WO1997028281A1 - Procede d'evaluation de l'activite de la telomerase - Google Patents

Procede d'evaluation de l'activite de la telomerase Download PDF

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WO1997028281A1
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Masayuki Tsuchiya
Ericka Savoysky
Ken-Ichi Akamatsu
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Chugai Seiyaku Kabusiki Kaisha
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    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining telomerase activity.
  • Telomerase is known to be an enzyme that catalyzes the extension of telomere terminals (terminal portions of linear chromosomes), and many studies have been made (Greider C.. And blackburn EH, (1987) ) Cell, 51, 887-898; Morin GB (1989) Cell, 59, 521-529).
  • telomerase activity is not detected in normal cells except for some cells such as hematopoietic stem cells.
  • strong telomerase activity can be detected in most cancer cells, suggesting that it is involved in maintaining infinite growth of cancer cells. Therefore, the detection and quantification of telomerase activity is important for the diagnosis of cancer, and its inhibitor can be expected as an anticancer drug with few side effects on normal cells (Counter CM. Et al., (1989) EMBO J., 11, 1921-1929; Counter CM et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 2900-2904; Chadeneau C. et al., (1995) Cancer Res..55, 2533-2536; Hiyama E. et al., (1995) Nature Med., 1, 249-255, Shay JW et a 1., (1995) Mol.Cell.Biol., 15,425- 432).
  • telomere has included the use of the ciliate Tetrahymena (Greider and Blackburn, 1985; 1987; 1989). This study detects telomerase with a single primer extension Atsey system. The only required to be based on quality in such Atsusi to an oligonucleotide sequence of Teromea single-stranded (TTGGGG) is 3, dGTP, dTTP, dGTP labeled with ⁇ beauty 32 P. A repeat of the Tetrahymena telomere sequence TTGGGG is added to the 3 'end of the oligonucleotide primer during a short incubation at room temperature.
  • reaction products are detected by electrophoresis and autoradiography.
  • kinetics and primer specificity Rosey, kinetics and primer specificity (Ro mero and Blackburn. 1991; Lee and Blackburn, 1993, Collins and Greider. 1993; Autexier and Greider, 1994) and telomerase from other male caterpillars. Loaning etc. became possible.
  • telomeres were as small as 92, and their telomerase activity was thought to be undetectable.
  • telomerase activity was found using human cell extract derived from human cervical carcinoma He cell extract (Morin, 1989), and many TTAGGG repeats were telomerized. It was revealed that telomerase is an enzyme conserved in all eukaryotic cells, suggesting that telomerase was significantly activated in human tumor cells ( Counter et al .. 1992; 1994).
  • telomerase activity is carried out by measuring the intensity of each of the appearing bands with a densitometer or the like and comparing it with a known amount of, for example, HeLa cell extract used as a control.
  • This method improves sensitivity and allows telomerase activity to be detected with as few as 100 cells. That is, the detection sensitivity of telomerase activity can be increased by 1 ( ⁇ times) as compared with the conventional Atsey method, and the sensitivity is dramatically improved as compared with the conventional technology.
  • polyacrylic Riruami Dogeru has the analysis of electrophoresis or by HPLC or the like 32 P- labeled reaction product or fluorescence-labeled reaction products still needed, there is a limit to the number of samples that can be measured, if the 32 P.
  • problems with its handling eg, gel or large wastewater treatment. Separation such as gel preparation and electrophoresis
  • the time required for (analysis) and the time for exposure (detection) and a series of operations take a long time, and then the intensity of the detected band must be quantified using a densitometer. And the results were delayed.
  • An object of the present invention is to provide a method capable of detecting and quantifying telomerase activity quickly and with high sensitivity.
  • telomere activity could be detected and quantified quickly and with high sensitivity, and completed the present invention.
  • the present invention relates to the presence of a radioisotope using a primer obtained by modifying an oligonucleotide sequence synthesized by a telomerase DNA synthesis reaction with one of two substances capable of binding to each other.
  • the resulting sequence was amplified by a volimerase chain reaction below, and the resulting sequence was previously bound to the microparticle coated with the other of the two types of substances capable of binding to each other, and generated from the microparticle by the binding.
  • This is a method for quantifying telomerase activity which comprises quantifying telomerase activity by measuring scintillation.
  • the present invention provides a DNA synthesis reaction by telomerase in the presence of a radioisotope using a primer modified with one of two types of substances that can bind to each other, It is characterized in that telomerase activity is quantified by binding to microparticles coated with the other of the two types of substances that can bind to each other and measuring scintillation generated from the microparticles by the binding.
  • telomerase activity is quantified by binding to microparticles coated with the other of the two types of substances that can bind to each other and measuring scintillation generated from the microparticles by the binding.
  • biotin and avidin are mentioned as two kinds of substances that can bind to each other.
  • the present invention is a method for detecting and quantifying telomerase activity in a cell extract.
  • the present invention uses a primer obtained by modifying an oligonucleotide sequence (telomere repeat sequence) synthesized by a telomerase DNA synthesis reaction with one of two substances capable of binding to each other. Includes a method of amplification in the presence of radioisotopes. However, a method of reacting the telomeric repeat sequence without amplifying it is also included in the present invention.
  • the obtained reaction product is previously bound to microparticles coated with the other of the two types of substances capable of binding to each other, and scintillation generated from the microparticles by the binding is measured. Quantify telomerase activity.
  • the polymerase chain reaction method can be used. Highly sensitive detection results can be obtained by the polymerase chain reaction.
  • the polymerase chain reaction is carried out in the presence of radioactive isotopes, such as 3 H or 1 2 using two kinds of primers modified with one of substances capable of binding to each other at the 5 'end of the oligonucleotide primer .
  • Trotype types of substances that can bind to each other include, for example, enzymes and substrates, biotin and avidin, antigens and antibodies, lectins and their receptors, hormones and their receptors, neurotransmitters and their receptors And the like.
  • Primers can be designed according to the telomere sequence to be amplified.
  • the primer described in SEQ ID NO: 1 (TS primer) or the primer described in SEQ ID NO: 2 (CX primer) can be used.
  • a known method can be used to bind the 5'-end of the primer to the ligand (for example, in the case of biotinylation).
  • this technique can be performed in a normal Atsushi buffer.
  • SPA beads attached to a reverse transcriptase activity detection kit (product number NK9020) supplied by Amersham can be used.
  • the extended oligonucleotide sequence amplified by the volimerase chain reaction is bound to the microparticle previously coated with the other of the two types of substances capable of binding to each other.
  • the primer is biotinylated
  • microparticles coated with streptavidin the other of the two substances, can be used. Since ⁇ O Rigo nucleotide is labeled with a radioisotope (3 H or 1 2 5 I, etc.), a result of amplification oligonucleotides bound to microparticles, the low energy emitted from the 3 H or 1 2/3
  • the lines stimulate the microparticles, which emit light (scintillation). The presence of the target oligonucleotide can be detected by measuring the scintillation as a signal.
  • the intensity of the detected signal is proportional to the amount of the reaction product bound to the microparticle, ie, the activity of telomerase. Therefore, a high signal means that telomerase activity is high.
  • the quantification of telomerase activity is carried out by using a standard sample as a control and measuring the fluorescence intensity as described above.
  • telomerase activity can be detected without using the above amplification method.
  • an oligonucleotide sequence synthesized by a telomerase DNA synthesis reaction is reacted in the presence of a radioisotope using a primer modified with one of two substances that can bind to each other.
  • the obtained reaction product is bound to microparticles coated in advance with the other of the two kinds of substances capable of binding to each other, and the scintillation generated from the microparticles by the binding is measured to obtain telomerase. Quantify activity.
  • the method of the present invention provides significantly higher sensitivity compared to conventional detection methods
  • telomerase activity can be easily quantified with good reproducibility, and a large amount of sample can be easily handled.
  • telomerase activity in clinically obtained tissues is extremely useful for diagnosing and monitoring the progress of cancer and the prognosis of treatment (Hiyama et al., 1995).
  • FIG. 1 is a diagram showing detection results of the present invention with respect to the concentration of a primer.
  • FIG. 2 is a diagram showing the detection results of the present invention with respect to the number of cells.
  • FIG. 3 is a diagram showing detection results of the present invention for various cells.
  • FIG. 4 is a diagram showing the detection results of the present invention with respect to the number of cycles of the polymerase chain reaction.
  • FIG. 5 is a diagram showing the detection results of the present invention with respect to the number of cells.
  • Cell extracts were prepared by known methods (Kim NW et al., (1994) Science, 206. 2011-2015): Prepared with some modifications. That is, the human erythroleukemia cell line HEL was cultured, and cells in the logarithmic growth phase were centrifuged at 2000 rpni for 5 minutes to collect the cells. The cells were washed twice with ice-cold PBS and once with ice-cold RNase-free washing buffer (10 mM Hepes pH 7.5. 1 mU MgCh, 10 mM KC1 and 1 mM DTT).
  • Pellet cells were lysed in lysis buffer without RNase (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM MgCl 2 , 1 mM EGTA, 0. ImM PSF, 5 mM MS-mercaptoethanol, 0.5% CHAPS (Cholamidopropyl -di me thy resuspended at 5 x 10 5 cells in 1 -amnion io-l-propanesulfonate) and 10% glycerol) in. After gently stirring and incubating on ice for 30 minutes, impurities in the lysate were removed by centrifugation at 15.000 rpm for 30 minutes. The supernatant was aliquoted and stored at -80 ⁇ m.
  • TS primer SEQ ID NO: 1
  • CX primer SEQ ID NO: 2
  • the CX and TS primers that were biotinylated were synthesized by force coupling of the biotin LCiotin-0N TM phosphoramidite (Clontech) to the 5 ′ end of the oligonucleotide.
  • the primer was purified using an AB10PC column (purification was performed according to the manufacturer's instructions), lyophilized, and resuspended in DEPC (getyl pio carbonate) treated water.
  • the TRAP-SPA Atsushi of the present invention can be prepared by a known method (Kim NW et al., (1994) Science, 206, 2011-2015; Piatyszek. A. et al., (1995) Meth. Cell Sci., ⁇ , 1 -15)) with the following improvements.
  • a predetermined amount (0, 0.01, 0.05. 0.1 ig / Atsey) of biotinylated CX primer (BitU-CX) was trapped under the wax layer of a Hot-Start tube (GIBC0-BRL).
  • a DNA synthesis reaction by telomerase 21 cell extracts (10 4 cells) were combined with 20 mM Tris-HCl pH 8.3, 1.5 mM MgC, 63 mM KCK 0.005% Tween 20, and ImM EGTA, 50 mM each.
  • dTTP of dATP and dCTP
  • 2 M of 50 uU of dGTP
  • 2 fid [Me- 3 H ] TTP (Amers am, 114Ci / drowsiness ol)
  • 0.1 fig / u 1 BSA 2 U Taq Boli Mela Ichize
  • Incubate at room temperature for 30 minutes on a PexVarier in 501 final reaction mixtures containing 0.1 g or the given amount of TS primer.
  • the mixture is then heated at 90 ° C for 90 seconds to amplify the synthesized telomere oligonucleotide, followed by one cycle at 94 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 45 seconds.
  • the polymerase chain reaction was performed in 31 cycles.
  • reaction product (401) was transferred to a 96-well plate (Wallac), and 50/1 streptavidin-coated microparticle fluoromicrospheres (1: 4 solution in 0.56 M EDTA) were added. After incubation at 10 ° C for 10 minutes, the biotinylated 3 H-labeled reaction product was bound to streptavidin beads.
  • the plate was counted on a MicroBeta scintillation counter (Waliac), and for comparison, a conventional method combining TRAPCTRAP and polyacrylamide gel electrophoresis; TRAP-PAGE) was performed as follows.
  • reaction product After the completion of the polymerase chain reaction, the reaction product is subjected to 10% polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) in 0.3 TBE and exposed to a phosphor imager (Fuji lmaging Plate) to analyze the reaction product (40). Was done.
  • SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
  • HEL cell CHAP S extract (1 (T and the amount corresponding to 10 s cells)), 20 mM Tris-HCK 1.5 mM MgCl 2 , 63 mM KC1, 0.005% Tween20, Im EDTA, 50 M each DATP and dGTP, 1M dTTP, 2 / Cie-3H TTP (Amersham, 114Ci / ol), 0.1 / ig BSA, and 0.1 g of biotinylated primer (501 reaction solution containing TTAGGG at room temperature). For 30 minutes.
  • reaction product 401 was then transferred to a 96-well plate, mixed with 50 "streptavidin-coated microparticle fluoromicrospheres (1: 4 solution in 0.56 M EDTA) and incubated at 37 ° C. After incubation for 10 minutes, the biotinylated 3 H-labeled reaction product was bound to streptavidin beads.
  • telomerase reaction mixture In the telomerase reaction mixture described above, the concentration of dTTP was changed to 5 5 and 2 ⁇ Ci (a32P) dGTP (Amersham, 800Ci / mniol) was added to increase the concentration of dTTP to 50M.
  • reaction product was electrophoresed on an 8% polyacrylamide gel containing 7M urea, and exposed to an imaging plate for 4 days.
  • the method of the present invention can detect telomerase activity without performing autoradiography after electrophoresis and can quantitatively measure it.
  • the sensitivity of the SPA detection of the present invention was measured by comparing with a conventional TRAP assay (TRAP-PAGE) performed by serially diluting an HEL CHAPS extract (a CHAPS extract of HE cells).
  • TRAP-PAGE a conventional TRAP assay
  • the detection limit is about 100 cells per assay (Fig. 2, lower panel).
  • telomerase activity is clearly detected even with only 10 cells. Yes ( Figure 2, top panel).
  • Lane numbers 1 to 7 in the lower panel of FIG. 2 correspond to 0, 10, 10 10 3 , 10 10 5 cells / Assy and 1 (mixture of ⁇ and RNase, respectively) in the upper panel of FIG. o
  • telomerase activity can be detected more sensitively and quantitatively by the method of the present invention.
  • the effect of cycle number on the accumulation of telomerase products by the polymerase chain reaction was also compared between the method of the present invention and the conventional method.
  • Significant incorporation of 3 H by band pattern or SPA by gel electrophoresis was observed at least after 27 cycles of amplification (FIG. 4).
  • the intensity of the detected signal increased with the number of cycles in both cases, and a very good relationship was obtained between the two methods.
  • the lane numbers 1 to 5 in the lower panel of FIG. 4 correspond to the cycle numbers 27, 28, 29, 30, and 31 in the upper panel, respectively.
  • telomere activity could be detected and quantified in the same manner as described above (FIG. 5).
  • FIG. 5 the telomerase activity with respect to the number of cells was the same in both the method of the present invention (upper) and the conventional method (lower).
  • the present invention provides a method for detecting and quantifying telomerase activity quickly and with high sensitivity.
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid (synthetic DNA) sequence characteristics
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid (synthetic DNA) sequence characteristics

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Description

明 細 書
テロメラーゼ活性の定量方法 技術分野
本発明は、 テロメラ一ゼ活性の定量方法に関する。 背景技術
テロメラ一ゼは、 テロメァ末端 （直鎖状染色体の末端部分） の伸長を触媒する 酵素であることが知られており、 数多くの研究がなされている（Greider C. . an d Blackburn E. H. , (1987) Cell, 51, 887-898; Morin G. B. (1989) Cell, 59, 521-52 9)。
テロメラーゼの活性は、 造血幹細胞など一部の細胞を除き、 正常細胞では検出 されない。 一方、 ほとんどのがん細胞で強いテロメラーゼ活性が検出できること から、 がん細胞の無限増殖の維持に関わっていると考えられる。 従って、 テロメ ラ一ゼ活性の検出、 定量は、 がんの診断に重要であり、 さらにその阻害剤は、 正 常細胞に対する副作用の少ない抗癌剤として期待することができる（Counter CM . et al. , (1989) EMBO J., 11, 1921-1929; Counter C. M. et al. , (1994) Proc. Na tl. Acad. Sci. USA, 91, 2900-2904; Chadeneau C. et al. , (1995) Cancer Res..55, 2533-2536; H i yama E. et al. , (1995) Nature Med. , 1, 249-255, Shay J. W. et a 1. , (1995) Mol. Cell. Biol., 15,425-432)。
テロメラーゼを検出するためになされた最近の研究としては、 繊毛虫であるテ トラヒメナ （Tetrahymena)を用いたものが挙げられる （Greider and Blackburn, 1985; 1987; 1989) 。 この研究は、 単一のプライマー伸長アツセィ系によりテ ロメラーゼを検出するというものである。 かかるアツセィに唯一必要とされる基 質は、 一本鎖のテロメァのオリゴヌクレオチド配列 （TTGGGG)3、 dGTP、 dTTP、 及 び32 Pで標識した dGTPである。 テトラヒメナのテロメァ配列である TTGGGGの繰り 返しは、 室温で短期間ィンキュベーションする間にォリゴヌクレオチドプラィマ 一の 3'端に付加される。 次に、 反応産物は電気泳動及びオートラジオグラフィ ー により検出される。 このアツセィにより、 キネティ クス、 ブライマー特異性 （Ro mero and Blackburn. 1991； Lee and Blackburn, 1993, Collins and Greider. 1993; Autexier and Greider, 1994) に関するテトラヒメナテロメラ一ゼの研究 及び他の雄毛虫由来のテロメラーゼの研究が可能となり、 テロメラーゼ RNA のク ローニングなどが可能となった。
—方、 ヒ トのテロメァは 92個と少なく、 そのテロメラーゼ活性は検出不能と考 えられていた。 しかし、 ヒ 卜子宮頸部癌由来の細胞株 He 細胞抽出物を用いてテ 口メラ一ゼアツセィを行った結果、 テロメラ一ゼ活性が見出され （Morin, 1989) 、 多数の TTAGGG反復配列をテロメァの 3'- 末端上に添加することが明らかにされ 、 テロメラーゼは全ての真核細胞中に保存された酵素であり、 ヒ ト腫瘍細胞中で 顕著に活性化されていることが示唆された（Counter et al.. 1992; 1994)。
しかしながら、 従来のアツセィ系には感度、 検出に要する時間、 定量性、 そし て大量のサンプル処理に問題がある （Counter et al. , 1994) 。
最近、 感度、 検出時間の問題については TRAP telomeric repeat ampl if icatio n protocol) と呼ばれるポリメラ一ゼ連鎖反応に基づく手法により改善された（K im N.W. et al., (1994) Science, 206, 2011-2015; Piatyszek M. A. et al. , (1995 ) Me th. Cell Sci..17, 1-15)) 。
この手法は、 テロメラーゼ反応及びボリメラーゼ連鎖反応を行った後、 ポリア クリルァミ ドゲル電気泳動及びォ一トラジォグラフィ一を行って反応産物を検出 するというものである。 テロメラーゼ活性の定量化は、 出現したバン ドそれぞれ の強度をデンシ トメーター等で測定し、 対照として使用された、 例えば HeLa細胞 抽出物の既知量と比較することにより行われる。
この方法により感度が改良され、 100細胞程の少ない細胞数でもテロメラーゼ 活性の検出ができる。 すなわち、 従来のアツセィ法と比較して 1(Τ倍もテロメラ ーゼ活性の検出感度を増加させることができ、 従来の技術と比較して飛躍的に感 度が向上した。
しかし、 この TRAP法でさえ、 ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動や H P L C等に よる32 P—標識反応産物や蛍光標識反応産物の分析を依然として必要としており 、 測定できるサンプル数に制限があり、 32 Pの場合、 その取扱い （例えばゲル又 は大量の廃液処理） に関する問題点もある。 さらに、 ゲル作成、 電気泳動等分離 (分析） のための時間及び露出 （検出） 時間 （通常は 2〜48時間） と一連の操作 に長時間を要し、 その後デンシ卜メーター等により、 検出されたバン ドの強度を 定量しなければならず、 結果が遅延するなどの問題点があつた。
これらの問題は、 特にリアルタイムの分析が求められる癌の進行、 予後の診断 においては極めて不都合なものであり、 大量のサンプル分析においても不都合と なる。 発明の開示
本発明は、 迅速かつ高感度にテロメラーゼ活性を検出、 定量できる方法を提供 することを目的とする。
本発明者は、 上記課題に基づいて鋭意研究を行った結果、 テロメラーゼによる DN A合成反応を、 Amersham社によって開発された（Bothworth N. and Towers P . (1989)Nature, 341, 167- 168)シンチレーショ ン近接ァッセィ技術（scintil lation proximity assay technology; SPA) と組み合わせたシステムを構築することに より、 迅速かつ高感度にテロメラーゼ活性を検出、 定量し得ることを見い出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 テロメラ一ゼによる DN A合成反応によって合成された オリゴヌクレオチド配列を、 相互に結合することができる 2種類の物質のいずれ か一方で修飾したプライマーを用いて放射性同位元素の存在下でボリメラーゼ連 鎖反応を行って增幅し、 得られる配列を予め前記相互に結合することができる 2 種類の物質の他方で被覆された微小粒子と結合させ、 該結合によって微小粒子か ら発生したシンチレーションを測定することにより、 テロメラ一ゼ活性を定量す ることを特徴とするテロメラーゼ活性の定量方法である。
さらに、 本発明は、 相互に結合することができる 2種類の物質のいずれか一方 で修飾したプライマーを用いて放射性同位元素の存在下でテロメラーゼによる D N A合成反応を行い、 得られる反応産物を予め前記相互に結合することができる 2種類の物質の他方で被覆された微小粒子と結合させ、 該結合によって微小粒子 から発生したシンチレーションを測定することにより、 テロメラ一ゼ活性を定量 することを特徴とするテロメラーゼ活性の定量方法である。 ここで、 相互に結合することができる 2種類の物質としては、 ビォチン及びァ ビジンが挙げられる。
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明は、 細胞抽出物中のテロメラーゼ活性を検出し、 その定量を行う方法で ある。 本発明には、 テロメラ一ゼによる D N A合成反応によって合成されたオリ ゴヌクレオチド配列 （テロメァ反復配列） を、 相互に結合することができる 2種 類の物質のいずれか一方で修飾したプライマーを用いて放射性同位元素の存在下 で增幅する方法が含まれる。 但し、 テロメァ反復配列を増幅することなく反応さ せる方法も本発明に含まれる。 次に、 得られる反応産物を予め前記相互に結合す ることができる 2種類の物質の他方で被覆された微小粒子と結合させ、 該結合に よって微小粒子から発生したシンチレーションを測定することにより、 テロメラ ーゼ活性を定量する。
( 1 ) 細胞抽出物によるテロメァ反復配列の増幅
テロメァ反復配列を增幅するには、 例えばポリメラ一ゼ連鎖反応法を用いるこ とができる。 ポリメラーゼ連鎖反応により高感度の検出結果が得られる。
ポリメラーゼ連鎖反応は、 オリゴヌクレオチドプライマーの 5 ' 末端に相互に 結合することができる 2種類の物質のいずれか一方で修飾したプライマーを用い て放射性同位元素、 例えば3 H又は 1 2 の存在下で行う。
「相互に結合することができる 2種類の物質」 とは、 例えば、 酵素と基質、 ビ ォチンとアビジン、 抗原と抗体、 レクチンとその受容体、 ホルモンとその受容体 、 神経伝達物質とその受容体などが挙げられる。
プライマーは、 增幅させるテロメァ配列に応じて設計することができる。 例え ば、 配列番号 1記載のプライマー （T Sプライマー） 又は配列番号 2に記載のプ ライマー （C Xプライマー） が挙げられる。 なお、 プライマーの 5' - 末端をリガ ンドと結合させる （例えばビォチン化する場合） には公知方法を用いることがで きる。 また、 この手法は通常のアツセィ緩衝液中で行うことができる。
また、 テロメラーゼによる D N A合成反応の際、 例えばピオチン化標識プライ マーを用いることで、 直接に新たに合成されたオリゴヌクレオチド配列を S P A 技術により検出することが可能である。 (2) 微小拉子の調製
微小粒子としては、 例えばアマシャム社によって供袷される逆転写酵素活性検 出キッ ト （商品番号 NK9020) 中に添付される S P Aビーズを用いることができる
(3) 伸長ォリゴヌクレオチド配列と微小粒子との結合反応及び検出
次に、 ボリメラーゼ連鎖反応によって増幅された上記伸長ォリゴヌクレオチド 配列を、 上記予め前記相互に結合することができる 2種類の物質の他方で被覆さ れた微小粒子と結合させる。 プライマーがビォチン化されている場合は、 当該 2 種類の物質の他方の物質であるストレプトアビジンを被覆した微小粒子を用いる ことができる。 增幅ォリゴヌクレオチドは放射性同位元素 （3 H又は1 2 5 I等） で標識されているので、 増幅オリゴヌクレオチドが微小粒子と結合した結果、 3 H又は1 2 から放出される低エネルギーの /3線により微小粒子が刺激され、 微小 粒子から光が発せられる （シンチレ一シヨ ン） 。 そして、 該シンチレーシヨ ンを シグナルとして測定することにより目的ォリゴヌクレオチドの存在を検出するこ とができる。
検出されるシグナルの強度は、 当該微小粒子に結合した反応生成物の量、 すな わちテロメラーゼの活性に比例する。 従って、 シグナルが高い場合はテロメラ一 ゼの活性が高いことを意味する。
テロメラーゼ活性の定量は、 標準サンプルをコン トロールとして用い、 上記に 従って蛍光強度で測定される。
(4) 本発明の方法では、 上記増幅法を用いなくてもテロメラーゼ活性を検出す ることができる。 例えば、 テロメラーゼによる D N A合成反応によって合成され たオリゴヌクレオチド配列を、 相互に結合することができる 2種類の物質のいず れか一方で修飾したプライマ一を用いて放射性同位元素の存在下で反応させる。 次に、 得られる反応産物を、 予め前記相互に結合することができる 2種類の物質 の他方で被覆された微小粒子と結合させ、 該結合によって微小粒子から発生した シンチレーションを測定することにより、 テロメラーゼ活性を定量する。
「相互に結合することができる 2種類の物質」 の意味、 微小粒子の調製法、 並 びに伸長オリゴヌクレオチド配列と微小粒子との結合反応及び検出法については
D一 前記と同様である。
本発明の方法により、 従来の検出方法と比較して明らかに高い感度が得られる
。 しかも、 低エネルギーの ;3 - 放出が要求されるのみであるため特殊な廃棄処理 設備を必要とせず、 反応産物と、 取り込まれなかった放射性同位元素とを分離さ せる必要もない。 その結果、 検出を迅速に行うことができるという主要な改良点 の一つが提供される。 すなわち、 本発明の検出方法により、 1時間以内に結果を 得ることができるため、 全体として 1 日以内で全ての測定プロセスを完了するこ とができる。
以上により、 本発明により、 テロメラーゼ活性を再現性よく定量することが容 易にでき、 大量のサンプルを容易に取り扱うことができる。
例えば、 臨床的に得られた組織のテロメラーゼ活性を定量することは、 癌の診 断及び進行や治療の予後をモニターしていくためにきわめて有用である（H i yama e t a l . , 1995) 。 図面の簡単な説明
図 1は、 プライマーの濃度に対する本発明の検出結果を示す図である。
図 2は、 細胞数に対する本発明の検出結果を示す図である。
図 3は、 各種細胞に対する本発明の検出結果を示す図である。
図 4は、 ポリメラーゼ連鎖反応のサイクル数に対する本発明の検出結果を示す 図である。
図 5は、 細胞数に対する本発明の検出結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例:こより本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明はこれら 実施例に限定されない。
〔実施例 1〕
I . 材料及び方法
( 1) 細胞抽出物の調製
細胞抽出物は、 公知の方法（Kim N. W. e t a l . , ( 1994)Sc i ence, 206. 2011 -2015)：： いくつかの改良を加えて調製した。 すなわち、 ヒ ト赤白血病細胞株 HE Lを培養 し、 対数増殖期にある細胞を 2000rpniで 5分間遠心分離し、 細胞を回収した。 氷 冷の PBSで 2回洗浄し、 氷冷の RNaseを含まない洗浄用緩衝液（10mM Hepes pH7. 5. 1 mU MgCh, lOmM KC1及び 1 mM DTT) で 1回洗浄した。 細胞のペレッ トを、 RN ase を含まない溶解緩衝液（lOmM Tris-HCl pH7.5、 1 mM MgCl2、 1 mM EGTA 、 0. ImM P SF, 5 mMS-メルカブトエタノール、 0.5 % CHAPS (Cholamidopropyl-di me thy 1 -amnion io-l-propanesulfonate ) 及び 10%グリセロール） 中に 5 x 105 細胞 で再懸濁した。 軽く撹拌し、 氷上で 30分インキュベートしたのち、 15 .OOOrpmで 30分遠心分離することにより溶解物中の不純物を取り除いた。 上清を 小分けし、 -80 てで拧蔵した。
(2) プライマーの合成
TSプライマ— （配列番号 1 ) 及び CXプライマ一 （配列番号 2 ) を、 AB1社の DNA 合成機を用いて合成した。 CX及び TSプライマ一をピオチン化したものについては 、 オリゴヌクレオチドの 5' 末端にピオチン LCピオチン- 0NTMホスホルアミダイ ト（Clontech)を力ップリングさせることにより合成した。 AB1 0PCカラムを用い てプライマーを精製し （精製は製造業者の使用説明書に基づいて行った）、 凍結 乾燥し、 DEPC (ジェチルピオ口カーボネート） で処理した水中に再懸濁させた。
(3) TRAP/SPAによるテロメラーゼ活性の定量的検出
本発明の TRAP- SPAアツセィは、 公知の方法（Kim N. W. et al., (1994) Science, 206, 2011-2015; Piatyszek . A. et al. , (1995) Meth. Cell Sci. , Π, 1- 15))にい くつかの改良を加えて以下のように行った。
所定の量 （0、 0.01、 0.05. 0.1 ig/アツセィ） のビォチン化 CXプライマ一 （ BitU- CX)を Hot- Start チューブ（GIBC0-BRL) のワックス層下にトラップさせた。 次に、 テロメラーゼによる DN A合成反応として 2 1の細胞抽出物 （104細 胞） を、 20mM Tris-HCl pH8.3 、 1.5 m.M MgC 、 63mM KCK 0.005% Tween 20 、 I mM EGTA 、 それぞれ 50 M の dATP及び dCTP、 2 M の dTTP、 50 uU の dGTP、 2 fid [Me-3H]TTP(Amers am, 114Ci/睡 ol) 、 0.1 fig/ u 1 BSA 、 2 U Taq ボリ メラ一ゼ、 並びに 0.1 g 又は所定量の TSプライマーを含む 50 1の最終反応混 合物中のヮックスバリァ上で、 室温で 30分ィンキュペートした。 次に、 合成されたテロメァオリゴヌクレオチドを増幅するため、 混合物を 90°C で 90秒加熱し、 次いで 94°Cで 30秒、 50°Cで 30秒及び 72°Cで 45秒を 1サイクルとし て、 これを 31サイクルでポリメラーゼ連鎖反応を行った。
なお、 大量のサンプル （具体的には、 96ゥヱルマイクロタイタープレー 卜を使 用） の場合は、 アツセィはワックスバリアなしで行い、 ポリメラーゼ連鎖反応直 前に Biot- CX を加え、 ミネラルオイルで混合物を覆った。
反応産物 （40 1) を 96ゥヱルプレート （Wallac) に移し、 50/ 1のス トレプ 卜アビジン被覆の微小粒子フルォロマイクロスフィァー （0.56M EDTA中、 1 ： 4 の溶液） を加え、 37°Cで 10分インキュベートし、 ピオチニル化した3 H標識反応 産物をストレプトアビジンビーズに結合させた。
プレー トは、 MicroBeta シンチレーシヨ ンカウンター（Waliac)上でカウン ト し 比較として、 従来の TRAPCTRAP とポリアクリルアミ ドゲル電気泳動とを組み合 わせた手法； TRAP-PAGE)を以下のように行った。
すなわち、 ビォチン化プライマーを非ビォチン化の CXプライマーに置き換え、 dGTP¾度を に変更し、 dTTPを に増加し、 2 Ciの [Me-32 H]TTP(Ame rsham, 114Ci/ranol)を [ -32 P]dGTP (Amersham, 800Ci/mmol)に置き換えて上 記と同様に行った。
ポリメラーゼ連鎖反応終了後、 反応産物を 0.3 TBE 中で 10%ポリアクリルァ ミ ドゲル電気泳動 （SDS- PAGE) にかけ、 フォスフォロイメージャー （Fuji lmagi ng Plate) に露出することにより、 反応産物 （40 ) の解析を行った。
(4) テロメラーゼによる DN A合成反応 PAによるテロメラーゼ活性の定 童的検出
まず、 テロメァ伸長反応として HEL細胞 CHAP S抽出物 （1(T及び 10s個 の細胞に相当する量） 、 20mM Tris-HCK 1.5mM MgCl2、 63mM KC1、 0.005 % Tween20、 Im EDTA、 それぞれ 50 Mの dATP及び dGTP、 1 M dTTP、 2 /Ci e- 3H TTP (Amersham, 114Ci/麵 ol)、 0.1 /i g BSA、 並びに 0.1 gのビォチン化 したプライマー （TTAGGG を含む 50 1の反応液を室温にて 30分間インキュべ 一トした。 次いで、 この反応産物 40 1を 96ゥヱルプレー トに移し、 50"のストレプトァ ビジン被覆の微小粒子フルォロマイクロスフィァー（0.56M EDTA中、 1:4の溶液 ) と混合して 37°Cで 10分間インキュベートし、 ピオチン化した3 H標識反応産物 をストレプトアビジンビーズに結合させた。
これを、 MicroBetaシンチレーシヨ ンカウンター（Wallac)でカウン 卜 した。 比較として、 従来のポリアクリルアミ ド電気泳動後オー トラジオグラフィ一に て検出する方法を行った。
上記のテロメラーゼ反応の混合物において、 dGTPの濃度を 5 Μに変更して 2 ^Ci(a32P)dGTP(Amersham, 800Ci/mniol)を加え、 dTTPの濃度は 50 Mに増加 させた。
7Mの尿素を含む 8 %ポリアクリルアミ ドゲルにて反応産物 40 〖を電気泳動し 、 4日間ィメイジングプレートに露出した。
II. 結果
(1) プライマー濃度の効果
プライマー濃度の効果は、 本発明の方法及び従来の方法ともに同一であった （ 図 1上及び下パネル） 。 図 i下パネルの電気泳動の図において、 レーン 1〜4は 、 それぞれプライマー濃度 0、 0.01、 0.05、 0.1 gノアッセィであり、 図 1上パ ネルのブラィマ一濃度と対応する。
従って、 本発明の方法は電気泳動後ォートラジオグラフィ一を行わずにテロメ ラーゼ活性を検出でき、 しかも定量的に測定できることを示している。
(2) 本発明の方法の感受性
本発明の SPA検出の感受性は、 HEL CHAPS 抽出物 （HEし 細胞の CHAPS 抽出液） を段階的に希釈させて行った従来の TRAPァッセィ （TRAP-PAGE)と比較することに より測定した。 従来の TRAP- PAGE アツセィでは、 検出限界はアツセィあたり約 10 0 細胞であるが （図 2、 下パネル） 、 本発明の TRAP- SPAアツセィの場合は、 テロ メラーゼ活性はわずか 10細胞でも明瞭に検出できる （図 2、 上パネル） 。 なお、 図 2下パネルのレーン番号 1〜 7は、 図 2上パネルの細胞数 0、 10、 10 103 、 10 105細胞/アツセィ並びに 1(Τ及び RNaseの混合物にそれぞれ対応する o
また、 TRAP-PAGE により予めスクリーニングされた多発性骨髄腫 （MM3)、 肝癌 (Hep-3B、 Hep-G2、 Hu-H7 ) 、 及び J urka t細胞等の他の細胞系を用いても同様の 結果が得られ、 観察された取り込みは、 ポリアクリルアミ ドゲルでのバン ドバタ —ンのそれぞれの強度とほぼ完全に一致した （図 3 ) 。 最も強いシグナルは、 本 発明及び従来の方法ともに多発性骨髄腫から得られたが、 対照として用いた正常 細胞であるケラチノサイ トでは活性は検出されなかった。 なお、 図 3下パネルの レーン番号 1〜8は、 図 3上パネルの各種細胞 HEし MM3 、 Hep-3B、 Hep- G2、 Hu -H7、 Jurka t, Kera t.及び細胞不含の対照にそれぞれ対応する。
従って、 本発明の方法により、 より高感度に、 そして定量的にテロメラーゼ活 性を検出できる。
ポリメラーゼ連鎖反応によるテロメラーゼ産物の蓄積に対するサイクル数の効 果についても、 本発明の方法と従来の方法とを比較した。 ゲル電気泳動でのバン ドのパターン又は S P Aによる3 Hの顕著な取り込みは、 少なく とも増幅の 27サ ィクル後に観察された （図 4 ) 。 検出されたシグナルの強度は、 両ケースともに サイクル数に伴って増加し、 二つの方法間で極めて良好な関係が得られた。 なお 、 図 4の下パネルのレーン番号 1〜 5は、 上パネルのサイクル数 27、 28、 29、 30 及び 31にそれぞれ対応する。
(3) テロメラーゼによる D N A合成反応 Z S P Aによるテロメラーゼ活性の定 量的検出
テロメァ反復配列を増幅しない場合でも、 前記と同様にテロメラーゼ活性を検 出 ·定量することができた （図 5 ) 。 図 5に示すように、 細胞数に対するテロメ ラーゼ活性は、 本発明の方法 （上段） 及び従来の方法 （下段） ともに同様であつ た。 産業上の利用可能性
本発明により、 迅速かつ高感度にテロメラーゼ活性を検出、 定量できる方法が 提供される。 配列表
配列番号： 1
配列の長さ ： 1 8
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列の特徴
他の情報 ： TS Primer
配列 ：
AATCCGTCGA GCAGAGTT 配列番号： 2
配列の長さ ： 2 4
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列の特徴
他の情報： CX Primer
配列：
CCCTTACCCT TACCCTTACC CTAA

Claims

請 求 の 範 囲 . テロメラーゼによる D N A合成反応によって合成されたオリゴヌクレオチド 配列を、 相互に結合することができる 2種類の物質のいずれか一方で修飾した プライマーを用いて放射性同位元素の存在下でポリメラーゼ連鎖反応を行って 増幅し、 得られる反応産物を予め前記相互に結合することができる 2種類の物 質の他方で被覆された微小粒子と結合させ、 該結合によって微小粒子から発生 したシンチレーションを測定することにより、 テロメラーゼ活性を定量するこ とを特徴とするテロメラーゼ活性の定量方法。
. 相互に結合することができる 2種類の物質のいずれか一方で修飾したブラィ マーを用いて放射性同位元素の存在下でテロメラーゼによる D N A合成反応を 行い、 得られる反応産物を予め前記相互に結合することができる 2種類の物質 の他方で被覆された微小粒子と結合させ、 該結合によって微小粒子から発生し たシンチレーションを測定することにより、 テロメラ一ゼ活性を定量すること を特徴とするテロメラ一ゼ活性の定量方法。
. 相互に結合することができる 2種類の物質がビォチン及びアビジンである請 求項 1又は 2記載のテロメラーゼ活性の定量方法。
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