WO1997032971A1 - Gene provoquant une proliferation selective - Google Patents

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Keiya Ozawa
Katsuhisa Itoh
Tsuneaki Sakata
Yasuji Ueda
Mamoru Hasegawa
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Dnavec Research Inc.
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    • C12N2799/027—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a retrovirus

Definitions

  • the present invention relates to the field of genetic engineering, particularly to the field of gene therapy. Background art
  • gene therapy which aims to fundamentally solve genetic diseases by replacing the defective gene with a normal gene or supplementing the normal gene. What is important in this gene therapy is to correctly introduce a normal gene into a target cell and to accurately express the introduced gene.
  • gene vectors for introducing normal genes into target cells have been represented by retrovirus vectors, adenovirus vectors, virus vectors such as adeno-associated virus vectors, and ribosomes.
  • Non-viral vectors have been used. However, all of them have disadvantages such as low efficiency of gene transfer into target cells.
  • ADA adenosine deaminase
  • G-CSF has been considered as a cytokine (hematopoietic factor) for selectively proliferating neutrophils, but in recent years, administration of G-CSF has shown an increase in neutrophils. As well as an increase in the bovine body of hematopoietic stem / progenitor cells Reported (Clinical Blood., 35, 1080 (1994)).
  • the mechanism by which G-CSF functions is that when G-CSF stimulation activates the G-CSF receptor, dimerization of the G-CSF receptor is observed (Proc Growth Factor Res., 3).
  • G-CSF receptor has a proliferation inducing domain and a differentiation inducing domain (Cell., 74, 1079-1087 (1993)).
  • an estrogen receptor is known as a receptor activated by dimerization (J Biol Chei., 264, 2397-2400 (1989)). It has also been reported that c-Abl tyrosine kinase activation occurs when a fusion protein of the receptor and c-Abl tyrosine kinase is expressed (The EMB0 Journal., 12,2809-2819 (1993)). Disclosure of the invention
  • the present invention aims to overcome the problem of low gene transfer efficiency by selectively amplifying hematopoietic stem cells or the like into which a therapeutic gene has been introduced, either in vivo or outside the body.
  • the aim is to provide basic technologies for gene therapy.
  • hematopoietic stem cells which are the cells that are the base of many blood cells such as erythrocytes and leukocytes, and are most preferred as target cells for gene therapy, they will contribute to the field of gene therapy.
  • the dedication is very large.
  • G-CSF which has been conventionally considered as a cytokine (hematopoietic factor) for selectively proliferating neutrophils, also causes the proliferation of hematopoietic stem cells, and this G-CSF receptor is activated.
  • System that expands hematopoietic stem cells by dimerizing G-CSF receptor using genetic engineering techniques, considering that G-CSF receptor dimerization is observed I thought.
  • estrogen stimulation causes the estrogen receptor to dimerize, a chimeric G-CSF receptor gene and an estrogen receptor gene were prepared, and cells transfected with the chimeric gene were prepared. From outside The present inventors have conceived of forcibly dimerizing the G-CSF receptor portion in the chimeric gene product by giving an estrogen stimulus.
  • the present inventors have newly developed a system that causes the activation of the G-CSF receptor portion in the chimeric gene product by external estrogen stimulation, and selectively proliferates the transfected hematopoietic stem cells.
  • the present invention was completed in order to apply this to the field of gene therapy.
  • the present invention includes a fusion protein comprising: a region to which a ligand binds; a region to which the ligand binds when bound to the region; and a region which, when associated, imparts proliferative activity to cells; and a gene encoding the fusion protein.
  • the present invention relates to a vector, a cell containing the vector, and a method for selectively growing the cell inside or outside the body by the action of a steroid hormone.
  • the present invention relates to a method for selectively growing cells into which the foreign gene has been introduced, when the vector contains a foreign gene.
  • a fusion protein comprising a region imparting proliferative activity
  • the cells described in (6) are selectively proliferated by allowing the cells described in (6) to act on a ligand that acts on the “ligand-binding domain” of the fusion protein described in (1). How to make
  • ligand binding region (a) ligand binding region, (b) ligand binding region (a) A vector that comprises a gene encoding a fusion protein and a desired foreign gene, including: a region that associates with a gene; and (C) a region that, when associated, confers growth activity on cells.
  • kits comprising: (a) the vector according to (5) or (8); and (b) a ligand which acts on a domain j to which a ligand binds, of a fusion protein encoded by a gene contained in the vector.
  • the ligand used in the present invention is not particularly limited as long as it associates the protein by acting on a specific protein.
  • Steroid hormone is preferable.
  • Steroid hormones include, for example, estrogen, androgen, lycogesterone, glucocorticoid, mineralcorticoid and the like, and are used in combination with the respective receptor proteins.
  • the cytokine receptor used in the present invention may be any that imparts a proliferative activity to cells by associating the cytokine.
  • examples include those belonging to the family of cytokine receptors such as G-CSF, Family of tyrosine kinase receptors such as c-kit and flk2 / flt3 And the like.
  • the “region imparting proliferative activity to cells” in the fusion protein of the present invention a molecule that transmits an intracellular proliferation signal, for example, a whole cytokine receptor molecule can be used. It is also possible to use only the region imparting the proliferation activity. In this case, since the cells into which the fusion protein gene has been introduced undergo only proliferation without causing differentiation, it is advantageous when the cells are grown as they are.
  • the vector used in the present invention includes a single molecule vector containing a gene encoding the fusion protein, a single molecule vector containing both the fusion protein and the foreign gene, and a gene encoding the fusion protein.
  • a vector system comprising a plurality of types of molecules consisting of a combination of a vector containing a foreign gene and a vector containing a foreign gene, for example, a binary vector system is also included.
  • This multi-molecule vector system is usually introduced into cells by co-transformation.
  • a dicistronic form containing IRES internal ribosome entry site
  • IRES internal ribosome entry site
  • a vector having the structure of “gene—IRES—foreign gene—3 ′” can be used.
  • the former form is generally used to make almost all cells expressing the fusion protein gene express the foreign gene.
  • the cells into which the vector is introduced include hematopoietic stem cells, lymphoid cells, and cells other than these blood cells.
  • the present invention is suitably applied to hematopoietic stem cells having self-renewal ability.
  • the exogenous gene to be introduced into cells is not particularly limited, but in the field of gene therapy, it is effective to use a normal gene corresponding to the defective gene.
  • Figure 1 shows a chimeric molecule (GCRER) of G-CSF receptor and estrogen receptor .
  • B shows a mutant (GCRA (5-195) / ER) of the chimeric molecule of G-CSF receptor and estrogen receptor in which the 5th to 195th amino acids of the G-CSF receptor are deleted.
  • C is a mutant of the chimeric molecule of G-CSF receptor and estrogen receptor in which the amino acids at positions 50 to 195 and 725 to 756 of the G-CSF receptor have been deleted (GCRA ( 5-1 95, 725-756) / E).
  • FIG. 2 is a diagram showing a retroviral vector “pMX” incorporating a chimeric gene of a G-CSF receptor and an estrogen receptor.
  • FIG. 3 is a diagram showing the temporal growth of Ba / F3 cells transformed with pCMX-GCRERj.
  • FIG. 4 is a graph showing the temporal growth of Ba / F3 cells after various concentrations of estradiol stimulation were applied to Ba / F3 cells transformed using “pC X-GCRER”.
  • FIG. 5 is a diagram temporally showing the growth of Ba / F3 cells transformed using “pCMX-GCRA (5-195) / ER”.
  • FIG. 6 is a diagram showing the plasmid “pCMX-GCRER-IRES-CD24”.
  • FIG. 7 is a diagram showing the plasmid “pCMX-GCRA (5-195) / ER-IRES-CD24”.
  • FIG. 8 is a diagram showing the plasmid “pCMX-GCRA (5-195, 725-756) / ER-IRES-CD24”.
  • Figure 9 is a diagram detected by Furosai densitometry expression of C D24 in r p C X-GCRA (5-195 ) / ER- Ba / F3 cells transfected with IRES-CD24j.
  • the upper panel shows the results for Ba / F3 cells transfected with “pCMX-GCRA (5-195) / ER-IRES-CD24”, and the lower panel shows “pCMX-GCRA (5-195) / ER” used as a control.
  • the results are shown for Ba / F3 cells transfected with E. coli. (Note that the data from the provodidium iodide used for the detection of dead cells is also included in the data.)
  • FIG. 10 is a micrograph showing a granulocyte-macrophage colony composed of bone marrow cells into which “vMXGCRER” has been introduced.
  • FIG. 11 is a photomicrograph showing an erythroid colony composed of bone marrow cells into which “vMXGCRA (5-195) / ER” has been introduced.
  • FIG. 12 is a photomicrograph of macrophages differentiated from bone marrow cells transfected with “vMXGCRER” stained with Wright-Giemsa.
  • Fig. 13 is a photomicrograph of erythroid cells differentiated from bone marrow cells transfected with “vMXGCRA-195) / ER stained with Wright-Giemsa.
  • GCREIl chimeric protein
  • GCRA GCRA (5-195,725-756) / ERj)
  • a mutant derivative (hereinafter, simply referred to as “GCRA (5-195,725-756) / ERj)” was prepared from the mutant derivative except for the portion containing the G-CSF receptor differentiation-inducing domain (725 to 756). (Fig. 1 (C)).
  • PCMX_GCRER was digested with Hindlll and EcoRI, and a vector fragment ("fragment 1") was recovered. Also, “pCMX-GCRER” and “pCMX-GCRA (5-195) / ER” and Hi The ndlll and Kpnl fragments ("fragment 2": 1672 bp and “fragment 3”: 1099 bp, respectively), and the EcoRI and Kpnl fragments ("fragment 4": 1888 bp and "fragment 5": 1792 bp, respectively) were recovered.
  • pBCEC pBluescriptllKS with EMCS-derived IRES and CD24 ligated, Migita, ⁇ ⁇ , Pro Natl. Acad. Sci.
  • Ba / F3 was washed twice with PBS and once with "0PTI-MEMI” (manufactured by Gibco-BRL).
  • the 10 'cells were reconstituted in 0.2 ml of "0PTI-MEMI", and "pCMX-GCRER-IRES" -CD24 '', ⁇ pCMX-GCRA (5-195) / ER-IRES-CD24 '' and ⁇ pCMX-GCRA (5-195, 725-756) / ER-IRES-CD24 '' are added lOmg each, and ⁇ Gene Pulser "(manufactured by Bioilad) at 290 V and 960 mF o After the introduction, the cells were cultured in & PMI medium containing 10% FCS, 10 U / ml mIL-3 (manufactured by R & D SYSTEMS) for 2 days.
  • CD24 antibody After washing the ⁇ 0 6 cells in 5% FCS / PBS, lmg / l anti (manufactured by Pharming en Co.) CD24 antibody was reacted at room temperature for 30 minutes, washed twice with 5% FCS / PBS, 1: 20 dilution The PE-labeled anti-mouse antibody (manufactured by DAK0) was reacted at room temperature for 30 minutes, and washed twice with 5% FCS / PBS. CD24 expression was analyzed using a 585 nm detector at 5 mg / in 1 propidium iodide / 1 ml of PBS and analyzed by flow cytometry (Becton Dickinson).
  • mice Four 6-week-old C57BL mice were injected intravenously with a 5-fluorouracil (5FU: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) saline solution (10 mg / ml) at a dose of 300 ml / animal.
  • 5FU Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • saline solution 10 mg / ml
  • bone marrow was collected from the femur, and mononuclear cells were isolated by centrifugation (1500 rpm, 25.C, 22 minutes) on rLympholyte-Mj (Cederlane).
  • the cells were cultured for 2 days in Iskov's modified Dulbecco's basic medium (IMDM; Gibco) supplemented with 20% FCS, 100 U / ml IL6, and 100 mg / ml rat SCF.
  • IMDM Iskov's modified Dulbecco's basic medium
  • IMDM methylcellulose
  • Wako 203 ⁇ 4 FCS
  • 1% deionized BSA 1% deionized BSA
  • lOmM 2-mercaptoeta Lumpur after microscopic observation Cultured. 10 days after culturing colonies in 10- 7 M b-estradiol), after creating Rye Togimuza stained smears, was identified constituent cells.
  • FIG. 10 shows granulocyte-macrophage colonies formed from "vMXGCRER” infected bone marrow cells by estradiol stimulation. Erythroid colonies formed from bone marrow cells infected with “vMXGCRA (5-195) / ER” by estradiol stimulation are shown in FIG. When the cells constituting these colonies were smeared and subjected to light-Giemsa staining, differentiated blood cell images were obtained.
  • FIG. 12 shows light-Giemsa-stained images of macrophages observed in smears of granulocyte-macrophage colonies formed from bone marrow cells in vMXGCRA (5-l95) / ER ”
  • Fig. 13 shows a Leyto Giemsa-stained image of erythroblasts observed in a smear of an erythroid colony formed from infected bone marrow cells.
  • cells into which a foreign gene has been introduced can be selectively amplified by an external stimulus, so that effective gene therapy can be performed even when the efficiency of gene introduction into target cells is low. became.
  • the selective cell expansion system of the present invention can be applied to various blood cells, the range of cells to be subjected to gene therapy has been expanded. Therefore, the present invention provides an important basic technology particularly in the field of gene therapy.

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Description

明細書 選択的増殖性を付与する遺伝子 技術分野
本発明は、 遺伝子工学分野、 特に遺伝子治療の分野に関する。 背景技術
先天的又は後天的に遺伝子に欠陥があるために発症する病気、 即ち、 遺伝子疾 患に対しては、 これまで様々な治療法が考えられてきた。 その一つとして、 欠陥 遺伝子そのものを正常な遺伝子と入れ換えたり、 正常な遺伝子を補ったりするこ とにより、 遺伝子疾患を根本的に解決しょうとするのが、 遺伝子治療である。 こ の遺伝子治療に当たって重要なことは、 正常な遺伝子を標的細胞に正確に導入す ると共に、 導入した遺伝子を正確に発現させることである。 正常な遠伝子を標的 細胞に導入するための遺伝子のベクターとしては、 これまで、 レトロウイルスべ クタ一、 アデノウイルスベクター、 アデノ随伴ウィルスベクター等のウィルスべ クタ一や、 リボソーム等に代表される非ウィルスベクターが用いられてきた。 し かし、 いずれも標的細胞への遺伝子の導入効率が低い等の欠点が存在した。 また 、 導入された遺伝子の発現効率が悪い等の欠点もあったため治療に不十分な場合 が多かった。 この場合でも、 アデノシンデァミナーゼ （ADA) 欠損症のように、 正 常 ADA遺伝子が導入された細胞が生存優位性 （survival advantage) あるいは増殖 優位性 （growth advantage) を獲得し、 体内で次第に選択され優位になっていく ものと期待されるものであれば、 たとえ遺伝子導入効率が低くても次第に治療効 果が現れるようになつていく可能性がある。 しかし、 このような体内での選択性 が期待てきないタイプの治療用遺伝子を導入する必要のある場合も多く、 遺伝子 を導入した細胞を選択的に増幅させるシステムの確立が望まれていた。
ところで、 G-CSFは、 好中球を選択的に増殖させるサイ トカイン （造血因子） と して従来から考えられてきたが、 近年、 G-CSFを投与すると、 好中球の増加がみら れるばかりでなく、 造血幹細胞/前駆細胞の体内ブールの増加がみられることが 報告された （臨床血液.， 35, 1080(1994)) 。 また、 G-CSFが機能する機構として、 G-CSF刺激により G- CSF受容体が活性化されるときには、 G-CSF受容体の二量体化が みられること (Proc Growth Factor Res. ,3(2), 131-141(1991)) や、 G-CSF受容体 には、 増殖誘導ドメインと分化誘導ドメインが存在することが報告された （Cell .,74,1079-1087(1993)) 。 さらに、 G- CSF受容体同様、 二量体化により活性化する 受容体としては、 エストロゲン受容体が知られており （J Biol Chei. , 264,2397 -2400(1989)) 、 細胞内でエストロゲン受容体と c-Ablチロシンキナーゼの融合夕 ンパク質を発現させることにより c-Ablチロシンキナーゼの活性化が起こることも 報告された (The EMB0 Journal.， 12,2809- 2819(1993)) 。 発明の開示
本発明は、 治療用遺伝子を導入した造血幹細胞等を体内あるいは体外で選択的 に増幅させることにより、 遺伝子導入効率が低いという問題点を克服することを 狙ったもので、 造血幹細胞等を標的とした遺伝子治療の基盤技術を提供すること を目的とする。
現在、 遺伝子治療の分野においては、 標的細胞への遺伝子の導入効率及び導入 された遺伝子の発現効率の面で克服すべき課題が多い。 従って、 遺伝子導入がな された標的細胞のみを選択的に増殖させるシステムが確立されれば、 大きな飛躍 がもたらされることは、 明らかである。 特に、 赤血球、 白血球など多くの血液細 胞の基となる細胞であり、 遺伝子治療の標的細胞として最も好ましいとされる造 血幹細胞に対し、 かかるシステムが確立されれば、 遺伝子治療の分野における貢 献度は、 非常に大きい。
本発明者らは、 好中球を選択的に増殖させるサイ トカイン （造血因子） として 従来から考えられてきた G- CSFが、 造血幹細胞の増殖をも引き起こし、 この G- CSF 受容体が活性化される際に、 G-CSF受容体の二量体化がみられることに鑑み、 遺伝 子工学的手法を用いて工夫した G-CSF受容体の二量体化により、 造血幹細胞を増殖 させるシステムを想到した。 また、 エストロゲン刺激によりエストロゲン受容体 が二量体化するということに鑑み、 G-CSF受容体遗伝子とエストロゲン受容体遺伝 子のキメラ遺伝子を作製し、 そのキメラ遺伝子を導入した細胞に対して外部から エス卜ロゲン刺激を与えることにより、 強制的にキメラ遺伝子産物中の G-CSF受容 体部分を二量体化させることを想到した。
即ち、 本発明者らは、 外部からのエストロゲン刺激により、 キメラ遺伝子産物 中の G-CSF受容体部分の活性化を引き起こし、 遺伝子を導入した造血幹細胞を選択 的に増殖させるシステムを新規に開発し、 これを遺伝子治療の分野に応用すべく 本発明を完成した。
本発明は、 リガンドが結合する領域、 該領域にリガンドが結合すると会合する 領域、 及び、 会合すると細胞に増殖活性を付与する領域、 とを含む融合タンパク 質、 該融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクター、 該ベクターを含む細 胞及びステロイ ドホルモンを作用させることにより該細胞を体内ないし体外で選 択的に増殖させる方法等に関する。 また、 本発明は、 該ベクターが外来遺伝子を 含む場合は、 該外来遺伝子が導入された細胞を選択的に増殖させる方法等に関す る。
より具体的には、
( 1 ) (a) リガンドが結合する領域、 （b) (a) の領域にリガンドが結合す ると会合する領域、 及び （c) サイ トカイン受容体又はその一部からなり、 会合 すると細胞に増殖活性を付与する領域、 を含む融合タンパク質、
(2 ) 「サイ ト力イン受容体又はその一部からなり、 会合すると細胞に増殖活性 を付与する領域」 が、 G-CSF受容体に由来する、 （ 1 ) 記載の融合タンパク質、
(3 ) 「リガンドが結合する領域」 がステロイ ドホルモン受容体に由来する、 （ 1 ) 記載の融合タンパク質、
(4 ) ステロイ ドホルモン受容体がエストロゲン受容体である、 （3) 記載の融 合タンパク質、
(5 ) ( 1 ) 記載の融合タンパク質をコ— ドする遺伝子を含むベクター、
( 6 ) (5) 記載のベクタ—を保持する細胞、
( 7 ) (6) 記載の細胞に対して、 ( 1 ) 記載の融合夕ンパク質の 「リガンドが 結合するドメイン」 に作用するリガンドを作用させて、 （6) 記載の細胞を選択 的に増殖させる方法、
(8 ) (a) リガンドが結合する領域、 （b) (a) の領域にリガンドが結合する と会合する領域、 及び （ C ) 会合すると細胞に増殖活性を付与する領域、 とを含 む融合タンパク質をコー ドする遺伝子と所望の外来遺伝子、 を含むベクタ—、
(9) 「会合すると細胞に増殖活性を付与する領域」 がサイ トカイン受容体に由 来する、 （8) 記載のベクタ一、
(10) サイ トカイン受容体が G- CSF受容体である （9) 記載のベクタ—、
( 1 1 ) 「リガンドが結合する領域」 がステロイ ドホルモン受容体に由来する、 (8) 記載のベクター、
(12) ステロイ ドホルモン受容体がエストロゲン受容体である （ 1 1) 記載の ベクタ一、
( 13) 「融合タンパク質をコードする遺伝子」 と 「外来遺伝子」 とが同一の分 子上に位置している （8) 記載のベクター、
( 14) 「融合タンパク質をコードする遺伝子」 と 「外来遗伝子」 とが別々の分 子上に位置している （8) 記載のベクター、
( 15) (8) 〜 （ 14) のいずれかに記載のベクターを保持する細胞、
( 16) ( 15) 記載の細胞に対して、 （8) 記載のベクターに含まれる遺伝子 がコ一ドする融合タンパク質の 「リガンドが結合するドメイン」 に作用するリガ ンドを作用させて、 （15) に記載の細胞を選択的に増殖させる方法、
( 17) (a) (5) または （8) に記載のベクター、 及び （b) 該ベクタ一に 含まれる遺伝子がコードする融合タンパク質の 「リガンドが結合するドメイン j に作用するリガンド、 を含むキッ ト、
に関する。
本発明に用いられるリガンドは、 特定のタンパク質に作用することにより該夕 ンパク質を会合せしめるものであれば、 特に制限はないが、 ステロイ ドホルモン が好適である。 ステロイ ドホルモンとしては、 例えば、 エストロゲン、 アンド口 ゲン、 了'コゲステロン、 グルココルチコイ ド、 ミネラルコルチコイ ドなどが挙げ られ、 それぞれの受容体タンパク質との組み合わせで用いられる。 また、 本発明 に用いられるサイ トカイン受容体は、 会合することによって細胞に増殖活性を付 与するものであればよく、 例えば、 G-CSFなどサイ ト力イン受容体ファミリーに属 するものや、 c-kitや flk2/flt3などのようにチロシンキナーゼ受容体ファミ リ一 に属するもの等がある。
本発明の融合タンパク質における 「細胞に増殖活性を付与する領域」 としては 、 細胞内増殖シグナルを伝える分子、 例えば、 サイ トカイン受容体分子全体を用 いることが可能であるが、 分子中の細胞に増殖活性を付与する領域のみを用いる ことも可能である。 この場合、 融合タンパク質遺伝子が導入された細胞の分化を 起こさず増殖のみを起こすので、 該細胞をそのままの形で増殖させる際に有利で ある。 さらに、 本発明において用いられるベクターには、 融合タンパク質をコー ドする遺伝子を含む単一種分子のベクター、 融合タンパク質と外来遺伝子の双方 を含む単一種分子のベクターの他、 融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベ クタ一と外来遺伝子を含むベク夕一の組み合わせからなる複数種の分子からなる ベクター系、 例えば、 バイナリーベクター系も含まれる。 この複数種の分子から なるベクタ—系は通常、 共形質転換 （co-transformation) によって細胞に導入さ れる。
なお、 融合タンパク質をコードする遺伝子と外来遗伝子とを同一のベクタ一に 挿入する場合には、 IRES ( internal ribosome entry site) (特表平 6- 509713号 公報） を含むジシストロニックの形にすることができる。 例えば、 「5'—プロモ 一夕—一外来适伝子一 IRES—融合タンパク質をコ— ドする遺伝子— 3'」 の構成を 有するベクター、 又は、 「5'—プロモーター一融合タンパク質をコ―ドする遗伝 子一 IRES—外来遺伝子一 3'」 の構成を有するベクタ—を用いることができる。 該 融合夕ンパク質遺伝子を発現している細胞のほぼ全てが外来遺伝子を発現してい るようにするには、 前者の形が一般に用いられる。
また、 本発明において、 ベクタ—の導入される細胞としては、 造血幹細胞、 リ ンパ系細胞、 これら血球系以外の細胞などが挙げられる。 特に、 本発明は、 自己 複製能を有する造血幹細胞に好適に適用される。 なお、 本発明において細胞に導 入される外来遺伝子については、 特に制限はないが、 遺伝子治療の分野において は、 欠陥遺伝子に対応する正常な遺伝子を用いるのが有効である。 図面の簡単な説明
図 1の（A)は、 G-CSF受容体とエストロゲン受容体のキメラ分子 （GCRER) を示す 。 （B )は、 G-CSF受容体とエス 卜ロゲン受容体のキメラ分子のうち、 G- CSF受容体の 5番目から 195番目のアミノ酸が欠失した変異体 （GCRA (5-195 )/ER) を示す。 （C )は、 G-CSF受容体とエス トロゲン受容体のキメラ分子のうち、 G-CSF受容体の 5番 0から 195番目及び 725番目から 756番目のアミノ酸が欠失した変異体 （GCRA ( 5-1 95, 725-756 )/E ) を示す。
図 2は、 G- CSF受容体とエス トロゲン受容体のキメラ遺伝子を組み込んだレ 卜口 ウィルスベクター 「pMX」 を示す図である。
図 3は、 「pCMX- GCRERj を用いて形質転換した Ba/F3細胞の増殖を絰時的に示す 図である。
図 4は、 「pC X-GCRER」 を用いて形質転換した Ba/F3細胞に対し、 様々な濃度の エストラジオール刺激を与えた後の、 Ba/F3細胞の増殖を絰時的に示す図である。 図 5は、 「pCMX-GCRA (5-195)/ER」 を用いて形質転換した Ba/F3細胞の増殖を絰 時的に示す図である。
図 6は、 プラスミ ド 「pCMX-GCRER- IRES-CD24」 を示す図である。
図 7は、 プラスミ ド 「pCMX-GCRA ( 5-195 )/ER-IRES-CD24」 を示す図である。 図 8は、 プラスミ ド 「pCMX-GCRA (5- 195、725-756 )/ER-IRES-CD24」 を示す図で ある。
図 9は、 rpC X-GCRA (5-195 )/ER- IRES-CD24j を導入した Ba/F3細胞における C D24の発現をフローサイ トメ トリーにより検出した図である。 上は、 「pCMX-GCRA ( 5-195 )/ER- IRES- CD24」 を導入した Ba/F3細胞での結果を示し、 下は対照として用 いた 「pCMX-GCRA (5-195 )/ER」 を導入した Ba/F3細胞での結果を示す （なお、 死細 胞検出のために用いたヨウ化プロビディゥムからのシグナルもデーターに含まれ ている） 。
図 1 0は、 「vMXGCRER」 が導入された骨髄細胞により構成された顆粒球-マクロ ファージ系コロニ一を示す顕微鏡写真である。
図 1 1は、 「vMXGCRA ( 5-195 )/ER」 が導入された骨髄細胞により構成された赤 芽球系コロニーを示す顕微鏡写真である。
図 1 2は、 「vMXGCRER」 が導入された骨髄細胞より分化したマクロファージを ライ トギムザ染色した顕微鏡写真である。 図 1 3は、 「vMXGCRA - 195)/ER」 が導入された骨髄細胞より分化した赤芽球 をライ トギムザ染色した顕微鏡写真である。 発明を実施するための最良の形態
[実施例 1 ] 選択的増幅遺伝子である G-CSF受容体/エス トロゲン受容体キメ ラ遺伝子の作製
G-CSF受容体全体とエストロゲン受容体のリガンド （エストロゲン） 結合領域の キメラタンパク質 （以下、 単に 「GCREIl」 と称する） が産生されるように、 それそ れのタンパク質をコ―ドする cDNAの融合遺伝子を作製した （図 1(A)) 。 次いで、 G-CSFに対する反応性を欠いたキメラタンパク質を産生するために、 「GCRER」 に 対応する融合遺伝子のうち G-CSF受容体の細胞外ドメインの 5番目の Gluから 1 9 5番目の Leuまでの部分を除いた変異誘導体 （以下、 単に 「GCRA(5- 195)/ER」 と 称する） を作製した （図 1 (B)) 。 さらに該変異誘導体から、 G- CSF受容体の分化 誘導ドメイン（725〜756)を含んだ部分を除いた変異誘導体 （以下、 単に 「GCRA( 5-195,725-756)/ERj と称する） を作製した （図 1 (C)) 。
[実施例 2] 選択的増幅遗伝子である G-CSF受容体/エストロゲン受容体キヌ ラ遗伝子が導入された Ba/F3細胞の単離
実施例 1で作製した 3種類の選択的増幅遣伝子をブラスミ ド 「pCMX」 （Cancer Res. 56: 4164(1996)) に組み込んで作成したプラスミ ド 10 gを、 Sealにて直線 化したブラストサイジン耐性遺伝子を有する 「pSV2bsr」 （科研製薬社製） l〃g とともに、 IL-3依存性細胞株である Ba/F3細胞に電気穿孔法にて導入した。 次いで 、 電気穿孔施行後の細胞を 5xl05個ずつ 24ゥヱルプレートに分配し、 ブラストサ ィジン 10/ig/mlを含む培地で培養した。 この結果、 「pCMX- GCRER」 を導入した場 合は、 17ゥエル中 11ゥエルで、 「pCMX- GCRA( 5-195〉/ER」 の場合は、 29ゥエル中 3 ゥエルで、 「pCMX- GCilA (5-195、 725-756)/ER」 では、 52ゥエル中 52ゥェルで、 ブ ラストサイジン耐性の細胞増殖がみられた。 次いで、 これらブラストサイジン耐 性の細胞をゥエルごとに IL-3で増殖させた後、 IL-3の代わりにエストラジオール 10—7Mを加えて培養を行ったところ、 「pCMX-GCilER」 を導入した場合は、 11ゥエル 中 7ゥエルで、 「pCMX- GCR厶（5-195)/ER」 の場合は、 3ゥエル中 3ゥエルで、 「pCM X-GCRA ( 5-195, 725-756 )/ERj の場合は、 16ゥェル中 13ゥェルで、 IL-3非依存性 · エストロゲン依存性の細胞増殖がみられた。 なお、 「pCMX-GCRER」 の代わりにレ トロウィルスベクタ—である 「pMX」 ( Exp. Hematol . 24 : 324( 1996 ) ) に 「GCRE R」 を挿入したもの （以下、 単に 「pMX-GCRER」 と称する） （図 2 ) を用いて同様 の実験を行ったところ、 各 1細胞を含む 24ゥエル中 2ゥエルで、 IL- 3非依存性 -ェ ストロゲン依存性の細胞増殖がみられた。 また、 「pCMX- GCRER」 を導入した細胞 に対し、 エス卜ラジオ—ルに代えて、 InMの G-CSFを加えたところ、 G-CSFで増殖の あるゥエルは、 エス 卜ラジオールで増殖のあるゥエルと一致した。 さらに、 ブラ スミ ド未導入の Ba/F3細胞をコントロ—ルとして用いたところ、 G- CSF及びエスト ラジオールによる増殖は認められなかった。 なお、 目的の融合タンパク質が細胞 内で生産されていることは、 抗 G- CSF受容体抗体又は抗エストロゲン受容体抗体を 用いたウェス夕ンブロッティング法により確認した。
[実施例 3 ] エストラジオ—ルによる細胞増殖の解析
実施例 2で限界希釈法にて得たクローンのうち、 エストラジオールに対する反 応性の良いものを選択し、 以下の実験 （XTTァヅセィ） に用いた。
まず、 「pCMX-GCRER」 を導入した Ba/F3細胞にて検討を行った。 この結果、 G-C SF及びエス卜ラジオ—ル刺激にて、 IL-3非依存性の細胞増殖が認められた （図 3 さらに、 エストラジオール濃度を 10— 1 4〜10—7Mの間で変化させて同様の実験 を行ったところ、 10 9〜： 10—7Mの間で細胞増殖が認められた （図 4 ) 。 これにより 、 10— 9〜： 10— 7Mの間の濃度によるエストラジオール刺激により、 細胞増殖シグナル が伝達されることが示唆された。
次いで、 「pCMX-GCRA ( 5-195 )/ER」 を導入した Ba/F3細胞にて検討をおこなった 。 この結果、 G-CSF刺激による細胞増殖はブロックされ、 エストラジオール刺激に よってのみ細胞増殖が認められた （図 5 ) 。
同様に、 「pCMX-GRA ( 5-195、 725-756 )/ER」 を導入した Ba/F3細胞でも、 ェスト ロゲン刺激で細胞増殖が起こり、 G-CSFに対する反応性は認められなかった。
[実施例 4 ] IRES- CD24発現プラスミ ドの作成
「pCMX_GCRER」 を Hindl l l , EcoRIで切断し、 ベクター断片 （ 「断片 1」 ) を回収 した。 また、 「pCMX-GCRER」 および 「pCMX-GCRA ( 5-195 )/ER」 それそれから、 Hi ndlllと Kpnl断片 （それぞれ 「断片 2」 ：1672bp、 「断片 3」 :1099bp) 、 EcoRIと Kp nl断片 （それぞれ 「断片 4」 ：1888bp、 「断片 5」 :1792bp) を回収した。 pBCEC(pB luescriptllKSに EMCV由来の IRESと CD24を連結したもの， Migita, Μ·， Pro Natl .Acad. Sci. USA 92: 12075(1995)) を Apolにて消化し、 IRES- CD24を含む断片 ( 「 断片 6」 ： 950bp) を回収した。 「断片 1」 、 「断片 2」 、 「断片 4」 、 および 「断片 6」 をライゲーシヨンし 「pCMXGCRER- IRES-CD24」 （図 6) を、 「断片 1」 、 「断片 3」 、 「断片 4」 、 および 「断片 6」 をライゲ一シヨンし 「pCMX- GCR厶（5-195)/ER- IRES-CD24j (図 7) を、 「断片 1」 、 「断片 3」 、 「断片 5」 、 「断片 6」 をライゲ —シヨンし 「pCMX-GCRA(5-195、725- 756)/ER-IRES-CD24」 （図 8) を構築した。
[実施例 5 ] CD24の細胞内発現
Ba/F3を PBSにて 2回、 「0PTI-MEMI」 （Gibco-BRL社製） にて 1回洗浄した 10'細胞を 0.2mlの 「0PTI- MEMI」 に想濁し、 「pCMX-GCRER-IRES-CD24」 、 「pCMX-GCRA (5-1 95)/ER- IRES-CD24」 、 「pCMX-GCRA (5-195、 725-756)/ER-IRES-CD24」 をそれぞれ lOmgずつ加え、 「Gene Pulser」 （Bioilad社製）を用いて 290V、 960mFにて導入した o 導入後、 2日間 10% FCS, 10U/ml mIL-3 (R & D SYSTEMS社製） を含む &PMI培地 にて培養した。 〗06細胞を 5%FCS/PBSにて洗浄後、 lmg/ l 抗 CD24抗体 (Pharming en社製）を室温 30分反応させ、 5%FCS/PBSにて 2回洗浄後、 1 :20希釈した PE標識抗 マウス抗体（DAK0社製）を室温 30分反応させ、 5%FCS/PBSにて 2回洗浄した。 5mg/in 1 ヨウ化プロビジゥム（propidium iodide)/ PBS 1mlに想濁し、 フローサイ トメ ト リ一 （Becton Dickinson)にて 585nmのディテクターを用いて CD24の発現の解析を 行った。 この結果、 「pCMX-GCRA(5-195)/ER- IRES-CD24」 が導入された細胞では 、 多くの細胞で CD24の発現が検出された。 なお、 pCMX-GCRA(5- 195)/ER- IRES-CD 24」 が導入された細胞の対照としては 「pCMX- GCRA(5- 195)/ERj が導入された細 胞を用いた。 結果を図 9および表 1に示す。 なお、 死細胞検出のために用いたョ ゥ化プロビディゥムからのシグナルもデータ一値に含まれている。 導入プラスミ ド 抗 CD24抗原（-）細胞 抗 CD24抗原（+ )細胞 pCMX-GCRA (5-195) 59.77% 40.23¾
/ER-IRES-CD24 pCMX-GCRA (5-195 )/ER 85.10% 14.90%
[実施例 6 ] プロジヱ二夕一アツセィ
6週齢 C57BLマウス 4匹に 5-フルォロウラシル （5FU：和光純薬社製） 生理食塩水 溶液（10mg/ml)を 300ml/匹静脈注射を行った。 投与後 2日目に、 大腿骨より骨髄を 採取し、 rLympholyte-Mj (Cederlane社製）上にて遠心 (1500rpm、 25。C、 22分） により単核球を単離した。 20%FCS、 100U/ml IL6、 100mg/mlラット SCFを添加した イスコフ変法ダルベッコ基本培地（IMDM;Gibco社製）にて 2日間培養した。 CH296 ( 宝酒造社製、 Hanenberg, H. et al. ature Med. 2: 876(1996)) をコートしたプ レート （1146： ファルコン社製） 上にて、 IL6と SCFにて前刺激した骨髄細胞 106を 、 ェコ トロビックパッケージング細胞株 「GP+E - 86j (J. Virol. 62: 1120(1988 )) に 「pMX- GCRERj を組み込み培養上清に得られたレトロウイルス 「vMXGCRER」 、 またはェコ トロビックパッケージング細胞株 「GP+E- 86」 に 「pMXGCRA( 5-195) /ERj を組み込み培養上清に得られたレ トロウイルス 「vMXGCRA(5-195)/EILi を 1 08含む培養上清で懸濁し、 IL6と SCFを添加し培養した。 2, 24， 26, 36, 38時間後 にウィルス上清を交換した。 6回目のウィルス上清交換の 24時間後、 細胞を 10ソ w ellになるようにメチルセルロースを含む培地（IMDM, 1.2¾ メチルセルロース 15 00cp;Wako, 20¾ FCS, 1% 脱イオン化 BSA， lOmM 2-メルカプトエタノール， 10— 7M b-エス トラジオール）にて培養した。 10日培養後コロニーを顕微鏡観察した後、 塗抹標本を作成しライ トギムザ染色後、 構成細胞の同定を行った。
この結果、 「vMXGCRER」 「vMXGCRA(5-195)/ER」 が感染した骨髄細胞では、 ェ ストラジオール刺激で分化した顆粒球一マクロファ一ジ系コロニー、 赤芽球系コ ロニーが観察された。 エストラジオール刺激によって 「vMXGCRER」 感染骨髄細胞 より形成された顆粒球—マクロファージ系コロニーを図 1 0に示す。 エストラジ オール刺激によって 「vMXGCRA ( 5-195 )/ER」 感染骨髄細胞より形成された赤芽球 系コロニーを図 1 1に示す。 これらのコロニーの構成細胞を塗抹標本にしてライ 卜—ギムザ染色したところ、 分化した血球細胞像が得られた。 「v XGCRER」 感染 骨髄細胞より形成された顆粒球一マクロファージ系コロニーの塗抹標本で観察さ れたマクロファージのにしてライ ト一ギムザ染色像を図 1 2に、 「vMXGCRA ( 5- l 95 )/ER」 感染骨髄細胞より形成された赤芽球系コロニーの塗抹標本で観察された 赤芽球のライ トーギムザ染色像を図 1 3に示す。 産業上の利用の可能性
本発明によって、 外来遺伝子を導入した細胞を、 外部刺激により選択的に増幅 させることが可能となり、 標的細胞への遺伝子の導入効率などが低い場合であつ ても、 有効な遺伝子治療が行えるようになった。 また、 本発明における細胞の選 択的増幅システムは、 様々な血液細胞に適用が可能であるため、 遺伝子治療の対 象となる細胞の範囲の拡大が図られた。 従って、 本発明によって、 特に遗伝子治 療の分野において重要な基盤技術が提供された。

Claims

請求の範囲
1. (a) リガンドが結合する領域、 （b) (a) の領域にリガンドが結合する と会合する領域、 及び （c) サイ 卜力イン受容体又はその一部からなり、 会合す ると細胞に増殖活性を付与する領域、 を含む融合タンパク質。
2. 「サイ トカイン受容体又はその一部からなり、 会合すると細胞に増殖活性を 付与する領域」 が、 G- CSF受容体に由来する、 請求項 1記載の融合タンパク質。
3. 「リガンドが結合する領域 j がステロイ ドホルモン受容体に由来する、 請求 項 1記載の融合タンパク質。
4. ステロイ ドホルモン受容体がエストロゲン受容体である、 請求項 3記載の融 合夕ンパク質。
5. 請求項 1記載の融合タンパク質をコ一ドする遺伝子を含むベクター。
6. 請求項 5に記載のベクターを保持する細胞。
7. 請求項 6に記載の細胞に対して、 請求項 1記載の融合タンパク質の 「リガン ドが結合するドメイン」 に作用するリガンドを作用させて、 請求項 6に記載の細 胞を選択的に増殖させる方法。
8. (a) リガンドが結合する領域、 （b) (a) の領域にリガンドが結合する と会合する領域、 及び （c) 会合すると細胞に増殖活性を付与する領域、 とを含 む融合タンパク質をコー ドする遺伝子と所望の外来遺伝子、 を含むベクタ一。
9. 「会合すると細胞に増殖活性を付与する領域」 がサイ トカイン受容体に由来 する、 請求項 8記載のベクタ一。
10. サイ トカイン受容体が G-CSF受容体である請求項 9記載のベクター。
1 1. 「リガンドが結合する領域」 がステロイ ドホルモン受容体に由来する、 請 求項 8記載のベクター。
12. ステロイ ドホルモン受容体がエス卜ロゲン受容体である請求項 1 1記載の ベクター。
13. 「融合タンパク質をコードする遺伝子」 と 「外来遺伝子」 とが同一の分子 上に位置している請求項 8記載のベクター。
14. 「融合タンパク質をコードする遺伝子」 と 「外来遺伝子」 とが別々の分子 上に位置している請求項 8記載のベクタ一。
15. 請求項 8〜 14のいずれかに記載のベクターを保持する細胞。
16. 請求項 15に記載の細胞に対して、 請求項 8記載のベクターに含まれる遺 伝子がコ一ドする融合夕ンパク質の 「リガンドが結合するドメイン」 に作用する リガンドを作用させて、 請求項 15に記載の細胞を選択的に増殖させる方法。
17. (a) 請求項 5または 8に記載のベクタ一、 及び （b) 該ベクタ一に含ま れる遺伝子がコードする融合タンパク質の 「リガンドが結合するドメイン」 に作 用するリガンド、 を含むキッ ト。
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