JP2001501481A

JP2001501481A - Ｍａｐキナーゼ：ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびその使用

Info

Publication number: JP2001501481A
Application number: JP10517320A
Authority: JP
Inventors: フィリップ、コーエン; マイケル、ゲーダート
Original assignee: メディカル、リサーチ、カウンシル
Priority date: 1996-10-09
Filing date: 1997-10-09
Publication date: 2001-02-06
Also published as: ATE284955T1; AU4630297A; CA2267656A1; AU727733B2; WO1998015618A1; US6617117B1; EP0932666A1; DE69731964D1; DE69731964T2; EP0932666B1

Abstract

(57)【要約】アミノ酸配列(I)、またはその変異体、断片、融合体もしくは誘導体、またはその変異体もしくは断片もしくは誘導体の融合体を含んでなる、実質的に純粋なストレス活性化プロテインキナーゼ。前記のストレス活性化プロテインキナーゼおよび関連のストレス活性化プロテインキナーゼSAPK3は、薬剤のスクリーニングアッセイに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 MAPキナーゼ：ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびその使用本発明は、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびその使用に関し、特に、ストレス活性化（stress-activated）プロテインキナーゼ(SAPK)ファミリーのメンバーに関する。４種のマイトジェン活性化(MAP)プロテインキナーゼファミリーのメンバーは、細胞ストレス（化学薬品、熱および浸透圧ショック、紫外線照射、タンパク質合成阻害剤）、細菌リポ多糖類(LPS)、およびサイトカイン・インターロイキン- 1(IL-1)および腫瘍壊死因子(LPS)により活性化され、それゆえ、ストレス活性化プロテインキナーゼすなわちSAPKと呼ばれてきた(Cohen，1997に概説）。イソ型 SAPK1[c-Jun N末端キナーゼ(JNK)とも呼ばれる]は、c-Junの活性化ドメイン内の Ser-63およびSer-73をリン酸化し(Pulverer et al，1991)、それによりその転写活性が増強される。転写因子E1k1(Cavigelli et al，1995)およびATF2はin vitr oでリン酸化され（後者はThr-69、Thr-71およびSer-90で(Gupta et al，1995;Li vingstone et al，1995)）、これらのタンパク質の転写活性が増強される。転写因子c-Junにおける同部位も、細胞が、SAPK1を活性化するストレスおよびサイトカイン類に曝された場合、あるいはSAPK1を活性化させることが知られているプロテインキナーゼを用いた同時トランスフェクション(Pulvere et al，1991;Hib i et al，1993;Derijard et al，1994;Kyriakis et al，1995;Zinck et al，199 5)の後にリン酸化され、このことはc-JunがSAPK1の生理学的基質であることを示唆している。 SAPK2[p38(Han et al，1994)、p40(Freshney et al，1994)、RK(Rouse et al ，1994)、CSBP(Lee et al，1994)およびMxi2(Zervos et al，1995)とも呼ばれる］は、いくつかの生理学的基質を同定するために開発されたピリジニルイミダゾールSB 203580およびSB 202190(Lee et al，1994;Cuenda et al，1995;Cohen，197 7で概説)により極めて特異的に阻害される。これらは、４種のプロテインキナーゼ、すなわち、MAPキナーゼ活性化プロテインキナーゼ-2(MAPKAP-2、Rouse et a l，1994)および75%のアミノ酸配列の一致を有し、in vitroで同様の基質特異性を有する密接に関連したMAPKAP-K3(McLaughlin et al，1996;Ludwig et al，199 6;Clifton et al，1996)、ならびにMAPキナーゼ相互作用プロテインキナーゼ-1 および-2(Mnk1 and Mnk2)(Waskiewicz et al，1997;Fukunaga and Hunter，1997 )を含む。 MAPKAP-K2/K3の生理学的基質には、熱ショックタンパク質(HSP)27(Stokoe et al，1992a;Cuenda et al，1995;Huot et al，1995)、転写因子CREB(Tan et al， 1995)を含み、一方、転写因子eIF4EはMnkl/2の生理学的基質である(Waskiewicz et al，1997)。HSP27のリン酸化は、アクチンの重合を促進するようであり、また、細胞ストレス中に損傷されるアクチン微細繊維網の修復を助け、それにより細胞の生存を助けると考えられる(Lavoie et al，1995)。CREBの（Ser-133における）リン酸化は、このタンパク質がサイクリックAMP応答エレメント(CRE)を含む遺伝子の転写を刺激することを可能にするために不可欠である。またSAPK2は、ストレス誘導リン酸化（Ser-78およびSer-81における）ならびにCEBPβ関連転写因子CHOP(Wang and Ron，1996)およびEIk-1(Price et al，1996)の活性化を仲介する。 SB 203580の作用に基づけば、SAPK2aの活性化は、単球におけるIL1およびTNF のLPSにより誘導される産生(Lee et al，1994)、繊維芽細胞におけるIL6およびG M-CSFのTNFにより刺激される転写(Beyaert et al，1996)、上皮細胞におけるIL1 により誘導されるグルコースの取り込み(Gould et al，1995)、コラーゲンにより誘導される血小板凝固(Saklatvala et al，1996)、繊維芽細胞におけるストレスにより誘導されるc-Junおよびc-Fosの転写(Hazzalin et al，1996;Price et a l，1996)およびRAW264.7マクロファージにおけるLSPにより誘導されるシクロオキシゲナーゼ-2の合成（COX-2、プロスタグランジン合成における律速酵素）(Pa ul et al，1996)における律速となる。c-fosおよびCOX2プロモーターはCREを含むので、MAPKAP-K2/K3が介在するCREBのリン酸化は、ストレスおよびサイトカインにより誘導されるこれら２つの遺伝子の転写の一因である可能性がある。c-fo s ｍＲＮＡの誘導におけるCREの重要性は十分に記載されている(Gimty et al，1 996)。SAPK2aにより触媒されるElk-1のリン酸化(Price et al，1996)およびMAPK AP-K2により触媒されるCREBのリン酸化(Tan et al，1996)は双方とも、ストレスにより誘導されるc-fosの転写の一因であると思われる(Ginty et al，1994)。転写因子ATF2およびElk-1はまた、in vitroにてSAPK2によりリン酸化され、上流の SAPK2のアクチベーターで哺乳類細胞をトランスフェクトした後は、SAPK1を活性化しない(Raingeaud et al，1996)。最近、さらに２つのSAPキナーゼが同定され、これらはSAPK2b[またはp38β(Ji ang et al，1996)]およびSAPK3(Mertens et al，1996)[ERK6(Lechner et al，19 96)およびp38γ(Li et al，1996)とも呼ばれる]と呼ばれている。SAPK2bのアミノ酸配列は、SAPK2aと73%一致し、それはSAPK2aと同濃度のSB 202190により阻害される。これに対し、SAPK3のアミノ酸配列はSAPK2aおよびSAPK2bとは60%しか一致せず、SAPK1とは47%しか一致しない。SAPK2同様、SAPK3は活性化ドメイン内に TGYモチーフを含み（これは、SAPK1ではTPYであり、p42およびp44 MAPキナーゼではTEYである）、サブドメインVIIは、６個のアミノ酸により、サブドメインVI II内の活性化ループから分断されている（比較として、SAPK1では8残基、他のいずれかのMAPキナーゼファミリーのメンバーでは12を超える残基）。SAPK2bは一時的トランスフェクションにより哺乳類細胞へ導入され、SAPK1およびSAPK2aと同様に、前炎症性サイトカイン類およびストレス性刺激に応答して活性化されることが示されている。SAPK2bおよびSAPK3の生理学的役割はまだ知られていない。これらの酵素をコードするｍＲＮＡは実験した総ての哺乳類組織に存在しており(Jiang et al，1996;Mertens et al，1996;Goedert et al，1997)、SAPK3をコードするｍＲＮＡは骨格筋に最も高い。筋細胞ラインC2C12における野生型SAPK3 および不活性突然変異体の発現はそれぞれ、筋管への分化を促進および阻害した (Lechner et al，1996)。in vitroにおいて、SAPK2bおよびSAPK3は、SAPK2aの基質でもあるいくつかのタンパク質をリン酸化した。SAPK2bはSAPK2aよりも効果的に転写因子ATF2をリン酸化するが(Jiang et al，1996)、繊維芽細胞においてストレスおよびサイトカインにより誘導されるリン酸化は、SB 203580により影響を受けないので(Hazzalin et al.，1996;Beyaert et al.，1996)、トランスフェクションに基づくアプローチを用いた初期の研究(Gupta et al，1995)とは対照的に、SAPK2aもSAPK2bもin vivoでのATF2のリン酸化の律速段階とはならないと考えられることが報告されている。しかしながら、SAPK1および／またはSAPK3のいすれがATF2のin vivoリン酸化の律速であるのかはまだわかっていない。哺乳類細胞において、クロマトグラフィーにより明確な５種のSAPキナーゼキナーゼ(SKKまたはSAPKK)が同定された(Meier et al，1996;Cuenda et al，1996) 。in vitroにおいて、SKK1[MKK4(Derijard et al，1995)、SEK1(Sanchez et al ，1994)およびXMEK2(Yashar et al，1993)とも呼ばれる]は、SAPK2bはあまり効果的にはリン酸化されないものの、４種SAPK1、2aおよび2b総てを活性化する(Sa nchez et al，1994;Derijard et al，1995;Doza et al，1996)。SKK2[MKK3(Deri jard et al，1995)とも呼ばれる]およびSKK3(Cuenda et al，1996)[MKK6(Han et al，1996;Moriguchi et al，1996;Raingeaud et al，1996)およびMEK6(Stein e t al，1996)とも呼ばれる]は、SAPK2aは活性化するが、SAPK1は活性化しない。S KK3はまた、同時トランスフェクション実験において、最も有効なSAPK2aのアクチベーターであった(Jiang et al，1996)。SKK4およびSKK5はSAPK1を活性化するが、SAPK2aは活性化しない(Meier et al，1996)。SKK4/SKK5は精製またはクローン化されておらず、従って、それらのアミノ酸配列もまだ知られていない。SKK1 およびSKK2は、ラットクロム親和性細胞種(PC12)細胞を化学薬品ストレス、浸透圧ショック、紫外線照射またはタンパク質合成阻害剤アニソマイシンに曝した場合に生成するSAPK2のアクチベーターでしかない(Meier et al，1996)。しかしながら、ヒト上皮(KB)細胞をPC12細胞と同様のストレスに曝すか、またはIL-1で刺激した場合、またはヒト(THP1)単球をLPSで刺激した場合、SKK3はSAPK2の優先的なアクチベーターであり、また、SKK4/SKK5はSAPK1の優先的なアクチベーターである(Meier et al，1996;Cueda et al，1996)。従って、このSAPK1およびSAPK2 の上流アクチベーターの特性は細胞によって様々である。 in vitroおよび／または同時トランスフェクション実験において、SKK1、SKK2 およびSKK3を活性化することができる少なくとも５種の酵素、すなわちMEKキナーゼ(MEKK)(Yan et al，1994;Lin et al，1995;Matsuda et al，1995;Blank et al，1996)、MAPキナーゼ上流キナーゼ(MUK)(Hirai et al，1996)、混合リネアージキナーゼ-3(MLK-3)(Rana et al，1996)、TGFb活性化プロテインキナーゼ-1(TA K-1)(Moriguchi et al，1996)および原腫瘍遺伝子Tp12(Salmeron et al，1996) が同定された。MEKKは、同時トランスフェクトされたSAPK2またはMAPキナーゼキナーゼ-1(MKK1、p42および44 MAPキナーゼの生理アクチベーター)(Xu et al，19 96)よりも効果的に同時トランスフェクトされたSAPK1を活性化する。しかしながら、SKK1はまた、MUK、MLK3およびTp12により、SKK2はTAK1により活性化され得、一方、Tp12はまたMAPKK1を活性化できる。（もしあるならば）これらキナーゼのいずれが、in vivoの異なる条件下で、各SAPKKを活性化するのかを理解するにはさらなる研究が必要である。発明者らは、発明者らがSAPK4と呼ぶ、新規MAPキナーゼファミリーのメンバーのクローニングおよびSAPK3およびSAPK4の特徴を報告する。SAPK4もまたその活性化ドメインにTGY配列を含み、SAPK2a、SAPK2bおよびSAPK3と約60%の一致示し、そのｍＲＮＡはヒト組織で広く発現している。発明者らは、SAPK4が、他のSAP キナーゼを活性化するのと同じ刺激によって活性化され、また、SKK3がin vivo において、SAPK3およびSAPK4の主要上流アクチベーターである可能性があることを示す。in vitroにおけるSAPK4の基質特異性はSAPK3のそれと同様であり、SAPK 3もSAPK4もSB 203580またはSB 202190により阻害されない。本発明の第１の態様は、アミノ酸配列を含んでなる、実質的に純粋なストレス活性化プロテインキナーゼ、またはその変異体、断片、融合体もしくは誘導体、またはその変異体もしくは断片もしくは誘導体の融合体を提供する。前記で示したアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本明細書ではSAPK4（ストレス活性化プロテインキナーゼ4）と呼ばれる。「実質的に純粋」により、発明者らは、このプロテインキナーゼが実質的に他のタンパク質を含まないことを意味する。従って、発明者らは、プロテインキナーゼの重量としての少なくとも30重量%のタンパク質内容物、好ましくは少なくとも50重量%、より好ましくは少なくとも70重量%、いっそう好ましくは少なくとも90重量%、最も好ましくは少なくとも95重量%のタンパク質内容物がプロテインキナーゼである、いずれの組成物をも含める。従って、本発明はまた、プロテインキナーゼと夾雑物を含んでなる組成物を含み、この夾雑物は組成物の70重量%未満、好ましくは組成物の50重量%未満、より好ましくは組成物の30重量%未満、いっそう好ましくは組成物の10重量%未満、最も好ましくは組成物の５重量%未満を含む。本発明はまた、ex vivoで他の成分と組み合わせた場合の実質的に純粋なプロテインキナーゼを含み、この他の成分は、プロテインキナーゼが見られる細胞中に見られる成分の必ずしも総てではない。ポリペプチドの「変異体」により、発明者らは、挿入、欠失および保存的または非保存的いずれかの置換を含める。特に発明者らは、かかる変異がプロテインキナーゼの活性を実質的に変更しない場合のポリペプチドの変異体を含める。「保存的置換」とは、Gly，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser， Thr；Lys，Arg；およびPhe，Tryなどの組み合わせを意味するものである。ストレス活性化プロテインキナーゼ変異体が、前記に与えられたアミノ酸配列と少なくとも65%の同一性、より好ましくは少なくとも70%の同一性、いっそう好ましくは少なくとも75%の同一性、なおいっそう好ましくは少なくとも80%の同一性、さらに好ましくは少なくとも85%の同一性、いっそうさらに好ましくは少なくとも90%の同一性、最も好ましくは前記に与えられたアミノ酸配列と少なくとも95%または97%の同一性を有するアミノ酸配列を持つならば特に好ましい。２つのポリペプチド間の配列同一性％は適切なコンピュータープログラム、例えば、University of Wisconsin Genetic Computing GroupのGAPプログラムを用いて決定すればよく、同一性％はその配列が最適に整列されたポリペプチドに関して補正されることに価値があると考えられる。本発明の特に好ましい具体例は、アミノ酸配列からなる、実質的に純粋なヒトSAPK4ポリペプチド、または自然に生じるその対立遺伝子変異体を提供する。不可欠ではないが、プロテインキナーゼの変異体もしくは断片もしくは誘導体もしくは融合体、またはその変異体もしくは断片もしくは誘導体の融合体が、ミエリン塩基性タンパク質のリン酸化に関して、SAPK4の酵素活性の少なくとも30% を有することが特に好ましい。プロテインキナーゼの変異体もしくは断片もしくは誘導体もしくは融合体、またはその変異体もしくは断片もしくは誘導体の融合体が、ミエリン塩基性タンパク質のリン酸化に関して、SAPK4の酵素活性の少なくとも50%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも90%を有しているならばより好ましい。しかしながら、酵素活性を欠く変異体もしくは融合体もしくは誘導体もしくは断片も、例えば、別のポリペプチドと相互作用することにより、やはり有用であり得ると認識されよう。本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様で定義されたプロテインキナーゼをコードするか、またはこのキナーゼの変異体もしくは断片もしくは誘導体もしくは融合体、またはその変異体もしくは断片もしくは誘導体の融合体をコードする組換えポリヌクレオチドを提供する。このプロテインキナーゼ変異体として好ましいのは、本発明の第１の態様におけるものと同様である。１つの好ましい具体例では、ポリヌクレオチドはアミノ酸配列またはその変異体、断片、融合体もしくは誘導体を含んでなる。本発明はまた、本発明の第２の態様の組換えポリヌクレオチドの断片を含んでなるポリヌクレオチドを含む。好ましくは、そのポリヌクレオチドは、少なくとも10ヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも14ヌクレオチドの長さ、さらに好ましくは少なくとも18ヌクレオチドの長さである断片を含んでなる。かかるポリヌクレオチドはPCRプライマーとして有用である。ポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、好ましくはＤＮＡである。ポリヌクレオチドは、コーディング配列にイントロンを含んでもよいし、また含まなくてもよい；好ましくはポリヌクレオチドはｃＤＮＡである。ポリヌクレオチドの「変異体」としては、(i)次にはポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体の調製に使用可能なタンパク質またはその断片を製造するのに使用可能なもの、または(ii)まさに定義した通りのタイプ(i)の遺伝子または変異体に対応するアンチセンス配列が挙げられる。例えば、元のコドンと同一のアミノ酸をコードする異なるコドンは置換可能である。また、置換コドンは、タンパク質の活性または免疫原性に作用しない、もしくはその活性または免疫原性を改良する、またそうでなければ変調する異なるアミノ酸をコードしてもよい。例えば、引用されることにより本明細書の開示の一部とされる、Boststein and Shortle，"Strategies and Applications of In Vitro Mutagenesis,"Science，229:193-210(1985)に記載の位置指定突然変異誘発または他の技術を使用して、置換、挿入、欠失および転位などの単一または複数の突然変異を作出することができる。このように修飾されたポリヌクレオチドは、本明細書に含まれる教示に対し公知の技術を適用することにより得ることができ、このように修飾されたポリヌクレオチドは本発明の請求の範囲内にある。さらに本発明のポリヌクレオチド配列（またはその断片）を使用して、高ストリンジェンシー条件下で、それとハイブリダイズする他のポリヌクレオチド配列を得ることができるということが、当業者により認識されるであろう。かかるポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡのいずれをも含む。従って、本発明のポリヌクレオチドは、本発明の方法において同定されたポリヌクレオチドと少なくとも55% 、好ましくは60%、さらに好ましくは70%、最も好ましくは90%の相同性を示すポリヌクレオチドを含む（ただし、かかる相同ポリヌクレオチドは、以下に記載する少なくともいくつかの方法に使用可能な、またはそうでなければ有用であるポリペプチドをコードする）。相同性%は、例えばUniversity of Wisconsin Genetic Computer GroupのGAPプログラムにより決定することができる。ＤＮＡ-ＤＮＡ、ＤＮＡ-ＲＮＡおよびＲＮＡ-ＲＮＡハイブリダイゼーションは、0.1XSSC〜6XSSCの間を含有する水溶液中で、55℃〜70℃の間の温度にて行ってよい。より高温またはSSC濃度がより低くなれば、ハイブリダイゼーション条件はよりストンリンジェントとなることは当該技術分野で十分に公知である。「高ストリンジェンシー」により、発明者らは2XSSCおよび65℃を意味する。1XSSC は0.15M NaCl/0.015Mクエン酸ナトリウムである。高ストリンジェンシーにおいてハイブリダイズするポリヌクレオチドは本発明の請求の範囲内に含まれる。ポリヌクレオチドの「変異体」はまた、たとえ２つのポリヌクレオチド間の全相同性が非常に低くとも、その比較的短い範囲（例えば、20〜50ヌクレオチド）が本発明のポリヌクレオチドの等価範囲と高度な相同性（少なくとも80%、好ましくは少なくとも90または95%）を有するポリヌクレオチドも含む。これはタンパク質の一般構造が異なる場合でさえ、重要な活性、または結合部位を共有しているといるからであろう。本発明のさらなる態様は、プロテインキナーゼ、またはそのプロテインキナーゼの変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体、断片もしくは誘導体の融合体をコードする組換えポリヌクレオチドを含んでなる複製可能なベクターを提供する。ポリヌクレオチド、特にＤＮＡを、例えば相補的付着末端を介して、ベクターへ作動可能なように連結するために、種々の方法が開発されてきた。例えば、相補的ホモポリマー域をＤＮＡセグメントに付加し、ベクターＤＮＡに挿入することが可能である。次いで、ベクターおよびＤＮＡセグメントを相補的ホモポリマー末端間での水素結合により連結し、組換えＤＮＡ分子を形成する。１以上の制限部位を含有する合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターに連結する代替法を提供する。ＤＮＡセグメントは、初めに記載したように、エンドヌクレアーゼ制限消化により作製し、バクテリオファージT4ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌(E.coli)ＤＮＡポリメラーゼI、3'-5'エキソ核酸分解活性を有する凸部の一本鎖3'末端を除去し、次いでそれらの重合活性を有する凹部の3'末端を満たす酵素群で処理する。従って、これらの活性の組合わせにより、平滑末端ＤＮＡセグメントが生じる。次いでこの平滑末端セグメントを、バクテリオファージT4ＤＮＡリガーゼのような平滑末端ＤＮＡ分子の連結を触媒することができる酵素の存在下で、高モル濃度の過剰なリンカー分子とともインキュベートする。このように、反応生成物はそれらの末端に重合リンカー配列を有するＤＮＡセグメントある。次いで、これらのＤＮＡセグメントを適切な制限酵素で切断し、ＤＮＡセグメントのそれらに適合した末端を生ずる酵素で切断した発現ベクターに連結する。種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーは、Internationa l Biotechnologies Inc，New Haven，CN，USAをはじめとする多数の入手元から、市販されている。本発明のペプチドをコードするＤＮＡを修飾する望ましい方法は、Saiki et a l（1988）Sciencs 239，487-491によって開示された、ポリメラーゼ連鎖反応を用いるものである。この方法は、例えば適した制限部位で加工することにより、ＤＮＡを適したベクターへ導入する目的で用いてもよいし、または当該技術分野で公知の他の有用な方法でＤＮＡを修飾するのに用いてもよい。この方法では、酵素的に増幅すべきＤＮＡを、それら自身が増幅されたＤＮＡに組み込まれるようになる、2種の特異的プライマーによってフランクさせる。この特異的プライマーは、当該技術分野で公知の方法を用いて発現ベクターへのクローニングに使用することの可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでもよい。次いで、ＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）を適当な宿主で発現させ、本発明の化合物を含んでなるポリペプチドを生産する。かくして、本発明の化合物を含んでなるポリペプチドをコードするＤＮＡは、本明細書に含まれる教示の点から適切に改良した公知の技術に従って使用し、次いで本発明のポリペプチドの発現および産生のための適切な宿主細胞に形質転換するために用いられる発現ベクターを構築することができる。かかる技術は、1984年4月3日にRutter et al.に対して発行された米国特許第4,440,859号、1985年7月23日にW eissmanに対して発行された同第4,530,901号、1986年4月15日にCrowlに対して発行された同第4,582,800号、1987年6月30日にMark et al.に対して発行された同第4,677,063号、1987年7月7Goeddelに対して発行された同第4,678,751号、1987 年11月3日にItakura et al.に対して発行された同第4,704,362号、1987年12月1 日にMurrayに対して発行された同第4,710,463号、1988年7月12日にToole，Jr．e t al．に対して発行された同第4,757,006号、1988年8月23日にGoeddel et al.に対して発行された同第4,766,075号、および1989年3月7日にStalkerに対して発行された同第4,810,648号に開示されたものを含み、これらすべては引用されることにより本明細書の開示の一部とされる。本発明の化合物を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）は、適切な宿主へと導入するための様々な他のＤＮＡ配列と連結してもよい。相手のＤＮＡは、宿主の性質、ＤＮＡの宿主への導入様式、およびエピソームとしての維持、または組込みが望ましいかどうかに依存するであろう。一般に、ＤＮＡは発現のために適切な方向、かつ正確なリーディングフレームで、プラスミドのような発現ベクターに挿入する。このような制御は発現ベクターには一般に有用ではあるが、必要であれば、ＤＮＡを、望ましい宿主によって認識される適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列と連結させてもよい。次いで、このベクターを標準的な技術によって宿主へ導入する。一般に、総ての宿主がこのベクターによって形質転換するわけではない。従って、形質転換宿主細胞を選択する必要があろう。１つの選択技術は、抗生物質耐性のような、形質転換細胞において選択可能な特質をコードする必要な制御エレメントのいずれかとともにＤＮＡ配列を発現ベクターへ組み込むことを含む。別法として、かかる選択可能な特質に関する遺伝子は別のベクターに存在していてもよく、これを使用して望ましい宿主細胞を同時形質転換する。次いで、本発明の組換えＤＮＡによって形質転換された宿主細胞を、次いで回収可能なポリペプチドの発現を可能にするため、本明細書で開示された教示の点で当業者に公知である、十分な時間、および適当な条件下で培養する。細菌（例えば、大腸菌および枯草菌(Bacillus subtilis)）、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)）、糸状菌（例えば、アスペルギルス(Aspergillus)）、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞を含む、多くの発現系が公知である。このベクターは、他の、非原核細胞種での発現に用いる場合でさえ、原核細胞の増殖のためのColE1 oriのような原核細胞レプリコンを含む。このベクターはまた、それで形質転換された大腸菌などの、細菌宿主細胞での遺伝子発現（転写および翻訳）を指示する能力を持った原核細胞プロモーターのような、適当なプロモーターを含む。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写が起こることを可能にするＤＮＡ配列によって形成される発現制御エレメントである。典型的には、典型的な細菌宿主と適合性のあるプロモーター配列を、本発明のＤＮＡセグメントの挿入に都合のよい制限部位を含有するプラスミドベクターに提供する。典型的な原核細胞ベクタープラスミドは、Biorad Laboratories，(Richmond， CA，USA)より入手可能なpUC18、pUC19、pBR322およびpBR329、ならびにPharmaci a，Piscataway，NJ，USAより入手可能なpTrc99AおよびpKK223-3である。典型的な哺乳動物細胞ベクタープラスミドは、Pharmacia，Piscataway，NJ，U SAより入手可能なpSVLである。このベクターは、クローン化された遺伝子の発現、COS-1細胞のようなＴ抗原産生細胞に見られる最も高レベルの発現を作動させるSV40後期プロモーターを用いる。誘導可能な哺乳動物発現ベクターの例としては、これもまたPharmaciaから入手できるpMSGがある。このベクターは、クローン化された遺伝子の発現を作動させるためのマウス乳癌ウイルスの長い末端反復配列のグルココルチコイド誘導プロモーターを用いる。有用な酵母プラスミドベクターは、pRS403-406およびpRS413-416であり、一般にStratagene Cloning Systems，La Jolla，CA92037，USAから入手できる。プラスミドpRS403、pRS404、pRS405およびpRS406は、酵母組込みプラスミド(Yips)であり、酵母選択可能マーカーHIS3、TRPI、LEU2およびURA3を組込んである。プラスミドpRS413-416は、酵母動原体プラスミド(Ycps)である。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドベクター構築体で形質転換された宿主細胞に関する。宿主細胞は、原核細胞か真核細胞のいずれかであり得る。細菌細胞は好ましい原核宿主細胞であり、典型的には例えば、Bethesda Research La boratories Inc.，Bethesda，MD，USAより入手可能な大腸菌DH5株のような大腸菌株、およびAmerican Type Culture Collection(ATCC)of Rockville，MD，USA( NoATCC31343)より入手可能なRRIである。好ましい真核宿主細胞は、酵母、昆虫および哺乳類細胞、好ましくはマウス、ラット、サルまたはヒト繊維芽細胞系統に由来するものなどの脊椎動物細胞を含む。酵母宿主細胞は、一般に、Stratage ne Cloning Systems，La Jolla，CA92037，USAから入手できるYPH499、YPH500およびYPH501を含む。好ましい哺乳類宿主細胞は、ATCCからCCL61として入手できるチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ATCCからCRL1658として入手できるNI Hスイスマウス胚細胞NIH/3T3、およびATCCからCRL1650として入手できるサル腎臓誘導COS-1細胞を含む。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現ベクターでトランスフェクトされ得るSf9細胞である。本発明のＤＮＡ構築体での、適切な細胞宿主の形質転換は、典型的には、用いられるべクターの種類により、十分に公知な方法によって行われる。原核宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Cohen et al．(1972)Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 69，2110およびSambrook et al．(1989)Molecular Cloning，A Laborator y Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NYを参照。酵母細胞の形質転換は、Sherman et al．(1986)Methods In Yeast Genetics，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY に記載されている。Beggs（1978）Nature 275，104-109の方法もまた有用である。脊椎動物細胞に関して、例えばリン酸カルシウムおよびDEAE-デキストランまたはリポソーム組成物などの細胞をトランスフェクトするのに有用な薬剤は、 Stratagene Cloning Systems,またはLife Technologies Inc.，Gaithersburg，M D20877，USAから入手できる。エレクトロポレーションもまた、細胞の形質転換および／またはトランスフェクションに有用であり、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞および脊椎動物細胞の形質転換に関しては当該技術分野で十分に公知である。例えば多くの細菌種は、引用されることにより本明細書の開示の一部とされる Luchansky et al．(1988)Mol．Microbiol．2，637-646に記載の方法により形質転換すればよい。2.5X PEB中に懸濁させたＤＮＡ細胞混合液の、25μFDにて6250 V/cmを用いたエレクトロポレーションの後、一貫して、最大数の形質転換細胞が回収される。エレクトロポレーションによる酵母の形質転換法は、Becker & Guarente（199 0）Methods Enzymol．194，182に開示されている。首尾よく形質転換された細胞、すなわち本発明のＤＮＡ構築体を含む細胞は、十分に公知な技術により同定できる。例えば、本発明の発現構築体の導入から得られた細胞を増殖させて、本発明のポリペプチドを生産することが可能である。細胞を採取し、溶解し、次いでそれらのＤＮＡ含有量を、Southem（1975）J．Mo l．Biol．98，503またはBerent et al．(1985)Biotech．3，208によって記載されるような方法を用いて、ＤＮＡの存在に関して試験することができる。別法として、上清中のタンパク質の存在を、以下に記載の抗体を用いて検出することもできる。組換えＤＮＡの存在についての直接的なアッセイに加え、組換えＤＮＡがタンパク質の発現を指示能力を有する場合、形質転換の成功を十分に公知な免疫学的方法によって確認することができる。例えば、発現ベクターで首尾よく形質転換された細胞は、適当な抗原性を呈するタンパク質を産生する。形質転換されたと思われる細胞のサンプルを採取し、適切な抗体を用い、タンパク質に関してアッセイをする。かくして、形質転換された宿主細胞自身に加え、本発明はまた、栄養培地における、それらの細胞の培養、好ましくはモノクロナール（クローンとして均一）培養、またはモノクロナール培養から誘導された培養を意図する。本発明のさらなる態様は、ストレス活性化プロテインキナーゼ、またはその変異体、誘導体、断片もしくは融合体、またはその変異体、断片もしくは誘導体の融合体を作出する方法であって、組換えポリヌクレオチドまたはストレス活性化プロテインキナーゼをコードする複製可能なベクターを含んでなる宿主細胞を培養し、次いでそのプロテインキナーゼ、またはその変異体、誘導体、断片もしくは融合体、またはその変異体、断片もしくは誘導体の融合体をその宿主細胞から単離する方法を提供する。宿主細胞を培養し、次いで組換えタンパク質を単離する方法は、当該技術分野で十分に公知である。本発明はまた、前記の本発明の方法によって得ることが可能なストレス活性化プロテインキナーゼ、またはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体もしくは断片もしくは誘導体の融合体を含む。本発明のなおさらなる態様は、本発明のストレス活性化プロテインキナーゼに対して反応性のある抗体を提供する。本発明のストレス活性化プロテインキナーゼに対して反応性のある抗体は、当該技術分野において十分に公知な方法によって作製してよい。特に、その抗体は、ポリクロナール抗体またはモノクロナール抗体であってよい。このプロテインキナーゼに対して反応性のある適切なモノクロナール抗体は、例えば"Monoclonal Antibodies:Amammal of techniques"，H Zola(CRC Press，1 988)および"Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications" ，SGR Hurrell(CRC Press，1982)に開示されたものなどの公知な技術によって調製すればよい。好ましい具体例では、SAPK4の所与のアミノ酸配列より得ることが可能な適切なペプチド配列のいずれかを用いて抗体を作製する。ポリクロナール抗ペプチド抗体が作製されれば望ましい。抗体がSAPK2a、SAPK2bまたはSAPK3などの別のストレス活性化プロテインキナーゼとは実質的に反応しないならば、特に望ましい。従って、SAPK4配列に基づくペプチドを使用すれば好ましく、これは、SAPK2a、SAPK2bまたはSAPK3などの他のストレス活性化プロテインキナーゼにいずれかで見られるいずれのペプチドとも有意に異なるものである。ペプチドが合成される前または後に、１以上のアミノ酸残基が化学的に修飾されているペプチドを使用すればよく、これにより、ペプチドの機能、すなわちin vivoで特異的抗体の産生が実質的に変化しないで留まっているということになる。かかる修飾は、酸または塩基、特に生理学上許容される有機または無機酸および塩基で塩を形成し、末端のカルボキシル基のエステルまたはアミドを形成し、次いでN-t-ブトキシカルボニルのようなアミノ酸保護基を付加することを含む。かかる修飾により、in vivo代謝からペプチドを保護すればよい。このペプチドは、単一または多重コピーとして、例えば縦列反復として存在してもよい。かかる縦列または多重反復は、それ自身、担体の使用を不要にするに十分に抗原性があると考えられる。ペプチドについては、N末端とC末端がともに連結したループとして形成されること、または１以上のCys残基を１末端に付加して、抗原性を増強すること、および／またはジスルフィド結合の形成を可能にすることが有利である。そのペプチドが担体、好ましくはポリペプチドと共有結合している場合には、次いで、本発明のペプチドがループを形成するように配置することが好ましい。最新の免疫学理論によれば、担体機能は、免疫系を刺激する、または刺激を増強するために、いずれの免疫原組成物にも存在するはずである。最良の担体は、 T細胞エピトープを包含する（または、抗原とともに、生じる）と思われる。ペプチドは、例えば架橋によって、血清アルブミン、ミオグロビン、細菌トキソイドおよびスカシガイ科ヘモシアニンのような、個々の担体と結合させてもよい。さらに最近開発された、免疫応答においてT細胞を援助する担体としては、B型肝炎コア抗原（ヌクレオキャプシドタンパク質とも呼ばれる）、Thr-Ala-Ser-Gly- Val-Ala-Glu-Thr-Thr-Asn-Cysのような推定T細胞エピトープ、β-ガラクトシダーゼおよびインターロイキン-1の163-171ペプチドが挙げられる。後者の化合物は、担体またはアジュバンドもしくはその両者と、様々に考えられ得る。別法として、本発明の同一の、または異なるペプチドのいくつかのコピーを別のものと架橋してもよく；このような状況では、別個の担体自体は存在しないが、担体機能はかかる架橋により提供され得る。適切な架橋剤としては、SigmaおよびPierc e cataloguesなどに一覧化されたもの、例えばグルタルアルデヒド、カルボジイミドおよびスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレートが挙げられ、後者の薬剤はC-末端システイン残基（存在する場合）の -SH基を利用するものである。ペプチドを、適切な宿主細胞において、適切なヌクレオチド配列の発現によって調製するのであれば、担体として働くペプチド配列を有する融合生成物として、そのペプチドを発現させることが有利である。Kabigenの"Ecosec"系は、かかる配置の一例である。本発明のペプチドを、他の抗原と結合させて、2つの効果を提供してもよい。ペプチドは、Lu et al．(1981)J．Org．Chem．46，3433、およびその中の参考文献よって開示された、Fmoc-ポリアミド様式の固相ペプチド合成によって合成してもい。一時的なN-アミノ基保護は、9-フルオレニルメチロキシカルボニル(F moc)基により供される。N,N-ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジンを用いて、この極めて塩基に不安定な保護基の反復切断がなされる。側鎖の官能性は、それらのブチルエーテル（セリン、トレオニンおよびチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン酸およびアスパラギン酸の場合）、ブチロキシカルボニル誘導体（リジンおよびヒスチジンの場合）、トリチル誘導体（システインの場合）および4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル誘導体（アルギニンの場合）として保護すればよい。グルタミンまたはアスパラギンがC-末端残基である場合には、側鎖アミド官能性の保護に、4,4'-ジメトキシベンズヒドリル基が使用される。この固相支持は3種のモノマー、ジメチルアクリルアミド（主鎖モノマー）、ビスアクリロイルエチレンジアミン（架橋剤）およびアクリロイルサルコシンメチルエステル（官能化剤）から構築されるポリジメチルアクリルアミドポリマーに基づく。用いるペプチド-樹脂切断可能結合剤は、酸に不安定な4 -ヒドロキシメチル-フェノキシ酢酸誘導体である。総てのアミノ酸誘導体は、逆転N,N'-ジシクロヘキシル-カルボジイミド/1-ヒドロキシベンゾトリアゾールが介在するカップリング法を用いて付加されるアスパラギンまたはグルタミンを除き、それらの予め作製した対称無水誘導体として付加される。カップリングおよび脱保護反応は、ニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸またはイソスズ試験法を用いてモニターする。合成の完了時、ペプチドを、50%スカベンジャー混合物を含有する95%トリフルオロ酢酸での処理によって、側鎖保護基の同時除去で樹脂支持体から切断する。通常用いられるスカベンジャーは、エタンジチオール、フェノール、アニソールおよび水であり、合成されたペプチドの構成アミノ酸により、的確な選択がなされる。トリフルオロ酢酸を真空蒸発により除去し、次いでジエチルエーテルでトリチュレートして粗ペプチドを得る。水性相の凍結乾燥の際にスカベンジャーを含まない粗ペプチドを得る単純抽出法により、存在するいずれのスカベンジャーも除去する。ペプチド合成剤は、一般にCalbioch em-Novabiochem（UK）Ltd，Nottingham NG72QJ，UKから入手できる。精製は、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび（主として）逆相高性能液体クロマトグラフィーなどの技術のいずれか１つ、または組合せによって達成すればよい。ペプチドの解析は、薄層クロマトグラフィー、逆相高性能液体クロマトグラフィー、酸加水分解後のアミノ酸分析および高速原子衝撃(F AB)による質量分析を用いて行ってよい。本発明のさらなる態様は、本発明の第１の態様で定義されたストレス活性化プロテインキナーゼ、またはストレス活性化ブロテインキナーゼSAPK3の活性を阻害する化合物の同定方法であって、化合物を、ストレス活性化プロテインキナーゼ、または適切なその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体、断片もしくは誘導体の融合体と接触させ、次いで、化合物の不在下で、プロテインキナーゼの活性がプロテインキナーゼ、またはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体、断片もしくは誘導体の融合体の活性に比べて低下するかどうかを決定することを含んでなる方法を提供する。 SAPK3が、SAPK4と類似した基質特異性を有するストレス活性化ブロテインキナーゼであるということは理解されるであろう(Cuenda et al(1997);実施例1および実施例4)。好都合なことに、この方法は、実施例1および実施例4に記載のように、SAPK3またはSAPK4がミエリン塩基性タンパク質をリン酸化するということを利用するものであるが、いずれの適切な基質を使用してもよい。例えば、Elk-1 、ATF2、SAP-1、MARKAP-K2、MARKAP-K3、p53、SAP-2またはc-junは、基質として用いればよい；特に、Elk-1、ATF2またはSAP-1が望ましい。便宜的には、この方法は、SAPK3をSAPK4に置き換えてもよいこと以外は、実施例4および出典明示して本明細書の一部とみなされるCuenda et al（1997）EMBO J．16，295-305で開示されたものと実質的に同様のアッセイを使用するものである。本発明のなおさらなる態様は、本発明の第１の態様で定義されたストレス活性化プロテインキナーゼ、またはストレス活性化ブロテインキナーゼSAPK3のSKK3 による活性化を阻害する化合物の同定方法であって、化合物が、(a)本発明の第１の態様で定義されたストレス活性化プロテインキナーゼ、すなわちSAPK3、または適切なその断片、変異体、誘導体もしくは融合体、または断片、変異体もしくは誘導体の適切な融合体と、(b)SKK3またはその適切な変異体、誘導体、断片もしくは融合体、または変異体、誘導体もしくは断片の適切な融合体との間の相互作用を増強または阻害するかどうかを決定するか、あるいは、その化合物が、ストレス活性化プロテインキナーゼ、または適切なその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、または断片、誘導体もしくは融合体の融合体の、SKK3またはその適切な変異体、誘導体、断片もしくは融合体による活性化を実質的に阻害するかどうかを決定することを含んでなる方法を提供する。 SAPK3をSAPK4に置き換えてもよいこと以外は、SKK3またはSKK1によるSAPK3またはSAPK4の活性化は、実施例4または引用されることにより本明細書の開示の一部とされるCuenda et al（1997）EMBO J．16，295-305に実質的に記載されたようにアッセイすればよい。「SKK3」により、発明者らは、実施例1に記載されたストレス活性化プロテインキナーゼキナーゼ3(SAPキナーゼキナーゼ3;SAPKK3)を意味する。SKK1も用いてよく、このように本発明はまた、本発明の第１の態様で定義されたSKK1によるストレス活性化プロテインキナーゼの活性化を阻害する化合物の同定方法も含む。便宜的には、この方法に用いるストレス活性化プロテインキナーゼまたはその断片、誘導体、変異体もしくは融合体は、組換えＤＮＡ技術により製造されたものである。同様に、この方法に用いるSSK3、またはその断片、誘導体、変異体もしくは融合体が、組換えＤＮＡ技術により生成されたものであれば好ましい。また、SKK3が適切な天然の供給源から精製されたSKK3であれば好ましく；例えば、SSK3は、Cuenda et al（1996）EMBO J．15，4156-4164に記載の方法を用いて単離してよい。「適切な」により、発明者らは、アッセイに用いる、あるいはより都合よく用いる場合に、その方法の構成要素が、SAPK3またはSAPK4またはSKK3のものと実質的に等価な相互作用または活性を有するものであることを意味するものと理解されよう。例えば、SAPK3またはSAPK4またはSKK3SKK1の融合体は、その融合体を容易に精製することを可能にする部分を含み得るので、特に有用である。ストレス活性化プロテインキナーゼと、SKK3または適切な誘導体、断片、融合体もしくは変異体との間の相互作用の増強または阻害は、生化学分野で十分に公知な方法を用いてin vitroで測定可能であり、タンパク質-タンパク質相互作用を評価するために用いることのできるいずれの方法をも含む。この相互作用はまた、例えば、当該技術分野で十分公知の酵母のツー・ハイブリッド系(two hybrid system)を用いて、細胞内で測定することができる。本発明はSAPK3もしくはSAPK4の活性、またはそれらのSKK3との相互作用を変調するのに有用な薬剤に関するスクリーニングアッセイを提供することが認識されるであろう。本方法で同定される化合物は、それら自身、薬剤として有用であり得るか、またはそれらはより効果的な化合物の設計および合成のための鉛化合物を提供してもよい。本発明のさらなる態様は、本発明のスクリーニング方法により同定可能な化合物を提供する。なおさらなる態様は、医薬に使用するためのかかる化合物を提供する。かかる化合物は、炎症性疾患の治療に有用であると確信される。炎症性疾患としては、慢性関節リウマチ、乾癩、敗血症発作、喘息、および炎症性腸疾患が含まれる。従って本発明のさらなる態様は、本発明のスクリーニング方法によって同定可能な化合物の有効量を患者に投与することを含んでなる、炎症性疾患を患う患者の治療方法を提供する。なおさらに本発明は、患者の炎症性疾患の治療用医薬の製造における、本発明のスクリーニング方法により同定可能な化合物の使用を提供する。本発明の前記化合物またはそれらの組成物は、経口および非経口（例えば、皮下または筋肉内）注射をはじめとする従来法のいずれにより投与されてもよい。治療は単回用量または一定期間にわたる複数回用量からなってよい。本発明の化合物は単独で投与可能であるが、１以上の許容される担体とともに医薬組成物として提供することが好ましい。この担体は、本発明の化合物と適合し、かつ、その受容者に有害ではないという意味から、「許容」されなければならない。典型的にはこれらの担体は、滅菌されかつ発熱物質を含まない水または食塩水であろう。従って本発明はまた、本発明のスクリーニング方法により同定可能な化合物および医薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物を提供する。本発明のさらなる態様は、プロテインキナーゼの活性を阻害するか、またはSK K3によるプロテインキナーゼの活性化を阻害する化合物に関するスクリーニングアッセイにおける、本発明の第１の態様で定義したストレス活性化プロテインキナーゼまたはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体、誘導体もしくは断片の融合体の使用を提供する。本発明のさらなる態様は、このスクリーニング方法を行うのに有用なキットの一部を提供する。本発明のなおさらなる態様は、タンパク質のリン酸化、遺伝子発現および／またはタンパク質合成の調節における、SAPK3、その類似体、イソ型、インヒビター、アクチベーターおよびその機能的等価体の使用（in vitroまたはin vivo）を提供する。かかる薬剤を含んでなる組成物はまた、本発明により包含され、タンパク質のリン酸化、遺伝子発現および／またはタンパク質合成が異常を示す疾病の治療のためのかかる薬剤の使用もまた提供される。本発明はまた、タンパク質のリン酸化、遺伝子発現および／またはタンパク質合成が異常を示す病状の治療用医薬の製造におけるSAPK3の使用を提供する。 SAPK3の活性に影響を及ぼし得る薬剤を同定する方法(in vitroまたはin vivo) であって、 a.SAPK3の基質の存在下で、試験化合物をSAPK3またはその機能的等価体に曝し； b)基質がリン酸化されたかどうか（さらに所望により、どの程度か）を検出することを含んでなる方法もまた提供される。アッセイ後、基質と結合した、または基質から解離したリン酸塩の存在および／または量の検出は、いずれの従来法により行ってもよい。一般に、検出は、自由溶液中の、または基質に結合した標識（例えば、放射性標識）リン酸塩を用い、次いで、アッセイ前と後で基質と結合した（もしくは基質から解離した）量を比較することにより達成されてよい。試験物質はSAPK3の類似体、イソ型、インヒビターまたはアクチベーターであってよい。基質はミエリン塩基性タンパク質(MBP)またはATF-2などの転写因子を含んでなり得る。ある具体例では、試験物質はそれ自身、基質として作用することができ、かつ、リン酸化されることもできる。従って、この基質は、それ自身がタンパク質のリン酸化、遺伝子発現および／またはタンパク質合成に作用することができるホスファターゼであり得る。アッセイは溶液中で行うことができるが、いくつかのアッセイ構成要素は、ブロッティングメンブランまたはELISA用アッセイプレートなどの表面上に置かれていてもよい。本発明のさらなる態様は、本発明の第１の態様で定義したようなストレス活性化プロテインキナーゼまたはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体、誘導体もしくは断片の融合体(SAPK4)、あるいはSAPK3またはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその(SAPK3)変異体、誘導体もしくは断片の融合体の活性に影響を及ぼし得る薬剤を同定する方法であって、 a)SAPK4またはSAPK3をSKK3に曝し； b)それぞれSAPK4またはSAPK3の基質の存在下で、試験物質をSAPK4またはSAPK3に曝し； c)基質がリン酸化されたかどうか（さらに所望により、どの程度か）を検出することを含んでなる方法におけるSKK3の使用にある。なおさらなる態様は、請求項１で定義されたストレス活性化プロテインキナーゼまたはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体、誘導体もしくは断片の融合体(SAPK4)、あるいはSAPK3またはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体、誘導体もしくは断片の融合体(SAPK3)を活性化する方法であって、SAPK4またはSAPK3をSKK3とともにインキュベートすることを含んでなる方法にある。 SKK1およびSKK3が、SAPK3およびSAPK4の活性化に関する機能的等価体であり得、かつ、SKK3の代わりにSKK1を用いてもよいことが認識されるであろう。SKK3を用いることが好ましい。 SKK3またはSKK1が精製されていてもよいことが認識されるであろうし；SKK3またはSKK1は精製されていることが好ましい。さらに、SKK3またはSKK1が組換え体であってもよいことが認識されるであろう。本発明のさらなる態様では、ヒトまたは非ヒト（好ましくは哺乳類）動物の身体の治療方法であって、SAPK3、その類似体、阻害剤、刺激剤またはその機能的等価体を身体に投与することを含んでなる方法を提供する。この方法は、好ましくは、遺伝子転写因子の活性に作用することにより、治療される身体での遺伝子発現の調節に作用する。本発明はまた、SAPK3、その類似体、阻害剤、刺激剤または機能的等価体と相互作用することにより、遺伝子発現および細胞調節に作用することができる治療薬を提供する。かかる治療薬は、抗炎症薬として、および／または免疫抑制剤、抗アポトーシスおよび抗癌剤として効果がある可能性がある。以下に記載する組換えポリヌクレオチドを用いて、当該技術分野で十分に公知のタンパク質工学および位置指定突然変異誘発変異体に関する方法を使用して変異体（自然に生じてもよいし、そうでなくともよい）を作製してもよい。「プロテインキナーゼの断片」により、発明者らは、活性を保持しているか、または他のいくつかの方法、例えば、抗体の作製もしくは結合アッセイにおける使用に有用ないずれの断片をも含める。「プロテインキナーゼの融合体」により、発明者らは、他のいずれのポリペプチドと融合したプロテインキナーゼをも含める。例えば、このプロテインキナーゼは、プロテインキナーゼの精製を助けるための、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)またはタンパク質Aなどのポリペプチドと融合していてもよい。同様に、このプロテインキナーゼは、His₆などのオリゴ-ヒスチジンタグと、または十分に公知のMycタグエピトープなどの抗体により認識されるエピトープと融合していてもよい。このプロテインキナーゼ変異体、断片または誘導体のいずれとも融合体も本発明の範囲内に包含される。以下、図面および実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定するものではない。図１は、ヒトSAPキナーゼ-4のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示している。ヌクレオチドは5'から3'方向に番号を付け、アミノ酸はヌクレオチド配列の上に１文字コードで示している。フレーム内終結コドンはアステリスクでマークしている。図2は、ヒトSAPK4、ヒトSAPK3(Goedert et al，1997)(ERK6およびp38γとも呼ばれる）、ヒトSAPK2a(Lee et al，1994)(p38、p40、RK、CSBP2、Mxi2およびXMp k2とも呼ばれる）、ヒトSAPK2b（p38βとも呼ばれる）およびS.セレビシエ由来のHOG1(Brewster et al，1993)の配列比較を示している。アミノ酸を並べ、ギャップを導入して相同性を最大にした。５つの配列のうち少なくとも３つの間でのアミノ酸一致を黒いバーで示している。アステリスクは活性ドメインのTGYモチーフにおける２つのリン酸化部位を示している。ここで示されるSAPK2b配列は、公表されたp38β配列(Jiang et al，1996)とは異なっている（実施例1の考察を参照）。SAPK3(Goedert et al，1997)のアミノ酸配列は、Lechner et al,(199 6)のERK6配列とは13位で、またLI et al，(1996)p38γ配列とは1個のアミノ酸で異なっている。図3は、プローブとして[³²P]標識SAPK4ＤＮＡを用いる、成人ヒト組織由来のポリ(A)⁺ＲＮＡのＲＮＡブロット解析を示している。サイズマーカー(kb)左に記している。レーン：1,心臓；2,脳；3,胎盤；4,肺；5,肝臓；6,骨格筋；7,腎臓； 8,膵臓；9,脾臓；10,胸腺；11,前立腺；12,精巣；13,卵巣；14,小腸；15,結腸； 16,白血球。図４は、KBおよび293細胞において、SAPK4がサイトカイン類および細胞ストレスにより活性化されることを示している。KB細胞は、「方法」に記載したように、mycエピトープタグ付きSAPK4をコードするＤＮＡ構築体で一時的にトランスフェクトした。細胞はDMEM中で、0.5Mソルビトール、1mM H202、20ng/ml IL1α、0 .5mM亜砒酸ナトリウム、100ng/ml TNFα、100ng/ml EGFまたは300ng/ml TPAで15 分間；10μｇ/mlアニソマイシンで30分間、または100ng/ml IGF-1で10分間刺激した。UV照射は60J/m²で行い、30分後に細胞を溶解した。刺激後、mycエピトープタグ付きSAPK4を、モノクローナル抗体9E10を用いて細胞溶解液から免疫沈降させ、次いで、実施例１の「材料および方法」で示したように、基質としてMBP を用いてキナーゼ活性を測定した。結果は、４実験の平均±SEMとして示されている。図5は、KB細胞においてSKK3が主要なSAPK4アクチベーターであることを示している。休止KB細胞（Aの白丸）からの細胞溶解液(0.6mgタンパク質)または10μｇ /mlアニソマイシンで30分間（AおよびＢの黒丸）、または20ng/ml IL1αで15分間（Cの黒丸）で刺激した細胞をMono Sでのクロマトグラフィーにかけ、次いで、ＳAPK2aのアクチベーター(A)またはSAPK4のアクチベーター(BおよびC)を「方法」に記載したようにアッセイした。(B)および(C)で見られるSAPK4アクチベーターピークからのアリコートを、抗MKK6抗体を用い、従前に記載されたように(Cue nda et al，1996)免疫沈降させ、次いで、上清中に残留しているSAPK4アクチベーターをアッセイした(BおよびCの白三角)。同様の結果が３つの異なる実験で得られた。図6は、SKK3によるSAPK4およびSAPK2aのリン酸化および活性化を示している。 (A)GST-SAPK4(0.5μＭ)白丸)またはアフリカツメガエルSAPK2a相同体であるMalE -Mpk2(0.5μＭ、黒丸)を100U/ml SKK3を用いてリン酸化し、次いで、非標識ATP およびSAPK活性を、基質としてMBPを用い、示された時間で測定した。(B)GST-SA PK4、不活性突然変異体GST-SAPK4(D168A)およびMalE-Mpk2を、[³²P]ATPを用いる以外は(A)と同様に2時間リン酸化した(Cuenda et al，1997)。反応物のアリコートを、1mlの20％（重量）TCAの添加により沈殿させ、この懸濁液を13000xgにて5 分間遠心分離し、次いで、このペレットを20%（重量）TCAで3回、水で5回洗浄して乾燥させた。次いで、このサンプルを6M HCl中、110℃にて90分間インキュベートし、pH3.5にて薄層セルロース上で電気泳動にかけてホスホセリン(pS)、ホスホスレオニン(pT)およびホスホチロシン(pY)を分離し、オートラジオグラフィーにかけた。図7は、SKK1(MKK4)によるSAPK4およびSAPK2aの活性化を示している。GST-SAPK 4(0.5μＭ、白丸)またはアフリカツメガエルSAPK2a相同体であるMalE-Mpk2(0.5 μＭ、黒丸)を100U/ml SKK1とともにインキュベートし、次いで、非標識ATPおよびSAPK活性の発生を、基質としてMBPを用いて示された時間で測定した。図8は、SAPKA2a、SAPK2bおよびSAPK4によるMAPKAP-K2およびMAPKAP-K3の活性化を示している。(A)GST-MAPKAP-K2(5-400)または(B)GST-MAPKAP-K3(0.2mg/ml) を非標識ATPおよび5U/mlのアフリカツメガエルSAPK2a相同体（黒丸）、5U/mlのS APK2b（黒三角）または5U/mlのSAPK4（白丸）とともにインキュベートし、次いで、MAPKAP-K2/K3活性を「方法」に記載したように示された時間で測定した。SA PK2a、SAPK2bまたはSAPK4を除いた場合、GST-MAPKAP-K2(5-400)またはMAPKAP-K3 のリン酸化または活性化は見られなかった。図9は、SAPK2a、SAPK2b、SAPK3およびSAPK4に対するSB 203580またはSB 20219 0の効果を示している。アフリカツメガエルSAPK2a相同体（黒丸）、ヒトSAPK2b （白丸）、ヒトSAPK3（黒丸）およびヒトSAPK4（白三角）は、図7と同様、in vi troにてSKK3で活性化し、次いで、示された濃度のSB 203580またはSB 202190とともに10分間インキュベートした後、アッセイした。結果は、阻害剤を除いた対照インキュベーションと比較して示されている。図10は、哺乳類MAPキナーゼおよびSAPキナーゼシグナル伝達経路の略図を示す。成長因子またはホルボールエステルでの刺激の後、MAPキナーゼキナーゼMKK1 およびMKK2（MEK1およびMEK2とも呼ばれる）は、MAPキナーゼのERK1およびERK2 基を活性化する。ERK1およびERK2（それぞれp44およびp42MAPキナーゼとも呼ばれる）は、プロテインキナーゼMAPKAP-K1（p90^rskとも呼ばれる）および転写因子Elk-1をはじめとする多くの基質をリン酸化する。いくつかの細胞のバックグラウンドにおいては、前炎症性サイトカイン類および細胞ストレスも、たとえ成長因子やホルボールエステルよりも弱いものであっても、MAPキナーゼ経路を活性化する（括弧によいｒ表示）。SAPキナーゼ(SAPK)経路は、前炎症性サイトカイン類および多数のストレス性刺激により、強力に活性化される。いくつかの細胞においては、それらはまたある成長因子（括弧により表示）により、より弱く活性化される。SAPキナーゼキナーゼSKK1（MKK4およびSEK1とも呼ばれる）は、転写因子c-Junをリン酸化するSAPK1（SAPKまたはJNKとも呼ばれる）を活性化する。高い相同性を有するSAPK1イソ型は、3つの異なる遺伝子の産物である。SAP キナーゼキナーゼSKK2（MKK3とも呼ばれる）は、SAPK2a（p38、RK、CSBPおよびMxi2 とも呼ばれる）を活性化する。SAPキナーゼキナーゼSKK3（MKK6またはMEK6とも呼ばれる）は、SAPK2a、SAPK2b（p38βとも呼ばれる）、SAPK3（ERK6およびp38 γ）およびSAPK4を活性化する。SAPK1、SAPK2aおよびSAPK3のその他の形態は、選択的なｍＲＮＡのスプライシングにより生じる。特異的阻害剤SB 203580を用いた研究では、SAPK2a（およびおそらくはSAPK2b）はプロテインキナーゼMAPKAP -K2/3およびMnk1/2、ならびに転写因子CHOPおよびElk-1をリン酸化することが示されている。なぜATF2がSAPK2aおよびSAPK2bに対する生理学的基質ではあり得ないかという理由は本明細書中に示され、従って、この転写因子はin vivoでSAPK1 、SAPK3および／またはSAPK4によりリン酸化され得る。SKK1は、in vitroおよびトランスフェクション実験においてSAPK2aおよびSAPK2bを活性化するが、in viv oではこれらの酵素を活性化するとは考えられない。SKK1はまた、in vitroにおいてSAPK3およびSAPK4を弱いながら活性化するが、トランスフェクション実験では活性化しない。酸化ストレスおよび浸透圧ストレスは、MEK5により活性化されると確信されているSAPK5（BMK1とも呼ばれる）を活性化するが、これはまだ直接的には示されていない（波線の矢印により表示）。疑問符は、与えられたSAPK がin vitroで標的タンパク質をリン酸化するが、現在のところin vivoにおけるこれに対応する働きに対する証拠はない。SAPK1はinvitroでリン酸化するが、El k-1のリン酸化およびc-fosの転写がSB 203580およびPD 098059により完全に抑制されるので、これはin vivoにおけるこのタンパク質のリン酸化の律速ではない( Hazzalin et al，1996；Price et al，1996)。MKK1(Alessi et al，1995a)の活性化の特異的阻害剤であるPD 098059は、ERK1およびERK2の活性化を妨げる。図11。KBおよび293細胞において、SAPK3はサイトカイン類および細胞ストレスにより活性化される。KB細胞(A)または293細胞(B)を、mycエピトープタグ付きSA PK3を発現するＤＮＡ構築体で一時的にトランスフェクトした。DMEM中の細胞を0 . 5Mソルビトールで（浸透圧ショック）、20ng/ml IL-1α、100ng/ml TNFa、0.5mM 亜砒酸ナトリウム（化学ストレス）、100ng/mlのEGFまたは300ng/ml TPAで15分間、または10mg/mlアニソマイシンで30分間、または100ng/ml IGF-1で10分間刺激した。細胞のUV-C照射は60J/m²（KB細胞）または200J/m²（293細胞）にて行い、次いで、この細胞を溶解前にさらに37℃にて30分間放置した。mycエピトープタグ付きSAPK3を、9E10モノクローナル抗体を用いて細胞溶解液から免疫沈降させ、次いで、基質としてMBPを用いてアッセイした。図は、各刺激に応答したSAP K3の活性化倍率を示しており、結果は3実験についての±SEMで表されている。UV -C照射後の抽出物におけるSAPK3活性は0.18U/mg（KB細胞）および0.1U/ml（293 細胞）であった。イムノブロッティング実験では、SAPK3が各実験で同レベルで発現したことが示された。図12。293細胞において、SKK3はSAPK3の主要なアクチベーターである。刺激を受けていない293細胞（白丸）、または0.5Mソルビトールで15分間浸透圧ショックを受けた細胞（黒丸）からの細胞溶解液（0.8mgタンパク質）を、Pharmacia S mart System(Cuenda et al，1995)を用い、MonoＳ(5x0.16cm)でのクロマトグラフィーにかけた。この画分を、「方法」に記載したように、SAPK2(A)または(C) のアクチベーターに関してアッセイした。波線はNaCl勾配を示す。3回の異なる実験から同様の結果が得られた。Aからの2つの主要なSAPK2アクチベーター(IおよびII)を別個にプールし、次いで、抗MKK6抗体、抗MKK4抗体または抗MKK3抗体を用いて免疫沈降させた。パネルBは、抗体を除いた場合の対照インキュベーション(100％）と比較において、適切な競合ペプチド抗原(0.6mM)の存在下(+)または不在下(-)での免疫沈降後、上清に残留するSAPK2アクチベーターの量を、パネルDは上清中に残留するSAPK3アクチベーターの量を示している。結果は、3回の別々の実験についての平均値±SEMを表してる。図13。KB細胞において、SKK3はSAPK3の主要なアクチベーターである。Aおよび B;刺激を受けていないKB細胞（白丸）、または0.5Mソルビトールで刺激した細胞（白丸）からの細胞溶解液（0.4mgタンパク質）を、Mono Sでのクロマトグラフィーにかけ、次いで、この画分をSAPK2(A)のアクチベーターまたはSAPK3(B)のアクチベーターに関してアッセイした。各画分のアリコートを、抗MKK6抗体を用いて免疫沈降させ、次いで、この上清をSAPK3のアクチベーター（白三角）に関して再びアッセイした。刺激を受けなかった細胞ではSAPK3アクチベーターは検出されなかった（図1Aを参照）。波線はNacl勾配を示す。3回の異なる実験で同様の結果が得られた。(C)細胞を、ソルビトールの代わりに10μｇ/mlアニソマイシンで30分間刺激し、次いで、SKK3の免疫沈降の前（黒丸）と後（白三角）に、SA PK3アクチベーターに関してアッセイした。図14。トランスフェクトされた細胞において、SKK3はSAPK3を活性化する。COS -1細胞をSAPK3を発現するＤＮＡで一時的にトランスフェクトするか、またはSKK 3もしくはMEKキナーゼ(MEKK)のいずれかで同時トランスフェクトした。細胞をDM EM中で、0.5Mソルビトールで15分間刺激した。刺激および細胞溶解後、SAPK3を、SAPK3のＣ末端16残基に対して作製した抗SAPK3抗体を用いて、細胞溶解液から免疫沈降させ（「方法」を参照）、次いで、基質としてMBPを用い活性を測定した。図は、SAPK3単独でトランスフェクトされた、刺激を受けなかった細胞との比較において、ソルビトールおよび／またはSKK3での同時トランスフェクションに応答したSAPK3の活性化倍率を示している。図15。精製SKK3によるSAPK3およびSAPK2のリン酸化および活性化。(A)GST-SAP K3(0.5μＭ)および(B)アフリカツメガエルSAPK2相同体(MalE-Mpk2、0.5μＭ)を非標識MgATPおよび100U/ml SKK3とともにインキュベートし、次いで、活性の発生（黒丸）を基質としてMBPを用い、示された時間で測定した。SKK3が最初にPP2 Aで不活性化された場合には（白丸）、GST-SAPK3またはMalE-Mpk2のいずれかの活性を生じることはなかった。GST-SAPK3またはMalE-Mpk2のリン酸化（白三角）は、 [γ-³²P]ATP(10⁶cpm/nmol)を用いる並行インキュベーションで、またAから15および120分時点(C)で測定し、Bは6M HCl中で110℃にて90分間部分加水分解し、pH 3.5にて薄層セルロース上で電気泳動し、次いで、オートラジオグラフィーにかけてホスホセリン(pS)、ホスホトレオニン(pT)およびホスホチロシン(pY)を同定した。(D)野生型SAPK3を、Asp-171がAlaに変化したキナーゼ不活性変異体に置き換えた以外は、Cと同じ120分時点。図16。SKK1(MKK4)のよるSAPK3およびSAPK2の活性化。GST-SAPK3(0.5mM、白丸) またはアフリカツメガエルSAPK2相同体のMalE融合タンパク質(0.5μＭ、黒丸)を、非標識MgATPおよび100U/ml SKK1とともにインキュベートし、次いで、活性の発生基質としてMBPを用い、示された時間で測定した。図17。SAPK3およびSAPK2によりリン酸化されたATF2上の部位の同定。GST-SAPK 3およびアフリカツメガエルSAPK2相同体をMBSに対する活性に関して合わせ、次いで、各酵素(0.4U/ml)を、1mM野生型(WT)または変異体GST-ATF2(19-96)およびM g[γ-³²P]ATPとともに全溶量50mlで、30℃にて30分間インキュベートした。反応は5mlの6%（重量）SDSの添加により停止させ、次いで、このサンプルを10% SDS/ ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動にかけ、オートラジオグラフィーにかけた。略号：T69T71，Thr-69およびThr-71がAlaに変異した突然変異体；T69T71S90， Thr-69、Thr-71およびSer-90がAlaに変異した突然変異体；S90，Ser-90がAlaに変異した突然変異体。図18。SAPK2およびSAPK3によるMAPKAP-K2およびMAPKAP-K3の活性化。(A)GST-M APKAP-K2(46-400)、(B)GST-MAPKAP-K3または(C)GST-MAPKAP-K2(5-400)(0.2mg/ml )を、非標識MgATPおよび0.3U/ml SAPK2（黒丸）または0.3U/mlSAPK3（白丸）とともにインキュベートし、次いで、示された時間で活性を測定した。SAPK2およびSAPK3を除いた場合、MAPKAP-K2またはGST-MAPKAP-K3のリン酸化または活性化は認められなかった。図19。SAPK3およびSAPK2の活性化に対するSB 203580の効果。SAPK3（白丸）およびSAPK2（黒丸）をin vitroで精製SKK3を用いて活性化させ（図5）、次いで、示された濃度のSB 203580の存在下でアッセイした。結果は、阻害剤を除いた対照インキュベーションと比較して表されている。実施例1：サイトカイン類および細胞ストレスによる新規ストレス活性化プロテインキナーゼSAPK4の活性化はSKK3(MKK6)により仲介される；他のSAPキナーゼとのその基質特異性の比較要約そのアミノ酸配列が、活性化ドメインにTGYモチーフを含む他の3種のSAPキナーゼの配列とおよそ60%一致する新規MAPキナーゼファミリーのメンバーである、ヒト・ストレス活性化プロテインキナーゼ4(SAPK4)をコードするｃＤＮＡをクローン化した。SAPK4をコードするｍＲＮＡは、ヒト組織中に広く分布していることが見出された。KB細胞で発現させる場合、SAKP4は、他のSAPKと同様に、細胞ストレスおよび前炎症性サイトカイン類に応答して活性化された。in vitroにおいてSAPK4は、SKK3（MKK6とも呼ばれる）により、またはCOS細胞中へSKK3とともに同時トランスフェクトした場合に活性化された。SKK3は、KB細胞を細胞ストレスに曝すか、またはインターロイキン-1で刺激した場合に誘導される、SAPK4の唯一のアクチベーターであった。これらの発見は、SKK3がSAPK4の活性化を仲介することを示すものである。in vitroにおけるSAPK4の基質特異性は、実施例４に示したSAPK3のそれと同様であった。両酵素は、転写因子ATF2、Elk-1およびSA P-1を同じ速度でリン酸化したが、MAPKAPキナーゼ-2およびMAPKAPキナーゼ-3の活性化においては、SAPK2a（RK/p38とも呼ばれる）またはSAPK2b（p38βとも呼ばれる）よりも効果は遥かに低かった。SAPK1（LNKとも呼ばれる）とは異なり、 SAPK3およびSAPK4は、c-Junの活性化ドメインリン酸化しなかった。SAPK2aおよびSAPK2bとは異なり、SAPK4およびSAPK3は、薬剤SB203580およびSB 202190により阻害されなかった。発明者らの結果は、以前にSAPK1および／またはSAPK2によるものとした細胞機能が、SAPK2またはSAPK4により仲介され得ることを示唆している。材料および方法材料 SB 203580およびSB 202190は、Dr JohnLee(SmithKline Beecham，King of Pru ssia，PA，USA)からの好意により譲渡されたものであり、DMSOに溶解させた。抗 MKK6抗体（ヒトMKK6のN末端付近の配列に相当するペプチドCNPGLKEAFEQPQTSに対して作製）を従前に記載したように作製、精製した(Cuenda et al，1996；Meier et al，1996)。MalE-Mpk2、アフリカツメガエルSAPK2a相同体(Rouse et al，19 94)およびラットGST-SAPK3（実施例4およびCuenda et al，1997）を従前に記載したように大腸菌(E.coli)で発現させ、精製した。他の総ての材料、酵素、融合タンパク質および方法の供給源は、実施例4またはCuenda et al(1997)に与えられている。ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定 SAPK2b(p38β，Jiang et al，1996)の一部をコードするESTクローン156272(Ge nBank number R72662)由来のNatI/EcoRI挿入配列をプローブとして用い、高ストリンジェンシー下で、ヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリー(Clontech，Palo Alto， CA)をスクリーニングした。2x10⁶のファージをスクリーニングした後に、いくつかの部分ERK5クローン、そのいくつかは全長であった多数のSAPK2bクローンおよび１つの部分SAPK4クローンが得られた。配列決定後、SAPK4挿入配列をプローブとして用いて、高ストリンジェンシー条件下で、下垂体ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。3x10⁶のプラークをスクリーニングした後、全16個のハイブリダイゼーション陽性クローンが得られ；それらを単離し、EcoRI挿入配列をM 13mp18中へサブクローニングし、次いで配列決定した。16クローンのうち3 つが全長であった。配列決定は、合成オリゴヌクレオチドを用いて手動で、また蛍光プライマーを用いてApplied Biosystems 377 DNAシーケンサーでも行った。全長配列は、ｃＤＮＡクローンhSAPK412の両鎖から作出した。ブラストアルゴリズム(blast algorithm)(blast@ncbi.nlm.nih.gov)を用い、NCBI配列のデータベースを検索した。SAPK4、SAPK3、SAPK2a、SAPK2bおよびHOG1の重複配列が視認により構築された。ＲＮＡブロットアッセイＲＮＡブロットは、レーンにつき2μｇのポリ(A)⁺ＲＮＡを用い、Clontech製のヒト・マルチプル・ティッシュ・ノーザンブロット(human multiple tissue N orthern blots)を使用して行った。プローブは、ランダムプライミングにより[³ ² p]dCTPで標識し、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズさせた。SAPK4 プローブはｃＤＮＡクローンhSAPK412のゲル精製した挿入配列から調製した。ヒトβ-アクチンプローブはClontechから購入した。 SAPK2b、SAPK3およびSAPK4発現プラスミド細菌での発現のためには、ヒトｃＤＮＡクローンhSAPK2B2、hSAPK32およびhSA PK412のオープンリーディングフレームをPCRにより増幅し、EcoRI断片として発現ベクターpGEX4T-1(Pharmacia)中へサブクローニングし、次いで、大腸菌株BL2 1(DE3)中に形質転換した。形質転換細菌を、600nmにて吸収0.6まで増殖させ、0. 4mMイソプロピル-1-チオ-β-ガラクトピラノシド(IPTG)を用いて誘導した。ヒト GST-SAPK2b、GST-SAPK3およびGST-SAPK4は、グルタチオン-アガロース上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。c-mycエピトープタグ付きSAP K4の発現のためには、PCRを用いてSAPK4のカルボキシ末端に、アミノ酸配列MEQK LISEEDLNをコードするヌクレオチド配列を導入し、停止コドンがこれに続く。得られたEcoRI/NotI断片を哺乳類発現ベクターpcＤＮＡ３.1(Invitrogen)中へサブクローニングした。キナーゼ不活性化突然変異体を作製するためのSAPK4におけるAsp-168のAlaによる置換は、位置指定突然変異誘発により行った。PCR断片はＤＮＡ配列決定により確認された。COS1細胞へのトランスフェクションは、実施例4およびCuenda et al，1997に記載のように行った。プロテインキナーゼアッセイ SAPK4、SAPK2aおよびSAPK2bは、厳密に実施例4およびCuenda et al，1997にSA PK3に関して記載したように、MBPのリン酸化により慣例的にアッセイした。１ユニットの活性とは、１分間に1nmolのリン酸塩をMBPへ組み込んだ酵素量であった。SAPK4アクチベーターは、実施例4およびCuenda et al，1997にGST-SAPK3に関して記載したように、それらのGST-SAK4を活性化する能力によりアッセイした。 GST-SAPK4を除いた対照実験を行った。１ユニットのSAPK4アクチベーターとは、 SAPK4活性をIU／分だけ増強した量であった。MAPKAP-K2およびMAPKAP-K3は、基質としてペプチドKKLNRTLSVAを用いてアッセイし(Stokoe et al，1993)、１ユニットの活性とは、１分に1nmのペプチド基質のリン酸化を触媒した量であった。S APK2aアクチベーターは、アフリカツメガエルSAPK2a相同体(Meier et al，1996) を活性化するそれらの能力によりアッセイした。活性化されたSAPK2a自身は、GS T-MAPKMLK2(46-400)の活性化により測定した。SB 203580およびSB 202190の効果を研究する場合には、総ての実験にDMSOが存在した。この濃度のDMSOは、約10% まで各々のSAPKを阻害した。 SAPK4の免疫沈降 mycエピトープタグ付きSAPK4でトランスフェクトされた細胞溶解物を4℃にて１0分間13000xgで遠心分離した。上清のアリコート（100μｇタンパク質）を、c -mycエピトープを認識する3μｇのモノクローナル抗体9E10と結合した5μｌのタンパク質G-Sepharoseとともに、振盪プラットフォーム上で2時間インキュベートした。免疫沈降物を、実施例4およびCuenda et al，1997に記載したように洗浄、アッセイした。結果ヒトSAPK4の分子クローニング SAPKファミリーの新規メンバーを同定するために、発明者らは、ヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして、SAPK2b(p38β )のタンパク質をコードするESTクローン156272(GenBank number R72662)を用いた。陽性クローンの配列決定によいり、別個の3つの配列が示された。第１のセットのクローンはERK5(Zhou et al，1995)[BMK1(Lee et al，1995)とも呼ばれる ]のタンパク質をコードしており、一方、第２のセットは新規形態のp38β（考察を参照）をコードしていた。第３のセットのクローンは、配列が公知のSAPKの配列と類似してはいるが異なっているタンパク質をコードしており、これが結果的にストレス活性化プロテインキナーゼ-4(SAPK4)と名付けられた。ヒトSAPK4のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列は図1に示されている。オープンリーディングフレームは、42kDaの推定分子量を有する、365個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしている。それはプロテインキナーゼに特有な保存されたアミノ酸ドメイン(I-XI)を有し、SAPK3と64%の一致、SAPK2aと59%の一致、SAPK2bと58%の一致、S.セレビシエ由来のHOG1と42%の一致(図2)、SAPK1と45%の一致、またp42MAP キナーゼと41%の一致を示している。サブドメインVIIIの残基Thr180およびTry18 2は、酵素活性のためにリン酸化が求められる、公知のMAPキナーゼおよびSAPキナーゼにおけるTEY、TPYおよびTGY配列と同じ位置にある。SAPK4は、SAPK2a、SA PK2b、SAPK3およびHOG1とTGY配列を共有する(図2)。さらに、SAPK2a、SAPK2b、S APK3およびHOGIにおけるのと同様、サブドメインVIIはたった6個のアミノ酸によって、サブドメインVIIIの活性化領域から分断されているが(図2)、このギャップは、SAPK1では8残基であり、MAPキナーゼでは12残基を超える。ヒト組織におけるSAPK4 ｍＲＮＡの組織分布は、ＲＮＡブロッティングによりアッセイした( 図3)。[³²P]標識SAPK4 ｃＤＮＡのマルチプル・ティッシュ・ノーザンブロットへのハイブリダイゼーションでは、およそ2.3kbの転写物が、種々のレベルではあるが、実験した16種の組織のほとんどに存在していたことが示された(図3)。最高レベルは膵臓、精巣、小腸および前立腺で検出された。ブロットのβ-アクチンに対するプローブとのハイブリダイゼーションでは、ほぼ同じＲＮＡ含量が示された（データ省略）。 SAPK4は細胞ストレスおよびサイトカイン類により活性化される SAPK4は、前記のように細胞ストレスおよびサイトカインIL1により活性化される酵素であるTNFSAPK3、SAPK2aおよびSAPK2bに最も密接に関連している。従って発明者らは、同じ刺激がSAPK4を活性化するかどうかを検討した。ヒト上皮KB細胞をmycエピトープタグ付きSAPK4で一時的にトランスフェクトし、細胞ストレスまたはサイトカイン類に曝した後に、酵素を免疫沈降させ、アッセイした。これらの実験では、SAPK2a、SAPK2bまたはSAPK3の活性化を引き起こす刺激はまた、S APK4を活性化するが(図4)、SAPK2a、SAPK2bまたはSAPK3を活性化しない刺激（インスリン様成長因子-1(IGF-1)およびホルボールエステル類など）はまたSAPK4を活性化できない(図4)ことが示された。上皮細胞におけるSAPK4の主要なアクチベータ−としてのSKK3の同定発明者らはこれまでに、いくつかの方法で、またはIL1による刺激でストレスを受けたKB細胞由来の細胞溶解物のMono Sクロマトグラフィー後に検出されるSA PK2aアクチベータの、SKK3は95%を占め、SKK2は5%を占めることを示した(Cuenda et al，1996;Meier et al，1996)。図5に示したように、KB細胞を、IL1またはM ono S上でSKK3とともに移動したタンパク質合成阻害剤アニソマイシンで処理した後に検出されたSAPK4の単一ピークを、抗MKK6抗体によって定量的かつ特異的に沈降させた。この実験はまた、これらの刺激によりKB細胞で活性化され、かつ、SKK3よりも高濃度NaClでMono Sから溶出するSKK4およびSKK5(Meier et al，19 96)はSAPK4を活性化しないことを証明した。SKK3はまた、KB細胞に、ソルビトールを用いた浸透圧ストレスをかけた後、SAPK4の唯一のアクチベーターであった（データ省略）。SKK3はin vivoでSAPK4を活性化することができるというさらなる証拠は、COS細胞中への同時トランスフェクションにより得られた。SAPK4活性は、SKK3との同時発現により12.5±0.63倍と評価された(n=3)。これに対し、SAPK4 は、MEKキナーゼがCOS細胞における内生SKK1を活性化した条件下での、MEKキナーゼとの同時トランスフェクションによっては有意に活性化されなかった（データ省略）。 in vitroにおけるSKK3によるSAPK4の活性化 SAPK4は、in vivoで骨格筋由来のSKK3の高精製調製物により活性化されたが( 図6)、p42 MAPキナーゼが最大に活性化された条件下で、MKK1によっては活性化することはできなかった（データ省略）。SAPK4およびSAPK2aの両酵素は、2時間後、ミエリン塩基性タンパク質(MB P)に対し同じ固有活性に達したが、SKK3によるSAPK4の活性化は、SAPK2aのそれより2〜3倍遅く生じた(図6)。MBPに対するSAP K2aおよびSAPK4の活性は、この基質に対するp42 MAPキナーゼの活性より25〜50 倍低い(Stokoe et al，1992a)。SAPK3の活性化同様、SAPK4の活性化（実施例４およびCuenda et al，1997）は〜1.6mol/サブユニットmolで平衡状態に達し（デ −タ省略）、同等量のホスホチロシンおよびホスホトレオニンの発生を伴っていた(図6B)。興味深いことに、SAPK4はまた、SAPK3と同等、しかしSAPK2aとは異なって、セリン残基でリン酸化されていた。野生型SAPK4を触媒として不活性なSAP K4-D168A突然変異体に置き換えた場合には、このようなことは起こらず(図7B)、このことはセリンのリン酸化が、活性化された後のSAPK4自身により触媒されることを示している。興味深いことに、不活性なSAPK4突然変異体はチロシンについてリン酸化され得るだけで、トレオニンについてはリン酸化されず、このことは、この突然変異が、SKK3によるSAPK4の認識に作用するコンホメーション変異をもたらしていることを示すものである。 in vitroにおけるSKK1(MKK4)によるSAPK4の活性化 SAPK2はin vitroで、SKK2およびSKK3によりリン酸化されるだけでなく、SKK1( MKK4)によってもリン酸化される（前記参照）。SKK1はサイトカイン類および細胞ストレスにより活性化され、従って、この酵素もまたin vitroでSAPK4を活性化する可能性があるかどうかを検討することは興味深いことである。図7は、SAP K4はin vitroでSKK1によりリン酸化され、活性化されるが、同条件下のSAPK2aよりかなり遅い速度であることを示している。この活性の速度の遅さに合致して、 SAPK4は、SKK1の上流アクチベーターであるMEKキナーゼでのCOS1細胞への同時トランスフェクションの後には活性化されない（データ省略）。このことは、KB細胞抽出物におけるSAPK4活性化活性に対するSKK1の寄与が無視できることと矛盾しない(図5)。 SAPK4の基質特異性とSAPK2aのそれとの比較 SAPK2bおよびSAPK3 グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)を転写因子Elk-1、ATF2、SAP-1、SAP -2およびp53の活性化ドメインに結合させた融合タンパク質のリン酸化において、SAPK4は、SAPK2aまたはSAPK2bより活性が高く、一方、c-Junは3つの酵素によりわずかにリン酸化されたのみであった(表1)。GST-MAPKAP-K2(5-400)および全長GST-MAPKAP-K3の活性化においては、SAPK4はSAPK2aよりはるかに作用が弱く、 MAPKAP-K2およびMAPKAP-K3活性化の初速度および最大活性化の半分の時間は20倍遅かった(図8)。in vitroにおけるSAPK4の特異性は、SAPK3のそれと同様であった（表1；実施例4およびCuenda et al.，1997）。それらの類似したアミノ酸配列と一致して（図2）、SAPK2aおよびSAPK2bの基質特異性は実質的には区別ができない（表1、図8）。表1．SAPK4の基質特異性のSAPK2a、SAPK2bおよびSAPK3の基質特異性との比較実験は、アフリカツメガエルSAPK2a相同体、ヒトSAPK2bおよびヒトSAPK4を用いて行った。SAPKはin vitroで活性化させ（図7）、各タンパク質のリン酸化はS APK濃度0.15U/mlにて試験した。結果は6回の測定（2回の独立した実験）の平均 ±SEMで表した。ラットSAPK3のデータは実施例4およびCuenda et al(1997)から取った。 SAPK4はSB 203580またはSB 202190により阻害されない。 SAPK3同様、in vitroにおいてSKK3により活性化された細菌により発現したSAP K4は、SB 203580またはSB 202190により阻害されなかった（図9）。これに対し、SAPK2aおよびSAPK2bは、0.3〜0.6μＭの類似するIC₅₀値を有する両薬剤により阻害された（図9）。SB 203580およびSB 202190はまた、リン酸化型の0.1%以上の活性を有するSAPK3およびSAPK4の脱リン酸化型を阻害しなかった（データ省略）。さらに、SB 203580はKB細胞の浸透圧ショックによっては、トランスフェクトされたSAPK3の活性化を妨げなかった。考察本実施例において、発明者らはそのｍＲＮＡが広く発現し、かつ、そのアミノ酸配列がSAPK2a、SAPK2bおよびSAPK3と約60%一致する新規MAPキナーゼファミリーのメンバーである、ヒトSAPK4をコードするｃＤＮＡのクローニングを報告する。さらに、SAPK2a、SAPK2bおよびSAPK3同様、SAPK4はサブドメインVIIおよびサブドメインVIIIの活性化ループの間に二重のTGYリン酸化モチーフおよび6個のアミノ酸挿入を含む。SAPK4はSAPK1（45%の一致）およびp42/p44 MAPキナーゼ（ 41%の一致）とはあまり類似していない。本研究中、発明者らはまた、SAPK2bのいくつかのｃＤＮＡクローンの配列決定を行った。それらは、公表されているp3 8β配列(Jiang et al，1996)とは2つの点で異なる364個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしていることがわかった。それはキナーゼサブドメインVおよびV I間の8個のアミノ酸配列を欠き、この領域において2個のアミノ酸の相違を示す。結果として、発明者らのSAPK2b配列は、他のSAPキナーゼ配列といずれのギャップも要することなく並ぶ。 SAPK2a、SAPK2bおよびSAPK3に対するそのアミノ酸配列の類似性と矛盾することなく、SAPK4は同様の細胞ストレスおよびサイトカイン類に応答して活性化される。細胞ストレスまたはIL1に曝された上皮KB細胞から調製された抽出液中で検出できたSAPK4の唯一のアクチベーターは、MKK6遺伝子の生成物であるSKK3であった。SAPK4はまた、COS細胞中にSKK3DNAで同時トランスフェクトされた場合に活性化されるようになる。これに対し、SAPK4はin vitroにおいてSKK1(MKK4) によっては十分には活性化されず、SKK1の上流アクチベーターであるMEKキナーゼでの同時トランスフェクション実験において活性化されなかった(Yan et al， 1994)。SAPK4はまた、MKK1、SKK2(MKK3)、SKK4またはSKK5によって活性化されなかった。このように、いくつかの哺乳類細胞系統においてSAPK2a(Cuenda et al ，1996)、SAPK2b(Jiang et al，1996)およびSAPK3(実施例4およびCuenda et al ， 1997)の優先的アクチベーターであるSKK3はまた、SAPK4の主要なアクチベーターであると思われた。マイクロモル以下の濃度でSB 203580またはSB 20190により阻害されるSAPK2a およびSAPK2bとは対照的に、SAPK3およびSAPK4はこれらの薬剤により作用されず；さらに、SB 203580はSAPK3の活性化を阻害しなかった。SB 202190がSAPK3を阻害できなかったということは、細菌により発現したSAPK3の基礎活性がこの薬剤によって阻害されたと報告したLi et al(1996)の研究とは一致しない。発明者らは、発現させたSAPK3の基礎活性またはSKK3でのリン酸化により最大限に活性化されたSAPK3のいずれに対してもSB 203580またはSB 202190の作用を認めることができなかったため、この矛盾の理由は明らかではない。同一の結果が、細菌により発現させたラットSAPK3(実施例４およびCuenda et al，1997)およびヒトSAP K3を用いて得られた。 in vitroにおけるSAPK4基質特異性は、SAPK3のそれに似ており、両酵素は多くのタンパク質（いくつかの転写因子の活性化ドメインを包む）を、SAPK2aおよび SAPK2bと同様の速度でリン酸化したが、それらはMAPKAP-K2およびMAPKAP-K3の活性化においては、SAPK2aまたはSAPK2bのいずれよりもかなり低い作用であった。前記の結果は、検討された総ての哺乳類細胞において、SB 203580がストレスおよびサイトカインが誘導するMAPKAP-K2およびMAPKAP-K3の活性化を80〜95％まで抑制するという所見と一致する(Cuenda et al，1995；Beyert et al，1996；Cli ifton et al，1996；McLaughlin et al，1996)。さらに、SAPK3およびSAPK4はin vitroにおいて転写因子Elk-1の活性化ドメインを有効にリン酸化するものの、i n vivoにおいては、いずれの酵素もElk-1のリン酸化に対する律速ではないと考えられ、これは細胞ストレスにより誘導されるElk-1のリン酸化が、繊維芽細胞系統においてはSB 203580によって(Hazzalin et al,，1996)、あるいはHeLa細胞においてはSB 203580およびPD 98059の組み合わせによって(Price et al，1 996)妨げられるからである。MKK1の活性化の特異的阻害剤であるPD098059(Aless i et al，1995a)は、p42/p44 MAPキナーゼの活性化を妨げる。SAPK3およびSAPK4 の生理学的基質としての候補は、細胞ストレスおよび／または前炎症性サイトカイン類により引き起こされるリン酸化／活性化がSB 203580により妨げられないタンパク質である。かかるタンパク質は転写因子c-Jun、ATF2およびNFKBを含む( Beyaert et al，1996；Hazzalin et al，1996)。しかしながら、c-JunはSAPK3およびSAPK4によりほとんどリン酸化されず、かつ、SAPK1のイソ型はおそらくin v ivoにおいてはこのタンパク質をリン酸化すると考えられる（「序章」を参照）。要約すれば、細胞ストレスおよび／または前炎症性サイトカイン類により活性化されるMAPキナーゼファミリーのメンバーの数は、これまでに明らかになっているものよりずっと多い（図10に化学量論的に示される）。SAPK1、SAPK2a、SAP K2b、SAPK3およびSAPK4に加えて、成長因子により強力に活性化されるp42/p44 M APキナーゼもまた、より弱くはあるが、いくつかの細胞のバックグラウンドで、ストレス性刺激および前炎症性サイトカイン類により活性化される。さらに、MA PキナーゼファミリーのメンバーERK5（BMK1とも呼ばれる）は、浸透圧および酸化ストレスにより活性化される(Abe et al，1996)。これらのMAPキナーゼファミリーメンバーの各々に対する特異的阻害剤の開発は、それらの生理学的役割の解明を大いに助けるであろう。実施例2：プロテインキナーゼアッセイ SAPK4は慣例的にMBPのリン酸化によってアッセイする。SAPK4(0.5または1μＭ )は、10μｌの50mM酢酸マグネシウム-0.5mM[γ-³²P]ATPで反応を開始させる前に、40μｌの25mM Tris/HCl pH7.5、0.1mM EGTA、0.1mMオルトバナジウム酸ナトリウム、1μＭ PKIおよび0.33mg/ml MBP中で30℃にて３分間インキュベートする。 30℃にて20分後、40μｌアリコートを採取し、1.5x1.5cm角のWhatman P81ホスホセルロースペーパー上にスポットし、75mMリン酸中に浸漬した。このペーパーを洗浄、乾燥後(Alessi et al，1995 Meth．Enzymol．255，279-290)、MBP中へ組み込まれた³²P放射活性を測定する。１ユニットの活性は、1分にMBS中へ1nmolのリン酸塩を組み込む酵素量である。 SAPK4アクチベーターは、それらのGST-SAPK4を活性化する能力によりアッセイする。15μｌ Mono S画分を、50mM Tris/HCl pH7.5、0.1mM EGTA、0.03%（重量）Brij-35、0.1%（容量）2-メルカプトエタノールおよび5%（容量）グリセロール中で、2.5μｌの10μＭ GST-SAPK4とともに30℃にて３分間インキュベートし、次いで、2.5μｌの80mM酢酸マグネシウム-0.8mM非標識ATPで反応を開始させる。30分後、アリコート(10μｌ)を採取し、前記のようにSAPK4活性に関してアッセイする。インキュベーション混合物からGST-SAPK4を除いた対照実験を行う。１ユニットのSAPK4アクチベーターとは、SAPK4の活性を1U/分だけ増強させる量である。 MAPKAP-K2およびMAPKAP-K3は、基質としてペプチドKKLNRTLSVAを用いてアッセイし(Stokoe et al，1993 Biochem J．296，843-849)、１ユニットの活性とは、 1分に1nmolのペプチド基質のリン酸化を触媒する量である。SAPK2はGST-MAPKAP- K2(46-400)の活性化により、またSAPK2アクチベーターはそれらのMalE-Mpk2（アフリカツメガエルSAPK2相同体）を活性化する能力により測定する(Meier et al, 1996 Eur．J．Biochem．236，796-805)。実施例3：SKK3およびSKK1によるGST-SAPK4の活性化およびリン酸化理論量インキュベーションは25mM Tris/HCl，pH7.5、0.1mM EGTA、1μＭ PKI、0.1% （容量）2-メルカプトエタノール、0.5μＭ GST-SAPK4、精製SKK3またはSKK1（1 00U/ml、単位の定義についてはCuenda et al，1996 EMBO J．15，4156-4164を参照）、10mM酢酸マグネシウムおよび0.1mM ATPを含む。反応は、他の成分を30℃ にて３分間インキュベートした後に、MgATPで開始させる。種々の時間でアリコートを採取し、前記実施例2に記載のようにSAPK4活性に関してアッセイする。SA PK 4のリン酸化の程度を求めるため、非標識ATPを[γ-³²P]ATP(2x10⁶cpm/nmol)に置き換えた並行インキュベーションを行った。種々の時間で反応液のアリコートを、1mlの20%（重量）トリクロロ酢酸(TCA)に加える。13000gにて5分間の遠心分離後、上清を除去し、ペレットを25%TCAで３回洗浄し、次いでCerenkov計数により解析する。リン酸化の理論量は、各融合タンパク質の算出分子量およびBradFord (1976)Anal．Biochem．72，248-254に従い求めたタンパク質濃度を用いて決定した。実施例4：SAPK3の同定材料および方法材料組織培養試薬、ミクロシステイン-LR、リポフェクチン試薬、MBPおよびヒトIG -1は、Gibco-BRL(Paisley，UK)から購入した。タンパク質G-SepharoseはPharmac ia(Milton Keynes，UK)から、ならびに組換えヒトIL-1およびEGFはBoehringerから；アニソマイシン、ソルビトールおよびTNFαはSigma(Poole，UK)から。cAMP- 依存プロテインキナーゼ(TTYADFIASGRTGRRNAIHD)の特異的ペプチド阻害剤である PKIおよび他の全てのペプチドは、MRC Protein Phosphorylation UnitのMr F B Caudwellにより合成された。SB 203580はDr J Lee(SmithKline Beecham，King o f Prussia，USA)から好意により譲渡され、これはジメチルスルホキシドに溶解して最終濃度20mMとした。他の試薬は分析用以上のものであり、BDH Chemicals またはSigma Chemical Co(Poole，UK)から購入した。酵素および転写因子 SKK3はウサギ骨格筋から精製した(Cuenda et al，1996) 。グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質をコードする大腸菌プラスミドは括弧内に示した研究者から好意により提供され、大腸菌で発現させ、次いでグルタチオン-アガロース上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した；GST-MAPKAP-K2(5-400)およびGST-MAPKAP-K2(46-400)(Dr R Ben-L ev y and Dr C Marshall，Institute for Cancer Research，London，Ben Levy et al，1995)、GST-MAPKAP-K3(Dr J Young，SmithKline Beecham，King of Prussia ，USA)、GST-MKK1(Dr C Marshall)、GST-MKK4(Dr J Woodgett，Ontario Cancer Institute，Canada)、GST-SAP1(267-431)、GST-SAP2(221-417)、GST-Elk1(307-4 28)、GST-cJun(1-194)、GST-ATF2(19-96)およびThr-69、Thr-71および／またはS er-90がAlaに変化したGST-ATF2(19-96)の種々の誘導体(Dr N Jones and R Treis man，ICRF，London)。MEKキナーゼのC末端キナーゼドメインを発現するMalE融合タンパク質(MalE-MEKK)およびアフリカツメガエルSAPK2相同体(MalE-Mpk2)は、D r A R Nebreda(EMBL，Heidelberg，Germany)からの好意により譲渡されたものであった。トランスフェクション研究用のMEKキナーゼのC末端キナーゼドメインを発現するＤＮＡ(Olson et al，1995)は、Dr A Ashworth(Institute of Cancer R esearch，London)により提供された。p53(Helps et al，1995)は、MRC Protein Phosphorylation UnitのDr N Helpsにより提供された。 SAPK3 およびSKK3発現プラスミド細菌発現については、ｃＤＮＡクローンrSAPK37のオープンリーディングフレーム(Mertens et al，1996)をPCRにより増幅させ、発現ベクターpGEX-4T1(Pharm acia)中へEcoRI断片としてサブクローニングし、次いで、大腸菌BL21株(DE3)中へ形質転換した。形質転換細菌を600nmにて吸収0.6まで増殖させ、次いで、0.4m Mイソプロピル-1-チオ-b-ガラクトピラノシド(IPTG)とともにインキュベートした。GST-SAPK3は、グルタチオン-アガロース上のアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。トランスフェクションについては、ｃＤＮＡクローンrSAP K37のオープンリーディングフレームをPCRにより増幅させ、次いで、哺乳類発現ベクターpSG5(Stratagene)中へEcoRI断片としてサブクローニングした。別法として、PCRを使用して、停止コドンが続くrSAPK3のカルボキシ末端にc-mycタグME QKLISEEDLNをコードするヌクレオチド配列を導入した。次いで、得られた断片を pSG5へ連結した。ヒトSKK3をコードする細菌発現構築体(Cuenda et al，1996)は Dr A R Nebreda(EMBL，Heidelberg，Germany)からの好意により譲渡されたものであった。ヒトSKK3のオープンリーディングフレームはPCRにより増幅させ、次いで、哺乳類発現プラスミドpcＤＮＡ3.1(Invitrogen)中へHindIII断片としてサブクローニングした。キナーゼ不活性突然変異体を作製するためのSAPK3におけるAsp171のAlaによる置換は、位置指定突然変異誘発により行った。PCR断片はＤＮＡの配列決定により様々である。細胞培養および一時的トランスフェクション 293、KBおよびCOS-7細胞を、10％ウシ胎児血清を添加したダルベッコの改変イーグル培地(Dulbecco's modified Eagles' Medium，DMEM)で、5%CO₂大気下、37 ℃にて培養した。293細胞のトランスフェクションはリン酸カルシウム法を用いて行った。細胞を2x10⁶/10cmディッシュの密度で分注し、37℃にて12時間後、50 μｌの滅菌CaCl₂に、0.45mlの滅菌水中10μｇのプラスミドＤＮＡを加え、次いで、50mM N,N-ビス[2-ヒドロキシエチル]-2-アミノエタン硫酸／HCl pH6.96、0. 28M NaClおよび1.5mM Na₂HPO₄からなる滅菌緩衝液0.5mlを加えた。得られた混合液を1分間攪拌し、20分間室温で静置し、次いで、293細胞が入った10cmディッシュへ滴下した。この細胞を37℃にて16時間、3%CO₂大気下に置き、次いで、培地を吸引し、10％ウシ胎児血清を含有する新鮮なDMEMに置換した。この細胞を、刺激前に、5%CO₂大気下37℃にて24時間インキュベートした。プラスミドＤＮＡは、供給者により推奨されたリポフェクチン法により、KB細胞およびCOS-1細胞中へトランスフェクトした。細胞を1x10⁶/6cmデッィシュの密度で分注し、5%CO₂大気下37℃にて24時間インキュベートした後、細胞を2mlの血清フリー増殖培地で２回洗浄し、２μｇのＤＮＡ（予め15mgのリポフェクチン試薬とともに室温にて 15分間インキュベートする）を加えた。5%CO₂大気下37℃にて6時間後、ＤＮＡ含有培地を10％ウシ胎児血清を含有する新鮮なDMEMと置換した。さらに48時間後、この細胞を図の凡例で示されたアゴニストで刺激した。細胞は、IGF-1での刺激前には血清の不在下で12時間、あるいは他の刺激に曝す前には1時間、DMEM中でインキュベートした。溶解緩衝液に2μＭミクロシスチンが存在した以外は、記載のように細胞を溶解した(Rouse et al，1994)。プロテインキナーゼアッセイ SAPK3は慣例的にMBPのリン酸化によってアッセイした。SAPK3(0.5または1μＭ )は、10μｌの50mM酢酸マグネシウム-0.5mM[γ-³²P]ATPで反応を開始させる前に、40μｌの25mM Tris/HCl pH7.5、0.1mM EGTA、0.1mMオルトバナジウム酸ナトリウム、１μＭ PKIおよび0.33mg/ml MBP中で30℃にて３分間インキュベートした。30℃にて20分後、40μｌアリコートを採取し、1.5x1.5cm角のWhatman P81ホスホセルロースペーパー上にスポットし、75mMリン酸中に浸漬した。このペーパーを洗浄、乾燥後(Alessi et al，1995b)、MBP中へ組み込まれた³²P放射活性を測定した。１ユニットの活性は、1分にMBS中へ1nmolのリン酸塩を組み込む酵素量であった。 SAPK3アクチベーターは、それらのGST-SAPK3を活性化する能力によりアッセイした。15ml Mono S画分を、50mM Tris/HCl pH7.5、0.1mM EGTA、0.03%（重量）B rij-35、0.1%（容量）2-メルカプトエタノールおよび5%（容量）グリセロール中で、2.5μｌの10μＭ GST-SAPK3とともに30℃にて３分間インキュベートし、次いで、2.5μｌの80mM酢酸マグネシウム-0.8mM非標識ATPで反応を開始させた。30 分後、アリコート(10μｌ)を採取し、前記のようにSAPK3活性に関してアッセイした。インキュベーション混合物からGST-SAPK3を除いた対照実験を行った。１ユニットのSAPK3アクチベーターとは、SAPK3の活性を1U/分だけ増強させる量である。 MAPKAP-K2およびMAPKAP-K3は、基質としてペプチドKKLNRTLSVAを用いてアッセイし(Stokoe et al，1993)、１ユニットの活性とは、1分に1nmolのペプチド基質のリン酸化を触媒する量であった。SAPK2はGST-MAPKAP-K2(46-400)の活性化により、またSAPK2アクチベーターはそれらのMalE-Mpk2（アフリカツメガエルSAPK2 相同体）を活性化する能力により測定した(Meier et al，1996)。 SKK3 およびSKK1によるGST-SAPK3およびMal-Mpk2の活性化ならびにリン酸化理論量インキュベーション物は、25mM Tris/HC，pH7.5、0.1mM EGTA、1mM PKI、0.1% （容量）2-メルカプトエタノール、0.5mM GST-SAPK3またはMalE-Mpk2、精製KK3 またはSKK1(100U/ml、単位の定義についてはCuenda et al，1996を参照)、10mM 酢酸マグネシウムおよび0.1mM ATPを含んだ。反応は、30℃にて3分間他の成分をプレインキュベーションした後、MgATPで開始させた。種々の時間でアリコートを採取し、前記のように、SAPK3またはSAPK2活性に関してアッセイした。SAPK3 およびSAPK2のリン酸化程度を測定するため、非標識ATPを[α-³²P]ATP(2x10⁶cpm /nmol)に置き換えた並行インキュベーションを行った。種々の時間で反応物のアリコートを1mlの20%（重量）トリクロロ酢酸(ACT)に加えた。13000xgで5分間遠心分離した後、この上清を除去し、ペレットを25%TCAで３回洗浄し、次いで、Ce renkov計数により分析した。リン酸化の理論量は、各融合タンパク質の算出分子量およびBradford(1976)に従って求めたタンパク質濃度を用いて決定した。 SAPK3 の免疫沈降 SAPK3でトランスフェクトされた細胞の溶解液を13000xgで4℃にて10分間遠心分離した。上清(100μｇタンパク質)を、mycエピトープを認識する9E10モノクローナル抗体3μｇ（mycエピトープタグ付きSAPK3として）、またはラットSAPK3の C末端配列(KPPRNLGARVPKETAL)に対してヒツジで作製された、アフィニティー精製ポリクローナル抗体5μｇ（非タグSAPK3として）のいずれかを結合させたタンパク質G-Sepharose 5mlとともに、振盪プラットフォーム上で120分間インキュベートした。この上清を13000xgで１分間遠心分離し、次いで、ペレットを、0.5M NaClを含有する溶解緩衝液1mlで２回、さらに溶解緩衝液で２回洗浄し、その後、反応を振盪プラットフォーム上で行って、アガロースビーズを懸濁させたままにし、それにより確実に基質に接近させるようにした以外は、前期と同様にして、この免疫沈降物をSAPK3活性に関してアッセイした。 SAPKK の抗体および免疫沈降ポリクローナル抗MKK3抗体（MKK3のN末端付近の配列に相当するペプチドRNLDS RTFITIGDRNに対して作製）、抗MKK4抗体（XMEK2のC末端の14残基に相当するペプチドEQMPVSPSSPMYVDに対して作製）および抗MKK6抗体（ヒトMKK6のN末端付近の配列に相当するペプチドCNPGLKEAFEQPQTSに対して作製）を従前に記載したように作製、精製した(Cuenda et al，1996;Meier et al，1996)。Mono Sで精製した SAPK2アクチベーターまたはSAPK3のアクチベーターのアリコート(30ml)を、5μ ｇの抗MKK3、5μｇの抗MKK4または2μｇの抗MKK6抗体を結合させたタンパク質G- Sepharose5mlとともに、振盪プラットフォーム上で4℃にてインキュベートした。90分間混合した後、上清を13000xgにて２分間遠心分離し、この上清をSAPK3アクチベーターに関してアッセイした。対照実験では、免疫沈降に先立ち、タンパク質G-Sepharoseに結合させた抗体を、適切なペプチド免疫源50nmolとともに4℃ にて30分間インキュベートした。結果 SAPK3 は細胞ストレスおよびサイトカイン類によって活性化されるヒト胚形成腎臓上皮293細胞およびヒト上皮KB細胞を、mycエピトープタグ付き SAPK3で一時的に形質転換し、次いで、細胞ストレスまたはサイトカイン類に曝した後、酵素を免疫沈降させてアッセイした。これらの実験は、SAPK2（またはS APK1）の活性化を引き起こす刺激はまた、SAPK3を活性化することを示した。浸透圧ショック、タンパク質合成阻害剤阻害剤アニソマイシン、化学ストレス（亜砒酸ナトリウム）、UV-C照射、IL1およびTNFは総て、SAPK3を5〜14倍活性化した（図11Aおよび11b）。同様の結果が、SAPK3をCOS7細胞中へ一時的にトランスフェクトし、次いで、浸透圧ショック、アニソマイシンまたは亜砒酸ナトリウムに曝した場合にも得られた（データ省略）。EGFはトランスフェクトされたSAPK3をより弱いながら活性化したが、IGF-1およびホルボールエステル類はほとんど、または全く活性化を引き起こさなかった（図11A）。これに対しIGF-1は、並行実験において、トランスフェクトされたプロテインキナーゼBの強力な活性化を引き起こした(Alessi et al，1996)。上皮細胞におけるSAPK3の主要なアクチベーターとしてのSKK3の同定 15分間を与えた浸透圧ショック293由来の細胞溶解液を、Mono Sでのクロマトグラフィーにかけ、SAPK2およびSAPK3のアクチベーターに関してアッセイした。他の哺乳類細胞に関してこれまでに報告されたように(Cuenda et al，1996;Meie r et al，1996)、SAPK2アクチベーターの２つのピークを同定した。第一のピークはSKK1およびSKK3と同じ位置に、第二のピークはSAPKK2と同じ位置に溶離した。刺激を受けなかった細胞由来の溶解液を用いた対照実験ではいずれのピークも認められなかった（図12）。活性の第一のピークは、抗MKK6抗体により定量的に免疫沈降したが、抗MKK4または抗MKK3抗体によってはしなかったので、それはSK K3（または極めて近い関連の相同体）であった（図12B）。第二のピークは抗MKK 3抗体によっては免疫沈降したが、抗MKK4または抗MKK6抗体によってはしなかった（図12B）。同画分をSAPK3のアクチベーターに関してアッセイした場合、SKK3 とともに溶離する単一ピークしか検出されず（図12C）、これは抗MKK6抗体によって免疫沈降したが、抗MKK4または抗MKK3抗体によってはしなかった（図12D）。同様の結果が、細胞をアニソマイシンで刺激した場合にも得られた（データ省略）。刺激を受けなかった細胞由来の溶解液を用いた対照実験では、SAPK3アクチベーターは認められなかった（図12C）。発明者らはこれまでに、SKK3は、いくつかの方法でストレスを受けたか、またはIL-1で刺激を受けたKB細胞由来の溶解液のMono Sクロマトグラフィーの後に検出されたSAPK2アクチベーターの95〜100%を占めることを示した(Cuenda et al， 1996;Meier et al，1996)。図13に示したように、KB細胞に浸透圧ショックまたはアニソマイシン処理をかけた後に検出されたSAPK3アクチベーターの単一ピークは、Mono S上でSKK3とともに移動し、抗MKK6抗体により定量的かつ特異的に免疫沈降した。この実験もまた、SAPKK4およびSAPKK5もまた、これらの刺激により KB細胞で活性化され、かつ、SKK3よりも高いNaCl濃度でMono Sから溶離し(Meier et al，1996)、SAPK3を活性化しないことを証明した。 SKK3がin vivoでSAPK3を活性化し得るというさらなる証拠は、COS細胞中への同時トランスフェクションによって得られた。これらの実験は、SAPK3活性がSKK 3との同時発現により10倍上昇し、また、浸透圧ショックに曝すことで、SSK3が同時トランスフェクトされた細胞では、トランスフェクトされたSAPK3の30倍高い活性化を引き起こしたことを示した（図14）。 in vitro におけるSKK3によるSAPK3の活性化 SAPK3はin vitroで、骨格筋由来のSKK3高精製調製物により活性化されたが（図15）、p42 MAPキナーゼが最大に活性化された条件下で、MKK1によっては活性化され得なかった（データ省略）。SKK3によるSAPK3の活性化速度はSAPK2のそれと同様であり、両酵素は1時間後にミエリン塩基性タンパク質(MBP)に対して同じ固有活性に達した（図15Aおよび15B）。 MBPに対するSAPK2およびSAPK3の活性は、この基質に対するp42 MAPキナーゼの活性よりも25〜50倍低い(Stokoe et al，1992b)。SKK3がSAPK2およびSAPK3とのインキュベーションに先立ち、プロテインホスファターゼ2Aにより不活性化された場合には、SAPK2またはSAPK3の活性化またはリン酸化は起こらなかった（図15A および15B）。SAPK2およびSAPK3の活性化は、予期していたようにホスホチロシンおよびホスホトレオニンの出現を伴い、両酵素は、同程度に低いまたは高いSA PK3およびSAPK2の活性化レベルまでリン酸化された（図15）。興味深いことに、 SAPK3（SAPK2とは異なり）もまた、セリン残基でリン酸化されるようになった。野生型SAPK3を不活性な突然変異体に置き換えた場合にはこのようなことは起こらず（図15D）、このことはセリンのリン酸化が、それが活性化された後にSAPK3 自身により触媒される自己リン酸化事象であることを示唆している。自己リン酸化部位はSer-3および／またはSer-281であると考えられ、これらはプロリンが続く、SAPK3中でのただ２つのセリンである(Merten et al，1996)。 in vitro におけるSKK1(MKK4)によるSAPK3の活性化 SAPK2はin vitroで、SAPKK2およびSKK3によりリン酸化されるだけでなく、SKK 1(MKK4)によってもリン酸化される（「序説」を参照）。SKK1はそれ自身サイトカイン類および細胞ストレスにより活性化され、ゆえに、この酵素がin vitroで SAPK3を活性化する能力を有するかどうか検討することに注目された。図16は、S APK3がin vitroでSKK1により活性化され得るが、SAPK3の活性化の初速度は、同条件下のSAPK2のそれよりかなり遅いことを示している（図16A）。この活性化の速度の遅さに一致して、SAPK3は、SKK1の上流アクチベーターであるMEKキナーゼを用いたCOS1細胞での同時トランスフェクション後には、活性化されなかった（図14）。このことは、KBおよびCOS細胞で観察された全SAPK3活性化活性へのSKK1 の寄与が無視できることと矛盾はない。 SAPK2 およびSAPK3の基質特異性の比較 SAPK3は、転写因子Elk1、ATF2、SAP1、SAP2およびp53のリン酸化において、SA PK2とまさに同等の活性を有するが、c-Junは両酵素により微弱にしかりン酸化されなかった（表1）。SAPK1は、Thr-69、Thr-71およびSer-90でATF2をリン酸化することが示されており(Livingstone et al，1995)、ゆえに、SAPK2およびSAPK3 によるATF2のリン酸化が、野生型ATF2およびそれらの残基がAlaへ変化した突然変異体を用いて、極めて詳細に研究された。SAPK3によるリン酸化後のホスホアミノ酸解析では、野生型ATF2がトレオニンおよびセリン残基でリン酸化され、ホスホトレオニン含量がホスホセリン含量より２倍高くなることが示された（データ省略）。これに対し、SAPK2によるリン酸化後では、ATF2はトレオニンでリン酸化されるだけであった（データ省略）。これらの実験と一致して、Thr-69およびThr-71がアラニンへ変化した変異体ATF2は、SAPK3によってはリン酸化されたが、SAPK2によってはリン酸化されず（図17）、しかもSAPK3によるこの突然変異体のリン酸化はセリンでしか起こらなかった（データ省略）。Thr-69、Thr-71およびSer-90が全てAlaへ変化した変異体ATF2は、SAPK2またはSAPK3のいずれかによりリン酸化されず、Ser-90がAlaへ変化した突然変異体は、SAPK3によりトレオニン残基でリン酸化されたが、SAPK2によってはリン酸化されなかった（図17）。これらの実験はSAPK2およびSAPK3はThr-69およびThr-71でATF2をリン酸化するが、SAPK3のみではSer-90をリン酸化することを示している。 SAPK3は、GST-MAPKAP-K2(46-400)および全長GST-MAPKAP-K3の活性化において、SAPK2よりもずっと効果が低く、MAPKAP-K2およびMAPKAP-K3の活性化の初速度、ならびに最大活性の半分の時間は20倍遅かった（図18Aおよび18B）。発明者らはこれまでに、p42 MAPキナーゼはin vitroでGST-MAPKAP-K2(46-400)を活性化することはできるが、全長に近いGST-MAPKAP-K2[GST-MAPKAP-K2(5-400)]を活性化することはできなないことを報告している(Ben-Levy et al，1995)。SAPK3はまた、GST-MAPKAP-K2(5-400)も有意には活性化することができない（図18C）。 SAPK3 はSB 203580により阻害されない SAPK3は、SAPK2(0.6μＭ)のIC50より100倍高い濃度(0.1mM)でさえ、SB 203580 により有意には阻害されなかった（図19）。考察発明者らは、SAPK3が、SAPK1およびSAPK2と同様の細胞ストレスおよびサイトカイン類に応答して活性化されることを証明した。２種の上皮細胞系統では、検出できたSAPK3の唯一のアクチベーターは、発明者らがこれまでに単球および筋肉ならびに上皮細胞から調製した抽出物において優勢なSAPK2のアクチベーターであることを示した、MKK6遺伝子の産物であるSKK3であった(Cuenda et al，199 6)。SKK3はin vitroにおいて同速度でSAPK3とSAPK2を活性化した。さらに、ストレスにより誘導されるSAPK3の活性化は、SKK3との同時発現により大幅に向上した。これらの観察は、上皮細胞では、SKK3が細胞ストレスおよびサイトカイン類によるSAPK3の活性化を仲介することを示している。SAPK3は、MKK1、SKK1(MKK4) 、SAPKK2(MKK3)、SAPKK4またはSAPKK5によっては有意な速度では活性化されない。 SAPK3のアミノ酸配列はSAPK2と60%一致し、かつ、両酵素はTGYリン酸化モチーフおよびサブドメインVIIとサブドメインVIIIの活性化ループとの間に６個のアミノ酸挿入を共有しているが、SAPK3の特性はいくつかの点でSAPK2とは異なっている。第一に、SAPK3はSB 203580によっては阻害されなかった（図19）。第二に、SAPK3はSAPK2とは異なり、Ser-90でATF2をリン酸化した（図17）。第三に、これまでに実験したあらゆる哺乳類細胞で、SB 203580がストレスおよびサイトカインにより誘導されるMAPKAP-K2およびMAPKAP-K3の活性化を80〜95%まで抑制するという知見(Cuenda et al，1995;Beyaert et al，1996;Clifton et al，1996; McLaughlin et al，1996)に一致して、SAPK3は、MAPKAP-K2およびMAPKAP-K3の活性化においてSAPK2よりも遥かに効果が低かった。前記で概略を示したSAPK3とSAPK2の間の違いにも関わらず、これらの酵素はin vitroにおいて同じ速度（表1）で、転写因子ATF2をはじめとする多くのタンパク質をリン酸化した。ATF2は、SKK1、MEKK（SKK1の上流アクチベーター）または SKK3で同時トランスフェクトされた細胞でリン酸化されるので、SAPK1およびSAP K2の生理学的基質であることが示唆された。しかしながら、上流アクチベーターでのトランスフェクションは、in vivo状態を模擬しないと考えられ、例えば、異常に高レベルのSAPK1およびSAPK2活性を生じる。さらに本研究は、SKK3がSAPK 3ならびにSAPK2を活性化することを証明することにより、これらの実験の解釈にもう１つの問題をもたらす。従って、SAPK2またはSAPK3がSKK3でのトランスフェクションによって引き起こされるATF2のリン酸化を仲介するかどうか評価するためには、SB 203580を用いたさらなる実験が不可欠である。しかしながら、たとえSB 203580がSKK3でのトランスフェクションによって誘導されたATF2のリン酸化を妨げたとしても、SAPK2活性はin vivoにおけるATF2のリン酸化の律速とはなり得ない。なぜならば、この薬剤がMAKPAK-K2の活性化ならびにIL６およびc-fos ｍＲＮＡの誘導を妨げる条件下で、繊維芽細胞系統における内生ATF2の、TNFにより誘導されるリン酸化(Beyaert et al，1996)も、ストレスにより誘導されるリン酸化(Hazzalin et al，1996)もSB 203580により影響を受けないからである。これらのｐ条件下で起こるATF2のリン酸化がSAPK1、SAPK3または別のSAPK(まだ同定されていないもの)によって触媒されるかどうか明らかにするためには、さらなる研究が必要である。 SAPK3とSAPK2は、転写因子Elk1を同じ速度でリン酸化し（表2）、また、ATF2 同様、Elk1はSKK1、MEKKまたはSKK3で同時トランスフェクトされた細胞でリン酸化されるようになるので（「序説」を参照）、SAPK1およびSAPK2の生理学的基質であることが示唆されている。これらの実験はATF2に関して前記で概略を記載したものと同様の制限を受けるが、Elk1に伴うさらなる警告は、それはまた、SAPK を活性化するいくつかのストレスおよびサイトカイン類によって活性化されるp4 2およびp44 MAPキナーゼの有効な基質でもあることである。Elk1（SAP1およびSA P2同様）はEtsドメインタンパク質であり、また、血清応答因子(SRF)と三元複合体を形成し、かつ、c-Fosをはじめとする多くの遺伝子のプロモーターで見られる血清応答エレメント(SRE)と結合するTCFファミリーの転写因子のメンバーである。アニソマイシンまたはUV照射に応答するc-fos ｍＲＮＡ誘導は、C3H T101/2 繊維芽細胞ではSB 203580により大幅に抑制されるが(Hazzalin et al，1996)、H eLa細胞およびNIH 3T3細胞では、UV照射により誘導されるc-fosの誘導は、SB 20 3580により部分的に阻害され、PD 98059(MKK1の活性化の特異的阻害剤(Alessi e t al，1995a))）により部分的に阻害され、また両阻害剤の存在によりほとんど完全に抑制された(Price and Treisman，1996)。これらの観察は、SAPK2活性がc -fos遺伝子の転写活性化における律速であり、SAPK2およびERK1/ERK2の活性化が、UV照射細胞におけるc-fos ｍＲＮＡの誘導の一因であることを証明するものである。しかしながら、SB 203580によるc-fos ｍＲＮＡ産生の抑制が、Elk1、またはSAPKもしくはSAP2のような別のTCFのリン酸化の阻害から、またはMAPKAP-K2 が介在するCREBのリン酸化を妨げることにより生じるかどうか（「序説」を参照）は、まだ確立されていない。MEKKでの同時トランスフェクションにより誘導されたElk1のリン酸化は、PD 98059により妨げられ、このことはこれらの条件下で ERK1/ERK2がElk1のリン酸化を仲介することを示している。初期の報告は、SAPK1 は、細胞が低レベルのMEKK ＤＮＡでトランスフェクトされた場合に特異的に活性化されたことを主張するものであったが(Minden et al，1994)、PD 98059の作用（SAPK1の活性化に対する作用はなかった；Cuenda et al，1995;Price and Tr eisman，1996）は、これがそのケースではないことを示している。ひとまとめにいて考えると、Price and Treisman(1996)の結果は、UV照射HeLa細胞においては、SAPK1およびSAPK3はいずれもElk1のリン酸化およびc-fos ｍＲＮＡの誘導の律速でないことを示している。本発明の範囲から逸脱しない限り、変更や改良も本発明の一部とみなされてよい。表2 SAPK2およびSAPK3の基質特異性の比較 SAPK2およびSAPK3をin vitroにて活性化し（図15）、次いで、0.1U/mlのSAPK 濃度で各タンパク質のリン酸化を研究した。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年９月１７日（１９９８．９．１７）【補正内容】請求の範囲１．下記アミノ酸配列（SAPK4）を含んでなるストレス活性化プロテインキナーゼ、またはストレス活性化プロテインキナーゼSAKP3/ERK6/p38γの、SKK3/MKK6/MEK6による活性化を阻害する化合物の同定方法であって、化合物が、(a)ストレス活性化プロテインキナーゼ、またはその適切な断片、変異体、誘導体もしくは融合体、または適切な融合体、または断片、変異体もしくは誘導体と、(b)SKK3/MKK6/MEK6またはその適切な変異体、誘導体、断片もしくは融合体、またはストレス活性化プロテインキナーゼを活性化することができる変異体、誘導体もしくは断片の適切な融合体との間の相互作用を増強または阻害するかどうかを決定すること、あるいは、化合物が、ストレス活性化プロテインキナーゼ、またはその適切な変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその断片、誘導体もしくは融合体の融合体の、SKK3またはストレス活性化プロテインキナーゼを活性化することができるその適切な変異体、誘導体、断片もしくは融合体による活性化を実質的に阻害するかどうかを決定することを含んでなり、ストレス活性化プロテインキナーゼの変異体もしくは断片もしくは誘導体もしくは融合体、またはその変異体もしくは断片もしくは誘導体の融合体がミエリン塩基性タンパク質リン酸化することができ、かつ、SB 203 5 80またはSB 202 190により阻害されない方法。２． SKK3/MKK6/MEK6によるプロテインキナーゼの活性化を阻害する化合物のスクリーニングアッセイにおける、請求項１記載のストレス活性化プロテインキナーゼ、またはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体、誘導体もしくは断片の融合体の使用。３．請求項１記載のストレス活性化プロテインキナーゼ、またはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体、誘導体もしくは断片の融合体(SAPK4またはSAPK3/ERK6/p38γ)の活性化に影響を及ぼし得る薬剤の同定方法であって、 a)SAPK4またはSAPK3/ERK6/p38γをSSK3/MKK6/MEK6に曝し； b)それぞれSAPK4またはSAPK3/ERK6/p38γの基質の存在下で、試験物質をSAPK4またはSAPK3/ERK6/p38γに曝し； c)基質がリン酸化されたかどうか（さらに所望により、どの程度か）を検出することを含んでなる方法におけるSSK3/MKK6/MEK6の使用。４．請求項１記載のストレス活性化プロテインキナーゼ、またはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体、誘導体もしくは断片の融合体 (SAPK4またはSAPK3/ERK6/p38γ)を活性化させる方法であって、SAPK4またはSAPK 3/ERK6/p38γをSSK3/MKK6/MEK6とともにインキュベートすることを含んでなる方法。５． SSK3/MKK6/MEK6が精製されている、請求項１記載の方法。６．基質がミエリン塩基性タンパク質(MBP)、転写因子、AFT-2、試験物質またはそれ自身がタンパク質のリン酸化、遺伝子発現および／またはタンパク質合成に影響を与えることができるホスファターゼを含んでなる、請求項３記載の使用。７．請求項１記載のストレス活性化プロテインキナーゼ、またはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体、誘導体もしくは断片の融合体、SSK3/MKK6/MEK6を含んでなるキットの一部、ならびに請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用または方法を実施するための手段。８．下記アミノ酸配列（SAPK4）またはその融合体を含んでなる、実質的に純粋なストレス活性化プロテインキナーゼ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者マイケル、ゲーダートイギリス国ケンブリッジ、ヒルズ、ロード、エムアールシー、ラボラトリー、オブ、モレキュラー、バイオロジー内【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．下記アミノ酸配列またはその変異体、断片、融合体もしくは誘導体、またはその変異体もしくは断片もしくは誘導体の融合体を含んでなる、実質的に純粋なストレス活性化プロテインキナーゼ。２．変異体のアミノ酸配列が与えられたアミノ酸配列と少なくとも65%の同一性を有する、請求項１記載のストレス活性化プロテインキナーゼの変異体。３．変異体のアミノ酸配列が与えられたアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有する、請求項２記載のストレス活性化プロテインキナーゼの変異体。４．変異体のアミノ酸配列が与えられたアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有する、請求項３記載のストレス活性化プロテインキナーゼの変異体。５．請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロテインキナーゼをコードする、またはそのキナーゼの変異体もしくは断片もしくは誘導体もしくは融合体、またはその変異体もしくは断片もしくは誘導体の融合体をコードする組換えポリペプチド。６．下記ヌクレオチド配列またはその変異体、断片、融合体もしくは誘導体を含んでなる組換えポリペプチド。７．イントロンを含まない請求項５または６に記載のポリペプチド。８．請求項５〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドを含んでなる複製可能なベクター。９．請求項５〜８のいずれか１項に記載の組換えポリペプチドまたは複製可能なベクターを含んでなる宿主細胞。１０．ストレス活性化プロテインキナーゼ、またはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体もしくは断片もしくは誘導体の融合体を作出する方法であって、ストレス活性化プロテインキナーゼ、またはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体もしくは断片もしくは誘導体の融合体を発現する請求項９記載の宿主細胞を培養し、次いで、そのプロテインキナーゼ、またはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体もしくは断片もしくは誘導体の融合体を単離する方法。１１．請求項１０の方法によって得ることができる、ストレス活性化プロテインキナーゼ、またはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体もしくは断片もしくは誘導体の融合体。１２．請求項１〜４および１１のいずれか１項に記載のストレス活性化プロテインキナーゼに対して反応性のある抗体。１３．別のストレス活性化プロテインキナーゼとは実質的に反応しない、請求項１２記載のストレス活性化プロテインキナーゼ、またはその変異体もしくは断片もしくは誘導体に対して反応性のある抗体。１４．請求項１記載のストレス活性化プロテインキナーゼ、またはストレス活性化プロテインキナーゼ3(SAPK3)の活性を阻害する化合物の同定方法であって、化合物を、ストレス活性化プロテインキナーゼ、または適切なその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体、断片もしくは誘導体の融合体と接触させ、次いで、化合物の不在下でのプロテインキナーゼの活性がプロテインキナーゼ、またはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体、断片もしくは誘導体の融合体の活性に比べて低下するかどうかを決定する方法。１５．請求項１記載のストレス活性化プロテインキナーゼ、またはストレス活性化プロテインキナーゼSAPK3の、SKK3による活性化を阻害する化合物の同定方法であって、化合物が、(a)本発明の第１の態様で記載されたストレス活性化プロテインキナーゼ、すなわちSAPK3、または適切なその断片、変異体、誘導体もしくは融合体、または断片、変異体もしくは誘導体の適切な融合体と、(b)SKK 3またはその適切な変異体、誘導体、断片もしくは融合体、または変異体、誘導体もしくは断片の適切な融合体との間の相互作用を増強または阻害するかどうかを決定するか、あるいは、その化合物が、ストレス活性化プロテインキナーゼ、または適切なその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその断片、誘導体もしくは融合体の融合体の、SKK3またはその適切な変異体、誘導体、断片もしくは融合体による活性化を実質的に阻害するかどうかを決定することを含んでなる方法。１６． SAPK3の活性に作用することができる薬剤の同定方法であって、 a)SAPK3の基質の存在下で、試験物質をSAPK3またはその機能的等価物に曝し； b)基質がリン酸化されたかどうか（さらに所望により、どの程度か）を検出することを含んでなる方法。１７．試験物質がSAKP3の類似体、イソ型、インヒビターまたはアクチベーターであるである、請求項１６記載の方法。１８．基質がミエリン塩基性タンパク質(MBP)、転写因子、ATF-2、試験物質またはそれ自身がタンパク質のリン酸化、遺伝子発現および／またはタンパク質合成に作用することができるホスファターゼを含んでなる、請求項１６または１７記載の方法。１９．アッセイ化合物のいくつかが表面上に置かれる、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。２０．請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法によって同定可能な化合物。２１．医薬に使用するための請求項２０記載の化合物。２２．炎症性疾患を患う患者の治療方法であって、請求項２１記載の化合物の有効量を患者に投与することを含んでなる方法。２３．プロテインキナーゼの活性を阻害するか、またはSKK3によるプロテインキナーゼの活性化を阻害する化合物に対するスクリーニングアッセイにおける、請求項１記載のストレス活性化プロテインキナーゼ、またはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体、誘導体もしくは断片の融合体、あるいは、ストレス活性化プロテインキナーゼSAPK3、またはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体、誘導体もしくは断片の融合体の使用。２４．請求項１記載のストレス活性化プロテインキナーゼ、またはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体、誘導体もしくは断片の融合体(SAPK4)、あるいはSAPK3またはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体、誘導体もしくは断片の融合体(SAPK3)の活性に作用することができる薬剤の同定方法であって、 a)SAPK4またはSAPK3をSKK3に曝し； b)それぞれSAPK4またはSAPK3の基質の存在下で、試験物質をSAPK4またはSAPK3に曝し； c)基質がリン酸化されたかどうか（さらに所望により、どの程度か）を検出することを含んでなる方法におけるSKK3の使用。２５．請求項１記載のストレス活性化プロテインキナーゼ、またはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体、誘導体もしくは断片の融合体(SAPK4)、あるいはSAPK3またはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体、誘導体もしくは断片の融合体(SAPK3)を活性化させる方法であって、SAPK4またはSAPK3をSKK3とともにインキュベートすることを含んでなる方法。２６． SKK3が精製されている、請求項１５記載の方法。２７．請求項１記載のストレス活性化プロテインキナーゼ、またはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体、誘導体もしくは断片の融合体、あるいは、SAPK3またはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその変異体、誘導体もしくは断片の融合体を含んでなるキットの一部、ならびに請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法を行うための手段。２８．本明細書で開示したいずれもの新規ストレス関連プロテインキナーゼ。２９． SAPK3またはその類似体、イソ型、インヒビター、アクチベーターもしくは機能的等価体を含んでなる組成物。３０．タンパク質のリン酸化、遺伝子発現および／またはタンパク質合成の調節における、請求項２９記載の組成物の使用。３１． in vitroにおいて用いられる、請求項３０記載の使用。３２．タンパク質のリン酸化、遺伝子発現および／またはタンパク質合成が異常を示す病状の治療のための、請求項２９記載の組成物の使用。３３．医薬として用いられる、請求項２９記載の組成物。３４．タンパク質のリン酸化、遺伝子発現および／またはタンパク質合成が異常を示す病状の治療用薬剤の製造のための、請求項２９記載の組成物の使用。３５．ヒトまたは非ヒト動物の身体の治療方法であって、SAPK3またはその類似体、阻害剤、刺激剤もしくは機能的等価体を身体へ投与することを含んでなる方法。３６．好ましくは遺伝子転写因子の活性に作用することにより、治療される身体での遺伝子発現の調節に影響を与える、請求項３５記載の方法。３７． SAPK3、その類似体、阻害剤、刺激剤または機能的等価体と相互作用することにより、遺伝子発現に影響を与え得る組成物。３８．抗炎症、免疫抑制、抗アポトーシスまたは抗癌治療が必要な症状に用いられる医薬の製造における、請求項２０または２９記載の化合物または組成物の使用。