WO1997007133A1

WO1997007133A1 - Conglutinine de recombinaison et procede pour produire cette substance

Info

Publication number: WO1997007133A1
Application number: PCT/JP1995/002035
Authority: WO
Inventors: Nobutaka Wakamiya
Original assignee: Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd.
Priority date: 1995-08-17
Filing date: 1995-10-02
Publication date: 1997-02-27
Also published as: EP0846701A1; US20020168627A1; KR100395065B1; KR100385538B1; AU3618895A; EP0846701A4; KR19990037694A; KR19990037693A; CA2229739A1; US6979727B2; US6110708A; CA2229739C; US6365342B1; AU698112B2

Description

明組換えコングルチニンおよびその製造方法〔技術分野〕

本発明は、抗ゥィルス活性（中和活性）を有し、また、医薬品用途への応用が期待できる組換えコングルチニンとその製造方法に関する。〔背景技術〕

コングルチニンは、カルシウム要求型の哺乳類 C型レクチンフアミリーに属するゥシ血清中に存田在する動物レクチンであり、 Lee et al . , によりその全ァミノ酸配列（配列番号： 1 ) が解析されている〔Lee e i αし，ジャーナル · バイオロジカル ' ケミストリ一（J . B i o l . Chem. )、 266巻、 2715 - 2723頁、 1991年〕。

C型レクチンは、（1 ) システィンを豊富に含む N末端領域、 (2) コラーゲン様領域、（3) ネック領域、および（4) 糖鎮認識領域（CRD)の 4種の特徴的な領域を含む基本構造から構成されている〔Ma l hor t ra e t al.，ョ一口ピアン · ジャーナル · ォブ · ィムノロジー（ £ur. J. Immunol . , 22巻、 1437— 1445頁、 1992年〕。

C型レクチンには、コングルチニンの他にマンノース結合夕ンパク質（MBP) 、サーファクタントタンパク質 A (SP-A)およびサーファクタントタンパク質 D (SP-D)なども含まれ、これらのレクチンをコレクチンと総称している。

脊椎動物では、細胞を介する免疫応答および特異的抗体反応によるメカニズムが、病原菌の侵入に対する最大の生体防御システムと考えられている。しかしながら、最近になって、これらのレクチンによる非特異的な免疫応答が、母親の移行抗体や特異的防御システムが充分に発達していない小児に対し、種々の微生物の中和作用や排除に重要な役割を果たしていると考えられてきている〔Super αし，ランセット（Lancet)、 II、 1236— 1239頁、 1989年）。

宿主の生体防御におけるこれらレクチンの役割について、例えば、マンノース結合タンパク質の遺伝子上の変異によるマンノース結合タンパク質の血中濃度の低下によって、感染を受けやすくなるという研究結果が報告されている〔Sumiya et αί.，ランセッ h (Lancet),- 337巻、 1569 - 1570頁、 1991年〕。

本発明者は、以前に、コングルチニンおよびマンノース結合夕ンパク質が、 HIおよび H3夕ィプのィンフルェンザ Aゥィルスの感染ゃ赤血球凝集抑制活性を阻害することを見出した〔\Vakamiya et al. , グリココンジュゲイト ' ジャーナル（Glycocon jugate J. ) 、 8巻、 235頁、 1991年； Wakamiya ei aし，バイオケミカノレ · アンド . パ 'ィオフイジ力ノレ · リサーチ · コミュニケイシヨンズ（Biochera. Biophys. Res. Comm. )、 187巻、 1270— 1278頁、 1992年〕。

その後、さらに本発明者らのグループにより、コングルチニンをコードする cDNAクローンが取得され、コングルチニンと種々のサ一ファクタントタンパク質- D遺伝子との間の強い関連性も見出されている〔Suzuki ei al.，バイオケミカル ' アンド · ノくィォフイジ力ノレ · リサーチ · コミュニケイシヨンズ (Biochem. Biophys. Res. Co龍.）、 191巻、 335— 342頁、 1993年〕。

このように、コングルチニンは、生理活性医薬物質としての有用性が期待される物質でありながら、ゥシ血清中からはごくわずかしかの量しか採取できず、また、動物にその採取源を依存しているためにその安定供給が困難であるとの問題点もあった。そこで、コングルチニンの大量生産を意図すべく、遺伝子組換え手法を用いて、コングルチニンの大腸菌での発現が試みられた。すなわち、まず、コングルチニンの全 cDNAを、 PCR (ポリメラーゼ · チェイン · リアクション： Po l yme ra s e Cha i n Rea c t i on)法により増幅し、これを発現ベクター PRSET-A に導入し、 M13/T7ファージを用いて発現させた。そして、得られた組換え体を解析した。その結果、この場合、組換えコングルチニンの発現は確認できたものの、ウエスタン · ブロット法で組換え体の生成がようやく確認できる程度の発現量しか得られず、この方法は大量生産に不向きであ ·つた。

他の 2〜 3種類の発現べクタ一についても同様の方法によってその発現効果を試みたが、いずれも同程度もしくはそれ以下の発現が確認されるに止まり、効率的な発現系を確立するには至らなかった。これは、コラーゲン様領域のような構造を有するタンパク質が大腸菌に存在しないために、コングルチニンの発現が困難であると考えられる。また、真核生物細胞系で得られるコングルチニンは、その生産量が少なく、時に不適当な転写後修飾が起ししこ ¾ ¾> ¾ σ

このように、コングルチニンは医薬品としての有用性が期待される物質でありながら、自然界から採取できる量はごくわずかである上に、遺伝子組換え手法によっても人為的に大量に得ることはできなかった。

〔発明の開示〕

本発明は上述した従来技術が克服できなかった問題点に鑑みて発明されたものであり、（i ) コングルチニンのコラーゲン領域を構成する 171個のァミノ酸配列（配列番号： 2 ) の一部のァミノ酸配列、すなわち、 G l y- Xaa- Xaa (配列番号： 3、第 2位および第 3位の Xaa はタンパク質構成ァミノ酸である）の単位のァミノ酸配列を二つ含む 6個のアミノ酵からなる極めて短いコラ一ゲン領域、（i i )ネック領域、および（i i i ) 糖鎖認識領域を含む組換えコングルチニンが、前述発現系と同様の方法によって、当該組換ぇコングルチニンが大量に生産できるとの知見に基づいて本発明を確立するに至ったものである。

また、本発明の組換えコングルチニンは、極めて短いコラーゲン領域、ネック領域、および糖鎖認識領域から構成されているにもかかわらず、天然型コングルチニンと同様の糖結合特異性、力ルシゥム依存性のコングルチネーション活性、ひいてはィンフルェンザ Aウィルスに対する赤血球凝集阻害（H I )活性、中和活性、およびウィルス増殖（感染拡大）阻止活性を有するものである。

〔図面の簡単な説明〕

第 1図は、組換えコングルチニン D N Aによる形質転換のためのベクターを示す図であり；

第 2図は、組換え融合コングルチニンの SDS-PAGEの結果を示す図であり；

第 3図は、マンナンーセファロ一ス ' ァフィ二ティー ' クロマトグラフィ一による各画分の吸光度測定、 CBB 染色およびウェスタン · ブロッテイングの結果を示す図であり；

第 4図は、ビス（スルホスクシ二ミジル）スベラ一卜処理後の SDS-PAGEの結果を示す図であり；

第 5図（a) 、 (b) および（c) は、組換えコングルチニンのゲル濾過ク口マトグラフィ一の結果を示すグラフであり；

第 6図は、組換えコングルチニン、および 20mMの N —ァセチルダルコサミン含有組換えコングルチニンのマンナンに対する結合能を示すダラフであり；

第 7図は、組換えコングルチニン、および 10mMの EDTA含有組換ぇコングルチニンのマンナンにする結合能を示すグラフであり；第 8図は、マイクロタイタープレートアツセィシステムによる組換えコングルチ二ンおよび天然コングルチ二ンのコングルチネ —シヨン活性を示す図であり；

第 9図は、天然型コングルチニンおよび組換えコングルチニンの赤血球凝集抑制（HI)活性を示す図であり；および

第 10図（a) および（b) は、組換えコングルチニンのウィルス増殖（感染拡大）阻止活性を示す図である。〔発明を実施するための最良の形態〕

以下に本発明の組換えコングルチニンに関して、実施例に沿つて詳細に説明するが、これら実施例の開示によって、本発明が限定的に解釈されるべきでないことは勿論である。

すなわち、大腸菌での部分コングルチニンの発現（実施例 1 ) 、組換えコングルチニンの構造的検討（実施例 2 ) 、組換えコングルチニンと天然コングルチニンの糖結合活性の検討（実施例 3 ) 、組換えコングルチニンのコングルチネ一ション活性試験（実施例 4 ) 、赤血球凝集抑制（HI)試験（実施例 5 ) 、中和活性試験（実施例 6 ) 、およびウィルス増殖（感染拡大）阻止試験（実施例 7 ) について以下に説明する。実施例 1 ：大腸菌での部分コングルチニンの発現

(1) RT- PCR法による部分コングルチニン

D N Aフラグメントの調製

Suzukiらの方法〔バイオケミカル · アンド ' ノくィオフィジカルリサーチ · コミュニケィションズ (Biochera. Biophys. Res.

Co龍.）、 191巻、 335- 342頁、 1993年〕に従い、まず、ゥシコングルチニンの cDNA配列に基づいて、以下の配列を有する PCR 用プライマーをデザインし、そして合成した。これらプライマ一は、それぞれ制限酵素 Xhol および EcoRI の切断部位を含んでいる。

5' -GGCTCGAGGGGGAGAGTGGGCTTGCAGA-3' (配列番号： 4 ) 5' -GGGAATTCTCAAAACTCGCAGATCACAA-3' (配列番号： 5 )

1 X反応緩衝液、 1 / Mの各プライマ—、 200〃 Mの dNTPs 、 1単位のディープ ' ベント ' D N Aポリメラ一ゼ（ニュー . イングランド ' バイオラブス社製）および 10ngの cDNAを含む反応混合物 50 1 を試料として用いた。アト一社製 P C R反応装置（ザィモリアクター（登録商標））を用い、 92°Cで 1分間の変性、 60°C で 1分間のアニーリング、および 72°Cで 2分間の P C R反応を、 35サイクル繰り返して、 497bp の P C R生成物を得た。

(2) 部分コングルチニン生成物の形質転換体の調製

実施例 1 (1) にて得られた P C R生成物を、制限酵素 Xhol および EcoRI で消化した後、 DNA ライゲ一シヨンキット（宝酒造製）を用いて、細菌の発現べクタ一である pRSET- A (インビトロゲン社製）に挿入した。そして、ライゲ一シヨン混液を、 E. coli JM109 中に形質導入し、コングルチニン D N Aの 631bp から 1113 bpに対応する部分コングルチニン D N Aが挿入された形質転換体を得た（第 1 図参照）。

このフラグメン卜の配列は、完全なコングルチニンタンノク質の 191から 351番目のァミノ酸残基に相当しており、すなわち、短いコラーゲン領域、ネック領域、および糖認識領域のシーケンスを含んだ形態にて正確に増幅を行っていた。また、この操作での P C R反応のエラーは認められなかった。かくして、かような部分コングルチニンを高レベルで産生する、所望の安定な形質転換体が得られた。 (3) 組換えコングルチニン夕ンパク質の発現および精製

完全な挿入体（部分コングルチニン D N A) を含む形質転換した E. co の単一コロニーを SOB 培地（アンピシリン 50 g/1 含有）中で、 37°Cで一晩培養した。培養液 1.2ml を 200ml の SOB 培地（アンピシリン 50 / g/1 含有）に接種し、 0D _{600 nm} 値が約

0.3になるまで培養した。濃度が最終的に 1 mMになるようにィソプロピル- 1- チォ一 3 -D- ガラクシド（IPTG)を加え、さらに 1 時間培養した。この細胞を、 E. coli ラクト一スプロモーターにより活動する T7RNA ポリメラ一ゼ遺伝子を含む M13 ファージで、 M0I 5 pfu/細胞で感染させ、さらに 3時間培養した。培養液を、 3, 000 gで 15分間遠心分離して集菌した。

細菌のペレットを 20mlの緩衝液 A (塩酸グァニジン 6 M、リン酸ナトリウム 20mM、塩化ナトリウム 500mM、 pH7.8)中に懸濁した後、超音波処理（15秒、出力 70%、 10回処理）により溶菌した。 43, OOOgで 30分間遠心分離した後、上清に、ニッケル- NTAァガロ —ス（キアゲン社製）を加えて 15分間反応させた。反応物を力ラムに流し込み、このカラムを TBS/NT液（トリス -塩酸 20mM、塩ィ匕ナトリウム 140mM、 0.05%アジ化ナトリウム、 0.05%ツイ一ン 20 (登録商標）、 PH7.4)で洗浄し、さらに、 TBS/NTC 液（ 5 mMの塩化カルシウムを含む TBS/NT液）で十分に洗浄した。融合タンパク質を、 0.5Mのィミダゾールを含む TBS/NTC 液で溶出した。溶出液を、 1, 000 倍容量の TBS/NTC 液に対して 3回透析した。透析および遠心分離した後、上清を、マンナンーセファロ一スカラム（CNBr活性化セファロ一ス 4B (フアルマシァ社製）にマンナン（シグマ社製）を結合させたァフィ二ティ一カラム）に流した _c TBS/NTC 液で洗浄した後、結合したタンパク質を、 5 mMの N-ァセチルダルコサミンを含む TBS/NTC 液で溶出した。

組換えコングルチニンの精製度を、後述するようにして、 SDS- PAGEまたはウェスタン · ブロット法により解析した。

(4) SDS-PAGE分析

SDS- PAGEには、 4 ~ 20%の濃度勾配のポリアクリルアミドゲルを用いた。また、ポリペプチドを、 1 %のクマシ一ブルー（CBB) で染色した。その結果を、第 2図に示した。第 2図において、レーン Mは標準タンパク質、レーン 1 は全細胞溶解物、レーン 2 は塩酸グァニジン可溶画分、レーン 3 は塩酸グァニジン不溶画分、レーン 4 はニッケルーァガロースカラム溶出画分、そして、レーン 5 はマンナンーセファロ一スカラム溶出画分を示す。ァミノ酸配列から推定される組換え融合コングルチニンの分子量は 22. 5 kDa であるが、 SDS- PAGEによる解析では、 27kDa であった。また、ェンテロキナーゼによる組換えコングルチニンの消化は不完全であるが、消化した微量の組換えコングルチニンの N末端アミノ酸配列は、成熟したコングルチニンと一致した。

(5) マンナンーセファロ一ス ' ァフィ二ティ一 ' クロマト

グラフィ一、 SDS- PAGE、および各画分のゥヱスタン · ブ口ッティング検定

マンナン—セファロースカラム溶出画分を、 4〜20%の濃度勾配のポリアクリルアミドゲル、 1 %のクマシ一ブル一染色の条件下で、 SDS-PAGEにより分析した。タンパク質をニトロセル口一ス膜上に転写した後、これを 2, 000倍希釈のゥサギ抗コングルチニン血清と共にインキュベートし、続いて抗ゥサギ I gG結合ピオチン（べクター社製）と反応させ、最後に、アルカリホスファタ —ゼ結合ストレプトアビジン（BRL社製）と反応させた。 NBT/BC I P (BRL製）をアルカリホスファターゼの発色基質として用いた。そして、溶出パターンの結果を第 3図に示した。組換えコングルチニンは、天然コングルチニンと同様に、 5 mMの N-ァセチルダルコサミンで溶出した。このことは、この融合タンパク質が、マンナンに対し強い親和性を有していることを示すに他ならないまた、組換えコングルチニンの最終精製量は、 E. coli の培養液 1 £ あたり 2.8mgであつた。実施例 2 ：組換えコングルチニンの構造的検討

(1) 組換え融合コングルチニンの化学的架橋

天然コングルチニンは、 9 18量体のポリベプチドから構成されている（Kawasaki et al. , アーティブス · ォブ · <ィオケミストリー · アンド · くィォフィジックス（Arch. Biochem.

Biophys. ) 305巻、 533 - 540頁、 1993年）。最も大きな多量体の分子量は約 1 OOOkDaであり、典型的な多量体構造は 4個の 3量体構造物が十文字構造を形成したものである（Strang et al. ,バイオケミカル · ジャーナル（Biochera. J. )、 234巻、 381 - 389頁、 1986年）。そこで、組換えコングルチニンについても、その構造について調査した。

組換えコングルチニンタンパク質を、 10mMの塩化カルシゥムを含んだ PBS 緩衝液に 22.8 g/mlの濃度で溶かした。検体を、 0 mM 0.15mM 0.3raM 0.6mM 1.2mM 2.5mM および 5 mMのビス (スルホスクシ二ミジル）スべラートにより、 37°Cで 20分間処理した後、 4 20%濃度勾配の SDS- PAGEで分析した。その結果を. 第 4図に示した。第 4図の結果から、組換え融合コングルチニンは、分子量 27kDa の単量体および三量体から構成されていることが確認された。

(2) ゲル濾過クロマトグラフィ一

精製した組換えコングルチニンを、 lOraMの EDTAを含む pH 8.0の TBS 緩衝液を用い、流速 0.5 ml/分で、スロース 6 (ファルマシア社製）により処理した。そして、 40 / g の組換えコングルチニンをこのカラムに流した。分画を、 280nm で測定した, 組換えタンパク質の回収量を、クマシ一タンパク質アツセィ試薬 (ピアス社製）で検定した。

そして、以下に示す抗ゥシコングルチニンゥサギ血清を用いたサンドウイツチ ELISA 系を各分画に適用した。力ラムの検量には、フアルマシア社製標準分子量キット（チログロブリン（THY) · フェリチン（FER) 、力夕ラーゼ、アルドラーゼ（ALD) 、ァルブミン（BSA) 、オボアルブミン（OVA) 、キモトリプシノーゲン A (CHY) 、リボヌクレアーゼ A) を用いた。図 5 に示すように、 94kDa (31画分）、 39kDa (34画分）および 4.6kDa (39画分）の三つの主要なピークを確認した。しかしながら、定量分析によれば、 39画分にはタンパク質は認められなかった。また、 SDS- PAGE後の銀染色によっても、 4.6kDaの画分は染色されなかつた。この画分は、 200nm および 280nm の紫外部吸収から、ぺプチドでないことが確認された。

以上の結果から、コングルチニンは、コラーゲン領域が存在しなくても三量体を形成できることが明らかになつた。さらに、この結果は、コングルチニンと同様に、 C型レクチンファミリ一に属する組換えヒト一マンノース結合タンパク質やゥシー肺サ一ファクタントタンパク質 Dが、コラーゲン領域を欠いていても、ネック領域を介して 3量体を形成するという事実と一致している (Sheriff et αί·，ネィチヤ一 · ストラクチュラル - バイオロジー (Nature Struct. Biol. )、 1巻、 789— 794頁、 1994年； Hoppe et al. , FEBSレターズ（FEBS Letし）、 344巻、 191— 195頁、 1994年）。実施例 3 ：組換えコングルチニンおよび天然コングルチニンの糖結合活性 ^

(1) 糖結合特異活性

マイクロタイタープレートを、マンナン（10 g/ml) を含む 100 1 のコーティング緩衝液（炭酸ナ卜リゥム 15mM、炭酸水素ナトリウム 35mM、 0.05%アジ化ナトリウム、 pH9.6)中、 4 °Cで 1 晚表面処理した。各段階後にプレー卜を TBS/NTC 液（卜リス一塩酸 20ιπΜ、塩化ナトリウム 140mM 、 0.05%ァジ化ナトリウム、 0.05%ツイーン 20 (登録商標）、 pH 7.4、塩化カルシウム 5 mM) で 3回洗浄した。コーティングが完了した後、プレートを、 1 %のゥシ血清アルブミンを含む TBS/NTC 液で、室温で 1 時間処理し、固定した。

組換えコングルチ二ンまたは天然コングルチ二ンの単独希釈物 ( 0、 1、 10、 100 および 1， 000ng/ml) あるいは種々の糖類の希釈液との混合物を TBS/NTC 、または 20mMの N-ァセチル -D- ダルコサミン（A) もしくは lOmMの EDTAを含む TBS/NTC に添加した。

TBS/NTCBで 1, 000または 2, 000倍に希釈したゥサギ抗天然コングルチ二ン血清およびャギ抗ゥサギ I gG西洋ヮサビペルォキシダ —ゼ結合物（バイオ · ラッド社製）を添加し、 37°Cで 1 時間ィンキュペートした。最後に、 TMB 基質液（KPL社製 TMB マイクロウエル . ペルォキシダーゼ基質システム） 100 1 を各ゥエルに加えた。 1 Mのリン酸 100 1 を添加する前後に、 450 あるいは 655nm での吸光度を測定した（フロー ' ラブス社製タイタ一テツク · マルチスキャン · プラス MK IIプレート · リーダ一）。そして、糖抑制試験はこの ELISA 系を用いて、 Lu et αί.，の方法 (バイオケミカル ' ジャーナル（Biochem. J. )、 284巻、 795— 802頁、 1992年）に従って実施した。

マイクロ夕イタ一 ' プレートを、酵母マンナン（ 1 g/ゥエル）でコートした後、組換えコングルチニンと糖類を共に反応させた抑制曲線と比較して、結合を 50%抑制する糖濃度を I ₅₀として算出した。このようにして得られた結果を、表 1 に示した。表 1 の結果から明らかなように、組換えコングルチ二ンの糖結合活性は、天然コングルチニンとほぼ一致していた。また、第 6図および第 7図に示すように、組換えコングルチニンの結合活性は天然コングルチニンと同様に、カルシウムィォン依存性であった, さらに、この結合活性は、 N— ァセチルダルコサミンにより抑制された。 '一方、組換えコングルチニンに融合したヒスチジンのタグは、マンナンへの結合活性および結合特異性には影響しなカヽつた。

組換えコングルチ二ンおよび天然コングルチ二ンの糖特異性

I 5 0 (raM) ' 組換え〕ングルチ: -ン天然コングルチニン **

N-ァセチル -D-グルコサミン 0.65 1.4

フコース 41.5

L— フコース 37.8

D— フコース 55.3

D—マンノース 12.3 19.5

マルトース 25.8 49.0

N-ァセチル- D-マンノサミン 26.6

グルコース 39.5 41.5

ガラクトース 46.8 > 100

N-ァセチル- D-ガラクトサミン CO * * *

ラクト一ス > 100 ∞ ***

* ：マンナンとの結合を 50%抑制する糖濃度

"： Lu, J. et al.， Biochera. J. ,

vol. 284, pp.795-802 (1992)

*** ：抑制活性が認められない。実施例 4 ：組換えコングルチニンのコングルチ

ネーション活性試験

組換えコングルチニンおよび天然コングルチニンのコングルチネーション活性を、マイクロ夕イタ一プレー卜アツセィシステムにより測定した。 Wakamiyaらの方法〔バイオケミカル ' アンド • ノィオフィジカル · リサーチ · コミュニケイションズ（B i ochem. Biophys. Res. Comm. )、 187卷、 1270— 1278頁、 1992年〕に従い, iC3b結合ヒッジ赤血球細胞を作製した。 10倍希釈した新鮮ゥマ血清と等量の抗フォルスマン抗体の混合物で感作し、 37°Cで 10分間培養して、 1 %iC3b結合ヒッジ赤血球細胞を得た。

ベロナール緩衝液のみ、あるいは 30mMの N-ァセチルダルコサミン含有べロナ一ル緩衝液中に、 50 / 1 の 1 % iC3b結合ヒッジ赤血球細胞および組換えコングルチ二ン、もしくは天然コングルチ二ン 50 1 を加え、 37°Cで培養し、コングルチネーシヨン活性を測定した。凝集を生じる最も低濃度のタンパク質を含む濃度をコングルチネーシヨンの力価とし、その結果を第 8図に示した。

第 8図において、レーン Aは天然コングルチニン、 Bは組換えコングルチニン、 Cは 30mMの N-ァセチルグルコサミン含有組換えコングルチニンを示す。コングルチネ一シヨンの力価は、天然コングルチニンが 0.16 g/mlであるのに対して、組換えコングルチニンは 1.3 〜 2.5 g/mlであった。また、その活性は、 30mMの N -ァセチルダルコサミンで完全に阻害された。実施例 5 ：赤血球凝集抑制（HI)試験

(1) ウイノレス

インフルェンザ Aウイルスの A/Ibaraki/1/90 (H3N2:ィンフルェンザウィルス A香港型）、 A /Osaka/869/95 (H3N2)、

A /Beijing/352/89 (H3N2)、 A /Adachi/1/57 (H2N2) 、および A /Suita/1/89 (H1N1：インフルエンザウイルス Aソ連型）を、赤血球凝集抑制（HI)試験に用いた。ゥィルスは標準的な方法で、 CAM (卵しょうのう膜）で増殖させ、使用時まで— 70°Cで保存した, ウィルス増殖用培地としては、 3 %組織培養用ビタミン、 0.2% アルブミン、 0.1%グルコース、および 0.2ng/mlのァセチレートトリプシンを含有するィ一ダル MEM 培地を用いた。

(2) 組換えコングルチニンの赤血球凝集抑制（HI)活性

Okuno et al. , の方法（ジャーナル . ォブ · クリニカル · ミク口バイオロジー（J. Clin. Microbiol. ) 、 28巻、 1308— 1313頁、 1990年）に従い、 1 %ヒョコ赤血球を用い、 96穴マイクロ夕イタ一プレー卜により実施した。エーテル処理した卵由来のゥィルス抗原を用いた。 TBS/C( 5 mMの塩化カルシウム含有 TBS液）中の培養混合液には、 30mMの N-ァセチルダルコサミン又は 10mMの EDTA以外は何も加えない。室温で 1時間培養後、ウィルス介在性のヒョコ赤血球凝集に対する組換え部分コングルチニンの効果を調査した。その結果を、表 2に示す。また、 A/Ibaraki/ 1/90における結果を、第 9図に示す。第 9図において、レーン Aは天然コングルチニン、レーン B、 Cおよび Dは組換え部分コングルチニンで、レーン Bは添加物なし、レーン Cは 30mMの N-ァセチルダルコサミン添加グループ、レーン Dは 10mMの EDTA添加グループを示す。

2

組換えコングルチニンおよび天然コングルチニンの

赤血球凝集抑制（HI)活性の発現濃度（ g/ml) _

ウイノレス組換えコンク'ルチニン天然コングルチニン

A/Suita/1/89(H1N1) 0.15-0.3 0.08

A/Adachi/1/57(H2N2) > 5 > 5

A/Ibaraki/1/90(H3N2) 0.08-0.3 0.08

A/Bei jing/352/89(H3N2) 0.3 nt*

A/0saka/869/95(H3N2) 0.15 nt*

* 検査せず。赤血球凝集抑制（HI)活性は、用量依存性かつカルシゥム依存性であった。また、組換えコングルチニンの赤血球凝集抑制（HI) 活性は、天然コングルチニンゃラット肺サーファクタントタンパク質ー D、ヒ卜肺サーファクタントタンパク質一 Dの力価

(Hartshorn et al. , ジャーナル · ォブ · クリニカル · インべスティゲイシヨン（J. Clin. Invest. ), 94巻、 311— 319頁、 1994 年）とほぼ同様の力価を示した。実施例 6 ；中和活性試験

(1) イルス

ィンフルェンザ Aウイルスの A/Ibaraki/1/90 (H3N2:ィンフルェンザウィルス A香港型）、および A/Suita/1/89 (H1N1:インフルェンザウィルス Aソ連型）を用いた。

(2) 中和活性試験

Okuno et al.，の方法（ジャーナル · ォブ · クリニカル . ミク口バイオロジー（J. Clin. Microbiol. ) 、 28巻、 1308— 1313頁、 1990年）に従って、中和活性試験を行った。 96穴マイクロタイタープレート上で、組換えコングルチニンとインフルエンザウイルスを混合し、さらに 10%ゥシ胎児血清を含むイーグル MEM 培地で培養された Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)細胞を加えて数日間培養した後、各種コングルチニンの中和活性を測定した。ィンフルェンザウイルスの感染フォーカスを、抗ィンフルェンザウィルス · マウスモノクローナル抗体、抗マウス IgG ャギ血清、ペルォキシダーゼ抗ペルォキシダ一ゼ（PAP) 染色システムにより検出した。

以下の表 3 に、組換えコングルチニンおよび天然コングルチニンの中和活性の比較結果を示した。また、中和価は、 50%感染阻止濃度で示した。

組換えコングルチニンおよび天然コングルチニンの

ゥィルス中和価（ g/ml)

* 検査せず。実施例 7 ：ウィルス増殖（感染拡大）阻止試験

(1) ウイノレス

ィンフルェンザ Aウイルスの A/Ibaraki/1/90 (H3N2:ィンフルェンザウィルス A香港型）を用いた。

(2) ウィルス増殖（感染拡大）阻止試験

24穴マイクロタイタープレート上で、 10%ゥシ胎児血清を含むイーグル MEM 培地で培養された Madin- Darby Canine Kidney

(MDCK) 細胞に、インフルエンザウイルスを接種した。細胞を洗浄した後に、 0、 1 および 2 / g/mlの組換えコングルチニンを含有する 0. 5% トラガカントゴム（シグマ社製）を含むインフルェンザウィルス増殖培地を用いて、 3 日間培養した。実施例 6 (2) の中和活性試験と同様にて操作し、 PAP 染色法にてウィルス感染フォーカスの総面積を求めた。対照として、組換えコングルチニンを含有しないグループを用いた。その結果を、第 10図 (a) および（b) に示す。第 10図（a) および（b) の結果から明らかなように、組換えコングルチニンは、濃度依存的にインフルェンザウイルスの感染フォ一カスの面積を減少させ、ウイルス増殖阻止効果を呈した。なお、この効果は、 lOOmMの N-ァセチルダルコサミンにより阻害された（データ示さず）。

〔産業上の利用可能性〕

本発明によれば、従来、動物（ゥシ）から極めて低収率でしか取得できなかったコングルチニンと同等の生理活性を呈する組換ぇコングルチニンを、人為的に大量に生産する手段を実現ならしめたのである。また、本発明の組換えコングルチニンが、天然型コングルチニンと同質の生理活性を呈することから、医薬品としての有用性も期待できる。さらに、本発明の組換えコンダルチニンが、天然型コングルチニンの部分的構造体であり、天然型コングルチニンと比較してタンパク分子量が小さいことから、精製が容易になるなどの製造工程上の利点も併せ持つものである。

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S丄 ΐ 0LI 99ΐ

ID ojj ojj Aio SJV ¾1V ^10 o^d ^13 ui3 OJJ AJO ail ¾IV Aio seozo/s6df/i3d ee o/.6 OAV 配列の種類：タンパク質

配列：

Gly Leu Pro Gly His Asp Gly Gin Asp Gly Arg Glu Cys Pro His Gly

1 5 10 15

Glu Lys Gly Asp Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Arg Ala Gly Arg

20 25 30

Pro Gly Trp Val Gly Pro lie Gly Pro Lys Gly Asp Asn Gly Phe Val

35 40 45

Gly Glu Pro Gly Pro Lys Gly Asp Thr Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly

50 55 60

Met Pro Gly Pro Ala Gly Arg Glu Gly Pro Ser Gly Lys Gin Gly Ser 65 70 75 80

Met Gly Pro Pro Gly Thr Pro Gly Pro Lys Gly Glu Thr Gly Pro Lys

85 90 95

Gly Gly Val Gly Ala Pro Gly lie Gin Gly Phe Pro Gly Pro Ser Gly

100 105 110

Leu Lys Gly Glu Lys Gly Ala Pro Gly Glu Thr Gly Ala Pro Gly Arg

115 120 125

Ala Gly Val Thr Gly Pro Ser Gly Ala He Gly Pro Gin Gly Pro Ser

130 135 140

Gly Ala Arg Gly Pro Pro Gly Leu Lys Gly Asp Arg Gly Asp Pro Gly 145 150 155 160

Glu Thr Gly Ala Ser Gly Glu Ser Gly Leu Ala

165 170 配列番号：.3

配列の長さ： 3

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

配列の特徵

存在位置： 2

他の情報：第 2位のァミノ酸は、夕ンパク質構成ァミノ酸であれば、特に限定されない。

存在位置： 3

他の情報：第 3位のァミノ酸は、タンパク質構成ァミノ酸であれば、特に限定されない。

配列： ·

G l y Xaa Xaa

1 配列番号： 4

配列の長さ： 28

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列：

GGCTCGAGGG GGAGAGTGGG CTTGCAGA 28 配列番号： 5

配列の長さ： 28

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列：

GGGAATTCTC AAAACTCGCA GATCACAA 28

Claims

求の囲

1. 天然コングルチニンの一部を含む組換えコングルチニンであつて、当該組換えコングルチニンが、 Gly- Xaa-Xaa (配列番号 3 ) のァミノ酸配列を二つ含むコラーゲン領域、天然コンダルチニンのネック領域、および天然コングルチニンの糖鎖認識領域を含み、前記 Gly-Xaa- Xaaのアミノ酸配列の第 2位および第 3位のアミノ酸が夕ンパク質構成ァミノ酸である、ことを特徴青

とする組換えコングルチニン。

2. 天然コングルチニンの一部を含む組換えコングルチニンの製造方法であって、下記工程、すなわち；

(a) 天然コングルチニン D NAの 631bp から 1113bpに対応する c D N Aを挿入したベクターを構築し、

(b) 前記べクタ一を、大腸菌 JM109 に導入して形質転換体を得.

(c) 前記形質転換体を、適当な培養培地にて培養し、

(d) 培養した形質転換体をファージ感染させ、および

(e) ファージ感染させた形質転換体から組換えコングルチニンを回収する、

工程を含み、前記組換えコングルチニンが、 Gly- Xaa- Xaa (配列番号： 3 ) のアミノ酸配列を二つ含むコラーゲン領域、天然コングルチニンのネック領域、および天然コングルチニンの糖鎖認識領域を含み、前記 Gly- Xaa-Xaaのアミノ酸配列の第 2位および第 3位のアミノ酸がタンパク質構成ァミノ酸である、ことを特徴とする組換えコングルチニンの製造方法。