WO1997024616A1 - Procede de determination du taux de viabilite de cellules - Google Patents

Procede de determination du taux de viabilite de cellules Download PDF

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WO1997024616A1
WO1997024616A1 PCT/JP1996/003842 JP9603842W WO9724616A1 WO 1997024616 A1 WO1997024616 A1 WO 1997024616A1 JP 9603842 W JP9603842 W JP 9603842W WO 9724616 A1 WO9724616 A1 WO 9724616A1
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nucleic acid
cells
intensity
cell
cell membrane
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Application number
PCT/JP1996/003842
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English (en)
French (fr)
Inventor
Fuminori Kato
Original Assignee
Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd.
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Publication date
Application filed by Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd. filed Critical Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd.
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination

Definitions

  • the present invention provides a simple and rapid method for treating the number of surviving cells and the Z or cell viability of a multi-sample by subjecting the cells to a treatment with a nucleic acid fluorescent stain that stains only dead cells and a treatment to damage the cell membrane. It provides a method for measurement and is used in the fields of research and development of pharmaceuticals, agricultural chemicals, cosmetics, foods, etc., and in the fields of medicine, pharmacy, biological research, and clinical testing and diagnostics, etc. Available. Background art
  • the safety and efficacy of pharmaceuticals, pesticides, cosmetics, foods, etc. are often evaluated by their cytotoxicity, and the number of viable cells is often measured as an indicator of this cytotoxicity.
  • the methods for detecting and quantifying the number of viable cells or cell viability are as follows: 1) Trypan blue staining method, 2) MTT assay method (Journ alof Immunological Medical Methods, 65, 55-63, 1983) 3Method described in US Pat. No. 5,314,805, 4Molecular Medicine, Vol. 32, pp. 1340-1342, 1995, 5US Patent Publication No. 5,534
  • the method described in c 1 which proposes the method described in No.
  • 416 is to measure the number of cells stained with the tribble dye, which stains only dead cells blue, within the visual field of the microscope.
  • MTT is used as a substrate for mitochondrial dehydrogenase in cells, and the amount of blue-violet formazan resulting from the enzymatic reaction is quantified using an absorptiometer.
  • two types of fluorescent substances Rosin AM and ethidium homodimer are allowed to act on the same sample, and the fluorescence emitted from living cells and the fluorescence emitted from dead cells are measured simultaneously. This is a method for measuring the number of viable cells.
  • Calcine AM is a substance that usually emits little fluorescence, but is broken down into calcine by the action of esterase in living cells, and emits strong fluorescence.
  • Etididium homodimer is a fluorescent nucleic acid stain that has the property of passing only through the damaged cell membrane.It specifically penetrates only dead cells and binds to nucleic acids, and emits fluorescence about 40 times that of normal. Emits.
  • the intensity of the fluorescence emitted from the test sample treated with providide iodide, which stains only the DNA of dead cells, and the effect of Hoechst 332,588, which stains DNA of dead cells and live cells, are used.
  • This is a method of measuring the intensity of the fluorescence emitted from the measurement sample and comparing the two intensities to measure the cell viability.
  • the method of 5 is a cyanine-based nucleic acid fluorescent stain described in US Pat. No. 5,436,134, which stains DNA of both live cells and dead cells.
  • This method measures the cell viability by measuring the intensity of the fluorescent light emitted from the measurement sample that has been acted on (they are collectively called Dye II) and comparing the two intensities. .
  • the methods (1) and (2) are difficult to distinguish between staining with the dye Tripan Blue and difficult to measure without the naked eye, so the measurement is extremely time-consuming. In principle, it depends on the enzyme reaction, so the measurement temperature, the measured pH, the enzyme reaction time, the difference in the enzyme activity depending on the cell type, etc. Susceptible. In addition, the method (2) requires a centrifugal separation operation and an operation to dissolve the poorly soluble formazan resulting from the enzyme reaction. In method (3), (1) serum-derived esterase in cell culture solution decomposes calcinein AM, so it is necessary to remove serum by washing cells several times, but dead cells are easily removed by washing. However, accurate measurement cannot be performed unless the system uses a serum-free cell culture solution.
  • the inventor of the present invention has been able to (1) easily and quickly measure the number of viable cells accurately in many sample samples, and (2) can measure a sample in which serum is present in a cell culture medium. Yes, (3) No complicated operations such as cell washing, cell centrifugation, and dye lysis are required for the measurement sample. (4) Measurement results differ depending on measurement temperature, measurement PH, reagent reaction time, and cell type.
  • the present invention was completed as a result of various studies to provide a method for measuring the number of viable cells that satisfies conditions such as being less susceptible to such effects as the above.
  • the present invention provides (1) the intensity of fluorescence emitted from a measurement sample to which a nucleic acid fluorescent stain that stains only dead cells has been applied, the treatment of the nucleic acid fluorescent stain, and the treatment of damaging the cell membrane. And the intensity of fluorescence emitted by the measured sample, and comparing the two intensities.
  • the method for measuring cell viability and (2) the intensity of fluorescence emitted from a measurement sample to which a nucleic acid fluorescent dye that stains only dead cells is applied, and the measurement sample to which the dye and an agent that damages the cell membrane are applied.
  • Fluorescent nucleic acid stains that measure only the number of viable cells and Z or cell viability by measuring the intensity of emitted fluorescence and comparing the two intensities, and agents that damage cell membranes And a kit for measuring the number of viable cells and Z or cell viability. More specifically, the present invention provides
  • the intensity of the fluorescence emitted from the measurement sample to which the nucleic acid fluorescent staining agent that stains only dead cells is applied, and the measurement sample subjected to the treatment with the nucleic acid fluorescent staining agent and the treatment to damage the cell membrane are emitted.
  • a method for measuring the number of viable cells and / or cell viability comprising measuring the intensity of fluorescence and comparing the two intensities;
  • nucleic acid fluorescent dye that stains only dead cells is allowed to act on the measurement sample, and the intensity of the resulting fluorescence is measured. ( ⁇ ) Then, a treatment to damage the cell membrane of this sample is performed. (3).
  • (0) A nucleic acid fluorescent dye that stains only dead cells is allowed to act on the 0 measurement sample to measure the intensity of the fluorescence enhanced by killing the cells. Measuring the intensity of the fluorescence emitted from the sample, and (ii) subjecting another measurement sample to a treatment with the nucleic acid fluorescent dye and damaging the cell membrane, and measuring the intensity of the fluorescence emitted from the sample. [1] Measurement method described;
  • nucleic acid fluorescent stain is a cationic nucleic acid fluorescent stain
  • the intensity of the fluorescence emitted by the measurement sample treated with the nucleic acid fluorescent stain that stains only dead cells and the intensity of the fluorescence emitted by the measurement sample treated with the stain and the agent that damages the cell membrane
  • Viable cells composed of a nucleic acid fluorescent stain that stains only dead cells and an agent that damages the cell membrane to measure the number of viable cells and Z or cell viability by measuring each and comparing the two intensities Provide kits for measuring number and Z or cell viability.
  • the invention relates to
  • nucleic acid fluorescent stain is an ethidium homodimer or a cyanine nucleic acid stain that stains only dead cells
  • nucleic acid fluorescent stain is a cyanine-based nucleic acid fluorescent stain that stains only dead cells
  • the agent that damages the cell membrane is Triton X—100 (trade name), Triton X—114 (trade name) or Nonidet p—40 (trade name) force, which is at least one surfactant selected from the above [5], [6],
  • nucleic acid fluorescent stain is ethidium homodimer or a cyanine nucleic acid fluorescent stain that stains only dead cells
  • nucleic acid fluorescent stain is a cyanine-based nucleic acid fluorescent stain that stains only dead cells
  • the drug that damages the cell membrane is selected from Triton X—100 (trade name), Triton X—114 (trade name) or Nonidet p—40 (trade name)
  • Triton X—100 trade name
  • Triton X—114 trade name
  • Nonidet p—40 trade name
  • a kit for measuring the number of viable cells and / or cell viability according to any one of [14] and [15] is provided.
  • the invention relates to
  • a means for supplying a nucleic acid fluorescent stain that stains only dead cells to the sample to be measured (b) Measuring the intensity of the fluorescent light emitted from the sample to be measured with the nucleic acid fluorescent stain (C) damaging cell membranes (D) at least means for measuring the intensity of the fluorescence emitted from the sample to be measured which has been treated with a nucleic acid fluorescent dye which stains only dead cells and which has been treated to damage the cell membrane.
  • a device for measuring the number of viable cells and Z or cell viability characterized by comprising means for comparing the intensities of the above (b) and (d) for each of the measured intensities of the fluorescence;
  • a drug injector for supplying a drug to a sample to be measured (A) a device that holds a drug that damages the cell membrane, (b) a device that holds a nucleic acid fluorescent stain that stains only dead cells, (c) a device that holds the above-mentioned device (a) or (b).
  • a container such as a measuring cuvette or microplate with a stirrer capable of holding the sample to be measured, and ( e ) a spectrofluorometer as described in (18) to (21) above. Measuring device according to any one of the above; and
  • a substance required for toxicity evaluation is allowed to act on cells, and then a nucleic acid fluorescent dye that stains only dead cells is allowed to act on the obtained measurement sample, and the intensity of fluorescence emitted from the measurement sample is determined.
  • the intensity of the fluorescence emitted from the measurement sample subjected to the treatment with the nucleic acid fluorescent stain and the treatment to damage the cell membrane is measured, and the two intensities are compared to obtain the number of surviving cells and Z or cell survival.
  • FIG. 1 is an example of the viable cell count measuring apparatus of the present invention.
  • the present invention can be performed by a method in which the number of dead cells is measured for the same sample, and then the total number of cells is measured.
  • FIG. 2 shows another example of the viable cell count measuring apparatus of the present invention.
  • This device several measurement samples under the same conditions are prepared, and the number of dead cells is measured for the half of the samples by the above-mentioned method, and the nucleic acid fluorescent dye is applied to the remaining half of the samples.
  • the present invention is carried out by a method in which the number of dead cells is measured for a sample in which the number of dead cells is determined in the same manner as in the above-mentioned method after performing the treatment and the treatment of damaging the cell membrane. be able to.
  • FIG. 3 shows the relationship between the number of planktonic cells and the fluorescence intensity measured in the present invention. This shows that there is a proportional relationship between cell number and fluorescence intensity.
  • FIG. 4 shows the relationship between the number of adherent cells and the fluorescence intensity. This shows that there is a proportional relationship between the cell number and the fluorescence intensity.
  • the measurement sample to which the present invention can be applied may be a cell having no cell wall, and examples thereof include animal cells, some microbial cells, and protoplasts of microorganisms and plants from which cell walls have been removed.
  • animal cells animal fluid cells (cells such as blood and lymph), cancer cells and the like can be mentioned as typical examples.
  • animal fluid cells cells such as blood and lymph
  • cancer cells cancer cells and the like can be mentioned as typical examples.
  • These samples may be anything as long as they are in an environment where cells can survive, such as cells in a culture solution.
  • cytotoxic drugs, pesticides, cosmetics, foods, etc. coexist in the living environment of these samples, some or all of the cells in the samples become dead cells. By measuring the number of surviving cells in such an environment, cytotoxicity can be evaluated.
  • Nucleic acid fluorescent stains that stain only dead cells (1) pass through damaged cell membranes but do not pass through intact cell membranes, (2) emit or emit weak fluorescence when not bound to nucleic acids (3) It emits strong fluorescence when bound to nucleic acid.
  • cationic nucleic acid fluorescent stains such as ethidium homodimer and cyanine nucleic acid stain; halogenated chemicals such as bromide chimide; and halogenated chemicals such as providium iodide can be used. Vibrant, stained only with ethidium homodimers or dead cells It is preferable to use a stain-based nucleic acid stain, and particularly desirable is a cyanine-based nucleic acid stain that stains only dead cells.
  • cyanine nucleic acid stains that stain only dead cells include those described in US Pat. No. 5,321,130. Specifically, BOB • —1 Iodide, BOBO— 3 I od id es BO-PRO- 1 I od ide, BO-PRO- 3 I od ide, POPO- 1 I od ide, POPO- 3 I odide, PO-PRO-1 I od ide, PO-PRO- 3 Iodide, TOTO-1 Iodide, TOTO-3 Iodide, TO-PRO-1 Iodide, TO-PRO-3 Iodide, YOY 0-1 Iodide.YOYO-3 I odide, Y0-PR0-1 Iodide, Y0-PRO-3 Iodide (all trade names; manufactured by Molecular Probes), and the like.
  • Fluorescence measurement wavelengths differ depending on the measurement conditions such as the type of cells to be measured and the type of target to be evaluated for cytotoxicity such as pharmaceuticals, agricultural chemicals, cosmetics, and foods, but each nucleic acid stain has its own unique Since it has an excitation wavelength and a fluorescence emission wavelength, it can be appropriately selected and used according to the measurement conditions.
  • the nucleic acid fluorescent stain itself may have intrinsic fluorescence in addition to the target or culture medium for which cytotoxicity is to be evaluated, the background fluorescence intensity (Fb) derived from them is measured in advance using a fluorometer. It is necessary to keep.
  • the nucleic acid fluorescent stain has a property of passing through a damaged cell membrane, that is, a cell membrane of a dead cell, and cannot pass through an intact cell membrane, that is, a cell membrane of a live cell.
  • the staining agent When activated, selectively penetrates the dead cells, binds to the nucleic acid, and emits strong fluorescence.
  • a method of damaging the cell membrane of the measurement sample there are a method of applying a drug that damages the cell membrane, and a method of damaging the cell membrane by a physical method such as applying ultrasonic waves.
  • any agent that damages the cell membrane can be used as long as it damages the cell membrane of living cells and kills all living cells in the system.
  • Surfactants acids such as hydrochloric acid and sulfuric acid; sodium hydroxide, and hydroxide Bases such as potassium and the like can be mentioned.
  • a surfactant in the above-mentioned drugs.
  • Nonionic surfactants such as ester-type nonionic surfactants such as Zwyn-20, Zwyn-1 80, and Span-1 20 (all trade names; manufactured by PI ERCECHEMI CAL);
  • Nonidet p-4 Nonidet p-4
  • Alcohol type nonionic surfactant such as 0 (trade name; manufactured by PI ERCECHEMI CAL); CHAP S, CHAPSO, BI GCHAP, DEOXY-BI GCHAP (all trade names; PI ERCECHEM)
  • Cholic acid-type nonionic surfactants such as 1 CAL); hexyl / 3-D-glucopyranoside, octyl / 3-D-glucoviranoside, octyl- ⁇ -glucoside, octyl; S-thiogluviranoside, octyl Glycoside-type non-ionic surfactants such as glucoviranoside; N-lauroyl sarcosine, N-lauroyl sarcosine sodium, sodium lauryl sulfate, lithium lauryl sulfate, sodium dodecyl sulfate and the like; surfactants such as saponin, o Ginseng saponins, glycyl It is preferable to use a polyoxyethylene ether type nonionic surfactant or an alcohol type nonionic surfactant, such as ritin, glycyrrhizic acid or saponins such as s
  • the drug should be dropped as a solution of a predetermined concentration into a culture solution containing stationary cells or the like, or into a stirred culture solution.
  • a culture solution containing cells or the like can be gently added to a liquid containing the drug at a predetermined concentration, or the culture solution can be added and mixed with stirring.
  • the addition can be carried out using, for example, a pipette, syringe (syringe), pipettor, dispenser, spot, or the like.
  • the cells may only need to temporarily contact the drug that damages the cell membrane, for example, only immerse the drug in the liquid containing the drug.
  • the method can be carried out by adding a predetermined amount of a solution of the drug to a culture solution according to a predetermined procedure using an automated device equipped with a microprocessor. It can be used by appropriately selecting from the following.
  • the cell membrane is damaged by a physical method, it may not only damage the cell membrane but also destroy the DNA inside the cell. If necessary, examine the processing conditions. For example, when applying ultrasonic waves, it is possible to immerse the vibrator in the sample, or to put the sample in a lip-shaped container equipped with the vibrator. An apparatus capable of continuous processing can also be used, and can be used by appropriately selecting from apparatuses known in the art. To further damage the cell membrane, osmotic shock, freeze-thaw, etc. can be used. If the cell viability cannot be obtained directly from the measured values, create a new calibration curve for each treatment condition as needed and correct the measured values.
  • the nucleic acid fluorescent stain enters the living cells, and the nucleic acid Binds and fluoresces. Therefore, fluorescence that is enhanced by the amount of fluorescence emitted from the living cells from the measurement sample is emitted.
  • the intensity of the enhanced fluorescence (Ft ') with a fluorimeter, the total number of cells present in the measurement sample can be quantified. Then, the number of living cells can be determined by subtracting the number of dead cells from the total number of cells.
  • the time interval between the previous measurement step and the subsequent measurement step becomes a problem.
  • the time interval varies depending on various conditions such as a cell type to be measured, a nucleic acid fluorescent stain, and an agent that damages the cell membrane, but is preferably short, preferably within 2 hours, and more preferably within 1 hour. . Therefore, it is desirable to select which method is the most suitable for these conditions, taking into account various conditions such as the cell type to be measured, the fluorescent nucleic acid stain, and the agent that damages the cell membrane. .
  • the cell viability can be calculated from the quantified values of the total cell number and the viable cell number. In addition, if the number of dead cells is estimated to be almost 0, it will be F1t. Therefore, when the fluorescence intensity is measured by simultaneously applying the nucleic acid fluorescent dye and the agent that damages the cell membrane at one time, one fluorescence
  • the total number of cells that is, the number of viable cells can be quantified only by measurement. In the case of pharmaceuticals, agricultural chemicals, cosmetics, foods, etc., the cytotoxicity exerted by the number of viable cells and the cell viability may be evaluated depending on the values.For example, 50% of the viable cells will be dead cells. it may determine the concentration IC 5 D drugs, etc., but according to the method of the present invention, it is possible to assess their cytotoxic easily and efficiently.
  • the cell viability can be directly measured without calculating the number of viable cells.
  • the intensity of the fluorescence emitted by the measurement sample treated with a nucleic acid fluorescent stain that stains only dead cells, and the intensity of the fluorescence emitted by the measurement sample treated with the nucleic acid fluorescent stain and treated to damage the cell membrane The first step of measuring the strength and the first step (this step includes each treatment performed before each measurement) and the operations of the series of steps consisting of the second step comparing both intensities are combined to form a system. Output the number of viable cells or cell viability
  • the present invention can be performed by a measuring instrument having a function. In the measuring device, a nucleic acid fluorescent stain for staining only dead cells and an agent for damaging the meniscus envelope were set in advance in order to perform each treatment performed before each measurement in the first step of the system.
  • kits for measuring the number of viable cells and a kit for measuring Z or cell viability can be applied to such a measuring instrument, the measurement of the number of viable cells and Z or cell viability according to the present invention can be performed efficiently.
  • the apparatus for automatically performing the measurement of the present invention include the apparatus shown in FIG. 1 and the apparatus shown in FIG.
  • the device is referred to as a viable cell count measuring device, it may be understood as a cell viability measuring device or a viable cell count and / or cell viability measuring device. In the present description and in the claims, the device is to be understood in a broad sense.
  • FIG. 1 shows an example of an apparatus for measuring the number of viable cells when the present invention is performed by a method of measuring the number of dead cells for the same sample and then measuring the total number of cells.
  • the device consists of a spectrofluorometer built into the device, where the measuring cuvette with a stirrer (6), the excitation side spectrometer (14), the fluorescence spectrometer (15), a light source (10), a lens (5, 9 and 11), a polarizing plate (4 and 12), and a photomultiplier tube (13).
  • 1 indicates a drug that damages the cell membrane
  • 3 indicates a nucleic acid stain that stains only dead cells, and each drug is set in a tank or a detachable container in the apparatus.
  • the drug set in these tanks or detachable containers can be injected into the measuring cuvette (6) with a stirrer by the drug injector (2).
  • the equipment is equipped with valves and pumps (not shown) for appropriate control. Further, a washing pump, a drainage pump, a switching valve, an air pump for stirring, a nozzle, and the like can be provided as necessary.
  • reference numeral 7 denotes a device for converting an analog signal into a digital signal
  • reference numeral 8 denotes a control system.
  • the measurement cuvette (6) can be continuously moved as necessary, and can automatically measure a plurality of cuvettes.
  • the measuring cuvette (6) can be held in a thermostatic bath.
  • the measurement cuvette (6) can be fixed so that the drug injector and the spectrofluorometer can be continuously moved as needed, and the measurement can be performed automatically.
  • FIG. 2 several samples under the same conditions are prepared, and the number of dead cells is measured for the half of the samples by the method described above, while the remaining half of the samples are treated with a nucleic acid fluorescent dye.
  • the present invention is carried out by performing a process of damaging the cell membrane, measuring the number of dead cells for a sample for determining the number of dead cells in the same manner as in the above method, and then measuring the total number of cells. In this case, an example of the viable cell counting device is shown.
  • the device consists of a spectrofluorometer built into the device, where a 96-well microphone port plate with plate agitator (5), an excitation side spectrometer (15), It consists of a fluorescence spectrometer (16), a light source (11), a lens (7, 10 and 12), a polarizing plate (6 and 13) and a photomultiplier (14).
  • 1 in the figure is a cell dilution suspension, which is set in a tank or a detachable container in the apparatus. In order to supply a suspension of uniform concentration from the tank to each well, a stirrer is attached to the tank or a detachable container.
  • Each drug is set in a reservoir or a detachable container in the apparatus.
  • the suspension or chemical set in these tanks or detachable containers is dispensed by a dispenser (3) to each well in a 96-well microphone port plate with plate agitator (5).
  • Disposable tip at tip of dispenser (3) Or they are equipped with nozzles, which can be replaced or cleaned as needed.
  • the tip of the dispenser (3) may be branched, and it is possible to dispense the drug to a plurality of sample wells at the same time.
  • Reference numeral 8 in the figure denotes a device for converting an analog signal into a digital signal
  • reference numeral 9 denotes a control system.
  • the microplate (5) can be continuously moved as required, and can automatically measure a plurality of microplates. Further, the microplate is fixed, and the dispenser (3) and the spectrofluorometer can be continuously moved as required, so that the measurement can be performed automatically.
  • the present invention is carried out by measuring the total number of cells after measuring the number of dead cells for the same sample, it is efficient to perform the measurement using the apparatus shown in FIG. An example of how to use this device is shown below.
  • [1] Set the measurement sample such as cells in the culture solution in a measurement cuvette (6) equipped with a stirrer and stir.
  • the nucleic acid stain (1) that stains only dead cells and the agent that damages the cell membrane (3) are set in advance in tanks in the apparatus.
  • a nucleic acid stain (1) which stains only dead cells, is injected into a measurement cuvette (6) containing a measurement sample by a drug injector (2), and the measurement sample is stained. I do. Then, the intensity of the fluorescence emitted by this is measured with a spectrofluorometer. The measurement result is converted from an analog signal to a digital signal and sent to the control system (8).
  • the amount used in (1) is automatically controlled in conjunction with the control system for fluorescence intensity measurement (8).
  • the measurement sample is used as a cell-diluted suspension (1) in each well of a 96-well microplate (5) with a plate agitator using a dispenser (3). Dispense. After dispensing, stir the microplate with a plate stirrer. Also, the nucleic acid stain (2) for staining only dead cells and the agent (4) for damaging cell membranes are set in advance in the tank in the apparatus.
  • [2] Dispense the nucleic acid stain (2), which stains only cells, into a 96-well microphone plate (5) in which the measurement sample is set using a dispenser, and stain the measurement sample. After that, the intensity of the fluorescence emitted from the sample in each well is measured with a spectrofluorometer. The measurement result is converted from an analog signal to a digital signal and sent to the control system (9). The amount of the nucleic acid stain (4) used to stain only dead cells is automatically controlled in conjunction with the control system (9) for measuring the fluorescence intensity.
  • the dispenser is equipped with a separate dispensing tube for each drug, so that a single operation can dispense the drug to multiple wells. Wear.
  • a test sample under the same conditions as those used in the measurement of [2] was set by a dispenser, using a dispenser for the drug (2) that damages the cell membrane and the nucleic acid dye (4) that stains only dead cells.
  • the amount of the agent (2) that damages the cell membrane and the amount of the nucleic acid stain (4) that stains only dead cells are automatically controlled in conjunction with the control system for fluorescence intensity measurement (9).
  • the measurement result is converted from an analog signal to a digital signal, sent to the control system (9), and the cell viability is measured in comparison with the measurement result in [2]. Also, if necessary, perform the above measurement on some samples whose cell numbers are known and have an appropriate cell number, and give a calibration curve to this device. Can be measured.
  • a device for measuring the number of viable cells and / or cell viability is provided, each component of which can be used in automated immunoassays, automated biochemical assays, etc. It can be used by selecting and applying it from among those known in, or it can be used with appropriate modifications as needed.
  • a programmed computer for example, a microcomputer, (a) a means for supplying a nucleic acid fluorescent stain for staining only dead cells to a sample to be measured, and (b) causing the nucleic acid fluorescent stain to act.
  • Means for measuring the intensity of the fluorescence emitted from the sample to be measured (c) means for enabling the cell membrane to be damaged, and (d) the action of a nucleic acid fluorescent dye which stains only dead cells and damage to the cell membrane.
  • the nucleic acid fluorescent dye for staining only the various dead cells described above is used.
  • the above-mentioned various agents that damage cell membranes can be used in combination with each other.
  • the combination of the above-mentioned nucleic acid fluorescent stain for staining only various dead cells and the above-mentioned various surfactants can be used. It is desirable to use.
  • nucleic acid fluorescent dye for staining only dead cells and the various surfactants described above are mixed in advance as necessary.
  • kits for measuring the number of viable cells and the Z or cell viability corresponding to the apparatus for measuring the number of viable cells shown in FIG. 1 or FIG.
  • One of the desirable forms of the kit is a kit in which a nucleic acid stain for staining only dead cells and an agent for damaging the cell membrane are pre-filled in a detachable container of the viable cell counting device.
  • the staining agent and the drug are filled in separate detachable containers, respectively, and if necessary, the same detachable container is used. It may be filled in a container.
  • MOLT-4 cells human acute lymphoblastic leukemia cells: obtained from the Institute for Microbiology, Osaka University
  • Culture solution is RPMI solution containing 10% fetal calf serum
  • samples under good culture conditions in which the culture medium was changed appropriately when the cell concentration became high, and two samples on a plate (cultured without changing the culture medium) ( The poor culture conditions (samples (1) and (2)) were used as cell viability measurement samples.
  • MOLT-4 human promyelocytic leukemia cells
  • U933 human histiocytic lymphoma cells
  • HT-1080 human fibrosarcoma cells
  • the cell concentration of the measurement sample was diluted 2-fold with the culture solution to prepare a cell-diluted suspension, which was dispensed into each of the 96-well microplates at a rate of 180 ⁇ 1.
  • FIG. 3 shows that there is a proportional relationship between the number of floating cells and the fluorescence intensity.
  • HL-60 and U-937 have a proportional relationship between cell number and fluorescence intensity within the range of 1.25 ⁇ 10 4 to 4 ⁇ 10 5 cells.
  • MOLT- 4 is proportional relationship between the cell number and fluorescence intensity in cell number 1. 2 5 xl (T ⁇ 2 xl 0 in five ranges.
  • FIG. 4 shows that there is a proportional relationship between the number of adherent cells and the fluorescence intensity.
  • ⁇ - 1 0 8 0 is proportional relationship between the cell number and fluorescence intensity in the number of cells 3 0 0 ⁇ 1 X 1 0 5 amino within range.
  • the fluorescence intensity was measured using an MTP-32 Corona Microplate Reader-1 (manufactured by Corona Electric Co., Ltd.) under the measurement conditions of an excitation wavelength of 420 nm and a fluorescence emission wavelength of 460 nm. This measurement can be performed even if it is automated by the device shown in FIG.
  • MOLT-4 cells were dispensed at 3 ⁇ 10 cells / 150 ⁇ 1 per cell.
  • Triton X-100 (trade name) to each cell at 1/0/1 (final concentration: 0.05%), stir for about 30 seconds with a plate stirrer, and measure fluorescence To obtain F f.
  • the number of surviving cells was measured by the MTT Atsey method with reference to pages 936 to 942, 1990, and the results are shown in Table 2.
  • Table 3 shows the outline of the steps of measuring the number of viable cells by the method of the present invention and the MTT assay. Note that the above-described measurement according to the present invention can be performed by automation using the apparatus shown in FIG.
  • TritonX- 100 (1%) 10 l / well 1 minute 4 37 ° C, 53 ⁇ 4C0 2 culture 3 hours
  • the cytotoxicity of mitomycin C was calculated to be 2.2 ⁇ g / ml in the method according to the present invention. This value is only on the order of / g / ml, compared to the value measured by the MTT method (5.5 Ug / m ⁇ ), which is currently most commonly used for evaluating the cytotoxicity of drugs, and is acceptable in the art.
  • the method according to the present invention can be sufficiently applied to the cytotoxicity evaluation by a drug.
  • the present invention has the advantage that the cell viability at each drug concentration can be calculated at the same time, and a lot of information can be obtained in evaluating the drug efficacy.
  • the time required for the measurement is about 5 minutes in the method according to the present invention, and the existing MT
  • the use of a nucleic acid fluorescent dye that stains only dead cells and a drug that damages the cell membrane allow the number of viable cells and / or cell viability of multiple samples to be measured simply, quickly, and accurately. It can be used to evaluate cytotoxicity of pharmaceuticals, agricultural chemicals, cosmetics, foods, etc. In addition, its cytotoxicity can be easily and quickly evaluated.

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Description

明 现 曞 生存现胞数の枬定方法 技術分野
本発明は、 现胞に察し、 死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀を䜜甚 させる凊理および现胞膜を損傷させる凊理を斜すこずにより、 簡䟿か぀ 迅速に倚怜䜓の生存现胞数および Zたたは现胞生存率を枬定する方法を 提䟛するものであり、 医薬、 蟲薬、 化粧品、 食品などの研究開発分野、 医孊、 薬孊、 生物孊䞊の研究分野、 および臚床的な怜査蚺断分野など における现胞毒性の評䟡などに利甚できる。 背景技術
医薬品、 蟲薬、 化粧品、 食品などの安党性、 薬効などはそれらのおよ がす现胞毒性によっお評䟡されるこずが倚く、 この现胞毒性の指暙ずし お生存现胞数が枬定されるこずが倚い。 生存现胞数たたは现胞生存率を 怜出定量する方法ずしおは、 ①トリパンブルヌ染色法、 ② MTTアツセ ィ法 (j ou rn a l o f Immuno l og i c a l M e t h o d s、 65卷、 55〜 63頁、 1 983幎 、 ③米囜特蚱公報第 5 , 314 805号に蚘茉の方法、 ④ Mo l e cu l a r Med i c i n e 32å·» 1 340〜 1 342頁、 1 995幎に蚘茉の方法、 ⑀米 囜特蚱公報第 5 534 4 16号に蚘茉の方法などが提案されおいる c ①の方法は、 顕埮鏡芖野内で、 死现胞のみを青色に染色する色玠トリバ ンブル䞀によ぀お染色された现胞数を肉県で蚈枬する方法であり、 ②の 方法は、 MTTが现胞内のミ トコンドリアの脱氎玠酵玠の基質ずなり、 その酵玠反応の結果生じる青玫色のホルマザンの量を吞光床蚈で定量す るものであり、 ③の方法は、 同䞀の詊料䞭に 2皮類の蛍光物質 力ルセ むン A Mおよびェチゞゥム ホモダむマヌ を䜜甚させ、 生现胞の発す る蛍光ず死现胞の発する蛍光ずを同時に蚈枬するこずにより、 生存现胞 数を枬定する方法である。 カルセィン A Mは通垞ほずんど蛍光を発しな い物質であるが、 生现胞内でぱステラヌれの䜜甚でカルセィンに分解 され、 匷い蛍光を発する。 ェチゞゥム ホモダむマヌは、 損傷郚を有す る现胞膜のみしか通過できない性質を持぀栞酞蛍光染色剀であり、 死现 胞のみに特異的に䟵入しお栞酞ず結合し、 通垞の玄 4 0倍の蛍光を発す る。 これらの枬定法により、 薬剀等による现胞毒性をマルチプレヌト䞊 で簡䟿か぀迅速に枬定するこずが可胜ずなった。 たた、 ④の方法は、 æ­» 现胞の D N Aのみを染色するペり化プロビゞゥムを䜜甚させた枬定詊料 の発する蛍光の匷床ず、 死现胞ず生现胞の D N Aを染色する H o e c h s t 3 3 2 5 8を䜜甚させた枬定詊料の発する蛍光の匷床ずを各々枬 定し、 䞡匷床を察比するこずにより、 现胞生存率を枬定する方法である。 さらに、 ⑀の方法は、 生现胞および死现胞の䞡方の D N Aを染色する米 囜特蚱公報第 5 4 3 6 , 1 3 4号蚘茉のシァニン系栞酞蛍光染色剀
( D y e I ) を䜜甚させた枬定詊料が発する蛍光の匷床ず、 死现胞の D N Aのみを染色する米囜特蚱公報第 5 , 3 2 1 , 1 3 0号蚘茉のシァ 二ン系栞酞蛍光染色剀たたは生现胞に䜜甚させるず蛍光を発する染色剀
(䞡者を総称しお D y e Πず呌んでいる を䜜甚させた枬定詊料が発 する蛍光の匷床ずを各々枬定し、 䞡匷床を察比するこずにより、 现胞生 存率を枬定する方法である。
し力、しな力くら、 ①の方法は色玠卜リパンブルヌによる染色を刀別する のが難しく、 肉県によらなければ蚈枬が困難であるので枬定に非垞に時 間がかかり、 ②および③の方法は原理的に酵玠反応に䟝存するので、 枬 定枩床、 枬定 p H、 酵玠反応時間、 现胞皮による酵玠掻性の差異等の圱 響を受けやすい。 たた、 ②の方法では遠心分離操䜜が必芁な䞊、 酵玠反 応の結果生じた難溶性のフオルマザンを溶解する操䜜が必芁である。 ③ の方法においおは、 1) 现胞培逊液䞭の血枅由来の゚ステラヌれがカル セィン AMを分解するので、 数回の现胞掗浄によっお血枅を陀く必芁が あるが、 死现胞は掗浄により陀倖されやすいため、 無血枅の现胞培逊液 を䜿甚した系以倖でないず正確な枬定が行えない、 2) 二皮類の蛍光に ぀いお枬定を行っおいるため、 枬定が煩雑になるなどの欠点がある。 さ らに、 ④および⑀の方法においおは、 1) 2皮類の蛍光に぀いお枬定を 行わなければならないため操䜜が煩雑である、 2) 1぀の詊料に 2皮類 の蛍光色玠を䜜甚させお现胞生存率を枬定する堎合には、 埌で䜜甚させ た蛍光色玠に察し前に䜜甚させた蛍光色玠が悪圱響を及がす、 3) 生存 率を求めるためには各枬定毎に怜量線を䜜成する必芁があるなどの欠点 がある。 発明の開瀺
本発明者は、 1) 簡䟿か぀迅速に、 倚くの怜䜓の詊料䞭の生存现胞数 を正確に枬定できる、 2) 现胞培逊液䞭に血枅が共存しおいる枬定詊料 に぀いおも枬定可胜である、 3) 枬定詊料に察しお现胞掗浄、 现胞遠心 分離、 色玠溶解など煩雑な操䜜が䞍芁である、 4) 枬定結果が、 枬定枩 床、 枬定 P H、 詊薬反応時間、 现胞皮による差異等の圱響を受けにくい などの条件を満足できる生存现胞数の枬定方法を提䟛すベく皮々怜蚎し た結果、 本発明を完成した。
本発明は、 1) 死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀を䜜甚させた枬 定詊料が発する蛍光の匷床ず、 該栞酞蛍光染色剀を䜜甚させる凊理およ び现胞膜を損傷させる凊理を斜した枬定詊料が発する蛍光の匷床ずを各々 枬定し、 䞡匷床を察比するこずを特城ずする生存现胞数および Zたたは 现胞生存率の枬定方法および 2 ) 死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色 剀を䜜甚させた枬定詊料が発する蛍光の匷床ず、 該染色剀および现胞膜 を i 傷する薬剀を䜜甚させた枬定詊料が発する蛍光の匷床ずを各々枬定 し、 䞡匷床を察比するこずで生存现胞数および Zたたは现胞生存率の枬 定を行うための死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀および现胞膜を損 傷する薬剀から構成された生存现胞数および Zたたは现胞生存率枬定甚 キッ トに関する。 より具䜓的には、 本発明は、
〔 1〕 . 死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀を䜜甚させた枬定詊料 が発する蛍光の匷床ず、 該栞酞蛍光染色剀を䜜甚させる凊理および现胞 膜を損傷させる凊理を斜した枬定詊料が発する蛍光の匷床ずを各々枬定 し、 䞡匷床を察比するこずを特城ずする生存现胞数および/たたは现胞 生存率の枬定方法
〔2〕 . (0 枬定詊料に察し死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀を 䜜甚させ、 その結果発せられる蛍光の匷床を枬定した埌、 Π)次いで、 この詊料の现胞膜を損傷させる凊理を斜し、 现胞を死滅させるこずによ り増匷された蛍光の匷床を枬定する䞊蚘 Π〕 蚘茉の枬定方法 〔3〕 . (0 枬定詊料に察し死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀を 䜜甚させ、 このものが発する蛍光の匷床を枬定し、 Η)別の枬定詊料に 察し該栞酞蛍光染色剀を䜜甚させる凊理および现胞膜を損傷させる凊理 を斜し、 このものが発する蛍光の匷床を枬定する䞊蚘 〔 1〕 蚘茉の枬定 方法
〔4〕 . 前蚘栞酞蛍光染色剀が、 陜むオン性栞酞蛍光染色剀である䞊 蚘 〔1〕 〜 〔3〕 のいずれか䞀蚘茉の枬定方法
〔5〕 . 现胞膜を損傷する薬剀を甚いお现胞膜を損傷させる䞊蚘 〔 1〕 〜 〔4〕 のいずれか䞀蚘茉の枬定方法
〔6〕 . 现胞膜を損傷する薬剀が界面掻性剀である䞊蚘 〔5〕 蚘茉の 枬定方法
〔7〕 . 死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀を䜜甚させた枬定詊料 が発する蛍光の匷床ず、 該栞酞蛍光染色剀を䜜甚させる凊理および现胞 膜を損傷させる凊理を斜した枬定詊料が発する蛍光の匷床ずを各々枬定 し、 䞡匷床を察比するこずから成る䞀連の工皋䞭の各々の操䜜を自動化 された装眮にお行う䞊蚘 〔1〕 〜 〔6〕 のいずれか䞀蚘茉の枬定方法 及び
〔8〕 . 死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀を䜜甚させた枬定詊料 が発する蛍光の匷床ず、 該染色剀および现胞膜を損傷する薬剀を䜜甚さ せた枬定詊料が発する蛍光の匷床ずを各々枬定し、 䞡匷床を察比するこ ずで生存现胞数および Zたたは现胞生存率の枬定を行うための死现胞の みを染色する栞酞蛍光染色剀および现胞膜を損傷する薬剀から構成され た生存现胞数および Zたたは现胞生存率枬定甚キッ トを提䟛する。 さらに別の態様ずしおは、 本発明は
〔9〕 . 前蚘栞酞蛍光染色剀がェチゞゥム ホモダむマヌたたは死现 胞のみを染色するシァニン系栞酞蜇光染色剀である䞊蚘 〔1〕 〜 〔3〕 のいずれか䞀蚘茉の枬定方法
〔1 0〕 . 前蚘栞酞蛍光染色剀が死现胞のみを染色するシァニン系栞 酞蛍光染色剀である䞊蚘 〔1〕 〜 〔3〕 のいずれか䞀蚘茉の枬定方法
〔1 1〕 . 现胞膜を損傷する薬剀がポリオキシ゚チレン型非むオン性 界面掻性剀たたはアルコヌル型非むオン性界面掻性剀である䞊蚘 〔5〕 、
〔6〕 、 〔9〕 及び 〔1 0〕 のいずれか䞀蚘茉の枬定方法
〔1 2〕 . 现胞膜を損傷する薬剀がトリ トン X— 1 0 0 (商品名 、 トリ トン X— 1 1 4 (商品名 たたはノニデッ ト p— 4 0 (商品名 力、 ら遞ばれる少なくずも 1皮の界面掻性剀である䞊蚘 〔5〕 、 〔6〕 、
〔9〕 及び 〔1 0〕 のいずれか䞀蚘茉の枬定方法
〔1 3〕 . 前蚘栞酞蛍光染色剀が、 陜むオン性栞酞蛍光染色剀である 䞊蚘 〔8〕 蚘茉の生存现胞数および/たたは现胞生存率枬定甚キッ ト 
〔1 4〕 . 前蚘栞酞蛍光染色剀がェチゞゥム ホモダむマ䞀たたは死 现胞のみを染色するシァニン系栞酞蛍光染色剀である䞊蚘 〔8〕 蚘茉の 生存现胞数および/たたは现胞生存率枬定甚キッ 卜 
〔1 5〕 . 前蚘栞酞蛍光染色剀が死现胞のみを染色するシァニン系栞 酞蛍光染色剀である䞊蚘 〔8〕 蚘茉の生存现胞数および Zたたは现胞生 存率枬定甚キッ ト 
〔1 6〕 . 现胞膜を損傷する薬剀がポリオキシ゚チレン型非むオン性 界面掻性剀たたはアルコヌル型非むオン性界面掻性剀である䞊蚘 〔8〕 、
〔1 3〕 、 〔1 4〕 及び 〔1 5〕 のいずれか䞀蚘茉の生存现胞数および Zたたは现胞生存率枬定キッ ト 及び
〔 1 7〕 . 现胞膜を損傷する薬剀がトリ トン X— 1 0 0 (商品名 、 卜リ トン X— 1 1 4 (商品名 たたはノニデッ ト p— 4 0 (商品名 か ら遞ばれる少なくずも 1皮の界面掻性剀である䞊蚘 〔 8〕 、 〔 1 3〕 、
〔1 4〕 及び 〔1 5〕 のいずれか䞀蚘茉の生存现胞数および/たたは现 胞生存率枬定甚キッ 卜を提䟛する。 さらに別の態様ずしおは、 本発明は
U 8〕 . (a) 死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀を枬定察象詊 料に䟛絊する手段、 b) 該栞酞蛍光染色剀を䜜甚させた枬定察象詊料 が発する泶光の匷床を枬定する手段、 c) 现胞膜を損傷させるこずを 可胜にする手段、 d) 死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀を䜜甚さ せ䞔぀现胞膜を損傷させる凊理を斜した枬定察象詊料が発する蛍光の匷 床を枬定する手段を、 少なくずも備えおおり䞔぀枬定された各々の蛍光 の匷床に぀き䞊蚘 b) ず䞊蚘 d) の䞡匷床を察比する手段を備えお いるこずを特城ずする生存现胞数および Zたたは现胞生存率の枬定装眮
〔1 9〕 . (i) 枬定詊料に察し死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀 を䜜甚させ、 その結果発せられる蛍光の匷床を枬定した埌、 ii)次いで、 この詊料の现胞膜を損傷させる凊理を斜し、 现胞を死滅させるこずによ り増匷された蛍光の匷床を枬定するこずを行うこずを特城ずする䞊蚘
〔 1 8〕 蚘茉の枬定装眮
〔20〕 . 䞊蚘i) 及びH)を自動化された圢態で行うようにされた こずを特城ずする䞊蚘 〔1 8〕 たたは 〔1 9〕 蚘茉の枬定装眮
〔2 1〕 . マむクロプロセッサヌを䜿甚しお予め保存されおいるプロ グラムに埓い自動的に制埡されお各凊理が行われるようにされたこずを 特城ずする䞊蚘 〔2 0〕 蚘茉の枬定装眮
〔22〕 . (a) 现胞膜を損傷する薬剀を保持する装眮、 b) 死现 胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀を保持する装眮、 c) 䞊蚘装眮 a) あるいは b) からの薬剀を枬定察象詊料に䟛絊する薬剀泚入噚、
(d) 枬定察象詊料を保持できる攪拌装眮付き枬定キュべッ トあるいは マむクロプレヌトなどの容噚、 及び e) 分光蛍光光床蚈を備えるこず を特埵ずする䞊蚘 〔1 8〕 〜 〔2 1〕 のいずれか䞀蚘茉の枬定装眮及 び
〔23〕 . (a) 同䞀の枬定察象詊料に察しお、 i) 死现胞のみを染 色する栞酞蛍光染色剀を䜜甚させ、 その結果発せられる蛍光の匷床を枬 定した埌、 ii)次いで、 この詊料の现胞膜を損傷させる凊理を斜し、 现 胞を死滅させるこずにより増匷された蛍光の匷床を枬定するこずを行う こずを可胜にする装眮、 あるいは b ) ( i ) ある枬定察象詊料に察しお 死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀を䜜甚させ、 その結果発せられる 蛍光の匷床を枬定し、 i i )それずは別の枬定察象詊料に察しお該死现胞 のみを染色する栞酞蛍光染色剀を䜜甚させ䞔぀现胞膜を損傷させる凊理 を斜し、 その結果発せられる蛍光の匷床を枬定するこずを行うこずを可 胜にする装眮を備えるこずを特埵ずする䞊蚘 〔1 8〕 蚘茉の枬定装眮が 提䟛される。 さらに別の態様ずしおは、 本発明は
〔2 4〕 . 毒性評䟡の求められる物質を现胞に䜜甚せしめ、 次に埗ら れた枬定詊料に死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀を䜜甚させ、 該枬 定詊料が発する蛍光の匷床ず、 該栞酞蛍光染色剀を䜜甚させる凊理およ び现胞膜を損傷させる凊理を斜した枬定詊料が発する蛍光の匷床ずを各々 枬定し、 䞡匷床を察比するこずにより、 生存现胞数および Zたたは现胞 生存率を枬定するこずを特城ずする物質の毒性評䟡方法
〔2 5〕 . (i) 毒性評䟡の求められる物質を现胞に䜜甚せしめ、 Π) 埗られた枬定詊料に察し死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀を䜜甚さ せ、 その結果発せられる蛍光の匷床を枬定した埌、 i i i) 次いで、 この 詊料の现胞膜を損傷させる凊理を斜し、 现胞を死滅させるこずにより增 匷された蛍光の匷床を枬定する䞊蚘 〔2 4〕 蚘茉の毒性評䟡方法及び
〔2 6〕 . (i ) 毒性評䟡の求められる物質を现胞に䜜甚せしめ、 i i) 枬定詊料に察し死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀を䜜甚させ、 この ものが発する蛍光の匷床を枬定し、 H i) 別の枬定詊料に察し該栞酞蛍 光染色剀を䜜甚させる凊理および现胞膜を損傷させる凊理を斜し、 この ものが発する蛍光の匷床を枬定する䞊蚘 〔2 4〕 蚘茉の毒性評䟡方法を 提䟛する。 図面の簡単な説明
第 1図は、 本発明の生存现胞数枬定装眮の䞀䟋である。 本装眮では、 同䞀詊料に぀いお死现胞数の枬定を行った埌、 党现胞数の枬定を行う方 法で本発明を行うこずができる。
1  现胞膜を損傷する薬剀 2  薬剀泚入噚
3  死现胞のみを染色する栞酞染色剀 10  光源
6  攪拌装眮付き枬定キュベッ ト 5、 9及び 11  レンズ
7  アナ口グ信号をデゞタル信号に倉換する装眮
4及び 12  偏光板 13  光電子倍増管
8  制埡システム 14  励光偎分光噚 15  蛍光分光噚 第 2図は、 本発明の生存现胞数枬定装眮の別の䞀䟋である。 本装眮で は、 同䞀条件の枬定詊料を䜕点か甚意し、 その䞭の半数の詊料に぀き前 蚘方法で前蚘死现胞数を枬定し、 䞀方残りの半数の詊料に栞酞蛍光染色 剀を䜜甚させる凊理および现胞膜を損傷させる凊理を斜し、 前蚘方法の 堎合ず同様に死现胞数を求める堎合の詊料に぀いお死现胞数の枬定を行぀ た埌、 党现胞数の枬定を行う方法で本発明を行うこずができる。
1  现胞垌釈懞濁液 2  现胞膜を損傷する薬剀
3  分泚噚 4  死现胞のみを染色する栞酞染色剀
5  プレヌト攪拌噚付き 9 6りェルマむク口プレヌト
6及び 13  偏光板 7、 10及び 12  レンズ
8  アナ口グ信号をデゞタル信号に倉換する装眮
9  制埡システム 11  光源   励光偎分光噚
16  蛍光分光噚 14  光電子倍増管 第 3図は、 浮遊性现胞の现胞数ず本発明で枬定した蛍光匷床ずの間の 関係を瀺しおいる。 现胞数ず蛍光匷床ずの間に比䟋関係があるこずを瀺 しおいる。 第 4図は、 接着性现胞の现胞数ず蛍光匷床ずの間の関係を瀺しおいる。 现胞数ず蛍光匷床ずの間に比䟋関係があるこずを瀺しおいる。 発明を実斜するための最良の圢態
本発明を適甚するこずのできる枬定詊料は、 现胞壁を有しない现胞で あればよく、 䟋えば、 動物现胞、 䞀郚の埮生物现胞、 现胞壁を陀去され た埮生物や怍物のプロ トプラストなどが挙げられる。 特に動物の现胞で あれば䜕でも枬定詊料ずするこずができ、 䟋えば動物の䜓液现胞 血液、 リンパ液などの现胞 、 癌现胞などを兞型的なものずしお挙げるこずが できる。 これら詊料は现胞が生存できる環境にあるものなら䜕でもよく、 䟋えば培逊液䞭の现胞などが挙げられる。 これら詊料の生存環境内に现 胞毒性がある医薬品、 蟲薬、 化粧品、 食品などを共存させた堎合、 è©Šæ–™ 䞭の䞀郚あるいは党郚の现胞が死现胞ずなる。 このような環境内で生存 现胞数を枬定するず、 现胞毒性の評䟡を行うこずができる。
死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀ずは、 1) 損傷した现胞膜は通 過するが、 無傷の现胞膜は通過しない、 2) 栞酞ず結合しおいない状態 では匱い蛍光を発するかあるいは蛍光をほずんど発しない、 3) 栞酞ず 結合するず匷い蛍光を発するなどの特城を持぀ものを意味する。 具䜓的 には、 ェチゞゥム ホモダむマヌ、 シァニン系栞酞染色剀などの陜ィォ ン性栞酞蛍光染色剀臭化工チゞゥムのようなハロゲン化工チゞゥム ョゥ化プロビゞナりムのようなハロゲン化プロビゞナりムなどが䜿甚で きる力く、 ェチゞゥム ホモダむマ䞀たたは死现胞のみを染色するシァニ ン系栞酞染色剀を䜿甚するのが望たしく、 死现胞のみを染色するシァニ ン系栞酞染色剀が特に望たしい。 死现胞のみを染色するシァニン系栞酞 染色剀ずしおは、 米囜特蚱公報第 5 32 1, 1 30号に蚘茉のものな どが挙げられ、 具䜓的には BOB◩— 1 I od i d e、 BOBO— 3 I od i d es BO- PRO- 1 I od i d e, BO-PRO- 3 I od i d e, POPO- 1 I od i d e, POPO- 3 I o d i d e、 PO - PRO - 1 I od i d e, PO-PRO- 3 I od i de、 TOTO - 1 I od i d e、 TOTO - 3 I od i de、 TO - PRO- 1 I o d i d e、 TO - PRO - 3 I od i d e, YOY 0 - 1 I od i de. YOYO- 3 I o d i d e、 Y 0 - P R 0 - 1 I od i de、 Y0— PRO— 3 I od i d e (以䞊党お商品名 M o l e c u l a r P rob e s瀟補 などが挙げられる。 枬定すべき 现胞の皮類や医薬品、 蟲薬、 化粧品、 食品など现胞毒性を評䟡すべき察 象の皮類などの枬定条件の違いにより、 蛍光枬定波長は異なるが、 各栞 酞染色剀は、 それぞれ固有の励起波長、 蛍光攟射波長を有するので、 枬 定条件に応じ適切なものを適宜遞択しお䜿甚するこずができる。 たた、 现胞毒性を評䟡すベき察象や培逊液のほか栞酞蛍光染色剀自䜓が固有の 蛍光を持぀堎合があるので、 予めそれらに由来するバックグラりンドの 蛍光匷床 Fb) を蛍光枬定蚈で枬定しおおく必芁がある。
前蚘栞酞蛍光染色剀は、 損傷した现胞膜即ち死现胞の现胞膜は通過す る力 \ 無傷の现胞膜即ち生现胞の现胞膜は通過できない性質を持぀ので、 生现胞および死现胞が共存する詊料にこの染色剀を䜜甚させるず、 死现 胞に染色剀が遞択的に䟵入し、 栞酞ず結合しお匷い蛍光が発せられる。 この蛍光の匷床 Fd' ) を蛍光枬定蚈で枬定するこずにより死现胞数 を定量するこずができる。 具䜓的には Fd = Fd' — Fbずいう蚈算匏 により、 死现胞数に盞圓する蛍光匷床 Fd) を求め、 この倀から死现 胞数を怜量線などによ぀お定量するこずができる。 たた死现胞数を求め るこずなく盎接现胞生存率を求めるこずもできる。
枬定詊料の现胞膜を損傷する方法ずしおは、 现胞膜を損傷させる薬剀 を䜜甚させる方法、 超音波を䜜甚させるなどの物理的方法によ぀お现胞 膜を損傷させる方法などがある。
现胞膜を損傷させる薬剀は、 生现胞の现胞膜に傷害を䞎え系内の党お の生现胞を死滅させる薬剀であれば䜕でもよく、 界面掻性剀塩酞、 ç¡« 酞などの酞氎酞化ナトリりム、 氎酞化力リりムなどのような塩基など が挙げられる。 し力、しな力 <ら、 埌蚘蛍光匷床の枬定を明瞭に行うために は前述の薬剀䞭、 界面掻性剀を䜿甚するのが望たしく、 具䜓的にはトリ トン X— 1 00、 トリ トン X— 1 14、 トリ トン X— 305、 トリ トン X - 405、 B r i j— 35、 B r i j— 56、 B r i j— 58 (以䞊 党お商品名 P I ERCECHEMI C A L瀟補 などのポリォキシェ チレン゚ヌテル型非むオン性界面掻性剀 ッりむヌン— 20、 ッりむ䞀 ンヌ 80、 スパン䞀 20 (以䞊党お商品名 P I ERCECHEMI C AL瀟補 などの゚ステル型非むオン性界面掻性剀 ノニデッ ト p— 4
0 (商品名 P I ERCECHEMI CAL瀟補 のようなアルコヌル 型非むオン性界面掻性剀 CHAP S、 CHAPSO、 B I GCHAP、 DEOXY-B I GCHAP (以䞊党お商品名 P I ERCECHEM
1 CAL瀟補 などのコヌル酞型非むオン性界面掻性剀ぞキシルヌ /3 — D—グルコピラノシド、 ォクチルヌ /3— D—グルコビラノシド、 ォク チルヌ ^ヌグルコシド、 ォクチルヌ S—チォグルビラノシド、 ォクチル グルコビラノシドなどのグリコシド型非ィォン性界面掻性剀 N—ラり ロむルサルコシン、 N—ラりロむルザルコシンナ ト リりム、 ラりリル硫 酞ナトリりム、 ラりリル硫酞リチりム、 ドデシル硫酞ナトリりムなどの 陰ィォン界面掻性剀サポニン、 ォタネニンゞンサポ二ン類、 グリチル リチン、 グリチルリチン酞たたはサむコサポニン類などのサポニン類が 挙げられる力く、 ポリオキシ゚チレン゚ヌテル型非むオン性界面掻性剀た たはアルコヌル型非ィォン性界面掻性剀を䜿甚するのが望たしく、 トリ トン X— 1 0 0 (商品名 、 トリ トン X— 1 1 4 (商品名 たたはノニ デッ ト p— 4 0 (商品名 を䜿甚するのが特に望たしい。 これら现胞膜 を損傷する薬剀は単独であるいは混甚しお䜿甚するこずができる。
现胞膜を損傷する薬剀を䜜甚させる堎合、 該薬剀は所定の濃床の溶液 ずしお、 静眮された现胞などを含有する培逊液䞭に滎䞋されたり、 攪拌 されおいる培逊液䞭に滎䞋されたりするこずで䜜甚させるこずができる。 たた該薬剀を所定の濃床で含有する液䜓䞭に、 现胞などを含有する培逊 液を静かに加えたり、 あるいは攪拌䞋に培逊液を加えお、 混合するこず もできる。 こうした堎合、 䟋えばピぺッ ト、 泚射噚 シリンゞ 、 ピぺッ タヌ、 分泚噚、 スポィ トなどを䜿甚しお添加を行うこずができる。 たた、 现胞は該现胞膜を損傷する薬剀に䞀時的に接觊、 䟋えば該薬剀含有液に 浞挬するだけでよいこずもある。 奜たしくは、 マむクロプロセッサヌを 備えた自動化された装眮を甚いお予め決められた手順に埓い該薬剀の溶 液を培逊液䞭に所定量加えるこずにより行うこずができ、 圓該分野で知 られた装眮の䞭から遞んで適宜利甚しお甚いるこずができる。
物理的方法によっお现胞膜を損傷させた堎合、 现胞膜を損傷するばか りでなく现胞内の D N A等たで砎壊する堎合があり、 必芁に応じお、 凊 理条件を吟味する。 䟋えば、 超音波を䜜甚させる堎合は、 振動子を詊料 に浞したり、 振動子を取り付けた力ップ状容噚に詊料を入れるなどしお 凊理するこずが可胜である。 たた連続凊理の可胜な装眮を䜿甚するこず もでき、 圓該分野で知られた装眮の䞭から遞んで適宜利甚しお甚いるこ ずができる。 さらに现胞膜を損傷させるには、 浞透圧ショック法、 凍結 融解法などを甚いるこずも可胜である。 たた、 枬定倀から盎接现胞生存率を求めるこずができない堎合は、 必 芁に応じお、 凊理条件ごずに怜量線を新たに䜜成し、 枬定倀を補正する。 死现胞の枬定を行぀た埌の枬定詊料䞭に存圚する生现胞の现胞膜を損 傷させる凊理を行い、 现胞を死滅させるず、 栞酞蛍光染色剀がかっおの 生现胞内にも䟵入し、 栞酞ず結合し蛍光を発する。 埓っお、 枬定詊料か らはかっおの生现胞が発する蛍光の分だけ増匷された蛍光が発せられる こずになる。 この増匷された蛍光の匷床 F t' ) を蛍光枬定蚈により 枬定するこずにより、 枬定詊料䞭に存圚する党现胞数を定量するこずが できる。 そしお党现胞数から死现胞数を枛じるこずにより生现胞数を定 量するこずができる。 具䜓的には F t=F t' — Fb' および F 1 = F t -F d = (F t' — Fb ) 侀 (F d" —Fb) ずいう蚈算匏によ り、 党现胞数に盞圓する蛍光匷床 F t) および生现胞数に盞圓する蛍 光匷床 F 1) をそれぞれ求め、 これらの倀から党现胞数および生现胞 数即ち生存现胞数を怜量線などによ぀お定量するこずができる。 なお、 Fb' は现胞毒性を評䟡すべき察象、 培逊液、 栞酞染色剀および现胞膜 を損傷する薬剀に由来するバックグラりンドの蛍光匷床である。 现胞膜 を損傷するために、 界面掻性剀を䜜甚させた堎合には、 Fb = Fb' ず なる堎合が倚いので、 そういった堎合には F 1 =F t' — Fd' ずいう 蚈算匏により F〗を求めるこずができる。
同䞀条件の枬定詊料を䜕点か甚意し、 その䞭の半数の詊料に぀き前蚘 方法で前蚘死现胞数を枬定し、 䞀方残りの半数の詊料に栞酞蛍光染色剀 を䜜甚させる凊理および现胞膜を損傷させる凊理を斜し、 前蚘方法の堎 合ず同様に党现胞数を求める。 このようにしお求めた党现胞数から死现 胞数を枛じるこずにより生存现胞数を枬定するこずもできる。 この方法 では死现胞数の枬定工皋ず党现胞数の枬定工皋ずを䞊行するこずが可胜 なので効率のよい枬定ができる。 しかしながら、 倚くの詊料に぀き枬定 を行わなければならないこず、 枬定誀差が倧きくなるなどの問題点を生 ずる可胜性がある。 䞀方、 同䞀詊料に぀いお死现胞数の枬定を行った埌、 党现胞数の枬定を行う堎合、 先の枬定工皋ず埌の枬定工皋の時間間隔が 問題ずなる。 該時間間隔は枬定すべき现胞皮、 栞酞蛍光染色剀、 现胞膜 を損傷する薬剀などの各皮条件によっお異なるが、 短時間がよく、 望た しくは 2時間以内であり、 さらに望たしくは䞀時間以内である。 埓っお、 枬定すべき现胞皮、 栞酞蛍光染色剀、 现胞膜を損傷する薬剀などの各皮 条件を考慮しお、 いずれの方法が、 それらの条件にもっずも適した枬定 法であるかを遞択するのが望たしい。
现胞生存率は定量された党现胞数および生存现胞数の倀から算出でき る。 たた、 死现胞数が殆ど 0ず掚定される堎合、 F 1 tずなるので、 栞酞蛍光染色剀ず现胞膜を損傷する薬剀ずを䞀床に同時に䜜甚させお蛍 光匷床を枬定するず、 䞀回の蛍光枬定だけで党现胞数即ち生存现胞数が 定量できる。 なお、 医薬品、 蟲薬、 化粧品、 食品などでは、 生存现胞数 および现胞生存率の倀によっお、 それらのおよがす现胞毒性を評䟡する 堎合があり、 䟋えば生存现胞数から 5 0 %の现胞が死现胞ずなる薬剀等 の濃床 I C 5 Dを求める堎合があるが、 本発明の方法によれば、 それらの 现胞毒性を簡䟿か぀効率的に評䟡するこずができる。
本発明では、 生存现胞数を算出するこずなく、 盎接现胞生存率を枬定 するこずが可胜である。
死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀を䜜甚させる凊理を斜した枬定 詊料が発する蛍光の匷床ず、 該栞酞蛍光染色剀を䜜甚させる凊理および 现胞膜を損傷させる凊理を斜した枬定詊料が発する蛍光の匷床ずをそれ ぞれ枬定する第 1工皋 本工皋は各枬定前に斜される各々の凊理を含む 䞊びに䞡匷床を察比する第 2工皋より成る䞀連の工皋における各操䜜を 組み合わせおシステム化し、 生存现胞数たたは现胞の生存率を出力する 機胜を有する枬定噚により本発明を行うこずができる。 該枬定噚におい おは、 前蚘システム第 1工皋各枬定前に斜される各々の凊理を行うべく 予め死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀ず现月包膜を損傷する薬剀ずを セッ 卜したシステムを利甚しお本発明を行うのが望たしい。 このような 枬定噚には、 生存现胞数枬定甚キッ トおよび Zたたは现胞生存率枬定甚 キッ 卜を適甚できるので、 本発明の生存现胞数および Zたたは现胞生存 率の枬定を効率的に行うこずができる。 本発明の枬定を自動的に行う装 眮ずしおは、 䟋えば第 1図に瀺した装眮や第 2図に瀺した装眮が挙げら れる。 なお該装眮では、 生存现胞数枬定装眮ず衚珟しおいるが、 现胞生 存率枬定装眮、 あるいは生存现胞数および/たたは现胞生存率枬定装眮 ずいうものず理解しおもよい。 本明现曞および請求の範囲においおは該 装眮は広い意味で理解されるべきである。
第 1図においお、 同䞀詊料に぀いお死现胞数の枬定を行った埌、 å…š 现胞数の枬定を行う方法で本発明を行う堎合の生存现胞数枬定装眮の䞀 䟋が瀺しおある。 このように該装眮は、 その装眮内に組み蟌たれた分光 蛍光光床蚈からなるもので、 そこでは攪拌装眮付き枬定キュべッ ト 6 ) 、 励光偎分光噚  1 4 ) 、 蛍光分光噚  1 5 ) 、 光源  1 0 ) 、 レンズ ( 5、 9および 1 1 ) 、 偏光板 4および 1 2 ) および光電子倍増管 ( 1 3 ) によっお構成されおいる。 図䞭の 1は现胞膜を損傷する薬剀、 3は死现胞のみを染色する栞酞染色剀を瀺し、 それぞれの薬剀は装眮䞭 のタンクたたは脱着可胜な容噚内にセッ 卜されおいる。 これらタンクた たは脱着可胜な容噚内にセッ トされた薬剀は、 薬剀泚入噚 2 ) により 攪拌装眮付き枬定キュべッ ト 6 ) 䞭に泚入するこずができる。 装眮に は適宜制埡のためのバルブやポンプ 図瀺されおいない が備え付けら れおいる。 たた、 必芁に応じお掗浄ポンプ、 排液ポンプ、 切替えバルブ、 攪拌甚゚アヌポンプ、 ノズルなどが備え付けられおいるこずもできる。 たた、 図䞭の 7は、 アナログ信号をデゞタル信号に倉換する装眮を瀺し、 8は制埡システムである。 たた枬定キュべッ 卜 6 ) は、 必芁に応じお 連続的に移動しうるようにされ、 耇数のキュべッ 卜に぀いお自動的に枬 定が行えるようにしおあるこずができる。 枬定キュべッ ト 6 ) は、 恒 枩槜に保持されるようになっおいるこずもできる。 さらに枬定キュべッ ト 6 ) を固定し、 薬剀泚入噚および分光蛍光光床蚈が必芁に応じお連 続的に移動しうるようにしお、 自動的に枬定を行うこずができる。
第 2図においお、 同䞀条件の枬定詊料を䜕点か甚意し、 その䞭の半数 の詊料に぀き前蚘方法で前蚘死现胞数を枬定し、 䞀方残りの半数の詊料 に栞酞蛍光染色剀を䜜甚させる凊理および现胞膜を損傷させる凊理を斜 し、 前蚘方法の堎合ず同様に死现胞数を求める堎合の詊料に぀いお死现 胞数の枬定を行぀た埌、 党现胞数の枬定を行う方法で本発明を行う堎合 の生存现胞数枬定装眮の䞀䟋が瀺しおある。 このように該装眮は、 その 装眮内に組み蟌たれた分光蛍光光床蚈からなるもので、 そこではプレヌ ト攪拌噚付き 9 6りェルマむク口プレヌト 5 ) 、 励光偎分光噚 1 5 ) 、 蛍光分光噚 1 6 ) 、 光源 1 1 ) 、 レンズ 7、 1 0および 1 2 ) 、 偏光板 6および 1 3 ) および光電子倍増管 1 4 ) によっお構成され おいる。 図䞭の 1は现胞垌釈懞濁液であり、 装眮䞭のタンクたたは脱着 可胜な容噚内にセッ 卜されおいる。 均䞀濃床の懞濁液をタンクから各ゥ ゚ルぞ䟛絊するために、 タンクたたは脱着可胜な容噚内には攪拌噚が取 り付けられおいる。 たた、 2は现胞膜を損傷する薬剀、 4は死现胞のみ を染色する栞酞染色剀であり、 それぞれの薬剀は装眮䞭の倕ンクたたは 脱着可胜な容噚内にセッ 卜されおいる。 これらタンクたたは脱着可胜な 容噚内にセッ 卜された懞濁液たたは薬剀は、 分泚噚 3 ) によっおプレヌ ト攪拌噚付き 9 6りェルマむク口プレヌト 5 ) 䞭の各ゥ゚ルぞ分泚す るこずができる。 分泚噚 3 ) の先端郚分にはデむスポヌザブルチップ たたはノズルが装着されおおり、 必芁に応じおこれらは亀換たたは掗浄 が可胜である。 たた分泚噚 3) の先端郚分は分岐しおいおもよく、 耇 数の詊料ゥ゚ルに同時に薬剀を分泚するこずが可胜である。 たた、 図䞭 の 8は、 アナログ信号をデゞタル信号に倉換する装眮であり、 9は制埡 システムである。 該マむクロプレヌ卜 5) は、 必芁に応じお連続的に 移動しうるようにされ、 耇数のマむクロプレヌトに぀いお自動的に枬定 力 <行えるようにしおあるこずができる。 さらに該マむクロプレヌトを固 定し、 分泚噚 3) および分光蛍光光床蚈が必芁に応じお連続的に移動 しうるようにしお、 自動的に枬定を行うこずができる。 同䞀詊料に぀いお死现胞数の枬定を行぀た埌、 党现胞数の枬定を行う 方法で本発明を行う堎合には、 第 1図に瀺した装眮を甚 、お枬定を行う ず効率的である。 この装眮の䜿甚方法の䞀䟋を以䞋に瀺す。
〔1〕 培逊液䞭の现胞などの枬定詊料を、 攪拌噚がセッ 卜された枬定甚 キュベッ ト 6) にセッ トし、 攪拌する。 たた、 死现胞のみを染色する 栞酞染色剀 1 ) および现胞膜を損傷する薬剀 3) は予め装眮䞭のタ ンク内にセッ トしおある。
〔2〕 死现胞のみを染色する栞酞染色剀 1 ) を薬剀泚入噚 2) によ぀ お、 枬定詊料がセッ 卜された枬定甚キュべッ ト 6) に泚入し枬定詊料 を染色する。 その埌、 このものが発する蛍光の匷床を分光蛍光光床蚈に お枬定する。 枬定結果はアナログ信号からデゞタル信号に倉換され、 制 埡システム 8) に送られる。 なお、 死现胞のみを染色する栞酞染色剀
(1) の䜿甚量は、 蛍光匷床枬定の制埡システム 8) ず連動しお自動 的に制埡される。
〔3〕 〔2〕 の枬定終了埌の枬定キュべッ 卜 6) には、 现胞膜を損傷 する薬剀  1 ) が薬剀泚入噚 2) によっお泚入され、 枬定詊料䞭の党 おの现胞が死现胞ずされる。 その埌、 このものが発する蛍光の匷床を分 光蛍光光床蚈にお枬定する。 枬定結果はアナ口グ信号からデゞタル信号 に倉換され、 制埡システム 8 ) に送られ、 〔2〕 の枬定結果ず察比し お、 现胞生存率が枬定される。 たた必芁に応じお现胞数が既知であり䞔 ぀適圓な现胞数であるいく぀かの詊料に぀いお前蚘の枬定を行い、 本装 眮に怜量線を䞎え、 现胞数が䞍明な詊料に぀いお生存现胞数等を枬定す るこずができる。
同䞀条件の枬定詊料を䜕点か甚意し、 その䞭の半数の詊料に぀き前蚘 方法で前蚘死现胞数を枬定し、 䞀方残りの半数の詊料に栞酞蛍光染色剀 を䜜甚させる凊理および现胞膜を損傷させる凊理を斜し、 前蚘方法の堎 合ず同様に党现胞数を求める堎合には、 第 2図に瀺した装眮を甚いお枬 定を行うず効率的である。 この装眮の䜿甚方法の䞀䟋を以䞋に瀺す。 〔 1〕 同䞀条件の枬定詊料を甚意するため、 枬定詊料を现胞垌釈懞濁液 ( 1 ) ずしお分泚噚 3 ) により、 プレヌト攪拌噚付き 9 6りェルマィ クロプレヌト 5 ) の各々のゥ゚ルに分泚する。 分泚埌、 マむクロプレヌ トをプレヌト攪拌噚で攪拌する。 たた、 死现胞のみを染色する栞酞染色 剀 2 ) および现胞膜を損傷する薬剀 4 ) は予め装眮䞭のタンク内に セッ トしおめる。
〔2〕 现胞のみを染色する栞酞染色剀 2 ) を分泚噚によっお、 枬定詊 料がセッ 卜された 9 6りェルマむク口プレヌ卜 5 ) に分泚し枬定詊料 を染色する。 その埌、 各々のゥ゚ル䞭の詊料が発する蛍光の匷床を分光 蛍光光床蚈にお枬定する。 枬定結果はアナ口グ信号からデゞ倕ル信号に 倉換され、 制埡システム 9 ) に送られる。 なお、 死现胞のみを染色す る栞酞染色剀 4 ) の䜿甚量は、 蛍光匷床枬定の制埡システム 9 ) ず 連動しお自動的に制埡される。 なお、 分泚噚には薬剀ごずに別々の分泚 管が぀いおおり、 1回の操䜜で耇数のゥ゚ルに薬剀を分泚するこずがで きる。
〔3〕 现胞膜を損傷する薬剀 2 ) および死现胞のみを染色する栞酞染 色剀 4 ) をそれぞれ分泚噚によっお、 〔2〕 の枬定で䜿甚したものず 同䞀条件の枬定詊料がセッ 卜された 9 6りェルマむク口プレヌト 5 ) に分泚し、 枬定詊料䞭の现胞を党お死现胞ずするず同時に染色する。 そ の埌、 各々のゥ゚ル䞭の詊料が発する蛍光の匷床を分光蛍光光床蚈にお 枬定する。 枬定結果はアナログ信号からデゞタル信号に倉換され、 制埡 システム 9 ) に送られる。 なお、 现胞膜を損傷する薬剀 2 ) および 死现胞のみを染色する栞酞染色剀 4 ) の䜿甚量は、 蛍光匷床枬定の制 埡システム 9 ) ず連動しお自動的に制埡される。 枬定結果はアナログ 信号からデゞタル信号に倉換され、 制埡システム 9 ) に送られ、 〔2〕 の枬定結果ず察比しお、 现胞生存率が枬定される。 たた必芁に応じお现 胞数が既知であり䞔぀適圓な现胞数であるいく぀かの詊料に぀いお前蚘 の枬定を行い、 本装眮に怜量線を䞎え、 现胞数が䞍明な詊料に぀いお生 存现胞数等を枬定するこずができる。 このように本発明に埓えば、 a ) 死现胞のみを染色する栞酞蛍光染 色剀を枬定察象詊料に䟛絊する手段、 b ) 該栞酞蛍光染色剀を䜜甚さ せた枬定察象詊料が発する蛍光の匷床を枬定する手段、 c ) 现胞膜を 損傷させるこずを可胜にする手段、 d ) 死现胞のみを染色する栞酞蛍 光染色剀を䜜甚させ䞔぀现胞膜を損傷させる凊理を斜した枬定察象詊料 が発する蛍光の匷床を枬定する手段を、 少なくずも備えおおり䞔぀枬定 された各々の蛍光の匷床に぀き䞊蚘 b ) ず䞊蚘 d ) の䞡匷床を察比 する手段を備えおいるこずを特城ずする生存现胞数および/たたは现胞 生存率の枬定装眮が提䟛されるが、 こうした装眮のうちの各構成芁玠は、 自動化された免疫枬定装眮、 自動化された生化孊的枬定装眮などの分野 で知られたもののうちから遞んで適甚しお䜿甚するこずもできるし、 あ るいは必芁に応じお適宜改倉を加えお䜿甚するこずもできる。 奜たしく はプログラムされたコンピュヌタ䞀、 䟋えばマむクロコンピュヌタ䞀に よっお、 䞊蚘 a ) 死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀を枬定察象詊 料に䟛絊する手段、 b ) 該栞酞蛍光染色剀を䜜甚させた枬定察象詊料 が発する蛍光の匷床を枬定する手段、 c ) 现胞膜を損傷させるこずを 可胜にする手段、 d ) 死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀を䜜甚さ せ䞔぀现胞膜を損傷させる凊理を斜した枬定察象詊料が発する蛍光の匷 床を枬定する手段、 及び枬定された各々の蛍光の匷床に぀き䞊蚘 b ) ず䞊蚘 d ) の䞡匷床を察比する手段のいずれか䞀あるいはその内の耇 数、 もしくは党郚が制埡されおいるものが挙げられる。
なお、 本発明の生存现胞数および/たたは现胞生存率の枬定法䞊びに 生存现胞数および Zたたは现胞生存率枬定甚キッ 卜においおは、 前蚘し た皮々の死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀ず前蚘した皮々の现胞膜 を損傷する薬剀ずをそれぞれ盞互に組み合わせお䜿甚するこずができる 力'、 前蚘した皮々の死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀ず前蚘した皮々 の界面掻性剀ずを組み合わせお䜿甚するのが望たしい。
たた、 死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀ず前蚘した皮々の界面掻 性剀を必芁に応じお予め混合したものを䜿甚するこずもできる。
さらに、 前蚘第 1図たたは第 2図で瀺される生存现胞数枬定装眮 あ る 、は生存现胞数およびノたたは现胞生存率枬定装眮 に察応する前蚘 生存现胞数および Zたたは现胞生存率枬定甚キッ トの望たしい圢態の䞀぀ ずしお、 死现胞のみを染色する栞酞染色剀および现胞膜を損傷する薬剀 のそれぞれが、 該生存现胞数枬定装眮の脱着可胜な容噚に予め充塡され おいるものが挙げられる。 この堎合、 該染色剀、 該薬剀はそれぞれ別々 の該脱着可胜な容噚に充填されるが、 必芁に応じお同䞀の該脱着可胜な 容噚に充塡されおもよい。 実斜䟋
本発明をより詳しく述べるため、 以䞋に実斜䟋を蚘茉するが、 これら は本発明を限定するものではない。 本発明は実斜䟋に限定されるこず無 く様々な態様が含たれるこずは理解されるべきである。
実斜䟋 1 (现胞生存率の枬定
( 1 ) 方法、 結果
① MOLT— 4现胞 ヒ ト急性リンパ芜球性癜血病现胞倧阪倧孊埮生 物研究所より入手 を 37お、 5%二酞化炭玠、 飜和氎蒞気条件䞋、 シャヌレ䞊で培逊した。 培逊液は 1 0 %牛胎児血枅を含む RPM I液
(G I BCO瀟補、 No. 31800 - 071 以䞋培逊液ず蚘茉する を䜿甚した。
②现胞濃床が高密床にな぀た時適宜培逊液を亀換したシャ䞀レ䞊の詊料 (良い培逊条件䞋の詊料 ず、 培逊液の亀換なしに培逊を行ったシダヌ レ䞊の詊料 2点 悪い培逊条件䞋 1) および 2) の詊料 を现胞生 存率枬定甚詊料ずした。
③各詊料をシャヌレから採取し、 蛍光枬定甚キュべッ トに入れ、 回転攒 拌子で攪拌しながら以䞋の枬定を行った。 なお、 蛍光匷床の枬定は、 分 光蛍光光床蚈 日立 F— 4000型 にお、 励起波長 420 nm、 蛍光 攟射波長 460 nmの枬定条件䞋で行った。
④先ず、 PO— PRO— l I od i de (商品名 M o 1 e c u 1 a r P rob e s瀟補、 No. P— 358 1 ) を添加し 最終濃床 2. 5 u M) . F d' を枬定した。 匕き続き、 同じ枬定系にトリ トン X— 100
(商品名 P I ERCE CHEM I C A L瀟補 を添加し 最終濃床 0. 05%) 、 F t' を枬定し、 前述の蚈算匏より现胞生存率を求め結 果を衚 1に瀺した。
⑀比范のため、 各詊料に぀きトリパンブルヌ染色法による现胞生存率を 顕埮鏡䞋で枬定し、 結果を衚 1に瀺した。 トリパンブル䞀染色法による 枬定倀は、 実斜䟋 1の枬定倀ずほが同䞀の倀を瀺し、 本発明による方法 は现胞生存率の枬定に十分適甚できるこずが刀明した。 なお、 この枬定 は第 1図に瀺した装眮により自動ィヒしおも行うこずが可胜である。 è¡š 1. 现胞生存率
Figure imgf000025_0001
実斜䟋 2 (栞酞染色剀ず现胞ずの反応の定量性
( 1 ) 方法および結果
① MOLT— 4、 HL- 6 0 (ヒ ト前骚髄性癜血病现胞 、 U 9 3 7 ( ヒト組織球性リンパ腫现胞 、 HT— 1 0 8 0 (ヒ ト繊維肉腫现胞 を 枬定甚詊料ずしお䜿甚した。 MOLT— 4以倖は、 倧日本補薬より入手 した。
②枬定甚詊料の现胞濃床を培逊液で 2倍ず぀垌釈しお、 现胞垌釈懞濁液 を䜜補し、 9 6ゥ゚ルのマむクロプレヌ卜の各ゥヱルに 1 8 0〃 1ず぀ 分泚した。
③各ゥヱルに 1 0 w 1ず぀ PO— PRO— 1 I o d i d e (商品名 を添加し 最終濃床 2. 5 M) 、 曎に各ゥ゚ルに 1 0 1ず぀トリ ト ン X— 1 0 0 (商品名 を添加し 最終濃床 0. 0 5 %) , プレヌ卜攪 拌噚にお玄 3 0秒間攪拌埌、 蛍光枬定を行い、 結果を第 3図および第 4 図に瀺した。
第 3図は、 浮遊性现胞の现胞数ず蛍光匷床ずの間に比䟋関係があるこ ずを瀺しおいる。 HL— 6 0および U— 9 3 7は、 现胞数 1. 2 5 x 1 04 〜4 X 1 05 個の範囲内で现胞数ず蛍光匷床ずの間に比䟋関係が ある。 たた、 MOLT— 4は、 现胞数 1. 2 5 x l (T 〜2 x l 05 個 の範囲内で现胞数ず蛍光匷床ずの間に比䟋関係がある。
第 4図は、 接着性现胞の现胞数ず蛍光匷床ずの間に比䟋関係があるこ ずを瀺しおいる。 Η΀— 1 0 8 0は、 现胞数 3 0 0〜 1 X 1 05 個の範 囲内で现胞数ず蛍光匷床ずの間に比䟋関係がある。
なお、 蛍光匷床の枬定は励起波長 4 2 0 nm、 蛍光攟射波長 4 6 0 n m の枬定条件䞋で、 MTP— 3 2コロナマむクロプレヌトリヌダ䞀 コロ ナ電気瀟補 にお行った。 なお、 この枬定は第 2図に瀺した装眮により 自動化しおも行うこずが可胜である。
(2) 考察
第 3図および第 4図の結果から、 浮遊性现胞ず接着性现胞ずは異な぀ た枬定範囲で蛍光匷床を枬定する必芁があるものの、 现胞数ず蛍光匷床 ずの間には比䟋関係があるため、 本方法により正確に生存现胞数が枬定 できるこずが刀明した。 実斜䟋 3 (薬剀による现胞毒性の評䟡
(1 ) 方法および結果
①抗癌剀であるマむ トマむシン C (協和醱酵工業補 を培逊液にお垌釈 し、 9 6ゥヱルのマむクロプレヌ卜に各ゥヱル圓たり 5 0 1ず぀分泚 した。
②続いお、 MOLT— 4现胞を各ゥヱル圓たり 3 X 1 0 個/ 1 5 0〃 1 ず぀分泚した。
③各ゥ゚ルを 3 7°C、 5 %炭酞ガス、 飜和氎蒞気条件䞋で 2日間培逊し、 以䞋の枬定を行った。 尚、 蛍光枬定は MTP— 3 2蛍光枬定噚 コロナ 電気瀟補 を䜿甚した。
④各ゥヱルに 1 0〃 1ず぀ PO— PRO— 1 I o d i d e (商品名 を添加し 最終濃床 2. 5 ιΜ 、 プレヌト攪捜噚にお玄 3 0秒間攪拌 埌、 蛍光枬定を行い F d' を求めた。
⑀曎に各ゥヱルに 1 0 // 1ず぀トリ トン X— 1 0 0 (商品名 を添加し (最終濃床 0. 0 5 %) 、 プレヌ卜攪拌噚にお玄 3 0秒間攪拌埌、 蛍光 枬定を行い F f を求めた。
⑥前述した蚈算匏により、 生存现胞数ず现胞生存率を算出し、 結果を è¡š 2に瀺した。
⑊比范のため、 各詊料に぀き C a n c e r R e s e a c h、 4 7巻、
9 3 6〜9 4 2頁、 1 9 8 7幎を参考に MTTアツセィ法による生存现 胞数を枬定し、 結果を衚 2に瀺した。
たた、 本発明による方法ず MTTアツセィ法による生存现胞数の枬定 ステップの抂略を衚 3に瀺した。 なお、 本発明による前蚘の枬定は第 2 図に瀺した装眮により自動化しおも行うこずが可胜である。
è¡š 2. マむ トマむシン Cの现胞毒性評䟡 マむ トマむシン C添加濃床  /g/ml) I C 5 0
100 10 1 0.1 0 ( g/ml)
(本発明による方法
生存现胞数 察照 3 24 63 76 100 2.2 现胞生存率 ) 29 87 100 99 98
(MTT法
生存现胞数 察照 3 34 95 120 100 5.5
è¡š 3. 生存现胞数の枬定ステップの抂略 本発明による方法 MTT法
■PRO- 1(50 10 z 1/ ell 1分 ①遠心分離、 2000rpm 5分
②マむク Dブレ -トミキザ-攪拌 30秒 ②䞊枅捚おる。 2分
③蛍光枬定 420/460 30秒 ③ MTT(0.04%) 100 1 /we 11 1分
④ TritonX- 100(1%) 10 l/well 1分 ④ 37°C、 5ŸC02 培逊 3時間
⑀マむク Dブレ-トミキサ-攪拌 30秒 â‘€ PBS 100// 1/well 1分
⑥蛍光枬定 420/460 30秒 ⑥遠心、 2000rpm 5分
⑊䞊枅捚おる。 2分
(DDMSO(100Ÿ) 150^1/ ell 1分
⑚マむク Dブレ-トミキサ-攪拌 30秒
⑩吞光床枬定 550nm 30秒 合蚈所芁時間 4分 合蚈所芁時間 3時間 20分 (2) 考察
è¡š 2に瀺す劂く、 マむ トマむシン Cの现胞毒性は本発明による方法に おいお、 I C 50倀が 2. 2〃g/mlず算定された。 この倀は、 珟圚薬剀 の现胞毒性評䟡に最も汎甚されおいる MTT法による枬定倀 5. 5 Ug/m\) ず察比すれば、 / g/mlのオヌダヌに止たり、 圓該技術分野では 蚱容される数倀差であった。 以䞊のこずから、 本発明による方法は、 薬 剀による现胞毒性評䟡に十分適甚できるこずが刀明した。 曎に本発明は、 各薬剀濃床においおの现胞生存率が同時に算定可胜であり、 薬効を評䟡 する䞊で倚くの情報が埗られるずいう利点がある。 䞀方、 枬定に芁する 時間は衚 3の劂く、 本発明による方法では玄 5分で完了し、 既存の MT
T法 3時間 20分 ず比べ飛躍的な時間短瞮が可胜ずなった。 たた、 操䜜性の面においおも、 本発明による方法は、 遠心分離、 掗浄操䜜、 色 玠溶解が䞍芁であり䞀局簡䟿性が増しおいる。 実斜䟋 4 (超音波による现胞膜の損傷
( 1 ) 方法、 結果
① 5 X 1 06 個の MOLT— 4现胞を含む 40 m 1の培逊液を枬定詊料 ずしお蛍光枬定甚キュべッ 卜に分取し、 超音波砎砕噚 SON I CAT OR ULTRASON I C PROCESSOR, Mode l W - 225, Se r i a l No. G 6453 , 20 kHz HEAT S YSTEMS— ULTRASON I C I NC. ) で 1 0秒間凊理した
(砎砕匷床レベル 3) 。
②超音波凊理を斜したキュべッ 卜䞭の詊料を、 回転攪拌子で攪拌しなが ら以䞋の枬定を行った。 なお、 蛍光匷床の枬定は、 分光蛍光光床蚈 日立 F— 4000型 にお、 励起波長 420 n m、 蛍光攟射波長 460 n m の枬定条件䞋で行った。 ④先ず、 PO - PRO— 1 I od i d e (商 品名 Mo l e c u l a r P r o b e s瀟補、 No. P- 3 5 8 1 ) を添加し 最終濃床 2. 5 M) 、 蛍光匷床を枬定したずころ、 4 1 0 (バックグラりンドの蛍光匷床は 1 0) であった。 産業䞊の利甚可胜性
本発明によれば、 死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀ず现胞膜を損 傷する薬剀を䜿甚するこずにより、 倚怜䜓の生存现胞数および/たたは 现胞生存率を簡䟿か぀迅速な䞊正確に枬定するこずができ、 医薬、 蟲薬、 化粧品、 食品などの现胞毒性の評䟡などに利甚できる。 たたその现胞毒 性の評䟡も簡䟿か぀迅速に行うこずができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀を䜜甚させた枬定詊料が発 する蛍光の匷床ず、 該栞酞蛍光染色剀を䜜甚させる凊理および现胞膜を 損傷させる凊理を斜した枬定詊料が発する蛍光の匷床ずを各々枬定し、 䞡匷床を察比するこずを特城ずする生存现胞数および/たたは现胞生存 率の枬定方法。
2 . (i ) 枬定詊料に察し死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀を䜜甚 させ、 その結果発せられる蛍光の匷床を枬定した埌、 i i)次いで、 この 詊料の现胞膜を損傷させる凊理を斜し、 现胞を死滅させるこずにより増 匷された蛍光の匷床を枬定するこずを特城ずする請求項 1蚘茉の枬定方
3 . (i ) 枬定詊料に察し死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀を䜜甚 させ、 このものが発する蛍光の匷床を枬定し、 i i)別の枬定詊料に察し 該栞酞蛍光染色剀を䜜甚させる凊理および现胞膜を損傷させる凊理を斜 し、 このものが発する蛍光の匷床を枬定するこずを特城ずする請求項 1 蚘茉の枬定方法。
4 . 前蚘栞酞蛍光染色剀が、 陜ィォン性栞酞蛍光染色剀である請求項 1〜 3のいずれか䞀蚘茉の枬定方法。
5 . 前蚘栞酞蛍光染色剀がェチゞゥム ホモダむマ䞀たたは死现胞の みを染色するシァニン系栞酞蛍光染色剀である請求項 1〜 4のいずれか 䞀蚘茉の枬定方法。
6 . 现胞膜を損傷する薬剀を甚いお现胞膜を損傷させる請求項 1〜 5 のいずれか䞀蚘茉の枬定方法。
7 . 现胞膜を損傷する薬剀が界面掻性剀である請求項 6蚘茉の枬定方 法。
8. 现胞膜を損傷する薬剀がポリォキシェチレン型非ィォン性界面掻 性剀たたはアルコ䞀ル型非ィォン性界面掻性剀である請求項 6たたは 7 蚘茉の枬定方法
9. 死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀を䜜甚させた枬定詊料が発 する蛍光の匷床ず、 該栞酞蛍光染色剀を䜜甚させる凊理および现胞膜を 損傷させる凊理を斜した枬定詊料が発する蛍光の匷床ずを各々枬定し、 䞡匷床を察比するこずから成る䞀連の工皋䞭の各々の操䜜を自動化され た装眮にお行う請求項 1〜 8のいずれか䞀蚘茉の枬定方法。
1 0. 死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀を䜜甚させた枬定詊料が 発する蛍光の匷床ず、 該染色剀および现胞膜を損傷する薬剀を䜜甚させ た枬定詊料が発する蛍光の匷床ずを各々枬定し、 䞡匷床を察比するこず で生存现胞数およびノたたは现胞生存率の枬定を行うための栞酞蛍光染 色剀ず现胞膜を損傷する薬剀ずを含む生存现胞数および Zたたは现胞生 存率枬定甚キッ ト。
1 1. (a) 死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀を枬定察象詊料に 䟛絊する手段、 b) 該栞酞蛍光染色剀を䜜甚させた枬定察象詊料が発 する蛍光の匷床を枬定する手段、 c) 现胞膜を損傷させるこずを可胜 にする手段、 d) 死现胞のみを染色する栞酞蛍光染色剀を䜜甚させ䞔 ぀现胞膜を損傷させる凊理を斜した枬定察象詊料が発する蛍光の匷床を 枬定する手段を、 少なくずも備えおおり䞔぀枬定された各々の^:光の匷 床に぀き䞊蚘 b) ず䞊蚘 d) の䞡匷床を察比する手段を備えおいる こずを特城ずする生存现胞数および/たたは现胞生存率の枬定装眮。
1 2. (a) 现胞膜を損傷する薬剀を保持する装眮、 b) 死现胞の みを染色する栞酞蛍光染色剀を保持する装眮、 c) 䞊蚘装眮 a) あ るいは b) からの薬剀を枬定察象詊料に䟛絊する薬剀泚入噚、 d) 枬定察象詊料を保持できる容噚、 及び e ) 分光蛍光光床蚈を備えるこ ずを特城ずする請求項 1 1蚘茉の枬定装眮。
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