫、 シロイヌナズナなどの揷 の全ゲノム DN Aおよび全 c DN A配列の解明が試みられている （G e n om e
D i r e c t o r y, Na t u r e, 3 7 7, 3 S, 1 9 9 5 ) 。 ヒ トの c D NAに関して、 T I GR (Th e I n s t i t u t e f o r G e n om i c R e s e a r c h) による ESTプロジェク ト、 ヮシン卜ン大学一 メルクに よる E STプロジェク ト、 コロラ ド大学による STSプ Dジヱク トなどがこの事 業に参入している。 これらの機関から提出された c DNAの部分塩基配列は G e n b a n kおよび E M B Lの遺伝子デ一夕ベースに登録されており、 開示されて いる。 i 9 9 5年 1 0月発行の G e n b a n kリ リース 9 1によれば、 E S Tク ローンの累積登録数は約 3 3万クローンで、 平均長は 3 4 6塩基対 （b p) であ ることかわかる。 これらのデータベースのデータを、 既知もしくは新たにクロ一ニングした新規 分子などの遺伝子配列、 アミ ノ酸配列をもとにしてホモロジ一検索を行い、 その 類似分子ファ ミ リ一分子の存在の可能性を知ることができ、 部分遺伝子を配列情 報を得ることができる。 その解折ソフトウエアとしては市販の解析ソフ トでも構わないし、 各々のデー 夕一ベースに付属している解析'ノフ トウエア、 例えば G e n b a n kに付属して いる B L A S Tを用いて解析する、 すなわち米国ナショナル · セン夕一 . ォブ . バイオテクノロジ一 ' イ ンフ ォ ノーショ ン、 日本国京都大学化学研究所などに W WW (ワール ド ' ワイ ド ' ゥヱブ） 、 電子メ一ルなどでァクセスして計算するこ とができる。 このような、 操作を通して、 的の遺伝子に対して類似性の高い遺伝子断片 （ 2 0 0から 3 5 O b程度の長さ） の遺伝子配列情報を入手することができる。 こ のように人手した遺伝子断片配列情報には一般に遺伝子配列情報とともに、 その 遺伝 :fのクローン名、 存在した臓器、 組織の情報が記載されている。 遺伝子配列 情報に閱しては、 D N Aシークェンサ一の生デ一夕情報に近いため、 遺伝子配列 か未決定で Nと記載されていたり、 遺伝 7·配列情報が問違つているケースが多い ため、 これらの遺伝子配列情報は必ずしも確かではない。 これらの遺伝子情報から、 遺伝子配列で Nのデータが出てこない領域を最も確 からしい遺伝子配列情報の部分と考えて、 これら遺伝子配列の最も確からしい遣 伝子配列をさらに比較して、 この領域で有意なホモロジ一のある （ 2 0 0 b程度 の遺伝子ならば、 遺伝子配列の類似性として 4 0 %前後の値以上であることか望 ましい） 遺伝子断片の同定を行う。 このように同定された遺伝子断片に関して、 —部の遺伝子については、 そのクローン名が明らかになれば米国ゲノムシステム 社などから購入可能であるが、 発現臓器が明示されているので、 市販の発現臓器 の c D N Aから P C Rによって分離することが出来る。 ただし、 このようにして見出された遗伝子情報は部分的な情報であり、 全体の 情報か得られない限り、 その部分遺伝子がコードしているであろう全長のァミノ 酸がもともとホモロジ一サーチに用いた分子の類似分子とは限らない。 この情報 だけからその分子に関して確実なことを示すことはできない。 下記に示すように 本発明者らは実際にホモロジ一を有するプローブを多数調製して、 プラークハイ ブリダィゼ一シヨ ンにてク σ—ニングを行つたが、 多くの遺伝子断片は目的の分 子をコードしてはいなかった。 したかって、 この手法は技術的に可能ではあるが
、 容易な手法ではないと結論づけられる。 具体的には、 ヒ トセレイ ト一 1 c DN Αと類似性を示す遺伝子断片をおよそ 5 0種以上にわたって P C Rにてプロ一ブを作製した。 最終的には下記に示すよう に、 イブラ リースク リ ーニングにてクローニング'を行い、 遺伝子配列を決定し た結果、 実施例 1 に記載した 3種の G e n b a n kに登録されている遺伝子配列 クローン （登録番号 T 0 8 8 5 3、 R 5 0 0 2 6 , R 4 6 7 5 1 ) を基に作製し た 3種の DN Aプローブ、 すなわち配列表の配列番号 8、 9及び 1 0に記載した 配列を有する DN Aプローブを fflいて分離された遺伝子かヒ トセレイ トー 2分子 をコ一ドしている遺伝子断片であった。 次に、 このように分離された c DN A遺伝子断片をプローブとして用い、 その 発現臓器などの c DNAライブラリ一をスクリ一ニングすることにより、 さらに 長い遺伝子配列遺伝子、 もしくは全長 c DN A遺伝子をクローニングすることが 出来る。 その方法としては、 前記の方法にて部分クローニング'した遺伝子をアイ ソ トープ標識、 及び各種非アイソ トープ標識し、 ライブラリ一をハイブリ ダィゼ ーションなどの方法にてスクリ一二ング'することによって得ることができる。 ァ ィソ ト一プの標識法としては、 たとえば [32P] ァ一 ATPと T 4ボリ ヌクレオ チドキナーゼを用いて末端をラベルする方法や、 他のニック トラ ンスレーシ ョ ン 法またはプライマー伸長法などによる標識法が利用できる。 さらに、 ライブラリーを用いない方法として 5 ' — RAC E法、 3 ' —RAC E法等で遺伝子を伸張する方法でも全長遺伝子をクローニングしたり、 より長い 遺伝子断片をクローニングすることか出来る。 また今までに示した P C Rを用い た方法、 データーベースを検索する方法によらない別の方法として、 ヒ ト由来の c D N Aライブラ リ一を発現ベクターに組み込み、 C O S— 7細胞などで発現さ せ、 リセプ夕ーノ ッチ蛋白質を用いて、 その結合分子を検索することにより、 0 的の遺伝子をスク リーニングする発現クローニングなどの手法でリガン ドの c D N Aを分離することもできる。 発現クローニングには、 T A N— 1 など今まで見 出されている 4種類のヒ トノ ツチのァ ミ ノ酸配列を含有するポリべプチ ドの結合 を利用したセルソー夕一による分画法、 ラジオァイソ トープを用いたフ ィ ル厶ェ マルジ ンによる検出法、 等の方法か举げられる。 ここではヒ トセレイ ト一 2遺伝子取得の方法として述べた力、、 ヒ 卜デルタ一 1 、 ヒ トセレイ ト一 1 のクローニングで行った P C R法を含め本発明に明示した各 種の手-法は、 、ずれもまだクローニング'されていない新しいノ ッチリガン 卜"つァ ミ リ一分子の取得に応 fflてきる。 たとえば、 ヒ トセレイ ト一 1 とヒ トセレイ ト— 2のァ ミ ノ酸配列、 遺伝子配列を比較して保存されている領域をいく らか¾いだ して P C Rでクローニングしたり、 ヒ トデルター 1、 ヒ トセレイ ト— 2を基に E S Tをサーチして同様にクローニングしたりする事ができる。 このようにクロ一 ニングした新しいノ ッチリガン ドファ ミ リ一分子は、 本発明で示したヒ トセレイ トー 2同様に全長クロ一ニング、 発現べクタ一作製、 形質転換細胞作製、 タ ンパ ク生産、 抗体作製、 生理活性探索を行うことかでき、 いずれも細胞の分化抑制作 用を期待できる。 本発明者らは実施例 2に示したごとく、 これらの 3種の遺伝子断片をラジオア イソ 卜ープでラベルし、 ハイブリ ダィゼーシヨ ンプローブとし、 ヒ ト胎児脳 c D N Aライブラリ一を用いてスク リ一二ングを行い、 得られた複数のクローンの D N A配列を決定し、 この結果、 全体の遺伝子配列にわたってヒ トセレイ ト— 1 と 類似性が高いことが判明した。 しかしながらこれらのクローンでは、 全長のアミ ノ酸をコ一 ドしている全長 c D N A遺伝子はクローニング'できていなかつたため 、 さらにこのクロ一ニング'された遺伝子配列を基に D N Aプローブを作製し、 再 度スク リーニングを行い、 これでも全長遺伝子が同定できなかったため、 最終的 に 5' — RAC E法にてァミ ノ酸の翻訳開始メチォニンコ ドンを含む遺伝子をク ローニングし、 遺伝子配列を決定し、 全長のヒ トセレイ ト一 2の遺伝子クロ一二 ングに成功した。 このようにクローニングされた c D N Aを実施例 2に示したよ うにつなぎ合わせて、 該ヒ トセレイ ト— 2の全長をコ一ドする c DNAを得るこ とができる。 c DN Aを組み込むプラスミ ドとしては、 例えば大腸菌由来の p BR 3 2 2、 PUC 1 8、 p UC 1 9、 p UC 1 1 8、 p UC 1 1 9 (いずれも宝酒造社製） などか举げられるが、 その他のものであっても宿主内で複製増殖できるものであ ればいずれも用いることかできる。 また c D N Aを組み込むファージベクターと しては、 例えは I g t 1 0、 λ g t 1 iなどが挙げられる力、、 その他のものであ つても宿主内で増祯できるものてあれば用いることができる。 このようにして、 得られたプラスミ ドは適当な宿主、 例えばェシエリ ヒア （E s c h e r i c h i a ) 厲菌、 バチルス （ B a c i 】 1 u s ) 属菌などにカルシウムクロライ ド法等 を用いて導入する。 上記ェンェリ ヒア属菌の例としては、 ェシエリ ヒア コリ Iく 1 2 HB 1 0 し MC 1 0 6 し L E 3 9 2、 JM 1 0 9などが举げられる。 上記バチルス属菌の 例としてはバチルス、 サチリス M l 1 1 4等が挙げられる。 また、 ファージべク 夕一は、 例えば増殖させた大腸菌にインビトロパッケージング法 （P r 0 c. N a t 1. A c a d. S c i . , 7 1 : 2 4 4 2—、 1 9 7 8 ) を用いて導入する ことができる。
このクロ一ニングされた全長の遺伝子配列をデ一夕べ一ス （G e n b a n k、 リ リース 9 3、 1 9 9 6 ) で比較したところ、 部分的に先に挙げた 3種の E ST クローンとこれら以外にほぼ一致する部分配列としていく らかの E STクローン デ一夕が存在したが、 全体を通した配列に関しては新規な配列である。 さらに、 該ヒ トセレイ ト— 2のァミノ酸配列、 すなわち配列表の配列番号 1、 2及び 3のァミノ酸配列についても同様に、 既知のァミノ酸配列のデータ一ベー ス （SW I S S— P R O T、 リ リース 3 2、 1 9 9 5、 及び G e n b a n k C D S、 リ リース 9 3、 1 9 9 6 ) で比較したところ、 一致するァミ ノ酸配列はなく 新規なァミ ノ酸配列であつた。 前述のヒ 卜セレイ ト一 1及び他生物のセレィ トホ モログとのアミ ノ酸配列の比較では、 ヒ トセレイ ト一 1、 シ yウジヨウバエセレ イ ト、 ラッ 卜ジャグ 'ドとの相同性はそれぞれ 5 3. 1 %、 3 4. 3 %、 5 2. 3 %であり、 これらの物質とは異なる新規な了ミ ノ酸配列を有する新規物質であり 、 本発明者らにより初めて明らかにされた物質である。 また、 このヒ トセレイ ト— 2のァ ミ ノ酸配列を K y t e - D o o l i t t l e の方法 （ J. Mo に B i o l . , 1 5 7 : 1 0 5、 】 9 8 2 ) にしたがって、 アミ ノ酸配列から疎水性部分、 親水性部分を解析した。 その結果、 配列表の配列 番号 4に記載したァミ ノ酸配列において、 遺伝子に全長の前駆体ァミ ノ酸配列は 該ァミ ノ酸配列の一 2 6番から 1 2 1 2番からなる！ 2 3 8アミ ノ酸から構成さ れるポリペプチドであり、 シグナルペプチド領域は、 一 2 6番のメチォニンから — 1番のプロリ ンにあたる 2 6アミ ノ酸から構成され、 細胞外部分は 1番のメチ ォニンから 1 0 5 5番のグリシンにあたる 1 0 5 5アミ ノ酸から構成され、 紬胞 膜通過領域は 1 0 5 6番のロイシンから 1 0 7 9番のトリプトファ ンにあたる 2 ァミ ノ酸から構成され、 紬胞内部分は 1 0 8 0番のスレオニンから 1 2 1 2番 のグルタ ミ ン酸から構成されると各々推定される。 ただし、 これらの各部分はあ く までもァミ ノ酸配列から予想された各ド ィン構造であり、 実際に細胞上並び に溶液中での存在形態は、 上記の構成と若千異なることも十分考えられ、 上記に 一応規定された各ド ィンの構成ァミ ノ酸力 5力、ら 1 0アミ ノ酸前後することも 考えられる。 特にアミノ末端 （N末端） に関しては、 実施例 6に記載したように精製された 本発明リガン ドポリべプチド EX S 2 F c及び EX S 2 F L AGの N末端のァミ ノ酸配列を同定したところ配列表の配列番号！〜 3の 1番目のアミ ノ酸であるメ チォニンである。 したがって、 少なく ともシグナルペプチドは配列表の配列番号
4の一 2 6番のメチォニンから— 1 番のプロリ ンである。 特に細胞外領域に関して、 ノ ツチのリガン ドファ ミ リー分子は進化論的に保存 された共通の配列を有している。 すなわち D S L配列と繰り返して存在する E G F様配列である。 ヒ トセレイ ト一 2とヒ トセレイ 卜— 1 との比較により、 ヒ 卜セ レイ トー 2のアミ ノ酸配列からこれらの保存された配列を推定した。 すなわち、 D S L配列は配列表の配列番号 4のァミ ノ酸配列の 1 7 2番のシスティンから 2 1 4番のシスティンにあたる 4 3アミ ノ酸残基に相当した。
E G F様配列は 1 6回繰り返して存在し、 配列表の配列番^ 4のァミ ノ酸配列 のうち、 第 1 E G F様配列は 2 1 7番システィンから 2 4 7番システィ ンまて、 第 2 E G F様配列は 2 5 0番システィンから 2 7 8番システィ ンまて、 第 3 E G F俅配列は 2 8 5番システィンから 3 1 8番システィンまで、 第 4 E G F様配列 は 3 2 5番システィンから 3 5 6番システィンまで、 第 5 E G F様配列は 3 6 3 番システィンから 3 9 4番システィ ンまで、 第 6 E G F様配列は 4 0 1番システ インから 4 3 2番システィンまで、 第 7 EG F様配列は 4 3 9番システィ ンから 4 6 9番システィンまで、 第 8 E G F様配列は 4 7 6番システィンから 5 0 7番 システィ ンまで、 第 9 E G F様配列は 5 1 4番システィンから 5 4 5番システィ ンまで、 第 1 0 E G F様配列は 5 6 3番システィンから 6 0 7番システィンまで 、 第 1 1 E G F様配列は 6 1 4番システィンから 6 4 5番システィンまで、 第 1 2 E G F様配列は 6 5 2番システィンから 6 8 3番システィンまで、 第 1 3 E G F様配列は 6 9 0番システィンから 7 2 1番システィンまで、 第 1 4 E G F様配 列は 7 2 9番システィンから 7 6 0番システィンまで、 第 1 5 E GF様配列は 7 6 7番システィンから 7 9 8番システィンまで、 第 1 6 E G F様配列は 8 0 5番 システィンから 8 3 6番システィンに該当した。 またシスティン残基に関して、 第 9 E G F様配列と第 1 0 E G F様配列の間に 2つのシスティン残基があり、 D S L配列の N末端方向に 6つのシスティ ン残基 があり、 第 1 6 EGF様配列の C末端方向に 1 6個のシスティ ン残基が存在し、 E G F様配列を含みいずれのシスティン残基もヒ トセレイ ト一 1 とほぼ同様な位 置に保存されていた。 ア ミ ノ酸配列から予想されることとして、 楗鎖が付加される部分は N—ァセチ 几— D—グルコサミ ンが N—ダルコシ ド結合可能な部分として、 配列表の配列番 号 3のァ ミ ノ酸配列の 1 2 7番、 5 4 4番、 5 9 3番、 7 2 6番及び 1 0 3 2番 のァスパラギン浅基か举かられる。 また、 N—ァセチル— D—ガラク トサミ ンの 0—グ'リ コシ ド結合を推定する部分として、 セリ ンまたはスレオニン残基が頻出 する部分が考えられる。 これらの槠鎖が付加された夕 ンパクの方がポリ ベプチ ド そのものより も一般に生体内での分解に対して安定であり、 また強い生理活性を 有していると考えられる。 したがって、 配列表の配列番号 1、 2または 3の配列 を含有するポリぺプチ ドのァ ミ ノ酸配列の中に N—ァセチルー D—ゲルコサミ ン が N—グルコシ ドゃ N—ァセチル— D—ガラク トサミ ンなどの糖鎖が N—ゲルコ シ ドあるいは 0—ク''ルコシ ド結合してなるポリぺプチドも本発明に含まれる。 シ ゥジ ゥバエノ ツチおよびそのリガン ドの結合に関する研究により、 ンョ ウジョゥバエノ ッチのリガン ドカ ノ ツチに結合するために必要なァミ ノ酸領域は 、 シグナルべプチ ドが切断された成熟体蛋白質の N末から D S L配列までである ことが明らかにされている （特表平 7 - 5 0 3 1 2 1号公報） 。 また、 同様に線 虫 用いた F i t z g e r a l dと G r e e nwa l d (D e v e 1 o pm e n t、 1 2 1、 4 2 7 5— 4 2 8 2、 1 9 9 5 ) の研究からノ ッチリガン ド様分子 A PX— 1 はノ ッチ様リセプターの活性化にとって全長のァ ミ ノ末端から DS L ドメイ ンまでで十分であることか明らかにされている。 このことから、 ヒ トセレ ィ トー 2のリガン ド作用の発現に必要な領域は配列表の配列番^ 1 に示した新規 ア ミ ノ酸配列であることかわかる。 また、 配列表の配列番号の 4の遺伝子配列の一部もしくは全部をコードする D NAを用いれば、 ノーザンブロッ 卜が可能である。 従って、 本遺伝子の発現を調 ベる方法として、 配列表の配列番号 4の一部の遺伝子配列を有する 1 2m e rか ら 1 6 m e r以上、 さらに望ましくは 1 8 m e r以上の相補し得る核酸、 つまり アンチセンス DNA、 RNA、 及びそれらがメチル化、 メチルフォスフェー ト化 、 脱ァミ ノ化、 またはチォフォスフェー ト化された誘導体を用い、 ハイプリ グイ ゼーシ ヨ ン、 P CR等の手法によって行うことが出来る。 同様な方法でマウス等 の他の生物の本遺伝子のホモログの検出や遺伝子クローニングかできる。 さらに、 ヒ トを含めたゲノム上の遺伝子のクロ一ニングも同様に可能である。 従って、 そのようにしてクローニングされたこれら遺伝子を用いれば、 本ヒ トセ レイ トー 2の更に詳細な機能も明らかにすることが出来る。 例えば、 近年の遺伝 子操作技術を用いれば、 トランスジヱニッ クマウス、 ジ一夕一ゲッティ ン ケマウ ス、 また、 本遺伝子と関連する遺伝子を共に不活化したダブルノ ッ クアウ トなど のあらゆる方法を用いることが出来る。 また、 本遺伝子のゲノ厶上の異常かあれ ば、 遺伝子診断、 遺伝子治療への応用も可能である。 実施例 3に記載したようにヒ ト正常組織における発現は、 各組織にわたってお り、 発現されている mRNAの長さは約 5 k bの一種類であった。 この様にして 本分子の mRN Aの発現を検出することは、 正常臓器でこれらの発現が認められ ない部位における悪性腫瘍の検出などの診断に応用可能である。 また、 この発現 臓器のパターンを参考にすれば本発明では具体的に指摘していないヒ トセレイ ト 一 2の用途を見出すことができる。 尚、 本発明のヒ トセレイ トー 2の全ァミ ノ酸配列をコードする c DNAを含む ベクター pUCSR— 2を大腸菌 J M 1 0 9に遺伝子導入した形質転換細胞は、 E. c o l i : JM 1 0 9— pUC SR— 2として日本国茨城県つくば市東 1丁 目 1番 3号に所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されて
1 0 いる。 寄託日は平成 8年 1 0月 2 8日であり、 受託番号は F ERM B P - 57 2 7である。 上記の方法にて分離したヒ トセレイ 卜一 2のアミ ノ酸配列をコードする c DN Aを用いた色々な形態を有したヒ トセレイ 卜一 2の発現、 精製には多数の方法力 成書によって知られている （K r i e g 1 e r , G e n e T r a n s f e r a n d Ex p r e s s i o n— A L a b o r a t o r y Ma n u a l S t o c k t o n P r e s. 1 9 9 0および横田ら、 バイオマニュアルシリーズ 4. 遺伝子導入と発現 ·解析法， 羊土社、 1 9 94 ) 。 すなわち、 分離した該ヒ 卜セレイ 卜一 2のアミ ノ酸配列をコードする c DN Aを適当な発現べク夕一につ なぎ、 動物細胞、 昆虫細胞などの真核細胞、 バクテリアなどの原核細胞を宿主と して生産させることができる。 本発明分子を発現させる際に、 本発明のポリべプチドをコ一ドする DN Aはそ の 5' 末端に翻訳開始コ ドンを有し、 また、 3' 末端には翻訳終止コ ドンを有し てもよい。 これらの翻訳開始コ ドンや翻訳終止コ ドンは適当な合成 DN Aァダプ クーを用いて付加することもできる。 更に該 DNAを発現させるには上流にプロ モーターを接続する。 ベクターとしては上記の大腸菌由来プラスミ ド、 枯草南由 来プラスミ ド、 酵母由来プラスミ ド、 あるいは ファージなどのパクテリオファ ―ジおよびレ トロウイルス、 ヮクシニアゥィルスなどの動物ゥィルスなどが举げ られる。 本発明に用いられるプロモー夕一としては、 遺伝子発現に用いる宿主に対応し て適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
形質転換する際の宿主かェシヱリ ヒア属菌である場合は t a cプロモー夕一、 t r pプロモ一夕一、 l a cプロモーターなどが好ましく、 宿主かバチルス属菌 である場合には S P 01プロモーター、 S P 02プロモーターなどが好ましく、 宿主が酵母である場合には P GKプロモ一夕一、 GAPプロモーター、 ADHプ 口モータ一などが好ましい。
宿主が動物細胞である場合には、 S V 4 0由来のプロモ一夕一、 レ トロウィル スのプロモ一夕一、 タルチオネインプロモーター、 ヒー トショ ッ クプロモー夕 一などが利用できる。 ポリべプチドを発現させるとき配列表の配列番号 1、 2または 3のアミ ノ酸配 列をコ一ドする DN Aのみでもかまわないか、 産生されたポリぺプチドの検出を 容易にするための既知抗原ェピトープをコ一ドする c DN Aを付加したり、 該ヒ トセレイ トー 2の多量体構造を形成させるためにィムノグ'ロブリ ン F cをコ一 ド する c DN Aを付加することで、 特別の機能を付加した蛋 質を生産させること もできる。 本発明者らは実施例 4に示したごとく、 細胞外タンパク質を発現する発現べク 夕一として、 1 ) 配列表の配列番号 2に記載のアミ ノ酸配列の 1番から 1 0 5 5 番のアミ ノ酸をコードする DNA、 2 ) 配列 ¾の配列番号 2に記載のアミ ノ酸配 列の 1番から 1 0 5 5番の了ミ ノ酸の C末側に 8アミノ酸、 すなわち A s ρ T y r L y s A s p A s A s p A s L y sのァミ ノ酸配列 （以下 F L A G配列、 配列表の配列番号 2 2 ) を持つポリぺプチドを付加したキメラ夕 ンパク質をコードする DNA、 および 3 ) 配列表の配列番号 2に記載のアミ ノ酸 配列の 1番から 1 0 5 5番のァミ ノ酸の C末側にヒ ト 1 gG 1のヒンジ部分以下 の F c配列 （国際公開番号 WO 9 4 / 0 2 0 3 5に記載されている） を付加し、 ヒンジ部分のジスルフィ ド結合により 2量体構造を有するキメラ夕ンパク質をコ ードする DNAを発現ベクター pMK I TN e 0 (丸山ら、 9 1年度日本分子生 物学会予稿集、 東京医科歯科大学丸山より入手可能） に各々別々につなぎ、 ヒ ト セレイ ト— 2の細胞外部分発現ベクターを作製した。 また、 全長タンパク質を発現する発現ベクターとして、 4 ) 配列表の配列番号 2の 1番から 1 2 1 2番の了ミ ノ酸をコードする DNA、 および 5 ) 配列表の配 列番号 2の 1番から 1 2 1 2番のァミ ノ酸の C末端側に F L A G配列を持つポリ ぺプチドを付加したキ ラタンパク質コ一ドする D N Aを発現べクタ一 p M K 】 T N e oに各々別々につなぎ、 ヒ トセレイ ト一 2の全長発現ベクターを作製した。 このようにして構築された該ヒ トセレイ 卜一 2をコードする D N Aを含有する発 現プラスミ ドを用いて、 形質転換体を製造する。
宿主としては例えばェシヱリ ヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 動物細胞などが 挙げられる。 動物細胞としては、 例えばサル細胞である C O S— 7、 V e r o、 チヤィニーズハムス夕一細胞 C H〇、 カイコ細胞 S F 9などが挙げられる。 実施例 5に示したごとく、 上記の 5種類の発現ベクターをそれぞれ別々に遺伝 了-導入し、 ヒ 卜セレイ 卜— 2を C O S— 7钿 (I'd (理化学研究所、 細胞開発銀行か ら人手可能、 R C B () 5 3 9 ) で発現させ、 これら発現プラスミ ドで形 f 転換さ れた形質転換休が得られる。 さらに、 各形質転換体をそれぞれ公知の方法により 、 適当な培地中で適当な培養条件により培養することによって各種ヒ トセレイ ト 一 2夕ンパクを製造することができる。
上記の培養物からヒ トセレイ ト - 2タンパクを分離精製するには、 例えば下記 の方法により行うことかできる。 培 ¾菌体あるいは紬胞から抽出するに際しては、 培養後、 公知の方法、 たとえ ば遠心分離法などで菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超 音波、 リゾチーム及び Zまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破砕し た後、 遠心分離や濾過によりヒ トセレイ ト— 2タンパクの粗抽出液を得る方法な どを適宜用いることかできる。 緩衝液の中に尿素、 塩酸グァニジンなどのタンパ ク変性剤や、 卜リ トン X— 1 0 0などの界面活性剤か含まれていてもよい。 培養 溶液中に分泌される場合には、 培養液を公知の方法、 たとえば遠心分離法などで 菌体あるいは細胞と分離し、 ヒ清を集める。 このようにして得られた細胞抽出液あるいは細胞上清に含まれるヒ トセレイ ト 一 2タンパクは公知のタンパク質精製法を用いることで、 精製できる。 その精製 の過程でタンパク質の存在を確認するために、 上記に示した FLAG、 ヒ ト I g G F cなどの融合タンパクの場合には、 それら既知抗原ェピトープに対する抗体 を用いたィ厶ノアツセィで検出して精製を進めることができる。 また、 このよう な融合タンパク質として発現させない場合には、 実施例 7に記載したヒ トセレイ 卜一 2に対する抗体を用いて検出することができる。 精製方法としてより有効な方法としては抗体を用いたァフィ二ティーク口マト グラフィ一が挙げられる。 この際に fflいる抗体としては実施例 7に記載した各種 ヒ トセレイ ト一 2に対する抗体を用いることができる。 また、 融合タンパクの場 合には、 実施例 6に示したように、 ヒ トセレイ ト一 2以外の部分に対する抗体、 例えは FLAGであれば FLAGに対する抗体、 ヒ ト I gGF cであれば P r o t e i n G、 P r o t e i n Aを用いることができる。 このようにして精製されたヒ トセレイ ト一 2タンパク、 またはヒ トセレイ ト一 2の生理機能を、 各種細胞株、 マウス、 ラッ トなどの生物個体を用いた各種生理 活性了ッセィ法、 分子生物学的手法に基づく紬胞内シグナル伝達の各種ァッセィ 法、 ノ ッチリセプ夕一との結合などの色々なァッセィ法にて知る二とができる。 その作用としては細胞の分化を抑制する作用が主に期待でき、 また組織再生を 促す作用等が期待できる。
すなわち、 実施例 8に示したように C D 34陽性細胞画分を濃縮した臍帯血 ώ 来血液未分化細胞において、 各種サイ トカイン存在下でコロニー形成する血液未 分化細胞に対してコロニー形成作用の抑制活性を有することを見いだした。 さらに、 実施例 9に示したように、 サイ ト力イン存在下での液体培養へのヒ 卜 セレイ ト— 2の I gG lキメラ蛋白質の添加により、 ヒ ト血液未分化細胞の中で 最も未分化な血液幹細胞と位置付けられている LTC— I C (Lon g— Te r m Cu l t u r e— I n i t i a t i ng Ce l l s) の数を有意に低下さ せる活性を有していることを見いだした。
これらの結果から、 ヒ トセレイ ト一 2は血液未分化細胞の分化を抑制し、 それ らの作用は血液幹細胞からコロニー形成細胞にわたって作用することか明らかで ある。 医薬品として用いた場合には、 抗癌剤などの副作用で見られる骨髄抑制作 用を保護し、 軽減する作用がある。 またさらに、 実施例 1 0に示したように本発明分子は血液細胞以外で未だ生理 活性の知られていない血管細胞に対する作用を調べたところ、 ヒ ト血管内皮細胞 の増殖を抑制する作用を見いだした。 したがって、 本発明には配列表の配列番号
1〜3のアミ ノ酸配列を有するポリペプチドを含有する血管細胞の增殖抑制剤、 並ひに各種血管新生を抑制することにより効 ¾が期待される疾患 （F o 1 km a n a n d K l a g s b r u n. S c i e n c e 2 3 5、 4 4 2 - 4 4 7、
1 9 8 7などを参照） を対象とした治療剤も本発明に含まれ、 これらの治療薬と して使用できる。 医薬品として用いるならば、 上記に示した形態を有する本発明のポリべプチド を適当な安定化剤、 例えばヒ ト血清アルブミ ンなどと共に凍結乾燥品を作製し、 用時注射用蒸留水にて溶解もしくは懸濁して使用し得る形状が望ましい。 例えは 0. 1から 1 0 0 0 gZm 1の濃度に調製した注射剤、 点滴剤として提供する ことができる。 本発明者らは本発明の化合物 1 mgZm 1、 ヒ ト血清アルブミ ン 5 m g/m 1 となるようにバイアルに小分けし、 長期にわたって該化合物の活性 は保持された。 さらに、 紬胞を体外にて培養、 活性化させる場合には医薬品同様 に、 凍結乾燥品、 もしくは溶液剤を作製して、 培地に加える、 もしくは培養に使 用する容器に固定化することができる。 また、 該化合物の毒性については、 マウ スに対して 1 OmgZK gを腹腔内投与したかマウスの死亡例は確認されなかつ た。 また、 本発明のインビトロの生理活性は、 あらゆる疾患モデルマウス、 または それらに準ずる疾患に似た症状を呈するラッ ト、 サル等の動物をモデルとして投 を行い、 その身体的、 生理的な機能の回復、 異常を調べることにより可能とな る。 例えば、 造血細胞に関する異常であれば、 5 - F U系の抗癌剤を投与して、 骨髄抑制モデルマウスを作製し、 このマウスに本発明の化合物を投与した群とし なかった群の骨髄細胞、 末梢血細胞の数、 生理的な機能を調べることで明らかに なる。 また更に、 体外で造血幹細胞を含む造血未分化細胞の培養、 增殖を調べる 場合には、 マウス骨髄細胞を培養器などを利用して、 培養を行い、 その際に本発 明の化合物を加えた群と加えなかった群で培養後の細胞を致死量放射線照射マウ スに钿胞移桢を行い、 その結果の回復の度合いを、 生存率、 血球数の変動などを 指標にすることで調べることが出来る。 勿論、 これらの結果か人にも外揷できる ため、 本化合物の薬効としての評価として有効なデータを得ることが出来る。 本発明の化合物を医薬品として利用する場合、 その適応として、 細胞の分化異 常に伴う疾患、 例えば白血病、 悪性腫瘍の治療かあげられ、 体外でヒ 卜由来細胞 を培養して、 その本来の機能を保ったまま増逋させる、 もしくは新たな機能を持 たせる等を行う細胞治療、 組織損傷後の再生時に投与することにより本来その組 織が有していた機能を損なうことなく再生させる治療法などの応用が可能である 。 その際の投与量としてはその形態などにもよるが、 体的には 1 0 g Z K g から 1 0 m g Z K g程度投与すればよし、。 また、 さらに強い生理活性を有する形態として、 多量体を形成し得る形態で発 現させることが望ましい。 実施例に記載したヒ ト I g Gの F c部分とのキメラ夕 ンパク質として発現させて抗体のヒンジ部分によりジスルフィ ド結合をした多量 体として発現させる方法、 また、 抗体認識部位を C末端もしくは N末端に発現す るキメラタンパクとして発現させ、 発現させた該ヒ トセレイ 卜の細胞外部分を含 むボリぺプチドを C末端もしくは N末端の抗体認識部位を特異的に認識する抗体 と反応させることにより多量体を形成させる方法が举げられる。 さらに、 別の方法として、 抗体のヒンジ領域部分のみとの融合タ ンパクを発現 させて、 ジスルフイ ド結合にて 2量体を形成させる方法、 もしくはその他の該ヒ トセレイ 卜— 2の活性に何等影響を与えない方法でジスルフ ィ ド結合を生じさせ る形のぺプチドを C末端、 N末端もしくはその他の部位に発現するように作成さ れた融合タンパクから構成された 2量体以上の高い比活性を有する多量体型該ヒ トセレイ ト— 2を得ることもできる。 また、 さらに配列表の配列番号 1 もしくは 2のァ ミ ノ酸配列を含むポリぺプチドを遺伝子工学的に 2つ以上直列に並べ多量 体構造を発現させる方法などもある。 その他、 現在知られている 2量体以上の多 量体構造を持たせるあらゆる方法が適応可能である。 したがって、 遺伝子工学的 な技術により作製される 2量休もしくはそれ以上の形態を有する形の配列表の配 列番号 1 もしくは 2に記載のァミ ノ酸配列を含むポリぺプチドを含む化合物に関 しても本発明に含まれる。 また、 その他の方法として、 化学的な架橋剤を用いて多量体化する方法か挙げ られる。 例えば、 リ シン残基を架橋するジメチルスべ口イ ミデート 2塩酸塩など 、 システィ ン残基のチオール基で架橋する N— (了一マレイ ミ ドブチリルォキシ） スクシンイ ミ ドなと、 ァミノ基とアミ ノ基を架橋するグ'ル夕一ルアルデヒ ドなど が举げられ、 これらの架橋反応を利用して、 2量体以上の多量体を形成させるこ とかできる。 したがって、 化学的な架橋剤により作製される 2量体もしくはそれ 以上の多量体の形態を有する形の配列表の配列番号 1 もしくは 2に記載のァミ ノ 酸配列を含むポリべプチドを含む化合物に関しても本発明に含まれる。 体外において細胞を増殖、 活性化し、 体内に細胞を戻す医療方法への適応には 、 上記のような形態を有したヒ トセレイ 卜一 2を直接培地中に加えることも可能 だか、 固定化する事も同様に可能である。 固定化の方法としてはヒ トセレイ 卜一 2のァミ ノ基、 カルボキシル基を利用したり、 適当なスぺーサーを用いたり、 上 記の架橋剤を用いたりして、 培養容器にリガン ドを共有結合させることかできる 。 したがって、 固体表面に存在する形態を有する配列表の配列番号 1 もしくは 2 のァミ ノ酸配列を含有するボリべプチドに関しても本発明に含まれる。 また、 ヒ トセレイ ト一 2分子はそのリセプ夕一であるノ ッチリセプ々一分子と 特異的な結合をするため、 例えば上記のヒ トセレイ トー 2の細胞外部分とヒ 卜 I gGF cの融合タンパクを用いれば、 ノ ッチリセプ夕一の発現を検出できる。 ノ ツチは、 ある種の白血病に関連していることが知られており （E l 】 i s e n e t a 1. , C e 1 1 6 6, 6 4 9 - 6 6 1 , 1 9 9 1 ) 、 したがって、 配 列表の配列番号 1 もしくは 2のアミ ノ酸配列を含有するポリペプチドは体外もし くは体内の診断薬として使用か可能である。 該ヒ トセレイ ト - 2を特異的に認識する抗体は実施例 7に示したように作製す ること力、できる。 また成書 （An t i b o d i e s a l a b o r a t o r y ma n u a l , E. Ha r l ow e t a l . , C o 】 d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y) に示された各種の方法ならびに遺伝子ク ローニング法などにより分離されたィムノグロプリン遺伝子を用いて、 紬胞に発 現させた遺伝子組換え体抗体によつても作製することかできる。 このように作製 された抗体はヒ トセレイ ト一 2の精製に利用できる。 すなわち、 実施例 7に示し たこれらのヒ 卜セレイ ト一 2を特異的に認識する抗体を用いれば、 本発明のヒ ト セレイ 卜 - 2の検出、 则定が可能であり、 細胞の分化異常に伴う疾患例えば悪性 腫瘪など疾患の診断薬として使用でき得る。 発明の実施の形態
以下に本発明を実施する形態について参考例及び実施例として示すが、 必ずし もこれらに限定されるものではない。
参考例 1
ヒ トセレイ ト— 1遺伝子プローブの作製 ショウジヨウバエセレイ トおよびラッ トジャグドに保存されたァミ ノ酸配列に 対応した混合プライマー、 すなわち配列表の配列番号 6に記載のセンスプライマ 一および配列番号 7に記載のアンチセンスプライマ一を用いた。 但しこれらの配 列で使用した記号 Sは Cおよび G、 記号 Yは Tおよび ( 、 記号 Wは Tおよび A、 記号 Kは Gおよび丁、 ¾号 Rは Aおよび G、 記号 Nは C、 G、 Tおよび A、 の各 々等量混合物を示す。 合成ォリゴヌクレオチドは固相法を原理とする全自動 DN A合成機を使用して 作成した。 全自動 DNA合成機としてはアプライ ドバイオンステ厶社 3 9 1 PC R— MATEを使用した。 ヌクレオチド、 3'-ヌクレオチドを固定した担体、 溶 液、 および試薬は同社の指示に従って使用した。 所定のカップリ ング反応を終了 し、 卜リ クロロ酢酸で 5' 末端の保護基を除去したオリゴヌクレオチド担体を濃 アンモニア中にて室温で 1時間放置することにより担体からオリゴヌクレオチド を遊離させた。 次に核酸及びリン酸の保護基を遊離させるために、 核酸を含む反 応液を、 封をしたバイアル内において濃アンモニア溶液中で 5 5でにて 1 4時問 以上放置した。 担体及び保護基を遊離した各々のォリゴヌクレオチドの精製をァ ブラィ ドバイオシステ厶社の 0 P Cカー卜リ ッジを使用して行い、 2 %トリフル ォ口酢酸で脱トリチル化した。 精製後のプライマ—は最終濃度が 1 0 0 pm o 1 / u】 となるように脱イオン水に溶解して PCRに使用した。 以下、 オリゴヌク レオチドの合成は同様に行った。
P CRによる増幅は以下のように行った。 ヒ ト胎児脳由来 c DNA混合溶液 （ QU I CK - C l o n e c DNA, C LONTECH社） 1 1を使用し、 1 0 x緩衝液 （ 5 0 0mM KC し 1 0 0 mM T r i s - HC 】 （ρ Η 8. 3 ) 、 1 5mM Mg C l 2 、 0. 0 1 %ゼラチン） 5〃 】、 dNTP M i x t u r e (宝酒造社製） 4〃 1、 前述のセレイ トホモログに特異的なセンスプライ マ一 DLTS 1 ( 1 0 0 pm o 1 / 1 ) 5〃 1およびアンチセンスプライマー DLTA 2 ( 1 0 0 pm 0 1 /// 1 ) 5 1、 及び T a q DNAボリ メラーゼ （ Amp 1 i Ta q ：宝酒造社製、 5 Ό u 1 ) 0. 2 1を加え、 最後に脱ィォ ン水を加えて全量を 5 0〃 】 として、 9 5 °Cで 4 5秒間、 4 2 °Cで 4 5秒間、 7 2 °Cを 2分間からなる行程を 1サイクルとして、 この行程を 5サイクル行い、 さ らに 9 5てで 4 5秒間、 5 0でで 4 5秒間、 72 °Cを 2分間からなる行程を 1サ ィクルとして、 この行程を 3 5サイクル行い、 最後に 72 °Cにて 7分間放置して P C Rを行った。 この P C R産物の一部を 2 %ァガロースゲル電気泳動を行い、 ェチジゥムブ口マイ ド （日本ジーン社製） にて染色後、 紫外線下で観察し、 約 5 0 0 b pの c DNAが増幅されていることを確認した。 このようにして得られた PC R産物の全量を低融点ァガロース （G 】 BCO BR L社製） にて作製した 2？ ァガロースゲルにて 気泳動し、 ェチジゥ厶ブ口 マイ ドにて染色後、 紫外線照射下にて約 5 0 0 b pのバン ドを切り出し、 ゲルと 同体 ¾の蒸留水を加え、 6 5°Cにて 1 0分問加熱し、 ゲルを完全に溶かしたのち 、 等量の TE飽和フ ノール （曰本ジーン社製） を加えて、 1 5 0 0 0 r pm、 5分間遠心分離後上洁を分離し、 さらに同様な分離作業を TE飽和フエノール ： クロロフオル厶 （ 1 ： 1 ) 溶液、 さらにクロロフオルムにて行った。 最終的に得 られた溶液から DN Aをエタノール沈澱して回収した。 ベクターとして p CR i I V e c t o r ( I n v i t o r o g e n辻製、 以 下 P CR I I と呼称する） を用い、 べク夕一と先の DN Aのモル比が 1 ： 3とな るように混せ合わせて、 T 4 DN Aリガーゼ （ 1 n V i t 0 r 0 g e n社製） にてベクターに DNAを組み込んだ。 DNAが組み込まれた p CR I Iを大腸菌 On e S h o t C omp e t e n t C e l l s I n v i t r o g e n社 製） に遺伝了導入し、 アンピシリ ン （S i gma社製） を 5 0〃 g/m 1含む L - B r o t h (宝酒造社製） 半固型培地のプレートに蒔き、 1 2時間程度3 7 に放置し、 現れてきたコロニーを無作為選択し、 同濃度のアンピシリ ンを含む L - B r 0 t h液体培地 2 m 1に植え付け、 1 8時間程度 37 °Cで振盪培養し、 菌 体を回収し、 ウイザ一ドミニプレップ （P r ome g a社製） を用いて添付の説 明書に従ってプラスミ ドを分離し、 このプラスミ ドを制限酵素 E c 0 R Iにて消 化して、 約 5 0 0 b pの DNAが切り出されてくることで該 PCR産物が組み込 まれていることを確認し、 確認されたクローンについて、 組み込まれている DN Aの塩基配列をアプライ ドバイオシステム社の螢光 DNAシークェンサ一 （モデ ル 3 7 3 S) にて決定した。 このようにして遺伝子-クローニングされた遺伝子断 片を既知のノ ッチリガン ド分子であるショウジョゥバエセレイ 卜、 ラッ トジャグ' ドのァ ミ ノ酸配列と比較し、 意な類似性を見出すことにより、 ヒ トセレイ ト一 1をコードしている c DN A断片であることを確認した。 参考例 2
ヒ トセレイ 卜— 1遺伝子の全長クローニング ヒ ト眙盤由来の c DN Aライブラリー （ λ g t — 1 1に c DNAが揷入された もの、 CLONTECH :製） からプラークハイブリ ダィゼーシヨ ンにて全長 c DNAを待ったクローンの検索を 1 X 1 06 相当のプラークから行った。 出現し たプ ークをナイ口ンフ ィ ルター （Hy b 0 n d N+ : Am e r s h am社製） に転写し、 転写したナイロンフィルターをアルカ リ処理 （ 1. 5 M Na C l、 0. 5 M N a OHを染み込ませたろ紙上に 7分間放置） し、 次いで、 中和処理
( 1. 5 M Na C l、 0. 5 M T r i s - HC 1 (pH 7. 2) 、 1 m EDTAを染み込ませたろ紙上に 3分間放置） を 2回行い、 次に、 SS PE溶液
( 0. 3 6 M N a C 0. 0 2 M リ ン酸ナ ト リウム （ p H 7. 7) 、 2 m EDTA) の 2倍溶液中で 5分間振とう後洗浄し風乾した。 その後、 0. 4 N a OHを染み込ませたろ紙上に 20分間放置し、 5倍濃度の S SPE溶液 で 5分問振とう後洗浄し、 再度風乾した。 このフ ィルターを用し、て放射性同位元 素32 Pにて標識されたヒ トセレイ ト— 1プローブにてスク リ一ニンケ'を行った。 放射性同位元素 32 Pにて標識された先の D N Aプローブは以下のように作成し た。 すなわち、 ヒ 卜セレイ トプライマーによる精製 P CR産物 （約 5 0 0 b p ) が組み込まれた p CR I Iより、 E c oR Iにてベクターより切り出し、 低融点 ァガロースゲルから DN A断片を精製回収した。 得られた DNA断片を DN Aラ ベリンク干ッ ト （Me g a p r i me DNA l a b e l i n g s y s t e m ： Am e r s h am社製） を用いて標識した。 すなわち、 DNA 2 5 n gにプ ライマ一液 5〃 1及び脱イオン水を加えて全量を 3 3〃 1 として沸騰水浴を 5分 間行い、 その後、 dNTPを含む反応緩衝液 1 0 w し ひ—32 P— d CTP 5 し 及び T 4 DNAポリ ヌクレオチドキナーゼ溶液 2 1を加えて、 3 7 で 1 0分間水浴し、 更にその後、 セフアデックスカラム （Q u i c k S i n C o l umn S e p h a d e x G— 5 0 ： ベ一リ ンガーマンハイム社製） で精 製し、 5分間沸騰水浴をしたのち、 2分間氷冷後使用した。 前述の方法にて作成したフィル夕一を、 各々の成分の最終濃度が 5倍濃度の S
S PE溶液、 5倍濃度のデンハルト液 （和光純薬社製） 、 0. 5 %SDS (ドデ シル硫酸ナトリゥム） 、 及び 1 0〃 gZm 1の沸騰水浴により変性したサケ精子
DNA (S i gm a让製） であるプレハイブリダィゼ一シヨン液中に浸し、 6 5 てにて 2時問振とうした後、 前述の方法で32 P標識されたプローブを含むプレハ イブリ ダィゼーシヨ ン液と同一組成のハイブリダィゼーシヨ ン液に浸し、 5 5°C にて 1 6時間振盪し、 ハイブリダィゼ一シヨンを行った。 次に、 フィル夕一を 0. 1 %SDSを含む S S P E溶液に浸し、 5 5°Cにて振 盪し 2回洗净後、 さらに 0. 1 %≤03を含む 1 0倍希釈した SS PE溶液に浸 し、 5 5 °Cにて 4回洗浄した。 洗浄を終了したフ ィ ルタ一を増感スク リーンを使 用して、 オートラジオグラフィーを行った。 その結果、 強く露光された部分のク ローンを拾い、 再度プラークを蒔き直し前述の方法にてスクリ一ニングを行い、 完全に単独のク口ーンを分離した。 単離されたファージクローンは 22クローンであった。 成書の方法に従い、 こ れらのすベてのクローンのファ一ジを約 1 X 1 09 p f u調製し、 ファージ DN Aを精製し、 制限酵素 E c 0 R Iにて消化し、 同様に E c o R Iで消化した p B l u e s c r i p t ( S t r a t a g e n e社製） に組み込んだ。 これらのクロ ーンの両端の DN A配列を DNAシークェンサ一により解析したところ、 S 1 6 および S 2 0の 2クローンは共に配列表の配列番号 4の DN AS 列の 1番から 1 8 7 3番の配列を含むクローンであり、 S 5および S 1 4の 2クローンは配列表 の配列番号 4の DN A配列の 9 9 0番から 4 0 0 5番を含むクローンであった。 これらのクローンはキロシークェンス用デリ シヨ ンキッ ト （宝酒造社製） を用い て添付の説明書に従ってデリシヨ ンミ ュータントを作製し、 DNAシークェンサ 一 （アプライ ドバイォシステム让製） を用いて 5' 方向、 3' 方向の両方向から 、 本発明のポリべプチドをコ一ドする全長の c DN A塩基配列を決定した。 二の結果、 C末端のアミ ノ酸配列をコードしている領域が 1 0 0程度クロー二 ングできていないことが判明したため、 全長遺伝子のクローニングを G I B C 0 一 BRL辻製 3' R AC Eシステムキッ トを用いて、 添付のマニュアルに従って 、 ヒ ト胎盤由来 p 0 1 y A+ RN A ( C L ONTE CH?±製） から 3 ' 方向の遺 伝子の c DNAのクローニング'を行い、 遺伝子配列を決定した。
二のように遺伝子クローニング'した 3つの遺伝子断片を配列表の配列番号 5の DNA配列の 1 2 9 3番にある制限酵素 B gl 2サイ トと 3 9 4 3番にある A c c 1サイ トを利用し、 配列表の配列番号 5の DN A配列全長を含むプラスミ ドを P UC 1 8のマルチクロ一ニングサイ 卜の E c oR l と Xb a lの間につなぎ込 み、 p UC SR— 1を作製した。 この遺伝子の配列を配列表の配列番号 5にアミ ノ酸配列とともに示す。 実施例 1
P C Rによるプローブの作製
スク リーニング用いる遺伝子プローブすなわち、 配列表の配列番号 8、 9及ひ 1 0に記載の遺伝子は次のようにして取得した。 これらの配列は各々 G e n b a n kの登録番号 T 0 8 8 5 3、 R 5 0 0 2 6及び R 4 5 7 5 1に記載の遺伝子配 列の一部に当たる。 以下、 配列番号 8の遺伝子配列を有するプローブを ¥ 1、 配 列番号 9の遺伝子配列を有するプローブを ¥2、 配列番号 1 0の遺伝子配列を有 するプローブを ¥4 とする。 すなわち、 配列表の配列番号 1 1及び 1 2の配列を有するオリゴヌクレオチド をプライマーを用いた PC Rにて配列番号 8の遺伝子を、 配列表の配列番号 1 3 及び 1 4の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマ一を用いた PC Rにて配 列番号 9の遺伝子を、 配列表の配列番号〗 5及び 1 6の配列を有するオリゴヌク レオチドをプライマーを用いた P CRにて配列番号 1 0の遺伝子を各々分離した c
PCRによる増幅は、 以下のように行った。 ヒ ト胎児脳由来 c DN A混合溶液 (QU I CK— C l o n e c DNA、 CLONTECHiJ:製） 1 は 1 を使用し 、 1 0 X緩衝液 （ 5 0 0mM KC 1、 1 0 0 mM T r i s - HC 1 ( p H 8 . 3) 、 1 5mM Mg C 1 , 0. 0 1 %ゼラチン） 5 1、 d N T P M i x t u r e (宝酒造社製） 4〃 1、 前述の組合せのブライマ一 2 0 pmo し 〃 1 を 1 1づっ、 及び Ta qDNAポリ メラーゼ （Amp 1 i T a q ：宝酒造社 製、 5 UZ 1 ) 0. 2 ^ 1を加え、 最後に脱イオン水を加えて全量を 5 0 1 として、 9 4 で 1分間、 5 5 °Cで 5分間、 7 2 °Cを 3分問からなる行程を 1サ ィクルとして、 この行程を 4 0サイクル行い、 最後に 7 2でにて 7分間放置して P CRを行った。 この P CR産物の一部を 2 %ァガロースゲル電気泳動を行い、 ェチジゥムブ口マイ ド （ 本ジーン社製） にて染色後、 紫外線下で観察し、 各々 の P C R産物が g的のサイズの遺伝子か増幅されていることを確認した。 次に、 これらの P C R産物の全量を低融点ァガロース （G I B C 0 BRL社 製） にて作製した 2 %ァガロースゲルにて電気泳動し、 ェチジゥムブロマイ ドに て染色後、 紫外線照射下にて各々のバン ドを切り出し、 ゲルと同体積の蒸留水を 加え、 6 5°Cにて 1 0分間加熱し、 ゲルを完全に溶かしたのち、 等量の TE飽和 フエノール （日本ジーン社製） を加えて、 1 5 0 0 0 r pm、 5分間遠心分離後 上清を分離し、 さらに同様な分離作業を TE飽和フニノール ： クロロフォ儿ム （ 1 : 1 ) 溶液、 さらにクロロフオル厶にて行った。 最終的に得られた溶液から D N Aをエタノール沈澱して回収した。 ベクタ一として p CR I I V e c t o r ( I n v i t o r o g e n社製、 以 下 P C R I I と呼称する） を用い、 ベクタ一と先の DN Aのモル比が I ： 3とな るように混ぜ合わせて、 丁 4 DNAリガーゼ （ I n V i t o r o g e n社製） にてベク ターに DN Aを組み込んだ。 DNAが組み込まれた p C R I Iを大腸菌 On e S h o t C omp e t e n t C e l 】 s ( I n v i t r o g e ntt 製） に遺伝子導人し、 アンピシリ ン （S i gma社製） を 5 0 g/m 1含む L - B r o t h (宝酒造社製） 半固型培地のプレートに蒔き、 1 2時間程度 3 7で に放置し、 現れてきたコロニーを無作為選択し、 同濃度のアンピシリ ンを含む L - B r o t h液体培地 2 m 1に植え付け、 1 8時問程度 3 7 °Cで振盪培養し、 菌 体を回収し、 ウイザードミニプレップ （P r ome g a社製） を用いて添付の説 明書に従ってプ スミ ドを分離し、 このプラスミ ドを制限酵素 E c 0 R Iにて fj 化して、 各々の 的のサイズの DNAか切り出されてくることで各々該 PCR產 物か組み込まれていることを確認し、 確認されたクローンについて、 組み込まれ ている DN Aの塩基配列をァプラィ ドバイオシステム社の螢光 DNAシークェン サー （モデル 3 7 3 S) にて決定し、 前述の G e n b a n kに登録されている遺 伝子配列と比較して、 目的の遺伝子、 すなわち配列表の配列番号 8、 9及び 1 ϋ の遺伝子配列を有する遺伝子が分離されていることを確認した。 実施例 2
ヒ トセレイ トー 2遺伝子の全長クロ一ニング ヒ ト眙兕脳由来の c DNAライブラリー （ λ g t— 1 0に c DNAか揷入され たもの、 C L0NTE CH社製） からプラークハイブリダィゼーシヨ ンにて全長 c DNAを持ったクローンの検索を 1 X 1 06 相当のプラークから行った。 出現 したプラークを参考例 2に記載の方法と同様にアル力リ固定した。 これらのフィ ルターを用いて参考例 2に記載した方法で放射性同位元素32 Pにて標識された実 施例 1にて分離された 3種のプローブを用いて、 各々別々にスクリーニングを行 い、 祓数のクローンを分離した。
： ί 4 単離されたファージクローンは ¥ 1をプローブとして用いた場合から 2クロ一 ン、 ¥ 2をプローブとして用いた場合から 6 クローン、 ¥4をプローブとして用 いた場合から 4 クローンであった。 但し、 ¥ 4から分離されたクローンは全て ¥ から分離されたクローンに含まれていた。 これらのすべてのクローンのファー ジを約 1 1 09 p f u調製し、 ウイザ一ドラ厶ダプレップ （ P r 0 m e g a社 製） を用いて添付の説明書に従ってファ一ジ DNAを精製し、 制限酵素 E c oR Iにて消化し、 同様に E c 0 R Iで消化した p B 1 υ e s c r i p t (S t r a t a g e n e社製） もしくは p UC 1 8 (フアルマシア社製） に組み込んだ。 これらのクロ一ンの全 DN A配列を参考例 2と同様に DN Aシークェンサ一に より決定し、 同一配列部分を比較した結果、 # 5 クローンは配列衷の配列番号 4 の DNA配列の 4 8 4番から 2 0 2 5番の配列を含むクローンであり、 # 2 1 ク ローンは配列表の配列番号 4の DNA配列の 1 8 8 2番から 3 5 3 7番の配列を 含むクローンであり、 # 8 6クローンは配列表の配列番号 4の 2 4 5 5番から 3 9 5 5番の配列を含むクローンであった。 残りのクローンは、 これらのクローン と配列が一致する部分のみからなる短いィンサ一卜しか有さないクローンであつ た。 この結果、 ヒ トセレイ ト— 1等のアミ ノ酸配列との比較から N末端のァミ ノ 酸配列をコー ドしている領域がクローニングできていなし、事が判明した。 そこで 更に、 配列表の配列番号 1 7の DNA配列を有するプローブを作成し、 5' 領域 の c DNAのクローニング 'をするために 2回目のスクリ一二ング'を行った。 プロ —ブの作成は実施例 1 に記載の方法と同様に配列表の配列番号 1 8及び 1 9の D N A配列を有する P C Rプライマーで上記の # 5クローンを踌型にして PC Rを 行い作成した。 ライブラリ一は 1回目のスクリ一二ング'と同様に調製したものを 使用し、 条件などは全く同じ方法で行った。 この様にして、 2回目のスクリ一二ングにおいて単離されたクローンは 6 クロ —ンであった。 これらのすべてのクローンのファージを約 1 X 1 09 p f u調製 し、 ウイザードラムダプレップ （P r om e g a社製） を用いて添付の説明書に 従ってファージ DNAを精製し、 制限酵素 E c 0 R Iにて消化し、 同様に E c o R Iで消化した pUC l 8に組み込んだ。 これらのクローンの全 DN A配列を参 考例 2と同様に DNAシークェンサ一により決定し、 同一配列部分を比較した結 果、 最も 5' 方向を含むと考えられたクローンとして S 4 3 - 1 クローンが分離 された。 ただし、 このクローンは配列表の配列番号 4の D N A配列の 3 8番から 1 5 3 8番の配列を含むクローンであった。 残りのクローンは、 1回目で分離さ れたクローン及び既に他のクローンで決定された配列と一致する部分のみからな る短いィンサ一 卜しか冇さないクローンであった。 この様に 2回目のスクリ一二ングでも翻訳開始のメチォニンをコ一ドする AT Gの配列が認められなかったので、 さらに 5 ' RAC E法にて 5' 方向の c DN A配列のクロ一ニングを った。 5' RAC Eは G I BCO— BR LH:製 5' R AC Eシステムキッ 卜を用いて、 添付のマニュアルにしたがって、 ヒ ト心臓由来 P o 1 y A+ RNA (C LONTE CH社製） から 5' 方向の遺伝子の c DNA のクロ一ニング 'を行い、 配列表の配列番号 4の DN A配列の 1番から 3 7番の遺 伝子配列を決定した。
以上の結果、 配列表の配列番号 4の DN A配列、 すなわちヒ トセレイ ト— 2の 全長をコードする c DN A配列を決定した。 全長遺伝子をコ一ドする c DNAを作成するために、 他のクローンとライゲー ンヨンできる 5' 端の c DN Aを得るために次のような P C Rを行い、 クロ一二 ングした。 すなわち、 配列表の配列番号 2 0の DNA配列を有するオリゴヌクレ ォチドと配列番号 2 1の DNA配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、 S 4 3 一 1 クローンを铸型にして実施例 1に記載の方法で P CRを行い、 同様に p CR I I にサブクロ一ニングして、 遺伝子配列を決定して、 配列表の配列番号 4の D NA配列の 1番から 5 0 3番の DN A配列を有するクローンを作製した。 このク ローンを S 2 - 5とする。 以上のクローン、 すなわち S 2— 5、 S 4 3 - # 5、 # 2 1、 # 8 6のク ローンの遺伝子を S 2— 5と S 4 3 - 1は配列表の配列番号 4の DN A配列の 2 1 7番目の制限酵素 S p i Iサイ トで、 S 4 3— 1 と # 5は同様に 1 4 5 3番目 の K p n Iサイ 卜で、 # 5と # 2 1は同様に 20 1 6番目の S a c Iサイ ト、 # 2 1 と # 8 6は同様に 29 9 1番目の B a mH 1サイ トを各々利用し、 最終的に 配列表の配列番号 4の DNA配列を有する DNAを p UC 1 8のマルチクロ一二 ング'サイ 卜の E c oR Iサイ トと H i n din サイ 卜の間につなぎ込み、 p UC SR- 2を作製した。 実施例 3
ヒ トセレイ ト一 2の発現臓器
ヒ トセレイ 卜一 2の mRN Aの発現を調べるため、 あらかじめ mRN Aが転写 されているフィルターである、 Huma n Mu l t i p l e T i s s u e No r t h e r n B l o t. Huma n Mu l t i p l e 丄' i s s u e No r t h e r n B l o t II ^ Huma n Mu l t i p l e T i s s u e No r t h e r n B l o t 11 K Huma n F e t a l Mu 1 t i p 1 e T i s s u e No r t h e r n B l o t [I (すべて C LONTEC H社製） を用い、 実施例 2に記載の配列表の配列番号 1 7の配列を有する DNA をプローブとして前掲の DN Aラベリ ングキッ ト （Me g a P r i m e DNA l a b e l i n g s s t em : Am e r s h a m社製） にて前述の方法で 32 P標識し、 上記のフィルターの添付の取扱説明書にしたがってハイプリ ダイゼ ーショ ンを行い発現を調べた。 その結果、 発現されている mRNAの長さは約 5 k bの一種類であった。 発現 部位としてヒ ト成人組織のうち強い発現を認めたのは、 心臓、 骨格筋、 甲状腺、 脊髄、 気管であり、 明かな発現を認めたのは脾臓、 前立腺、 精巣、 小腸、 副腎で あり、 極めて弱く しか発現が認められなかったのは脳、 胎盤、 腎臓、 胸腺、 卵巣 、 胃、 リ ンパ節であり、 全く発現が認められなかったのは肺、 肝臓、 脾臓、 結腸 、 末梢血リ ンパ球、 骨髄であった。 ヒ ト胎児組織においては胎児肺に発現が高く 、 fl 児脳、 眙児腎臓に明かな発現が認められ、 胎児肝臓には発現は認められなか つた。 実施例 4
ヒ トセレイ ト一 2発現べク夕一の作製
配列表の配列番号 4に記載の DNA配列からなる遺伝子を用いて、 次の 1 ) か ら 5 ) に举げるヒ トセレイ ト一 2およびそのキメラ夕ンパク質の発現べク夕一を 作製した。
1 ) 分泌型細胞外ヒ トセレイ ト一 2の発現べクタ一
配列表の配列番号 2のァミ ノ酸配列の 1番から 1 0 5 5番のポりぺプチドをコ 一ドする c DNAを、 S Rひのプロモ一夕一とネオマイシン耐性遺伝子を含む発 現べク夕一 pMK I TN e 0 (丸山ら、 9 】年度日本分子生物学会予稿奥、 東京 医科歯科大学丸山より人手可能） につなぎ、 発現べクタ一を作製した。 すなわち、 配列表の配列番号 4に記載の DN A配列を有するべク夕一 p UC S - 2を铸型として配列表の配列番号 23の配列を有するオリゴヌクレオチド及 び配列番号 2 の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、 上記の 方法に従い PC Rを行い、 PCR産物をクロ一ニングベクター pCR 1 Iにつな ぎ、 P C R産物の遺伝子配列を決定して、 配列表の配列番号 4の DN A配列の 2 9 8 6番から 3254番まで遺伝子配列でその 3' 端に終止コドンと制限酵素 S a 1 Iサイ トか付加されている DNAを作製した。
PUCSR- 2を制限酵素 E c oR I と B amH Iで消化して得られるおよそ 3 k b pの遺伝子断片、 上記の P C R産物をィンサ一トとして含む p C R I Iベ クタ一を制限酵素 B amH I と S a 1 Iで消化して得られるおよそ 25 0 b の 遺伝子断片、 pMK I Tn e oを制限酵素 E c oR I と Xh o Iで消化して得ら れるおよそ 4. 3 k bの遺伝子断片、 これら 3つの遺伝子断片を同時にライゲ一 シヨ ンして、 配列表の配列番号 4に DNA配列の 1番から 3 2 5 4番の遺伝子断 片を含む発現ベクター、 すなわち分泌型紬胞外ヒ ト七レイ ト一 2タンパク質 下二のタンパク質を EXS 2と呼称する） 発現ベクター pMEXS 2を作製した。 ) 分泌型細胞外ヒ トセレイ 卜— 2の F L A Gキメラタンパク質の発現
ベクター
配列 ¾の配列番 2の了ミ ノ酸配列の 1番から 1 0 5 5番のポリべプチドの C 末端に FLAG配列 （配列表の配列番号 22) をコードする c DNAを付加した キメラ夕ンパク質をコードする c DNAを、 発現べクター pMK I TN e 0につ なぎ、 発現べクタ一を作製した。 すなわち、 配列表の配列番号 4に記載の D N A配列を有するベクター p U C S R - 2を铸型として配列 ¾の配列番号 2 3の配列を有するオリゴヌクレオチド及 び配列番号 2 5の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、 上記の 方法に従い PC Rを行い、 PCR産物をクロ一ニングベクター p CR I Iにつな ぎ、 P CR産物の遺伝子配列を決定して、 配列表の配列番号 4の DN A配列の 2 9 8 6番から 3 2 5 4番まで遺伝子配列で、 その 3' 端に F L A 列をコード する DNA配列 （配列表の配列番号 22の DNA配列） と終止コ ドンと制限酵素 S a 1 〗サイ トが付加されている DNAを作製した。
PUC SR- 2を制限酵素 E c oR I と B amH Iで消化して得られるおよそ 3 k b pの遺伝子断片、 上記の PC R産物をィンサ一卜として含む p CR I Iベ ク夕一を制限酵素 B amH I と S a 1 1で消化して得られるおよそ 3 0 0 b pの 遺伝子断片、 pMK 〗 Tn e oを制限酵素 E c oR I と Xh o Iで消化して得ら れるおよそ 4. 3 k bの遺伝子断片、 これら 3つの遺伝子断片を同時にライゲー シヨンして （制限酵素 Xh 0 I と S a 1 Iは認識配列は異なるが消化された末端 遺伝子配列か相補的なためつなぐ事かできる） 、 配列表の配列番号 4に DNA配 列の 1番から 325 4番の遺伝子断片と F LAG配列をコ—ドする遺伝子断片を 含む発現ベクター、 すなわち分泌型細胞外ヒ トセレイ ト一 2の FLAGキメラ蛋 白質 （以下このタンパク質を EXS 2 FLAGと呼称する） 発現べクタ一 pME XS 2 FLAGを作製した。
3 ) 分泌型細胞外ヒ トセレイ ト— 2の 1 g G 1 F cキメラタンパク質発現
ベクター
配列 ¾の配列番号 2のァミノ酸配列の 1番から 1 0 55番のポリべプチドの C 末端にヒ 卜 1 gG 1のヒンジ部分以下の F c部分のァミノ酸配列をコードする c DNAを付加したキメラタンパク質をコードする c DNAを、 発現べク夕一 pM K 】 TNe oにつなぎ、 発現ベクターを作製した。
ィ厶ノグロブリ ン F c夕ンパクとの融合夕ンパクの作製は、 Z e t t 1 m e i s s 1 らの方法 （Z e t t l me i s s l e t a に ， DNA c e l l B i o l . , 9, 34 7 - 35 4, 1 9 9 0) にしたかって、 イントロンを含む ゲノ厶 DN Aを用いた遺伝子を利用し、 その遺伝子を P CR法を用いて作製した。 すなわち、 ヒ トゲノム DNAをテンプレートとして使用して、 ヒ ト I gG l F c部分をコードする遺伝子配列を制限酵素 B amH Iサイ トのついた配列表の配 列番号 2 8の配列を有するォリゴヌクレオチド、 制限酵素 X b a Iサイ 卜のつし、 た配列表の配列番号 2 9の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマ一として 用いて PC Rを行い、 およそに 4 Kb pのバン ドを精製し、 制限酵素 B amH I及び Xb a I (宝酒造社製） で処理をして、 同様の制限酵素処理をした p B 1 u e s c r i p tに T4 DNAリガーゼにて遺伝子をつないでサブクローニング した。 その後、 このプラスミ ド DNAを精製して、 シークェンスをして遺伝子配 列を確認し、 遺伝子配列が確かにひと 1 gG 1の重鎖のヒンジ部分にあたるゲノ 厶 DN Aであることを確認した （その配列は K a b a t e t a 1. , S e q u e n c e o f I mmu n o l o g i c a l I n t e r e s t, N I H u b l i c a t i o n N o 9 1 - 3 24 2, 1 9 9 1参照のこと） 。 以下、 このプラスミ ドを p BSh I g F cとする。 配列表の配列番号 4に記載の DN A配列を有するべクター pUC SR— 2を铸 型として配列表の配列番号 2 3の配列を有するォリゴヌクレオチド及び配列番号 2 6の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、 上記の方法に従い PCRを行い、 PCR産物をクロ一ニング 'ベクター p CR I Iにつなぎ、 PCR 産物の遗伝了-配列を決定して、 配列表の配列番号 4の DNA配列の 2 9 8 6番か ら 3 25 4番まで遺伝子配列で、 その 3' 端に制限酵素 B gl 2サイ 卜が付加さ れている DNAを作製した。 この P CR産物をィンサ一 卜として含む p CR ベクタ一を制限酵素 E c 0 R I と B gl 2消化し得られるおよそ 2 5 0 b pの遺伝子断片を、 上記のヒ ト 1 g G 1 F Cをコードする遺伝子をィンサー トとして含む p B 1 u e s c r i p t を制限酵素 E c oR I と B amH lで消化したべク夕一 （およそ 4. 3 k b p ) にライゲーシヨンしてつなぐ。 この際には制限酵素 B amH 1 と B gl 2は消化 された末端遺 子配列が相補的なためつなぐ事かできる。 また、 その後この部分 はこれらの制限酵素によって消化されない。 次いで、 このベクターを制限酵素 B amH I と No t 1で消化して得られるお よそ 1. 5 k b pの遺伝子断片、 p U C S R— 2を制限酵素 E c oR I と B am H Iで消化して得られるおよそ 3 k b pの遺伝子断片、 pMK I Tn e oを制限 酵素 E c o R I と No t 1で消化して得られるおよそ 4. 3 k bの遺伝子断片、 これら 3つの遺伝子断片を同時にライゲーションして （制限酵素 X h 0 I と S a 1 Iは認識配列は異なるか消化された末端遺伝子配列が相補的なためつなぐ事か できる） 、 配列表の配列番号 4に DN A配列の 1番から 325 4番の遺伝子断片 とヒ ト I g G 1 F cをコードする遺伝子断片を含む発現べクター、 すなわち分泌 型細胞外ヒ トセレイ トー 2の I gキメラタンパク質 （以下このタンパク質を E X S 2 F cと呼称する） 発現べクター pMEXS 2 F cを作製した。
4 ) 全長ヒ トセレイ 卜一 2夕ンパク質の発現ベクター 配列 ¾の配列番号 3のァミノ酸配列の 1番から 〖 2 1 2番のポリべプチドをコ — ドする c DNAを、 発現べクタ一 p MK I TN e 0につなぎ、 発現ベクターを 作製した。
すなわち、 pUCSR— 2を制限酵素 E c oR I と H i n d ill で消化して切 り出されてくるおよそ 4 k b pの遺伝子断片を同様の制限酵素で消化した p B 1 u e s c r i p tにライゲーシヨンし、 次いでこのべク夕一を E c oR I と Xh 0 Iで消化し切り出されてくるおよそ 4 k b pの遺伝子断片を、 発現べクタ一 p M K I T n e 0を制限酵素 E c o R I と N o t 1で消化し得られるおよそ 4. 3 k bの遺伝子断片にライゲ一ションして、 配列表の配列番号 4に DNA配列の 1 番から 3 9 5 5番の遺伝子断片を含む発現ベクター、 すなわち全長ヒ トセレイ ト 一 2タンパク質 （以下このタンパク質を F S 2と呼称する） 発現べク クー pMF S 2を作製した。
5 ) 全長ヒ トセレイ ト一 2 FLAGキメラタンパク質の発現べクタ一
配列表の配列番号 3のァミノ酸配列の 1番から 1 2 1 2番のポリべプチドの C 末端に FLAG配列 （配列表の配列番号 22) をコードする c DN Aを付加した キメラ夕ンパク質をコ一ドする c DN Aを、 発現べクター pMK I TN e oにつ なぎ、 発現べクタ一を作製した。
すなわち、 配列表の配列番号 4に記載の DN A配列を有するベクタ— p U C S 一 2を踌型として配列表の配列番号 23の配列を有するオリゴヌクレオチド及 び配列番号 27の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、 上記の 方法に従い PC Rを行い、 PCR産物をク π—ニングベクター pCR I Iにつな ぎ、 PCR産物の遺伝子配列を決定して、 配列表の配列番号 4の DN A配列の 2 9 8 6番から 3 7 25番まで遺伝子配列で、 その 3' 端に F LAG配列をコード する DNA配列 （配列表の配列番号 22の DNA配列） と終止コドンと制限酵素 S a l 1サイ 卜が付加されている DN Aを作製した。
PUCSR- 2を制限酵素 E c 0 R I と B amH Iで消化して得られるおよそ 3 k b pの遺伝子断片、 上記の PC R産物をインサートとして含む pCR I Iベ クタ一を制限酵素 B a m H Iと S a j Iで消化して得られるおよそ 70 0 b pの 遺伝子断片、 p MK I T n e 0を制限酵素 E c o R I と X h o Iで消化して得ら れるおよそ 4. 3 k bの遺伝子断片、 これら 3つの遺伝子断片を同時にライゲー シ ンして （制限酵素 X h 0 I と S a i Iは認識配列は異なるか消化された末端 遺伝 ·配列か相補的なためつなぐ事ができる） 配列表の配列番号 4に DN A配列 の 1番から 3 72 5番の遺伝子断片と F LAG配列をコードする遺伝子断片を含 む発現べクタ一、 すなわち全長型ヒ トセレイ 卜一 2の FLAGキメラタンパク質
(以下このタンパク質を F S 2 FLAGと呼称する） 発現ベクター pMFS 2 F LAGを作製した。 実施例 5
ヒ トセレイ 卜— 2発現ベクターの細胞への遺伝子導入と発現
実施例 4で作製した発現べクタ—は COS - 7細胞 （理化学研究所、 細胞開発 銀行から入手可能、 RCB 0 5 3 9 ) に遺伝子導入した。
遺伝子導入前の細胞の培養は D— MEM (ダルベッコ改変 MEM培地、 G 1 B じ0- 81¾し社製） 1 0 %FCSにて培養した。 遺伝子導入の前口に細 fl の培地 を交換し、 細胞数を 5 X 1 07 c e 1 1 s/m 1にして一晩培養した。 遺伝子導 人の当日、 遠心分離にて細胞を沈澱させ、 PBS (-） にて 2回遠心洗浄後、 1 m Mg C 12 、 PBS (一） に 1 x 1 07 e e l 1 s Zm 1 となるようにし て細胞を調製した。 遺伝子導入は B i 0— R a d社製遺伝子導入装置ジーンパル サーを用いたエレク トロポレ一シヨン法で行った。 上記の細胞懸濁液を 5 0 0〃 1エレク トロポレーショ ン専用セル （ 0. 4mm) に取り、 発現ベクターを 2 0 〃 g加え、 氷中で 5分問放置した。 その後、 3〃F, 4 5 0 Vの条件で 2回電圧 をかけ、 その 2回の間は 1分間室温で放置した。 その後、 氷中で 5分間放置後、 上記の培地 1 0m lをあらかじめ分注した直径 1 0 cm細胞培養用ディシュに細 胞を播種し、 37て、 5 %炭酸ガスインキュベーターで培養した。 その翌日、 培養上清を除去し、 ディ ッシュに付着した細胞を P BS (—） 1 0 m 1で 2回洗浄し、 無血清の D— MEM 1 0m l を加えてさらに 4 日間培養し、 発現べクタ一 pMEXS 2、 PMEXS 2 FLAG及び pMEXS 2 F cを遺伝 子導入した場合に関しては培養上'清を回収し、 セン トリコン 3 0 (了ミコン社製） にてバッファ一を P B S (—） に置換すると同時に 1 0倍濃縮を行った。
また、 pMF S 2及び pMF S 2 F L A Gを遺伝子導入した場合に閱しては、 同様に 4日間の培養後、 細胞を P B S (―) 1 0 m lで冼浄し、 セルスクレイパ 一 （コース夕一社製） にて細胞を剥がし、 再度 P BS (-） を 1 Om l加えて、 1 5 0 0 r p mで 5分間遠心分離し洗浄した。 この細胞沈殿物をセルリシスバッファー [5 OmM He p e s ( p H 7. 5 ) 、 1 % T r i t o n X 1 0 0 , 1 0 % グ'リセロール、 4 mM E D T A、 5 0 g /m 1 Ap r o t i n i n、 1 0 0 M L e u p e p t i ru 2 5 uM P e p s t a t i n A, 1 mM PMS F] 5 0 0 /^ 1 に懸濁し、 氷中に 2 0分問放置し、 その後 1 5 0 0 0 r pmで 2 0分間遠心し上淸を取り細胞抽出 液を得た。 こうして得られたサンプルを用いてゥヱス夕ンブロッティ ング法にて F LAG キメラ蛋白とィムノグロブリ ンキメラ蛋白の発現を確認した。 すなわち、 上記の 得られた細胞上清濃縮液もしくは細胞抽出液を AC I ジャパン社製の SD S - P AGE用電気泳動槽及び SDS— PAGE用ポリアクリルアミ ドゲル （グ'ラジェ ン トゲル 5〜 1 5 %) を用い、 添付の取扱い説明書に従って SDS— PAGEを おこなった。 サンプルは 2—メルカプトエタノール （ 2— M E ) を加えて 5分間 の沸騰水浴加熱処理により還元処理を行ったもの、 もしくはこの処理を行わない 非還元状態のものを用い、 マ一カーとしては Am e r s h am社製レィンボーマ 一力一 （高分子量用） を用い、 サンプルバッファ一、 泳動バッファーについては 添付の取扱い説明書に従って作製した。 SDS - PAGE終了後、 アクリルアミ ドゲルを P VD Fメンブランフ ィルター （ B i 0 R a d社製） に B i o R a d社 製ミニトランスブロッ 卜セルにより転写した。 二のように作製されたフィ ルターをブロッ クエース、 TB S— T [ 2 0 mM T r i s、 1 3 7 mM N a C 1 ( p H 7. 6) 、 0. 1 %Tw e e n 20] に 4 °C 晚振 ¾してブロッキングした。 E C Lウエスタンブロッテイ ング'検出シ ステム （Ame r s h am社製） に添付の説明害に従い、 目的のタンパク質か F LAGキメ の場合は一次抗体としてマウスモノ クロ一ナル抗体 An t i - F L AG M2 (コダッ ク社製） 、 二次抗体としてペルォキシダ一ゼ標識抗マウス I g羊抗体 （Am e r s h a m社製） を反応させた。 また、 ヒ ト I g G 1 F cキノ ラの場合は、 ペルォキシダーゼ標識抗ヒ ト I gヒッジ抗体 （Ame r s h am社 製） を反応させた。 抗体の反応時問は各々室温で一時問反応させ、 各反応間は、 TBS—丁にて 1 0分問室温で振盪洗浄する操作を 3回ずつ繰り返した。 最後の 洗浄後、 フ ィ ルターを ECLウエスタンプロッティ ング検出システム （Ame r s h am社製） の反応液に 1分間浸し、 ポリ塩化ビニリデンラップに包んで X線 フィル厶に感光させた。 その結果、 発現べクタ一 pMEXS 2 FLAGを遺伝子導入した COS上清か ら A n t i -FLAG M 2抗体によりおよそ 1 3 5 Kダル卜ンの分子量を有す るバン ドか検出され、 目的のタンパク EXS 2 FLAGを産生していることが確 認され、 発現べクタ一 PMEXS 2 FLAGにより形質転換された紬胞を得た。 また、 SDS - PAGEの際の還元処理の有無による分子量にほとんど変化は無 かった。 また、 アミ ノ酸配列から予想される分子量に比べおよそ 20 Kダル トン 程度大きく楗鎖が付加されていると考えられた。 また、 発現べクタ一 pMEXS 2 F cを遺伝子導入した COS上清から抗ヒ ト I gヒッジ抗体により、 SDS— PAGEにおいて還元条件下の場合にはおよそ 1 6 5 Kダルトンの分子量を有するバン ドが検出され、 非還元条件下ではおよそ 3 3 0 Kダルトンの分子量を有するバンドが目的の夕ンパク EXS 2 F Cを産生 していることか確認され、 発現ベクター pME X S 2 F cにより形質転換された 細胞を得た。 還元条件下の EXS 2 F cの分子量が非還元条件下のそれのおよそ ^分であることから、 この EXS 2 F cはジスルフ ィ ド結合を介した 2量体を形 成している。 また、 同様にアミ ノ酸配列から予想される分子量に比べおよそ 4 0 Kグ a卜ン程度大きく糖鎖が付加されていると考えられた。 さらに、 発現ベクター pMFS 2 F LAGを遺伝子導入した COS細胞抽出液 から A n t i - F LAG M 2抗体により、 還元条件下でおよそ 1 5 0 Kダルト ンの分了- を有するバン ドが検出され、 的のタンパク F S 2 F L AGを産生し ていることが確認され、 発現べクタ一 pMFS 2 FLAGにより形質転換された 細胞を得た。 また、 同様にアミ ノ酸配列から予想される分子量に比べおよそ 2 0 Kダルトン程度大きく、 細胞外部分に糖鎖か付加されていると考えられた。
また、 キメラタンパク以外に関しては、 ウェスタンプロッ トの際の ί次抗体と して、 実施例 7に記載の抗ヒ トセレイ ト— 2マウスモノ クロ一ナル抗体及び抗ヒ トセレイ トー 2ゥサギポリ クローナル抗体を用い、 二次抗体としてペルォキシダ —ゼ摞識抗マウス 1 g羊抗体 （Am e r s h a m社製） もしくはペルォキシダ一 ゼ標識杭ゥサギ I g羊抗体 （Ame r s h am社製） を H 、同様に行った。 その結果、 発現べクタ一 PMEXS 2を遺伝子導入した COS上清中に、 およ そ 1 3 5 Kダルトンの分子量を有するバン ドか検出され、 目的のタンパク EXS 2を産生していることか確認され、 発現ベクター pMEXS 2により形質転換さ れた細胞を得た。 また、 SDS - PAGEの際の還元処理の有無による分子量に ほとんど変化は無かった。 また、 発現ベクター pMF S 2を遺伝子導入した CO S紬胞抽出液から還元条件下でおよそ 1 5 0 Kダルトンの分子量を有するバン ド か検出され、 目的のタンパク F S 2を産生していることが確認され、 発現べクタ 一 PMFS 2により形質転換された細胞を得た。 いずれの場合 ァミ ノ酸配列か ら予想される分子量に比べおよそ 20 Kダル卜ン程度大きく、 細胞外部分に糖鎖 が付加されていると考えられた。 これらの実験では、 コン トロールとして pMK I TNe oべク夕一を導入した COS- 7細胞の紬胞破砕物および培養上谙を同様に試験したが、 抗 F L A G抗 体、 抗ヒ 卜 I g抗体、 抗ヒ トセレイ トー 2杭体に反応するバン ドは検出されなか つた。 実施例 6
遺伝子導入細胞による分泌型細胞外ヒ トセレイ ト一 2 キメラ夕ンパク質の精製
実施例 5の方法で発現べクタ一 PMEXS 2 F LAGもしくは PMEXS 2 F cにより形質転換された COS - 7細胞培養上清を大量調製し、 ァフ ィ二ティー カラムによってキメラ夕ンパク K、 すなわち Ε X S 2 F LAGもしくは EXS 2 F cを精製した。
Ε X S 2 FLAGに関しては、 実施例 5に記載した方法によって取得した 2 リ ッ 卜ルの培養上淸を A n t i — FLAG M 2 A f f i n i t y G e l (コ ダック社製） を充塡したカラムに通して、 キメラタンパク質か有する FLAG配 列とゲルの A n ΐ i ― F LAG抗体のァフィニティーによりキメラ蛋白 ¾を力ラ ムに吸着させた。 カラ厶は内径 1 Ommのディスポカラ厶 （B i 0 r a d社製） を用い、 上記ゲルを 5 m 1充塡した。 吸着は培地ボトル→カラム■→ペリスターポ ンプ—培地ボトルの環流式回路を組み立て、 流速 1 m 1 Z分て 72時間循環させ た。 その後、 カラムを P B S (―) 3 5m lで洗浄し、 0. 5 MT r i s—グリ シン （pH 3. 0 ) 5 0m lで溶出した。 あらかじめ小チユ ーブ （ファルコン社 製 2 0 6 3 ) に 0. 5MT r i s— HC 1 (p H 9. 5) を 2 0 0〃 1分注して おき、 溶出液は 2m 1ずつ 2 5画分をそのチューブに分取し、 各々の画分を中和 した。 上記の方法で精製された EXS 2 FLAGの溶出画分の各 1 0 1は実施例 5 に記載の還元処理を行い、 5— 1 5 %濃度勾配ポリアクリルアミ ドゲルによる S DS - PAGE電気泳動を行い、 電気泳動終了後、 和光純薬社製ヮコー銀染キッ ト I Iを用いて、 添付の説明書に従って銀染色を行った。 結果として、 EXS 2 F LAGは第 4番から第 8番の溶出画分にバン ドが検出され、 この分子量は実施 例 5で得られた抗 F L A G抗体によるゥヱスタンプロッテイ ング'の結果と一致し た。 この結果から EXS 2 F LAGの純品が精製された。
E X S 2 F cに関しては、 ^様の操作で培養上清の 2 リ ッ トルをファルマシア 社製 P r o t e i n Aセファロースカラムに吸着させ、 溶出画分を分取した。
EX S 2 F LAGと同様に溶出液の一部を用いて、 還元条件での S D S - PA GE^気泳動および銀染色により溶出画分の決定、 サイズの確認、 純度検定を行 つた。 結果として、 溶出画分の第 4番から第 1 5番にバン ドが検出され、 それら の分子量は実施例 5の結果と一致した。 この結果から E X S 2 F cの純品か精製 された。 実施例 7
ヒ トセレイ ト一 2を認識する抗体作成
実施例 6に記載の方法で精製された EXS 2 F LAGを免疫原としてゥサギに 免疫して、 抗体価の測定後、 全血の採血を行い、 血清を採取して、 B i o R a d 辻製のェコノパック血清 I gG精製キッ 卜を用いて、 添付の取扱い説明書に従つ て、 抗ヒ トセレイ ト— 2ゥサギポリ クローナル抗体を精製して作製した。
また、 実施例 6に記載した方法で精製された EXS 2 F LAGを免疫原として 、 成書の方法に従いマウスモノクローナル抗体を作成した。 すなわち、 上記のよ うに精製された HSFLAGを B a 1 b/cマウス （日本エスエルシー社製） に 1匹あたり 1 0 gを皮下 '皮内に免疫した。 2回の免疫後、 眼底採血を行い血 清中の抗体価の上昇を認めた後、 3回目の免疫を行つてからマウスの脾臓細胞を 取り出し、 マウスミエローマ細胞株 P 3 X 6 3 Ag 8 (ATCC T I B 9 ) と ポリエチレングリコール法にて細胞融合を行った。 HAT培地 （口本免疫生物研 究所製） にてハイプリ ドーマを選択し、 酵素抗体法にてヒ トセレイ トの細胞外部 分を認識する抗体を培地中に産生しているハイプリ ドーマ株を分離し、 ヒ トセレ ィ トを特異的に認識するマウスモノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマ産 生株か樹立された。 このようにして樹立されたハイブリ ド一マの培養上清をフアルマシア社製 M a b T r a p G 1 Iを fflいて、 添付の取扱い説明書に従って、 抗ヒ トセレイ ト 一 2マウスモノ クロ一ナル抗体を精製し作製した。
このモノ クローナル抗体を用いてァフィニティ一カラムを作製した。 ァフィ二 ティ 一カラムの作製はファルマシア社製 CNB r活性化 S e p h a r o s e 4 B にて添付の取扱い説明書に従い行つた。 力ップリ ング効率は 9 9. 6 %であつた 。 このゲルの 2 m 1 を 2 cmx 1 c mのサイズのカラムを作製した。
このカラムに対し E X S 2を含む細胞培養上淸を実施例 5に記載の方法で作成 し、 その濃縮液を 2 Om 1 Zh rの速度で流し、 その後同一-速度で P B S (-） を 1 5 m 1流して洗浄し、 最終的に 0. 1 M酢酸ナト リウム、 0. 5 M N a C 1 ( P H 4. 0 ) にて溶出した。 この溶離液を 1 m 1づっ分取し、 各画分に 1 M
T r i s - HC 1 (p H 9. 5 ) を 2 0 0 1づっ加えて、 中和した。
さらに実施例 5に記載の方法に従って、 精製蛋白質を還元条件下で SDS - P AGEを行い、 銀染色、 及びウエスタンブロッテイ ング'を行ない、 分子 の推定 を行った。 この結果、 約 1 4 0 kダルトンのバン ドが検出された。 したかって、 このモノ クローナル抗体でウェス夕ンブロッ トか可能であり、 またこのァフ ィ二 ティーカラムでヒ トセレイ ト一 2が精製可能である。 実施例 8
ヒ トセレイ ト— 2タンパクの血液未分化細胞のコロニー
形成に対する作用
ヒ トセレイ 卜 - 2の血液未分化細胞に対する生理作用を観察するため、 CD 3 4陽性細胞を E X S 2 F cおよび既存のサイ ト力ィン存在下で無血清半固形培地 で培養し、 コロニー形成細胞の増減を観察した。
ヒ ト臍帯血もしくはヒ ト正常骨髄血の CD 3 4陽性紬胞は臍帯血もしくは成人 正常骨髄血をシリカ液 （IH本国免疫生物研究所製） により添付の説明書にしたが つて処理し、 その後フイコールパック （スエーデン国フアルマシア社製） による 比重遠心分離法により低密度細胞画分 （く し 0 7 7 g/m 1 ) を分画した単核 球より分離した。
CD 3 4陽性細胞の分離は、 ノルゥ —国 D y n a 1社製 D y n a b e a d s - 4 5 0 C D 3 4 と D ETA C H a B EAD S CD 3 4を用い、 添付の取 扱説明書に従って分離した。 分離後、 その純度は F I TC標識抗 C D 3 4抗体 H P C A 2 (米国べク トンデッキンソン社製） で染色し、 同社のフローサイ トメ一 夕一 （FAC S C a l i b u r ) にて検定し、 8 5 %以上の純度を有しているこ とを確認して用いた。
二のようにして分離した CD 3 陽性細胞 4 0 0個か下記の培地 1 m 1中に存 在するように均一に懸濁し、 3 5 mnディ ッシュ （米国ファルコン辻製） にまき 、 3 7 °C\ 5 %炭酸ガス、 5 %酸素ガス、 9 0 %窒素ガス、 1 0 0 %湿度雰囲気 下の炭酸ガスインキュベーターで 2週問の培養後、 形成された血球コロニーを倒 立顕微鏡下で計測した。 培養に用いた培地は、 ひ一 m e d i urn (米国 G 〗 B C〇一 BR L製） に 2 % D e i o n i z e d B o v i n e S e r um A l b um i n (B SA、 米 国 S i gm a社製） 、 1 0 gZin l ヒ トインスリ ン （米国 S i g m a社製） 、 2 0 0 w g/m 1 卜ランスフヱ リ ン （米国 S i gm a社製） 、 1 0 — 5 M 2一メルカプトエタノール （日本国ナカライテスク社製） 、 1 6 0 〃 g/m 1 ソ ィビーンレ クチン （米国 S i gm a社製） 、 9 6 g/m 1 コレステロール （米 国 S i gm a社製） 、 0. 9 %メチルセルロース （日本国和光純薬社製） で行つ た。 上記の培地に下記条件のサイ トカイン存在下に対し、 最終的に 1 は g/m 1の 濃度となるようにヒ トセレイ ト一 2細胞外】 gキメラ蛋白質 （E X S 2 F c ) を 加え、 比較区には I gGF c部分の影響を見るため、 ヒ ト I gG l (米国 A t h e n s R e s e a r c h a n d T e c h n o 】 o g y社製） を同濃度加え た。 サイ ト力イ ン条件は、 l O O n gZm l ヒ 卜 SCF、 l O n gZm l ヒ 卜 I L— 3、 1 0 0 11 £ /111 1 ヒ ト 1 し_ 6、 2 U/m 1 E p o (日本国中外製薬 社製） 、 1 0 n gZm 1 ヒ ト G— CSF (日本国中外製薬社製） で行った。 その 結果を第 1 ¾に示す。 CD 34 + 細胞 4 0 0個当たりのコロニー数を n = 3の平 均値として示し、 4種の異なったさい帯血由来細胞で行った。
第 1表
EXS 2 F c非添加 E X S 2 F c添加 実験 1 3 0. 1 1 2. 8
実験 2 4 8. 3 4 0. 7
実験 3 38. 2 28. 1
実験 4 5 0. 9 3 7. 1 第 1表の結果から、 4種の異なった臍帯血由来血液未分化細胞に対していずれ も作用し、 本発明のヒ トセレイ ト - 2は血液幹細胞を含む血液未分化細胞の分化 を抑制する活性を有していることが明らかとなった。 実施例 9
ヒ トセレイ ト一 2の血液未分化細胞 LTC一 I Cの
液体培養に対する作用
ヒ トセレイ ト - 2の血液未分化細胞に対する生理作用を観察するため、 臍帯血 CD 34陽性細胞を E X S 2 F cおよび既存のサイ 卜力イン存在下で無血淸培地 で 2週間液体培養し、 現在最も未分化な血液細胞群と考えられる LTC - I Cの 増減を観察した。
実施例 8に記載した方法で分離した臍帯血単核球 C D 34陽性細胞を 1 0 0 0 0 0から 2 0 0 0 0個を下記の培地で 2週間培養し、 培養前区、 E X S 2 F c存 在区、 比較区の 3つの実験区に存在する LTC - I C数の違いを調べた。 液体培養に用いた培地はひ一 m e d i umに 2 % B S A、 1 0 gZm 1 ヒ ト イ ンス リ ン、 2 0 0 g ΖΙ 1 卜ランスフニ リ ン、 4 0 g Zm 1低密度リポプ 口ティン、 1 0 — 5 M2—メルカプトェタノ一ルを加え、 更に 1 0 0 n g/m 1 ヒ ト S C F、 1 0 n g/m l ヒ ト I L— 3、 1 0 0 n g/m l ヒ ト I L— 6加え た培地を用い、 これに EX S 2 F cを 1 〃 g/m 1加え、 比較区には前述のヒ ト 1 g G 1 を同濃度加えた。
LTC一 I Cに使用するヒ 卜骨髄ストロ一マ細胞層の作製、 限界希釈法による L TC一 1 Cの頻度の定量は S u t h e r 1 a n dらの方法 （B 1 o o d、 7 4 、 1 5 6 3 -、 1 9 8 9 ； P r o c . N a t l . A c a d. S c i . U S A, 8 7、 3 5 8 4 -, 1 9 9 0 ) に従って行った。 すなわち、 実施例 8で得られた分離前のシリ力液処理しない骨髄単核球を 1 〜 2 1 07 細胞を 1 Mハイ ドロコルチゾン （日本国日本ァップジョン社製） 添 加した L TC培地 （My e 1 0 C u 1 t、 カナダ国 S t em C e l l T e c h n o 1 o g i e s社製） 5 m l で T一 2 5 フラスコ （米国フアルコン 製） に て、 3 7°C、 5 %炭酸ガス、 1 0 0 %湿度雰囲気下の炭酸ガスイ ンキュベーター 中で培養し、 付着細胞層であるストローマ細胞形成が底面積の 8 0 %以上の状態 になるまで培養し、 その後トリプシン EDTA液 （日本国コスモバイオ社製） で 処理して剝かした。 9 6穴プレー 卜 （米国べク トンデッキンソ ン社製） に 1 ゥェ ルあたり約 2 X I 04 個蒔き、 再度培養を同培地にて培養を続け、 ストローマ細 胞の再構成を行った後、 2 5 0 K i l o v o l t P e a kの X線を 1 5 G y照 射して、 ス卜ローマ細胞の増殖とストローマ細胞中の血液細胞を除去した物をス トローマ細胞層として実験に用いた。 上記の方法で培養した各実験区の細胞を LTC - 1 Cアツセィに共するにあた つて、 1 ゥヱルあたり培養前の C D 3 4陽性細胞細胞は 2 5〜 4 0 0個、 培養後 の各実験区の細胞は 6 2 5〜 2 0 0 0 0個の範囲で 6段階希釈し、 上記のストロ 一マ細胞形成した 9 6穴プレー卜にて、 1希釈段階について 1 6ゥ ルで共培養 行った。 培養の培地はス卜口—マ形成で用いた培地、 条件は 3 7て、 5 %炭酸ガ ス、 1 0 0 %湿度^囲気下の炭酸ガスインキュベータ一中で 5週間にわたって培 養を行った。 培養後の細胞は 1 ゥエルづっ浮遊細胞、 付着細胞とも回収し、 a— m e d i un^ O . 9 %メチルセル ス、 3 0 %牛胎児血清 （ F C S、 日本国 I CNバイオメディ カルジャパン社製） 、 1 %B SA、 1 0 — 5 M 2— メ ルカプ 卜エタノール、 I 0 0 n gZm 1 ヒ 卜 S C F、 1 0 11 01 1 ヒ ト 1 しー 3、 1 0 0 n gZm 1 ヒ ト 1 L— 6、 2 U/m 1 E p o、 l O n g/m l ヒ ト G— C S F添加した半固形培地に移し、 2週間の培養後、 実施例 8同様のコロニー形成 細^の検出を行い、 コロニー形成細^が存在したゥ ル数を検出した。 このデー 夕をもとに T a s w e 1 1 らの方法 （J. I mm u n o l . , 1 2 6、 1 6 1 一、 1 9 8 1 ) に従って LTC一 I Cの頻度の算出を行った。 結果を第 2表に示 す。
第 2表 培養前 E X S 2 F c非添加 E X S 2 F c添加 全細胞数 1 9 4 7 5 1 2 1 0 0 0 0 9 3 0 0 0 0
L TC - 1 C数 1 8 5 2 3 5 第 2表の結果からヒ トセレイ トー 2は LTC一 I Cに作用し、 その数を減少さ せる作用を有していることが明らかとなった。 実施例 1 0
ヒ トセレイ ト一 2の血管内皮細胞増笳に及ほす変化
血管内皮細胞は、 日本国クラボウ社製の正常ヒ 卜大動脈血管内皮細胞と正常ヒ 卜肺動脈血管内皮細胞のそれぞれ 4次継代培養細胞を用いた。 細胞は、 3次培養 の継代時に組織培養用 9 6ゥエルプレート （米国ファルコン社製） に 5 0 0細胞 数ノウエルズずつ蒔き、 日本国クラボウ社製のヒ トリコンビナント E G Fを I 0
0 n g/m 1、 ヒ トリコン ビナン ト F G F— Bを 5 n g 1各々含冇する低血 清血管内皮細胞増殖用培地 （H u M e d i a - E G 2、 H本国クラボウ社製） 中 で培養し、 その際、 最終的に 1 gZm】 の^度となるようにヒ 卜セレイ 卜一 2 細胞外 I gキメラ蛋白質 (E XS 2 F C ) を加え、 比例区には I g G F c部分の 影響を SIるため、 ヒ ト I g G l (米国 A t h e n s R e s e a r c h a n d T e c h n o l o g y社製） を同濃度加えた。 尚、 対照は H uM e d i a - E G 2以外の添加蛋白質無しの条件で培養を行った。 培養は 3 7°C、 5 %炭酸ガス 、 1 0 0 %湿度雰囲気下て 3日間行った後に、 紬胞を計数した。 血管内皮細胞の計数は、 B o r e n f r e u n dと P u e r n e r ( J o u r n a 1 o f T i s s u e C u l t u r e M e t h o d s 9 ( 1 ) ， 7 一 9， 1 9 8 4 ) によって開発された方法、 すなわち、 生体染色色素の n e u t r a 1 r e d ( 3 - am i η ο - 7 - d i m e t h y 1 am i η ο - 2 -m e t h y l p h e n a z i n e h y d r o c h l o r i d e ) が生きている細胞 においてのみ原形質膜を通りリソソ一ムに蓄積されることを利用したニューラル レッ ド法を原理とした日本国クラボゥ社製の NR試薬セッ 卜を用い、 5 4 0 nm の吸光度は口本国日本ィンターメ ッ ド社製ィ厶ノ リーダー （N J— 2 0 0 0 ) て 測定した。 その結果、 大動脈血管内皮細胞の場合は、 対照区では吸光度の値か Op t i c a 1 D e n s i t y (OD) として 0. 2 1 ± 0. 0 2であり、 ヒ ト I g G l 添加区ではほぼ同様な 0. 2 0 ± 0. 0 1であったが、 E X S 2 F c添加区では 0. 1 0 ± 0. 0 2でありと著名に少なかった。 また、 肺動脈血管内皮細胞の場 合は対照区では 0. 1 5 ± 0. 0 1であり、 ヒ ト I g G 1添加区ではほぼ同様な 0. 1 6 ± 0. 0 2であったか、 EX S 2 F c添加区では 0. 0 7 ± 0 0 2で ありと著名に少なかった。 これらの結果から、 E X S 2 F cは血管内皮細胞の増 殖を抑制することがわかった。 発明の効果
本発明のヒ トセレイ ト— 2は、 未分化細胞の分化を制御する作 fflを有し、 新し し、細胞の分化制御剂として使用できる。
配列表
配列番号 ： 1
配列の長さ ： 2 1 4
配列の ¾ ： アミ ノ酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： アミ ノ酸
起源
生物名 ： ヒ ト
配列
Met Gly Tyr Phe Glu Leu Gin Leu Ser Ala Leu Arg Asn Val Asn Gly
1 5 10 15
Glu Leu Leu Ser Gly Ala Cys Cys Asp Gly Asp Gly Arg Thr Thr Arg
20 25 30
Ala Gly Gly Cys Gly His Asp Glu Cys Asp Thr Tyr Val Arg Val Cys
35 40 45
Leu Lys Glu Tyr Gin Ala Lys Val Thr Pro Thr Gly Pro Cys Ser Tyr
50 55 60
Gly His Gly Ala Thr Pro Val Leu Gly Gly Asn Ser Phe Tyr Leu Pro 65 70 75 80
Pro Ala Gly Ala Ala Gly Asp Arg Ala Arg Ala Arg Ala Arg Ala Gly
85 90 95
Gly Asp Gin Asp Pro Gly Leu Val Val tie Pro Phe Gin Phe Ala Trp
100 105 110
Pro Arg Ser Phe Thr Leu He Val Glu Ala Trp Asp Trp ASP Asn Asp
115 120 125
Thr Thr Pro Asn Glu Glu Leu Leu He Glu Arg Val Ser His Ala Gly 130 135 140 Met He Asn Pro Glu Asp Arg Trp Lys Ser Leu His Phe Ser Gly His 145 150 155 160
Val Ala His Leu Glu Leu Gin lie Arg Val Arg Cys Asp Glu Asn Tyr
165 170 175
Tyr Ser Ala Thr Cys Asn Lys Phe Cys Arg Pro Arg Asn Asp Phe Phe
180 185 190
Gly His Tyr Thr Cys Asp Gin Tyr Gly Asn Lys Ala Cys Met Asp Gly
195 200 205
Trp Met Gly Lys Glu Cys
210 214 配列番号 ： 2
配列の長さ ： 1 0 5 5
配列の型 ： アミ ノ酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類： アミ ノ酸
起源
生物名 ： ヒ 卜
配列
Met Gly Tyr Phe Glu Leu Gin Leu Ser Ala Leu Arg Asn Val Asn Gly
1 5 10 15
Glu Leu Leu Ser Gly Ala Cys Cys Asp Gly Asp Gly Arg Thr Thr Arg
20 25 30
Ala Gly Gly Cys Gly His Asp Glu Cys Asp Thr Tyr Val Arg Val Cys
35 40 45
Leu Lys Glu Tyr Gin Ala Lys Val Thr Pro Thr Gly Pro Cys Ser Tyr 50 55 60 8 S
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965 970 975
Ala Val Ala Arg Asp Arg Leu Leu Val Leu Leu Cys Asp Arg Ala Ser
980 985 990
Ser Gly Ala Ser Ala Val Glu Val Ala Val Ser Phe Ser Pro Ala Arg
995 1000 1005
Asp Leu Pro Asp Ser Ser Leu He Gin Gly Ala Ala His Ala [le Val
1010 1015 1020
Ala Ala He Thr Gin Arg Gly Asn Ser Ser Leu Leu Leu Ala Val Thr 1025 1030 1035 1040
Glu Val し ys Val Glu Thr Val Val Thr Gly Gly Ser Ser Thr Gly
1045 1050 1055 配列番号 ： 3
配列の長さ ： 1 2 1 5
配列の型 ： アミ ノ酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： アミ ノ酸
起源
生物名 ： ヒ ト
配列
Met Gly Tyr Phe Glu Leu Gin Leu Ser Ala Leu Arg Asn Val Asn Gly
1 5 10 15
Glu Leu Leu Ser Gly Ala Cys Cys Asp Gly Asp Gly Arg Thr Thr Arg
20 25 30
Ala Gly Gly Cys Gly His Asp Glu Cys Asp Thr Tyr Val Arg Val Cys
35 40 45 e 9
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290 295 300
Tyr Arg Cys Thr Cys Pro Asp Gly Tyr Ser Gly Arg Asn Cys Glu Lys 305 310 315 320
Ala Glu His Ala Cys Thr Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys
325 330 335
His Glu Val Pro Ser Gly Phe Glu Cys His Cys Pro Ser Gly Trp Ser
340 345 350
Gly Pro Thr Cys Ala Leu Asp I le Asp Glu Cys Ala Ser Asn Pro Cys
355 360 365
Ala Ala Gly Gly Thr Cys Val Asp Gin Val Asp Gly Phe Glu Cys He
370 375 380
Cys Pro Glu Gin Trp Val Gly Ala Thr Cys Gin Leu Asp Ala Asn Glu 385 390 395 400
Cys Glu Gly Lys Pro Cys Leu Asn Ala Phe Ser Cys Lys Asn Leu lie
405 410 415
Gly Gly Tyr Tyr Cys Asp Cys He Pro Gly Trp Lys Gly ile Asn Cys
420 425 430
His Ile Asn Val Asn Asp Cys Arg Gly Gin Cys Gin His Gly Gly Thr
435 440 445
Cys Lys Asp Leu Val Asn Gly Tyr Gin Cys Val Cys Pro Arg Gly Phe
450 455 460
Gly Gly Arg His Cys Glu Leu Glu Arg Asp Lys Cys Ala Ser Ser Pro 465 470 475 480
Cys His Ser Gly Gly Leu Cys Glu Asp Leu Ala Asp Gly Phe His Cys
485 490 495 5 9 Ζί SU OU 90Z J9S io sAq 丄 Aio OJd OJd SA3 BJV SAO Sjy JM1 dsy A19
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1170 1175 1180
Arg Pro Ala His Trp Ala Ser Gly Pro Lys Val Asp Asn Arg Ala Val
1185 1190 1195 1200
Arg Ser lie Asn Glu Ala Arg Tyr Ala Gly Lys Glu
1205 1210 1212 配列番号 4
配列の長さ 3 9 5 5及び 1 2 3 8
配列の型 核酸及びァミノ酸
鎖の数 二本鎖及び一本鎖
トポロジー 直鎖状
配列の ft類 c DN A to mRNA, 及びアミノ酸
起源
生物名 ヒ 卜
配列
T CGCGGGGGCA ATG CGG GCG CAG GGC CGG GGG CGC CTT CCC 41
Met Arg Ala Gin Gly Arg Gly Arg Leu Pro
-26 -25 - 20
CGG CGG CTG CTG CTG CTG CTG GCG CTC TGG GTG CAG GCG GCG CGG CCC 89
Arg Arg Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Trp Val Gin Ala Ala Arg Pro
- 15 -10 -5 -1
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Met Gly Tyr Phe Glu Leu Gin Leu Ser Ala Leu Arg Asn Val Asn Gly
1 5 10 15
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配列の長さ 4 0 0 5及び 1 1 9 9
配列の型 核酸及びァミ ノ酸
鎖の数 二本鎖及び一本鎖
卜ポロジー 直鎖状及び不明
配列の種類 c D N A to m R N A , 及びァミ ノ酸
起源
生物名 ヒ
配列
GGCCGGCC CGCGAGCTAG GCTGGTTTTT TTTTTTCTCC CCTCCCTCCC -18 CCCTTTTTCC ATGCAGCTGA TCTAAAAGGG AATAAAAGGC TGCGCATAAT CATAATAATA 108 AAAGAAGGGG AGCGCGAGAG AAGGAAAGAA AGCCGGGAGG TGGAAGAGGA GGGGGAGCGT 168 CTCAAACAAG CGATCAGAAT AATAAAAGGA GGCCGGGCTC TTTGCCTTCT GGAACGGGCC 228 GCTCTTGAAA GGGCTTTTGA AAAGTGGTGT TGTTTTCCAG TCGTGCATGC TCCAATCGGC 288 GGAGTATATT AGAGCCGGGA CGCGGCGGCC GCAGGGGCAG CGGCGACGGC AGCACCGGCG 348 GCACCACCAG CGCGAACAGC AGCGGCGGCG TCCCGAGTGC CCGCGGCGCC CGGCGCAGCG 408
ATG CGT TCC CCA CGG ACG CGC GGC CGG TCC GGG CGC CCC CTA AGC 453
Met Arg Ser Pro Arg Thr Arg Gl y Arg Ser G l y Arg Pro し eu Ser
- 31 -30 -25 -20
CTC CTG CTC GCC CTG CTC TGT GCC CTG CGA GCC AAG GTG TGT GGG GCC 501 Leu Leu Leu Ala Leu Leu Cys Ala Leu Arg Ala Lys Val Cys C l y Ala
- 15 - 10 -5 -1
TCG GGT CAG TTC GAG TTG GAG ATC CTG TCC ATG CAG AAC GTG AAC GGG 549 Ser Gl y G i n Phe Gl u Leu Gl u l ie Leu Ser Met G i n Asn Val Asn G l y
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165 170 175
GGA CAC TAT GCC TGT GAC CAG AAT GGC AAC AAA ACT TGC ATG GAA GGC 1077
Gly His Tyr Ala Cys Asp Gin Asn Gly Asn Lys Thr Cys Met Glu Gly
180 185 190
TGG ATG GGC CCC GAA TGT AAC AGA GCT ATT TGC CGA CAA GGC TGC ACT 1125
Trp Met Gly Pro Glu Cys Asn Arg Ala lie Cys Arg Gin Gly Cys Ser
195 200 205
CCT AAG CAT GGG TCT TGC AAA CTC CCA GGT GAC TGC AGG TGC CAG TAC 1173
Pro Lys His Gly Ser Cys Lys Leu Pro Gly Asp Cys Arg Cys Gin Tyr
210 215 220
GCC TGG CAA GGC CTG TAC TGT GAT AAG TGC ATC CCA CAC CCG GGA TGC 1221
Gly Trp Gin Gly Leu Tyr Cys Asp Lys Cys lie Pro His Pro Gly Cys
225 230 235 240
GTC CAC GGC ATC TGT AAT GAG CCC TGG CAG TGC CTC TGT GAG ACC AAC 1269
Val His Gly He Cys Asn Glu Pro Trp Gin Cys Leu Cys Glu Thr Asn
245 250 255
TGG GGC GGC CAG CTC TGT GAC AAA GAT CTC AAT TAC TGT GGG ACT CAT 1317
Trp Gly Gly Gin Leu Cys Asp Lys Asp Leu Asn Tyr Cys Gly Thr His
260 265 270
CAG CCG TGT CTC AAC GGG GGA ACT TGT AGC AAC ACA GGC CCT GAC AAA 1365
Gin Pro Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Ser Asn Thr Gly Pro Asp Lys
275 280 285
TAT CAG TGT TCC TGC CCT GAG GGG TAT TCA GGA CCC AAC TGT GAA ATT 1413
Tyr Gin Cys Ser Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Pro Asn Cys Glu lie
290 295 300
GCT GAG CAC GCC TGC CTC TCT GAT CCC TGT CAC AAC AGA GGC AGC TGT 1461
Ala Glu His Ala Cys Leu Ser Asp Pro Cys His Asn Arg Gly Ser Cys 0 8 m 991^ 05t-
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GGA GAC AAC TCG TAC CGG TGC GAA TGT GCC CCG GGT TTT GCT GGG CCC 2853
Gly Asp Asn Trp Tyr Arg Cys Glu Cys Ala Pro Gly Phe Ala Gly Pro
770 775 780
GAC TGC AGA ATA AAC ATC AAT GAA TCC CAG TCT TCA CCT TGT GCC TTT 2901
Asp Cys Arg lie Asn lie Asn Glu Cys Gin Ser Ser Pro Cys Ala Phe
785 790 795 800
GGA GCG ACC TGT GTG GAT GAG ATC AAT GGC TAC CGG TGT GTC TGC CCT 2949
Gly Ala Thr Cys Val Asp Glu lie Asn Gly Tyr Arg Cys Val Cys Pro
805 810 815
CCA GGG C.AC AGT GGT GCC AAG TGC CAG GAA GTT TCA GGG AGA CCT TGC 2997
Pro Gly His Ser Gly Ala Lys Cys Gin Glu Val Ser Gly Arg Pro Cys
820 825 830
ATC ACC ATG GGC AGT GTG ATA CCA GAT GGG GCC AAA TGG GAT GAT GAC 3045
I le Thr Met Gly Ser Val lie Pro Asp Gly Ala Lys Trp Asp Asp Asp
835 840 845
TGT AAT ACC TCC CAG TGC CTG AAT GGA CGG ATC GCC TGC TCA AAG GTC 3093
Cys Asn Thr Cys Gin Cys Leu Asn Gly Arg He Ala Cys Ser Lys Val
850 855 860
TGG TGT GGC CCT CGA CCT TGC CTG CTC CAC AAA GGG CAC AGC GAG TGC 3141
Trp Cys Gly Pro Arg Pro Cys Leu Leu His Lys Gly His Ser Glu Cys
865 870 875 880
CCC AGC GGG CAG AGC TGC ATC CCC ATC CTG GAC GAC CAG TGC TTC GTC 3189
Pro Ser Gly Gin Ser C.ys lie Pro He Leu Asp Asp Gin Cys Phe Val
885 890 895
CAC CCC TGC ACT GGT GTG GGC GAG TGT CGG TCT TCC AGT CTC CAG CCG 3237
His Pro Cys Thr Gly Va! Gly Glu Cys Arg Ser Ser Ser Leu Gin Pro
900 905 910 GTG AAG ACA AAG TGC ACC TCT GAC TCC TAT TAC CAG GAT AAC TGT GCG 3285
Val Lys Thr Lys Cys Thr Ser Asp Ser Tyr Tyr Gin Asp Asn Cys Ala
915 920 925
AAC ATC ACA TTT ACC TTT AAC AAG GAG ATG ATG TCA CCA GGT CTT ACT 3333
Asn He Thr Phe Thr Phe Asn Lys Glu Met Met Ser Pro Gly Leu Thr
930 935 940
ACG GAG CAC ATT TGC AGT GAA TTG AGG AAT TTG AAT ATT TTG AAG AAT 3381
Thr Glu His 【le Cys Ser Glu Leu Arg Asn Leu Asn Ue Leu Lys Asn
945 950 955 960
GTT TCC CCT GAA TAT TCA ATC TAC ATC GCT TGC GAG CCT TCC CCT TCA 3429
Val Ser Ala Glu Tyr Ser lie Tyr [le Ala Cys Glu Pro Ser Pro Ser
965 970 975
GCG AAC AAT GAA ATA CAT GTG GCC ATT TCT GCT GAA GAT ATA CGG GAT 3477
Ala Asn Asn Glu lie His Val Ala lie Ser Ala Glu Asp lie Arg Asp
980 985 990
GAT GGG AAC CCG ATC AAG GAA ATC ACT GAC AAA ATA ATC GAT CTT GTT 3525
Asp Gly Asn Pro lie Lys G【u lie Thr As し ys lie 【le Asp Leu Val
995 1000 1005
AGT AAA CGT GAT GGA AAC AGC TCC CTG ATT GCT CCC GTT GCA GAA CTA 3573
Ser Lys Arg Asp Gly Asn Ser Ser Leu lie Ala Ala Val Ala Glu Val
1010 1015 1020
AGA GTT CAG AGG CGG CCT CTG AAG AAC AGA ACA GAT TTC CTT GTT CCC 3621
Arg Val Gin Arg Arg Pro し eu Lys Asn Arg Thr Asp Phe Leu Val Pro
1025 1030 1035 1040
TTG CTG AGC TCT GTC TTA ACT GTG GCT TGG ATC TGT TGC TTG GTG ACG 3669
Leu Leu Ser Ser Val Leu Thr Val Ala Trp lie Cys Cys Leu Val Thr
1045 1050 1055
GCC TTC TAC TGG TGC CTG CGG AAG CGG CGG AAG CCG GGC AGC CAC ACA 3717 ς 8
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S801 0801 9Z01 n uio "ID SJV Ι¾Λ usy usy J¾ jq丄 usv dsy J9S i?IV S SIH
99ZS 9X3 0V3 OVO 003 010 3VV 3VV 33V 33V 3VV 3V9 OVO 131 330 V31 3V3
O OI 9901 0901 ji S!H J3S [0 OJd s q SJV 3JV sAq 8jy na s, dJi J入丄 ^ ZO/Z^dT/JLOd 8SW0/86 OM TTTTGACAAG CTGGCTTACA CTGGCA 4208 配列番号 ： 6
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
卜ボ口ジー ： 直鎖状
配列の種類： その他の核酸 合成 DNA
配列
TGCSTSTGYG ANACCAACTG 配列番号 ： 7
配列の良さ ： 2 0
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： その他の核酸 合成 DNA
配列
TTTATKTCRC AWKTCKGWCC 配列番号 8
配列の長さ 1 8 0
配列の型 核酸
鎖の数 二本鎖
トポロジー 直鎖状
配列の種類 c DN A to mRN A
起源
生物名 ヒ 卜 配列
GAGTGTGCAC CTGGCTTCGC GGGGCCTGAC TGCCGCATCA ACATCGACGA GTGCCAGTCC 60 TCGCCCTGTG CCTACGGGGC CACGTGTGTG GATGAGATCA ACGGGTATCG CTCTAGCTGC 120 CCACCCGCCC GAGCCGGCCC CCGGTCCCAG GAACTGATCG GGTTCGGGAG ATCCTGCTGG 180 配列番号 9
配列の長さ 2 5 2
配列の型 核酸
鎖の数 二本鎖
トポロジー 直鎖状
配列の種類 c D N A t o m R N A
起源
生物名 ヒ 卜
配列
GCATCAACTG CCATATCAAC GTCAACGACT GTCGCGGGCA GTGTCAGCAT GGGGGCACCT 60 GCAAGGACCT GGTGAACGGG TACCAGTGTG TGTGCCCACG GGGCTTCGGA GGCCGGCATT 120 GCGAGCTGGA ACGAGACAAG TGTGCCAGCA GCCCCTGCCA CAGCGGCGGC CTCTGCGAGG 180 ACCTGGCCGA CGGCTTCCAC TGCCACTGCC CCCAGGGCTT CTCCGGGCCT CTCTGTGAGG 240 TGGATGTCGA CC 252 配列番号 1 0
配列の長さ 1 8 4
配列の型 核酸
鎖の数 二本鎖
トポロジー 直鎖状
配列の種類 c D N A to m R N A
起源
生物名 ヒ 卜 配列
CAACTTTTCC TGCATCTGTG ACAGTGGCTT TACTGGCACC TACTGCCATC AGAACATTGA 60
CGACTGCCTG GGCCAGCCCT GCCGCAATGG GGGCACATGC ATCGATGAGG TGGACGCCTT 120
CCGCTGCTTC TGCCCCAGCG GCTGGGAGGG CGAGCTCTGC GACACCAATC CCAACGACTG 180
CCTT 184 配列番号 ： 1 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： その他の核酸 合成 D N A
配列
GAGTGTGCAC CTGGCTTCGC 配列番号 ： 1 2
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： その他の核酸 合成 D N A
配列
CCAGCAGGAT CTCCCGAACC 配列番号 ： 1 3
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ·.核酸
鎖の数 ：一本鎖 トポロジー ：直鎖状
配列の種類： その他の核酸 合成 DNA 配列
GCATCAACTG CCATATCAAC 配列番号 ： 1 4
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジ一 ：直鎖状
配列の種類： その他の核酸 合成 DNA 配列
GGTCGACATC CACCTCACAG 配列番号 ： 1 5
配列の長さ ： 20
配列の型 ：核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： その他の核酸 合成 DNA 配列
CAACTTTTCC TGCATCTGTG 配列番号 ： 1 6
配列の長さ ： 20
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ：直鎖状 配列の種類：その他の核酸 合成 D N A
配列
AAGGCAGTCG TTGGGATTGG 配列番号 1 7
配列の長さ 3 9 7
配列の型 核酸
鎖の数 二本鎖
卜ポロジ一 直鎖状
配列の種類 c D N A to m R N A
起源
生物名 ヒ 卜
配列
ATGAGGAGCT GCTGATCGAG CGAGTGTCCC ATGCCGGCAT GATCAACCCG GAGGACCGCT 60 GGAAGAGCCT GCACTTCAGC CGCCACGTGC CGCACCTGGA GCTGCAGATC CGCGTGCGCT 120 GCGACGAGAA CTACTACAGC GCCACTTGCA ACAAGTTCTG CCGGCCCCGC AACGACTTTT 180 TCGGCCACTA CACCTGCGAC CAGTACGGCA ACAAGGCCTC CATGGACGGC TGGATGGGCA 240 AGGACTGCAA GGAAGCTGTG TGTAAACAAG GGTCTAATTT GCTCCACGGG CGATGCACCG 300 TGCCTGGGGA GTGCAGGTGC AGCTACGGCT GGCAAGGGAG GTTCTGCGAT GAGTGTGTCC 360 CCTACCCCGG CTGCGTGCAT GGCAGTTGTG TGGAGCC 397 配列番号 ： 1 8
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： その他の核酸 合成 D N A
配列 ATGAGGAGCT GCTCATCGAG 配列番号 ： 1 9
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジ— ： 直鎖状
配列の種類： その他の核酸 合成 D N A
配列
GGCTCCACAC AACTGCCCATG 配列番号 ： 2 0
配列の長さ ： 6 0
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類： その他の核酸 合成 D N A
配列
TCGCGGGGGC AATGCGGGCG CAGGGCCGGG GGCGCCTTCC CCGGCGGCTG CTGCTGCTGC 配列番号 2 1
配列の長さ 2 2
配列の型 核酸
鎖の数 一本鎖
トポ αジ一 直鎖状
配列の種類： その他の核酸 合成 D N A
配列
CACACGCGCA CGTACGTGTC GC 配列番号 ·. 2 2
配列の長さ ： 2 7及び 8
配列の型 ：核酸及びァミ ノ酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： その他の核酸 合成 D N A及びァ 酸 配列
GAT TAT AAA GAT GAT GAT GAT AAA TGA 27 Asp Tyr し ys Asp Asp Asp Asp し ys
1 5 8 配列番号 ： 2 3
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： その他の核酸 合成 D N A
配列
GCTCCGGGAT CCGCTCCCTG 配列番号 ： 2 4
配列の長さ ： 3 3
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： その他の核酸 合成 D N A
配列
CTCGAGCAAC CTGTGGAAGA GCCGCCCGTA ACA 配列番号 ： 2 5
配列の長さ ： 5 8
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： その他の核酸 合成 D N A
配列
CTCGAGTCAT TTATCATCAT CATCTTTATA ATCACCTGTG GAAGAGCCGC CCGTAACA 配列番号 ： 2 6
配列の長さ ： 3 1
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： その他の核酸 合成 D N A
配列
AGATCTCCTG TCGAAGAGCC GCCCGTAACAA 配列番号 ： 2 7
配列の長さ ： 5 8
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類： その他の核酸 合成 D N A
配列
CTCGAGTCAT TTATCATCAT CATCTTTATA ATCCTCCTTG CCGGCGTAGC GGGCCTCA 配列番号 ： 2 8 配列の長さ ： 3 6
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類： その他の核酸 合成 D N A 配列
AAGGATCCCG AGGGTGTCTG CTGGAAGCCA GGCTCA 配列番号 ： 2 9
配列の長さ ： 3 3
配列の型 ：核酸
銷の数 ：一本鎖
トポロジー ·.直鎖状
配列の種類： その他の核酸 合成 D N A 配列
CCTCTAGAGT CGCGGCCGTC GCACTCATTT ACC

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 配列番号 1に記載のァミ ノ酸配列を含有するポリべプチド。
2 . 配列番号 2に記載のァミ ノ酸配列を含有する請求の範囲 1項に記 載のポリぺプチド。
3 . 配列番号 3に記載のアミ ノ酸配列を含有する請求の範囲 1項に記 載のポリべプチド。
4 . 未分化細胞の分化抑制作用を有する請求の範囲 1項〜 3項のいず れかに記載のポリぺプチド。
5 . 未分化細胞が脳神経系または筋肉系未分化細胞以外の未分化細胞 である請求の範囲 4項に記載のポリぺプチド。
6 . 未分化細胞か血液未分化細胞である請求の範囲 4項に記載のポリ ぺプチド。
7 . 血管内皮細胞の増埴を抑制する作用を有する請求の範囲 1項〜 3 項のいずれかに記載のポリべプチド。
8 . 請求の範囲 1項〜 2項のいずれかに記載のポリべプチドを含有す る医薬組成物。
9 . 請求の範囲 1項〜 2項のいずれかに記載のポリぺプチドを含有す る細胞培養培地。
1 0. 細胞が、 血液未分化細胞である請求の範囲 9項に記載の細胞培養 培地。
1 1. 配列番号 1に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ— ドする DNA。
1 2. 配列表の配列番号 4に記載の DN A配列の 9 0番から 7 3 1番に あたる配列を有する請求の範囲 1 1項に記載の DNA。
1 3. 配列番号 2に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー ドする DNA。
1 . 配列表の配列番号 4に記載の DN A配列の 9 0番から 3 2 5 4番 にあたる配列を有する請求の範囲 1 3項に記載の DNA。
1 5. 配列番号 3に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー ドする DNA。
1 6. 配列表の配列番号 4に記載の DN A配列の 9 0番から 3 7 2 5番 にあたる配列を有する請求の範囲 1 5項に記載の DNA。
1 7. 配列番号 1 に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー ドする D N Aと、 宿主細胞中で発現可能なベクター DNAと連結してなる組換え DNA体。
1 8. 配列番号 2に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー ドする D N Aと、 宿主細胞中で発現可能なベクタ一 D N Aと連結してなる組換え DNA体。
1 9. 配列番号 3に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ一 ドする D N Aと、 宿主紬胞中で発現可能なベクタ一 D N Aと連結してなる組換え DNA体。
2 0. 請求の範囲 1 7項に記載した組換え DNA体により形質転換され た細胞。
2 1. 請求の範囲 1 8項に記載した組換え DNA体により形質転換され た細胞。
2 2. 請求の範囲 1 9項に記載した組換え DNA体により形質転換され た紬胞。
2 3. 請求の範囲 2 0項〜 2 2項のいずれかに記載の細胞を培地に培養 し、 培養物中より産生された化合物を採取することを特徴とする請求の範囲 1項 〜 3項のいずれかに記載のポリぺプチドの製造方法。
2 4. 配列番号 1〜 3のいずれかのアミノ酸配列を有するポリべプチド を特異的に認識する抗体。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002016556A1 (fr) * 2000-08-25 2002-02-28 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Milieu de culture de cellule souche et procede de culture utilisant ce milieu
JP2003047470A (ja) * 2001-08-01 2003-02-18 Asahi Kasei Corp 新規な抗体及びその用途
JP2006515177A (ja) * 2002-09-10 2006-05-25 ロランティス リミテッド Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質を含む医薬組成物及び医学的処置
JP2008260772A (ja) * 1997-05-14 2008-10-30 Asahi Kasei Corp 新規な分化抑制剤

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003042246A2 (en) * 2001-11-14 2003-05-22 Lorantis Limited Inhibitors of the notch signalling pathway for use in the treatment of cancer
JP2005518785A (ja) * 2001-11-14 2005-06-30 ロランティス リミテッド 内科療法
US20030185829A1 (en) * 2002-03-12 2003-10-02 Erich Koller Jagged 2 inhibitors for inducing apoptosis
WO2003087159A2 (en) * 2002-04-05 2003-10-23 Lorantis Limited Modulators of the notch signalling pathway and uses thereof in medical treatment
AU2003255735A1 (en) * 2002-08-03 2004-02-23 Lorantis Limited Conjugate of notch signalling pathway modulators and their use in medical treatment
GB0300428D0 (en) * 2003-01-09 2003-02-05 Lorantis Ltd Medical treatment
JP2004301454A (ja) * 2003-03-31 2004-10-28 Calsonic Kansei Corp 熱交換器用のヘッダタンク
GB0307472D0 (en) * 2003-04-01 2003-05-07 Lorantis Ltd Medical treatment
CA2525029A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-18 Health Research, Inc. Use of jag2 expression in diagnosis of plasma cell disorders
US8029984B2 (en) * 2003-08-08 2011-10-04 Licentia, Ltd. Materials and methods for colorectal cancer screening, diagnosis and therapy
JP2007512348A (ja) * 2003-11-26 2007-05-17 ヘルス　リサーチ　インコーポレイテッド 形質細胞の治療のためのノッチ経路干渉剤の使用
EP2633047A4 (en) 2010-10-25 2014-04-02 Philadelphia Children Hospital COMPOSITIONS AND METHOD FOR PRODUCING BLOOD PLATES AND USE METHOD THEREFOR
AU2013278075B2 (en) 2012-06-22 2018-05-17 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-jagged 1/Jagged 2 cross-reactive antibodies, activatable anti-Jagged antibodies and methods of use thereof
KR102519166B1 (ko) * 2016-10-07 2023-04-07 세카나 파머씨티컬스 지엠비에이치 엔 씨오. 케이지 Cd39의 발현을 억제하는 면역억제-복구 올리고뉴클레오타이드

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992019734A1 (en) * 1991-05-03 1992-11-12 Yale University Binding domains in notch and delta proteins
WO1997019172A1 (fr) * 1995-11-17 1997-05-29 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Polypeptide suppresseur et de differenciation

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4603106A (en) * 1982-02-22 1986-07-29 The Rockefeller University Lipoprotein lipase suppression by endotoxin-induced mediator (shock assay)
US5521288A (en) * 1990-03-26 1996-05-28 Bristol-Myers Squibb Company CD28IG fusion protein
US5869282A (en) * 1991-12-11 1999-02-09 Imperial Cancer Research Technology, Ltd. Nucleotide and protein sequences of the serrate gene and methods based thereon
US6004924A (en) * 1991-12-11 1999-12-21 Imperial Cancer Research Technology, Ltd. Protein sequences of serrate gene products
US5864020A (en) 1994-07-20 1999-01-26 Genentech, Inc. HTK ligand
WO1996011212A1 (fr) 1994-10-07 1996-04-18 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Nouveau ligand de tyrosine kinase de type recepteur
US6136952A (en) * 1997-06-25 2000-10-24 University Of Washington Human jagged polypeptide, encoding nucleic acids and methods of use

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992019734A1 (en) * 1991-05-03 1992-11-12 Yale University Binding domains in notch and delta proteins
WO1997019172A1 (fr) * 1995-11-17 1997-05-29 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Polypeptide suppresseur et de differenciation

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CELL, Vol. 61, No. 5, (1990), R.G. FEHON et al., "Molecular Interactions Between the Protein Products of the Neurogenic Loci Notch and Delta, Two EGF-Homologous Genes in Drosophila", pages 523-534. *
DEVELOPMENTAL BIOLOGY, Vol. 174, No. 2, (1996), MAYT A. et al., "A Chick Homologue of Serrate and its Relationship with Notch and Delta Homologues During Central Neurogenesis", pages 233-247. *
GENES AND DEVELOPMENT, Vol. 4, (1990), R.J. FLEMING et al., "The Gene Serrate Encodes a Putative EGF-Like Transmembrane Protein Essential for Proper Ectodermal Development in Drosophila Melanogaster", pages 2188-2201. *
NATURE, Vol. 375, (1995), D. HENRIQUE et al., "Expression of a Delta Homologue in Prospective Neurons in the Chick", p. 787-790. *
NATURE, Vol. 375, (1995), D. HENRIQUE et al., "Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Regulated by a Homologue of the Drosophila Neurogenic Gene Delta", pages 761-766. *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008260772A (ja) * 1997-05-14 2008-10-30 Asahi Kasei Corp 新規な分化抑制剤
JP2008260773A (ja) * 1997-05-14 2008-10-30 Asahi Kasei Corp 新規な分化抑制剤
WO2002016556A1 (fr) * 2000-08-25 2002-02-28 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Milieu de culture de cellule souche et procede de culture utilisant ce milieu
JP2003047470A (ja) * 2001-08-01 2003-02-18 Asahi Kasei Corp 新規な抗体及びその用途
JP2006515177A (ja) * 2002-09-10 2006-05-25 ロランティス リミテッド Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質を含む医薬組成物及び医学的処置

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