WO1997040143A1 - Proteine inductrice de l'apoptose et gene codant pour elle - Google Patents

Proteine inductrice de l'apoptose et gene codant pour elle Download PDF

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WO1997040143A1
WO1997040143A1 PCT/JP1997/001348 JP9701348W WO9740143A1 WO 1997040143 A1 WO1997040143 A1 WO 1997040143A1 JP 9701348 W JP9701348 W JP 9701348W WO 9740143 A1 WO9740143 A1 WO 9740143A1
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PCT/JP1997/001348
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Kohei Miyazono
Hidenori Ichijo
Original Assignee
Japanese Foundation For Cancer Research
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to a protein that induces apoptosis (cell death), a gene encoding the same, and a bacterium.
  • Mitogen-activated protein (MAP) kinase signaling cascade is a well-preserved intracellular signal pathway from yeast to vertebrates, including MAP kinase (MAPK) and MA PK kinase (MAPKK). And three different members of the protein kinase, including MA PKK kinase (MAPKKK) (T. Sturgillk J. Wu, Biochim. Biophys. Acta. 1092, 350 (1991); E. Nishida & Y. Gotoh , Trends Biochem. Sci., 18, 128 (1993); B. Errede.
  • MA PKK kinase MA PKK kinase
  • MAP KKK phosphorylates MAPPK, thereby activating MAPPK force
  • activity ⁇ h3 ⁇ 4MAPPK phosphorylates MAPPK, thereby activating MAPK.
  • Activated MAPKs translocate to the cell nucleus and regulate the activity of transcription factors, which are tightly regulated by various factors (T, Sturgill & J. Wu, Biochim. Biophys. Acta. 1092, 350 (1991); E. Nishida & Y. Gotoh, Trends Biochem. Sci., 18, 128 (1993); B. Errede & D. Levin, Curr. Op in. Cell
  • MKK3 / MAPKK6 (or MKK6; a protein highly listened to by MKK3) and ⁇ 38 protein kinase are protein kinases corresponding to the MAPMAP and MAP stages, respectively, which form separate MAPK signal fe ⁇ pathways
  • MKK3 / MAPKK6 or MKK6; a protein highly listened to by MKK3
  • ⁇ 38 protein kinase are protein kinases corresponding to the MAPMAP and MAP stages, respectively, which form separate MAPK signal fe ⁇ pathways.
  • the power of what is known R. Davis, Trends Biochem. Sci., 19, 470 (1994); A. Waskiewicz & J. Cooper, Curr. Op in. Cell Biol., 7, 798 (1995) J. Han et al., J. Biol. Chem., 271, 2886 (1996); J. Raingeaud et al., Mol. Cell. Biol., 16, 1247 (1996); T. Moriguchi e
  • apoptosis means cell death different from necrosis, that is, program cell death.
  • Apoptosis DNA per nucleosome DNA fragmented by force and fragmented by electrophoresis can be observed on the ladder.
  • Apoptosis is thought to be involved not only in cancer, but also in autoimmune disease, HIV infection, nervous ⁇ , hepatitis, leukemia, ⁇ disease, ⁇ m ⁇ eye disease, and aging. (Masayuki Miura, Katana! ⁇ Nobu, Osamu Kizaki, "The Forefront of Apoptosis Research", Experimental Medicine Vo 1.13 (1995)) o
  • M «5 necrosis factor (TNF) - ⁇ is known as a potent initiator of cellular apoptosis.
  • SAP, SAP K signal ⁇ system activation was shown to be activated by these cellular apoptosis initiating substances (J. yriakis et al., Nature
  • the present inventors have now identified a novel protein (ASK1) corresponding to MAPKKK, which activates not only the SEK1-SAPK signal pathway but also the MKK3-p38 signal.
  • ASK1 novel protein
  • pro-inflammatory cytokines activate ASK1
  • the activated A SKI is involved in the induction of cell apoptosis via the SEK1-SAPK and MKK3-p38 signal cascades.
  • a dominant negative mutant of ASK1 inhibits TNF-a-induced apoptosis.
  • the present invention is based on such knowledge.
  • an object of the present invention is to provide an apoptosis-inducing protein, a 3 ⁇ 45 sequence encoding the same, a vector containing the base sequence, a host containing the vector, and a method for producing the protein.
  • Another object of the present invention is to provide an agent for treating malignant disease or malignant disease.
  • Another object of the present invention is to provide antibodies against partial peptides of apoptosis-inducing protein and apoptosis-inducing protein.
  • the protein according to the present invention is a protein having protein kinase activity and enhancing SEK1 kinase activity and / or MKK3 kinase activity, or a derivative thereof.
  • FIG. 1 shows the deduced amino acid sequence of human ASK1.
  • the predicted translational start sites of the two clones (clone 20 and clone 27) are indicated by arrows.
  • the protein kinase region is shown in bold.
  • the motivation of FKBP-type peptidyl-prolyl cis-trans isomerase found in the non-terminal region of the N-terminus is underlined.
  • FIG. 2 is a diagram showing the affinity of MAP KKK based on system i ⁇ i chemicals.
  • FIG. 3 is an RNA blot (electro-photograph) showing the fiber distribution of ASK1.
  • He art Heart, Brain: Brain, Plac en ta: Placenta, Lung: Lung, L iver: Liver, Ske letal Muscle: Skeletal muscle, Ki dney: Kidney, Pancreas: Satsu, Sp le en: Spleen, Thymu s: thymus, Pr 0 state: anterior, Te stis: testis, 0 very: ovary, Small Intestine: small intestine, Colon: colon ⁇ Leukocy te: white blood cells.
  • Figure 4 shows the growth of the yeast mutant TM257-HI with or without ASK1 ⁇ (ASK1, ASK1 (K709R)) or without (vector).
  • FIG. 5 is an electrophoretogram showing the activation of MAPKK and MAPK by ASK1 in vivo. Activation was based on the phosphorylation of the substrate protein.
  • the location of the quality protein is indicated by the] and ⁇ symbols.
  • the fold increase in kinase activity due to co-expression of ASK1 is shown above each lane. Magnification is the average of three ⁇ 3 ⁇ experiments. The quantity is in kilodaltons (kDa).
  • FIG. 6 is an electrophoretic photograph showing the activation of MAPKK by ASK1 in vitro.
  • COS7 cells were transfected with pcDNA3-ASKl, and cell lysates were immunoprecipitated with pre-immune serum (mockppt) or anti-A SKI SlflT clear (ASK Ippt).
  • kinase activity of each MAPKK was measured using GST-kinase negative MAPK as a substrate for MAPKK and His-kinase negative MPK2 for SEK1, MKK3 and MAPKK6.
  • ⁇ —MA PKJ represents GST—kinase * negative MAPK
  • ⁇ —MPK2J represents His—kinase * negative MPK2.
  • FIG. 7 is an electrophoretogram showing the ZnCl 9 -dependent expression of ASK1 and ASK1 (K709R) in stably transfected MvI Lu cells.
  • FIG. 8 is a diagram showing ASK1-dependent suppression of [ 3 H] thymidine incorporation.
  • ⁇ Vector alone, ⁇ : ASK1, ⁇ : ASK1 (K 709 R).
  • the figure is a representative example of three experiments. Error bars represent standard deviation.
  • FIG. 10 is an electrophoretic photograph showing ASK1-dependent activation of endogenous S APK (upper) and p38 (lower). The positions of p54 and p46 SAPK (upper) and ATF2 (lower) are indicated by arrows and arrows, respectively.
  • FIG. 11 is a micrograph showing a representative cell morphology at the same magnification under phase contrast microscopy. A SK1-dependent cell death has been shown.
  • FIG. 12 is a photograph showing ASK1-dependent DNA fragmentation.
  • FIG. 13 is a diagram showing the activation time of ASK1 by TNFa in various cells.
  • (Upper) The relative values of the ASK1 activity in Mv1 Lu cells transfected with ASK1 are shown. The results are the average of at least five 3 ⁇ 45: experiments performed. Error * Bar indicates standard deviation.
  • (Lower) is a diagram showing the time course (min: minutes) of ASK1 activity by TNFa in MvLLu Itoda spores transfected with ASK1, 293 cells not transfected with ASK1 and A673 cells.
  • FIG. 14 is a diagram showing Jt-dependent activation of ASK1 using TNF ⁇ .
  • ASK1 activity values are shown as average values. Results are averages from at least five replicate experiments. Error * Bar indicates standard deviation.
  • Figure 15 shows the results in the presence of actinomycin D or ⁇ ? DNA fragmentation in 293 cells stimulated with TNF- ⁇ in the absence (none) of ASK1 (K7 09R) is an electrophoresis photograph showing that the inhibition is caused by transfection.
  • FIG. 16 is an electrophoretogram showing that DNA fragmentation in TNF-stimulated unkat T cells is inhibited by ASK1 (K709R) transfection.
  • ASK1 K709R
  • amino U is used in a sense including both optical isomers, that is, L-form and D-form. Therefore, in the present invention, “protein” refers to L-form The term means not only a protein composed of only amino acids but also a protein containing a part or all of D-form amino acids.
  • amino U refers to not only 20 kinds of ⁇ -amino acids constituting natural proteins, but also other ⁇ -amino acids, and 8-, ⁇ -, amino acids and unnatural amino acids. Therefore, the amino acids substituted in the protein or inserted into the protein as described below are limited to only 20 kinds of ⁇ -amino acids constituting the natural protein.
  • amino acids such as ⁇ -amino M // 3-, 7-, ⁇ -amino acids and unnatural amino acids may be used. Examples include / 9-alanine, 7-aminobutyric acid and orditin. Examples of amino acids other than those constituting natural proteins or non-natural amino acids include 3,4-diamine Hydroxyphenylalanine, phenylglycine, cyclohexylglycine, 1,2,3,4-tetrahydridoisoquinoline-13-carboxylic acid, and dipecotinic acid are exemplified.
  • protein is used to include a peptide. Further, in the present specification, the term “protein according to the present invention” is used to include its derivatives.
  • the apoptosis-inducing protein according to the present invention is a protein having a protein kinase region and having SEKI kinase activity and / or MKK3 kinase activity, or a derivative thereof.
  • the origin of the apoptosis-inducing protein is not particularly limited, and may be derived from humans including humans, or may be derived from other sources.
  • Apoptosis-inducing proteins have protein kinase activity.
  • “having protein kinase activity” refers to a protein that is evaluated by those skilled in the art as having a protein kinase activity of ⁇ recognized.For example, when an experiment is performed under the same conditions as in Example 1, A protein whose protein activity is recognized as Nffi.
  • “protein kinase activity” is used in a sense that includes serine / threonine / protein kinase activity.
  • Apoptosis-inducing proteins silence SEK1 kinase activity and Z or MKK3 kinase activity.
  • a protein that “modulates SEK 1 kinase activity and Z or MKK 3 kinase activity” refers to a protein that is evaluated by those skilled in the art as having a strong activity of these activities. Proteins evaluated to have S ⁇ 1 kinase activity and ⁇ or ⁇ 3 kinase activity when tested under conditions similar to, 4 and 6. Shall taste.
  • the protein according to the present invention has a property of inducing apoptosis. This apoptosis is mediated by the activity of SAPK or JNK and Z or P38: 3 ⁇ 4.
  • Kit activity is dependent on tumor necrosis factor (TNF).
  • TNF tumor necrosis factor
  • the tumor death factor includes, for example, TNF a power.
  • protein derivative refers to the amino terminus of a protein.
  • Part (or all) of the amino group at the (N-terminal) or the side chain of each amino acid, and / or part of the carboxyl group at the carboxyl terminal (C-terminal) of the protein or the side carboxyl group of each amino acid A part or all of Z and / or fgg (for example, a hydrogen group, a thiol group, an amide group, etc.) other than the amino group and the carboxy group of the side chain of each amino acid in the protein, It refers to one modified by another suitable substituent. Modification with an appropriate other substituent is performed, for example, for the purpose of protecting a functional group present in a protein, improving safety and tissue transferability, or enhancing activity.
  • acyl Groups for example, formyl group, acetyl group, propyl group, cyclohexylcarbonyl group, benzoyl group, phthaloynole group, tosyl group, nicotinol group, pyridincarboninole group
  • urethane-type protecting group for example, , P-Nitrobenzyloquinecarbonyl group, P-meth Xybenzyloxycarbonyl group, p-biphenylisopropyloxycarbonyl group, t-butoxycarbonyl group
  • urea-type substituent for example, methylaminocarbonyl group, phenylcarbonyl group, cyclopropyl, cyclohexyl, benzyl
  • substituted or unsubstituted acyl Groups for example, formyl group, acetyl group, propyl group, cyclohexylcarbonyl group, benzoyl group
  • a functional group other than an amino group and a carboxyl group in the side chain of each amino acid of a protein is partially or entirely the same as the amino group Alternatively, those modified with a trityl group and the like can be mentioned.
  • proteins according to the invention include one or more additions, insertions, substitutions and / or deletions, have protein kinase activity, and enhance SEK 1 kinase activity and Z or MKK 3 kinase activity And a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the additions, insertions, substitutions, and deletions herein impair the ability of the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to enhance the protein kinase activity and K1 kinase activity and / or MKK3 kinase activity.
  • the number of ⁇ Is, insertions, substitutions and deletions can be one or several.
  • the protein according to the present invention has the property of enhancing SEK1 kinase activity and Z or MKK3 kinase activity.
  • SEK 1 and MKK 3 are It is known to be involved in potosis. Therefore, the protein according to the present invention is useful for elucidation of cell functions such as apoptosis.
  • a protein comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 having one or more ⁇ n, insertion, substitution, Z or deletion, and having lost protein kinase activity or a derivative thereof (dominant negative mutant). ) Power provided.
  • the number of n, insertions, substitutions and deletions can be one to several.
  • This protein is obtained by modifying a protein that has protein kinase activity and that promotes SEKI kinase activity and Z or MKK3 kinase activity to impair proteinkinase activity. Examples of such modifications include the substitution: K709R.
  • This modified protein inhibits apoptosis caused by TNF- ⁇ , as shown in the examples below. Therefore, the modified protein is useful for elucidating the biological phenomenon involving ASK1.
  • nucleotide sequence encoding the protein according to the present invention is a sequence having a part or all of the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a base sequence shall mean both a DNA sequence and an RNA sequence.
  • the nucleotide sequence encoding it can be easily determined, and various nucleotide sequences encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 can be selected. Therefore, the nucleotide sequence encoding the protein according to the present invention is a sequence encoding the same amino acid, in addition to a part or all of the DNA sequence of SEQ ID NO: 2, and a degenerate codon as a DNA sequence. It also means the sequence that has it. Furthermore, this base sequence also includes the RNA sequence corresponding thereto.
  • the nucleotide sequence according to the present invention may be of natural origin or fully synthesized. You may. In addition, it may be synthesized by using a natural source.
  • a typical method for obtaining DNA is a method commonly used in the field of ⁇ fe ⁇ engineering from a chromosome library or a cDNA library, for example, using an appropriate DNA probe prepared based on partial amino acid sequence information. And a method of performing screening using the same.
  • sequence encoding the protein according to the present invention includes, for example, a sequence consisting of the DNA sequence of Nos. 268 to 4392 of SEQ ID NO: 2 (corresponding to an open reading frame).
  • a vector comprising the above-mentioned nucleotide sequence of the present invention in a state capable of replicating in a host cell and expressing a protein encoded by the nucleotide sequence. Further, according to the present invention, there is provided a host cell transformed with this vector.
  • the host-vector system is not particularly limited, and a fusion protein expression system with another protein can be used. Examples of fusion protein expression systems include those using MBP (maltose binding protein), GST (glucose thione S transferase), HA (hemagglutinin), His (hexahistidine), myc, Fas, etc. Can be
  • the vector examples include a plasmid vector (for example, an expression vector in blastocysts, yeast, insect cells, animal cells, etc.), a virus vector (for example, a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, and a herpes virus).
  • a plasmid vector for example, an expression vector in blastocysts, yeast, insect cells, animal cells, etc.
  • a virus vector for example, a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, and a herpes virus.
  • Virus vector Sendai virus vector, HIV vector, vaccinia virus vector
  • ribosome vector for example, catonic ribosome vector
  • the vector according to the present invention controls the expression in addition to the above-described nucleotide sequence according to the present invention.
  • the vector may contain the nucleotide sequence according to the present invention in a repeated form (for example, in evening repeat). These may be made to exist in a vector according to a conventional method, and a method for transforming a product, Mi cell, animal cultured cell, or the like using this vector may be the one used in this field.
  • the procedure and method for constructing a vector according to the present invention may be those commonly used in the field of engineering.
  • host cells include Escherichia coli, yeast, insect cells, COS cells (eg, COS 7 cells), mink lung epithelial cells (eg, MV 1 Lu), lymphocytes, fibroblasts, CH 0 cells, blood cells, and animal cells such as tumor cells.
  • the transformed host ffl cells are cultured in an appropriate medium, and the protein according to the present invention can be obtained from the culture.
  • a method for producing a protein according to the present invention The culture of the transformed host cells and their conditions may be essentially the same as for the cells used.
  • the protein of the present invention can be recovered and purified from the culture solution according to a conventional method.
  • the cells to be transformed are, for example, cancer cells in a cancer patient (eg, leukemia cells, digestive organ cancer cells, lung cancer cells, spleen cancer cells, ovarian cancer cells, uterine cancer cells, melanoma cells, brain cancer cells, etc.)
  • the vector containing the base sequence according to the present invention is introduced into a cancer cell in a living body including a human by an appropriate method, and the protein according to the present invention is expressed. And be able to perform rehabilitation.
  • a protein according to the present invention can be used in vivo, including humans,
  • apoptosis is induced, and as a result, bad ffiSSS can be active and bad can be treated (see Example 5 below).
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ For more information on therapeutic vectors, see Experimental Medicine (Supplement), Vol. 12, No. 15, “Frontiers of Liao Treatment” (1994), supervised by Fumima Takahisa.
  • the protein according to the present invention has protein kinase activity and enhances SEKI kinase activity and Z or MKK3 kinase activity.Examples 3 and 4)
  • the protein according to the present invention induces apoptosis of immortal cells (Example 5). Therefore, the protein according to the present invention is useful for suppressing the formation and / or metastasis of estrogen.
  • a metabolism comprising the protein of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • treatment is used in the sense including prevention.
  • white blood eg, myelinated white blood, lymphoid white blood such as Burkitt's lymphoma
  • gastrointestinal cancer e.g., gastrointestinal cancer, lung cancer, eye cancer, ovarian cancer, uterus
  • lung cancer e.g., eye cancer, ovarian cancer, uterus
  • examples include cancer, brain SSS, malignant black fe®, carcinoma, and sarcoma.
  • the therapeutic agent for malignant tumor according to the present invention can be administered orally or parenterally (for example, intramuscular, intravenous, subcutaneous, iU3 ⁇ 4, transdermal, nasal, etc.), preferably orally. It is administered to humans and non-human animals in various dosage forms suitable for oral or parenteral administration as drugs.
  • injections such as intravenous and intramuscular injections
  • It can be prepared in any form such as an enteral preparation, a fat and oil agent, and a water-soluble tt ⁇ agent.
  • enteral preparation a fat and oil agent
  • water-soluble tt ⁇ agent include commonly used excipients, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, lubricants, ingredients, buffers, preservatives, dissolution aids, preservatives, Manufactured by a conventional method using a flavoring agent, painless shampoo, stabilizer, etc. Can be.
  • Non-toxic additives that can be used include, for example, lactose, fructose, glucose, starch, gelatin, magnesium carbonate, synthetic magnesium gayate, tanolek, magnesium stearate, methylcellulose, carboxymethylcellulose or its salts, gum arabic , Polyethylene glycol, syrup, vaseline, glycerin, ethanol, propylene glycol, citric acid, sodium salt, sodium sulfite, sodium phosphate and the like.
  • the content of the protein of the present invention in the drug varies depending on its dosage form, which is usually about 0.1 to about 50% by weight, preferably about 1 to about 20% by weight in the total composition.
  • the dosage required for the treatment of malignant tumors is appropriately determined in consideration of the usage, the age of the patient, the degree of k-symptoms, etc., but is usually about 0.1 to about 500 mg, preferably about It should be 0.5 to about 5 Omggjg, which can be administered once or several times a day.
  • target cells can be transformed using a nucleotide sequence encoding the protein of the present invention or a vector containing the same, thereby suppressing the formation and / or translocation of virulence M. That is, the nucleotide sequence and the vector are
  • ntfe ⁇ translation The method of administration of the remedy, the dosage, and the carriers that may be contained can be the same as those used for the treatment of evil.
  • the present invention is based on the HV J ribosome method (Kaneda, Experimental Medicine, Vol.12 No.2, 78 (184), 1994 and Morishita et al., Experimental Medicine, Vol.12 No.15 158 (1928) , 1994), a method in which the nucleotide sequence according to the present invention is directly administered by injection or the like, a calcium phosphate method, a DEAE-dextran method, an electoral poration method, a method using an itfe ⁇ gun (TM Klein et al., Bio / Technology 10, 286-291 (1992)), a method of administration by the lipofection method (Nabel et al .: Science 244, 1285, 1990), a suitable vector (eg, adenovirus vector, adeno-associated virus vector) (1) Herpes virus vector, vaccinia virus vector, retrovirus vector, etc.) can be administered to humans and other animals including humans.
  • a suitable vector eg, adenovirus vector, aden
  • the gene therapy agent according to the present invention is preferably administered in such a manner that it is transiently (transient) in an ASK1 organism.
  • examples of such embodiments include parenteral methods such as a method of administering the ⁇ sequence according to the present invention as it is by 3 ⁇ 4tt, a lipofection method, an HVJ ribosome method, a method using an adenovirus vector, and a method using a vaccinia virus vector.
  • parenteral methods such as a method of administering the ⁇ sequence according to the present invention as it is by 3 ⁇ 4tt, a lipofection method, an HVJ ribosome method, a method using an adenovirus vector, and a method using a vaccinia virus vector.
  • Administration power such as a method of administering the ⁇ sequence according to the present invention as it is by 3 ⁇ 4tt, a lipofection method, an HVJ ribosome method, a method using an adenovirus vector, and
  • a protein, sequence or vector according to the invention in particular in the manufacture of a treatment according to the invention.
  • a therapeutic power of afflicted with bad efficiency comprising administering a protein, ⁇ sequence or vector according to the present invention.
  • the effective dose, administration method, administration form and the like can be the same as described above.
  • a peptide comprising the amino acid sequence of No. 654 to 669 of SEQ ID NO: 1 and a peptide comprising the amino acid sequence of No. 654 to 669 of SEQ ID NO: 1 Code is provided.
  • Examples of the peptide comprising the amino acid sequence of No. 654 to 696 of SEQ ID NO: 1 include peptides obtained by adding an arbitrary amino acid sequence to the N-terminal and Z- or C-terminal of the amino acid sequence. This also includes the proteins according to the invention.
  • This peptide can be used as an antigen for obtaining an antibody against the protein according to the present invention. Further, the protein according to the present invention is closely involved in apoptosis as described above. Therefore, the peptide according to the present invention It is useful for elucidation of the information.
  • an antibody against the peptide examples include polyclonal antibodies and monoclonal antibodies.
  • the antibody according to the present invention can be obtained by a method commonly used in the art.
  • the peptide is injected into an animal body (eg, a heron, a goat, a rat, a mouse, a sheep) together with an optional carrier (eg, a male serum albumin), and after a certain period of time, the serum of the animal is injected.
  • an animal body eg, a heron, a goat, a rat, a mouse, a sheep
  • an optional carrier eg, a male serum albumin
  • monoclonal antibodies can be prepared by hybridoma fusion technology.
  • the peptides according to the invention are part of the amino acid sequence of the protein according to the invention.
  • the specific response of an antibody according to the present invention ie, an immune response
  • Example 1 Polymerase >> Cleaning of ASK 1c DNA by chain reaction (PCR) method and determination of the amino acid sequence of ASK 1
  • PCR was performed using a set of PCR primers derived from the conserved subdomains of the serine nothreonine kinase family, VII and VIII (S. Hanks et al., Science, 241, 42 (1988)). A fragment was obtained. Using this, a corresponding almost full-length cDNA clone was isolated (hereinafter, serine-nothreonine kinase encoded by this cDNA was used to determine the characteristics of tiVatorof EK1 and MKK3 (ASK1) ).
  • oligo a cDNA library derived from Igt11 human erythroleukemia cells (HEL cells) (Poncz et al., Blood, 69, 219 (1987) )) was screened with ⁇ 2 P-labeled PCR fragment.
  • Hybridization and positive bacteriophage were purified according to the method described in H. lchijo et al., I. Biol. Chem., 268, 14505 (1993). Base sequencing was performed on both strands using the Sequenase DNA Sequencing Kit (US Biochemical Corp.). From the 18 clones obtained, the longest three clones (clone 20, 27 and 72) were completely sequenced.
  • the sequence of clone 72 began near the middle of the open reading frame and extended to the polyA stretch and terminated.
  • the ASK1 cDNA The sequence consists of 4533 ⁇ pairs of sequences and contains an ATG codon starting at base 268, followed by an open reading frame of 4125 base pairs, which contains an open reading frame from 1375 amino acids.
  • a different protein was encoded (Fig. 1), and the estimated amount of this protein (ASK1 protein) was found to be 154,715 Da.
  • clone 27 Another clone (clone 27) was obtained that started open reading frame strongly from the site corresponding to amino acid 375 of clone 20. Clone 27 had a stop codon force formed upstream in-frame due to the deletion of the ASK1 cDNA at positions 805-808: 4.
  • the serine-nothreonine kinase region of ASK1 was found in the middle of the ASK1 protein, and had long flanking sequences at the N-terminal and C-terminal (Fig. 1). As a result of RNA block analysis, it was found that a single transcript of 5 kilobases was expressed in various human threads! ⁇ (Fig. 3). MRNA from various human tissues
  • the blot using (Clontech) was performed using ASK1 cDNA labeled by random priming as a probe.
  • a database-based search using the ASK1 sequence outside the kinase domain revealed that the N-terminal short amino acid sequence contained a motif found in the FK506-binding protein (FKBP) -type peptidyl-prolyl cis-trans-isomerase.
  • FKBP FK506-binding protein
  • the kinase region of ASK 1 had a homologous sequence homologous to the kinase region of the MAPKKK family member (Fig. 1, underlined part).
  • the degree of homology was 30.0% for MEKK1 of N-H and 32.3% and 30.4% for SSK2 and STE11 of Saccharomyces cerevisiae, respectively.
  • ASK1 was obtained from MAPKKK JP
  • ASK1 and the yeast MAPKKK SSK2ZSSK22 differ in overall structure (i.e., the kinase region of SSK2 and SSK22 is located at the C-terminal end of these proteins (T. Maeda et al., Science, 269, 554 (1995))
  • ASK1 is not related to SSK2 / SSK22, as described above, ASK1 has the ability to function as a kinase in yeast, and thus the yeast MA PKK We considered this to complement the deletion of K.
  • We investigated this by first encoding the cDNA encoding ASK1 into the yeast expression vector pNVl1.
  • SH01 is a transmembrane osmotic sensor containing the SH3 region.
  • SSK2 / SSK22 another one that induces various responses to hyperosmolarity through H0G1 activation Signaling pathway.
  • Figure 4 is a photograph of plates grown after growth at 30 ° C for 6 days.
  • Example 3 Cell biological analysis of ASK 1 kinase activity using mammalian cells
  • ASK1 plasmid was transfected into COS 7 cells together with gE3 ⁇ 4 MAPK and MAPKK expression plasmids (Fig. Five). All MAPK and M APKK constructs were tagged with hemagglutinin (HA) -epitope-tag, expressed with or without ASK1, and precipitated with anti-HA antibody to ⁇ E. Specifically, it was done according to the method described below.
  • Xenopus MAPK Y.
  • Rat SAPKa J. Kyriakis et al., Nature, 369, 156 (1994)
  • human P38 J. Han et al., Biochim. Biophys. Acta. 1265, 224 (1995)
  • mouse SEK1 I The coding regions of Sanchez et al., Nature, 372, 794 (1994) and human MKK3 (B.
  • HA-tag introduced into Bg1II—EcoRI site of pSRa456 (Y. Takebe et al., Mol. Cell. Biol., 8, 466 (1988)) By doing so, a pSR-like HA1 was constructed.
  • MAPK, S ⁇ 38, ⁇ , SEK1, and c3 cDN ⁇ were subcloned into the BglII site of pSRa—HA1.
  • ASK1 cDNA was introduced into another lactating expression vector pcDNA3 (Invitrogen).
  • COS 7 cells were transfected with ribofectamine according to the manufacturer's instructions (Life Technology).
  • buffer separation (2 OmM Tris-HC1 (pH 7.5), 12 mM glycerol phosphate, 150 mM NaC15 mM EGTA, 10 mM NaF, l% Triton X- 100, 0.5% dexcholate, 3 mM dithiothreitol (DTT :), ImM Cells were lysed in sodium vanadate, lmM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 20 gXml aprotinin. The cell extract was centrifuged at 15,000 X g for 10 minutes to remove the suspension.
  • PMSF phenylmethylsulfonyl fluoride
  • the precipitated immune complex was subjected to phosphorylation.
  • a basic protein was added from outside.
  • the substrate proteins used here were myelin basic protein (MBP) (Sigma) for MAPK, c-Jun for SAPK, ATF-2 for p38, and MAPKK.
  • MBP myelin basic protein
  • MPK2 kinase-negative p38
  • ATF2 used here was prepared according to a previously described method (S. Gupta et al., Science 267, 389-393 (1995)).
  • C-Jun S. atsuda et al., J. Biol. Checi., 210, 12181 fused to a hexahistidine (His) tag
  • Negative MPK2 (K54R) was prepared according to the method described in T. Moriguchi et al., J. Biol. Chem., 270, 12969 (1995). To determine the activity of phosphorylating MBP, c-Jun, ATF2, kinase-negative MA PK and kinase-negative MP ⁇ 2, immunocomplexes are combined with their respective substrate proteins (3 / g each). , final volume 25 1 of solvent solution (20mM T ris -HC 1 (pH7 . 5), 1 OmM MgC l 0, 100 iM [ ⁇ one 3 ⁇ ] ATP (0. i) ) in 30 minutes, 30. C incubated. The reaction was stopped by boiling after the addition of LaemniH's sample buffer. After performing SDS-polyacrylamide electricity (PAGE), phosphorylation of these proteins was analyzed using an image analyzer (Fuji XB AS 2000).
  • the glutaraldehyde method is used to couple with Keyho I elimpet hemocyan in, mixed with Freund's adjuvant, and immunized with egrets. It was done. Coupled 'kinase' assays were combined with this immune complex using recombinant SEK1, MKK3, MAPKK6 and recombinant kinase * negative ⁇ 38 protein according to the method described below.
  • ASK1 is a novel MAPKKK and selectively activates the SEK1-S APK pathway and the MKK 3ZMAPKK6-p38 pathway.
  • ASK1 The biological activity of ASK1 was examined by using a mink lung epithelial cell line (MvI Lu) in which the expression plasmid based on the metallothionein promoter was stably transfected.
  • MvI Lu mink lung epithelial cell line
  • a metallothionein-inducible promoter system was used.
  • ASK1 and ASK1 (K709R) cDNA were converted to pMEP4 vector
  • ASK1 has any effect on cell proliferation.
  • Mv LLU cells stably Toransufuweku preparative with and incubated for 16 hours with 1% ⁇ shea womb] 3 ⁇ 4Jfil Kiyoshi (FB S) and MEM medium containing Z n C 1 2 of ⁇ illustrated. Thereafter, the cells were pulse-labeled with [ 3 H] thymidine for 1 hour, and the [ 3 H] release it activity incorporated into DNA was measured by a liquid scintillation counter. The results were as shown in FIG.
  • each cell extract was prepared using c-Jun as a substrate protein in order to measure the activity of S APK.
  • the polyacrylamide containing gel was subjected to an assay for in-gel kinase detection (in-gel kinase assay).
  • Endogenous SAP K and p38 were also found to be activated in correlation with ASK1 activity.
  • Cytoplasmic shrinkage and cellular condensation were found to be induced (data not shown). Such morphological changes occur in cells expressing ASK1 (K709)! Not done. Cells, 100 M ZnC 1 2 the presence of or under ⁇ standing, and incubated MEM and 26 hours with 1% FBS. Apot Cytoplasmic shrinkage and cellular condensation, which are typical features of cells undergoing one cis, were most pronounced after vigorous, long-term induction (26 hours) (Fig. 11, upper panel).
  • ASK1 induces cell death by apoptosis I *, in situ staining of cells by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling (TUNE L) method (FIG. 11, bottom) and genomic DNA fragmentation.
  • TUNE L terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling
  • TNFa activated ASK1 activity within 5 minutes after stimulation in ASK-1 transfected Mv ILu cells (upper and lower panels in FIG. 13). ASK1 activation by TNFa was observed in a dose-dependent manner (FIG. 14).
  • 293 cells and A673 cells not transfected with ASK1 were treated with 100 ngml of TNF- ⁇ . As a result, it is well known that apoptosis is induced by TNF- ⁇ (data not shown).
  • Various types of cells namely, human 293 fetal 1 g gland cells, A673 rhabdomyosarcoma (
  • ASK1 was transiently transfected into 293 cells (FIG. 15) or Jurkat T cells (FIG. 16). Specifically, experiment according to the method described below! I did. 293 cells (2 ⁇ 10 D ) were transiently transfected with 2 ⁇ g of pcDNA3 control vector or pCDNA3-A SKI (K709R) using Tfx-50 (Promega) according to the manufacturer's protocol. The sex was transfected. Eight hours after transfection, cells were treated with TNF-a (100 ng / ml) for 16 hours in the presence or absence of 300 nM actinomycin D (ActD). Apoptotic cells released from the culture plate were collected, total DNA was isolated, and analyzed by 2% agarose gel electrophoresis (Figure 15).
  • pHok-1 plasmid (lnviogeii) by DMR IE-C reagent (Life Technologies).
  • pHo ok-1 plasmid encodes a single-chain antibody fusion protein against the nopten h0X (4-ethoxymethyIene-2-plienyI-2-oiazoIin-5-one). I have. Therefore, the ability to selectively isolate the transfected cells by using the magnetic beads coated with Ph0X is the key feature.
  • the reaction was performed with Tris—HC 1 (pH 7.5), 1 OmM EDTA, 0.5% Triton X—100).
  • the resulting lysate was incubated with 0.2 mg of proteinase K and 0.1 mgZml of RNaseN for 1 hour at 42 ° C. Thereafter, the DNA was extracted with ethanol and then purified by phenol Z-cloth form extraction. The extracted cytoplasmic DNA was analyzed by 2% agarose gel electrophoresis ( Figure 16).
  • Val Leu Lys lie Ser Asp Phe Gly Thr Ser Lys Arg Leu Ala Gly He
  • Sequence type nucleic acid
  • Arg lie Arg Gin Arg Val Asp Asn lie Glu Val Leu Thr Ala Asp He
  • GGT CGA ATC TAC AAA GAT ATG TTT TTG GAC TCT AAT TTC ACG GAC ACT 1494
  • AAG CAT TTT GTG AAA CTG ACC ACA GAA CAG CCT GTG GCC
  • GAG AAT GGT TTC ATT AAA ATC TTC ATG GAG CAG GTC CCT GGA GGA AGT 2550

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Description

明 細 書 アポトーシス誘導タンパク質およびそれをコードする遗 発 明 の 背景
発明の分野
本発明は、 アポトーシス （細胞死） を誘導するタンパク質およびこれをコード する遺伝子並びに悪 洽癆 に関する。
背景技術
Mitogen-act ivated protein (MA P) キナーゼによるシグナル伝達カスケ一 ドは、 酵母から脊椎動物に至るまでよく保存された細胞内シグナル ^路であ り、 MAPキナーゼ （MAPK) 、 MA PKキナーゼ （MAPKK) および MA PKKキナーゼ （MAPKKK) を含むタンパク質キナーゼの 3つの異なるメン バーより構成される （T. Sturgi l l k J. Wu, Biochim. Biophys. Acta. 1092, 350 (1991)； E. Nishida & Y. Gotoh, Trends Biochem. Sci. , 18, 128 (1993)； B. Errede
& D. Levin, Curr. Op in. Cel l Biol. , 5, 254 (1993)； C. Marsha! 1, Curr. Op in.
Genet. Dev. , 4, 82 (1994) ) 。 MA P KKKは M A P KKをリン酸化しこれに より M A P K K力活性化し、 活性 <h¾M A P K Kは M A P Kをリン酸化しこれに より MA PKが活性化する。 活性化された MAPKは細胞核へ移動し、 転写因子 の活性を調節し、 それによつて種々の遗&? ¾現力く制御される （T， Sturgi l l & J. Wu, Biochim. Biophys. Acta. 1092, 350 (1991)； E. Nishida & Y. Gotoh, Trends Biochem. Sci. , 18, 128 (1993)； B. Errede & D. Levin, Curr. Op in. Cel l
Biol. , 5, 254 (1993)； C. Marshal 1, Curr. Op in. Genet. Dev. , 4, 82 (1994)) 0 M A P Kシグナル伝皿路に関する知見の最近の進歩によつて、 哺乳動物の細 胞では少なくとも明らかに異なる 2種類の MAP KKK— MA PKK— MA PK シグナル 路が機能していることが明らかになった （R. Davis, Trends Bio chem. Sci. , 19, 470 (1994)； A. Waskiewicz & J. Cooper, Curr. Op in. Cell Biol . , I in (1995)；]. Kyriakis & J. Avruch, J. Biol. Chem. , 265, Π 355 (1990) ； B. Deri jard et al., Cell, 76, 1025 (1994)； . Yan et al. , Nature, 112 , 798 (1994)； K. Yamaguchi et al. , Science 270, 2008 (1995)； J. Kyriakis et al. , Nature, 369, 156 (1994) ;1. Sanchez et al. , Nature, 372, 794 (1994 )； B. Deri jard et al. , Science, 267, 682 (1995)； S. Matsada et al. , J. Biol. Chem., 270, 12781 (1995)) 。 これらの 2種類の経路はそれぞれ、 R a f 一 MAPKK— MAPK経路および MEKK— S EK 1 (または MKK4) — S APK (または J NK) 経路より成る。
MKK3/MAPKK6 (または MKK6 ； MK K 3に極めて聽のタンパク 質） および ρ 38タンパク質キナーゼは、 それぞれ MAP ΚΚおよび MAP の 段階に相当するタンパク質キナーゼであり、 これは別の MAPKシグナル fe^ 路を形成していること力《知られている （R. Davis, Trends Biochem. Sci. , 19, 470 (1994)； A. Waskiewicz & J. Cooper, Curr. Op in. Cell Biol., 7, 798 ( 1995)； J. Han et al. , J. Biol. Chem. , 271, 2886 (1996)； J. Raingeaud et al. , Mol. Cell. Biol., 16, 1247 (1996) ； T. Moriguchi et al., J. Biol. Chem, 211, 13675 (1996) ) 0
最近の研究より、 S APKおよび Zまたは p 38 MAPキナーゼのシグナル β¾カスケ一ドが、 アポトーシスを誘導するシグナル 路の少なくとも一部 に関係していることが示唆されている （Z. Xia et al. , Science, 2Τ0, 1326 (1995)； Y. -R. Chen et al. , j. Biol. Chem. , 271, 631 (1996)； N. Johnson et al. , J. Biol. Chem., 271, 3229 (199fi)； . Verhei j et al. , ature 380, 75 (1996)) 。 ここで、 アポトーシスは、 壊死とは異なる細胞死、 すなわち、 プ ログラム細胞死、 を意味する。 アポトーシスでは、 ヌクレオソームごとに DNA 力断片化され電気泳動で断片化した DNAが梯子伏に観察できる。 また、 アポト 一シスは、 ガンの のみならず、 自己免疫 患、 H I V感染、 神経^ Β、 肝炎、 白血病、 肾疾患、 ^m ^眼 患および老ィヒ等にも関与していると考えられて いる （三浦正幸、 刀!^信、 木崎治 集「アポトーシス研究の最前線」、 実験 医学 Vo 1. 13 (1995) ) o
—方、 M«5壊死因子 (TNF) 一 αは、 強力な細胞性アポトーシス開始物質と して知られている。 ¾¾、 これらの細胞性アポトーシス開始物質によって SAP Kシグナル^系力活性化されることが示された （J. yriakis et aし， Nature
372, 794 (1994)； J. Raingeaud et al., J. Biol. Chem. , 270, 7420 (1995)) c しかしながら、 MKK3— p 38経路および SEK1— SAPK経路の上流の MAPKKKに相当するタンパク質や、 離路の活性化のメカニズム、 更には、 これらの経路を介したアポトーシスの については、 本発明者らが知る限り報 告されていない。
発明 の概要
今般、 本発明者らは、 S EK1— SAPKシグナル 路のみならず MKK 3-p 38シグナル をも活性化する、 MAPKKKに相当する哺^の 新規タンパク質 （ASK1) を同定した。 また、前炎症性サイトカインが ASK 1を活性化し、 活性化された A SKIが SEK1— SAP Kおよび MKK 3-p 38シグナル カスケ一ドを介して細胞のアポトーシス誘導に関与することを 見出した。 また、 本発明者らは、 ASK1のドミナントネガティブ変異体が TN F-aが誘導するアポトーシスを阻害することを見い出した。 本発明はかかる知 見に基づくものである。
従って、 本発明は、 アポトーシス誘導タンパク質、 それをコードする ¾5配列、 前記塩基配列を含むベクター、 前記ベクターを含む宿主、 および前記タンパク質 の製造法の提供をその目的とする。 また、 本発明は、悪性 ¾治 または悪性 ¾R遗 治療剤の提供をその目 的とする。
更に、 本発明は、 アポトーシス誘導タンパク質の部分べプチドおよびアポトー シス誘導タンパク質に対する抗体の提供をその目的とする。
そして、 本発明によるタンパク質は、 プロテインキナーゼ活性を有し、 かつ S EK1キナーゼ活性および /または MKK 3キナーゼ活性を亢進するタンパク質 またはその誘導体、 である。
図面の簡単な説明
図 1は、 ヒト ASK1の推定アミノ酸配列を示した図である。 2つの した クローン （クローン 20およびクローン 27) で想定される翻訳開始部位を矢印 で示した。 タンパク質キナーゼ領域は太字で示した。 N末端の非,領域に見出 された FKB P型のぺプチジル一プロリル シス一トランス イソメラーゼのモ チーフは下線で示した。 アミノ酸残基の略語は、 A : A i a、 C : Cy s、 D : As p、 E : G l u、 F : Phe、 G : G l y、 H : H i s、 I ： I l e、 K： Ly s、 L : Leu、 M:Me t、 N : As n、 P : P r o、 Q : G l n、 R： Ar g、 S : S e r、 T : Th r、 V : Va l、 W: Trp、 Y : Ty rである。 図 2は、 系 i^i化学的な MA P KKKの類縁関係を示した図である。
図 3は、 ASK 1の纖分布を示した RNAブロット （電気- 写真） である。 He a r t ：心臓、 B r a i n：脳、 P l a c en t a :胎盤、 Lung：肺、 L i v e r :肝臓、 Ske l e t a l Mu s c l e :骨格筋、 Ki dney： 腎臓、 Panc r ea s ：薩、 Sp l e en :脾臓、 Thymu s ：胸腺、 P r 0 s t a t e ：前¾¾、 Te s t i s :精巣、 0 v e r y：卵巣、 Sma l l I n t e s t i ne :小腸、 Co l on :結腸ヽ Leukocy t e ：白血球。 図 4は、 ASK 1遗 を発現させたか （ASK1、 ASK1 (K709R) ) または発現させなかった （vector)酵母変異株 TM257—HIの生育 （コロニ 一形成） を示した写真である。 1. 5Mソルビトール （sorbitol) 存在下または 在下にお 、て試験した。
図 5は、 インビボでの ASK 1による MAPKKおよび MAP Kの活性化を示 した電気泳動写真である。 活性化は、 基質タンパク質のリン酸化を指標とした。
質タンパク質の位置は、 ] 印および^印で示した。 ASK1の共発現によ るキナーゼ活性の増加の倍率を、 各レーンの上に示した。 倍率は、 3回の ¾3Ϊし た実験の平均値である。 量はキロダルトン （kD a) である。
図 6は、 インビトロでの ASK 1による MAPKKの活性化を示した電気泳動 写真である。 COS 7細胞にp cDNA3—ASKlをトランスフェク卜し、細 胞のライゼートを免疫前血清 (mo c k p p t ) または抗 A SKI S lflT清 (A SK I p p t) で免疫沈降した。 免疫複合体またはバッファ一溶液 （b u ί ί e r) を H i s— MAPKK、 H i s— SEKl、 H i s— MKK3または H i s— MAPKK6の存在下 (+) または非存在下 （一） でインキュベートした後、 それぞれの MAPKKのキナーゼ活性を、 MAPKKには G ST—キナーゼネガ ティヴ MAPKを基質として、 SEK1、 MKK3および MAPKK6には H i s—キナーゼ ·ネガティヴ MP K 2を基質として測定した。 写真中 ΓΚΝ— MA PKJ は、 G ST—キナーゼ*ネガティブ MAPKを、 ΓΚΝ— MPK2J は、 H i s—キナーゼ*ネガティブ MP K 2を、 それぞれ表す。
図 7は、 安定的にトランスフヱクト （transfectioii) した Mv l Lu細胞での ASK 1および ASK 1 (K709R) の ZnC l 9依存的な発現を示した電気 泳動写真である。
図 8は、 ASK 1依存的な [3H] チミジンの取り込みの抑制を示した図であ る。 騸：ベクター単独、 拿： ASK1、 〇： ASK1 (K 709 R) 。 図は 3回 の した実験の代表例である。 エラー ·バーは標準偏差を表わす。
図 9は、 ZnC 1 2誘導による用量依存的な A SKIタンパク質の発現 （上段） と ASK1の活性ィ匕 （下段） を示した電気泳動写真である。 「no— I P」 は、 免疫沈降を行わずに細胞ライゼ一トを^ ^標品として用いた場合を表わす。 図 10は、 ASK1依存的な内在性の S APK (上段） および p 38 (下段） の活性化を示した電気泳動写真である。 p 54および p 46 SAPK (上段） および ATF2 (下段） の位置は、 矢尻印および矢印でそれぞれ示した。
図 11は、 代表的な細胞の形態を位相差顕^で同じ拡大率で した顕¾^ 写真である。 A SK1依存的な細胞死が示されている。 （上段） 細胞を 1%FB Sを含む M E M培地中で、 100 zM Z n C 19存在下または非存在下で 26 時間培養した。 （下段） 細胞を F B Sを含まない MEM培地中で、 100 ίίΜ ZnC 12存在下または非存在下で 25時間培養した。 その後、 TUNEL法に より染色した。 アポトーシスを起こした細胞は、 ダーク ·ブラウンに染色された 部分で示されている。 写真は、 上段に比べて高い拡大率で ϋ¾した。
図 12は、 ASK1依存的な DNA断片化を示した 写真である。 図 13は、 様々な細胞における TNFaによる ASK1の活性化の時間^!を 示した図である。 （上段） ASK1をトランスフエクトした Mv 1 Lu細胞にお ける A S K 1活性の値を相対値で示した。 結果は少なくとも 5回の ¾5：した実験 からの平均値である。 エラー *バ一は標準偏差を示している。 （下段） ASK1 をトランスフエクトした Mv lLu糸田胞、 A SK1をトランスフエクトしていな い 293細胞および A673細胞における TNFaによる ASK1活性の時間経 過 （m i n：分） を示した図である。
図 14、 TNF αの用 Jt依存的な ASK 1の活性化を示した図である。 ASK 1活性の値は平均値で示した。 結果は少なくとも 5回の した実験からの平均 値である。 エラー *バ一は標準偏差を示している。
図 15は、 ァクチノマイシン D存在下または^？?在下 (none) で TNF— αで 刺激 （Stimulation ) した 293細胞における DN A断片化が、 ASK1 (K 7 09R) のトランスフエクシヨン （Transfection) によって阻害されることを示 した電気泳動写真である。
図 16は、 TNF—なで刺激 （Stimulation ) した] unkat T細胞における D NA断片化が、 ASK1 (K709R) のトランスフエクシヨン （Transf ection) によって阻害されることを示した電気泳動写真である。 図中、 「n on e」 は、 トランスフヱクシヨンしなかつた場合または刺激がなかった場合を示す。
発明の具体的説明
本発明において、 「ァミノ U とは、 光学異性体、 すなわち L体および D体、 のいずれをも含む意味で用いられるものとする。 従って、 本発明において 「タン パク質」 とは、 L体のアミノ酸のみによって構成されているタンパク質だけでな く、 D体のアミノ酸を一部または全部含むタンパク質をも意味するものとする。 また、 本発明において、 「ァミノ U とは、 天然のタンパク質を構成する 20 種の α—アミノ酸のみならず、 それら以外の α—アミノ酸、 並びに 8—、 ァー、 アミノ酸および非天然のアミノ酸等を含む意味で用いられるものとする。 従 つて、 下記のようにタンパク質において置換されるかまたはタンパク質中に挿入 されるアミノ酸としては、 天然のタンパク質を構成する 20種の α—アミノ酸だ けに限定されることはなく、 それら以外の α—ァミノ M びに /3—、 7—、 δ- アミノ酸および非天然のアミノ酸等であってもよい。 このような^一、 7—また は (5—アミノ酸としては、 /9-ァラニン、 7—ァミノ酪酸あるいはオル二チンが 挙げられ、 また天然タンパク質を構成するもの以外のアミノ酸あるいは非天然の アミノ酸としては、 3, 4—ジヒ ドロキシフエ二ルァラニン、 フエニルグリシン、 シクロへキシルグリシン、 1, 2, 3, 4—テトラハイ ド口イソキノリン一 3— カルボン酸あるいは二ペコチン酸等力く挙げられる。
本明細書において、 特定の変異を表す場合には、 本来のアミノ酸残基 （一文字 表記） 力最初に、 位置番号が二番目に、 そして置換された後のアミノ ® ^基 （一 文字表記） 力く三番目に示される。 例えば、 「K 7 0 9 R」 は、 7 0 9番目のアミ ノ酸残基である K (Lys ： リジン） が R (Arg ：アルギニン） で置換されている ことを表す。
本明細害において 「タンパク質」 とは、 ペプチドを含む意味で用いられるもの とする。 また、 本明細書において 「本発明によるタンパク質」 というときは、 そ の誘導体を含む意味で用いられるものとする。
アポトーシス誘導タンパク質
本発明によるアポトーシス誘導タンパク質は、 プロティンキナーゼ 領域を 有し、 かつ S E K 1キナーゼ活性および/または MK K 3キナーゼ活性を] す るタンパク質またはその誘導体である。
アポトーシス誘導タンパク質の起源は特に限定されず、 ヒトを含むホ¾@由来 のものであっても、 それ以外を由来とするものであってもよい。
アポト一シス誘導タンパク質は、 プロテインキナーゼ活性を有する。 本発明に おいて、 「プロテインキナーゼ活性を有する」 とは、 当業者によりプロテインキ ナーゼ活性力 <認められたと評価されるタンパク質をいい、 例えば、 例 1と同 様の条件において実験した場合に、 プロティンキナ一ゼ活性が認められたと Nffi されるタンパク質をいう。 ここで、 「プロテインキナーゼ活性」 とは、 セリン/ スレオニン ·プロテインキナーゼ活性を含む意味で用いられる。
アポト一シス誘導タンパク質は、 S E K 1キナーゼ活性および Zまたは MK K 3キナーゼ活性を冗進する。 本発明において、 「S E K 1キナーゼ活性および Z または MK K 3キナーゼ活性を冗進する」 タンパク質とは、 当業者によりこれら の活性の 7ΰϋ力く認められたと評価されるタンパク質をいい、 例えば、 例 3、 4および 6と同様の条件において実験した場合に、 S Ε Κ 1キナーゼ活性および Ζまたは ΜΚ Κ 3キナーゼ活性の: ίΐϋが認められたと評価されるタンパク質を意 味するものとする。
本発明によるタンパク質は、 アポトーシスを誘導するとの性質を有する。 この アポトーシスは、 S A P Kもしくは J N Kおよび Zまたは P 3 8の活性の: ¾ に よって媒介されるものである。
本発明によるタンパク質による S E K 1キナーゼ活性および Zまたは MKK 3 キナーゼ活性 Kit活性は、 腫瘙壌死因子 (T N F) によって^！する。 ここで、 腫瘍壌死因子としては、 例えば T N F a力、'挙げられる。
本明細書において、 「タンパク質の誘導体」 とは、 タンパク質のァミノ末端
(N末端） のァミノ基または各ァミノ酸の側鎖のァミノ基の一部もしくは全部、 および またはタンパク質のカルボキシル末端 （C末端） のカルボキシル基また は各ァミノ酸の側鐄のカルボキシル基の一部もしくは全部、 および Zまたは、 夕 ンパク質の各ァミノ酸の側鎖のァミノ基およびカルボキシノレ基以外の官 fgg (例 えば、 水素基、 チオール基、 アミ ド基等） の一部もしくは全部が、 適当な他の置 換基によって修飾を受けたものをいう。 適当な他の置換基による修飾は、 例えば、 タンパク質中に存在する官能基の保護、 安全性ならびに組織移行性の向上、 ある いは活性の増強等を目的として行われる。
タンパク質の誘導体としては、 具体的には、
( 1 ) タンパク質のァミノ末端 （N末端） のァミノ基または各アミノ酸の側鎖の ァミノ基の一部もしくは全部の水素原子力く、 置換または非置換のアルキル基 （直 鎖、 分岐鎖または環状であってもよい） （例えば、 メチル基、 ェチル基、 プロピ ル基、 イソプロピル基、 イソブチル基、 ブチル基、 t一ブチル基、 シクロプロピ ル基、 シクロへキシル基、 ベンジル基） 、 置換または非置換のァシル基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基、 力プロィル基、 シクロへキシルカルボニル基、 ベンゾ ィル基、 フタロイノレ基、 ト シル基、 ニコチノィル基、 ピぺリ ジンカルボ二ノレ基） 、 ウレタン型保護基 （例えば、 p—ニトロベンジルォキンカルボニル基、 P -メ ト キシベンジルォキシカルボニル基、 p—ビフヱ二ルイソプロピルォキシカルボ二 ル基、 t—ブトキシカルボニル基） またはウレァ型置換基 （例えば、 メチルアミ ノカルボニル基、 フヱニルカルボニル基、 シクロへキシルァミノカルボニル基） 等によって置換されたもの、 並びに
( 2 ) タンパク質のカルボキシル末端 （C末端） のカルボキシル基または各アミ ノ酸の側鎖のカルボキシル基の一部もしくは全部が、 エステル型の修飾を受けて いるもの （例えば、 その水素原子がメチル、 ェチル、 イソプロピル、 シクロへキ シル、 フエニル、 ベンジル、 t—プチル、 4一ピコリルにより置換されたもの） 、 了ミ ド型の修飾を受けているもの （例えば、 非置換ァミ ド、 C 1一 C 6アルキル アミ ド （例えば、 メチルァミ ド、 ェチルァミ ド、 ィソプロピルァミ ド） を形成し ているもの、 並びに
( 3 ) タンパク質の各ァミノ酸の側鎖のァミノ基およびカルボキシル基以外の官 能基 （例えば、 水素基、 チオール基、 アミノ基等） の一部もしくは全部が、 のァミノ基と同様の置換基あるいはトリチル基などで修飾されたもの等が挙げら れる。
本発明によるタンパク質の例としては、 1以上の付加、 挿入、 置換および ま たは欠失を有し、 プロテインキナーゼ活性を有し、 かつ S E K 1キナーゼ活性お よび Zまたは MK K 3キナーゼ活性を亢進する配列番号 1のァミノ酸配列を含む タンパク質が挙げられる。 ここにいう付加、 挿入、 置換、 および欠失とは、 配列 番号 1のァミノ酸配列からなるタンパク質のプロティンキナーゼ活 びに K 1キナーゼ活性および/または MK K 3キナーゼ活性を冗進する性質を損 ないようなものをいう。 ここで、 †¾I、 挿入、 置 および欠失の数は、 1 し数個であることができる。
本発明によるタンパク質は、 S E K 1キナーゼ活性および Zまたは MK K 3キ ナーゼ活性を亢進する、 との性質を有する。 また、 S E K 1および MKK 3はァ ポトーシスに関与していることが知られている。 従って、 本発明によるタンパク 質は、 アポトーシスのような細胞機能の^解明に有用である。
本発明によれば、 1以上の ¾n、 挿入、 置換および Zまたは欠失を有し、 力、つ プロティンキナーゼ活性が失われた配列番号 1のアミノ酸配列を含むタンパク質 またはその誘導体 （ドミナントネガティブ変異体） 力提供される。 n、 挿入、 置換および欠失の数は 1ないし数個であることができる。
このタンパク質は、 プロテインキナーゼ活性を有し、 かつ S E K 1キナーゼ活 性および Zまたは MK K 3キナーゼ活性を冗進するタンパク質をプロティンキナ 一ゼ活性を損なうように改変することによって得られる。 このような改変の例と しては、 置換： K 7 0 9 Rが挙げられる。
この改変タンパク質は、 後記 例において示されるように T N F— αによつ て引き起こされるアポトーシスを阻害する。 従って、 該改変タンパク質は、 A S K 1が関与する生命現象の解明に有用である。
配列
本発明によれば、 本発明によるタンパク質をコ一ドする塩基配列が提供される。 本発明によるタンパク質をコードする塩基配列の例は、 配列番号 2に記載される D N A配列の一部または全部を有する配列である。 なお、 本明細書において塩基 配列とは、 D N A配列および R N A配列のいずれをも意味するものとする。
前記改変ァミノ酸配列力与えられれば、 それをコードする塩基配列は容易に定 まり、 配列番号 1に記載されるァミノ酸配列をコードする種々の塩基配列を選択 することができる。 従って、 本発明によるタンパク質をコードする塩基配列とは、 配列番号 2の D N A配列の一部または全部に加え、 同一のァミノ酸をコードする 配列であって、 縮重関係にあるコドンを D N A配列として有する配列をも意味す るものとする。 更にこの塩基配列は、 これらに対応する R N A配列も含む。
本発明による塩基配列は、 天然由来のものであっても、 全合成したものであつ てもよい。 また、 天然由来のものの を利用して合成を行ったものであっても よい。 D N Aの典型的な取得方法としては、 染色体ライブラリーまたは c D N A ライブラリ一から遗 fe^工学の分野で慣用されている方法、 例えば部分ァミノ酸 配列の情報を基にして作成した適当な D N Aプローブを用いてスクリーニングを 行う方法、 等が挙げられる。
本発明によるタンパク質をコードする 配列としては、 例えば、 配列番号 2 の 2 6 8〜4 3 9 2番の D N A配列 （オープンリ一ディ ングフレームに相当） 力、 らなる配列が挙げられる。
ベクタ一および形 ¾ ^換された宿 ¾¾3胞
本発明によれば、 前記の本発明による塩基配列を、 宿主細胞内で複製可能でか つその塩基配列がコードするタンパク質を発現可能な状態で含んでなるベクター が提供される。 更に、 本発明によれば、 このベクターによって形質転換された宿 主細胞力く提供される。 この宿主一ベクター系は特に限定されず、 また、 他のタン パク質との融合タンパク質発現系などを用いることができる。 融合タンパク質発 現系としては、 M B P (マルトース結合タンパク質） 、 G S T (グル夕チオン S トランスフェラーゼ） 、 H A (へマグルチニン） 、 H i s (へキサヒスチジン） 、 m y c、 F a s等を用いたもの力《挙げられる。
ベクターとしては、 プラスミ ドベクター （例えば、 原棚胞、 酵母、 昆虫細胞 動物細胞等での発現ベクター） 、 ウィルスベクター （例えば、 レトロウイルスべ クタ一、 アデノウイルスベクター、 アデノ関連ウィルスベクター、 ヘルぺスウイ ルスベクター、 センダイウィルスベクター、 H I Vベクター、 ワクシニアウィル スベクタ一） 、 リボソームベクター （例えば、 カチォニックリボソームベクター） 等が挙げられる。
本発明によるベクターは、 これを実際に宿主細胞に導入して所望のァミノ酸配 列を発現させるためには、 前記の本発明による塩基配列の他に、 その発現を制御 する配列 （例えば、 プロモーター配列、 ターミネ一ター配列、 ェンハンサー配列） や微生物、 昆虫細胞または動物培養細胞等を選択するための遗伝子マーカー （例 えば、 ネオマイシン耐性遺 fe^、 カナマイシン耐性遗 ^?) 等を含んでいてもよ い。 また、 このべクタ一は、 本発明による塩基配列を反復した形で （例えば、 夕 ンデムリピートで） 含んでいてもよい。 これらは常法に従いベクターに存在させ てよく、 このべクターによる 物、 Mi細胞または動物培養細胞等の形質転換 の方法も、 この分野で惯用されているものを用いることができる。
本発明によるベクター構築の手順および方法は、 遗 工学の分野で慣用され ているものを用いることができる。
また、 宿主細胞としては、 例えば、 大腸菌、 酵母、 昆虫細胞、 並びに C O S細 胞 （例えば、 C O S 7細胞） 、 ミンク肺上皮細胞 （例えば、 M V 1 L u ) 、 リン パ球、 繊維芽細胞、 C H 0細胞、 血液系細胞、 および腫瘍細胞等のような動物钿 胞が挙げられる。
上記形質転換された宿 ^ ffl胞を適当な培地で培養し、 その培養物から本発明に よるタンパク質を得ることができる。 従って、 本発明の別の面によれば、 本発明 によるタンパク質の製造法が提供される。形質転換された宿主細胞の培養および その条件は、 使用する細胞についてのそれと本質的に同様であってよい。 また、 培養液からの本発明によるタンパク質の回収、精製も常法に従って行うことがで きる。
形質転換される細胞が例えばガン患者体内のガン細胞 （例えば、 白血病細胞、 消化器ガン細胞、 肺ガン細胞、 スィ臓ガン細胞、 卵巣ガン細胞、 子宮ガン細胞、 メラノーマ細胞、 脳腫癌細胞等） であるときは、 その前記の本発明による塩基配 列を含むベクターをヒトを含む生体内のガン細胞に適当な方法によって導入し、 本発明によるタンパク質を発現させることにより、悪 ¾ 瘍等につ 、て遺 治 療を行うことができる。 例えば、 本発明によるタンパク質をヒトを含む生体内、 特に、悪 細胞、 で発現させると、 アポトーシスが誘導され、 その結果とし て悪 ffiSSS力職し、 悪 ¾¾¾を治療することができる （後記 例 5参照） 。 遗 治療用のベクターについては、 高久史磨監修の実験医学 （増刊号） 第 1 2巻、 第 1 5号「遼 治療の最前線」 （ 1 9 9 4年） を参照することができる。
用途/医 物
本発明によるタンパク質は、 プロテインキナーゼ活性を有し、 かつ S E K 1キ ナーゼ活性および Zまたは MK K 3キナーゼ活性を亢進する 例 3および 4 )
0 また、 本発明によるタンパク質は、 不死 胞のアポトーシスを誘導する ( 施例 5 ) 。 従って、 本発明によるタンパク質は、悪 ¾ ¾の形成および /または 転移の抑制に有用である。
従って、 本発明によれば、 本発明によるタンパク質と薬学上許容される担体と を含む悪 冶 «0カ《提供される。 なお、 本発明において治療とは予防を含む 意味で用いられるものとする。 ここで、 悪 ¾ ¾としては、 白 (例えば、 骨 髄性白 ΙΜ、 バーキッ ト（Burk i t t) リンホーマのようなリンパ性白細） 、 消化 器ガン、 肺ガン、 眸臓ガン、 卵巣ガン、子宮ガン、 脳 SSS、悪性黒 fe®、 カルシ ノーマ、 サルコ一マなどが挙げられる。
本発明による悪性腫瘍治療剤は、 また、経口または非経口投与 （例えば、 筋注、 静注、皮下投与、 iU¾投与、経皮投与、経鼻投与など） 、 好ましくは経口投与す ることができ、 薬剤として経口または非経口投与に適した種々の剤型で、 ヒトぉ よびヒト以外の動物に^ fflされる。
悪性腫癘治療剤は、 例えばその用途に応じて、 錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 散 剤、 丸剤、細粒剤、 トローチ錠などの経口剤、 静注および筋注などの注射剤、 直 腸投与剤、 油脂 ¾ ^剤、 水溶 tt^剤などのいずれかの 形態に調製することが できる。 これらの各種製剤は、 通常用いられている賦形剤、 増量剤、 結合剤、 湿 潤化剤、崩壊剤、 表面活性剤、 潤滑剤、 分 、緩衝剤、 保 、 溶解補助剤、 防腐剤、 矯味矯臭剤、 無痛ィ匕剤、 安定化剤などを用いて常法により製造すること ができる。 使用可能な無毒性の上記添加剤としては、 例えば乳糖、 果糖、 ブドウ 糖、 でん粉、 ゼラチン、 炭酸マグネシウム、 合成ゲイ酸マグネシウム、 タノレク、 ステアリン酸マグネシウム、 メチルセルロース、 カルボキシメチルセルロースま たはその塩、 アラビアゴム、 ポリエチレングリコール、 シロップ、 ワセリン、 グ リセリン、 ェタノ一ル、 プロピレングリコール、 クェン酸、 塩ィ匕ナトリウム、亜 硫酸ソーダ、 リン酸ナトリゥムなど力挙げられる。
薬剤中における本発明のタンパク質の含有量はその剤形に応じて異なる力 <通常 全組成物中約 0. 1〜約 50重量％、 好ましくは約 1〜約 20重量％離である。 悪性腫瘍の治療のために必要な投与量は、 用法、 患者の年齢、 k症状の程 度などを考慮して適宜決定されるが、 通常成人 1日当り約 0. 1〜約 500mg、 好ましくは約 0. 5〜約 5 Omggjgとするのがよく、 これを 1日 1回または数 回に分けて投与することができる。
本発明によれば、 本発明によるタンパク質をコードする塩基配列またはこれを 含むベクタ—を用いて標的細胞を形^換し、 悪 ¾M の形成および/または転 移を抑制することができる。 すなわち、 該塩基配列およびベクターは悪 ¾ 癌遗
&- mi (以下、 単に ntfe^治翻」 ということがある） として用いること ができる。 遺 治 の投与方法、 投与量、 および含んでいてもよい担体 等は悪 ¾ ¾治 のそれに準ずることができる。
本発明による遗 治 S^Wは、 HV Jリボソーム法 （金田， 実験医学， Vol.12 No.2, 78 (184), 1994および森下等， 実験医学， Vol.12 No.15 158 (1928), 1994) 、 本発明による塩基配列を注射等によってそのまま投与する方法、 リン酸カルシ ゥム法、 DE AE—デキストラン法、 エレクト口ポレーシヨン法、 itfe^銃によ る方法 (T. M. Klein et al., Bio/Technology 10, 286-291 (1992)) 、 リポフエ クシヨン法によって投与する方法 （Nabel et al. ： Science 244 , 1285, 1990) 、 適当なベクター （例えば、 アデノウイルスベクター、 アデノ関連ウィルスベクタ 一、ヘルぺスウィルスベクター、 ワクシニアウィルスベクター、 レトロウイルス ベクタ一等） を使う方法等によって、 ヒトを含むほ? やその他の動物に投与す ることができる。
本発明による遺伝子治療剤は、 局所的または一時的なアポトーシスの誘導の点 から、 A S K 1力生体内に一過的 （t r a n s i e n t ) に存在する様な態様で投与する ことが好ましい。 このような態様としては、 本発明による^配列を ¾tt等によ つてそのまま投与する方法、 リポフエクシヨン法、 H V J リボソーム法、 アデノ ウィルスベクターを用いた方法、 ワクシニアウィルスベクターを用いた方法のよ うな非経口投与力挙げられる。
本発明による別の面によれば、 本発明によるタンパク質、 配列またはべク ターの使用、 特に、 本発明による治 の製造における使用、 が提供される。 本発明による更に別の面によれば、 本発明によるタンパク質、 ^配列または べクタ一を投与することを含んでなる、 悪 ffi^に罹ったほ ¾ ^の治療法力《提供 される。 この場合の有効投与量、 投与方法、 および投与形態等は、 前記に準ずる ことができる。
ぺプチドおよび抗体
本発明によれば、 配列番号 1の 6 5 4〜6 6 9番のァミノ酸配列からなるぺプ チド、 および配列番号 1の 6 5 4〜6 6 9番のアミノ酸配列を含んでなるぺプチ ドが提供される。
配列番号 1の 6 5 4〜6 6 9番のァミノ酸配列を含んでなるぺプチドとしては、 該ァミノ酸配列の N末端および Zまたは C末端に任意のァミノ酸配列を 卩した ぺプチドが挙げられ、 これには本発明によるタンパク質も含まれる。
このべプチドは、 本発明によるタンパク質に対する抗体を得るための抗原とし て用いることができる。 また、 本発明によるタンパク質は、 前述のようにアポト 一シスの に密接に関与している。 従って、 本発明によるペプチドは、 これら の の解明等に有用である。
本発明によれば、 前記ペプチドに対する抗体が提供される。 本発明において、 抗体としては、 ポリクローナル抗体およびモノクロ一ナル抗体力《挙げられる。 本発明による抗体は、 当業界において通常用いられる方法によつて するこ とができる。 例えば、 前記ペプチドを、 任意の担体 （例えば、 ゥシ血清アルブミ ン） とともに動物体内 （例えば、 ゥサギ、 ャギ、 ラッ ト、 マウス、 ヒッジ） に注 射し、 一定期間の後に、 その動物の血清を精製することによってポリクローナル 抗体を得ることができる。 また、 モノクローナル抗体はハイプリ ドーマ融合技術 によって調製することができる。 例えば、 下記の文献を参照することができる ： (Kohler and Mi lstein, Nature, 256:495-97 (1975)； Brown et al. , J. Immunol. , 127 (2) :539-46 (1981)； Brown et al. , J. Biol. Chem. , 255:4980-83 (1980)； Yeh et al., Proc. Nat!. Acad. Sci. (USA), 76 (6) :2927-31 (1976)； and Yeh et al., Int. J. Cancer , 29:269-75 (1982))； Zola s t a 1. , in Monoclonal Hybridoma An t i bodi es :Te chn i ues And Ap lications, Hure 11 (ed. ) pp.51-52 (CRC Press (1982)) 。
本発明によるべプチドは、 本発明によるタンパク質のァミノ酸配列の一部であ る。 従って、 本発明による抗体の特異的な反応 （すなわち、 免疫 反応） は、 本発明によるタンパク質の存在の 1つの指標となる。
従って、 本発明のもう一つの面によれば、 本発明による抗体によって認識され るタンパク質、 および本発明による夕ンパク質であつて上記抗体によつて認識さ れるもの、 が提供される。
実 施 例
例 1 ポリメラーゼ》チヱーン · リアクション （PCR)法による ASK 1 c DN Aのク□—ニングと ASK 1のァミノ酸配列の決定
(1) cDNAの単離
P. ten Di jke et al. , Oncogene, 8, 2879 (1993) 、 P. Franzen et al. , Cel I, 75, 681 (1993) 、 および P. ten Dijke et aし, Science, 264, 101 (1994) に記載の方法に従って、 degenerate PCR-based strategy を用いて新規のセリ ン Zスレオニン ·キナーゼ c DN Aの取得を試みた。
その結果、受容体型セリン/スレオニン ·キナーゼのファミ リ一とともに、 よ り の機能不明のタンパク質キナーゼをコ一ドするヒト c DN Α断片力く幾つか 得られた。
まず、 セリンノスレオニン ·キナーゼ'ファミ リーの保存されたサブドメイン V I Iおよび V I I I (S. Hanks et aし, Science, 241, 42 (1988)) を由来と する P CRプライマーのセッ トを用いて P C R断片を得た。 これを用いて、 相当 するほとんど全長の c DNAクローンを単離した （以下、 この c DNAにコード されるセリンノスレオニン ·キナーゼを、 その特徴により、 t i V a t o r o f EK 1 a n d MKK 3 (A S K 1 ) と呼ぶ） 。
具体的には、 オリゴ （dT) を用いてプライムすることにより増幅した； I g t 1 1 ヒト赤白血病細胞 （HE L細胞） 由来 c DNAライブラリー （ Poncz et al. , Blood, 69, 219 (1987)) を ύ 2 P—標識 P C R断片でスクリーニングした。 ハイブリダィゼーシヨンおよび陽性のバクテリオファージの精製は H. lchijo et al. , I. Biol. Chem. , 268, 14505 (1993) に記載の方法に従って した。 塩 基配列の決定は、 シーケナーゼ DNAシーゲンシング ·キッ ト （U. S. Biochemi cal Corp. ) を用いて、 両方のストランドについて H½した。 得られた 1 8クロ —ンの中から、 最も長い 3つのクローン （クローン 20、 27および 72) につ いて完全に塩基配列を決定した。 クローン 72の配列は、 オープン · リーディ ン ゲ · フレームの中間付近から始まりポリ Aのストレッチまで伸長して終結してい た。 クローン 20および 27の配列は、 ASK 1 c DNAの 5' 末端部分を力 バーし、 クローン 72とオーバ一ラップする部分は配列がそれと完全に一致した。 クローン 20およびクローン 72を合わせることにより、 ASK 1 c DNA配 列が 4533 ^対の配列からなり、 268番目の塩基で始まる ATGコドンに 続いて 4125塩基対のオープン · リーディング ·フレームを含み、 このオーブ ン · リ一ディ ング ·フレームには 1375のァミノ酸からなるタンパク質がコ一 ドされ （図 1) 、 このタンパク質 （ASK1タンパク質） の推定 量は 154， 715 D aであることがわかった。
一方、 クローン 20の 375番目のアミノ酸に相当する部位からオープン · リ 一ディ ング ·フレーム力く始まるもうひとつのクローン （クローン 27) 力く得られ た。 クローン 27は、 ASK1 c DNAの 805〜808番目の 4： ^力く欠失 しているために、 イン ·フレームで上流にストップ ·コドン力《形成されていた。
ASK1のセリンノスレオニン ·キナーゼ領域は ASK 1タンパク質の中間に 見出され、 N末側と C末側に長いフランキング配列が存在していた （図 1) 。 ま た、 RNAブロッ ト解析を行った結果、 5キロ塩基の単一転写産物が、 様々なヒ ト糸!^に発現していることがわかった （図 3) 。 様々なヒト組織からの mRNA
(クロンテック社） を用いたブロッ トは、 ランダム ·ブライミングすることによ つて標識した ASK1 c DNAをプローブとして実施した。
(2) データ ·ベースによるホモロジ一検索
キナーゼ領域の外側の ASK 1配列を用いてデータ ·ベース ·サーチを し た結果、 N末端の短いアミノ酸配列に、 FK506結合タンパク質 （FKBP) 型のぺプチジル ·プロリル シス一トランス ·ィソメラーゼに見られるモチーフ が存在していた （図 1、 下線部分） 対照的に、 ASK 1のキナーゼ領域には、 MAPKKKファミリーのメンバーのキナーゼ領域と明らかな配列のホモロジ一 が認められた。 そのホモロジ一の程度は、 哺? Hの MEKK1とは 30. 0%、 出芽酵母 （Saccharomyces cerevisiae) の S SK2および STE 11とはそれぞ れ 32. 3%および 30. 4%であった。
系 ¾ϋ化学的な比較を行なったところ、 ASK1は、 哺? の MAPKKK JP
20
(RAF— 1、 KSR— 1、 TAK— 1および TPL— 2) とかなり舰のタン パク質である力く、 酵母の MAP KKKタンパク質であり酵母の HOG 1 MAP K (T. aeda et al., Science, 269, 554 (1995)) の上流の調節タンパク質であ る S SK2ZS SK22ファミリーに最も類縁性が高いことがわかった （図 2)。
AS K 1のキナーゼ領域と他の MAP KKKのキナーゼ領域との間のァミノ酸 配列比較はレーザ一ジーン ·プログラム （DN A STAR社） のクラスタル
(clustal ) ·コンピュータ ·アラインメント ·プログラム （D. Higgins & P. Sharp, Comput. Appl. Biosci. , 5, 151 (1989) ) を用いて した。
例 2 酵母を用いた A S K 1キナーゼ活性の分子遺伝学的な解析
ASK1と酵母 MAPKKKである S SK2ZS SK22では、 全体的な構造 に差異 （即ち、 S SK2や S SK22のキナーゼ領域はこれらのタンパク質の最 も C末端部分に位置する (T. Maeda et aし Science, 269, 554 (1995) ) があ る。 しかしながら、 前述のように ASK1は S SK2/S SK22と類縁性か いことから、 A SK1力《酵母でキナーゼとして機能し、 それによつて酵母の MA PKK Kの欠損を相補するという可肯 があると考え、 これについて検討した。 まず、 ASK 1をコードする cDNAを酵母発現ベクター pNVl 1
(H. Shibuya et ai., Nature, 357, 700 (1992)) 中に導入し、 通常の Y P D培 地では生育できる力 <高^圧培地では生育できない酵母変異株 TM257 -H1 (s s k 2 Δ s s k22厶 s h o 1厶） （T. Maeda et al. , Science, 269, 554 (1995) ) において、 ASK1力く、 S SK2または S SK22 MAPKK Kのシグナルの欠損を回復させることができるかどうかにつ 、て検討した。 因み に、 SH01は、 SH 3領域を含む膜貫通浸透圧センサーであり、 S SK2/S S K 22とは 的に、 H 0 G 1活性化を介して高浸透圧に対する種々の応答を 導くもうひとつのシグナル経路に関係している。 SH01、 S SK2または S S K22に単一の変異もしくは 2つの変異を有する変異株は高浸透圧培地に抵抗性 を示す。 しかしながら、 SH01、 S SK2および S SK22を同時に破壊する と、 高浸 ¾Ε培地で酵母が生育できなくなることがわかっている。
そこで、 形質転換体が 1. 5Mのソルビトール存在下で生育できるかどうかに ついて試験した （図 4) 。 具体的には、 5つの した形 換体を選択し、 1. 5M ソルビトール存在下または^??在下で YPDプレート上で生育させた。 図 4は、 6日間、 30°Cで生育させた後にプレートを した写真である。
pNVl 1ベクター単独または ASK1 (K709R) (Ly s 709を A r gに置換することによつてキナーゼ)^活性を不活性化した変異 A S K 1 ) べク ターを用いて形 換して得た形 Mfe換体も同時にテストした。
その結果、 ASK1を発現させると、 TM257— HIが高浸透圧環境で生育 できるようになった力く、 ベクターだけを発現させた場合や ASK 1 (K709R) を発現させた場合には、 TM257— HIが高浸透圧環境で生育できるようにな らなかった （図 4) 。 ASK1は PBS 2 (SH〇1、 S SK2および S SK2 2の下流の標的タンパク質 （Maeda, T. et aし， Science 269, 554 (1995) ) が 変異した酵母株では浸透圧応答を相補できなかった （デ一夕省略） 。 このことよ り、 TM257— H 1で観察された ASK 1活性は P B S— HOG 1シグナル経 路によってメディエー卜される力く、 HOG1活性化以外の別の経路によってはメ ディエートされないことが強く示唆された。
これらの結果と、 酵母の HOG 1に相当する哺？ カウンターパー卜が ρ 38
MAPキナーゼであるという事実 (J. Rouse et al., Cell, ?8, 1027 (1994)； J. Han et al. , Science, 265, 808 (1994)； J. Lee et al. , Nature 372, 739 (1994)) とによって、 A SKIは新規の哺？ ΙϋΜ A PKKKであって、 MKK3をリン酸 化することにより MKK3— p 38のシグナル 路の活性化にかかわつてい ることが示唆された。
例 3 哺乳類細胞を用いた A S K 1キナーゼ活性の細胞生物学的な解析 ASK1が哺? IJ^の細胞で M A P K K Kとして機能するかどうかを検討するた めに、 ASK 1プラスミ ドを gE¾の MAP Kおよび MAP KK発現プラスミ ドと ともに、 COS 7細胞にトランスフエクシヨンした （図 5)。 MAPKおよび M APKKのコンストラクトには全てへマグルチニン （HA) —ェピトープ一タグ を付加し、 これらを ASK1とともに、 または ASK 1なしに発現させ、 抗 HA 抗体を用いて^ E沈降した。 具体的には、 下記に記載した方法に従って!^した。 アフリカッメガエル （Xenopus ) の MAPK (Y. Gotoh et al. , EMBO J., 10 , 2661 (1991) ) およびアフリカッメガエル MAP KK (H. osako et al. , EM BO I., 12, 787 (1993) ) の cDNAは、 過去に記載の方法に従ってクローニン グした。 ラッ ト SAPKa ( J. Kyriakis et al. , Nature, 369, 156 (1994)) 、 ヒト P 38 (J. Han et al., Biochim. Biophys. Acta. 1265, 224 (1995) ) 、 マウス SEK1 (I. Sanchez et al. , Nature, 372, 794 (1994)) およびヒト M KK3 (B. Derijard et al., Science, 267, 682 (1995) ) のコーディング領域 は P CR法によって増幅した。 HA—タグを哺¾^用発現ベクター p SRa 45 6 (Y. Takebe et aし， Mol. Cell. Biol., 8, 466 (1988) ) の B g 1 I I— E c oR I部位中に導入することによって、 p SRな一 HA1を構築した。 MAP K、 S ΑΡΚ ρ 38、 ΜΑΡΚΚ、 S EK1、 および ΜΚΚ 3の c DN Αを、 p SRa— HA1の B g l I I部位中にサブクローニングした。 ASK1 c D N Aは別の哺 用発現べクタ一 p c D N A 3 (インビトロジェン社） 中に導入 した。 一過的に発現させるために、 COS 7細胞を製造業者 （ライフ ·テクノロ ジ一社） の使用説明害に従って、 リボフェク トアミンを用いてトランスフエク ト した。 抽出液を調製するために、 バッファー離 (2 OmM T r i s -HC 1 (p H 7. 5) 、 12mM ーグリセ口ホスフヱー卜、 150mM N a C 1 5mM EGTA、 10mM Na F、 l% T r i t o n X— 100、 0. 5% デォキシコレート、 3mM ジチオスレィ トール （DTT：) 、 ImM バナジン酸ナトリウム、 lmM フエ二ルメチルスルホニル ·フルオライド (PMSF) 、 20 gXm l ァプロチニン） 中で細胞をリシスした。 細胞抽 出液を 15, 000 X gで 10分間遠心分離して懸濁を除いた。
免疫沈降を行なうために、 上清を抗 H Aモノクローナル抗体 （12CA5) と ともに、 1時間、 4°Cでインキュベートした。 プロテイン A—セファロース （フ アルマシア ·バイオテク社） を添加した後、 ライゼートをさらに 1時間インキュ ペートした。 ビーズを、 溶液 （50 OmM N a C 2 OmM Tr i s— H C I (pH7. 5) . 5mM EGTA. 1% トリ トン X - 100、 2 mM DTT、 ImM PMS F) を用いて 2回洗浄した後、 溶液 （15 OmM N a C 2 OmM T r i s - HC 1 (pH 7. 5) 、 5mM EGTA、 2mM
DTT、 ImM PMS F) を用いてさらに 2回洗浄した後、 キナーゼ.アツ セィにかけた。
沈降させた免疫複合体をリン酸化アツセィにかけた。 アツセィに際しては、 基 質タンパク質を外から加えた。 ここで用いた基質タンパク質は、 MAPKに対し てはミエリン塩基性タンパク質 （MB P) (シグマ社） 、 SAPKに対しては c — J un、 p 38に対しては ATF— 2、 MA P KKに対してはキナーゼ ·ネガ ティブ MAPK、 SEK1および MKK3に対してはキナーゼ ·ネガティブ p 3 8 (MPK2) とした。 ここで用いた AT F 2は過去に記載の方法 （S. Gupta et al., Science 267, 389-393 (1995)) に従って調製した。 へキサヒスチジン （H i s) 一タグを融合した c一 J u n (S. atsuda et al. , J. Biol. Checi. , 210, 12181
(1995)) およびグル夕チオン一 S—トランスフェラーゼ （GST) を融合したキ ナ一ゼ*ネガティブのアフリカッメガエル MAP K (K57D) は H. Kosako et al., EMB0 し 12, 787 (1993)に記載の方法に従って調製した。 ヒ卜 p 38に対す るアフリカッメガエルのカウンターパートである MPK2 ( J. Rouse et al. , Cell, 1 1027 (1994) ) は、 S E K 1および MKK 3の基質タンパク質として アツセィに使用した。
H i s—タグと融合したキナーゼ.ネガティブの MPK 2 (K54R) は T. Moriguchi et al. , J. Biol. Chem. , 270， 12969 (1995) に記載の方法に従って 調製した。 MBP、 c一 J un、 ATF2、 キナーゼ ·ネガティブ MA P Kおよ びキナーゼ ·ネガティブ MP Κ 2をリン酸化する活性を測定するために、 免疫複 合体を、 それぞれの基質タンパク質 （各 3/ g) とともに、 最終量 25 1の溶 液 （20mM T r i s -HC 1 (pH7. 5) 、 1 OmM MgC l 0、 100 iM [ァ一 3 Ρ] ATP (0. i) ) 中で 30分間、 30。Cでィ ンキュペートした。 反応は、 LaemniH' s サンプル ·バッファーの添加後、 煮沸す ることによって停止した。 SDS—ポリアクリルアミ ド電気 (PAGE) を 行なった後、 これらのタンパク質のリン酸化をイメージ ·アナライザー （Fu j i X B AS 2000) を用いて^ *した。
その結果、 ASK 1の発現によって、 SAPKおよび p 38 MAPキナーゼ はそれぞれ 7. 6倍および 5. 0倍活性化された。 MAPKでは極めて弱い活性 化しか観察されなかった （図 5)。
また、 A SK 1によって、 MKK 3および S EK 1はそれぞれ 11. 8倍およ び 7. 0倍まで活性化された。 これに対して MAP KKの活性化は全く検出され なかった （図 5) 。
H½例 4 インビト口での組換えタンパク質を用いた力ップル ·キナーゼ ·ァ ッセィ
図 5で! ^された MK K 3の活性化が A SK による直接的な効果かどうかを 検討するため、 組換え SEK1、 MKK 3、 MA PKK 6および組換えキナーゼ •ネガティヴ ρ 38 (ΜΡΚ2) タンパク質を用いてインビトロ ·キナーゼ*ァ ッセィを した。 本¾½例では、 実施例 3に記載の方法に準じて、 COS 7細 胞中に発現させた A SKIを抗 A S K 1ポリクローナル抗体を用いて免疫沈降さ せ、 免疫複合体を ASK lg^標品とした。 免疫沈降に用いた抗 ASK 1ポリク ローナル血清は、 A S K 1のアミノ酸 6 5 4〜66 9に相当するべプチド配列
(TEEKGRSTEEGDCE SD) に対するもので、 H. Ichijo et al., ].
Biol. Chem. , 270, 7420 (1995)に記載の方法に従って、 グルタルアルデヒド法 を^ ヽて Keyho I e limpet hemocy an i n とカップノレさせ、 Freund' s adjuvant と混 合し、 ゥサギを免疫して作製したものである。 この免疫複合体とともに、 組換え 型 S EK1、 MKK3、 MAPKK6と組換え型キナーゼ*ネガティブ ρ 38夕 ンパク質を用いて、 下記に記載する方法に従って、 カップル 'キナーゼ 'アツセ ィを H½した。
Y. Gotoh et a!. , Oncogene, 9, 1891 (1994) に記載の方法に従って、 H i s -夕グを付カロしたアフリカッメガエル M APKKおよびヒト MKK3を: «菌で 発現し、 精製した。 免疫複合体が M APKKまたは MKK 3を活性化する活性を 測定するために、 まず 0. 2 β gの H i s一 MAPKKまたは H i s -MKK3 を免疫複合体とともに、最終量 25 α 1の溶液 （20mM T r i s— HC 1 (pH7. 5) 、 1 OmM MgC 1 2. 100 ATP) 中で 15分間、 30°Cでインキュベートした。 次いで、 0. 3 C iの [7— 3 2 P] ATPお よび 3 gの GST-キナーゼ ·ネガティブ MAP K (MAPKKに対して） ま たは H i s—キナーゼ ·ネガティブ MPK2 (MKK3に対して） を同一のバッ ファー （最終量、 35 1) 中で 7分間、 25°Cでインキュベートした。 その後、 サンプルを S D S— PAGEにかけ、 イメージ ·アナライザーで解析した。 結果 は図 6に示される通りであった。
C O S 7細胞からの A S K 1の免疫沈降物は、 S E K 1、 MKK 3および MA PKK6活性を強く （それぞれ 40倍以上） 活性化し、 八3 1がキナーゼ'ァ ッセィに存在しているときにのみ P 38のリン酸化が観察された。 さらに野^ P 38および AT F 2を用いることによって ASK 1依存的な p 38のリン酸化 力く、 P 38の活性化を誘導することを確認した。 対照的に、 MAPKKについて は、 MAPKK力く存在していても弱い活性ィ匕 （2. 2倍） 力観察されただけであ つた o
一方、 Ra f を MAPKKKとしてポジティブ ·コントロールに用いた場合に は、 27. 8倍の MAP KKの活性化が観察された （データ省略） 。 以上の結果
(¾拖例 4) および実施例 3の結果より、 ASK1は新規の MAPKKKであり、 S EK1— S APK経路および MKK 3ZMAPKK6— p 38径路を選択的に 活性化することが示された。
例 5 ASK1発現によるアポトーシスの誘導
(1) ASKの発現の確認
メタロチォネィン ·プロモーターをベースとした発現プラスミ ドを安定的にト ランスフエク 卜したミンク肺上皮細胞株 （Mv l Lu) を用いることによって、 ASK1の生物活性を検討した。 構成的に発現した A S K 1力く細胞死を誘導し、 結果として安定な形 sii換体の取得に失敗するという可 を排除するために、 メタロチォネィン誘導性プロモーター ·システムを用いた。
まず、 ASK1および ASK1 (K709R) c DN Aを pME P 4ベクター
(インビトロジェン社） 中の制限！^切断部位にサブクローニングした。 cDN Aのトランスフエクションは、 トランスフエク夕ム （プロメガ社） を用いて、 製 造業者の使用説明害に従つて^した。 ハイグロマイシン Bによる選択は、 M. Saitoh et aし J. Biol. Chem. , 271, 2769 (1996)に記載の方法に従って実 施した。 したクローンを幾つかリング ·クローニングし、 ASK 1タンパク 質の発現を抗 ASK 1血清を用いた免疫沈降 （H. lchijo et al., J. Biol.
Chem., 258, 14505 (1993) ) によって決定した。 した陽性のクローン 2つ を下記に記載のァッセィに用いたが、 どちらのクローンを用いても結果は本質的 に同じであった。 [35 S] メチォニンおよび [ύ ϋ S] システィン混合液を用いて、 100 M ZnC 12存在下または非存在下で 5時間、 細胞を代謝標識した。 次いで、 細胞のライゼ一トを特異的な抗 ASK 1抗血清を用いた免疫沈降にかけ、 その後 SDS— PAGEおよびフルォログラフィ一を用いた解析を行なつた。
結果は図 7に示した通りであった。 即ち、 ZnC 12によって誘導したときに のみ、 A SK1が強く発現することがわかった。 ASK1 (K709R) をトラ ンスフヱクシヨンした細胞も同じ の組換え型タンパク質を発現していること がわかった。
(2) チミジンの取り込みへの効果
ASK1が細胞増殖に何らかの効果を示すかどうかを検討するために、 ベクタ 一単独 （図 8、 黒四角） 、 ASK1 (図 8、 黒丸） および ASK 1 (K 709 R) (図 8、 白丸） を用いて安定的にトランスフヱク トした Mv lLu細胞を、 1% ゥシ胎] ¾Jfil清 (FB S) と図示した濉の Z n C 12を含む M E M培地中で 16時間インキュベートした。 その後、細胞を [3H] チミジンを用いて 1時間 パルスラベルし、 DNA中に取り込まれた [3H]放 it活性を液体シンチレ一 シヨン ·カウンターによって測定した。 結果は図 8に示される通りであった。
ASK1をトランスフヱク卜した細胞では [3H] チミジンの取り込みの劇的 な抑制が観察された。 これに対して、 ベクターのみをトランスフヱクトした細胞 や ASK1 (K709 R) ベクタ一でトランスフエクトした細胞では、 [3H] チミジンの取り込みの抑制は!^されなかった （図 8)。
ZnC 12による用量依存的な [：。 H] チミジンの取り込みの抑制と、 ASK 1の用量依存的な発現と活性化との相関性について検討した。 A S K 1をトラン スフェク 卜した MvlL u細胞を、 様々な量の Z n C 12で 5時間処理した後、 免疫沈降によって ASK1の発現レベルを決定した （図 9上段） 。 また、 細胞を 様々な量の Z n C 12で 5時間処理し、免疫沈降によつて A S K 1を細胞から回 収した後、 MKK3—MPK2カップル ·キナーゼ*アツセィにかけた （図 9下） 。 その結果、 Z nC 1 2による用量依存的な [3H] チミジンの取り込みの抑制 は、 A SK1の用量依存的な発現と活性化によく相関していた （図 9) 。
(3) SAPKおよび p 38のキナーゼ活性の 進への効果
次に、 ASK1活性と内在性の SAPKおよび p 38の活性化との相関性を検 討するために下記の実験を実施した。
ASK 1を安定的にトランスフエクトした Mv 1 L u細胞を、 図示した ¾gの ZnC 1 2と 5時間インキュベートした。 S APKの活性を測定するために、 S. Matsuda et al. , J. Biol. Chem. , 270, 12781 (1995)に記載の方法に従って、 各々の細胞抽出液を c- J unを基質タンパク質として含むポリアクリルアミ ド ゲル内でのキナーゼ検出アツセィ （イン—ゲルキナーゼ ·アツセィ） にかけた。
P 38の活性を検出するために、 抗 p 38ポリクローナル抗体 （C— 20、 サン 夕 ·クルーズ社） を用いて、 0. 1%SDS存在下で免疫沈降を した以外は ¾6S例 3に記載の方法に準じて、 免疫沈降した。 その後、 ATF2を基質タンパ ク質として用いてキナーゼ活性を検出した。 結果は図 10に示される通りであつ た。
内在性の SAP Kおよび p 38も、 A S K 1活性と相関して活性化されている ことがわかった。
(4) 細胞の形態変化および DN Aの断片ィヒへの効果
さらに、 100 M ZnC 1 2によって細胞を処理し、 AS K1を継続的に 発現させたところ、 ZnC 1 9添加後 6時間以内に形態変化 （すなわち、
cytoplasmic shrinkage および cellular condensation ) が誘 ¾されることがわ かった （データ省略） 。 このような形態変化は、 ASK1 (K709) を発現さ せた細胞では！ ^されなかった。 細胞を、 100 M ZnC 1 2の存在下また は^ 在下で、 1%FBSを含む MEMと 26時間インキュベートした。 アポト 一シスを起こしている細胞に典型的な特徴である cytoplasmic shrinkage および cellular condensation 力く、長時間誘導 （26時間） の後、 最も著しくなつた (図 1 1上段） 。
ASK1によってアポトーシスによる細胞死が誘導されるかどうかにつ I*、て、 ターミナル ·デォキシヌクレオチジル · トランスフヱラーゼーメディエーティッ ド dUTPニック ·エンド ·ラベリング （TUNE L) 法によって細胞を i n s i t u染色することにより （図 1 1下段） 、 およびゲノミック DN A断片化 により検討した。 具体的には、 A SK 1をトランスフエク卜した Mv l L u細胞 を 1 00 //M Z n C 1 2存在下または非存在下で、 F B Sを含まない MEM培 地中で 25時間培養した。 その後、 i n s i t u細胞死検出キット （ベーリン ガー ·マンハイム社） を用いて TUNE L法で染色 （図 1 1下段） 、 あるいはト 一タル DNAを単離し、 2%ァガロースゲル電気泳導にかけた （図 12) 。 その 結果、 Z n C 1 2による A SK 1発現の誘導後に、 アポトーシスおよび DNA断 片化が観察された （図 1 1下段および図 12) 。
麯例 6 TNFaによる A S K 1の活性化
本 H¾例では、 TNFなで細胞を処理することによって、 AS K 1力、'活性化さ れるかどうかを検討した。 A SK 1をトランスフヱク卜した Mv l L u細胞を、 50 Μ Z nC 1 2で 5時間前処理し、 ASK 1発現を誘導した。 その後、 1 00 n g/m lの TNF aで様々な時間細胞を刺激した。 T N F crで処理した 細胞由来の ASK 1免疫沈降物を、 MKK3およびキナーゼ'ネガティブ p 38 を用いたカップル ·キナーゼ*アツセィにかけた （図 1 3上段および下段および 図 14) 。
その結果、 TNF aは、 ASK— 1をトランスフヱクトした Mv I L u細胞に おいて刺激後 5分以内に ASK l活性を活性化した （図 1 3上段および下段） 。 TNF aによる ASK 1活性化は用量依存的な様式で観察された （図 14 ) 。 次に、 A SK 1をトランスフエク トしていない 293細胞および A 673細胞 を 100 n g m 1の TN F— αで処理した。 その結果、 TNF— αによってァ ポトーシスが誘導されること力く知られている （データ省略） 様々なタイプの細胞、 即ちヒト 293胎児1 g臓細胞、 A673ラブドミオサルコ一マ (
rhabdomyosarcoma) 細胞 （図 13下段） 、 Jurkat T細胞および K B上皮性カルシ ノーマ細胞 （データ省略） において、 内在性の ASK1もまた TNF— αによつ て活性化された。
さらに、 ASK1 (K709R) を一過性に 293細胞 （図 15) あるいは Ju rkat T細胞 （図 16) にトランスフヱク 卜させた。 具体的には下記に記載の方法 に従って実験を！^した。 293細胞 （2 X 10 D) を、 2 β gの p cDNA3 コントロール ·ベクターまたは p CDNA3— A SKI (K 709 R) で、 T f x— 50 (Promega 社） を用いて製造業者のプロトコールに従って一過性にトラ ンスフェク トさせた。 卜ランスフエクシヨンの 8時間後より、 細胞を TNF-a (100 n g/m 1 ) で、 300 nMのァクチノマイシン D (ActD) の存在下ま たは非存在下で、 16時間処理した。 培養プレートより遊離したアポトーシスを 起こした細胞を回収し、 トータル DNAを単離し、 2%ァガロース 'ゲル電気泳 動によって解析した （図 15) 。
また、 p cDNA3— ASK1 (K 709 R) を Jurkat細胞に、 DMR I E— C リエージェント （Life Technologies 社） によって、 pHo o k— 1プラス ミ ド （lnvi ogeii社） とともにトランスフヱク 卜した。 因みに、 pHo o k— 1 プラスミ ドには、 ノヽプテン h 0 X (4-e thoxyme thy I ene-2-plieny I -2-oiazo I in -5 - one) に対する単鎖抗体融合タンパク質がコードされている。 従って、 P h0 Xをコートした磁石ビーズを用いることによって、 トランスフエク 卜された細胞 を選択的に単離すること力河能である。
ASK1 (K 709 R) をトランスフエク トした細胞のポピュレーション （ 3 一ガラク トシダーゼ染色によって測定したコトランスフエクシヨンの効率はほと んど 100 %であった） を、 ρ h Oxをコートした磁石ビーズによって、 Capture- Tec kit (liivitrogen社） を用いて単離した後、 細胞を様々な の T N F— α とともに 5. 5時間培養した。 細胞質の小さく断片化した DN Αを、 過去に記載 の方法 （Selins, . & Cohen, J., J. Immunol. 139, 3199 (1987)) を若干改良 した方法によって単離した。 3 x 106細胞を 200 ^ 1の緩衝溶液 (2 OmM
T r i s— HC 1 (pH7. 5) , 1 OmM EDTA, 0. 5% T r i t o n X— 100) でリシスした。 得られたライゼートを、 0. 2mgノ mlの プロティナーゼ Kと 0. lmgZmlの RNa s e Nとともに、 42てで1時 間インキュベートした。 その後、 DN Aをエタノール抽出後にフエノール Zクロ 口ホルム抽出によって精製した。 抽出した細胞質 DN Aを 2%ァガロース ·ゲル 電気 によって解析した （図 16)。
その結果、 TNF— αによる DNA断片化は効率的に減少した。 尚、 DNA断 片化アツセィにおいて、 トランスフエクトされていない jinkat細胞および単離し た Jurkat細胞 （pHo 0 k— 1および対照の p cDNA3プラスミ ドでトランス フヱク 卜したもの） は同様に TNF— αに感受性であった （データ省略）。 この ことより、 ASK 1 (K709R) 力くドミナント ·ネガティブ変異体として機能 することが示唆されたとともに、 より重要な事には、 TNF— αによって誘導さ れるアポトーシスに ASK1が必須であることが示唆された。
配 列 表
配列番号： 1
配列の長さ ： 1375
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源：
生物名： ヒト
配列
Met Ser Thr Glu Ala Asp Glu Gly He Thr Phe Ser Val Pro Pro P
1 5 10 15
Ala Pro Ser Gly Phe Cys Thr lie Pro Glu Gly G!y lie Cys Arg Arg
20 25 30
Gly Gly Ala Ala Ala Val Gly Glu Giy Glu Glu His Gin Leu Pro Pro
35 40 45
Pro Pro Pro Gly Ser Phe Trp Asn Val Glu Ser Ala Ala Ala Pro Gly
50 55 60
He Gly Cys Pro Ala Ala Thr Ser Ser Ser Ser Ala Thr Arg Gly Arg 65 70 15 80
Gly Ser Ser Val Gly Giy Gly Ser Arg Arg Thr Thr Val Ala Tyr Val
85 90 95 lie Asn Glu Ala Ser Gin Gly Gin Leu Hi Val Ala Glu Ser Giu Ala
100 105 110 し eu Gin Ser Leu Arg Glu Ala Cys Glu Thr Val Gly Ala Thr Leu Glu ui su ou 50ε
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S2S 02S SIS
SP£lOIL6d£/IDd £WOt 6 OAV Pro Leu His Glu Glu lie Ala Leu His Lys His Leu Lys His Lys Asn
725 730 T35 lie Val Gin Tyr Leu Gly Ser Phe Ser Glu Asn G!y Phe lie Lys lie
140 T45 750
Phe Met Glu Gin Val Pro G!y Gly Ser Leu Tyr Ala Leu Leu Arg Ser
?55 760 765
Lys Trp G I y Pro Leu Lys Asp Asn Glu Gin Thr lie Gly Phe Tyr Thr
Π0 775 780
Lys Gin 11 e Leu Glu Gly Leu Lys Tyr Leu His Asp Asn Gin lie Val 785 790 795 800
His Arg Asp 11 e Lys G 1 y Asp Asn Val Leu I！ e Asn Thr Tyr Ser Gly
805 810 815
Val Leu Lys lie Ser Asp Phe Gly Thr Ser Lys Arg Leu Ala Gly He
820 825 830
Asn Pro Cys Thr Glu Thr Phe Thr Gly Thr Leu Gin Tyr Met Ala Pro
835 840 845
Glu lie He Asp Lys Gly Pro Arg Gly Tyr Gly Lys Ala Ala Asp He
850 855 860
Trp Ser Leu Gly Cys Thr He He Glu Met Ala Thr Gly Lys Pro Pro 865 870 875 880
Phe Tyr Glu Leu Gly Glu Pro Gin Ala Ala Met Phe Lys Val Gly Met
885 890 895
Phe Lys Val His Pro Glu lie Pro Glu Ser Met Ser Ala Glu Ala Lys
900 905 910
Ala Phe He Leu Lys Cys Phe Glu Pro Asp Pro Asp Lys Arg Ala Cys ΟΠΙ sin οιπ son m dsv mo siq iis si] n3 Jijj, m γ 91 ί I siq
ΟΟΠ S60I 0601
2】v dsv m 3JV 1ΒΛ m "193jV nsq 〗35 »! I j i jqi
S80I 0801 SiOI l s!H nig <h丄 s n s nig n| B|V ^10 "ID V "^l "S
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S26 026 SI6
L S Asp Ser His Gly He Ser Gin Val Gin Val Val Leu P e Gly Phe Gin
1125 1130 1135
Asp Ala Va i Asn Lys Val Leu Arg Asn His Asn lie Lys Pro His Trp
1140 1145 1150
Met Phe Ala Leu Asp Ser He lie Arg Lys Ala Val Gin Thr Ala He
1155 1160 1165
Thr He Leu Val Pro Glu Leu Arg Pro His Phe Ser Leu Ala Ser Glu
1170 11T5 1180
Ser Asp Thr Ala Asp Gin Glu Asp Leu Asp Val Glu Asp As His Glu 1185 1190 1195 1200
Glu Gin Pro Ser Asn Gin Thr Val Arg Arg Pro Gin A!a Val lie Glu
1205 1210 1215
Asp Ala Ya! Ala Thr Ser Gly Yal Ser Thr Leu Ser Ser Thr Val Ser
1220 1225 1230
His Asp Ser G Ser Ala His Arg Ser Leu Asn Ya I Gin Leu Gly Arg
1235 1240 1245
Met Lys lie Glu Thr Asn Arg Leu Leu Glu Glu Lcu Val Arg Lys Glu
1250 1255 1260
Lys Glu Leu Gin Ala Leu Leu His Arg Ala lie Glu Glu Lys Asp Gin 1265 1270 12T5 1280
Glu 11 e Lys Hi s Leu Lys Leu Lys Se「 Gin Pro i I e Glu lie Pro Glu
1285 1290 1295
Leu Pro Val Phe His Leu Asn Ser Ser Gly Thr Asn lie Glu Asp Ser
1300 1305 1310
Glu Leu Thr Asp Trp Leu Arg Val Asn Gly Ala Asp Glu Asp Thr He 1315 1320 1325
Ser Ar Phe Leu Al Glu Asp Tyr T r Leu Leu Asp Va 1 Leu Tyr Ty r
1330 1335 1340
Va 1 Thr Arg Asp Asp Leu Lys Cys Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Leu
1345 1350 1355 1360
Cys Thr Leu Trp Lys Ala He He Asp Phe Arg Asn Lys G!n Thr
1365 1370 1375 配列番号： 2
配列の長さ ： 4533
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： :DNA
起源：
生物名： ヒト
配列
ACCCGGCTTC CCCACCCCTT GTACTCTAAA CTCTGCAGAG GGCGAGCGTG CGGCCACGGA 60 GGCGCCGAGG AGGAGCGAGC GCCGCCGGGC AGCGGCGTGC CCTCGGGGGA GAGGGCCCCG 120 GAGAGGAGGC GGCGGCGCGG CGGCGAGGGC GCGGCGCGCG ATGGCAGCTG CTTAGCCCGG 180 CGGGCGCGGA GCAGCCCCGA GCTGTGGCTG GCCAGGCGGT GCGGCTGGGC GGGGGACGCC 240 GCCGCCGTTG CTGCCCGGCC CGGAGAG ATG AGC ACG GAG GCG GAC GAG GGC ATC 294
Met Ser Thr Giu Ala Asp Glu Gly He
1 5
ACT TTC TCT GTG CCA CCC TTC GCC CCC TCG GGC TTC TGC ACC ATC CCC 342 Thr Phe Ser Val Pro Pro Phe Ala Pro Ser Gly Phe Cys T r Me Pro
10 15 20 25
GAG GGC GGC ATC TGC AGG AGG GGA GGA CCG GCG GCG GTG GGC GAG GGC 390
Glu Gly Gly He Cys Arg Arg Gly Gly Ala Ala A Val Gly Glu Gly
30 35 40
GAG GAG CAC CAG CTG CCA CCG CCG CCG CCG GGC AGT TTC TGG AAC GTG 438
Glu Glu His Gin Leu Pro Pro Pro Pro Pro Gly Ser Phe Trp Asn Val
45 50 55
GAG AGC GCC GCT GCC CCT GGC ATC GGT TGT CCG GCG GCC ACC TCC TCG 486
Glu Ser Ala Ala Ala Pro Gly lie Gly Cys Pro Ala Ala Thr Ser Ser
60 65 70
AGC AGT GCC ACC CGA GGC CGG GGC AGC TCT GTT GGC GGG GGC AGC CGA 534
Ser Ser Ala Thi Arg Gly Arg Gly Ser Ser Val Gly G!y Gly Ser Arg
T5 80 85
CGG ACC ACG GTG GCA TAT GTG ATC AAC GAA GCG AGC CAA GGG CAA CTG 582
Arg Thr Thr Val Ala Tyr Val lie Asn Glu Ala Ser Gin Gly Gin Leu
90 95 100 105
GTG GTG GCC GAG AGC GAG GCC CTG CAG AGC TTG CGG CAG GCG TGC GAG 630
Val Val AU Glu Ser G Ala Leu Gin Ser Leu Atg Glu Ala Cys Glu
110 115 120
ACA CTG GGC GCC ACC CTG GAA ACC CTG CAT TTT GGG AAA CTC GAC TTT 678
Thr Val Gly Ala Thr Lea Giu Thr Leu His Phe Gly Lys Leu Asp Phe
125 130 135
GGA GAA ACC ACC GTG CTG GAC CGC TTT TAC GCA GAT ATT GCG GTG 126
Gly Glu Thr Thr Val Leu Asp Arg Phe Tyr Asn Ala Asp He Ala Val —3
—3 3
AAA GCT CGT AAT TTA TAC ACT GGT AAA GAA TTG GCA GCT GAG TTG GCA 1158
Lys Ala Arg Asn Leu Tyr Thr Gly Lys Glu Leu Ala Ala Glu Leu Ala
285 290 295
AGA ATT CGG CAG CGA GTA GAT AAT ATC GAA GTC TTG ACA GCA GAT ATT 1206
Arg lie Arg Gin Arg Val Asp Asn lie Glu Val Leu Thr Ala Asp He
300 305 310
GTC ATA AAT CTG TTA CTT TCC TAC AGA GAT ATC CAG GAC TAT GAT TCT 1254
Val 11 e Asn Leu Leu Leu Ser Tyr Arg Asp 11 e Gin Asp Tyr Asp Ser
315 320 325
ATT GTG AAG CTG GTA GAG ACT TTA GAA AAA CTG CCA ACC TTT GAT TTG 1302 lie Val L" Leu Val G I u Thr Leu Glu Lys Leu Pro Thr Phe Asp Leu
330 335 340 345
GCC TCC CAT CAC CAT GTG AAG TTT CAT TAT GCA TTT GCA CTG AAT AGG 1350
Ala Ser His His His Val Lys Phe His Tyr Ala Phe Ala Leu Asn Arg
350 355 360
AGA AAT CTC CCT GGT GAC AGA GCA AAA GCT CTT GAT ATT ATG ATT CCC 1398
Arg Asn Leu Pro Gly Asp Arg Ala Lys Ala Leu Asp lie Met 11 e Pro
365 3T0 375
ATG GTG CAA AGC GAA GGA CAA GTT GCT TCA GAT ATG TAT TGC CTA GTT 1446
Met Val Gin Ser Glu Gly Gin Val Ala Ser Asp Met Tyr Cys Leu Val
380 385 390
GGT CGA ATC TAC AAA GAT ATG TTT TTG GAC TCT AAT TTC ACG GAC ACT 1494
Gly Ar 【le Tyr Lys Asp Met Phe Leu Asp Ser Asn Phe Thr Asp Thr
395 400 405
GAA AGC AGA GAC CAT GGA GCT TCT TGG TTC AAA AAG GCA TTT GAA TCT 1542 Glu Ser Arg Asp His Gly Ala Ser Trp Phe Lys Lys Ala Phe Gla Ser
410 415 420 425
GAG CCA ACA CTA CAG TCA GGA ATT AAT TAT GCG GTC CTC CTC CTG GCA 1590
Glu Pro Thr Leo Gin Ser Gly He Asn Tyr Ala Val Leu Leu Leu Ala
430 435 440
GCT GGA CAC CAG TTT GAA TCT TCC TTT GAG CTC CGG AAA GTT GGG GTG 1638
Ala Gly His Gin Phe Glu Ser Ser Phe Glu Leu Arg Lys Val Gly Val
445 450 455
J G CTA AGT AGT CTT CTT GGT AAA AAG GGA AAC TTG GAA AAA CTC CAG 1686
Lys Leu Ser Ser Leu Leu G I y Lys Lys Gly Asn Leu Glu Lys Leu Gin
460 465 470
AGC TAC TGG GAA GTT GGA TTT TTT CTG GGG GCC AGC GTC CTA GCC AAT Π34
Ser Tyr Trp Glu Val Gly Phe Phe Leu Gly Ala Ser Val Leu Ala Asn
475 480 485
GAC CAC ATG AGA GTC ATT CAA GCA TCT GAA AAG CTT TTT AAA CTG AAG Π82
Asp His Me t Arg Val lie Gin Ala Ser Glu Lys Leu Phe Lys Leu Lys
490 495 500 505
ACA CCA GCA TGG TAC CTC AAG TCT ATT GTA GAG ACA ATT TTG ATA TAT 1830
Thr Pro Ala Trp Tyr Leu Lys Ser lie Val Glu Thr lie Leu lie Tyr
510 515 520
AAG CAT TTT GTG AAA CTG ACC ACA GAA CAG CCT GTG GCC AAG CAA GAA 1878
Lys His Phe Val Lys Leu Thr Thr Giu Gin Pro Vai Ala Lys Gin Glu
525 530 535
CTT GTG GAC TTT TGG ATG GAT TTC CTG GTC GAG GCC ACA AAG ACA GAT 1926
Leu Val Asp Phe Trp Met Asp Phe Leu Val Glu Ala Tin Lys Thr Asp 089 S19 0i9
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8P£lO/L6dT/LDd Zf\WIL6 OW GAC AGA GTC GTT TTA GGA AAA GGC ACT TAT GGG ATA GTC TAC GCA GGT 2358
Asp Arg Val Val Leu Gly Lys Gly Thr Tyr Gly lie Val Tyr Ala Gly
685 690 695
CGG GAC TTG AGC AAC CAA GTC AGA ATT GCT ATT AAG GAA ATC CCA GAG 2406 Atg Asp Leu Ser Asn Gin Val Arg He Ala lie Lys Glu lie Pro Glu
700 705 Π0
AGA GAC AGC AGA TAC TCT CAG CCC CTG CAT GAA GAA ATA GCA TTG CAT 2454
Arg Asp Ser Arg Tyr Ser Gin Pro Leu His Giu Glu lie Ala Leu His
715 720 ?25
AAA CAC CTG AAG CAC AAA AAT ATT GTC CAG TAT CTG GGC TCT TTC AGT 2502
Lys His Leu Lys His Lys Asn He Va! Gin Tyr Leu Gly Ser P Ser
730 735 740 745
GAG AAT GGT TTC ATT AAA ATC TTC ATG GAG CAG GTC CCT GGA GGA AGT 2550
Glu Asn Gly P e He Lys lie Phe Met Glu Gin Val Pro Gly Gly Ser
150 755 fl
CTT TAT GCT CTC CTT CGT TCC AAA TGG GGT CCA TTA AAA GAC AAT GAG 2598
Lea Tyi Al Leu Leu Arg Ser Lys Trp Gly Pro Leu Lys Asp Asn Glu
765 170
CAA ACA ATT GGC TTT TAT ACA AAG CAA ATA CTC GAA GGA TTA AAA TAT 2646
Gin Thr He Gly Phe Tyr Thr Lys Gin He Leu Glu Gly Leu Lys Tyr
780 785 ?90
CTC CAT GAC AAT CAG ATA GTT CAC CGG GAC ATA AAG GGT GAC AAT GTG 2694
Lea His Asp Asn Gin lie Val His Arg Asp I ! e Lys Gly Asp Asn Val
795 800 805
TTG ATT AAT ACC TAC AGT GGT GTT CTC AAG ATC TCT GAC TTC GGA ACA 2U2
OA Oi£10/卜 sr/i.リ d，
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CD
940 945 950
CTT TCA GCT GGA TCA AAT GCA GAA TAT CTC AGG AGT ATA TCC TTG CCG 3Π4
Leu Ser Ala Gly Ser Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Ser lie Ser Leu Pro
955 960 965
GTA CCT GTG CTG GTG GAG GAC ACC AGC AGC AGC AGT GAG TAC GGC TCA 3222
Val Pro Va! Leu Yal Glu As Thr Ser Ser Ser Ser Glu Tyr Gly Ser
970 975 980 985
GTT TCA CCC GAC ACG GAG TTG AAA GTG GAC CCC TTC TCT TTC AAA ACA 3270
Val Ser Pro Asp Thr Glu Leu Lys Val Asp Pro Phe Ser P e Lys Thr
990 995 1000
AGA GCC AAG TCC TGC GGA GAA AGA GAT GTC AAG GGA ATT CGG ACA CTC 3318
Arg Ala Lys Ser Cys Gly Glu Arg Asp Val Lys Gly He Arg Thr Leu
1005 1010 1015
TTT TTG GGC ATT CCA GAT GAG AAT TTT GAA GAT CAC AGT GCT CCT CCT 3366
Phe Leu Gl 7 11 e Pro Asp Glu Asn Phe Glu Asp His Ser Ala Pro Pro
1020 1025 1030
TCC CCT GAA GAA AAA GAT TCT GGA TTC TTC ATG CTG AGG AAG GAC AGT 3414
Ser Pro Glu Glu Lys Asp Ser Gly Phe Phe Met Leu Arg Lys Asp Ser
1035 1040 1045
GAG AGG CGA GCT ACC CTT CAC AGG ATC CTG ACG GAA GAC CAA GAC AAA 3462
Glu Arg Arg Ala Thr Leu His Arg lie Leu Thr Glu Asp Gin Asp Lys
05Q 1055 106Q 1065
ATT GTG AGA AAC CTA ATG GAA TCT TTA GCT CAG GGG GCT GAA GAA CCG 3510 lie Val Arg Asn Leu Met Glu Ser Leu Ala Gin Gly Ala Glu Glu Pro
1070 1075 1080 AAA CTA AAA TGG GAA CAC ATC ACA ACC CTC ATT GCA AGC CTC AGA GAA 3558
Lys Leu Lys Trp Glu His He Thr Thr Leu lie Ala Ser Leu Arg Glu
1085 1090 1095
TTT GTG AGA TCC ACT GAC CGA AAA ATC ATA GCC ACC ACA CT GTCA AAG 3606
Phe Val Arg Ser Thr Asp Arg Lys lie lie Ala Thr Thr Leu Ser Lys
1100 1105 1110
CTG AAA CTG GAG CTG GAC TTC GAC AGC CAT GGC ATT AGC CAA GTC CAG 3654
Leu Lys Leu Glu Leu Asp Phe Asp Ser His Gly lie Ser Gin Val Gin
1115 1120 1125
GTG GTA CTC TTT GGT TTT CAA GAT GCT GTC AAT AAA GTT CTT CGG AAT 3702
Val Va 1 Leu Phe Gly Pbe Gin Asp Ala Val Asn Lys Va I Leu Arg Asn
1130 1135 1140 1145
CAT AAC ATC AAG CCG CAC TGG ATG TTT GCC TTA GAC AGT ATC ATT CGG 3750
His Asn 11 e Lys Pro His Trp Met Phe Ala Leu Asp Ser I i e 11 e Arg
1150 1155 1160
AAG GCG GTA CAG ACA GCC ATT ACC ATC CTG GTT CCA GAA CTA AGG CCA 3798
Lys Ala Val Gin Thr Ala lie Thr lie Leu Val Pro Glu Leu Arg Pro
1165 1170 1175
CAT TTC AGC CTT GCA TCT GAG AGT GAT ACT GCT GAT CAA GAA GAC TTG 3846
His Phe Se〖 Leu Ala Ser Glu Ser Asp Thr Ala Asp Gin Glu Asp Leu
1180 1185 1190
GAT GTA GAA GAT GAC CAT GAG GAA CAG CCT TCA AAT CAA ACT GTC CGA 3894
Asp Val Gla Asp Asp His Glu Glu Gin Pro Ser Asn Gin Thr Val Arg
1195 1200 1205
AGA CCT CAG GCT GTC ATT GAA GAT GCT GTG GCT ACC TCA GGC GTG AGC 3942 nsf s^3 siq nsq dsy dsy 3JV 】U MA iLl 】 ns] | ΪΛ ns na 9Πί- Oil 391 VVV VII DVO IVO X93 V3V 119 1V1 3V1 DID 110 IVD Oil V13
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TTAA

Claims

請 求 の 範 囲
1. プロテインキナーゼ活性を有し、 かつ SEK1キナーゼ活性および Zま たは MKK 3キナーゼ活性を 進する、 タンパク質またはその誘！^。
2. アポトーシスを誘導する、請求項 1に記載のタンパク質。
3. アポトーシスが、 SAPKもしくは JNKおよび Zまたは P 38の活性 の) ΐϋによって媒介される、請求項 2に記載のタンパク質。
4. ffi¾S壊死因子 (TNF) によって SEK1キナーゼ活性および または MKK 3キナーゼ活性 ΐϋ活性力く: I iする、請求項 1に記載の夕ンパク質。
5. ヒト由来である、 請求項 1に Slgのタンパク質。
6. 配列番号 1のァミノ酸配列を含む、請求項 1に記載のタンパク質。
7. i _hの ¾π、 挿入、 置換および/または欠失されたを有する配列番号 1のァミノ酸配列を含む、 請求項 1に記載のタンパク質。
8. 配列番号 1のァミノ酸 g^ijからなるタンパク質またはその誘^^。
9. 1以上の ¾Π、 挿入、 置換および/または欠失を有し、 かつプロテイン キナーゼ活性が失われた配列番号 1のァミノ酸配列を含む、 タンパク質またはそ の誘導体。
10. 置換： Κ709Rを有する、 請求項 9に記載のタンパク質。
11. 請求項 1に記載のタンパク質またはその誘導体をコードする塩基配列。
12. 配列番号 2の D Ν Α配列の一部または全部を有する、請求項 11に記 載の塩基配列。
13. 請求項 9に記載のタンパク質またはその誘導体をコードする塩基配列。
14. 請求項 11に記載の塩基配列を含んでなる、 ベクター。
15. 請求項 13に記載の塩基配列を含んでなる、 ベクター。
16. プラスミ ドベクター、 ウィルスベクター、 およびリボソームベクター 力、らなる群から選択される、 請求項 1 4または 1 5に記載のベクター。
1 7. 請求項 1 4〜1 6のいずれか一項に記載のベクタ一によって形 ¾ ^換 された、 宿主細胞。
1 8. 大腸菌、酵母、 細胞、 C O S細胞、 ミンク肺上皮細胞、 リンパ紬 胞、 纖芽細胞、 I H/ 3 T 3細胞、 C H 0細胞、 血縣細胞、 および醒細 胞からなる群から選択されるものである、 請求項 1 7に記載の宿 ^胞。
1 9. 請求項 1 7に記載の宿 ¾¾3胞を培養し、 そしてその培養物から請求項 1、 8または 9に記載のタンパク質またはそれらの誘導体を単離することを含む、 請求項 1、 8または 9に記載の夕ンパク質またはその誘 ¾W本の製造法。
2 0. 請求項 1に記載のタンパク質またはその誘導体と薬学上許容される担 体とを含んでなる、悪體疡治翻。
2 1. 請求項 1 1に記載の塩基配列または請求項 1 4に記載のベクターと薬 学上許容される担体とを含んでなる、悪性應遗 治翻。
2 2. 悪 ¾¾¾治¾¾»』の製造のための、 請求項 1に記載の夕ンパク質または その誘導体の使用。
2 3. 悪性腫瘍遺伝子治療剤の製造のための、 請求項 1 1に記載の塩基配列 または請求項 1 4に記載のべクタ一の使用。
2 4. 請求項 1に記載のタンパク質またはその誘導体、請求項 1 1に記載の 塩基配列、 または請求項 1 4に記載のベクターの有効量を投与することを含んで なる、 悪 ¾®¾に罹ったほ 顏の治療法。
2 5. 配列番号 1の 6 5 4〜6 6 9番のァミノ酸配列からなるぺプチド。
2 6. 配列番号 1の 6 5 4〜 6 6 9番のァミノ酸配列を含んでなるべプチド。
2 7. 請求項 2 5に記載のぺプチドに対する抗体。
2 8. ポリクローナル抗体である、 請求項 2 7に記載の抗体。
2 9. 請求項 2 7または 2 8に記載の抗体によって認識される、 タンパク質 またはその誘導体。
3 0. 請求項 2 7または 2 8に記載の抗体によって認識される、 請求項 1に 記載のタンパク質。
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