WO1997049819A1 - Nouvelle enzyme de deblocage des terminaisons amino - Google Patents

Nouvelle enzyme de deblocage des terminaisons amino Download PDF

Info

Publication number
WO1997049819A1
WO1997049819A1 PCT/JP1997/002121 JP9702121W WO9749819A1 WO 1997049819 A1 WO1997049819 A1 WO 1997049819A1 JP 9702121 W JP9702121 W JP 9702121W WO 9749819 A1 WO9749819 A1 WO 9749819A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino
protecting group
enzyme
activity
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/JP1997/002121
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yukiko Izu
Tetsuki Tanaka
Masaru Miyagi
Tetsuo Tanigawa
Jun Tomono
Susumu Tsunasawa
Ikunoshin Kato
Original Assignee
Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takara Shuzo Co., Ltd. filed Critical Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority to AU31907/97A priority Critical patent/AU3190797A/en
Priority to EP97927398A priority patent/EP0911411A4/en
Priority to JP50267398A priority patent/JP3493400B2/ja
Priority to US09/202,832 priority patent/US6194190B1/en
Publication of WO1997049819A1 publication Critical patent/WO1997049819A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)

Definitions

  • the present invention relates to an amino terminal protecting group releasing enzyme having an activity of releasing a protecting group present at the amino terminal of proteins and peptides.
  • the present invention also relates to DNA encoding such an amino terminal protecting group releasing enzyme.
  • the present invention also relates to a method for producing such an amino terminal protecting group releasing enzyme by a genetic recombination technique.
  • the present invention also relates to a method for removing an amino terminal protecting group using such an amino terminal protecting group releasing enzyme.
  • the present invention relates to a method for analyzing an amino acid sequence using such a removing method.
  • the present invention relates to a kit containing the amino terminal protecting group releasing enzyme and used for analyzing an amino acid sequence.
  • the present invention relates to an antibody or a fragment thereof which specifically binds to the amino terminal protecting group releasing enzyme or a functional equivalent thereof. Furthermore, the present invention relates to a synthetic oligonucleotide probe or a synthetic oligonucleotide primer which hybridizes with the above-mentioned DNA. Background art
  • Determining the amino-terminal amino acid sequence of proteins and peptides is an indispensable step for their identification or confirmation.
  • Protecting groups that block the amino terminal of proteins and peptides include: Formyl, acetyl, myristoyl, pyroglutamyl, dimethyl, glucuronyl, glycosyl, and trimethyl groups have been reported.
  • a method of analyzing the amino terminal amino acid sequence of these blocked proteins a method of applying the Edman degradation method after removing the protecting group is used.
  • an object of the present invention is to provide an amino-terminal protecting group-enzyme having functional activity for protecting two or more protecting groups with an amino-terminal protecting group, a functional equivalent thereof, a DNA encoding the enzyme, and the enzyme. It is an object of the present invention to provide a method for producing an amino acid, a method for removing an amino terminal protecting group which acts on the enzyme, a method for analyzing an amino acid sequence using the method, and a kit for amino acid sequence analysis containing the enzyme.
  • an object of the present invention is to provide an antibody or a fragment thereof that specifically binds to the amino-terminal protecting group releasing enzyme or a functional equivalent thereof, and a synthetic oligonucleotide probe or a synthetic oligonucleotide primer that hybridizes with the DNA. To provide.
  • the present inventors searched for a cosmid protein library derived from Pyrococcus furiosus, and obtained one cosmid clone expressing the activity of releasing an amino-terminal protecting group.
  • the present inventors isolated the amino-terminal protecting group releasing enzyme gene contained in this clone and determined its nucleotide sequence.
  • a recombinant plasmid that expresses the enzyme in a large amount in a microorganism was constructed, the enzyme was successfully produced, and various enzymatic properties of the enzyme were clarified.
  • the enzyme has an activity to release a plurality of amino terminal protecting groups including an acetyl group.
  • the functional equivalent of the enzyme was successfully produced, and the present invention was completed. That is, the gist of the present invention is:
  • amino terminal protecting group releasing activity An enzyme having an activity of acting on a peptide whose amino terminal is blocked by a protecting group to release the protecting group (abbreviated as “amino terminal protecting group releasing activity”), and two or more enzymes.
  • amino-terminal protecting group-releasing enzyme which exhibits the above activity for a protecting group of
  • the enzyme according to (1) which exhibits an amino-terminal protecting group-releasing activity for at least two or more protecting groups selected from the group consisting of an acetyl group, a virogultamyl group, a formyl group, and a myristoyl group. ,
  • amino acid residues are deleted, added, inserted or substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and at least one amino acid residue is deleted, and the amino terminal protecting group releasing activity A functional equivalent of the enzyme according to the above (5),
  • one or more amino acid residues are deleted, added, inserted, or substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and at least one amino acid residue is released, and the amino-terminal protecting group is released DNA encoding a protein that exhibits activity
  • the amino-terminal protecting group is blocked by the amino-terminal protecting group-releasing enzyme or the functional equivalent thereof according to any of (1) to (9) above, on the peptide whose amino terminal is blocked by the protecting group.
  • FIG. 1 is a diagram showing a restriction map of plasmid pDAP3.
  • FIG. 2 is a diagram showing a restriction map of brassmid pDAP.
  • FIG. 3 is a graph showing the optimum temperature of the amino terminal protecting group releasing enzyme of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing the optimum pH of the amino-terminal protecting group-enzyme in the present invention.
  • ⁇ is a sodium acetate buffer solution. I PES-Na buffer, ⁇ indicates data using sodium borate buffer, and ⁇ indicates data using sodium hydrogen phosphate sodium hydroxide.
  • FIG. 5 is a graph showing the temperature stability of the amino terminal protecting group releasing enzyme of the present invention at 75 ° C.
  • Qin Isseki data of a buffer containing 0.101! ⁇ Of Flip 0 Ji 1 2, ⁇ indicates the data in buffer containing no CoC l 2.
  • FIG. 6 is a graph showing the time-dependent action of an amino-terminal protecting group releasing enzyme on neurotensin in the present invention.
  • FIG. 7 is a graph showing the aging effect of the amino terminal protecting group releasing enzyme on MSH in the present invention.
  • FIG. 8 is a view showing the time-dependent action of the amino-terminal protecting group releasing enzyme of the present invention on Ac-G1y-Asp-Va1-G1u-Lys.
  • FIG. 9 is a graph showing the time-dependent action of the amino-terminal protecting group-transferring enzyme of the present invention on Fo r -Me t -L e ⁇ -Phe-Ls.
  • FIG. 10 is a graph showing the time-dependent action of the amino-terminal protecting group releasing enzyme of the present invention on Myr-Phe-A1a-Arg-Lys-GlyA1a-Leu-ArgGln. .
  • FIG. 11 shows that the amino-terminal protecting group releasing enzyme of the present invention is Myr-G1y-A1a-G1y-A1a-Ser-A1a-Gl ⁇ -Glu-L.
  • FIG. 4 is a view showing the time-dependent action on ys.
  • FIG. 2 is a graph showing the time-dependent action of the amino terminal protecting group releasing enzyme of the present invention on reduced ribzyme.
  • the amino-terminal protecting group releasing enzyme of the present invention is an enzyme having an activity of acting on a peptide having an amino terminal blocked by a protecting group to release the protecting group (amino terminal protecting group releasing activity), It is characterized by exhibiting activity on more than one kind of protecting group.
  • peptide refers to one in which two or more amino acids are connected by a peptide bond, and includes those described as “protein J”.
  • Protecting groups present at the amino terminus of this peptide include acetyl, pyrrogylyl, formyl, myristoyl, and the like.
  • the amino-terminal protecting group-releasing enzyme of the present invention is an amino acid of the peptide of the substrate. It has an activity to release at least two or more of these protecting groups from the terminal. Such an amino terminal protecting group releasing activity can be measured by a method described later by using a synthetic peptide or the like whose amino terminal is blocked by the above protecting group as a substrate.
  • the amino-terminal protecting group releasing enzyme of the present invention includes an enzyme having an amino-terminal protecting group releasing activity, an enzyme having an amino-terminal protecting group releasing activity and an aminopeptidase activity of sequentially releasing amino acid from the amino terminal of the peptide.
  • Specific examples include an enzyme having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. If the peptide has additional aminopeptidase activity, the amino acid sequence of the peptide should be analyzed without the need to use other peptide amino terminal digestion methods. Both are possible.
  • Such an aminopeptidase activity can be determined by a generally known method (Arch. Biochera. Biophys., Vol. 274, Vol. 241 to 250 (pp. 1989)). Can be measured.
  • Examples of an enzyme having an amino terminal protecting group releasing activity and an aminopeptidase activity include, specifically, an enzyme having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the enzyme of the present invention may have its amino terminal in a free state, or the amino terminal of the enzyme itself may be blocked by a protecting group. Therefore, unless otherwise specified in the present specification, the amino terminus of the enzyme includes any state. Therefore, although SEQ ID NO: 1 shows a state in which the amino terminal is free, a compound having the sequence of SEQ ID NO: 1 and whose amino terminal is blocked by a protecting group such as a cetyl group is also described in the present invention. Is within the range.
  • the amino-terminal protecting group releasing enzyme of the present invention can be obtained, for example, from 1) purification from a culture of a microorganism producing the enzyme of the present invention, and 2) from a culture of a transformant containing DNA encoding the enzyme of the present invention. Can be produced by a method such as purification.
  • microorganism producing the enzyme of the present invention such a microorganism can be found by screening using the enzyme activity as an index.
  • a method for detecting the enzymatic activity an amino acid or a peptide whose amino terminal is blocked with a protecting group is used as a substrate, and the release of the protecting group from the substrate is determined by high performance liquid chromatography / amino acid analysis. There is a method of confirming by mass spectrometry.
  • a synthetic substrate obtained by adding an appropriate coloring group or fluorescent group to an amino acid blocked with a protecting group can also be used.
  • the enzyme can be produced by culturing a microorganism in which production of the amino-terminal protecting group-releasing enzyme has been confirmed.
  • the cultivation of the microorganism may be performed under conditions suitable for the growth of the microorganism, and is preferably such that the expression level of the target enzyme is high. Culture conditions are used.
  • the target enzyme produced in the cells or the culture solution in this manner can be purified by a method generally used for enzyme purification.
  • Microorganisms that produce the enzyme of the present invention include Pyrococcus furiosus DSM 368.
  • Viroko Cass Friosus DSM 3638 can be obtained from Deutsch Sung Lung von Mikroorgani smen und Zellkulturen und GmbH, Germany. It is a strain.
  • a method usually used for culturing hyperthermostable bacteria can be used, and the nutrient added to the medium may be any one that can be used by the strain.
  • the carbon source for example, starch and the like can be used, and as the nitrogen source, for example, tryptone, leptone, yeast extract, and the like can be used.
  • Metal salts such as magnesium salts, sodium salts, and iron salts may be added to the medium as trace elements.
  • the medium is desirably a transparent medium containing no solid sulfur. If the medium is used, the growth of the cells can be easily monitored by measuring the turbidity of the culture solution.
  • the culture can be performed by static culture or stirring culture. For example, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 55, pp. 286-208, pp. (1992) As described in (2), a through-culture method may be used.
  • the culture temperature is preferably around 95 ° C, and usually about 16 hours, a significant amount of the amino-terminal protecting group-releasing enzyme accumulates in the culture.
  • the culture conditions are preferably set so that the production amount of the amino-terminal protecting group-releasing enzyme is maximized according to the cells used and the medium composition.
  • a method for crushing the cells a method having a high effect of extracting the target enzyme may be selected from ultrasonic crushing, bead crushing, and lytic enzyme treatment.
  • the enzyme is secreted into the culture solution, the enzyme is concentrated by ammonium sulfate precipitation / ultrafiltration or the like to obtain a crude enzyme solution.
  • a method used for ordinary enzyme purification can be used. For example, a combination of ammonium sulfate salting-out treatment, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography and the like can be used in combination.
  • the DNA encoding the enzyme according to the present invention can be obtained by screening a gene library of an appropriate microorganism. As described above, microorganisms can be found by screening using enzyme activity as an index.
  • the desired DNA can be screened and obtained from, for example, a genomic cosmid library of bacteria belonging to the genus Pyrococcus, for example, Pyrococcus flyosus.
  • Pyrococcus furiosus DSM3638 can be used as Pyrococcus furiosus.
  • the Pyrococcus furiosus genome cosmid library is obtained by introducing DNA fragments obtained by partially digesting Pyrococcus furiosus genomic DNA with the restriction enzyme Sau3AI (Takara Shuzo) into Triblehelix Cosmid Vector-1 (Stratagene). After that, lambda phage particles It can be manufactured by packaging inside. Next, a suitable E. coli, for example, Escherichia coli DH5 MCR (manufactured by BRL) is transformed using the thus obtained library, and the enzymatic activity according to the present invention in this transformant is examined. Clones containing the DNA of the enzyme can be obtained.
  • the present inventors have focused on the fact that the enzyme produced by Pyrococcus furiosus used as a material in screening the enzyme activity has high heat resistance, and individually transformed the transformants obtained using the cosmid library.
  • the steps of culturing and preparing a lysate containing only heat-resistant protein from the obtained cells were combined.
  • This group of lysates is called a cosmid protein library, and by using the cosmid protein library for detecting enzyme activity, the detection sensitivity is improved as compared with the method using a colony of a transformant.
  • adverse effects such as inhibition of background II enzyme activity due to host-derived proteins and the like can be eliminated by heat denaturation.
  • the cells obtained by culturing the transformant obtained using the cosmid library are subjected to heat treatment (100, 10 minutes), ultrasonic treatment, and re-heat treatment (100 ° C, After 10 minutes), centrifuge and collect the supernatant (lysate) to prepare a cosmid protein library.
  • amino acid-MCA synthetic peptide amino acid-4-methylcoumalil 7-amide
  • Met-MCA Leu-MCA. A1a-MCA. His-MCA (manufactured by Peptide Institute) can be used.
  • the lysate in which peptidase activity was observed was further purified using Hiichi MSH (Nippon Melanocyte Stimulating Hormone: Peptide Laboratories), a peptide whose amino terminus was blocked by an acetyl group. Whether it has the activity of releasing a protecting group at the amino terminal. You can find out. As a result, a cosmid clone containing DNA expressing the activity of releasing a protecting group can be obtained.
  • Hiichi MSH Natural Melanocyte Stimulating Hormone: Peptide Laboratories
  • cosmids prepared from the cosmid clones thus obtained can be fragmented with an appropriate restriction enzyme to produce a recombinant plasmid into which each fragment has been inserted.
  • a transformant obtained by introducing the plasmid into a suitable microorganism is produced.
  • a recombinant plasmid containing DNA encoding the enzyme of interest is obtained.
  • the cosmid prepared from the above cosmid clone was digested with BamHI (Takara Shuzo), and the obtained DNA fragment was inserted into the BamHI site of the plasmid vector pUC18 (Takara Shuzo). Can be made.
  • the peptidase activity in the lysate prepared from the obtained cells is examined to contain the DNA of interest. You can get Brasmid.
  • the plasmid is named plasmid pDAP1.
  • the above plasmid pDAP1 is digested with EcoRI (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), and self-ligation can be performed to prepare a recombinant plasmid.
  • EcoRI manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.
  • self-ligation can be performed to prepare a recombinant plasmid.
  • Escherichia coli JM109 into which the plasmid has been introduced, the bactidase activity of the lysate obtained from the cells can be confirmed, and a plasmid containing the target DNA can be obtained.
  • the plasmid has been named pDAP2.
  • a DNA fragment containing no amino-terminal protecting group releasing enzyme gene from the above plasmid pDAP2 can be removed as follows. Specifically, an approximately 1.7 kb DNA fragment obtained by digesting the plasmid pDAP2 with Sacl (Takara Shuzo) was inserted into the SacI site of the plasmid vector pUC18 (Takara Shuzo), and Introduce into fungus JM109. The peptidase activity of the lysate prepared from the obtained transformant is measured, and a plasmid is prepared from the transformant showing the activity.
  • the plasmid has been named Brasmid p DAP3.
  • Fig. 1 shows the restriction enzyme map. Show. In the figure, the thick solid line is the DNA fragment inserted into the plasmid vector pUC18.
  • a DNA fragment containing no amino-terminal protecting group releasing enzyme gene from the plasmid pDAP3 can be removed as follows. That is, the plasmid pD eight? 3 was digested with 311 & 8 1 (Takara Shuzo) and Sacl (Takara Shuzo) digested. About 1.2 kb of SnaBI—SacI DNA fragment was digested with SmaI of plasmid vector pUC19. — Insert into SacI site and introduce into E. coli JM109. The peptidase activity of the lysate prepared from the obtained transformant is measured.
  • plasmid pDAP The plasmid is named plasmid pDAP.
  • Fig. 2 shows the restriction enzyme map.
  • the thick solid line is the DNA fragment inserted into plasmid vector pUC19.
  • Escherichia coli JM109 into which plasmid pDAP has been introduced is named Escherichia coli J109 / pDAP. Deposited with the National Institute of Technology, FERM BP-5804 (Original deposit date: March 29, 1996, transfer to international deposit: January 30, 1997).
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment derived from Pyrococcus furiosus contained in the plasmid pDAP can be determined by a known method, for example, the dideoxy method.
  • SEQ ID NO: 3 in the sequence listing shows the nucleotide sequence of a DNA fragment of about 1.2 kb inserted into plasmid pDAP.
  • the nucleotide sequence of the open reading frame present in the sequence is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. That is, SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is an example of the nucleotide sequence of the amino terminal protecting group releasing enzyme gene obtained by the present invention.
  • SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of the amino terminal protecting group releasing enzyme of the present invention deduced from the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2. Ie the sequence listing SEQ ID NO: 1 is an example of the amino acid sequence of the amino terminal protecting group releasing enzyme obtained by the present invention.
  • the Escherichia coli JM109 / pDAP into which the plasmid pDAP has been introduced, obtained as described above, can be used to obtain the amino-terminal protecting group releasing enzyme of the present invention. That is, Escherichia coli JM109 / pDAP was cultured under normal culture conditions, for example, LB medium containing 100 g / mL of ampicillin (10 liters of tryptone, 5 g of yeast extract, 5 g of yeast extract, 5 g of ZCI By culturing at 37 in pH 7.2), the amino-terminal protecting group-transferring enzyme can be expressed in the cultured cells.After completion of the culture, the cultured cells were collected and obtained. Heat the cells at I 00 for 10 minutes.
  • the crude enzyme solution is obtained as a supernatant obtained by centrifuging the heat-treated cells after sonication, denaturing contaminating proteins by heat treatment at 100 ° C for 10 minutes, gel filtration chromatography, ion exchange.
  • An amino-terminal protecting group-releasing enzyme can be purified by using a combination of methods commonly used for purification of enzymes such as chromatography.
  • the enzyme of the present invention releases at least an acetyl group, a pyroglutamyl group, a formyl group, and a myristoyl group among various protecting groups present at the amino terminal of the peptide. Further, the enzyme of the present invention releases amino acids sequentially from the amino terminus of the peptide.
  • the enzyme activity of the present invention is measured by the following operation using Met-MCA as a substrate.
  • 7-Amino-4-methylcoumarin produced by the reaction is quantified using a titer tech fluoroscan [ ⁇ (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) at an excitation wavelength of 355 nm and a measurement wavelength of 450 nm.
  • One unit of enzyme uses Met-MC ⁇ as a substrate, ⁇ 7.6, 75. Determine the amount of enzyme capable of producing 1 jmo 1 of 7-amino-4-methyltamarin per minute in C.
  • the enzyme of the present invention had met-MCA decomposition activity at the measured pH of 7.6 and 75 ° C.
  • the enzyme of the present invention acted on Leu-MCA, A1a-MCA, His-MCA, etc. in addition to Met-MCA to release amino acid.
  • the enzyme of the present invention releases a protecting group from the amino terminal even if a protecting group is present at the amino terminal of the peptide, and further sequentially transmits amino acids.
  • the above activity can be confirmed by using a synthetic peptide having a blocked amino terminal as a substrate. That is, it can be confirmed by measuring the time-dependent change in the amount of amino acid released from the substrate peptide by the enzymatic reaction by amino acid analysis, and analyzing the decomposition mode of the peptide.
  • a synthetic peptide having a blocked amino terminal as a substrate. That is, it can be confirmed by measuring the time-dependent change in the amount of amino acid released from the substrate peptide by the enzymatic reaction by amino acid analysis, and analyzing the decomposition mode of the peptide.
  • those not commercially available can be chemically synthesized and used by a known method, for example, using a peptide synthesizer.
  • SEQ ID NO: 4 in the sequence listing shows the amino acid sequence of neurotensin . That is, 0.1 mM enzyme sample (5 L) in 10 L of ImM new mouth tensin (manufactured by Peptide Research Institute), 4 OmM PIPES-Na buffer solution (pH 7.6) 5 After adding 0 ⁇ L and 35 ml of distilled water and reacting at 37'C for 0 to 5 hours, the amount of free amino acids in the reaction solution was measured by amino acid analysis.
  • the activity of releasing the formyl group can be examined using For-Me-Leu-Phe-Lys (manufactured by BA Chem) as a substrate.
  • SEQ ID NO: 7 in the sequence listing shows the amino acid sequence of For-Me-Leu-Phe-Lys. That is, 1 OmM
  • the activity to release the myristoyl group is as follows: Myr—Phe—Ala-Arg-Lys-Gly-Ala-Leu-Arg-Gln (manufactured by BACHEM) and Myr-G1y- A1a-G1y-A1a-Ser-A1a-G1u-Glu-Lys can be used as a substrate to examine.
  • 1 shows the amino acid sequence of 1y-A1a-Gly-A1a-Ser-A1a—Glu1G1u—Lys. That is, 4 L units of enzyme preparation (3.5 L), 0.1 M N-ethyl morpholine acetate buffer (pH 9.0) 25 L, distilled water 1 After adding 6.5 L and reacting at 0 to 9 hours at 37 ° C, the amount of free amino acid in the reaction solution was measured by an amino acid analysis method. As a result, when either substrate was used, the amino acid at the amino terminus from which the myristoyl group had been lost was first released, indicating that the enzyme of the present invention had the activity to release the myristoyl group. Indicated. It was also confirmed that the amino acids following this were sequentially released over the reaction time.
  • the enzyme of the present invention also acts on the amino terminal of the peptide whose amino terminal is not blocked by the protecting group, and has an aminopeptidase activity to release the amino terminal amino acid. This activity can be confirmed by the method described in Arch. Biochem. Bioptys .. Vol. 274, Vol. 24, p. 250 (1989).
  • the enzyme of the present invention can act on the amino terminus of high-molecular-weight proteins in addition to the short-chain polypeptides described above. For example, this can be confirmed using reduced chicken egg white lysozyme as a substrate. That is, ImM reduced chicken egg white rib team (water-soluble, molecular weight about 14000, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 5 milliliters of enzyme product (1.6 // L), 0.1 mM CoC l 2 containing 5 OmM disodium hydrogen phosphate-sodium hydroxide buffer (pH 11.0) 50 L and 43.4 L of distilled water were added, and the mixture was reacted at 50 for 0 to 240 minutes.
  • ImM reduced chicken egg white rib team water-soluble, molecular weight about 14000, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • 5 milliliters of enzyme product 1.6 // L
  • the optimum temperature of the enzyme preparation of the present invention is 75 to 95 ° C. at pH 7.6.
  • the vertical axis shows the relative activity (%) with respect to the maximum activity (95 “C), and the horizontal axis shows the reaction temperature (in).
  • the optimum pH of the enzyme of the present invention was around pH 6.5 to 9.5.
  • the vertical axis shows the relative activity (%) with the activity at pH 7.2 as 100, and the horizontal axis shows the pH at 75'C.
  • the activity of the enzyme of the present invention is inhibited by amycin (manufactured by Peptide Research Institute). For example, when 0.3 milliunit of the enzyme of the present invention is treated with 5 nmol of amastatin and its activity is measured using Met-MCA as a substrate, the enzyme activity is almost completely lost.
  • the enzyme of the present invention has a molecular weight of about 40,000 by SDS-polyacrylamide electrophoresis and about 400,000 by ultracentrifugation. (8) Temperature stability
  • the residual enzyme activity after heat treatment of the enzyme product at 75'C was examined, and the temperature stability of the enzyme of the present invention was examined. 5 As shown, after the enzyme is 0. 1 mM C o C 1 2 containing 0. 1 M Bok squirrel one HC 1 buffer (PH 8. 0) 5 hours treatment in the present invention also not seen at all decrease in enzyme activity (in FIG Qin), also C oC l If 2 for 5 hours at buffer without also had retained 80% or more activities (in the figure ⁇ ). In the figure, the vertical axis shows the remaining enzyme activity (%), and the horizontal axis shows the heat treatment time (hour).
  • the amino-terminal protecting group-releasing enzyme in the present invention includes, in addition to the above enzymes, all or a part of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and exhibits an amino-terminal protecting group releasing activity. Or its functional equivalents.
  • “functional equivalent” refers to: Naturally occurring proteins have polymorphisms and mutations in the DNA encoding them, as well as deletions and insertions of amino acids in their amino acid sequences due to modification reactions in vivo and during purification of the produced proteins. Mutations such as addition, substitution and the like may occur. However, when such a mutation is present in a portion that is not important with respect to the activity and structure retention of the protein, some of them show physiological and biological activities substantially equivalent to those of the protein having no mutation. It is known. In the present specification, those having little difference in function even if there is a slight difference in structure are called “functional equivalents”. The same applies to the case where the above-mentioned mutation is artificially introduced into the amino acid sequence of a protein.
  • proteins are known to have peptide regions that are not essential for activity. For example, signal peptides present in extracellularly secreted proteins, pro-sequences found in protease precursors, and the like. Most of these regions are post-translationally or converted to active proteins. Removed. Such proteins are forces that exist in different forms in their primary structure, and ultimately express the same function.
  • a peptide chain irrelevant to the activity of the protein may be added to the amino or carboxyl terminus of the target protein.
  • a fusion protein in which a part of the amino terminal region of the protein highly expressed in the host used is added to the amino terminal of the target protein is produced.
  • a peptide having an affinity for a specific substance has been added to an amino terminal or a carboxyl terminal of a target protein.
  • Functional equivalents of the above-mentioned amino terminal protecting group mobilizing enzyme include, for example, a deletion, addition, insertion or substitution of one or more amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. At least one enzyme may be used, and the enzyme may exhibit amino terminal protecting group releasing activity. In the present invention, aspects of functional equivalents are not particularly limited. Although there is no modified amino acid sequence, an amino acid sequence modified by blocking the N-terminus of the amino-terminal protective group releasing enzyme of the present invention with a protecting group is exemplified. An example is an enzyme in which valine at amino acid number 2 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing has been replaced with aspartic acid.
  • the modified enzyme can be obtained, for example, by using a genetic engineering technique. That is, the modified enzyme is prepared by modifying the nucleotide sequence of the DNA region encoding the above enzyme on pDAP plasmid DNA using a known nucleic acid mutagenesis technique, and then expressing the protein using an appropriate host. Can be implemented. It is known that the N-terminal amino acid sequence Met-Asp of the modified enzyme serves as an acetyl-added signal sequence in baker's yeast [Journal of Biochemistry], No. 265. Vol., Pp. 19638-196643 (1990)].
  • a protein having an N-terminal acetylated protein can be obtained by incorporating the DNA region encoding the modified enzyme into an appropriate yeast expression vector and expressing it in an appropriate host yeast.
  • pVT103-L Gene, Vol. 52, pp. 225-233 (1987)
  • BJ2168 BJ2168
  • the activity of releasing the amino-terminal protecting group of the protein can be confirmed by using the method described in the above section on substrate specificity to confirm that the protein is the amino-terminal protecting group-releasing enzyme of the present invention. I can do it.
  • PVT103-L into which DNA encoding the enzyme consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 10 was inserted which was named pAc DAP
  • pAc DAP DNA encoding the enzyme consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 10
  • pAc DAP plasmid BJ2168
  • Saccharomyces cerevisiae BJ2168 / pAcDAP FERM BP- Deposited as 595 (Original deposit date: May 23, 1997).
  • the method of blocking the N-terminus of the protein with a protecting group by modifying the amino acid sequence is not limited to this method, and examples thereof include an alternative method of acetylation (Journal of Biological Chemistry, Vol. 260, pp. 5382-5391 (19985)] and the method of myristoylation (Procedings of the National Academy of Sciences of the USA (Proceedings of the USA) Vol. 84, pp. 2708-2712 (19987)] may be used, and a method for blocking the N-terminus of a protein with a protecting group may be used.
  • the method is not limited to the method by amino acid substitution as described above. For example, a chemical method (Methods in Enzymology, Vol. 11, pp. 565-570 (1967)) can be used. Good.
  • the DNA of the present invention is a DNA encoding the above-mentioned amino-terminal protecting group releasing enzyme of the present invention, and specifically, the whole or a part of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.
  • DNA encoding an amino acid having an amino terminal protecting group releasing activity (2) DNA containing all or a part of the DNA shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, (3) Functionality of the present invention DNA encoding an equivalent, and (2) DNA encoding a protein capable of hybridizing to DNA described in (1) to (3) above and having an amino terminal protecting group releasing activity.
  • Such a DNA of the present invention can be obtained, for example, as follows.
  • the DNAs 1) and 2) can be obtained from Pyrococcus furiosus DSM3638, as described in the description of the amino-terminal protecting group releasing enzyme of the present invention. It is also possible to obtain a DNA of a protein having the same activity as the enzyme of the present invention based on the base sequence of DNA 6 encoding the amino-terminal protecting group releasing enzyme provided by the present invention. That is, by using a DNA encoding the enzyme of the present invention or a part of its nucleotide sequence as a probe for hybridization or a primer for a gene amplification method such as PCR, a functionally equivalent to the present enzyme is obtained. The DNA encoding the active protein can be screened. The DNA of (3) and (4) can be obtained by power, power, and method.
  • a DNA fragment containing only a part of the target DNA may be obtained.
  • the nucleotide sequence of the obtained DNA fragment is examined, and the DNA sequence of the target DNA is obtained.
  • the PCR is performed using a primer that has been synthesized based on the ability to perform hybridization or a primer synthesized based on the nucleotide sequence of the DNA fragment. By doing so, the entire target DNA can be obtained.
  • the above hybridization can be performed, for example, under the following conditions. That is, the membrane on which the DNA was immobilized was treated with 0.5% SDS, 0.1% serum albumin (BSA), 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% polyester 400, 0.01 6 x SSC containing% denatured salmon sperm DNA (1 XSSC is 0.15M
  • nucleotide sequence is not the same as the nucleotide sequence disclosed in the present specification, as long as it encodes a protein having an amino-terminal protecting group releasing activity disclosed in the present specification, such a nucleotide sequence may be used in the present invention. Is included in the range as described above. The reason is as follows.
  • DNA is not stable in nature, and mutations in its nucleotide sequence are not uncommon. In some cases, mutations that occur in DNA do not change the amino acid sequence encoded by them (called silent mutations), in which case different DNAs encoding the same amino acid sequence have been generated. . Therefore, even if a DNA encoding a specific amino acid sequence is isolated, there is a possibility that many types of DNA that encode the same amino acid sequence will be produced as the organism containing it is passaged. Cannot be denied. Furthermore, it is not difficult to artificially produce various kinds of DNAs encoding the same amino acid sequence by using various genetic engineering techniques.
  • the expression level of the protein may decrease. May be low.
  • high expression of the target protein can be achieved by artificially converting codons into those commonly used in the host without changing the encoded amino acid sequence.
  • DNA that is artificially mutated to impart specific properties to the protein is included in the DNA of the present invention as long as it encodes the enzyme having the amino-terminal protecting group releasing activity of the present invention.
  • Examples of such DNA include a DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing.
  • the DNA has a nucleotide sequence in which the nucleotide sequence TG present at nucleotide numbers 5 to 6 in the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing has been substituted with the nucleotide sequence AT, and was encoded by the DNA.
  • the valine at amino acid number 2 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is replaced with aspartic acid and the N-terminal is acetylated. Enzymes can be obtained.
  • the method for removing the amino-terminal protecting group of the present invention comprises protecting the amino-terminal by reacting the amino-terminal-protected peptide with the protecting group with the amino-terminal protecting group-releasing enzyme of the present invention or a functional equivalent thereof. It is characterized by liberating a group.
  • the substrate is mixed with the substrate at 50 ° C. in 5 OmM PI PES-Na buffer (pH 7.6) By reacting, the protecting group can be released.
  • the reaction conditions differ depending on the type of the protecting group and the peptide.
  • Ru can also be added CoC 1 2 to increase the activity of the enzyme needed.
  • the method for analyzing an amino acid sequence according to the present invention is a method for analyzing an amino acid sequence of a peptide having an amino terminal blocked by a protecting group, comprising the steps of: It is characterized by being used for analysis of
  • an amino acid sequence analysis method of the obtained peptide includes, for example, removing the amino terminal protecting group of the peptide whose sequence is to be determined using the amino terminal protecting group releasing enzyme of the present invention, and then starting from the newly generated amino terminal. The sequence is determined by the Edman decomposition method.
  • the use of an excess amount of the enzyme caused the enzyme to degrade the amino acid sequence information of the sample. It is conceivable that the amino acid sequence information of the enzyme of the present invention used in the treatment is mixed as noise. In this case, for example, when an amino-terminal protecting group releasing enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing is used, the amino-terminal protecting group releasing enzyme itself is not subjected to Edman degradation, so that noise contamination can be prevented.
  • the N-terminal protecting group is not particularly limited to an acetyl group.o
  • the amino acid is also sequentially released by the action of the enzyme following the release of the protecting group, but under conditions where the action of the enzyme can be controlled. Then, the amino group can be determined by Edman degradation method after removing only the protecting group at the amino terminal or the protecting group followed by a few residues of amino acid.
  • amino acid sequence analysis can be performed by the following method. That is, a method of determining the sequence by reacting the amino acid protecting group-releasing enzyme of the present invention on the peptide whose sequence is to be determined, and then analyzing the change over time of the amino acid released in the reaction solution, Alternatively, there is a method in which the amino acid composition of various partially digested peptides generated in the reaction solution is identified and the sequence is determined by comparing the amino acid compositions.In the latter case, the molecular weight is determined by mass spectrometry. A method for identifying the amino acid composition of a peptide is advantageous. In the method using mass spectrometry, the type of amino acid released can be easily determined from the difference in molecular weight of the partially digested peptide, and the protecting group existing at the amino terminus can be easily determined. Can be determined at the same time.
  • the kit for analyzing an amino acid sequence of the present invention is a kit used for analyzing the amino acid sequence of a peptide whose amino terminal is blocked by a protecting group, and contains the enzyme of the present invention described above. It is characterized by doing. By using such a kit, it can be used for amino acid sequence analysis of a peptide whose amino terminus is blocked, regardless of the type of protecting group. In addition, a standard product of a protecting group compound for identifying a protecting group blocking an amino terminal of a peptide can be added to the kit.
  • An antibody or a fragment thereof which specifically binds to the above amino terminal protecting group releasing enzyme or a functional equivalent thereof can be obtained by a conventional method. Such antibodies and the like are useful for purification and detection of the enzyme of the present invention.
  • a synthetic oligonucleotide probe or a synthetic oligonucleotide primer that hybridizes with the above-mentioned DNA can be obtained by a conventional method. Such probes and primers are useful for the detection and amplification of DNA of the present invention. Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to the following examples. Incidentally,% in the examples means% by weight.
  • the culture of Pyrococcus furiosus DSM36638 was performed as follows.
  • the composition of the medium used is as follows: 1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1 % Soluble starch, 3.5% Jamarin S ⁇ Sori' de (Jamarin Laboratory, I), 0.5% Jamarin S ⁇ Riki' de (Jamarin Laboratory), 0. 0 0 3% MgS0 4, 0. 00 1% Na C 0. OOO l ⁇ F e SO * ⁇ 7 ⁇ 2 0, 0. 000 1% C o S O4, 0. 000 1% C a C 12 ⁇ 7 ⁇ 2 ⁇ , 0. 0 0 0 1% Zn S0 4 . 0. 1 p pmCu SO * ⁇ 5 ⁇ 2 0, 0. 1 p pmKA 1 (S Rei_4) 2, 0. lp pmH 3 B0 3, 0. 1 pmN a 2 Mo 0 4 ⁇ 2 ⁇ 2 ⁇ , 0. 25 p pmN i C 12 ⁇ 6 H 20 .
  • the collected cells were suspended in 4 mL of 0.05 M Tris-HC1 (pH 8.0) containing 25% sucrose, and 0.8 mL of lysozyme (5 mg ZmL, 0.25 M Tris-HC) was added to this suspension.
  • 1 (pH 8.0)] add 2 mL of 0.2 M EDTA (pH 8.0), incubate at 20'C for 1 hour, then add 24 mL of the SET solution (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, HC1 (pH 8.0)), add 4 mL of 5% SDS and 400 L of proteinase K (10 mg / mL), and react at 37 ° C for 1 hour.
  • phenol-chloroform was extracted, followed by ethanol precipitation to prepare about 3.2 mg of genomic DNA.
  • Cosmids were prepared by selecting several of the obtained transformants, and after confirming that an insert fragment of an appropriate size was present, 500 transformants were re-added with 100 ⁇ g ZmL of ampicillin.
  • LB medium 10 liters of tryptone, 5 liters of yeast extract, 5 g of NaC5 gZ liter, pH 7.2
  • the culture was centrifuged, and the collected cells were suspended in 1 mL of 20 mM Tris-HC1 (pH 8.0) and heat-treated at 100 for 10 minutes. Subsequently, ultrasonic treatment was performed, and the cell lysate was heat-treated again at 100 for 10 minutes.
  • the lysate obtained as the supernatant after centrifugation was used as the cosmid protein library.
  • a cosmid clone having peptidase activity in the cosmid protein library was selected by quantifying the amount of 7-amino-4-methylcoumarin produced using amino acid-MCA as a substrate. Specifically, 10 to 30 L of the lysate was taken from the above cosmid protein library, and 0.1 MPI PES—100 L of Na buffer (pH 7.6) and 18 5 mM amino acids—MC A ( (Dissolved in dimethyl sulfoxide) was added, and reacted at 90 eC for 1-3 hours.
  • the generated 7-amino-4-methylcoumarin was measured using Titertec Fluoroscan II (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) at an excitation wavelength of 355 nm and a measurement wavelength of 460 nm, and met-MCA, A lysate having degrading activity against Leu-MCA, A1a-MCA, and His-MCA was selected. Furthermore, acetyl group and amino acid were converted from these lysates to amino terminal using MSH as a substrate.
  • Cosmid was obtained from the cosmid clone obtained as described above and having an activity of sequentially releasing an acetyl group and an amino acid from the amino terminal. It was prepared and the DNA fragment obtained by BamHI digestion was inserted into the BamH site of plasmid vector pUC18.
  • an LB plate containing 100 xz gZmL of ambicilin (10 g of tryptone / liter, 5 g of yeast extract / liter, NaC 15 g / litre, agar 15 g / litre, pH 7.2) Spread on top, and transform the resulting transformants individually into 5 mL containing 100 gZmL of ampicillin.
  • LB medium The cells collected by centrifugation of the culture were suspended in 50 mM Tris-HC1 ( ⁇ 8.0) 50 ⁇ L, heat-treated at 100 ° C for 10 minutes, and then sonicated. The cells were disrupted. The lysate was again heat-treated at 100 ° C. for 10 minutes and centrifuged to obtain a lysate. Peptidase activity was measured for this lysate.
  • plasmid pDAP1 50 L of 0.1 MPI PES-Na buffer (pH 7.6) and 5 L of 5 mM Met-MCA (dissolved in dimethyl sulfoxide) were added to 15 L of lysate, and the mixture was reacted at 90 for 1.5 hours. I let it. Thereafter, the amount of 7-amino-4-methyl coumarin produced was measured using Titertec Fluoroscan II (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) at an excitation wavelength of 355 nm and a measurement wavelength of 460 nm.
  • a plasmid was prepared from a transformant having Met-MCA degrading activity and named plasmid pDAP1.
  • plasmid p DAP2 containing amino-terminal protecting group releasing enzyme gene
  • the above plasmid pDAP1 was digested with Ec0RI and self-ligated. Was done.
  • the recombinant plasmid was introduced into Escherichia coli JM109, and the lysate prepared from the obtained transformant was used to examine the peptidase activity by the method described above.
  • a plasmid was prepared from the transformant in which the enzyme activity was observed, and this was named plasmid pDAP2.
  • FIG. 1 shows a restriction map of plasmid pDAP3.
  • FIG. 1 A plasmid was prepared from a colony in which the enzyme activity was observed, and this was named plasmid pDAP.
  • Figure 2 shows a restriction map of plasmid PDAP.
  • Escherichia coli JM109 transformed with the plasmid pDAP is named and displayed as Escherichia coli JM109 / pDAP, and 1-3 1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan (zip code 30 5) Deposited with FERM BP-5804 at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology of the Ministry of International Trade and Industry of the Ministry of International Trade and Industry of Japan (Original deposit date: 1992, March 29, 2006 Transfer to international deposit: 19 January 30, 1997).
  • nucleotide sequence of each fragment was determined.
  • the nucleotide sequence was determined by the dideoxy method using Bca BEST dideoxy sequencing kit (Takara Shuzo Co., Ltd.).
  • the nucleotide sequences of the obtained fragments were compared and integrated, and the above 1.2 kb DNA fragment was analyzed. The entire nucleotide sequence was determined.
  • SEQ ID NO: 3 in the sequence listing shows the nucleotide sequence of a DNA fragment of about 1.2 kb containing the DNA encoding the amino-terminal protecting group-releasing enzyme inserted into plasmid pDAP.
  • base numbers 86 to 88 are the start codon
  • base numbers 113 to I132 are the stop codon
  • the open reading frame between them is assumed to be the structural gene region of the enzyme.
  • SEQ ID NO: 2 in the sequence listing shows the nucleotide sequence of the above open reading frame. Further, SEQ ID NO: 1 in the sequence listing shows the amino acid sequence of the amino terminal protecting group releasing enzyme of the present invention deduced from the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Escherichia coli JM109 / pDAP was inoculated into each of two test tubes containing 5 mL of LB medium supplemented with 100 ⁇ g ZmL of ampicillin under normal culture conditions and cultured at 37 ° C. A 68 .
  • When 1, add isopropyl yS-D-thiogalactopyranoside to a final concentration of ImM, and then add 37 to 16 to 18 hours
  • the active fraction is adsorbed to a 5 mL Econopack hig hQ cartridge (manufactured by BioRad) column previously equilibrated with buffer B, washed thoroughly with buffer B, and then washed with 0.5 to 0.5 M NaCl. 1Eluted with buffer B having a linear concentration gradient.
  • the met-MCA degrading activity of the eluate was measured, and the active fraction was collected to obtain a purified enzyme preparation.
  • One unit of the obtained purified enzyme preparation was defined as the amount of enzyme capable of producing 7-amino-4-methylcoumarin with 1 mol per minute at pH 7.6 and 75 ° C using Me-MCA as a substrate. .
  • Example 2 Example 2
  • the measurement of the optimum temperature was performed by the following operation. That is, the activity was measured at various temperatures by an enzyme activity measurement method using Met-MCA as a substrate, using an enzyme sample of 18 micro units. As shown in FIG. 3, the enzyme of the present invention has an activity in the range of 25 to 95 at the measured pH of 7.6, and has the highest activity at 95 ° C., which is the highest temperature at which the measurement was performed. Indicated. As shown in FIG. 3, the optimal temperature of the enzyme preparation of the present invention was 75 to 95 ° C. at pH 7.6. In the figure, the vertical axis shows the relative activity (%) relative to the maximum activity (95 ° C), and the horizontal axis shows the reaction temperature (° C). 2Optimal pH
  • the measurement of the optimum pH was performed by the following operation. That is, using the enzyme sample of 18 micro units and using the above-mentioned method of measuring enzyme activity using Met-MCA as a substrate, the buffer added to the reaction solution was changed to various pH buffers. Activity measurements were performed. As shown in FIG. 4, the optimum pH of the enzyme of the present invention was around pH 6.5 to 9.5. In the figure, the vertical axis shows the relative activity (%) with the activity at pH 7.2 as 100, and the horizontal axis shows the pH at 75 ° C.
  • the buffer used for activity measurement is 2 OmM sodium acetate buffer at pH 4.1 to pH 5.1, 20 mM PI PES-Na buffer at ⁇ 5.8 to pH 7.2, pH 8.0 to 9.5. In the above, 20 mM sodium borate buffer was used, and in the case of pH 9.9 to 10.6, 20 mM disodium hydrogen phosphate-sodium hydroxide buffer was used. The above pH is a value at 75.
  • the activity of the enzyme of the present invention was inhibited by amastin.
  • amastin For example, after treating the enzyme of the present invention in 3 milliliters in 50 L of 2 OmM borate buffer (pH 10.0) containing 1 mM amastatin for 37 minutes (:, 30 minutes, When the activity of 5 L was measured by the method described in (2) above, the value was 1.5% of that of the buffer treated with amastatin-free buffer.
  • the activity of the enzyme of the present invention is facilitated by C oC 1 2.
  • C oC 1 2 the addition of C 0 C 1 2 to a final concentration of 9 1 M in the measurement system using the above-mentioned M et-MCA, was about 6 times the activity as compared to those not added.
  • the enzyme of the present invention showed a molecular weight of about 40,000 by SDS-polyacrylamide electrophoresis and about 400,000 by ultracentrifugation. 5 Temperature stability
  • the residual enzyme activity after heat treatment of the enzyme preparation was examined, and the temperature stability of the enzyme of the present invention was examined. That, 26 0. 1 M Tris containing millimeter units of enzyme preparation - HC 1 buffer (. PH8 0), or which was also added to C 0 C 1 2 at a final concentration of 0. 1 mM to 75 After treating for 0 to 5 hours, the remaining enzyme activity was measured using a part thereof. The activity was measured by the enzyme activity measurement method using the above-mentioned system using Met-MCA as a substrate.
  • 0 enzyme of the present invention including C oC 1 2 of 0. 1 mM.
  • Tris - HC 1 buffer (p H 8. 0) was not observed at all low under the enzymatic activity after 5 hours treatment in, also 5 hours at C o C l 2 does not include a buffer In this case, the activity was maintained at 80% or more.
  • the vertical axis indicates the remaining enzyme activity (), and the horizontal axis indicates the heat treatment time (hour).
  • FIG. 8 shows the results of an experiment similar to Hiichi MSH, in which the substrate was changed to Ac—Gly-Asp-Va1—Glu-Lys.
  • glycine was released in the reaction solution, indicating that the enzyme cleaved the bond between the acetyl group and glycine, and subsequently the bond between daricin and aspartic acid. It was suggested.
  • trace amounts of aspartic acid and parin were also confirmed in the reaction solution.
  • the reaction solution contained lysine, valin, phenylalanine, and glycine at the amino terminal of reduced lysozyme.
  • Arginine is released, and from the change in the amount of arginine produced over time, this enzyme acts from the amino terminal side of reduced lysozyme to produce amino acids. It was shown that sequential release.
  • the pDAP DNA is a type II, and consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing for replacing the codon of valine, which is the second amino acid from the N-terminal of the enzyme, with the codon of aspartic acid.
  • Synthetic DNA and plasmid p PCR was performed using a synthetic DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 for crushing each of the Hind III and Sph I restriction enzyme sites with the sequence in the multi-cloning site as a primer pair. After the PCR reaction, the reaction mixture is digested with Sph I (Takara Shuzo) to digest the non-mutated plasmid, and then introduced into Escherichia coli J Ml09 (Takara Shuzo) to obtain the resulting transformant. The desired mutagenized plasmid was prepared from the body.
  • this plasmid DNA was designated as type III, and the base described in SEQ ID NO: 14 of the sequence listing for introducing the BamHI site immediately upstream of the protein initiation codon in the protein coding region of the DNA PCR was performed using a synthetic DNA having a nucleotide sequence complementary to the downstream region of the protein coding region of the DNA described in SEQ ID NO: 15 in SEQ ID NO: 15 as a primer pair. .
  • the reaction solution was subjected to agarose electrophoresis, and the amplified DNA fragment of about 1.2 kb was recovered from the agarose gel.
  • This DNA fragment was digested with BamHI (Takara Shuzo) and HindIII (Takara Shuzo), and the plasmid vector PVT1033-L BamHI and Hind of the E. coli and yeast shuttle vectors were digested. Inserted using the i II site. This recombinant plasmid was introduced into Escherichia coli JM109, and plasmid DNA was prepared from the obtained transformant.
  • an auxotrophic plate (6.7 g / litre of yeast nitrogen base, 20 g of glucose, 3 g of glucose, tritophan 2 OmgZ little, histidine) Transformants obtained on 2 OmgZ liter, Peracil 2 OmgZ liter, agar 15 gZ liter) were individually transformed into YPD medium (10 liter yeast extract, 20 gZ liter yeast peptone, 20 gZ liter glucose, 20 gZ glucose). (Little) A test tube containing 5 ml was inoculated and cultured at 30 ° C for 16 hours.
  • Each culture was individually inoculated into a triangular flask containing 50 Om1 of the auxotrophic medium described above, and cultured at 30 ° C for 16 hours. The culture is centrifuged and the cells are recovered. Received. The obtained cells are suspended in 5 Om 1 of buffer C (1 M sorbitol, 5 OmM Tris-HC1, pH 7.5, 3 OmMDTT), incubated at 30 ° C for 10 minutes, and centrifuged. The cells were further suspended in 1 Oml of buffer D (1 M sorbitol, 5 OmM Tris-HC1, pH 7.5, 2 mM DTT), and Zymoryase 100 T (manufactured by Seikagaku Corporation) was finally added.
  • buffer C 1 M sorbitol, 5 OmM Tris-HC1, pH 7.5, 3 OmMDTT
  • Zymoryase 100 T manufactured by Seikagaku Corporation
  • the solution was added to a concentration of 0.5 mgZm 1, incubated at 30 ° C for 30 minutes, and centrifuged to obtain protoplasts.
  • the obtained protoplasts were suspended in 20 ml of buffer E (50 mM Tris-HC1, pH 7.5, 2 mM DTT), and EDTA, KC1, and TritonX-100 were added to final concentrations of 1 mM and 0.2 M, respectively. , 0.2%, and kept at 37 ° C for 5 minutes.
  • the suspension was heat-treated at 100 ° C. for 15 minutes, and then centrifuged to obtain a lysate.
  • a modified enzyme preparation was prepared using Met-MCA degrading activity as an index according to the same purification method as the amino terminal protecting group releasing enzyme described in (9) of Example 1.
  • One unit of the modified enzyme preparation is the amount of enzyme capable of producing 1 / mol of 7-amino-4-methylcoumarin per minute at pH 7.6 and 75'C using met-MCA as a substrate.
  • the yeast expressing the above protein was named and displayed as Saccharomyces cerevisiae BJ2168 / pA cDAP, and it was designated as 1-3-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan (zip code: 2005).
  • FERM BP-5952 (Original date of deposit: May 23, 1997).
  • the amino terminal protecting group releasing activity of the modified enzyme preparation prepared in (2) was measured according to the method described in (3) and (4) of Example 3. As a result, the modified enzyme showed a releasing activity for the acetyl group and a myristyl group at the N-terminal of the peptide, and further showed an activity of allowing the amino acid to migrate sequentially from the N-terminal of the peptide.
  • the molecular weight difference 57 between the two enzymes was equal to the sum of the molecular weight difference 15 when palin was replaced by asparagine and the molecular weight increase 42 due to the addition of the acetyl group. Further, the modified enzyme was subjected to HP G1000A Protein Sequencer (manufactured by Hewlett-Packard) employing an N-terminal amino acid sequence analysis method by Edman degradation, and a signal was obtained. Thus, it was found that the modified enzyme did not undergo Edman degradation.
  • a carboxymethylated product of N-terminally acetylated erythrocyte superoxydoximesidase (molecular weight: 1,551, manufactured by Washington Biochemical Corp.—Shion) was used.
  • the solution 51 prepared so that the substrate had a concentration of 0.4 mM was added to the modified enzyme preparation (52 1) of 600 milliunits prepared in (2), and 10 OmM of trimethylamine-HC1.
  • buffer 1 0 0 ⁇ 1, 1 Omm C 0 C 1 2 of 2 // and distilled water 4 1 1 was added, after 48 hours reaction at 5 0 ° C, the reaction solution was directly subjected to HP G1000A protein sequencer to perform amino acid sequence analysis.
  • the obtained amino acid sequence data is shown in SEQ ID NO: 16 in the sequence listing.
  • the sequence was consistent with the known amino acid sequence of superoxide dismutase used as a substrate.
  • no signal other than the amino acid sequence of the above superoxide dismutase was mixed.
  • the amino terminal protecting group releasing enzyme of the present invention exhibits an amino terminal protecting group releasing activity for two or more kinds of protecting groups.
  • the present invention also provides a method for removing the amino-terminal protective blockage of a peptide using such an enzyme.
  • the enzymes are useful for amino acid sequencing of peptides, especially proteins and peptides where the amino terminus is blocked by an unidentified protecting group.
  • the present invention provides a DNA encoding such an enzyme and a method for producing the enzyme.
  • the N-terminal acetylated amino terminal protecting group releasing enzyme produced by modifying the DNA is not subject to Edman degradation, and particularly, in the amino acid sequence analysis method using Edman degradation, the amino acid sequence information derived from the enzyme is noise. This is useful.
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • GTAGTTTCTC CTTAAAAGTC TCGCCCAAAA TCCTTATATA ATGAGAAAAT AACACTTAGA 60 TGATCATCTA AATGGGGGGA GGAAGATGGT GGACTATGAG CTTTTAAAAA AGGTAGTAGA 120 GGCTCCGGGA GTTTCAGGAT ATGAGTTCAT GGGAATTAGA GATGTCGTATAGAG
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence:
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence:
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence:

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

明 紬 書 新規なァミノ末端保護基遊離酵素 技術分野
本発明は、 タンパク質およびべプチドのァミノ末端に存在する保護基を遊離さ せる活性を有するァミノ末端保護基遊離酵素に関する。 また本発明は、 かかるァ ミノ末端保護基遊離酵素をコードする D N Aに関する。 また本発明は、 かかるァ ミノ末端保護基遊離酵素の遺伝子組換え技術による製造方法に関する。 また本発 明は、 かかるァミノ末端保護基遊離酵素を用いるァミノ末端保護基の除去方法に 関する。 さらに本発明は、 かかる除去方法を用いるアミノ酸配列の解析方法に関 する。 さらに本発明は、 上記アミノ末端保護基遊離酵素を含有する、 アミノ酸配 列の解析に使用されるキッ トに関する。 さらに本発明は、 上記アミノ末端保護基 遊離酵素又はその機能的同等物に特異的に結合する抗体またはその断片に関する 。 さらに本発明は、 上記 D NAとハイブリダィズする合成オリゴヌクレオチドプ ローブ又は合成オリゴヌクレオチドプライマ一に関する。 背景技術
タンパク質およびペプチドのァミノ末端アミノ酸配列を決定することは、 それ らの同定もしくは確認に対して不可避の分折である。
しかしながら、 真核細胞生物由来の可溶性タンパク質の 6 0 %以上がそのアミ ノ末端のひ—アミノ基をァセチル基やその他の保護基によってプロックされてい ると言われており、 ァミノ末端からのアミノ酸配列決定法として既に確立され広 く利用されているェドマン分解法では、 保護基によりアミノ末端がプロックされ たタンパク質およびべプチドの分析を行うことができない。
夕ンパク質およびべプチドのァミノ末端をプロックしている保護基としては、 ホルミル基、 ァセチル基、 ミ リストイル基、 ピログルタミル基、 ジメチル基、 グ ルクロニル基、 グリコシル基、 トリメチル基等が報告されている。 これらブロッ クされたタンパク質のァミノ末端ァミノ酸配列分析法としては、 保護基を除去し た後にエドマン分解法を適用する方法が用いられる。
保護基の除去には、 酵素を用いる方法と化学的方法があるが、 酵素法では、 ァ セチル基の場合はアンルァミノ酸遊雜酵素、 ピログルタミル基の場合にはピログ ルタミルぺプチダーゼを用いるといった具合に保護基の種類により用いる酵素が 異なり、 汎用性に欠けるという欠点を持っており、 化学的方法も汎用性のある方 法は開発されていない。 また、 了ミノ末端がブロックされている場合にその保護 基を同定する方法は知られていないため、 実際に保護基の除去を行う際には、 そ れぞれの保護基の種類に応じた除去方法をひとつずつ試してみる以外の方法はな い。 さらに、 ミ リストイル基でブロックされたタンパク質及びペプチドについて は有効な保護基除去方法がなく、 アミノ末端からの配列を得ることは不可能であ る
なお、 これまでにピロコッカス フリオサスより単離された、 ペプチドのアミ ノ末端部分に作用するべプチダ一ゼとしてはァミノぺプチダ―ゼ （特開平 6-3195 66号） 、 ピログルタミルべプチダ一ゼ （特開平 7- 298881号） 、 およびメチォニン アミノぺプチダ一ゼ （特開平 8-9979号） が知られている。 このうち、 ピログル夕 ミルぺプチダーゼはァミノ末端のピログル夕ミル基を遊離する活性を有している が、 これ以外の保護基、 たとえばァセチル基に対しては作用しない。 また、 他の 2種の酵素は保護基でブロックされたァミノ末端には作用できない。
前記のように保護基によりアミノ末端がプロックされたタンパク質およびぺプ チドに対する現行のァミノ末端ァミノ酸配列分析法は、 汎用性がないことに問題 点を有する。 発明の開示 従って、 本発明の目的は、 2種以上の保護基に対してァミノ末端保護基遊雜活 性を示すァミノ末端保護基遊雜酵素やその機能的同等物、 該酵素をコードする D NA、 該酵素の製造方法、 該酵素を作用させるァミノ末端保護基の除去方法、 該 方法を用いるアミノ酸配列の解析方法、 及び上記酵素を含有するアミノ酸配列解 折用キッ トを提供することにある。 さらに本発明の目的は、 上記アミノ末端保護 基遊離酵素又はその機能的同等物に特異的に結合する抗体またはその断片や、 上 記 D N Aとハイプリダイズする合成オリゴヌクレオチドプローブ又は合成オリゴ ヌクレオチドプライマ一を提供することにある。
本発明者らは、 ピロコッカス フリオサス由来のコスミ ドプロテインライブラ リ一を検索し、 ァミノ末端の保護基を遊離する活性を発現する 1個のコスミ ドク ローンを取得した。 本発明者らは、 このクローン中に含まれるァミ ノ末端保護基 遊離酵素遺伝子を単離してその塩基配列を決定した。 また微生物において該酵素 を大量に発現する組換えプラスミ ドの構築を行ない、 酵素の生産に成功するとと もに、 該酵素の種々の酵素学的性質を明らかにした。 さらに、 該酵素がァセチル 基をはじめとする複数のァミノ末端保護基を遊離する活性を有することを見い出 した。 また該酵素の機能的同等物の作製に成功し本発明を完成させた。 即ち、 本発明の要旨は、
〔 1〕 保護基によってァミノ末端がブロックされたぺプチドに作用して該保護 基を遊離させる活性 （ 「アミノ末端保護基遊離活性」 と略記する。 ） を有する酵 素であって、 2種以上の保護基に対して前記活性を示すことを特徴とするアミ ノ 末端保護基遊離酵素、
〔2〕 ァセチル基、 ビログルタミル基、 ホルミル基、 及びミ リストイル基から なる群より選ばれる少なくとも 2種以上の保護基に対してァミノ末端保護基遊離 活性を示す、 前記 （ 1 ) 記載の酵素、
〔3〕 さらにアミノぺプチダーゼ活性を有する請求項 1又は 2記載の酵素、 〔4〕 下記の理化学的性質を有する前記 （ 1 ) 〜 （3) いずれか記載の酵素、
( 1 ) 至適温度： pH7. 6において 75〜 95で
(2) 至適 pH : pH6. 5〜9. 5
( 3 ) 各種試薬の影響：
アマス夕チンによって活性が阻害を受け、 CoC l 2 によって促進される。 〔5〕 配列表の配列番号： iに示されるアミノ酸配列の全部、 又はその一部を 含むものであってァミノ末端保護基遊離活性を示す、 前記 （ 1 ) 〜 （4) いずれ か記載の酵素、
〔6〕 配列表の配列番号： 1に示されるアミノ酸配列に、 1個もしくは複数の アミノ酸残基が欠失、 付加、 挿入もしくは置換の少なく とも 1つがされており、 かつアミノ末端保護基遊離活性を示す、 前記 （5) 記載の酵素の機能的同等物、
〔7〕 ァミノ末端が保護基によりブロックされた前記 （6) 記載の機能的同等 物、
〔8〕 保護基がァセチル基である前記 （7) 記載の機能的同等物、
〔9〕 配列表の配列番号： 1 0に示されるアミノ酸配列を有する前記 （8) 記 載の機能的同等物、
〔 1 0〕 前記 （ 1 ) 〜 （4) いずれか記載のァミノ末端保護基遊離酵素をコー ドする DNA、
〔 1 1〕 配列表の配列番号： 1に示されるアミノ酸配列の全部、 又はその一部 を含むものであってアミノ末端保護基遊離活性を示すものをコードする DNA、
〔 1 2〕 配列表の配列番号： 2に示される DNAの全部、 又はその一部を含む ものであってァミノ末端保護基遊離活性を示すものをコードする DNA、
〔 1 3〕 配列表の配列番号： 1に示されるアミノ酸配列に、 1個もしくは複数 のアミノ酸残基が欠失、 付加、 挿入もしくは置換の少なく とも 1つがされており 、 かつアミノ末端保護基遊離活性を示すタンパク質をコ一ドする DNA、
〔 1 4〕 配列表の配列番号： 1 1に示す塩基配列を有する前記 （ 1 3) 記載の DNA、
〔 1 5〕 前記 （ 1 0) 〜 （ 1 4) いずれか記載の DNAにハイプリダイズ可能 な、 アミノ末端保護基遊離活性を示すタンパク質をコードする DNA、
〔 1 6〕 前記 （ 1 0) 〜 （ 1 4) いずれか記載の DNAを含んでなる組換え D NA、
〔 1 7〕 前記 （ 1 6) 記載の組換え DN Aを挿入されてなる、 微生物、 動物細 胞又は植物細胞を宿主細胞とする発現ベクター、
〔 1 8〕 前記 （ 1 7) 記載の発現ベクターにより形質転換されてなる形質転換 体、
〔 1 9〕 前記 （ 1 8 ) 記載の形質転換体を培養し、 該培養物中よりアミノ末端 保護基遊離活性を有するタンパク質又はその活性と機能的に同等の活性を有する ポリぺプチドを採取することを特徴とするァミノ末端保護基遊離酵素又はその機 能的同等物の製造方法、
〔20〕 保護基によってァミノ末端がプロックされたぺプチドに、 前記 （ 1 ) 〜 （9) いずれか記載のァミノ末端保護基遊離酵素又はその機能的同等物を作用 させてァミノ末端の保護基を遊離させることを特徴とするァミノ末端保護基の除 去方法、
〔2 1〕 保護基によってァミノ末端がプロックされたぺプチドのァミノ酸配列 の解析方法において、 前記 （ 1 8) 記載の除去方法により該保護基を遊離させた 後、 ァミノ酸配列の解析に供することを特徴とするァミノ酸配列の解析方法、
〔22〕 保護基によってァミノ末端がプロックされたぺプチドのァミノ酸配列 の解析に使用されるキッ 卜であって、 前記 （ 1 ) 〜 （9) いずれか記載のァミノ 末端保護基遊離酵素又はその機能的同等物を含有することを特徴とするキッ ト、
〔23〕 前記 （ 1 ) 〜 （ 9 ) いずれか記載のァミノ末端保護基遊離酵素又はそ の機能的同等物に特異的に結合する抗体又はその断片、
〔24〕 前記 （ 1 0) 〜 （ 1 5) いずれか記載の DNAとハイプリダイズする 合成ォリゴヌクレオチドプローブ又は合成オリゴヌクレオチドプライマ一、 に閭 するものである。 図面の簡単な説明
第 1図は、 プラスミ ド p DAP 3の制限酵素地図を示す図である。
第 2図は、 ブラスミ ド pDAPの制限酵素地図を示す図である。
第 3図は、 本発明におけるァミノ末端保護基遊離酵素の至適温度を示すグラフ である。
第 4図は、 本発明におけるァミノ末端保護基遊雜酵素の至適 pHを示すグラフ である。 図中、 △は酢酸ナトリウム緩衝液、 拿は？ I PES— N a緩衝液、 〇は ホウ酸ナトリゥム緩衝液、 ▲はリン酸水素ニナトリゥム一水酸化ナトリゥ厶緩衝 液を用いてのデータを示す。
第 5図は、 75 °Cでの本発明におけるァミ ノ末端保護基遊離酵素の温度安定性 を示すグラフである。 図中、 秦は 0. 101!^のじ 0じ 12 を含む緩衝液中でのデ 一夕、 〇は CoC l 2 を含有しない緩衝液中でのデータを示す。
第 6図は、 本発明におけるアミノ末端保護基遊離酵素のニューロテンシンに対 する経時作用を示す図である。
第 7図は、 本発明におけるァミノ末端保護基遊離酵素のひ一 MS Hに対する経 時作用を示す図である。
第 8図は、 本発明におけるァミノ末端保護基遊離酵素の Ac - G 1 y-As p 一 Va 1— G 1 u— Lysに対する経時作用を示す図である。
第 9図は、 本発明におけるアミノ末端保護基遊雜酵素の Fo r -Me t -L e υ-Phe-L sに対する経時作用を示す図である。
第 1 0図は、 本発明におけるァミノ末端保護基遊離酵素の My r— Ph e - A 1 a-Ar g-Lys-G l y-A 1 a-Leu-Ar g-G l nに対する経時 作用を示す図である。 第 1 1図は、 本発明におけるァミノ末端保護基遊離酵素の M y r - G 1 y - A 1 a - G 1 y - A 1 a - S e r - A 1 a - G l υ - G l u - L y sに対する経時 作用を示す図である。
第】 2図は、 本発明におけるァミノ末端保護基遊離酵素の還元リブチームに対 する経時作用を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
1 . 本発明のァミノ末端保護基遊離酵素について
本発明のァミノ末端保護基遊離酵素は、 保護基によってァミノ末端がプロック されたぺプチドに作用して該保護基を遊離させる活性 （アミノ末端保護基遊離活 性） を有する酵素であって、 2種以上の保護基に対して活性を示すことを特徴と する。
ここで、 「ペプチド」 とは、 2以上のアミノ酸がペプチド結合によってつなが つたものを示し、 「タンパク質 J として記載されているものを包含する。
このペプチドのァミノ末端に存在する保護基としては、 ァセチル基、 ピログル 夕ミル基、 ホルミル基、 ミ リストイル基等が挙げられる力 本発明のァミノ末端 保護基遊離酵素は、 基質のぺプチドのァミノ末端からこれらの保護基のうち少な く とも 2種以上の保護基を遊離させる活性を有する。 このようなァミノ末端保護 基遊離活性は、 ァミノ末端が上記保護基でプロックされた合成べプチド等を基質 として用いることにより後述の方法により測定できる。
本発明のァミノ末端保護基遊離酵素としては、 ァミノ末端保護基遊離活性を有 する酵素、 ァミノ末端保護基遊離活性を有し且つべプチドのァミノ末端より順次 ァミノ酸を遊離するァミノべプチダーゼ活性を有する酵素が举げられ、 具体的に はその一例として配列表の配列番号： 1に示されるァミノ酸配列からなる酵素が 挙げられる。 ァミノべプチダーゼ活性をさらに有する場合、 他のペプチドァミノ 末端分解法を併用する必要なしに、 ぺプチドのアミノ酸配列の解析を実施するこ とも可能である。 このようなァミノぺプチダ一ゼ活性は通常用いられる公知の方 法 （Arch. Biochera. Bi ophys.，第 2 7 4巻、 第 2 4 1〜2 5 0頁 （ 1 9 8 9 ) ) に より測定できる。
ァミノ末端保護基遊離活性を有しかつァミノぺプチダーゼ活性を有する酵素の —例として、 具体的には配列表の配列番号： 1に示されるアミノ酸配列からなる 酵素が挙げられる。 本発明の酵素は、 そのアミノ末端が遊離の状態であってもよ く、 あるいは該酵素のァミノ末端自体が保護基によってプロックされていてもよ い。 従って、 本明細書において特に言及がない限り、 該酵素のァミノ末端はいず れの状態のものをも含んでいる。 従って、 配列番号： 1にはァミノ末端が遊離の 状態のものを示したが、 配列番号： 1の配列を有し、 ァミノ末端が了セチル基な どの保護基によってプロックされているものも本発明の範囲内である。
本発明のァミノ末端保護基遊離酵素は、 例えば 1 ) 本発明の酵素を生産する微 生物の培養物からの精製、 2 ) 本発明の酵素をコードする D N Aを含有する形質 転換体の培養物からの精製、 等の方法により製造することができる。
1 ) 本発明の酵素を生産する微生物の培養物からの精製
本発明の酵素を生産する微生物については、 酵素活性を指標としたスクリ—二 ングによってかかる微生物を見い出すことができる。 酵素活性を検出する方法と しては、 ァミノ末端が保護基でプロックされたァミノ酸やべプチドを基質に用い て、 該基質からの保護基の遊離を高速液体クロマ卜グラフィーゃァミノ酸分析法 、 質量分析法等によって確認する方法がある。 また、 保護基でブロックされたァ ミノ酸に、 さらに適当な発色基や蛍光基を付加した合成基質等を利用することも できる。
上記のようにして、 アミノ末端保護基遊離酵素の生産が確認された微生物を培 養することにより該酵素を製造することができる。 微生物の培養はその微生物の 生育に適した条件で行えばよく、 好ましくは目的の酵素の発現量が高くなるよう な培養条件が用いられる。 こうして菌体あるいは培養液中に生産された目的の酵 素は、 通常の酵素精製に用いられる方法によって精製することができる。
上記のスクリ一二ングにより明らかになった、 本発明の酵素を生産する微生物 としては、 ピロコッカス フリオサス D S M 3 6 3 8が挙げられる。
以下、 ピロコッカス フリオサス D S M 3 6 3 8を例として、 本発明の酵 素の製造方法について述べるが、 これに限定されるものではない。 なお、 ビロコ ッカス フリオサス D S M 3 6 3 8は、 ドイツチェ ザムルンク フォン ミ クロオルガニスメン ゥント ッヱルクルチュレン ゥント G m b H (Deuts ch S細 lung von Mi kroorgani smen und Zel lkul turen und GmbH)より入手可能な 菌株である。
該菌株の培養にあたっては、 通常、 超耐熱菌の培養に用いられる方法が利用で き、 培地に加える栄養源は該菌株が利用しうるものであればよい。 炭素源として は、 例えばデンプン等が利用でき、 窒素源としては、 例えばトリプトン、 ぺプト ン、 酵母エキス等が利用できる。 培地中には、 マグネシウム塩、 ナトリウム塩、 鉄塩等の金属塩を微量元素として加えてもよい。 また例えば、 培地の調製に人工 海水を用いることが有利である。 また培地は固形の硫黄を含んでいない透明な培 地が望ましく、 該培地を用いれば、 菌体の増殖は培養液の濁度を測定することに より容易に監視することができる。 培養にあたっては静置培養又は攪拌培養で行 なうことができるが、 例えばアプライド アンド エンバイロンメンタル マイ クロバイオロジー、 第 5 5巻、 第 2 0 8 6〜2 0 8 8頁 （ 1 9 9 2 ) に記載のよ うに、 透折培養法を用いてもよい。 一般に培養温度は 9 5 °C前後が好ましく、 通 常 1 6時間程度でァミノ末端保護基遊離酵素が培養物中に著量蓄積する。 培養条 件は、 使用する菌体、 培地組成に応じアミノ末端保護基遊離酵素の生産量が最大 になるように設定するのが好ましい。
アミノ末端保護基遊離酵素を採取するに当たっては、 例えば培養液から遠心分 離、 濾過などによって菌体を集め、 次いで菌体を破砕して粗酵素液を調製する。 菌体の破砕方法としては、 超音波破砕、 ビーズ破砕、 溶菌酵素処理等のうちから 目的酵素の抽出効果の高い方法を選べばよい。 また、 培養液中に該酵素が分泌さ れている場合には、 硫安塩析法ゃ限外濾過法等によって酵素を濃縮し、 これを粗 酵素液とする。 かく して得られた粗酵素液からァミノ末端保護基遊離酵素を単離 するにあたっては、 通常の酵素の精製に用いられる方法を使用できる。 例えば、 硫安塩析処理、 イオン交換クロマトグラフィー、 疎水クロマトグラフィー、 ゲル 濾過クロマトグラフィ一等の方法を組み合わせて使用できる。
2 ) 本発明の酵素をコードする D N Aを含有する形質転換体の培養物からの精 製
本発明に係る酵素をコードする D NAは、 適当な微生物の遺伝子ライブラリ一 のスクリーニングにより得ることができる。 微生物としては上記と同様、 酵素活 性を指標としたスクリ一二ングによって見い出すことができる。
より具体的には、 例えばピロコッカス属に属する細菌、 例えばピロコッカス フリォサスのゲノ厶のコスミ ドライブラリーより目的の D NAをスクリ一二ング し、 得ることができる。 ピロコッカス フリオサスとしてはピロコッカス フリ ォサス D S M 3 6 3 8が使用できる。
また、 このような微生物からの所望の D N Aのクローニングゃ本発明の酵素を コードする D N Aを含有する形質転換体の調製及び培養、 培養物からの所望の夕 ンパク質の精製等の方法は、 通常行われる公知の方法を用いることができる。 以 下、 ピロコッカス フリオサス D S M 3 6 3 8を例として、 本発明の製造方 法について述べるが、 これに限定されるものではない。
ピロコッカス フリオサス ゲノムのコスミ ドライブラリーは、 ピロコッカス フリオサス ゲノム D N Aを制限酵素 S a u 3 A I (宝酒造社製） で部分消化し て得られた D NA断片をトリブルヘリックスコスミ ドベクタ一 （ストラタジーン 社製） に導入した後、 インビトロパッケージング法によってラムダファージ粒子 中にパッケージングすることにより作製することができる。 次にこうして得られ たライブラリ一を用いて適当な大腸菌、 例えば大腸菌 DH 5ひ MCR (BRL社 製） を形質転換し、 この形質転換体中の本発明に係わる酵素活性を調べることに より、 該酵素の DNAを含有するクローンを得ることができる。
さらに本発明者らは、 該酵素活性のスクリーニングに際し、 材料としたピロコ ッカス フリオサスの生産する酵素が高い耐熱性を有する点に着目し、 コスミ ド ライブラリ一を用いて得られる形質転換体を個別に培養し、 得られた菌体から耐 熱性の蛋白のみを含むライゼ一トを調製する工程を組合わせた。 この一群のライ ゼ一 トは、 コスミ ドプロティンライブラリーと命名され、 該コスミ ドプロティン ライブラリーを酵素活性の検出に用いることにより、 形質転換体のコロニーを用 いる方法よりも検出感度が上がるとともに、 宿主由来のタンパク等によるバック グラウンドゃ酵素活性の阻害といった悪影響を熱変性操作により除去することが できる。
即ち、 まず、 コスミ ドライブラリーを用いて得られた形質転換体を培養して得 られる菌体を熱処理 （ 1 0 0て、 1 0分間）、 超音波処理、 再熱処理 （ 1 0 o°c 、 1 0分間） した後、 遠心分離を行って上清 （ライゼート） を回収し、 コスミ ド プロテインライブラリ一を作製する。
次に、 該ライブラリーに含まれるそれぞれのライゼ一トについてぺプチダーゼ 活性の有無を調べ、 ぺプチダ一ゼを発現するクローンのスクリーニングを行う。 ぺプチダーゼ活性の検出には、 合成べプチドであるァミノ酸— 4ーメチルクマリ ルー 7—アミ ド （以下、 アミノ酸一 MCAと記載する。 ） を基質として使用する ことができ、 例えば、 Me t -MCA. Leu -MCA. A 1 a -MCA. H i s -MCA (ペプチド研究所社製） 等が使用できる。 ぺプチダーゼ活性が認めら れたライゼ一トは、 さらに、 ァミノ末端がァセチル基によりブロックされたぺプ チドであるひ一 MSH (な一メラニン細胞刺激ホルモン ：ぺプチド研究所社製） を基質に用いることにより、 ァミノ末端の保護基を遊離する活性を有するかどう かを調べることができる。 これにより、 保護基を遊離する活性を発現する DNA を含むコスミ ドクローンを得ることができる。
さらに、 このようにして得られたコスミ ドクローンより調製したコスミ ドを適 当な制限酵素で断片化し、 各断片を挿入した組換えプラスミ ドを作製することが できる。 次に該プラスミ ドを適当な微生物に導入して得られる形質転換体の生産. する Me t一 MCA分解活性を調べることにより、 目的の酵素をコ一ドする DN Aを含む組換えプラスミ ドを得ることができる。
上記のコスミ ドクローンから調製したコスミ ドを BamH I (宝酒造社製） 消 化し、 得られた DN A断片をプラスミ ドベクター pUC 1 8 (宝酒造社製） の B amH Iサイ 卜に挿入した組換えプラスミ ドを作製することができる。 次に、 こ のプラスミ ドを導入した大腸菌 JM1 09 (宝酒造社製） を培養した後、 得られ た菌体より調製したライゼ一ト中のぺプチダーゼ活性を調べることにより、 目的 とする DNAを含むブラスミ ドを得ることができる。 該プラスミ ドはプラスミ ド pDAP 1と命名されている。
次に、 上記のプラスミ ド pDAP 1を E c oR I (宝酒造社製） 消化し、 セル フライゲーシヨンを行うことにより組換えブラスミ ドを作製することができる。 該プラスミ ドを導入した大腸菌 JM 1 09を培養して得られる菌体のライゼ一ト のべプチダーゼ活性を確認し目的 DNAを含むプラスミ ドを得ることができる。 該プラスミ ドは p DAP 2と命名されている。
更に、 上記プラスミ ド pDAP 2よりアミノ末端保護基遊離酵素遺伝子を含ま ない DNA断片を次のように除くことができる。 すなわち、 前記プラスミ ド pD AP2を Sa c l (宝酒造社製） 消化して得られる約 1. 7kbの DNA断片を プラスミ ドベクター pUC 1 8 (宝酒造社製） の S a c Iサイ 卜に挿入し、 大腸 菌 JM1 09に導入する。 得られた形質転換体より調製したライゼ一トのぺプチ ダーゼ活性を測定し、 活性を示す形質転換体よりプラスミ ドを調製する。 該プラ スミ ドはブラスミ ド p DAP 3と命名されている。 第 1図にその制限酵素地図を 示す。 図中、 太い実線がプラスミ ドベクター pUC 1 8への挿入 DNA断片であ o
更に、 上記プラスミ ド p DAP 3よりアミノ末端保護基遊離酵素遺伝子を含ま ない DNA断片を次のように除くことができる。 すなわち、 前記プラスミ ド pD 八？ 3を311 & 8 1 (宝酒造社製） 、 S a c l (宝酒造社製） 消化して得られる 約 1. 2 k bの S n a B I— S a c I DNA断片をプラスミ ドベクター p UC 1 9の Sma I— S a c Iサイ 卜に挿入し、 大腸菌 JM 1 09に導入する。 得ら れた形質転換体より調製したライゼ一トのぺプチダーゼ活性を測定する。 さらに 、 ライゼ一トがァセチル基をァミノ末端より遊離する活性をひ一 MSHを基質に 用いて確認し、 活性を示す形質転換体よりプラスミ ドを調製する。 該プラスミ ド はプラスミ ド pDAPと命名されている。 第 2図にその制限酵素地図を示す。 図 中、 太い実線がプラスミ ドベクタ一 pUC 1 9への挿入 DNA断片である。 ブラ スミ ド p DAPを導入した大腸菌 JM 1 0 9は Escherichia coli J 109/pDAP と 命名され、 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 305 ) の通商産 業省工業技術院生命工学工業技術研究所に FERM BP— 5804として寄託 されている （原寄託日 ： 1 996年 3月 29日、 国際寄託への移管： 1 9 9 7年 1月 3 0曰） 。
上記プラスミ ド p DAPに含有されるピロコッカス フリオサス由来の DN A 断片の塩基配列は公知の方法、 例えば、 ジデォキシ法を用いて調べることができ る 0
配列表の配列番号： 3にプラスミ ド p DAPに揷入されている約 1. 2 kbの DNA断片の塩基配列を示す。 また、 該配列中に存在するオープンリーディ ング フレームの塩基配列を配列表の配列番号： 2に示す。 すなわち配列表の配列番号 ： 2は本発明によって得られるァミノ末端保護基遊離酵素遺伝子の塩基配列の 1 例である。 さらに配列番号： 1に、 配列番号： 2に示される塩基配列より推定さ れる本発明のァミノ末端保護基遊離酵素のァミノ酸配列を示す。 すなわち配列表 の配列番号： 1は本発明によって得られるァミノ末端保護基遊離酵素のァミノ酸 配列の 1例である。
上記のようにして得られる、 プラスミ ド p D A Pを導入した Escherichia col i JM109/pDAP を用いて本発明のァミノ末端保護基遊離酵素を得ることができる。 即ち、 Escherichia col i JM109/pDAP を通常の培養条件、 例えば 1 0 0 g / m Lのアンピシリンを含む L B培地 （トリプトン 1 0 リッ トル、 酵母エキス 5 g リッ トル、 N a C I 5 g Zリッ トル、 P H 7 . 2 ) 中、 3 7でで培養する ことにより、 培養菌体中にァミノ末端保護基遊雜酵素を発現させることができる 培養終了後、 培養菌体を集菌し、 得られた菌体を I 0 0で、 1 0分間の熱処理 を行う。 粗酵素液は熱処理菌体を超音波処理後遠心分離した上清として得られ、 該酵素液の 1 0 0 'C、 1 0分間の熱処理による夾雑タンパク質の変性処理、 ゲル ろ過クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィ一等の通常酵素の精製に 用いられる方法を組み合わせて用いることによってァミノ末端保護基遊離酵素を 精製することができる。
上記の方法により Escherichia col i JM109/pDAP より得られた本発明のァミノ 末端保護基遊離酵素の酵素化学的及び理化学的性質を以下に示す。
( 1 ) 作用
本発明の酵素は、 ペプチドのァミノ末端に存在する各種の保護基のうち、 少な く ともァセチル基、 ピログルタミル基、 ホルミル基、 ミ リストイル基を遊離する 。 さらに本発明の酵素は、 ペプチドのアミノ末端より順次アミノ酸を遊離する。
( 2 ) 酵素活性測定法
本発明の酵素活性は、 M e t— M C Aを基質に用い、 以下に示す操作によって 測定される。
a . 反応 酵素活性を測定しょうとする酵素標品を適度に希釈し、 その酵素溶液 5 に 2 OmM P I PES— Na緩衝液 （pH7. 6) 1 00 Lを加え、 さらに 1 mM Me t— MCA (ジメチルスルホキシドに溶解したもの） を 5〃 L添加し 、 7 5。Cで 20分間反応させた後、 30%酢酸を 1 0 L加えることにより反応 を停止する。
b. 測定
反応により生成する 7—アミノー 4—メチルクマリンを、 励起波長 355 nm 、 測定波長 4 6 0 nmでタイターテックフルォロスキャン【ί (大日本製薬株式会 社製） を用い定量する。 酵素 1単位は Me t—MC Αを基質とし、 ρΗ7· 6、 75。Cにおいて 1分間に 1 j mo 1の 7—アミノー 4 -メチルタマリンを生成し うる酵素量とする。 本発明の酵素は、 測定した pH7. 6、 75 °Cにおいて Me t一 MCA分解活性を有していた。 同様に、 本発明の酵素は Me t—MCAの他 、 L e u— MCA、 A 1 a -MCA, H i s— MCA等に作用し、 ァミノ酸を遊 離した。
( 3 ) 基質特異性
本発明の酵素は、 ベプチドのァミノ末端に保護基が存在する場合であっても、 ァミノ末端より保護基を遊離し、 更にアミノ酸を順次遊雜する。
上記活性は、 ァミノ末端がブロックされている合成べプチドを基質に用い確認 することができる。 すなわち、 酵素反応によって基質ペプチドより遊離するアミ ノ酸量の経時変化をァミノ酸分析により測定し、 ぺプチドの分解様式を解析する ことにより確認できる。 なお、 以下に示すペプチドのうち、 市販されていない物 は公知の方法、 例えばペプチド合成機を使用することにより化学的に合成し、 使 用することができる。
ピログルタミル基を遊離する活性は、 ニューロテンシンを基質に用いて調べる ことができる。 配列表の配列番号： 4にニューロテンシンのアミノ酸配列を示す 。 すなわち、 I mMニュー口テンシン （ペプチド研究所社製） 1 0 Lに 0. 1 2 ミ リ単位の酵素標品 （5 L) 、 4 OmM P I P E S - N a緩衝液 （ p H 7 . 6) 5 0〃L、 蒸留水 3 5 しを添加し、 3 7'Cで 0〜5時間反応させた後、 アミノ酸分析法により反応液中の遊雜アミノ酸の測定を行った。 この結果、 反応 時間の経過にしたがってニューロテンシンのァミノ末端よりピログルタミル基を 失ったロイシン及びそれに続くァミ ノ酸が順次遊離されていくことが確認され、 本発明の酵素がピログルタミル基を遊離する活性を有していることが示された。 ァセチル基を遊雜する活性は、 ひ一 MS H及び、 Ac— G l y— A s p-Va 1 -G 1 u -L y sを基質に用いて調べることができる。 配列表の配列番号： 5 及び配列番号： 6にそれぞれひ— MS H、 Ac -G 1 y-A s p-Va 1 -G 1 u— L y sのアミノ酸配列を示す。 すなわち、 1 mMの上記べプチド基質溶液 1 0 Lに 0. 1 2 ミ リ単位の酵素標品 （5 L) 、 4 OmM P I PES - Na ( H 7. 6) 緩衝液 5 、 蒸留水 3 5 u Lを添加し、 37 で0〜5時間 反応させた後、 ァミノ酸分析法により反応液中の遊離ァミノ酸の測定を行った。 この結果、 どちらの基質を用いた場合もまずァセチル基を失ったァミノ末端のァ ミノ酸が遊離されており、 本発明の酵素がァセチル基を遊離する活性を有してい ることが示された。 また反応時間の経過にしたがってこれに続くァミノ酸が順次 遊離されていくことも確認された。
ホルミル基を遊離する活性は、 F o r -Me t— L e u— Ph e - L y s (BA CHEM社製） を基質に用いて調べることができる。 配列表の配列番号： 7に F o r — Me t— L e u-Ph e— Ly sのアミノ酸配列を示す。 すなわち、 1 OmM
F o r -Me t -L e u-Ph e -Ly s ( 3 0 %酢酸溶液） 0. 5 Lに 4 ミ リ単位の酵素摞品 （3. 5 L) . 0. 1 Ν -ェチルモルホリ ン 25 juL 、 蒸留水 2 1 Lを添加し、 3 7 'Cで 0〜 2時間反応させた後、 アミノ酸分折法 により反応液中の遊離アミノ酸の測定を行った。 この結果、 反応液中にホルミル 基を失ったメチォニンが遊離されていることが確認され、 本発明の酵素がホルミ WO 97/49819 PCT/JP97 //0 v21 ^21丄
ル基を遊離する活性を有していることが示された。 また反応時間の経過にしたが つてこれに続くァミノ酸が順次遊離されていくことも確認された。
ミ リストイル基を遊離する活性は、 Myr— Phe— A l a-Ar g-Ly s -G l y-Al a-Leu-Arg-G l n (BACHEM社製） 及び My r -G 1 y -A 1 a -G 1 y - A 1 a -S e r -A 1 a -G 1 u - G l u -L y sを基質に . 用いて調べることができる。 配列表の配列番号： 8および配列番号： 9にそれぞ れ My r— Phe— A l a-Ar g-Lys-G l y - A 1 a-Leu-Ar g -G 1 n、 My r - G 1 y -A 1 a - G l y - A 1 a - S e r - A 1 a— G l u 一 G 1 u— L y sのアミノ酸配列を示す。 すなわち、 1 mMの上記べプチド基質 溶液 5 Lに 4ミ リ単位の酵素標品 （3. 5 L) , 0. 1 M N—ェチルモル ホリン酢酸緩衝液 （pH 9. 0) 25 L、 蒸留水 1 6. 5 Lを添加し、 37 てで 0〜 9時間反応させた後、 ァミノ酸分折法により反応液中の遊雜ァミノ酸の 測定を行った。 この結果、 どちらの基質を用いた場合もまずミ リストイル基を失 つたァミノ末端のァミノ酸が遊離されており、 本発明の酵素がミ リストイル基を 遊離する活性を有していることが示された。 また反応時間の経過にしたがつてこ れに続くアミノ酸が順次遊離されていく ことも確認された。
また、 本発明の酵素は保護基によって了ミノ末端がプロックされていないぺプ チドのァミノ末端にも作用し、 ァミノ末端ァミノ酸を遊離するァミノぺプチダ一 ゼ活性を有する。 この活性は、 Arch.Biochem.Bioptys..第 274巻、 第 24 卜 250頁 （1 989 ) に記載された方法により確認することができる。
さらに本発明の酵素は、 上記のような短鎖のポリペプチドの他、 高分子量の夕 ンパク質のアミノ末端にも作用することができる。 例えば、 還元ニヮトリ卵白リ ゾチームを基質としてこのことを確認することができる。 すなわち、 ImM還元 ニヮ トリ卵白リブチーム （水溶性、 分子量約 1 4000、 和光純薬工業社製） 5 Lに 8ミ リ単位の酵素搮品 （ 1. 6//L) 、 0. 1 mM CoC l 2 を含む 5 OmMリン酸水素ニナトリウム—水酸化ナトリウム緩衝液 （pH 1 1. 0) 50 L、 蒸留水 4 3. 4 Lを添加し、 50でで 0〜240分間反応させた後、 ァ ミノ酸分析法により反応液中の遊離アミノ酸の測定を行った。 反応液中に生成し たァミノ酸の経時変化から還元リゾチームのァミノ末端からァミノ酸が順次遊離 されていることが示され、 本発明の酵素がタンパク質の了ミノ末端に対しても作 用することが確認された。
( ) 至適温度
第 3図より、 本発明の酵素標品の至適温度は、 pH7. 6において 75〜95 °Cである。 図中、 縱軸は最大活性 （95"C) に対する相対活性 （％) 、 横軸は反 応温度 （で） を示す。
(5) 至適 pH
第 4図に示すように本発明の酵素の至適 pHは pH6. 5〜9. 5付近であつ た。 図中、 縦軸は pH7. 2における活性を 1 00とした相対活性 （％) を、 横 軸は 75'Cにおける pHを示す。
( 6 ) 各種試薬の影響
本発明の酵素の活性はァマス夕チン （ペプチド研究所社製） によって阻害を受 ける。 例えば、 0. 3ミ リ単位の本発明の酵素を 5 nmo 1のァマスタチンで処 理した後、 その活性を、 Me t— MCAを基質として測定した場合、 酵素活性は ほぼ完全に失われる。
また、 本発明の酵素の活性は C o C 12 によって促進される。
( 7 ) 分子量
本発明の酵素は、 SDS -ボリアクリルアミ ド電気泳動により約 4万、 超遠心 法により約 4 0万の分子量を示す。 ( 8 ) 温度安定性
酵素摞品を 7 5 'Cで熱処理した後の残存酵素活性を調べ、 本発明の酵素の温度 安定性を調べた。 第 5図に示されるように、 本発明の酵素は 0. 1 mMの C o C 12 を含む 0. 1 M卜リス一 HC 1緩衝液 （PH 8. 0) 中では 5時間処理の後 も酵素活性の低下はまったく見られず （図中の秦） 、 また C oC l 2 を含まない 緩衝液中で 5時間処理した場合も 8 0 %以上の活性を保持していた （図中の〇） 。 図中、 縦軸は残存する酵素活性 （％) 、 横軸は熱処理の時間 （時間） を示す。 本発明におけるアミノ末端保護基遊離酵素は上記酵素の他、 配列表の配列番号 ： 1に示されるアミノ酸配列の全部、 又はその一部を含むものであってアミノ末 端保護基遊離活性を示す酵素、 あるいはその機能的同等物が挙げられる。
本明細書に記載の 「機能的同等物」 とは以下のようなものをいう。 天然に存在 するタンパク質にはそれをコードする DNAの多形や変異の他、 生成後のタンパ ク質の生体内および精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ 酸の欠失、 揷入、 付加、 置換等の変異が起こりうる。 しかしこのような変異が該 夕ンパク質の活性や構造の保持に関して重要でない部分に存在する場合には、 変 異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、 生物学的活性を示すものがある ことが知られている。 このように構造的に若干の差違があってもその機能につい ては大きな違いが認められないものを本明細書では 「機能的同等物」 と呼ぷ。 人為的にタンパク質のァミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様 であり、 この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。 た とえば、 ヒトインタ一ロイキン 2 ( I L— 2) のアミノ酸配列中のあるシスティ ン残基をセリンに置換したポリぺプチドがインターロイキン 2活性を保持するこ とが知られている [サイエンス （Science ) 、 第 224巻、 1 4 3 1頁 （ 1 9 8 4 ) ] 。 したがって、 本発明によって開示されたアミノ酸配列 （配列表の配列番 号： 1 ) に 1 もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、 挿入、 付加、 置換が生じたァ ミノ酸配列によって示されるものであっても、 機能的に差違が見られないもので あれば本発明の範囲内に属するものである。
また、 ある種のタンパク質は、 活性には必須でないペプチド領域を有している ことが知られている。 たとえば細胞外に分泌されるタンパク質に存在するシグナ ルぺプチドゃ、 プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれにあたり 、 これらの領域のほとんどは翻訳後、 あるいは活性型タンパク質への転換に際し て除去される。 このようなタンパク質は一次構造上は異なった形で存在している 力、 最終的には同等の機能を発現するタンパク質である。
遺伝子工学的にタンパク質の生産を行う場合には、 目的のタンパク質のァミノ 末端、 あるいはカルボキシル末端に該タンパク質の活性とは無関係のぺプチド鎖 が付加されることがある。 たとえば、 目的のタンパク質の発現量を上げるために 、 使用される宿主中で高発現されているタンパク質のアミノ末端領域の一部を目 的のタンパク質のァミノ末端に付加した融合夕ンパク質が作製されることがある 。 あるいは発現されたタンパク質の精製を容易にするために、 特定の物質に親和 性を有するぺプチドを目的のタンパク質のァミノ末端、 あるいはカルボキシル末 端に付加することも行われている。 これらの付加されたべプチドは目的夕ンパク 質の活性に悪影饗をおよぼさない場合には付加されたままであってもよく、 また 必要であれば適当な処理、 たとえばプロテア一ゼによる限定分解などによって目 的夕ンパク質から除去できるようにすることもできる。
上記されたような、 その夕ンパク質の機能には必須でないぺプチドを保持した 、 あるいは付加されたものであっても、 同等の機能を発現できる限りにおいては 「機能的同等物」 の範囲内に属するものである。
上記ァミノ末端保護基遊雜酵素の機能的同等物としては、 例えば配列表の配列 番号： 1に示されるアミノ酸配列に、 1個もしくは複数のアミノ酸残基が欠失、 付加、 揷入もしくは置換の少なく とも 1つがされ、 かつアミノ末端保護基遊離活 性を示す酵素が挙げられる。 本発明において機能的同等物の態様は特に限定され ないが、 本発明のァミノ末端保護基遊離酵素の N末端を保護基によりプロックす ベくアミノ酸配列を改変した改変酵素が例示される。 例えば、 配列表の配列番号 ： 1に記載されたアミノ酸配列のアミノ酸番号 2のバリンがァスパラギン酸に置 換された酵素が挙げられる。
該改変酵素は例えば遺伝子工学的手法を用いることにより得ることが出来る。 即ち該改変酵素の作製は p D A Pプラスミ ド D N A上の上記酵素をコードした D N A領域に公知の核酸変異導入技術を利用し塩基配列を改変した後、 適当な宿主 を用い夕ンパクを発現させることにより実施することが出来る。 なお該改変酵素 の N末端ァミノ酸配列 Me t— A s pはパン酵母中においてァセチル基付加シグ ナル配列として働くことが知られている [ジャーナル ォブ バイオケミストリ - (Journal of Biochemistry) 、 第 26 5巻、 第 1 9 6 38〜 1 9 64 3頁 （ 1 9 90 ) ] 。 従って該改変酵素をコードする DNA領域を適当な酵母用発現べ クタ一に組み込み適当な宿主酵母中で発現させることにより N末端がァセチル化 されたタンパクを得ることが出来る。 例えば、 酵母用発現べクタ一としては pV T 1 0 3 -L [ジーン （Ge n e) 、 第 52巻、 第 225〜 233頁 （ 1 9 87 ) ] 、 宿主酵母としては B J 2 1 68 [FEMS マイクロバイオロジー レビ ユー （FEMS Microbiology Review) 、 第 54巻、 第 1 7〜4 6頁 （ 1 9 88 ) ] を使用することができる。 さらに該タンパクのアミノ末端保護基遊離活性を 上記基質特異性の項に記載した方法を用レ、測定することにより該タンパクが本発 明のアミノ末端保護基遊離酵素である事を確認することが出来る。 配列表の配列 番号： 1 0に記載されたアミノ酸配列からなる酵素をコードした DNAを挿入さ れた p VT 1 03—Lは p A c DAPと命名され、 該プラスミ ドで形質転換され た酵母 B J 2 1 6 8は Saccharomyces cerevisiae BJ2168/pAcDAP と命名され、 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 305 ) の通商産業省工業技 術院生命工学工業技術研究所に FERM BP- 5 9 5 として寄託されている (原寄託日 ： 1 997年 5月 23日） 。 このような修飾酵素であっても、 2種以 上のァミノ末端保護基を遊離する活性を有する酵素であれば本明細書における機 能的同等物に包含される。
ァミノ酸配列の改変によりタンパクの N末端を保護基によりブロックする方法 としては本法に限定されるものではなく、 例えばァセチル化の別法 〔ジャーナル ォブ バイオロジカル ケミストリ一（Journal of Biological Chemistry) 、 第 2 60巻、 第 5 382〜 53 9 1頁 （ 1 9 8 5) 〕 やミ リストイル化の方法 （： プロシ一ディングス ォブ ザ ナショナル アカデミー ォブ サイエンシー ズ ォブ ザ USA (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America). 第 84巻、 第 27 08〜 27 1 2頁 （ 1 9 8 7) 〕 を用いてもよい。 更にタンパクの N末端を保護基によりブロックする方法 は前記のようなアミノ酸の置換による方法に限定されず、 例えば化学的な方法 〔 メソッズ イン ェンザィムォロジ一 （Methods in Enzymology), 第 1 1巻、 第 5 65〜 570頁 （ 1 9 67) 〕 を用いてもよい。
2. 本発明の DNAについて
本発明の DNAは、 前記のような本発明のァミノ末端保護基遊離酵素をコード する DNAであり、 具体的には①配列表の配列番号： 1に示されるアミノ酸配列 の全部、 又はその一部を含むものであってァミノ末端保護基遊離活性を示すもの をコードする DNA、 ②配列表の配列番号： 2に示される DNAの全部、 又はそ の一部を含む DNA、 ③本発明の機能的同等物をコードする DNA、 及び④前記 ①〜③の DN Aにハイブリダィズ可能な、 ァミノ末端保護基遊離活性を示す夕ン パク質をコードする DNA等である。
かかる本発明の DN Aは、 例えば次のようにして得ることができる。
まず、 ①及び②の DNAは、 本発明のァミノ末端保護基遊離酵素の説明中に記 載したように、 ピロコッカス フリオサス DSM 3 638より得ることがで きる。 また、 本発明により提供されるァミノ末端保護基遊離酵素をコードする DNA 6 の塩基配列をもとに本発明の酵素と同様の活性を有するタンパク質の DNAを取 得することも可能である。 すなわち、 本発明の酵素をコードする DNA、 あるい はその塩基配列の一部をハイプリダイゼ一ションのプローブ、 あるいは P CR等 の遺伝子増幅法のプライマーに用いることにより、 本酵素と機能的に同等の活性 を有するタンパクをコードする DN Aをスクリ一二ングすることができる。 力、力、 る方法により、 ③、 ④の DNAを得ることができる。
上記の方法では目的の DN Aの一部のみを含む DN A断片が得られることがあ るが、 その際には得られた DN A断片の塩基配列を調べてそれが目的の DN Aの —部であることを確かめた上、 該 DNA断片、 あるいはその一部をプローブとし てハイプリダイゼーションを行う力、、 または該 DN A断片の塩基配列に基づいて 合成されたプライマーを用いて PC Rを行うことにより、 目的の DN A全体を取 得することができる。
上記のハイプリダイゼーシヨンは、 たとえば以下の条件で行うことができる。 すなわち、 DNAを固定したメンブレンを 0. 5%SDS、 0. 1 %ゥシ血清ァ ルブミ ン （BSA) 、 0. 1 %ボリ ビニルピロリ ドン、 0. 1 %フイ コール 4 0 0、 0. 0 1 %変性サケ精子 DNAを含む 6 xSSC ( 1 XSSCは 0. 1 5M
Na C 0. 0 1 5Mクェン酸ナトリウム、 pH7. 0を示す） 中で、 5 0 °Cにて 1 2〜20時間、 プローブとともにィンキュベートする。 ィンキュベーシ ヨ ン終了後、 0. 5%SDSを含む 2 XSSC中、 37 °Cでの洗浄から始めて、 3≤ (：濃度は0. 1倍までの範囲で、 また、 温度は 50てまでの範囲で変化させ 、 固定された DN A由来のシグナルがバックグラウンドと区別できるようになる までメンブレンを洗浄したうえ、 プローブの検出を行う。 また、 こうして得られ た新たな DN Aについて、 そこにコードされているタンパクの有する活性を上記 同様の方法によって調べることにより、 得られた DN Aが目的とするものである かどうかを確認することができる。 さらに、 これらの D N Aを含有する形質転換体を作製し、 これを用いて上記の 了ミノ末端保護基遊離酵素を工業的に生産することも可能になる。
なお、 本明钿書に開示された塩基配列と同一の塩基配列ではなく とも、 それが 本明細書に開示されたァミノ末端保護基遊離活性を示すタンパク質をコードする 限り、 かかる塩基配列は本発明の範囲に含まれるものであることは前記のとおり. であるが、 その理由は次のとおりである。
遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン （3つの塩基の組み合わせ） はアミノ酸 の種類ごとに 1〜 6種類ずつが存在することが知られている。 したがってあるァ ミノ酸配列をコードする DNAはそのァミノ酸配列にもよるが多数存在すること ができる。 D N Aは自然界において決して安定に存在しているものではなく、 そ の塩基配列に変異が起こることはまれではない。 D N A上に起こった変異がそこ にコードされるァミノ酸配列には変化を与えない場合 （サイレント変異と呼ばれ る） もあり、 この場合には同じアミノ酸配列をコードする異なる D N Aが生じた といえる。 したがってある特定のァミノ酸配列をコードする D NAが単離されて も、 それを含有する生物が継代されていく うちに同じアミノ酸配列をコ一ドする 多種類の D N Aができていく可能性は否定できない。 さらに同じァミノ酸配列を コードする多種類の D NAを人為的に作製することは種々の遺伝子工学的手法を 用いれば困難なことではない。
たとえば遺伝子工学的な夕ンパク質の生産において、 目的のタンパク質をコー ドする本来の D N A上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いもの であった場合には、 タンパク質の発現量が低いことがある。 このような場合には コードされている了ミノ酸配列に変化を与えることなく、 コドンを宿主で繁用さ れているものに人為的に変換することにより、 目的タンパク質の高発現を図るこ とが行われている （たとえば特公平 7— 1 0 2 1 4 6号） 。 このように特定のァ ミノ酸配列をコ一ドする多種類の D NAは人為的に作成可能なことは言うまでも なく、 自然界においても生成されうるものである。 更にタンパクに特定の性質を持たせるために人為的に変異を導入させた DNA であっても、 本発明のァミノ末端保護基遊離活性を有する酵素をコードしていれ ば本発明の DNAに包含される。 このような DNAとして例えば配列表の配列番 号： 1 1に示す塩基配列を有する DNAが挙げられる。 該 DNAは配列表の配列 番号： 2に記載された塩基配列の塩基番号 5〜 6に存在する塩基配列 TGが塩基 配列 ATに置換された塩基配列を有し、 該 DNAにコ一ドされた夕ンパクを酵母 中で発現させると、 配列表の配列番号： 1に記載されたアミノ酸配列のアミノ酸 番号 2のバリンがァスパラギン酸に S換されると共に N末端がァセチル化された ァミノ末端保護基遊離酵素を得ることが出来る。
3. 本発明のァミノ末端保護基の除去方法について
本発明のァミノ末端保護基の除去方法は、 保護基によって了ミノ末端がプロッ クされたぺプチドに本発明のァミノ末端保護基遊離酵素、 又はその機能的同等物 を作用させてァミノ末端の保護基を遊離させることを特徴とする。
具体的な除去方法としては、 例えば配列表の配列番号： 1記載のアミノ酸配列 からなる酵素を用いる場合、 5 OmMの P I PES— Na緩衝液 （pH 7. 6) 中で基質と 50°Cで反応させることにより、 保護基を遊離させることができる。 ただし、 保護基の種類、 ペプチドにより反応条件が異なるのは当然のことである 。 また、 必要に応じ本酵素の活性を上昇させる CoC 12 を添加することもでき る。
4. 本発明のアミノ酸配列の解析方法について
本発明のァミノ酸配列の解析方法は、 保護基によってァミノ末端がプロックさ れたぺプチドのァミノ酸配列の解析方法において、 前記の除去方法により該保護 基を遊雜させた後、 ァミノ酸配列の解析に供することを特徴とする。
本発明の保護基の除去方法を利用した、 ァミノ末端が保護基によってプロック されたペプチドのアミノ酸配列解析方法としては、 例えば、 配列を決定しようと するぺプチドのァミノ末端保護基を本発明のァミノ末端保護基遊離酵素を用いて 除去した後、 新たに生じたァミノ末端からエドマン分解法によって配列を決定し ていく方法が挙げられる。
なお本発明のァミ ノ末端保護基遊離酵素を用いて酵素処理した試料をェドマン 分解法によるァミノ酸配列解折に用いた場合、 過剰量の酵素の使用により試料の ァミノ酸配列情報に対し酵素処理に用いた本発明の酵素のァミノ酸配列情報がノ ィズとして混入することが考えられる。 この場合例えば配列表の配列番号： 1 0 に示したアミノ酸配列を有するアミノ末端保護基遊離酵素を用いると、 アミノ末 端保護基遊離酵素自体がェドマン分解を受けずノイズ混入を防ぐことが出来る。 なお該酵素において N末端の保護基はァセチル基に特に限定されるものではない o
また、 ァミノ末端保護基遊離酵素がァミノぺプチダーゼ活性を有している場合 には保護基の遊離に続いてァミノ酸も酵素の作用によって順次遊離されていくが 、 酵素の作用が制御できる条件にすれば、 ァミノ末端の保護基のみ、 あるいは保 護基とそれに続く数残基のァミノ酸を除去した後にェドマン分解法によってァミ ノ酸配列を決定することもできる。
さらに、 このァミノべプチダーゼ活性を利用することにより、 以下に示すよう な方法でアミノ酸配列解析を行うことができる。 すなわち、 配列を決定しようと するぺプチドに本発明のァミノ末端保護基遊離酵素を作用させた後、 反応液中に 遊離されてくるァミノ酸の経時的変化を解析して配列を決定する方法、 あるいは 反応液中に生じた種々の部分消化べプチドのァミノ酸組成を同定し、 これらを比 較することにより配列を決定する方法があり、 特に後者においては質量分折法を 用いた分子量測定によってべプチドのァミノ酸組成を同定する方法が有利である 。 質量分析法を用いた方法では部分消化べプチドの分子量の差から遊離されたァ ミノ酸の種類を容易に決定することができ、 さらにアミノ末端に存在する保護基 の種類を同時に決定することも可能である。
5 . 本発明のアミノ酸配列の解析用キッ トについて
本発明のァミノ酸配列の解析用キッ トは、 保護基によってァミノ末端がプロッ クされたペプチドのアミノ酸配列の解析に使用されるキッ トであって、 上記に記 載の本発明の酵素を含有することを特徵とする。 かかるキッ トを用いることによ り、 保護基の種類に関係なく、 ァミノ末端がブロックされたペプチドのアミノ酸 配列解析に利用することができる。 また、 本キッ ト中には、 ペプチドのアミノ末 端をプロックしている保護基の同定を行うための、 保護基化合物の標準品を加え ることもできる。
6 . 本発明の抗体、 プローブ又はプライマ一について
常法により、 上記のァミノ末端保護基遊離酵素又はその機能的同等物に特異的 に結合する抗体またはその断片を得ることができる。 かかる抗体等は、 本発明の 酵素の精製や検出に有用である。 また、 常法により、 上記の D N Aとハイブリダ ィズする合成オリゴヌクレオチドプローブ又は合成オリゴヌクレオチドプライマ 一を得ることができる。 かかるプローブやプライマ一は、 本発明の D N Aの検出 や増幅に有用である。 以下に本発明の実施例を示すが、 本発明は以下の実施例により何ら限定される ものではない。 なお、 実施例中の％は重量％を意味する。
実施例 1
(ァミノ末端保護基遊離酵素の調製）
( 1 ) ピロコッカス フリオサス ゲノム D NAの調製
ピロコッカス フリオサス D S M 3 6 3 8の培養は以下のとおりに行った。 使用した培地の組成を以下に示す： 1 %卜リプトン、 0 . 5 %酵母エキス、 1 %可溶性デンプン、 3. 5 %ジャマリン S · ソリッ ド （ジャマリンラボラ トリ一 ) , 0. 5 %ジャマリン S · リキッ ド （ジャマリンラボラトリー） 、 0. 0 0 3 %MgS04 、 0. 00 1 %Na C 0. O O O l ^F e SO* · 7Η2 0、 0. 000 1 %C o S O4、 0. 000 1 %C a C 12 · 7Η2 〇、 0. 0 0 0 1 %Zn S04 . 0. 1 p pmCu SO* · 5Η2 0、 0. 1 p pmKA 1 (S 〇4 ) 2 、 0. l p pmH3 B03 、 0. 1 pmN a 2 Mo 04 · 2Η2 〇、 0. 25 p pmN i C 12 · 6 H2 0。
上記の組成の培地 2リッ トルを 2リッ トル容のメディゥムボトルに入れ、 1 2 0て、 20分間殺菌した後、 窒素ガスを吹込み溶存酸素を除去した。 次いで、 こ れに上記菌株を接種して 95て、 1 6時間静置培養した。 培養後、 遠心分離によ つて菌体を集めた。
次に集菌体を 25 %スクロースを含む 0. 05M卜リス一 HC 1 (pH 8. 0 ) 4mLに懸 j¾し、 この懸濁液に 0. 8mLのリゾチーム 〔5mgZmL、 0. 25Mト リスー HC 1 (pH8. 0) 〕 、 2mLの 0. 2M EDTA (pH8 . 0) を加えて、 20'Cで 1時間保温した後、 24mLの SET溶液 〔 1 5 0m M Na C l、 1 mM EDTA, 20πιΜ卜リス一 HC 1 (p H 8. 0) 〕 を 加え、 更に 5%SDS 4mL、 プロティナ一ゼ K ( 1 0 mg/mL) 4 0 0〃L を加え、 37°C、 1時間反応させた。 反応終了後、 フエノールークロロホルム抽 出、 続いてエタノール沈殿を行い、 約 3. 2mgのゲノム DNAを調製した。
(2) コスミ ドプロテインライブラリーの作製
ピロコッカス フリオサス ゲノム DNA 4 00 gを S a u 3 A Iで部分消 化した後、 密度勾配超遠心法による分画を行い、 35〜50 k bに相当する DN A画分を得た。 次に、 トリプルヘリックスコスミ ドベクター 1 gを B amH I 消化し、 上記の 35-5 O kbの DNA画分 1 40〃 gと混合してライゲ一ショ ンを行い、 ガイガーパックゴールド （ストラタジーン社製） を用いたインビトロ パッケージング法によってピロコッカス フリオサス ゲノム DNAのフラグメ ントをラムダファージ粒子中にパッケージングしたコスミ ドライブラリーを作製 した。
得られたファージ溶液の一部を用いて大腸菌 DH 5ひ MCRを形質転換し、 コ スミ ドクローンを得た。 得られた形質転換体のうち数個を選んでコスミ ドを調製 し、 適当な大きさの挿入断片があることを確認したのち、 あらためて 5 0 0個の 形質転換体を 1 00〃 gZmLのアンピシリンを含む I 5 OmLの L B培地 （ト リプトン 1 0 リ ツ トル、 酵母エキス 5 リ ッ トル、 N a C 1 5 gZリ ッ ト ル、 pH7. 2) 中で個別に培養した。 該培養物を遠心し、 回収した菌体を 20 mM卜リス— HC 1 (pH 8. 0) l mLに懸濁し、 1 0 0でで 1 0分間熱処理 した。 続いて超音波処理を行い、 菌体破砕液を更にもう一度 1 00で、 1 0分間 熱処理した。 遠心後の上清として得られるライゼ一トをコスミ ドプロテインライ ブラリーとした。
( 3 ) アミ ノ末端保護基遊離酵素遺伝子を含むコスミ ドの選択
まずァミノ酸一 MC Aを基質として、 生成する 7 -アミノー 4ーメチルクマリ ン量を定量することによってコスミ ドプロテインライブラリ一中のぺプチダ一ゼ 活性を有するコスミ ドクローンを選択した。 すなわち、 上記コスミ ドプロテイン ライブラリーからライゼ一ト 1 0〜30 Lずつをとり、 0. 1 M P I PES — Na緩衝液 （pH7. 6) 1 00 L及び 1 8種の 5 mMアミノ酸— MC A ( ジメチルスルホキシドに溶解したもの） を 5 L添加し、 90eCで 1〜3時間反 応させた。 その後、 タイターテックフルォロスキャン II (大日本製薬株式会社製 ) を用い、 生成する 7—アミノー 4—メチルクマリンを励起波長 355 nm、 測 定波長 4 6 0 nmで測定し、 Me t— MCA、 L e u -MCA, A 1 a -MCA 、 H i s— MCAに対し分解活性をもつライゼートを選択した。 さらにひ—MS Hを基質として、 これらのライゼ一卜からァセチル基及びァミノ酸をァミノ末端
2 g から順次遊離させる活性を有するものを選択し、 該ライゼ一卜に対応するコスミ ドクローンを得た。
(4) ァミノ末端保護基遊雜酵素遺伝子を含むプラスミ ド pDAP 1の調製 上記のようにして得られた、 ァセチル基及びァミノ酸をァミノ末端から順次遊 離させる活性を持つコスミ ドクローンよりコスミ ドを調製し、 B amH I消化に より得られた DNA断片をプラスミ ドベクタ一 pUC 1 8の BamHサイ トに揷 入した。 この組換えプラスミ ドを大腸菌 JM 1 09に導入した後、 1 0 0 xz gZ mLのアンビシリンを含む LBプレート （トリプトン 1 0 g/リ ッ トル、 酵母ェ キス 5 g/リ ッ トル、 N a C 1 5 g/リ ッ トル、 ァガ一 1 5 g/リ ッ トル、 p H 7. 2) 上にまき、 得られた形質転換体を個別に 1 0 0 gZmLのアンピシリ ンを含む 5 m Lの L B培地中で培養を行つた。 該培養物を遠心して回収した菌体 を 5 0mMト リスー HC 1 (ρΗ8. 0) 5 0〃Lに懸濁し、 1 0 0 °C、 1 0分 間熱処理を行った後、 超音波処理によって菌体を破砕した。 菌体破砕液をもう一 度、 1 0 0'C、 1 0分間の熱処理を行い、 遠心してライゼートを得た。 このライ ゼ一トについてぺプチダーゼ活性を測定した。
すなわち 1 5 Lのライゼートに 0. 1 M P I PES - Na緩衝液 （pH 7 . 6 ) 50 L及び 5mM M e t— MC A (ジメチルスルホキシドに溶解） 5 Lを加え、 90でで1. 5時間反応させた。 その後、 タイターテックフルォロ スキャン Π (大日本製薬株式会社製） を用い、 生成する 7—アミノー 4一メチル クマリン量を励起波長 355 nm、 測定波長 4 60 nmで測定した。 Me t— M C A分解活性を有する形質転換体よりブラスミ ドを調製し、 これをプラスミ ド p DAP 1 と命名した。
(5) ァミ ノ末端保護基遊離酵素遺伝子を含むプラスミ ド p D A P 2の調製 上記プラスミ ド p DAP 1について E c 0 R I消化し、 セルフライゲ一ション を行った。 この組換えプラスミ ドを大腸菌 JM1 09に導入し、 得られた形質転 換体より調製したライゼートにつレ、て前述の方法でぺプチダ一ゼ活性を調べた。 該酵素活性が認められた形質転換体よりブラスミ ドを調製し、 これをプラスミ ド pDAP 2と命名した。
(6) ァミノ末端保護基遊離酵素遺伝子を含むプラスミ ド p DAP 3の調製 上記プラスミ ド pDAP2を Sa c I消化して得られる約 1. 7 kbの DNA 断片をプラスミ ドベクター PUC 1 8の Sa c lサイ 卜に挿入した。 この組換え プラスミ ドを大腸菌 JM1 09に導入し、 得られた形質転換体より調製したライ ゼ一卜について前述の方法でぺプチダ一ゼ活性を調べた。 該酵素活性が認められ た形質転換体よりブラスミ ドを調製し、 これをプラスミ ド pDAP 3と命名した 。 第 1図にプラスミ ド p DAP 3の制限酵素地図を示す。
(7) ァミノ末端保護基遊離酵素遣伝子を含むプラスミ ド PDA Pの調製 上記プラスミ ド pDAP3を SnaB I、 Sa c I消化後、 ァガロース電気泳 動を行い、 約 1. 2 k bの DNA断片をァガロースゲルより回収した。 この DN A断片をプラスミ ドベクタ一 pUC 1 9に Sma I— Sa c Iサイ トを利用し揷 入した。 この組換えプラスミ ドを大腸菌 JM1 09に導入し、 得られた形質転換 体より調製したライゼートについて前述の方法でぺプチダーゼ活性を調べた。 こ のライゼ一卜が更にァミノ末端にァセチル基を有する 一 MSHに対し、 ァセチ ル基及びァミノ酸をァミノ末端から順次遊離させる活性を有することを確認した σ
該酵素活性が認められたコロニーよりブラスミ ドを調製し、 これをプラスミ ド pDAPと命名した。 第 2図にプラスミ ド PDA Pの制限酵素地図を示す。 ブラ スミ ド p DAPで形質転換した大腸菌 JM 1 09は、 Escherichia coli JM109/p DAP と命名、 表示され、 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 30 5 ) の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に F E R M BP- 5 80 4として寄託されている （原寄託日 ： 1 9 9 6年 3月 29日、 国際寄託への移管 ： 1 9 97年 1月 30日） 。
( 8 ) アミノ末端保護基遊離酵素遺伝子の塩基配列の決定
上記プラスミ ド pDAPに挿入されたァミノ末端保護基遊雜酵素遺伝子を含む 約 1. 2 kbの DNA断片を種々の制限酵素で適当なサイズに断片化し、 該断片 をプラスミ ドベクターに挿入した後、 各断片の塩基配列を決定した。 塩基配列の 決定は B c a BESTジデォキシシークェンシングキッ ト （宝酒造社製） を用い たジデォキシ法により行い、 得られた各断片の塩基配列を比較、 総合し、 上記 1 . 2 kbDNA断片の全塩基配列を決定した。
配列表の配列番号： 3にプラスミ ド p DAPに揷入されたァミノ末端保護基遊 離酵素をコードする DNAを含む約 1. 2 kbの DN A断片の塩基配列を示す。 配列番号中、 塩基番号 8 6番〜 88番が開始コドン、 塩基番号 1 1 30番〜 I 1 3 2番が終止コドンであり、 この間のオープンリ一ディングフレームが該酵素の 構造遺伝子領域と推定された。
配列表の配列番号： 2に上記オープンリーディ ングフレームの塩基配列を示す 。 さらに、 配列表の配列番号： 1に配列番号： 2に示される塩基配列より推定さ れる本発明のァミノ末端保護基遊離酵素のァミノ酸配列を示す。
( 9 ) 酵素標品の調製
Escherichia coli JM109/pDAP を通常の培養条件、 1 00〃 gZmLのアンピ シリ ンを添加した LB培地 5mLを含む 1 2本の試験管に各々接種し、 37°Cで 培養を行い、 培養液漪度 A68。 = 1の時に終濃度 I mMとなるようにイソプロピ ルー yS— D—チォガラク トピラノシドを添加し、 さらに 37 で1 6〜1 8時間
¾ ^feしフ ο 上記で得られた培養液計 6 OmLを遠心して菌体を回収した。 得られた菌体を 0. 6mLの緩衝液 A (2 OmMトリスー HC 1 ρΗ 8. 0) に懸濁し、 1 0 0°C、 1 0分間熱処理を行った後、 超音波処理によって菌体を破砕した。 さらに もう一度 1 00で、 1 0分間の熱処理を行い、 遠心しライゼ一トを得た。 得られ たライゼ一卜をあらかじめ緩衝液 B (5 OmMトリス— HC 1 ： pH 8. 0 ) で 平衡化した 5 OmLのセフアクリル S— 300 HR (フアルマシア社製） カラ 厶でゲルろ過を行い、 Me t— MCA分解活性を有する画分を集めた。 更に、 こ の活性画分をあらかじめ緩衝液 Bで平衡化した 5 mLのェコノパック h i g hQ カートリッジ （バイオラッ ド社製） カラムに吸着させ、 緩衝液 Bで充分洗浄後、 0〜0. 5Mの Na C 1直線濃度勾配をもつ緩衝液 Bで溶出した。 溶出液につい て Me t— MCA分解活性を測定し、 活性画分を集めて精製酵素標品とした。 得られた精製酵素標品の 1単位は、 Me t— MC Aを基質とし、 pH7. 6、 7 5°Cにおいて 1分間に l mo 】の 7—アミノー 4ーメチルクマリンを生成し うる酵素量とした。 実施例 2
(実施例 1で調製した酵素標品の理化学的性質）
①至適温度
至適温度の測定は以下に示す操作により行った。 すなわち、 1 8マイクロ単位 の酵素標品を用い、 Me t - MC Aを基質に用いる酵素活性測定方法により、 種 々の温度で活性を測定した。 第 3図に示すように本発明の酵素は測定された p H 7. 6において 25〜 95ての範囲で活性があり、 測定を行った最高の温度であ る 95 °Cにおいて最も高い活性を示した。 第 3図より、 本発明の酵素標品の至適 温度は、 pH7. 6において 75〜95'Cであった。 図中、 縦軸は最大活性 （ 9 5°C) に対する相対活性 （％)、 横軸は反応温度 （°C) を示す。 ②至適 pH
至適 pHの測定は以下に示す操作により行った。 すなわち、 1 8マイクロ単位 の酵素標品を用い、 上記に示した Me t— MCAを基質に用いる酵素活性測定方 法のうち、 反応液に加える緩衝液を種々の p Hの緩衝液に変えて活性測定を行つ た。 第 4図に示すように本発明の酵素の至適 pHは pH 6. 5〜9. 5付近であ つた。 図中、 縦軸は pH 7. 2における活性を 1 00とした相対活性 （％) を、 横軸は 75 °Cにおける pHを示す。 活性測定に用いる緩衝液には、 pH4. 1〜 P H 5. 1においては 2 OmM酢酸ナトリウム緩衝液、 ρΗ5. 8〜pH7. 2 においては 20mM P I PES— Na緩衝液、 pH8. 0〜9. 5においては 2 0 mMホウ酸ナトリウム緩衝液、 pH 9. 9〜1 0. 6においては 20 mMリ ン酸水素ニナトリウム—水酸化ナトリウム緩衝液を用いた。 なお、 上記した pH は 75ででの値である。
③各種試薬の影響
本発明の酵素の活性はァマス夕チンによって阻害を受けた。 例えば、 3 ミ リ単 位の本発明の酵素を 1 mMアマス夕チンを含む 2 OmMホウ酸緩衝液 （pH 1 0 . 0 ) 5 0〃 L中で 37 ' (：、 30分間処理後、 その 5 Lを上記の （ 2 ) の酵素 活性測定法に示した方法で活性測定を行うと、 ァマスタチンを含まない緩衝液で 処理したものに対し、 1. 5 %の値を示した。
また、 本発明の酵素の活性は C oC 12 によって促進された。 例えば上記の M e t—MCAを用いる測定系に終濃度 9 1 Mとなるように C 0 C 12 を添加し た場合、 添加しないものに比べて約 6倍の活性を示した。
④分子量
本発明の酵素は、 SDS—ボリアクリルアミ ド電気泳動により約 4万、 超遠心 法により約 4 0万の分子量を示した。 ⑤温度安定性
酵素標品を熱処理した後の残存酵素活性を調べ、 本発明の酵素の温度安定性を 調べた。 すなわち、 26ミ リ単位の酵素標品を含む 0. 1 Mトリス- HC 1緩衝 液 （pH8. 0 ) 、 あるいはこれに終濃度 0. 1 mMの C 0 C 12 を添加したも のを 75でで 0〜5時間処理した後、 その一部を用いて残存する酵素活性を測定 した。 なお、 活性測定は上記の Me t— MCAを基質として用いた系による酵素 活性測定方法によって行った。
第 5図に示されるように、 本発明の酵素は 0. 1 mMの C oC 12 を含む 0.
1 Mトリス— H C 1緩衝液 （ p H 8. 0 ) 中では 5時間処理の後も酵素活性の低 下はまったく見られず、 また C o C l 2 を含まない緩衝液中で 5時間処理した場 合も 80 %以上の活性を保持していた。 図中、 縦軸は残存する酵素活性 （ ） 、 横軸は熱処理の時間 （時間） を示す。 実施例 3
(実施例 1で調製した酵素標品のァミノ末端保護基遊離活性の確認）
実施例 1で調製した酵素標品を用いて、 ァミノ末端がプロックされている合成 ぺプチドに対する本酵素の作用を検討した。
( 1 ) ピログルタミル基に対する作用
1 mMニューロテンシン 1 0 /Z Lに、 0. 1 2ミ リ単位の酵素摞品 （ 5 L ) 、 4 OmMの P I PE S— Na緩衝液 （pH 7. 6) 50 L、 蒸留水 3 5 L を添加し、 37 で0、 1、 3、 5時間反応させた。 反応液の一部をとつて L— 8 5 0 0型高速アミノ酸分析計 （日立製作所社製） を用いたアミノ酸分析を行い 、 反応液中に生成した遊離アミノ酸を定量した。 第 6図にその結果を示す。 第 6 図に示されるように反応液中にはニューロテンシンのァミノ末端側に存在する口 イシン、 チロシン、 グルタミン酸が遊離されており、 その生成量の経時変化から 本酵素が二ユーロテンシンのァミノ末端側から作用してァミノ酸を順次遊離して いることが示された。 さらに、 ロイシンが遊離アミノ酸として検出されているこ とから、 本酵素がピログル夕ミル基とロイシンの間の結合を切断していることも 明らかとなった。
(2) ァセチル基に対する作用
1 mMの a— MSH ( 1 0 L) に、 0. 1 2ミ リ単位の酵素摞品 （5 L) 、 4 OmMの P I PES-Na (pH 7. 6) 緩衝液 50 L、 蒸留水 35 し を添加し、 37'Cで 0、 1、 3、 5時間反応させた後、 反応によって生成した遊 離アミノ酸を上記同様の操作で分析した。 第 7図にその結果を示す。 第 7図に示 されるように、 α— MSHより遊離されるアミノ酸の量はそのアミノ末端側に存 在するものほど多く （セリンはァミノ末端、 およびァミノ末端から 3番目の 2箇 所に存在するため、 他のアミノ酸に比べて多く検出されている） 、 本酵素がひ一 MSHのァミノ末端側から作用していること、 およびァセチル基とセリンの間の 結合を切断していることが明らかとなった。
また、 基質を A c—G l y -A s p -Va 1 —G l u - L y sにかえてひ一 M SH同様の実験を行った結果を第 8図に示す。 第 8図に示されるように、 反応液 中にはグリシンが遊離されており、 本酵素がァセチル基とグリシンの間の結合、 続いてダリシン—ァスパラギン酸の間の結合を切断していることが示唆された。 なお、 反応液中にはグリシンの他、 微量のァスパラギン酸、 およびパリ ンの存在 も確認された。
(3) ホルミル基に対する作用
1 0mMの F o r -Me t - L e u - Ph e - Ly s (30 %酢酸溶液） 0. 5〃 Lに 4 ミ リ単位の酵素標品 （3. 5 し） 、 0. 1 IV [の N—ェチルモルホリ ン 25 L、 蒸留水 2 1 Lを添加し、 37 で0、 20、 40、 6 0、 1 20 分間反応させた後、 反応によって生成した遊離アミノ酸を上記同様の操作で分折 した。 第 9図にその結果を示す。 第 9図に示されるように、 反応液中にはまずホ ルミル基を失ったメチォニンが遊離されており、 本発明の酵素がホルミル基を遊 離する活性を有していることが示された。 また、 このほかのアミノ酸 （ロイシン 、 フヱニルァラニン、 リジン） の生成の経時変化から本酵素が上記基質ペプチド のァミノ末端側から順次ァミノ酸を遊離していることも示された。
(4) ミ リストイル基に対する作用
1 mMの My r - P h e - A 1 a— Ar g - Ly s - G l y - A 1 a - L e u 一 A r g - G 1 n溶液 5 Lに、 4 ミ リ単位の酵素標品 （ 3. 5 χ/L) , 0. 1 Mの N—ェチルモルホリン酢酸緩衝液 （pH 9. 0) 25 L、 蒸留水 1 6. 5 uLを添加し、 37°Cで 0、 1. 5、 3、 6、 9時間反応させた後、 反応によつ て生成した遊離アミノ酸を上記同様の操作で分析した。 第 1 0図にその結果を示 す。 第 1 0図に示されるように、 反応液中には先ずミ リストイル基を失ったフエ 二ルァラニンが遊離されており、 本発明の酵素がミ リストイル基を遊離する活性 を有していることが示された。 またこのほかのァミノ酸の生成の経時変化から本 酵素が上記基質べプチドのァミノ末端側から順次ァミノ酸を遊離していることも 示された。
また、 基質を M y r -G 1 - A 1 a -G 1 y - A 1 a - S e r - A 1 a -G 1 υ -G 1 υ -L y sにかえて上記同様の実験を行った結果を第 1 1図に示す。 上記の基質べプチドは分子内に 2残基のグリシン、 3残基のァラニンを有してい るために第 1 1図の結果からァミノ酸の遊離の順序を決定することは難しいが、 本発明の酵素が基質のアミノ末端側から作用していること、 及び本発明の酵素が ミ リストィル基を遊離する活性を有していることが示唆された。 実施例 4 (実施例 1で調製した酵素標品のタンパク質に対するァミノぺプチダーゼ活性の 確認）
上記の酵素標品のタンパク質に対する作用を、 還元ニヮトリ卵白リゾチームを 基質として調べた。
1 mM還元ニヮトリ卵白リゾチーム （水溶性、 分子量約 1 4 0 00、 和光純薬 工業社製） 5 しに、 8ミ リ単位の酵素標品 （ 1. 6 , 0. I mMの C o C 12 を含む 5 OmMリン酸水素ニナトリゥ厶—水酸化ナトリゥム緩衝液 （pH 1 1. 0 ) 50 L、 蒸留水 43. 4 fi Lを添加し、 5 0 °Cで 0、 4 0、 8 0、 1 2 0、 1 80、 240分間反応させた。 反応液の一部をとつて L— 8 5 0 0型 高速アミノ酸分折計 （日立製作所製） を用いたアミノ酸分析を行い、 反応液中に 生成した遊離アミノ酸を定量した。 第 1 2図にその結果を示す。 第 1 2図に示さ れるように、 反応液中には還元リゾチームのァミノ末端に存在するリジン、 バリ ン、 フエ二ルァラニン、 グリシン、 アルギニンが遊離されており、 その生成量の 経時変化から本酵素が還元リゾチームのアミノ末端側から作用してアミノ酸を順 次遊離していることが示された。
なお、 ここで用いた還元リゾチームのアミノ末端からのアミノ酸配列は、 L y s -Va l -Ph e -G l y-Ar g - · ·の順であつた。 実施例 5
(N末端がァセチル基によりプロックされたァミノ末端保護基遊雜酵素の作製） ( 1 ) ァミノ末端保護基遊離酵素遺伝子の改変
配列表の配列番号： 1に記載のァミノ酸配列からなる酵素の N末端ァミノ酸配 列がァセチル基付加シグナル Me t - A s pとなるよう pDA Pに変異を導入し た。 即ち pDAP DNAを铸型とし、 該酵素の N末端から 2番目のアミノ酸で あるバリンのコドンをァスパラギン酸のコドンに置換するための配列表の配列番 号： 1 2に記載された塩基配列からなる合成 DN Aとプラスミ ド p DAP上のマ ルチクロ一ニングサイ 卜内の配列で Hi nd I I I及び Sph I各制限酵素サイ トをつぶすための配列番号： 1 3に記載された塩基配列からなる合成 DNAをプ ライマー対として PCRを行った。 PCR反応後、 該反応液を Sph I (宝酒造 社製） で酵素処理して変異導入されていないブラスミ ドを消化してから大腸菌 J Ml 09 (宝酒造社製） に導入し、 得られた形質転換体から目的とする変異導入 プラスミ ドを調製した。 次にこのプラスミ ド DNAを铸型とし、 該 DNAのタン パクコード領域におけるタンパク開始コドンのすぐ上流に B amH Iサイ トを導 入するための配列表の配列番号： 1 4に記載された塩基配列からなる合成 DN A と配列表の配列番号： 1 5に記載された該 DN Aのタンパクコード領域の下流領 域に相補的な塩基配列からなる合成 DN Aをプライマー対として PC Rを行った 。 該反応液をァガロース電気泳動に供し、 増幅された約 1. 2kbのDNA断片 をァガロースゲルより回収した。 この DNA断片を B amH I (宝酒造社製） 及 び H i nd I I I (宝酒造社製） で消化し、 大腸菌と酵母のシャ トルベクターで あるプラスミ ドベクター PVT1 03— Lの BamH I、 H i nd i I Iサイ ト を利用し挿入した。 この組み換えブラスミ ドを大腸菌 JM1 09に導入し、 得ら れた形質転換体からブラスミ ド DNAを調製した。
( 2 ) 改変酵素の発現
得られたプラスミ ド DNAを酵母 B J 21 68に導入した後、 栄養要求性ブレ ー ト （イースト ニトロゲンベース 6. 7g/リッ トル、 グルコース 20 g リ ッ トル、 ト リブトファン 2 OmgZリ ッ トル， ヒスチジン 2 OmgZリ ッ トル、 ゥラシル 2 OmgZリッ トル、 ァガー 1 5 gZリッ トル） 上で得られた形質転換 体を個別に YPD培地 （酵母エキス 1 0 リッ トル、 ペプトン 20 gZリッ ト ル、 グルコース 20 gZリッ トル） 5m 1を含む試験管に接種し、 30°Cで 1 6 時間培養を行った。 各培養液を個別に上記の栄養要求性培地 50 Om 1を含む三 角フラスコに接種し、 30°Cで 1 6時間培養した。 該培養液を遠心し、 菌体を回 収した。 得られた菌体を 5 Om 1の緩衝液 C ( 1 Mソルビトール、 5 OmMトリ スー HC 1、 pH7. 5、 3 OmMDTT) に懸 ®し、 30 °Cで 1 0分間保温後 、 遠心して得た菌体を、 さらに 1 Om lの緩衝液 D ( 1 Mソルビトール、 5 Om Mトリスー HC 1、 pH 7. 5、 2mMDTT) に懸濁し、 ザィモリエース 1 0 0 T (生化学工業社製） を最終濃度 0. 5mgZm 1 となるように添加し、 30 てで 3 0分間保温後遠心し、 プロトプラストを得た。 得られたプロトプラストを 20m lの緩衝液 E (5 0mMトリスー HC 1、 pH 7. 5、 2mMDTT) に 懸濁し、 EDTA、 KC 1、 Tr i t o nX— 1 00をそれぞれ最終濃度 1 mM 、 0. 2M、 0. 2%となるように加え、 3 7 °Cで 5分間保温した。 該懸濁液を 1 00°C、 1 5分間の熱処理を行った後、 遠心しライセ一トを得た。 得られたラ イセートより、 Me t - MCA分解活性を指標とし実施例 1の （ 9) 記載のアミ ノ末端保護基遊離酵素と同様の精製法に従つて改変酵素標品を調製した。 なぉ該 改変酵素標品の 1単位は、 Me t— MC Aを基質とし、 pH7. 6、 75'Cにお いて 1分間に 1 / mo lの 7—アミノー 4ーメチルクマリンを生成しうる酵素量 とした。 上記タンパクを発現する酵母は、 Saccharomyces cerevisiae BJ2168/pA cDAP と命名、 表示され、 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 05 ) の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に F E R M BP- 5 9 5 2として寄託されている （原寄託日 ： 1 9 9 7年 5月 23日） 。
( 3 ) 改変酵素のァミノ末端保護基遊離活性の測定
(2) で調製した改変酵素標品のアミノ末端保護基遊離活性を実施例 3の （2 ) 及び （4) 記載の方法に従い測定した。 その結果、 該改変酵素はペプチド N末 端のァセチル基及びミ リストィル基に対する遊離活性を示し、 さらにべプチド N 末端より順次ァミノ酸を遊雜させる活性を示した。
(4) 改変酵素の N末端ァセチル化の確認 該改変酵素の N末端がァセチル化されているかについて質量分析により確認し た。 即ち実施例 1で調製した酵素と該改変酵素の質量を AP 1 / 3 0 0 (PE- S c i e x社製） で測定しその質量差を求めた。 その結果、 大腸菌で発現させた 実施例 1で調製した酵素の分子量は 3 8 5 8 6、 該改変酵素の分子量は 3 8 6 4 3であった。 2種の酵素間の分子量差 5 7はパリンがァスパラギンに置換した分 子量差 1 5及びァセチル基の付加による分子量増加分 4 2の合計に一致した。 更に該改変酵素を、 エドマン分解による N末端ァミノ酸配列解析方法を採用し た HP G 1 0 0 0 Aプロテインシークェンサ一 （H e w 1 e t t P a c k a r d社製） に供したがシグナルは得られず、 該改変酵素はエドマン分解を受けな いことが明らかとなった。
( 5 ) 改変酵素を用いたぺプチドのァミノ末端配列の解析
改変酵素の基質として、 N末端がァセチル化されたゥシ赤血球スーパーォキシ ドジスム夕一ゼ （分子量 1 5 5 5 1、 ワシントン バイオケミカル コーポレ —シヨン社製） のカルボキシメチル化物を用いた。 該基質を 0. 4mMとなるよ う調製した溶液 5 1に、 （2) で調製した 6 0 0 ミ リ単位の改変酵素標品 （ 5 2〃 1 ) 、 1 0 OmMの卜リメチルァミン- HC 1 (pH 1 I . 0) 緩衝液 1 0 0〃 1、 1 OmMの C 0 C 12 を 2 // し 蒸留水を 4 1 1添加し、 5 0°Cで 4 8時間反応後、 反応液をそのまま HP G 1 0 0 0 Aプロテインシークェンサ一 に供しァミノ酸配列分析を行った。 得られたァミノ酸配列データは配列表の配列 番号： 1 6に示した。 該配列は基質として使用したスーパーォキシドジスムター ゼの既知ァミノ酸配列と一致した。 またァミノ酸配列解析において上記スーパー ォキサイ ドジスムターゼのァミノ酸配列以外のシグナルの混入は無かった。 実施例 6
(質量分折法を用いたぺプチドのァミノ末端配列の解析） 実施例 1で調製した酵素標品と基質として F o r -Me t -L e u-Ph e- L y sを使用し、 質量分析法を用いたぺプチドのァミノ末端配列の解析を行った o
1 0 mMの F 0 r -Me t -L e u-Ph e -Ly s (30 %酢酸溶液） 1. 5 Lに 2. 4 ミ リ単位の酵素標品 （2. 1〃L) 、 0. 1 Mの炭酸水素アンモ ニゥム 75〃L、 I mMの Co C l 2 ( 1 5 L ) 、 蒸留水 56. 4〃 Lを添加 し、 30てで 4時間反応させた後、 ギ酸 1 5 Lを添加して反応を停止した。 次 にこの反応液を DEVELOS I L ODS— HG— 5カラム （NOMURA CHEM I C AL社製） を用いた逆相 HP LC (高速液体クロマトグラフィ一） に供し、 反応液中のペプチドを含む 4つのビークを分取した。 さらに、 各ピーク に含まれるぺプチドの分子量を J MS— HX 1 0 0二重収束型 FAB質量分析計 (JEOL社製） を用いて測定した。 各ピークの溶出時間、 ピーク中に含まれる ペプチドの分子量、 およびこの分子量より推定される各ペプチドの配列を表 1に 示す。 表 1
Figure imgf000044_0001
表 1に示されるように、 反応液中に生成したぺプチドのうちピーク 4として分 離されたものは未反応の基質ペプチドであった。 また、 ピーク 3に含まれるぺプ チドの分子量は基質ペプチドからホルミル基がはずれたものに、 さらにピーク 2 に含まれるものの分子量は基質べプチドからホルミル基、 およびメチォニンが遊 離されたものにそれぞれ一致した。 この結果より本発明の酵素がこの基質べプチ ドのァミノ末端側から作用し、 ホルミル基、 メチォニンを順次遊離していってい ることが明らかになった。 また、 このように本発明の酵素をペプチドに作用させ て得られる各種の部分分解べプチドの分子量を正確に则定し、 これらを比較する ことによって、 アミノ末端の保護基の種類を含めたぺプチドのァミノ末端配列を 決定することが可能であることが示された 産業上の利用可能性
本発明のアミノ末端保護基遊離酵素は、 2種以上の保護基に対してァミノ末端 保護基遊離活性を示す。 また本発明により、 かかる酵素を用いたペプチドのアミ ノ末端保護塞の除去方法が提供される。 該酵素はペプチド、 特にアミノ末端が未 確認の保護基によってブロックされたタンパク質及びべプチドのァミノ酸配列解 折に有用である。 また、 本発明により、 かかる酵素をコードする D N Aや、 該酵 素の製造方法が提供される。 該 D N Aを改変することにより作製した N末端ァセ チル化ァミノ末端保護基遊離酵素はェドマン分解を受けず、 特にェドマン分解を 用いたァミノ酸配列解析方法において該酵素由来のァミノ酸配列情報がノイズと ならず有用である。
配列表
配列番号： 1
配列の長さ ： 34 8
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
Met Val Asp Tyr Glu Leu Leu Lys Lys Val Val Glu Ala Pro Gly
1 5 10 15
Val Ser Gly Tyr Glu Phe Met Gly He Arg ASP Val Val lie Glu
20 25 30
Glu lie Lys Asp Tyr Val Asp Glu Val Asn Val Asp Lys Leu Gly
35 40 45
Asn Val lie Ala His Lys Lys Gly Glu Gly Pro Lys Val Met lie
50 55 60
Ala Ala His Met Asp Gin He Gly Leu Met Val Thr His He Glu
65 70 75
Lys Asn Gly Phe Leu Arg Val Ala Pro He Gly Gly lie Asp Pro
80 85 90
Arg Thr Leu 〖le Ala Gin Arg Phe Lys Val Trp lie Asp Lys Gly
95 100 105
Lys Phe He Tyr Gly Val Gly Gly Ser Val Pro Pro His lie Gin
110 115 120
Lys Pro Glu Asp Arg Lys Lys Ala Pro Asp Trp Asp Gin lie Phe
125 130 135 s \
OSS 02S
dsv 1¾Λ dsv 8JV nio dsV 1¾Λ Ι^Λ nio ^I v J9S SIH an J sis οιε 90S
3JV Biv OJd 9ii J9S ΪΒΛ BIV O OJd Ι¾Λ 3 ¾IV 3JV JqjL
008 962 062
na SIH 911 ¾1V ^io BIV dsy Jill λιο Aio λ]0 nai ns an dsy
983 082 ^LZ
丄 UIO 丄 OJd 31 ] ni J s人 Ί sAつ BIV naq nio "19 丄 LZ 092
V 1¾Λ 311 J¾ OJd SIH SAo 9U Ι¾Λ 3JV dsv »I1 s
99S 092
911 ¾1V J¾ io sAn λιο uio JM11¾Λ "10 sAq SJH OJd
982 0
j i Aio OJd 1¾Λ dsv ¾IV BIV l jqi Λ V 911 ¾1V 9Md ^10 923 022 912
JAi dsy OJJ usv 911 ^IO ^IV -i^S J Sjy ¾1V i 3JV "31 0Ϊ2 503 002
{0 m nio "13 «10 ΙΕΛ J¾ ¾IV ί^Λ 9Md "1311 dsy sAl S61 061 981
JMl dsv UIO Π3Ί ui98JV ¾IV Jqi d\\ ngq jqx JAJ, \ \ BIV 08 ϊ 9 I O I
9Π 3JV dsy dsv 9 BIV ail J9S Ι^Λ 9Md 8JV SIH sAq Aig na^ S9I 091 991
3JV nio つ SJV XlO dsy jqi 八 911 J 1人 1；) sA ^
09Ϊ O l
IO nai nio NI9 ¾IV nio n sAi J9S ¾IV ^io 9]] dsy d\\
IZirO/Z.6df/XDd 6I86 L6 OAV Ala Ser Val Lys Leu Met Val Lys Val Leu Glu His l ie His Glu
335 340 345
Leu し ys He 配列番号： 2
配列の長さ ： 1 0 4 4
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
配列：
ATGGTGGACT ATGAGCTTTT AAAAAAGGTA GTAGAGGCTC CGGGAGTTTC AGGATATGAG 60 TTCATGGGAA TTAGAGATGT CCTTATTGAA GAGATAAAGG ACTATGTGGA TGAAGTAAAT 120 GTAGACAAAC TCGGAAACGT TATTGCTCAC AAGAAAGGGG AAGGTCCAAA AGTAATGATA 180
GCGGCCCATA TGGATCAAAT TGGACTGATG GTCACGCATA TAGAAAAGAA TGGATTTCTC 240
AGAGTTGCTC CAATAGGAGG AATAGATCCA AGGACATTAA TTGCTCAGAG GTTTAAAGTT 300
TGGATAGACA AAGGAAAGTT TATCTACGGA GTTGGAGGTA GTGTTCCTCC ACACATACAG 360
AAGCCTGAAG ATAGGAAGAA AGCTCCAGAT TGGGATCAGA TATTCATAGA CATTGGAGCA 420
GAGAGCAAGG AAGAGGCCGA GGAGTTGGGA GTAAAAATAG GAACAATAGT AACCTGGGAT 480
GGGAGACTTG AGAGGCTGGG GAAACACAGA TTTGTCAGCA TAGCATTTGA CCATAGGATA 540
GCTGTATACA CTTTAATTGA AACTGCAAGA CAGCTTCAAG ATACGAAGGC AGATATCTAC 600
TTTGTGGCCA CAGTGCAGGA GGAGGTTGGG TTAAGAGGTG CGAGGACAAG TGCCTTTGGA 660
ATTAATCCCG ATTATGGTTT TGCCATTGAT GTTACTATAG CTGCAGATGT ACCAGGAACA 720
CCACAGCACA AGCAACTTAC TCAACTTGGA AAGGGCACTG CAATCAACAT AATGGATCGT 780
TCAGTAATCT GCCATCCAAC AATTGTTAGG TGGATGGAGG AACTGGCAAA GAAGTACGAG 840
ATTCCTTACC AGTGGGATAT TCTGCTGGGA GGAGGTACAG ACGCTGGGGC TATTCACTTA 900 ACTAGGGCTG GAGTTCCAAC AGGTGCTGTA AGTATTCCTG CACGATACAT ACACTCAAAT 960
GCAGAGGTTG TAGATGACAG AGACGTTGAT GCAAGTGTAA AGTTGATGGT AAAAGTTCTT 1020
GAACATATAC ACGAGCTAAA GATT 1044 配列番号： 3
配列の長さ ： 1 2 4 7
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
配列：
GTAGTTTCTC CTTAAAAGTC TCGCCCAAAA TCCTTATATA ATGAGAAAAT AACACTTAGA 60 TGATCATCTA AATGGGGGGA GGAAGATGGT GGACTATGAG CTTTTAAAAA AGGTAGTAGA 120 GGCTCCGGGA GTTTCAGGAT ATGAGTTCAT GGGAATTAGA GATGTCGTTA TTGAAGAGAT 180
AAAGGACTAT GTGGATGAAG TAAATGTAGA CAAACTCGGA AACGTTATTG CTCACAAGAA 240
AGGGGAAGGT CCAAAAGTAA TGATAGCGGC CCATATGGAT CAAATTGGAC TGATGGTCAC 300
GCATATAGAA AAGAATGGAT TTCTCAGAGT TGCTCCAATA GGAGGAATAG ATCCAAGGAC 360
ATTAATTGCT CAGAGGTTTA AAGTTTGGAT AGACAAAGGA AAGTTTATCT ACGGAGTTGG 420
AGGTAGTGTT CCTCCACACA TACAGAAGCC TGAAGATAGG AAGAAAGCTC CAGATTGGGA 480
TCAGATATTC ATAGACATTG GAGCAGAGAG CAAGGAAGAG GCCGAGGAGT TGGGAGTAAA 540
AATAGGAACA ATAGTAACCT GGGATGGGAG ACTTGAGAGG CTGGGGAAAC ACAGATTTGT 600
CAGCATAGCA TTTGACGATA GGATAGCTGT ATACACTTTA ATTGAAACTG CAAGACAGCT 660
TCAAGATACG AAGGCAGATA TCTACTTTGT GGCCACAGTG CAGGAGGAGG TTGGGTTAAG 720
AGGTGCGAGG ACAAGTGCCT TTGGAATTAA TCCCGATTAT GGTTTTGCCA TTGATGTTAC 780
TATAGCTGCA GATGTACCAG GAACACCAGA GCACAAGCAA GTTACTCAAC TTGGAAAGGG 840
CACTGCAATC AAGATAATGG ATCGTTCAGT AATCTGCCAT CCAACAATTG TTAGGTGGAT 900 J31190131 S1JIVV0V3V1SV0313VJ0V a3000 ivj-ug0J303VV VVV3933J0LVV VVV
Figure imgf000050_0001
9J-3 EVVVV
さνοΕi ιΰδιΰδνΙL1133ΰι ν IVVJ
Figure imgf000050_0002
) 1 N 1Ϊト Xaa Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val 1 5 10
配列番号： 6
配列の長さ ： 5
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列の特徴： 1 (N—ァセチルーグリシン）
配列 ：
Xaa Asp Val Glu Lys
1 5 配列番号： 7
配列の長さ ： 4
配列の型： アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列の特徴： 1 (N—ホルミル一メチォニン） 配列：
Xaa Leu Phe Lys
1 配列番号： 8 配列の長さ ： 9
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列の特徴： 1 (N—ミ リストイルーフエ二ルァラニン） 配列：
Xaa Ala Arg Lys Gly Ala Leu Arg Gin
1 5 配列番号： 9
配列の長さ ： 9
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列の特徴： 1 (N—ミ リストイルーグリ シン） 配列 ：
Xaa Ala Gly Ala Ser Ala Glu Glu Lys
1 5 配列番号： 1 0
配列の長さ ： 3 4 8
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状 911 3JV dsv dsy ^I 9H J9S Ι^Λ 9Md 3JV SiH sA Xio Π9つ
591 091 99Ϊ
3JV nio Π9Ί 3JV Ai dsy 丄 J¾ ΙΒΛ 911 3 ^II sAq 八
OS! S OH
AlO Π3Ί nio nio ¾1V nio nig sA， J9S ¾1V 3 911 V 9ΪΙ
SSI Οδ Ϊ 921
a d an uio dsy dJj, dsy OJJ ¾IV s^n sAq 8JV dsy n^ OJJ sAq
02 ϊ 9Π Oil
uiO 911 s!H OJd OJd m J8S Aio JO 1¾Λ 811 d δλη
901 001 96
AlO sAi dsy 311 d sAq ai 3JV uio BIV 911 na J¾ 3JV
06 98 08
OJd dsy 3ΪΙ Aio ^IO 911 oJd ^IV Ι^Λ 3jy ^IO USV sAq
9Z OA 99
ni9 l siH Jqi Ι¾Λ 1 ns
Figure imgf000053_0001
dsy S!H ¾IV ¾1V
09 99 09
911 ΙΒΛ sXi oj<j A{9 nio Aio sXq sAq S!H ¾IV 311 Ι¾Λ usv o 9ε
AlO ηθ s つ dsy Ι¾Λ usv Ι^Λ "10 V Ϊ¾Λ 1 dsv s 9!】 nio OS Z Z
niO 911 ΙΒΛ dsy 3jy 911 Aio nio ^10 ΐ¾Λ 9Ϊ 01 9 1
Aio OJd BIV nio \^ sA s^i n9] na nio J^l dsy dsy B¾X
：
( ^^ー ^ 丄 -N) I ：
mcDu lZJZQIL6d£llDd 6I86 .6 OAV Z 9
91] sAq Π9 988
nio siH 911 siH naq Ι¾Λ sXq \ naq sXq Λ S ¾iv οεε s 02ε
dsv Λ dsv V ni dsv Ι¾Λ Ι¾Λ nio ¾IV usv S!H »1 1 丄
9Ιδ OIC 90S
3J Biv OJd an J9S ΙΕΛ Βίν Aio JMl OJJ Ϊ¾Λ ^IQ BIV 8JV JMl
OOS 962 062
Π91 siH ail ¾IV /iI9 BiV dsv J¾L ^io Aio Aio na ηθη an dsv
98S 083 912
dJl uio J OJd an nio 丄 s sA ¾ιν Π91 nio 丄
QLZ 593 092
3JV 1¾Λ θΐΐ OJd s?H s 9Π Λ 3JV dsv 19JV ^Il sAq
993 092 S
911 EIV Jqi Aio sAi i ngq ui 丄 Ι¾Λ UI9 SAq S IR ni 。
OtS 9S2 OSS
J 1 |9 OJd ΙΒΛ dsv ¾1V ^iv 311 J 1 dsv »11 ¾1V ^19
922 033 1Z
丄 dsy OJd usv 911 ^199i)d ¾IV J l 3jy ¾IV AiQ 8jy
OIZ 902 002
AI3 \ \ nio nio "ΐθ Ι¾Λ JlU ^IV Ι¾Λ 9Md J ^II dsv Biv sX 961 06 Ϊ 981
jqi dsy "13 n9q uio V ¾IV JM1 nio 9H na jqi JA丄 \ \ ¾iv 08Ϊ 9 1 Ο Ϊ iriZ0/I6df/13d ム 6 ΟΛ 配列の長さ ： 1 0 4 4
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
配列：
ATGGATGACT ATGAGCTTTT AAAAAAGGTA GTAGAGGCTC CGGGAGTTTC AGGATATGAC 60 TTCATGGGAA TTAGAGATGT CGTTATTGAA GAGATAAAGG ACTATGTGGA TGAAGTAAAT 120 GTAGACAAAC TCGGAAACGT TATTGCTCAC AAGAAAGGGG AAGGTCCAAA AGTAATGATA 180
GCGGCCCATA TGGATCAAAT TGGACTGATG GTCACGCATA TAGAAAAGAA TGGATTTCTC 240
AGAGTTGCTC CAATAGGAGG AATAGATCCA AGGACATTAA TTGCTCAGAG GTTTAAAGTT 300
TGGATAGACA AAGGAAAGTT TATCTACGCA GTTGGAGGTA GTGTTCCTCC ACACATACAG 360
AAGCCTGAAG ATAGGAAGAA AGCTCCAGAT TGGGATCAGA TATTCATAGA CATTGGAGCA 420
GAGAGCAAGG AAGAGGCCGA GGAGTTGGGA GTAAAAATAG GAACAATAGT AACCTGGGAT 480
GGGAGACTTG AGAGGCTGGG GAAACACAGA TTTGTCAGCA TAGCATTTGA CGATAGGATA 540
GCTGTATACA CTTTAATTGA AACTGCAAGA CAGCTTCAAG ATACGAAGGC AGATATCTAC 600
TTTGTGGCCA CAGTGCAGGA GGAGGTTGGG TTAAGAGGTG CGAGGACAAG TGCCTTTGGA 660
ATTAATCCCG ATTATGGTTT TGCCATTGAT GTTACTATAG CTGCAGATGT ACCAGGAACA 720
CCAGAGCACA AGCAAGTTAC TCAACTTGGA AAGGGCACTG CAATCAAGAT AATGGATCGT 780
TCAGTAATCT GCCATCCAAC AATTGTTAGG TGGATGGAGG AACTGGCAAA GAAGTACGAG 840
ATTCCTTACC AGTGGGATAT TCTGCTGGGA GGAGGTACAG ACGCTGGGGC TATTCACTTA 900
ACTAGGGCTG GAGTTCCAAC AGGTGCTGTA AGTATTCCTG CACGATACAT ACACTCAAAT 960
GCAGAGGTTG TAGATGAGAG AGACGTTGAT GCAAGTGTAA AGTTGATGGT AAAAGTTCTT 1020
GAACATATAC ACGAGCTAAA GATT 1044 配列番号： 1 2 配列の長さ ： 24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖伏
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列：
GCTCATAGTC ATCCATCTTC CTCC 24 配列番号： 1 3
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列：
TGATTACGCCT AGCTTACAT 20 配列番号： 1 4
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列：
CTAAATGGGG GGATCCAGAT GGATGAC 27 ς 9
9i ΟΖ 99
ηΐ9 dsy δλη ο XJO λΐθ SIH sAi sXq J9S naq OJJ usy SIH
09 99 09
OJd Aio BIV J9S J 1 sA3 Αΐθ «10 ^ Ι usy dsy ΑίΟ "10 s!H
98
ΙΒΛ SIH 8Md Aio SIH dsy λ]0 "19 ^41 ngq A j i 9] ] J3S Aio
OS 52 OZ
Ml 1¾Λ Λ Ji dsv λίθ δλη ¾iv rqj) 9Ud SIH all Jill O 91 01 9 ΐ uiO Ι¾Λ OJd io dsv io sAq naq Ι¾Λ SAQ 八 BJV sAq jqi Biv
：
、 -^ - ^m 鹩まー： 0镞 顧 ミ ： ow
9 I ： ½#½2S 3011 VIOVVOOOOI V31V10130V
:
(νΝα ^ ） mmom - m u 親 *一： o
Figure imgf000057_0001
z ： ^owm
9 I ·· ½¾ 2S
UU0IL6d£IJ d 6I86 L6 OM 9 9
S人つ
Ogi 9Η 0\Ί
BIV 911 ^19911 Ι^Λ λΐο SAQ \Μ na Sjy J8S HO ¾IV usv 3
SSI OSl 931
jqi sxq J¾ J9S nio nio usv ^10 ^IO 3JV ^IO dsv dsv OJd
021 9Π Oil
s入 Ί ni STH Ι¾Λ ί^Λ JM1 V 入 13 ^II »ll S "丄 "10
50 ΐ 001 96
J9S ηθη J9S 911 ηθΊ OJd dsv 1¾Λ ^ΙΙ dsv Ι^Λ θΙΙ ¾IV Ι¾Λ ^19
06 98 08
usv sAq dsy BIV JLU Ι¾Λ usv ^io naq dsy AIJ) Ι^Λ STH 3JV "ID
UirO/I6JT/XDd 6I86t>/Z.6 OAV

Claims

請 求 の 範 囲
1. 保護基によってァミノ末端がプロックされたぺプチドに作用して該保護基 を遊離させる活性 （ 「ァミノ末端保護基遊雜活性」 と略記する。 ） を有する酵素 であって、 2種以上の保護基に対して前記活性を示すことを特徵とするアミノ末 端保護基遊離酵素。
2. ァセチル基、 ピログルタミル基、 ホルミル基、 及びミ リス卜ィル基からな る群より選ばれる少なくとも 2種以上の保護基に対してァミノ末端保護基遊離活 性を示す、 請求項 1記載の酵素。
3. さらにァミノべプチダ一ゼ活性を有する請求項 1又は 2記載の酵素。
4. 下記の理化学的性質を有する請求項 1〜 3いずれか記載の酵素。
( 1 ) 至適温度： pH7. 6において 75〜95°C
(2) 至適 pH : pH6. 5〜9. 5
( 3 ) 各種試薬の影響：
ァマスタチンによって活性が阻害を受け、 CoC l 2 によって促進される。
5. 配列表の配列番号： 1に示されるアミノ酸配列の全部、 又はその一部を含 むものであってァミノ末端保護基遊離活性を示す、 請求項 1〜4いずれか記載の 酵素。
6. 配列表の配列番号： 1に示されるアミノ酸配列に、 1個もしくは複数のァ ミノ酸残基が欠失、 付加、 挿入もしくは置換の少なく とも 1つがされており、 か っァミノ末端保護基遊離活性を示す、 請求項 5記載の酵素の機能的同等物。
7. ァミノ末端が保護基によりブロックされた請求項 6記載の機能的同等物。
8. 保護基がァセチル基である請求項 7記載の機能的同等物。
9. 配列表の配列番号： 1 0に示されるアミノ酸配列を有する請求項 8記載の 機能的同等物。
1 0. 請求項 1〜4いずれか記載のァミノ末端保護基遊離酵素をコードする D NA。
1 1. 配列表の配列番号： 1に示されるアミノ酸配列の全部、 又はその一部を 含むものであってァミノ末端保護基遊離活性を示すものをコードする D N A。
1 2. 配列表の配列番号： 2に示される DNAの全部、 又はその一部を含むも のであってァミノ末端保護基遊離活性を示すものをコードする DNA。
1 3. 配列表の配列番号： 1に示されるアミノ酸配列に、 1個もしくは複数の アミノ酸残基が欠失、 付加、 揷入もしくは置換の少なくとも 1つがされており、 かつアミノ末端保護基遊離活性を示すタンパク質をコードする DNA。
1 4. 配列表の配列番号： 1 1に示す塩基配列を有する請求項 1 3記載の DN A。
1 5. 請求項 1 0〜1 4いずれか記載の DN Aにハイブリダィズ可能な、 アミ ノ末端保護基遊離活性を示すタンパク質をコードする D N A。
1 6 . 請求項 1 0〜1 4いずれか記載の D N Aを含んでなる組換え D N A。
1 7 . 請求項 1 6記載の組換え D N Aを挿入されてなる、 微生物、 動物細胞又 は植物細胞を宿主細胞とする発現ベクター。
1 8 . 請求項 1 7記載の発現ベクターにより形質転換されてなる形質転換体。
1 9 . 請求項 1 8記載の形質転換体を培養し、 該培養物中よりアミノ末端保護 基遊離活性を有するタンパク質又はその活性と機能的に同等の活性を有するポリ ぺプチドを採取することを特徴とするアミノ末端保護基遊離酵素又はその機能的 同等物の製造方法。
2 0 . 保護基によってァミノ末端がブロックされたペプチドに、 請求項 1〜9 いずれか記載のァミノ末端保護基遊離酵素又はその機能的同等物を作用させてァ ミノ末端の保護基を遊離させることを特徵とするァミノ末端保護基の除去方法。
2 1 . 保護基によってァミノ末端がプロックされたぺプチドのァミノ酸配列の 解析方法において、 請求項 2 0記載の除去方法により該保護基を遊離させた後、 ァミノ酸配列の解析に供することを特徵とするァミノ酸配列の解析方法。
2 2 . 保護基によってァミノ末端がプロックされたぺプチドのァミノ酸配列の 解析に使用されるキッ 卜であって、 請求項 1〜9いずれか記載のァミノ末端保護 基遊離酵素又はその機能的同等物を含有することを特徴とするキッ ト。
5 g
2 3 . 請求項 1〜 9いずれか記載のァミノ末端保護基遊離酵素又はその機能的 同等物に特異的に結合する抗体又はその断片。
2 4 . 請求項 1 0〜1 5いずれか記載の D N Aとハイブリダィズする合成オリ ゴヌクレオチドプローブ又は合成オリゴヌクレオチドプライマ一。
PCT/JP1997/002121 1996-06-24 1997-06-19 Nouvelle enzyme de deblocage des terminaisons amino WO1997049819A1 (fr)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU31907/97A AU3190797A (en) 1996-06-24 1997-06-19 Novel amino-terminal deblocking enzyme
EP97927398A EP0911411A4 (en) 1996-06-24 1997-06-19 NEW AMINO TERMINATION RELEASE ENZYME
JP50267398A JP3493400B2 (ja) 1996-06-24 1997-06-19 新規なアミノ末端保護基遊離酵素
US09/202,832 US6194190B1 (en) 1996-06-24 1997-06-19 Amino-terminal deblocking enzyme

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP8/184050 1996-06-24
JP18405096 1996-06-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1997049819A1 true WO1997049819A1 (fr) 1997-12-31

Family

ID=16146504

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1997/002121 WO1997049819A1 (fr) 1996-06-24 1997-06-19 Nouvelle enzyme de deblocage des terminaisons amino

Country Status (5)

Country Link
US (1) US6194190B1 (ja)
EP (1) EP0911411A4 (ja)
JP (1) JP3493400B2 (ja)
AU (1) AU3190797A (ja)
WO (1) WO1997049819A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000061711A1 (fr) * 1999-04-07 2000-10-19 Takara Shuzo Co., Ltd. Composition de decomposition de proteines

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6156535A (en) * 1995-08-04 2000-12-05 University Of Ottawa Mammalian IAP gene family, primers, probes, and detection methods
US6821745B2 (en) 2000-09-14 2004-11-23 Bayer Aktiengesellschaft Regulation of human pyroglutamyl peptidase-like enzyme
AU2002310050A1 (en) * 2001-05-23 2002-12-03 Diversa Corporation Peptide synthesis method
JP5397229B2 (ja) * 2008-02-22 2014-01-22 和光純薬工業株式会社 β−グルカン及び／又はエンドトキシン測定用基質並びに測定方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07298881A (ja) * 1994-05-10 1995-11-14 Takara Shuzo Co Ltd 耐熱性ピログルタミルペプチダーゼ及びその遺伝子

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3464810B2 (ja) * 1993-05-18 2003-11-10 タカラバイオ株式会社 超耐熱性アミノペプチダーゼ遺伝子

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07298881A (ja) * 1994-05-10 1995-11-14 Takara Shuzo Co Ltd 耐熱性ピログルタミルペプチダーゼ及びその遺伝子

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000061711A1 (fr) * 1999-04-07 2000-10-19 Takara Shuzo Co., Ltd. Composition de decomposition de proteines

Also Published As

Publication number Publication date
AU3190797A (en) 1998-01-14
EP0911411A4 (en) 2004-05-06
EP0911411A1 (en) 1999-04-28
JP3493400B2 (ja) 2004-02-03
US6194190B1 (en) 2001-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5266265B2 (ja) ヘモグロビンＡ１ｃ測定法およびそれに用いる酵素とその製造法
Tsunasawa et al. Methionine aminopeptidase from the hyperthermophilic Archaeon Pyrococcus furiosus: molecular cloning and overexperssion in Escherichia coli of the gene, and characteristics of the enzyme
JPH08500741A (ja) ストレプトコッカス・ピオゲネスから誘導された組換えｄｎアーゼｂ
CN113801862A (zh) 一种海洋链霉菌磷脂酶d突变体及其重组表达菌株的制备方法
EP0739983B1 (en) Gene encoding lacto-n-biosidase
KR100454174B1 (ko) 엔도글리코세라미데이즈를 암호화하는 유전자
EP0759470B1 (en) Gene encoding endoglycoceramidase activator
KR100543051B1 (ko) 푸코스 황산 함유 다당 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를암호화하는 유전자
WO1997049819A1 (fr) Nouvelle enzyme de deblocage des terminaisons amino
EP0877084A1 (en) Thermostable diaphorase gene
Thapar et al. Expression, purification, and characterization of the protein repair L-isoaspartyl methyltransferase from Arabidopsis thaliana
US6238904B1 (en) Type II restriction endonuclease, HpyCH4III, obtainable from Helicobacter pylori CH4 and a process for producing the same
JP3463951B2 (ja) 耐熱性ピログルタミルペプチダーゼ及びその遺伝子
KR100496748B1 (ko) 신규 아미노말단 보호기 유리 효소
CN113913414B (zh) 高稳定性和高催化效率的双碱基酶Kex2突变体
CA2041875A1 (en) Peptide amidase and the use thereof
JP3512237B2 (ja) 耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ及びその遺伝子
JP3616203B2 (ja) エンドグリコセラミダーゼアクチベーター遺伝子
JP3335287B2 (ja) ヘキソキナーゼ遺伝子
CA1200775A (en) Expression linkers
JP2961143B2 (ja) アミノペプチダーゼ遺伝子、該遺伝子を含むプラスミドベクターおよび形質転換体
JP2005312459A (ja) 遺伝子
EP0472651A4 (en) Endo f-free pngase
AU2383088A (en) Acyl-peptide hydrolase and methods of production and use
JPH09191885A (ja) Ｎｓｐ７５２４ＩＩＩ制限・修飾系酵素及びその遺伝子

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AU BG BR CA CN CZ HU JP KR MX NO NZ PL RO SK US VN AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09202832

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1019980710524

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1997927398

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1997927398

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: CA

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1019980710524

Country of ref document: KR

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1019980710524

Country of ref document: KR