KR100289993B1 - 텔로머라제활성의정량방법 - Google Patents

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Abstract

텔로머라제에 의한 DNA 합성반응에 의해서 합성된 올리고뉴클레오티드 서열을, 상호결합 가능한 두 물질 중 어느 하나로 변형된 프라이머를 사용하여 방사성동위원소 존재하에 증폭시키는 단계; 전기 반응산물을 전기 상호결합 가능한 두 물질 중 나머지 다른 하나로 미리 코팅시킨 미세입자에 결합시키는 단계; 및, 전기 결합으로 인하여 전기 미세입자로부터 발생하는 섬광을 측정하여 텔로머라제 활성을 정량하는 단계로 구성되는 텔로머라제 활성의 정량방법.

Description

텔로머라제 활성의 정량방법
텔로머라제(telomerase)는 텔로미어(telomere)의 말단부분(선형 염색체의 말단부분)의 신장(extension)을 촉매하는 효소로 알려져있으며, 지금까지 많은 연구가 진행되어 왔다(참조: Greider C.W. and Blackburn E. H.,(1987) Cell, 51, 887-898; Morin G. B. (1989) Cell, 59, 521-529). 텔로머라제 활성은 조혈간세포(hemapoietic stem cell)와 같은 특정세포를 제외한 정상세포에서는 발견되지 않는 반면, 대부분의 암세포에서는 높은 텔로머라제 활성이 관찰된다. 텔로머라제는 암세포들의 무한한 증식유지에 관련되어 있는 것으로 여겨지므로, 텔로머라제 활성의 탐지 및 정량은 암 진단에 중요하다 하겠다. 더 나아가서, 텔로머라제 활성의 억제제는 정상세포에 대한 부작용이 거의 없는 항암제로서 기대되어진다(참조: Counter C. M. et al., (1989) EMBO J., 11, 1921-1929; Counter C. M. et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 2900-2904; Chadeneau C. et al., (1995) Cancer Res., 55, 2533-2536; Hiyama et al., (1995) Nature Med., 1, 249-255, Shay J. W. et al., (1995) Mol. Cell. Biol., 15, 425-432).
최근에, 텔로머라제의 탐지는 섬모충 테트라히메나(Tetrehymena)를 이용하여 연구되어 왔다(참조: Greider and Blackburn, 1985; 1987; 1989). 이들 연구에서, 텔로머라제는 단일 프라이머 신장분석 시스템(single primer extension assay system)을 이용하여 탐지되어 졌다. 전기 분석에 필요한 기질들로는 단일가닥 텔로미어 올리고뉴클레오티드 서열(TTGGGG)3, dGTP, dTTP 및32P로 표지된 dGTP 등이 있다. 테트라히메나의 텔로미어 서열인 전기 (TTGGGG)3는 실온에서 짧게 배양하는 동안 올리고뉴클레오티드 프라이머의 3' 말단에 반복적으로 가해진다. 그런 다음, 반응산물은 전기영동과 방사선사진술(autoradiography)에 의해서 탐지된다. 이러한 분석은 테트라히메나와 다른 섬모충으로부터 유래된 텔로머라제의 프라이머 선택성과 반응속도론(kinetics)에 관한 연구 및 텔로머라제 RNA의 클로닝을 가능케 하였다(참조: Romero and Blackburn, 1991; Lee and Blackburn, 1993, Collins and Greider, 1993; Autexier and Greider, 1994).
한편, 인간 텔로미어의 수는 92개에 불과하여 텔로머라제 활성을 탐지하는 것이 불가능하다고 여겨져 왔다. 그러나, 인간의 자궁경부암(cervical cancer)으로부터 유래된 헬라 세포주(Hela cell line)의 추출물을 이용한 텔로머라제 분석에서 텔로머라제 활성이 탐지되었으며, 이 효소는 텔로미어의 3' 말단에 다수의 TTAGGG 반복서열을 가하는 것으로 밝혀졌다(참조: Morin, 1989). 텔로머라제는 모든 진핵 세포에서 보존되어 있는 효소이며, 특히 인간 암세포에서 현격히 활성화된다는 사실이 제시되어 왔다(참조: Counter et al., 1992; 1994).
그러나, 종래의 분석시스템에서는 민감도, 탐지에 필요한 시간, 정량성 및 다량의 시료를 다루어야 한다는 점 등이 문제가 되어왔다(참조: Counter et al., 1994).
최근에, 민감도와 탐지시간은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)에 근거한 ″TRAP″(telomeric repeat amplification protocol)이라고 불려지는 방법에 의해서 개선되어 졌다(참조: Kim N. W. et al.,(1994) Science, 206, 2011-2015; Piatyszek M.A. et al., (1995) Meth. Cell Sci., 17, 1-15).
이 방법은 텔로머라제 반응과 중합효소 연쇄반응을 수행한 다음, 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동과 방사선사진술에 의하여 반응산물을 탐지하는 과정을 포함한다. 텔로머라제 활성의 정량은 나타난 밴드의 세기를 농도계(densitometer) 또는 다른 방법으로 측정하고, 이를, 예를 들면, 일정량의 헬라 세포 추출물을 대조군으로 하여 비교분석함으로써 이루어진다. 이 방법은 100개 정도의 적은 수의 세포에서조차도 텔로머라제 활성을 탐지할 수 있도록 민감도를 개선시켰다. 즉, 텔로머라제 활성의 탐지 감도는 종래의 분석방법과 비교하여 104배 가량 증가하였으며, 이는 종래의 방법에 비하여 크게 향상된 것이다.
그러나, 전기 TRAP 방법조차도 여전히 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 그외의 다른 방법을 사용하여,32P 또는 형광물질로 표지된 반응산물을 분석하여야 할 필요성이 있으며, 따라서 측정할 수 있는 시료의 수가 제한되어 진다. 더 나아가,32P의 경우, 방사성 물질을 포함하는 젤의 처리나 폐기 또는 다량의 방사성 폐수 등과 같은 문제점들을 안고 있다. 게다가, 젤의 준비, 전기영동에 의한 분리(분석), 그리고 감광 또는 탐지(보통 2 내지 48시간) 등과 같은 일련의 조작을 실행하는데 긴 시간이 소요된다. 이어서, 탐지된 밴드들의 세기를 농도계측기(densitometer)나 다른 방법으로 측정해야만 한다. 따라서, 결과의 수득이 지연된다는 문제가 여전히 남아있었다.
이러한 문제점들은 특히 빠른 분석을 요하는 암의 진행 및 예후의 진단에 있어서 매우 불편하며, 또한 다량의 시료 분석에 있어서도 불편하다.
발명의 개시
본 발명의 목적은 높은 민감도로 텔로머라제 활성을 신속하게 탐지하고 정량할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기 문제점들을 해결하기 위하여 연구노력한 결과, 텔로머라제에 의한 DNA 합성반응과 아머샴(Amersham, USA)에서 개발되어 본 발명을 완성으로 이끈 섬광근접분석법(scintillation proximity assay technology, ″SPA″, 참조: Bothworth N. and Towers P. (1989) Nature, 341, 167-168)을 결합시킨 시스템을 구축함으로써, 텔로머라제 활성을 높은 민감도로 신속하게 탐지하고 정량할 수 있음을 발견하였다.
즉, 본 발명은 다음과 같은 단계로 구성되는 텔로머라제 활성의 정량방법이다: 텔로머라제에 의한 DNA 합성반응에 의해서 합성된 올리고뉴클레오티드 서열을, 상호결합 가능한 두 물질 중 어느 하나로 변형된 프라이머를 사용하여 방사성동위원소 존재하에 증폭시키는 단계; 전기 증폭된 서열을 전기 상호결합 가능한 두 물질 중 나머지 다른 하나로 미리 코팅시킨 미세입자에 결합시키는 단계; 및, 전기 결합으로 인하여 전기 미세입자로부터 발생하는 섬광을 측정하여 텔로머라제 활성을 정량하는 단계.
더 나아가, 본 발명은 다음과 같은 단계들로 구성되는 텔로머라제 활성의 정량방법이다: 상호결합 가능한 두 물질 중 어느 하나로 변형된 프라이머를 사용하여, 방사성동위원소 존재하에 텔로머라제에 의한 DNA 합성반응을 수행하는 단계; 전기 반응산물을 전기 상호결합 가능한 두 물질 중 나머지 다른 하나로 미리 코팅시킨 미세입자에 결합시키는 단계; 및, 전기 결합으로 인하여 전기 미세입자로부터 발생하는 섬광을 측정하여 텔로머라제 활성을 정량하는 단계.
여기서 사용된 상호결합 가능한 두 물질은 비오틴(biotin)과 애비딘(avidin)이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명은 세포추출물에서 텔로머라제 활성을 탐지하고 정량하는 방법이다. 본 발명은 방사성동위원소 존재하에, 상호결합 가능한 두 물질 중 어느 하나로 변형된 프라이머를 사용하여 텔로머라제의 DNA 합성반응에 의해서 합성된 올리고뉴클레오티드 서열(텔로미어 반복서열)을 증폭하기 위한 방법을 포함한다. 그러나, 본 발명은 텔로미어 반복서열의 증폭없이 반응을 수행하는 방법 또한 포함한다. 그런 다음, 전기 반응산물을 상호결합 가능한 두 물질 중 다른 하나로 미리 코팅시킨 미세입자에 결합시키고, 전기 결합으로 인하여 전기 미세입자들로부터 발생되는 섬광을 측정하여 텔로머라제 활성을 정량한다.
(1) 세포추출물에 의한 텔로미어 반복서열의 증폭
텔로미어 반복서열은, 예를 들면, 중합효소 연쇄반응에 의해서 증폭되어 질 수 있다. 중합효소 연쇄반응은 고감도의 탐지결과를 제공한다.
전기 중합효소 연쇄반응은 방사성동위원소, 예를 들면,3H 또는125I의 존재하에, 상호결합 가능한 두 물질 중 하나로 5' 말단이 변형된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 수행된다.
전기 상호결합 가능한 두 물질은, 예를 들면, 효소와 기질, 비오틴과 애비딘, 항원과 항체, 렉틴(lectin)과 그 수용체, 호르몬과 그 수용체 및 신경전달물질과 그 수용체 등을 포함할 수 있다.
전기 프라이머는 증폭할 텔로미어 서열에 의존하여 고안되어질 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO. 1에서 보여지는 프라이머(TS 프라이머)와 SEQ ID NO. 2에서 보여지는 프라이머(CX 프라이머)들이 포함된다. 비오틴과 같은 리간드는 공지의 방법에 의하여 전기 프라이머의 5' 말단에 연결될 수 있다. 이 기술은 통상의 분석완충액에서 수행될 수 있다.
텔로머라제에 의한 DNA 합성반응에서, 예를 들어, 비오틴으로 표지된 프라이머의 사용은 새로이 합성된 올리고뉴클레오티드 서열을 SPA 기술로 직접 탐지하는 것을 가능케 한다.
(2) 미세입자의 준비
여기서 사용될 수 있는 미세입자들은, 예를 들면, 아머샴에서 공급되는 역전사효소 활성탐지 킷트(제품번호 NK9020)에 포함되어 있는 SPA 비드들을 포함한다.
(3) 신장된 올리고뉴클레오티드 서열과 미세입자들의 결합반응 및 탐지
이어서, 전기 중합효소 연쇄반응에 의해서 증폭된 전기 신장된 올리고뉴클레오티드 서열을 전기 상호결합 가능한 두 물질 중 다른 하나로 미리 코팅시킨 미세입자들에 결합시킨다. 프라이머를 비오틴화시킨 경우에는, 미세입자들은 전기 상호결합 가능한 두 물질 중 다른 하나인 스트렙트애비딘(streptavidin)으로 코팅될 수 있다. 증폭된 올리고뉴클레오티드가 미세입자들에 결합하게 되면, 전기 증폭된 올리고뉴클레오티드가3H 또는125I와 같은 방사성동위원소로 표지되어 있기 때문에, 전기 미세입자들이3H 또는125I으로부터 방출되는 저 에너지의 베타선에 의하여 자극받게 되고, 그 결과 전기 미세입자들로부터의 빛의 방출(섬광: scintillation)이 일어난다. 신호로서의 섬광은 관심있는 올리고뉴클레오티드의 존재를 탐지하기위하여 측정될 수 있다.
탐지된 신호의 세기는 미세입자에 결합한 반응산물의 양, 즉 텔로머라제의 활성에 비례한다. 따라서, 신호의 세기가 클수록 텔로머라제의 활성이 크다는 것을 의미한다.
텔로머라제 활성은 표준시료를 대조군으로 사용하여 상기방법에 따라 형광세기를 측정함으로써 정량적으로 결정된다.
(4) 본 발명의 방법에 의하면, 텔로머라제 활성은 전기 증폭방법을 사용하지 않고도 탐지되어 질 수 있다. 예를 들면, 텔로머라제의 DNA 합성반응에 의해서 합성된 올리고뉴클레오티드 서열을, 상호결합 가능한 두 물질 중 하나로 변형된 프라이머를 사용하여 방사성동위원소 존재하에서 반응시킨다. 그런 다음, 전기 반응산물을 상호결합 가능한 두 물질 중 다른 하나로 미리 코팅시킨 미세입자들에 결합시키고, 전기 결합으로 인하여 전기 미세입자들로부터 발생하는 섬광을 측정하여 텔로머라제 활성을 정량한다.
″상호결합 가능한 두 물질″의 의미, 미세 입자들의 제조, 미세입자들과 신장된 올리고뉴클레오티드 서열간의 결합반응 및 탐지 등은 모두 상술한 바와 동일하다.
본 발명에 따르면, 종래의 탐지방법과 비교해 볼 때, 월등하게 높은 감도를 얻을 수 있다. 게다가, 저 에너지 베타선 방출만이 요구되므로, 특별한 폐기장비가 필요하지 않고, 또한 반응에 사용되지 않은 여분의 방사성동위원소로부터 반응산물을 분리할 필요가 없다. 그 결과, 신속하게 탐지할 수 있다는 중요한 개선점 중의 하나가 제공된다. 따라서, 본 발명의 방법에서는 1시간 이내에 결과를 얻을 수 있으며, 그 결과 측정에 필요한 모든 과정들이 하루에 완결될 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 의하면 텔로머라제 활성을 우수한 재현성을 갖고 용이하게 정량할 수 있으며, 다량의 시료를 손쉽게 다룰 수 있다.
예를 들면, 임상적으로 얻은 조직에서의 텔로머라제 활성의 정량은 암 진단 및 암의 진행과 치료의 예후를 모니터하는데 매우 유용하다(참조: Hiyama et al., 1995).
본 발명은 텔로머라제 활성의 정량방법에 관한 것이다.
도 1은 프라이머 농도에 따른 본 발명에 의한 탐지결과를 나타낸다.
도 2는 세포수에 따른 본 발명에 의한 탐지결과를 나타낸다.
도 3은 다양한 세포에 따른 본 발명에 의한 탐지결과를 나타낸다.
도 4는 중합효소 연쇄반응의 주기수에 따른 본 발명에 의한 탐지결과를 나타낸다.
도 5는 세포수에 따른 본 발명에 의한 탐지결과를 나타낸다.
본 발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하에서, 본 발명은 실시예를 통하여 설명되어질 것이다. 그러나, 본 발명은 이들 실시예에만 국한되는 것은 아니다.
실시예 1
1. 실험재료 및 방법
(1) 세포추출물의 제조
세포추출물은 종래의 방법(참조: Kim N. W. et al., (1994) Science, 206, 2011-2015)을 약간 변형하여 제조되었다. 인간의 적백혈병(erythroleukemia) 세포주인 HEL 세포를 배양하고, 대수기(logarithmic growth phase)의 세포를 2,000rpm에서 5분동안 원심분리하여 세포를 회수하였다. 전기 회수된 세포를 얼음에 방치해둔 PBS로 2번 세척하고, 리보누클레아제(RNase)가 없는 세척완충액(10mM Hepes pH 7.5, 1mM MgCl2, 10mM KCl 및 1mM DTT)으로 한번 세척하였다. 이어서, 세포침전물을 리보누클레아제가 없는 세포용해성 완충액(10mM Tris-HCl pH 7.5, 1mM MgCl2, 1mM EGTA, 0.1mM PMSF, 5mM β-mercaptoethanol, 0.5% CHAPS(cholamidopropyl-dimethyl-ammonio-1-propanesulfonate) 및 10% glycerol)으로 5 x 105세포/ul 의 농도가 되도록 재현탁시켰다. 전기 현탁액을 가볍게 저어주고, 얼음에서 30분동안 배양한 다음, 15,000rpm에서 30분동안 원심분리하여 세포 용해물로부터 불순물을 제거하고, 상층액은 소량으로 분배하여 -80℃에 보관하였다.
(2) 프라이머의 합성
ABI의 DNA 합성기를 사용하여 TS 프라이머(SEQ ID NO. 1)와 CX 프라이머(SEQ ID NO. 2)를 합성하였다. 이어서, 비오틴 엘씨 비오틴-온TM포스포라미다이트(biotin LC biotin-ONTMphosphoramidite, Clontech)를 전기 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 연결시켜 비오틴화된 CX 프라이머와 TS 프라이머를 합성하였다. 전기 프라이머들을 ABI OPC 컬럼을 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하고, 동결건조시킨 다음, DEPC(diethylpyrocarbonate)로 처리된 물에 재현탁시켰다.
(3) TRAP/SPA에 의한 텔로머라제 활성의 정량적 탐지
본 발명에 따른 TRAP/SPA 분석은 다음과 같이 종래의 방법(참조: Kim N. W. et al., (1994) Science, 206, 2011-2015; Piatyszek M. A. et al., (1995) Meth. Cell Sci., 17, 1-15)을 약간 변형하여 수행되었다.
비오틴화된 CX 프라이머(″Biot-CX″)의 일정량(0, 0.01, 0.05, 0.1ug/assay)을 핫-스타트 튜브(Hot-Start tube, Gibco-BRL)의 왁스층 밑에 트랩시켰다.
그런 다음, 텔로머라제에 의한 DNA 합성반응에서, 세포추출물(104개 세포) 2ul를 20mM Tris-HCl pH 8.3, 1.5mM MgCl2, 63mM KCl, 0.005% Tween 20, 1mM EGTA, 50uM dATP, 50uM dCTP, 2uM dTTP, 50uM dGTP, 2uCi [Me-3H] TTP(Amersham, 114Ci/mmol), 0.1ug/ul BSA, 2U Tag polymerase 및 0.1ug 또는 선결된 양의 TS 프라이머가 함유된 최종반응혼합물 50ul에서 전기 왁스층 위에서 실온에서 30분동안 배양하였다.
이어서, 전기 합성된 텔로미어 올리고뉴클레오티드를 증폭하기 위하여, 전기 혼합물을 90℃에서 90초간 가열하고, 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 그리고 72℃에서 45초로 구성된 중합효소 연쇄반응 주기를 31회 반복 수행하였다.
시료가 많은 경우, 특히 96웰 마이크로타이터 플레이트를 사용하는 경우에는, 왁스층 없이 분석을 수행하였고, Biot-CX 프라이머를 중합효소 연쇄반응 직전에 가하였으며, 혼합물 위를 미네랄 오일로 덮었다.
비오틴화된3H로 표지된 반응산물을 스트렙트애비딘 비드에 결합시키기 위하여, 전기 반응산물(40ul)을 96 웰 플레이트(Wallac)로 옮기고, 스트렙트애비딘으로 코팅된 미세입자 플루오로마이크로스피어(0.56M EDTA 중 1:4 용액) 50ul를 가한 다음, 37℃에서 10분간 배양하였다.
이어서, 전기 플레이트를 마이크로베타 섬광계측기(MicroBeta scintillation counter, Wallac)를 이용하여 계측하였다.
비교예로서, 종래의 TRAP(폴리아크릴아마이드 젤 전기영동과 결합된 TRAP, TRAP-PAGE)를 다음과 같이 수행하였다.
비오틴화된 프라이머를 비오틴화되지 않은 CX 프라이머로 대체하고, dGTP 농도를 20uM로 변화시켰으며, dTTP 농도를 50uM로 증가시키고, 2uCi [Me-3H] TTP (Amersham, 114Ci/mmol)를 [α-32P]dGTP(Amersham, 800Ci/mmol)로 대체한 점을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 수행하였다.
중합효소 연쇄반응이 완료된 다음, 반응산물(40ul)을 0.3xTBE 완충액에서 10% 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(SDS-PAGE)으로 분리하고, 포스포이메이저(phosphorimager, Fuji Imaging Plate)에 감광시켜 반응산물을 분석하였다.
(4) 텔로머라제에 의한 DNA 합성반응 /SPA에 의한 텔로머라제 활성의 정량적 탐지
첫째, 텔로미어 신장반응의 경우, HEL 세포의 CHAPS 추출물(104내지 105개 세포에 상당함), 20mM Tris-HCl, 1.5mM MgCl2, 63mM KCl, 0.005% Tween 20, 1mM EDTA, 50uM dATP, 50uM dGTP, 1uM dTTP, 2uCi [Me-3H] TTP(Amersham, 114Ci/mmol), 0.1ug BSA 및 비오틴화된 프라이머 (TTAGGG)4를 함유하는 반응액 50ul를 실온에서 30분간 배양하였다.
그런 다음, 반응산물(40ul)을 96 웰 플레이트로 옮기고, 스트렙트애비딘으로 코팅된 미세입자 플루오로마이크로스피어(0.56M EDTA 중 1:4 용액) 50ul와 혼합한 다음, 37℃에서 10분간 배양하여 전기 비오틴화된3H로 표지된 반응산물을 스트렙트애비딘 비드에 결합시켰다.
이어서, 전기 플레이트를 마이크로베타 섬광계측기(MicroBeta scintillation counter, Wallac)로 계측하였다.
비교예로서, 종래의 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동과 방사선사진술에 의한 탐지도 수행하였다.
상기 텔로머라제 반응혼합물에서, dGTP 농도는 5uM로 변화시키고, [α-32P] dGTP(Amersham, 800Ci/mmol) 2uCi를 가하였으며, dTTP 농도는 50uM로 증가시켰다.
전기 반응산물(40 ul)을 7M 우레아가 포함된 8% 폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동하고, 4일동안 이미지 판(imaging plate)에서 감광시켰다.
II. 결과
(1) 프라이머 농도 효과
본 발명의 방법과 종래의 방법 모두에서, 프라이머 농도의 효과는 동일하였다(참조: 도 1, 위와 아래 패널). 도 1에 보여진 전기영동에서, 1 내지 4 레인의 프라이머 농도는 각각 0, 0.01, 0.05 및 0.1ug/assay이며, 이것은 도 1의 위 패널에서의 프라이머 농도에 해당한다.
이와 같이, 본 발명의 방법에 의하면 전기영동에 이은 방사선사진술을 행하지 않고서도, 텔로머라제 활성의 탐지 및 정량이 가능함을 확인하였다.
(2) 본 발명에 따른 방법의 민감도
본 발명에 따른 SPA 탐지법의 민감도를 종래의 TRAP 분석(TRAP-PAGE)과 비교하여 결정하였다. 이때, HEL CHAPS 추출물(HEL 세포의 CHAPS 추출물)을 단계적으로 희석하여 사용하였다. 종래의 폴리아크릴아마이드 TRAP-PAGE 분석법에서는 탐지한계가 분석당 100개의 세포인데 반하여(참조: 도 2, 아래 패널), 본 발명의 TRAP/SPA 분석에서는 10개의 세포에서조차도 텔로머라제 활성을 명확하게 탐지할 수 있었다(참조: 도 2, 위 패널). 도 2의 아래 패널의 1 내지 7 레인은 각각 도 2의 위 패널에서의 0, 10, 102, 103, 104및 105세포/assay와 리보누클레아제가 혼합된 104개 세포에 해당한다.
또한, 다발성골수구종(multiple myeloma) 세포주(MM3), 간암 세포주 (Hep-3B, Hep-G2, Hu-H7) 및 TRAP-PAGE에 의해서 미리 검색된 다른 세포주들, 예를 들면 Jurkat 세포에서도 유사한 결과가 얻어졌으며, 관찰된 결과는 폴리아크릴아마이드 젤에서의 밴드 패턴의 각각의 세기와 사실상 완벽하게 일치하였다(참조: 도 3). 본 발명의 방법과 종래의 방법 모두에서, 가장 강한 신호는 다발성골수구종 세포주로부터 얻어졌으며, 대조구로 사용된 각질세포와 정상세포에서는 활성이 탐지되지 않았다. 도 3의 아래 패널의 1 내지 8 레인은 각각 HEL, MM3, Hep-3B, Hep-G2, Hu-H7, Jurkat, Kerat 세포 및 세포가 없는 반응혼합물(대조군)에 해당한다.
결론적으로, 텔로머라제 활성은 본 발명의 방법에 의해서 높은 민감도로 정량적으로 탐지될 수 있다.
중합효소 연쇄반응의 주기수가 텔로머라제 산물의 축적에 미치는 영향 또한 본 발명의 방법과 종래의 방법 간에 비교되었다.3H의 의미있는 흡수는(uptake) 최소한 27 주기의 증폭 후에야 젤 전기영동의 밴드 패턴 또는 SPA에서 관찰되어졌다(참조: 도 4). 두 경우에 모두 탐지된 신호의 세기는 주기수에 비례하여 증가하였다; 따라서, 두 방법간의 매우 좋은 일치 관계가 성립된다. 도 4의 아래 패널의 1 내지 5레인은 각각 위 패널의 주기수 27, 28, 29, 30 및 31에 해당한다.
(3) 텔로머라제에 의한 DNA 합성반응 - 텔로머라제 활성의 정량적 탐지
텔로미어 반복서열을 증폭하지 않았을 때 조차도, 텔로머라제 활성을 유사한 방식으로 탐지하고 정량적으로 측정할 수 있었다(참조: 도 5). 도 5에서 보듯이, 세포수에 따른 텔로머라제 활성은 본 발명의 방법(위 패널)과 종래의 방법(아래 패널) 모두에서 유사하였다.
본 발명에 의하면, 텔로머라제 활성을 신속하고 높은 민감도로 탐지하고 정량하는 것을 가능케 하는 방법이 제공된다.
서열번호: 1
서열의 길이: 18
서열의 타입: 핵산
쇄의 수: 1본쇄
토폴로지: 선형
분자의 타입: 기타 핵산(합성 DNA)
서열의 특징
기타 정보: TS 프라이머
서열의 기재방법:
AATCCGTCGA GCAGAGTT
서열번호: 2
서열의 길이: 24
서열의 타입: 핵산
쇄의 수: 1본쇄
토폴로지: 선형
분자의 타입: 기타 핵산(합성 DNA)
서열의 특징
기타 정보: CX 프라이머
서열의 기재방법:
CCCTTACCCT TACCCTTACC CTAA

Claims (3)

  1. 텔로머라제에 의한 DNA 합성반응에 의해서 합성된 올리고뉴클레오티드 서열을 상호결합 가능한 두 물질 중 어느 하나로 변형된 프라이머를 사용하여 방사성동위원소 존재하에 증폭시키는 단계;
    전기 반응산물을 전기 상호결합 가능한 두 물질 중 나머지 다른 하나로 미리 코팅시킨 미세입자에 결합시키는 단계; 및,
    전기 결합으로 인하여 전기 미세입자로부터 발생하는 섬광을 측정하여 텔로머라제 활성을 정량하는 단계로 구성되는 텔로머라제 활성의 정량방법.
  2. 상호결합 가능한 두 물질 중 어느 하나로 변형된 프라이머를 사용하여, 방사성동위원소 존재하에 텔로머라제에 의한 DNA 합성반응을 수행하는 단계;
    전기 반응산물을 전기 상호결합 가능한 두 물질 중 나머지 다른 하나로 미리 코팅시킨 미세입자에 결합시키는 단계; 및,
    전기 결합으로 인하여 전기 미세입자로부터 발생하는 섬광을 측정하여 텔로머라제 활성을 정량하는 단계로 구성되는 텔로머라제 활성의 정량방법.
  3. 제 1항 또는 2항에 있어서,
    상호결합 가능한 두 물질은 비오틴과 애비딘인 것을 특징으로 하는
    텔로머라제 활성의 정량방법.
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