WO1996028966A1 - Transformant de mammifere autre que primate et dont un serotype de primate superieur s'exprime par transduction d'un gene etranger, procede de fabrication de ce transformant - Google Patents

Transformant de mammifere autre que primate et dont un serotype de primate superieur s'exprime par transduction d'un gene etranger, procede de fabrication de ce transformant Download PDF

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Definitions

  • Rui a non-primate mammal expressing a higher primate antigen by the introduction of a foreign gene W transgenic animal and its production method
  • the present invention relates to a method for producing a transgenic animal of non-primates with non-primates, including a cell transplanted into a higher primate, a transgenic non-primate beaked animal, and the like, and Converts sugar antigens of non-primate mammals into a form unique to higher primates,
  • the higher 38 primates refers to the narrow forests a belonging to human primates, orangutans, baboons, Japanese monkeys, etc. among the true suborders of primates.
  • the non-higher spirits refer to the broad-spectrum Ao and Omena among the genus Monkeys.
  • Non-primate baby s or non-s longid W milk animal is a non-primate mammal
  • a tissue includes ⁇ 3 ⁇ 4 such as »11 and liver n, as well as skin, blood vessels, and» vesicles.
  • an artificial material represented by an artificial »# or an artificial blood vessel is used as a substitute for such a tissue. This includes self-tissues, and even the same or different animal tissues.
  • braids extracted from such dairy animals are known to cause severe rejection in humans, and in particular, rejection that occurs within 24 hours of censorship. This is also called acute rejection.
  • hyperacute rejection occurs in the blood vessels of the donor tissue during the blood flow by anastomosing the blood vessels of the replenished donor tissue with the blood vessels of the recipient.
  • This hyperacute rejection in combination with humans or species with natural antibodies, is the classical pathway triggered by the anti-K antibody response of the two activated S pathways of the human complement system. Is thought to be the main chestnut reaction. This antigen-antibody reaction is thought to be due to the following causes.
  • the antigenicity on the vascular ia vesicle and blood cell system (hereinafter also referred to as vascular and blood cell system iffl ⁇ ) containing the vascular endothelium of non-primate beaked mammals such as septum is considered to be low. This is because it is different from that of the higher primates such as G.
  • non-spirit fi mammals such as stags
  • GS anti-JF anti-K
  • GS anti-JF anti-K
  • the precursor of the GS antigen is added to the donor tissue, and before that, the B substance K is also a so-called Bombay 1 [because it is an antigen, it is still a natural antibody still present in humans. Acute rejection will result.
  • the substance H according to the present invention acts on the substance K (N-acetyllactosamine) with GDP-fucose: galactoside 2- ⁇ -lefucosyltransferase (hereinafter simply referred to as FT).
  • the produced GS substance is UDP-galactose for N-acetyllactosamine, which is the same precursor as the above-mentioned H-type substance: yS-D-galactosyl-1,4-N-acetyl-D-darcosamino2 It is produced by the action of ⁇ -1.3-galactosyltransferase (hereinafter referred to as GT on cars).
  • the difference between the antigen S in the blood vessels and blood cells in humans and the like is due to the difference in the enzymes acting on the 18 substances, in other words, the enzyme GT in the blood and the like. It is based on the difference that the enzyme GT exists and the enzyme F does not exist in humans and the like.
  • the presence or absence of ABHS substances and enzymes in such various tissues is considered to be based on evolution.
  • the present invention provides a novel method for solving WS in conventional xenograft transplantation using non-conventional new methods in non-S long W mammals such as pusta which are widely grown and easily available as a family.
  • An object of the present invention is to alleviate hyperacute rejection at the time of transplantation and apply a non-primate W milk animal to transplantation into higher primates.
  • the present inventor has developed a high S-length S glycosyltransferase such as FT in non-JI long-range ft animals such as epta, in terms of gene engineering and developmental engineering.
  • the present invention can be said to be a more K-like solution S than the conventional method in that the binding itself between the natural anti-G antibody and the GS antigen in higher primates such as humans is suppressed.
  • Transgenic animals of the non-primate ⁇ such present invention is especially ft to have glycosyltransferase ⁇ foreign ⁇ Ko which Ru is expressed in higher primates ⁇
  • exogenous “genes” may be held in the form of “Het ⁇ ” or in the form of “Homo”, but are preferably held in the form of “Homo”.
  • the animal may in particular also have a foreign gene that expresses FT as a glycosyltransferase of higher primate S.
  • the animal of the present invention comprises a first exogenous tract gene that expresses a glycosyltransferase of a higher primate, and a second exogenous gene that suppresses the expression of «transferase in a non-primate primate.
  • a glycosyltransferase of the higher length such as FT
  • a glycosyltransferase of the non S length mammals can be GT beta
  • exogenous a genes may be stored in a heterogeneous form 1 or in a homozygous state us, but are preferably maintained in a homozygous form].
  • the non-primate beaked mammal of the present invention can be a primate.
  • the tissue obtained from the animal of the present invention can be widely used as a transplant material for the second and higher stages of ⁇ .
  • the method of the present invention expresses a higher S-long glycosyltransferase.
  • the first outpatient ⁇ A second exogenous gene that suppresses the expression of glycosyltransferase in a gene and / or non-S long babies Higher S-long antigen S that specially introduces genes into non-two-long babies This is a method for producing a transformed animal of a non-S long mammal that expresses S.
  • the present invention will be described in detail.
  • non-primate W dairy animals such as Puyu
  • G T instead of F T
  • K G-type substance
  • an exogenous gene fragment containing the FT Liao gene encoding the transferase FT which produces an HS substance from the substance E before it, is introduced into a recipient egg such as a pig, and this gene fragment is transferred to the chromosome.
  • a recipient egg such as a pig
  • this gene fragment is transferred to the chromosome.
  • the enzyme removes the pre- ⁇ 3 ⁇ 4, it can be expected that the ring between the endogenous enzyme GT and pre-eei will be inhibited and the production of GSttiK will be suppressed.
  • the FT gene can be stably transmitted to progeny after it has been incorporated into the chromosome.
  • the expression of the gene for glycosyltransferase GT which produces glycosyltransferase II present in non-S-long S ⁇ ⁇ animals such as Pusan, for example, GS «) substance from substance B before In order to inactivate E.
  • a foreign gene fragment containing the antisense DNA of the GT gene is equally introduced into the ovum. If this gene fragment is integrated on the chromosome of the body, If this antisense DNA is transcribed in ⁇ ⁇ , it is expected that the transcript I will be paired with the endogenous GT transcript and that the R of the GT gene will be suppressed.
  • the foreign gene Once the foreign gene has been integrated into the chromosome, it can be transformed into a foreign * gene to form a homozygous JB by crossing, and it expresses higher glycosyltransferases.
  • humans can be particularly targeted as the higher S longs.
  • non-lingual long babies an animal which is a target of xenotransplantation with respect to the 32 higher S long chains can be targeted. Furthermore, bush, sea lions, sheep, goats, etc., raised as domestic animals, are preferred. Since these livestock are easy to raise and can be supplied in a stable manner, they are suitable for replenishing tissue for transplantation. In addition, stags are fast because of the size of IR8, physiological and biochemical points of view, and their rapid development and high production. Higher S long-chain glycosyltransferases are glycosyltransferases that are found in higher S longs and that contribute to the generation of anti-surfaces that are not found in non-3 long mammalian vasculature and blood cells. Say.
  • ⁇ capable of increasing FT is specified by [EC 2.4.1. ⁇ ].
  • An exogenous gene that expresses a glycosyltransferase cord of a higher primate may have a promoter, a terminator, etc., in addition to the glucosyltransferase gene.
  • SV40 early inheritance Yuichi Minei Yuichi is one of the E rows suitable for addition. The level of gene expression greatly depends on the poly-A signal from which one of the transgenes is taken, but the early stage of SV40 ⁇ Boli A addition from the gene I have. This signal is placed before the evening minator.
  • foreign genes can be constructed for homologous recombination as well as non-reciprocal recombination in chromosomes.
  • the pig GT gene is targeted and the human FT gene is recombined, it is possible to suppress the expression of GT and to express FT at the same time.
  • a means in which the transferase is expressed at a high rate can be used for the gene fragment or chromosome that has been recombined.
  • high expression can be induced by steroid administration.
  • Glycosyltransferase with non-s-length m milk is found in vascular and blood cells of non-S-length W mammals and is a glycosyltransferase that contributes to the production of antigens that are not found in primates such as 5555. .
  • the mouse GT is specified in [EC 2.4.1.15 1].
  • Non-S long lactating exogenous genes that suppress the expression of glycosyltransferase in lactate S include: antisense DNA against the translocated transgenic hatchling gene and homologous genes in the glycosyltransferase. Introduced to replace the * «gene by replacing the ⁇ gene with another Liao gene, conducting another gene in the K * gene, or introducing a mutation. * Can use a gene.
  • the mouse GT3 ⁇ 4 gene has already been reported (Proc, atl. Acad. Sci. USA. 86 (1989). Pp. 8227-8231). The pig GT gene has also been reported (Xeno tr ansp lant atti on 1994; 1: PP.81-88).
  • the antisense DNA of GT when used as an exogenous gene, a fragment in which Ichiro or all of the cDNA of GT gene is incorporated in the antisense direction is formed as an exogenous gene.
  • non-S length In order to suppress the expression of glycosyltransferases, a conventionally known method can be used in addition to the introduction of a foreign gene. There are many methods for introducing an exogenous gene into a non-primate mammal, such as a method using a retrovirus or a method using a microinjector, and any method can be adopted. In order to obtain offspring, it is desirable to transform the cells. In this case, it is desirable that the transformation be performed on embryo blasts and ES vesicles of non-primate PH animals, or on the recipient ft.
  • non-primate mammals into which the foreign gene has been introduced can be expressed by the expression of glycosyltransferase of higher primates in various cells or simultaneously with the expression of glycosyltransferase of non-mammal mammals.
  • the suppression results in an animal whose ⁇ BSi of the braid and blood is approximated to a higher octagon. Therefore, it becomes possible to ⁇ -reduce hyperacute rejection when the tissues 9 of these animals are transplanted into higher primates, and the tissues of these animals can be transferred to primates such as S. It will be faster.
  • ⁇ -acute rejection is greatly reduced, especially when expressed in vascular endothelium.
  • one or more GT gene loci on the chromosome do not exist, and Since at least one FT will be present at the time of cultivation, it is possible to obtain an individual that has neither GT nor one on the chromosome by crossing, and instead has two FTs.
  • These valences provide the transplanted material for transplantation in humans and the like as a donor, regardless of the recipient's ABO blood type.
  • a transformed non-S long mammal W has a tissue and blood which can be transplanted into a higher primate such as a human, it is possible to provide a substitute for a tissue such as a human. It becomes.
  • a method for providing an animal or material that can mitigate super elephant rejection in the case of xenogeneic M transplantation by expressing the FT gene specific to higher S-mammals in non-S-mammal lambs is a novel novel method. As well as providing a more essential solution for the mitigation of neutrophil rejection in xenografts.
  • non-primate transgenic animal of the present invention a higher primate sugar tt anti-stable is produced in the tissue and blood, or a non-primate ⁇ milk sugar ⁇ antigen Since the production of non-primate Tate mammals is suppressed, hyperacute rejection ffi can be mitigated when the tissue of a non-primate Tateyama mammal is transplanted to a higher primate, which is a xenograft transplant. It is possible to provide a material which can be replaced by the same kind or the like.
  • transforming non-primate primates according to the present invention does not cause any damage or refuge to these animals, and the present invention provides a method for transforming non-primate primates. It has no effect on survival, life, etc. Further, the present invention does not affect humans or any other animals, including humans.
  • FIG. 1 is a diagram showing the synthesis of the ABHStt substance and the GS substance from the precursor (N-acetyl lactosamine).
  • 02 is an as plane for constructing and operating the plasmid pMAM / FT having the FT gene of Example 1.
  • H3 is a model B of the fragment for introducing an FT gene in Example 1.
  • H4 shows a process diagram for “building” pREP 885/0 in Example 2.
  • FIG. 6 is a process diagram for constructing the tank of PREP 9 / GT3-4 of the third embodiment.
  • E7 is pREP 9 / GT3-4ZFT / m S s p l / ⁇ r a I of Example 3.
  • FIG. 8 shows a process 0 for constructing and operating p GTZFT of the third embodiment.
  • B9 is a graph 0 showing the result of “Cr release attestation.
  • RNA was extracted, and CDNA corresponding to total RNA was synthesized using reverse transcriptase. Using this cDNA as a primer, PCR was performed using the previous primer.
  • MCS multiple cloning site
  • the LB medium Composition: Bacto-tryprone 10g (manufactured by DIFC0), Bacto-yeast extract 5g (manufactured by DIPC0), and aCl 10g made up to 1L with water, the same shall apply hereinafter).
  • Mini Brasmid W made.
  • the extracted brassmid DNA was digested with various restriction enzymes and then electrophoresed to determine the size and position of the inserted fragment.
  • the brassine that was assembled in the right direction was called pMAM / FT (see 02).
  • Escherichia coli JM109 / p MAM / FT strain was mass-cultured in LB, and then subjected to plasmid 39 in order to obtain a straight ft-shaped fragment for gene transfer. Further, the obtained plasmid was purified by CsC1 density gradient E centrifugation. The purified plasmid 1 Otfg is digested with Pvu I and BamHI, and this fragment is purified.
  • RNA was extracted, and cDNA corresponding to the total RNA was synthesized using reverse transcriptase. This cDNA was transformed into a »form, and PCR was performed using the above primers.
  • the cDNA fragment obtained by this PCR was subjected to electrophoresis on 1 ⁇ GALOS gel. As a result, a band having a length of about llOObp was obtained.
  • the base sequence was determined using an automatic S-sequence reader. I was Therefore, this cDNA was electrophoresed on an LMP gel, purified, treated with the R enzymes Nhel and Xhol, and separated by ft using the Wizard system.
  • the extracted brassmid DNA was digested with various restriction enzymes and electrophoresed to determine the size and orientation of the input fragments.
  • the plasmid correctly incorporated in the antisense direction was called PREP 8ZASZGT (see Fig. 4).
  • plasmids were produced after large-scale fertilization of the O. seedling JM109 / ⁇ REP8 / ASZGT strain in LB * ground. . Furthermore, the obtained plasmid was refined by Cs C l * gradient « « heart method Colour 1 After digestion of 10 g of the prepared plasmid with the control element Xba I and Pst I, this fragment was purified and separated by LMP gel «Swimming and Wizard system, and the fragment for ASZGT * gene transfer was obtained. And A schematic diagram of the construction of this fragment is shown in FIG.
  • a primer with a cleavage site of the ⁇ -strand Kpn I as the sense primer of exon 3 (pZA) and an antisense primer A primer (p / B) containing a restriction enzyme S8pI cleavage site at the start codon site of exon 4 ⁇ and a downstream cleavage site of the restriction enzyme HindII1 was synthesized.
  • pREP9 an expression vector, was digested with BamHI, a ⁇ -enzyme cable, and its cleavage was smoothed with T4 DNA polymerase, followed by ligation with T4 DNA ligase.
  • the expression vector in which the cleavage site of I was deleted was designated as pREP9 / mBamHI.
  • both ends were controlled by elimination, and the FT cDNA expression initiation site was located at the beginning of the GT.
  • This plasmid was designated as pREP 9ZGT 3-4 / FT / ASspI / ADraIlI.
  • all of these 15 elements, Kpn Hl nd ll Ss p I, Nhe I, Dra III, and Xho 1 were able to convert the fragments from exon 3 to exon 4 and the fragment at the top of the expression of FT cDNA. Do not cut or H is bitten.
  • An antisense primer (p / E) was synthesized in a form that contained the 3 ′ primate of p01 yA of pREP 9 and also contained a restriction site BamHI cleavage site. This was combined with the sense primer (p / A).
  • pREP 9 / GT 3-4 / FT / m S sp I / AD ra III use? The 13 ⁇ 4 method was carried out, and the obtained fragment was cut with control elements Kpn I and BamHI, divided by ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ , and the obtained fragment was called GT 3-4 / FT / p 01 yA.
  • the expression vector pREP9 was digested with the IRB elements KpnI and BamHI, and the above fragment GT3-4 / FT / p01yA was entered. This is pREP9 / GT3 1 4 / FT / po] y It was called A.
  • a portion from GT exon 4 to exon 6 or exon 7 is cut by restriction enzyme BamHI for both sense primer (p / F) and antisense primer (PZG), and extracted by PC method.
  • This fragment was cleaved with K ⁇ * BamH I, and the obtained fragment was subjected to plasmin FpREPSZGT 3—4 / FT / p01yA opened with the R enzyme BamH I (BamH I, GT 3-4, FT, po1yA and T4-17 have not been cut previously).
  • the resulting plasmid was called pREP 9 / GTZFT on 13 ⁇ 4 £ 9 (? C3-4 / C / 01 yA / GT4-7, or «! Car.
  • the Primer p / A and PCR was performed using pZG
  • the fragment obtained after ft production was used as a fragment for introduction into fertilized eggs, and was referred to as GT3-4ZFTZP01A / GT4-7, or simply pGTZFT.
  • the 3 ⁇ 4 gene fragment for introduction which was created as described above, has high homology to the * gene on the chromosome of GT and is expected to cause homologous recombination.
  • FT is used instead of GT
  • the expression (Fo) results in the expression of both GT and FT, but after one or two generations of crossing, it is possible to obtain a valence having only FT according to Mendel's law.
  • non-primate ⁇ is a transgenic animal that has no antigen specific to mammals but has an antigen specific to higher primates. Since the homology between T and Busu GT is high, homologous recombination based on mouse GT can be used quickly.
  • fragments for introduction should be IB-rinsed with TE «3 ⁇ 43 ⁇ 4 (0.25mM EDTA, 5mM Tris (pH7.4)), and IB rinsed to 1.0 each. ⁇ The product made from I was used.
  • the cells were cultured in an M2 medium for 2 to 3 hours in a CO. Incubator, and then the fertilized eggs were transplanted into oviducts of ⁇ -mature pigs in estrus. Transplantation was performed by Mffift under intrasystemic hepatitis »tubal transfer tt. Fallopian tube transfer. The animals were bred up until the postpartum period to give birth.
  • the fertilized eggs into which the gene has been injected are immediately transplanted.
  • cDNA was synthesized from total RNA using reverse transcriptase, and PCR was performed using the primers used for FT gene extraction described above.
  • One in 27 of the sugar fruits was determined to be »sex.
  • the introduced FT * gene was converted into mRNA and produced the FT enzyme protein K.
  • a similar search was performed for the control puta 15K into which no transgene was introduced, but all of them were found to be dangerous.
  • Blood was collected from the pups that were determined to be BB in Example 6; that is, it is considered to be producing S white matter of FT. After centrifugation, blood cells were separated »FI using S photoantibodies. Putta blood cells were stained by the TC method. On the other hand, blood was also collected from the control puta (Buyu, who did not use the gene guide) and stained similarly.
  • an anti-antibody was used as a primary antibody, and mouse 7 globulin (P (ab),) labeled with a fluorescent dye was used as a secondary antibody.
  • P (ab) mouse 7 globulin
  • the offspring of »sex in Example 6 were determined to be K sex.
  • the blanking evening IF derived colonies sleeves vesicular systems PK 15 were infected with pMAM FT of and S-option, C. in culture plus ll C r, constant during 18 culture, then healthy adult human blood (A. (Including four blood types B, 0, and AB). "

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Description

明》睿 外来遺伝子の導入により高等霊長類の抗原 を発現した非霊長晡乳類の形 W転换 動物及びその作出方法
〔技術分野〕
この発明は、 外来 ¾伝子等入により、 高等霊長類への移植に aした細胞、 组礅 あるいは its等を有する非霊長嘴乳類の形質転換動物及びその動物の作出方法に Mし、 特に、 非霊長哺乳類の糖 抗原を高等霊長類に特有な形に転換し、 その状
I»を *伝的に安定化させた形 K転換動物及びその作出方法に Mするものである。 なお、 本発明において、 高等 38長類とは、 霊長類の真 a亜目のうち、 ヒトゃチ ンパンジー、 オランウータン、 ヒヒ、 日本猿などが属する狭森 a類をいう。 また 、 非高等靈畏 »とは、 s畏類の真猿亜目のうちの広鼻 8鰲及び面猿亜目をいう。 また、 非霊長喃乳 sあるいは非 s長類 W乳動物とは、 霊長類でない嗨 類をいう
〔背景技術〕
今日、 ヒトの欠損あるいは不完全な組纖を、 代替物を移植することにより補充 する治療法が一般的な治麽法の一つとなりつつある。 ここで、 例えば組織とは、 »11や肝 n等の κ¾から、 皮膚、 血管、 »胞までも含まれ、 かかる組織の代^物 としては、 人工 »#や人工血管に代表される人工材料、 自己の組織、 さらには同 種あるいは異種の動物の組繊ゃ細胜までが含まれるものである。
しかし、 人工 の多くは、 いまのところ人工弁の他は移植された動物体内で u として充分に機能できるまでには至っておらず、 また、 人工血管においては 、 その内部に血栓が生じやすいという欠点かあり、 とりわけ、 人工血管の直径が 小さいほど、 その «向か大きいという Ηβがある。
ま 、 自己の組織を代 として用いるにあたっては、 袖充用として利用可能 な »官や量に «めて Rりがあるし、 かかる組繊を摘出し、 さらに補充するための 身体への負徂を考 *すれば、 実 BRには不可 ttなことも多い β
さらに、 ヒトに近い高等霊長類から摘出した組纖により補充するには、 その匐 育上の |¾题から需妄に応じ切れないとともに、 搶理的観点等からの weかあるた め、 困 Sなことが多い。 一方、 家畜は、 穽霊長喃乳頻であって、 その β育方法が確立しており、 容易に 入手でき、 伧理的 も少ないため、 代替物の提供体、 いわゆるドナーとして有 Sである。
しかしなから、 その反面、 かかる ¾乳動物から搞出した組繊は、 ヒトにおいて は激しい拒絶反応を引き起こすことが知られ、 特に 2 4時閲以内に発生する «し い拒絶反応 （以下、 超急性拒絶反応ともいう。 ） か問 Βとなっている。
かかる超急性拒 «反応は、 補充したドナー組織の血管をレシピエントの血管と を吻合して血液を «流する課に、 ドナーの組織内の血管內皮) to胞で生じる。 この超急性拒絶反応は、 ヒトか自然抗体を持つところの種との組み合わせにお いては、 2種類あるヒトの補体系の活性化 S路のうち、 抗 K抗体反応によって引 き起こされる古典径路が主栗な反応であると考えられている。 この抗原抗体反応 は、 以下の原因によるものと考えられている。
まず、 第 1に、 プタなどの非霊長類嘴乳動物の血管内皮 を含む脈管系 ia 胞及び血球系 (以下、 軍に脈管，血球系 iffl跑ともいう。 ） 上の抗原性がヒ ト 等の高等霊長 «のそれと異なるからである。
すなわち、 プタなど非霊 fi哺乳類は、 高等霊長類の持っていない彼ら特有の糖 錶抗 K (以下、 この抗 Kを GS抗 JFあるいは という。 ） をその脈管 ·血 球系 表面に持っているからである。
第 2に、 ヒトはプタなどの Gffl抗屎に対する自然抗体を生まれながらに持って いるからである。 したがって、 例えばブ夕をドナーとする場合に、 ブ夕の血管の中にヒトの血液 が流された雇、 ヒトの血 中の抗 G自然抗体とプ夕の血管内皮 Jtetett上の GS抗 愿との抗原抗体反応か引き起こされ、 その據果形成された抗原抗体 II合体が補体 系を活性化し、 プタの血管内皮 tt胞が破壞され、 »充したドナー組繊の破 ¾につ ながり、 超 性拒 «反応が生ずるのである。 かかる超急性拒絶反応を回避するために、 非 S長喵乳類の組纖を徜出してヒ ト に被充するほに、 罔時にヒト等のレシピエントにおける袖体の活性を制限する物 質を供給する技術も開示されているが （特表平 5— 5 0 3 0 7 4号公報） 、 そこ に示されている補体制限因子を持ったプ夕の細胞とヒトの血流との H係は、 基本 的にはいわゆる異 «I血と同じ構造を持った M係となるため、 超象性拒絶反応の ¾生を必ずしも防止できるものではなく、 又、 ヒトが動物の抗原に «5作されるた め、 いわゆる血清 を »発する可能性を併せもっという不都合がある。 また、 ドナーにおいて G型抗原の発現に係わる道伝子に対するアンチセンス D N Aを導人したり、 この遗伝子の発現を完全に抑制したりしてドナー組織におけ る G 抗原の発現を抑制しょうとする考えもある。 しかし、 この方法だけでは、 ドナー組織に、 GS抗原の前駆物質が されることになり、 この前 B物 Kは、 また、 いわゆるボンベイ 1 [抗原であるため、 依然としてヒトに存する自然抗体に よる超急性拒艳反応を生じることになる。
さらに、 同《移植の埸合は免疫抑制剤の利用は有効な場合が多いか、 異種移植 の場合は多剤併用してもなお、 今日、 超急性拒絶反応を免れていない。 ここで、 脈管 ·血球系 ttiSにおける A B HS¾Kの異種闉分布をみると、 A B H型物質が発現されるのは、 本発明にいう、 高等 S畏麵、 すなわち、 真 »亜目の うち、 ヒ トゃチンパンジー、 オランウータン、 ヒヒ、 日本猿などが sする狭 *a 類だけであって、 他の霊長頻ゃ非霊長鎖 ffl乳動物では消化管粘膜ゃ咦覚受容体 la 胞などでは発現されていることがあるが、 IR管 ·血球系細胞には発現されていな い 0 一方、 非 S長嘧乳 Sが脈管，血球系細胞に有する GS物質は、 A B H型物質の W駆 tt» (N—ァセチルラクトサミン） に対し、 ガラクトースが a 1— 3構造で 轄仓した物質である。 A B HSei と GS物質の合成経路について 1に示す。
すなわち、 本発明にいう H 物質は前 K物質 （N—ァセチルラクトサミン） に 対して、 G D P - いフコース： ガラクトシド 2 - β - レフコシルトラン スフエラーゼ （以下、 単に F Tという。 ） か作用して生成され、 G S物質は、 前 述の H型物質と同じ前駆物 «である N—ァセチルラク トサミンに対して U D Pガ ラクトース： yS -D- ガラク トシル -1, 4- N- ァセチル -D- ダルコサミ二ド α -1 .3- ガラクトシルトランスフェラーゼ （以下、 車に G Tという。 ） が作用して生 成されるのである。 このように， ヒト等とプ夕等における脈管，血球系細胞にお ける抗原 Sの差與は、 前 18物 Κに作用する酵素の差異、 換言すれば、 プ夕等に酵 素 G Tが存在し、 反対にヒト等に酵素 G Tが存在せず酵素 F丁が存在するという 差異に基づくものである。 このような各種組織における A B HS物質の存否、 酵 素の存否は、 進化に基づくものであると考えられている。 しかしながら、 かかる高等霊長類と非霊長 喃乳動物におけるそれぞれ特有の 糖 抗原の分布と、 超急性拒絶反応の主たる場である血管內皮 19胞等におけるこ れら «lfl抗原の差異を種極的に利用して、 超急性拒絶反 を tt和することについ ては、 従来全く着目されていなかった。
〔発明の開示〕
そこで、 本発明は、 従来の異種 ΓΒ移植における WSを解决するべく、 家 ¾とし て広く鐲育され入手の容易なプタ等の非 S長類 W乳動物において、 従来にない新 しい手法により、 移植時の超急性拒絶反応を緩和して、 非霊長類 W乳動物の組繳 を高等霊 頻への移植に適用することを目的とするものである。 上 目的を達成するため、 本発明者は、 プタ等の非 JI長類晡 ft動物において、 遗伝子工学的 ·発生工学的に、 例えば F T等の高等 S長 Sの糖転移酵素を ¾現さ せて、 Λ等霊長類の抗 Kttl を »S的に生成せしめ、 あるいは岡時に、 例えば G T等の非 S長) 乳動物の糖転移酵素の発現を抑制して、 脈管 ·血球系細胜を抗 K的に高等 S長 に転換することにより、 高等霊長類に非霊長類喃乳動物の組 繊を移植した隨の β急性拒絶反応を »和できることを見い出し、 以下の発明を完 成したのである。 なお、 異種 移植の超急性拒絶反応を援和させるために、 ドナーにおいてヒト 等の高等霊長類とおなじ HSttl を発現させることは従来考えられていない。 す なわち、 従来は、 自然抗体と抗原との結合後における楝体活性化経路の抑制等に 着目されていた。 また、 本発明は、 ヒト等の高等霊長類における抗 G自然抗体と GS抗原との結合自体を抑制する点で、 従来の手法に対し、 より本 K的な解決手 Sといえる。 本発明の非霊長啼乳類の形質転換動物は、 高等霊長類の糖転移醉素を発現させ る外来遗伝子を有することを特 ftとする β
これらの外来 «伝子は、 へテ αの状 »で保持されていても、 ホモの状 »で保持 されていてもかまわないが、 ホモの状 »で保持されることが好ましい。
この動物は、 特に、 前 高等霊長 Sの糖転移酵素として F Tを発現させる外来 伝子を有することもできる。 また、 本発明の動物は、 高等霊長類の糖転移酵素を発現させる第 1の外来道伝 子と、 非靈長喃乳類の «転移酵素の発現を抑制する第 2外来《伝子、 とを有する 特に、 前記高等 長類の糖転移酵素を F Tとし、 非 S長哺乳類の糖転移酵素を G Tとすることができる β
これらの外来 a伝子は、 ヘテロの状 1»で保待されていても、 ホモの状 usで保持 されていてもかまわないが、 ホモの状 ]»で保持されることが好ましい。 特に、 本発明の非霊長類嘴乳動物は、 プ夕とすることができる。
また、 本発明の動物から得られた組織は、 糫広く高等 2£期への移植材料に遼 用することができる β さらに、 本発明の方法は、 高等 S長類の糖転移酵素を発現させる第 1の外来遗 伝子及び 又は非 S長喃乳類の糖転移酵素の発現を抑制する第 2の外来 «伝子を 非 2長喃¾類に導入することを特 ftとする高等 S長類担の抗原 Sを発現した非 S 長哺乳類の形質転換動物の作出方法である。 以下、 本発明を詳細に説明する。
プ夕等の非霊長類哺乳動物の脈管 ·血球系細胞において、 ヒトなど高等霊長類 だけが持ち、 プタなどの非霊長類嘴乳勖物が持たない ¾伝子あるいはその発現物 であるタンパク Kを発現させるには、 形質転換動物を作成することか必要にな る》 ヒトとヒトとの移 «における基本原則の一つとして血 ¾aを合わせることが広 く Bめられているが、 いわゆる血 型すなわち A B 0式の分類の基本 ¾Kは H型 物 Κであって、 それは脈管 ·血球系 »跑においては、 前 ¾のように ItHBtt ( N 一ァセチルラクトサミン） »転移醉素 F Tが作用して形成される。
しかし、 プ夕など非霊長類 W乳動物は、 F Tでなく G Tを持ち、 それによりヒ トとは異なった物 K ( G型物質〉 を形成している。
したがって、 例えば、 HS物質をその前 E物質から生成する *転移酵素 F Tを コードする F T遼伝子を含む外来 ¾伝子断片をブタ等の受 «卵に導入し、 この遗 伝子断片が染色体上に組み込まれた場合、 各細胞でこの F丁《伝子が転写翻訳さ れ、 酵素 F Tが康生されて HS物質を発現させることが期待できる。
さらに、 HS¾貧の *合には、 酵 が前 β¾ を消 »すれば、 それだけ、 内在する酵素 G Tと前 eei との輪合が阻害され、 GSttiKの生成が抑制される ことが期待できる。 なお、 F T«伝子はプタ染色体にくみこまれた後、 安定して 子孫に伝達されることが可能である。 さらに、 本発明では、 プ夕等の非 S長 S喵玑動物に內在する糖転移 II素、 例え ば、 GS«)質をその前 B物質から生成する糖転移酵素 G Tの遗伝子の発現を不活 性化する目的で、 G T¾伝子のアンチセンス D N Aを含む外来 ¾伝子断片をブ夕 受«卵に等入する。 この ¾伝子断片か、 偭体の染色体上に組み込まれた場合、 各 细跑でこのアンチセンス D N Aか転写されれば、 その転写 «Iは内在性の G T転写 産物と対合して、 G T遺伝子の Rが抑制されることが期待される。
この結果、 価体レベルでは、 »¾5F Tが積極的に発現されるとともに、 酵素 G Tの発現が抑制されて、 H型物質が生成される一方、 一履 GS物質の生成が低滅 されたブ夕等を得ることができる。 なお、 アンチセンス D N A等の外来遺伝子断 片は、 染色体に組み込まれた後、 安定して子孫に伝達されることが可能である。
なお、 一旦、 染色体に外来 ¾伝子が組みこまれた後、 交 により外来 *伝子に Mしてホモの伏 JBにすることが可能であり、 高等 類の糖転移 »素を発現させ る外来遠伝子に Hしてホモの状 fflの系と、 非霊長晴乳類の糖転移 »素に Mしてホ モの状 »の系とを交配させることにより、 非霊長哺孔類の酵素を発現するかわり に、 高等 S長類の糖転移酵素を発現して、 高等 S長類の抗原型を呈した非霊長類 喃 ¾動物の系を得ることができる。 本発明では、 高等 S長類として、 特にヒトを対象することができる。 また、 本 発明では、 非靈長喃乳顯として、 特に、 前 32高等 S長鎖に対して異種間移植の対 象となる動物を対象とすることかできる。 さらに、 家畜として鲷育されるブ夕、 ゥシ、 ヒッジ、 ャギ等か好 ¾である。 これらの家畜は、 鲷育が容易で、 安定した 供給が可能なため、 移植用組織の補充に ¾する。 さらに、 プタが、 IR8の大きさ や、 生理学的，生化学的な観点、 発育か早く多産である点から好速である。 高等 S長鎖の糖転移酵素とは、 高等 S長類において見いだされ、 非 3長嗬乳類 の脈管 ·血球系麴胞において見いだされない抗面の生成に M与する糖転移 S素を いう。 I 体例としては、 F Tを举げることができる β 特に、 ヒト F Tは 〔E C 2 . 4 . 1 . β β〕 で特定される。 高等霊長蒙の糖転移酵索を発現させる外来遠伝子は、 眩糖転移酵素の «伝子の 他、 プロモータ、 ターミネータ一等を有することかできる。 S V 4 0の初期遺伝 に據く夕一ミネー夕一は付加に適した E列の一つである 。 一投的にどの遠伝子からとったポリ Aシグナルかによつて遺伝子の発現のレべ ルはかなり左右されるが、 SV40初期 ¾伝子から取ったボリ A付加 «伝子が便 れている。 このシグナルは夕ーミネーターの前に置かれる。 例えば、 FTを発現させることのできる外来 ¾伝子を形成するには、 少なくと も FTの *伝子配列を知る必要がある。 ヒトの FTについては、 既に «吿されて いる （P r 0 c. Na t l . Ac a d. S c i . USA, 87(1990), pp6674-6678
) c
また、 外来遗伝子は、 染色体における非相問的組み換えのみならず、 相同的組 み換えを目的として構築することもできる。 この場合、 例えば、 ブタの GT«伝 子をターゲッ トに、 ヒトの FT遗伝子を組み換えるようにすれば、 GTの発現の 抑制と、 FTの発現が同時に可能である，
なお、 遠伝子断片か染色体に組み換えられた »に、 高率に前記»転移酵素か発 現される手段を用いることができる。 例えば pMAMをベクターブラスミ ドとし て外来遣伝子断片を W»した *合には、 ステロイドの投与により高 ¾現が誘導さ れうる。 非] s長 m乳額の糖転移酵素とは、 非 S長 W乳類の脈管 ·血球系細胞において見 いだされ Λ等霊長類において見いだされない抗原の生成に 55与する糖転移酵素を いう。 具体例としては、 プタゃマウスの GTを掌げることかできる。 特に、 マウ ス GTは、 [EC 2. 4. 1. 1 5 1〕 で特定される。 非 S長嗜乳 Sの糖転移酵素の発現を抑制する外来遗伝子には、 »糖耘移孵素の 遣伝子に対するアンチセンス DN Aや、 該糖転移酵素の ¾伝子において相同的に 組み.換えされて、 陔遺伝子を他の遼伝子で置換したり、 K*伝子に他の遺伝子を 揮人したり、 変異を導入することにより、 »«伝子を破 *する外来 *伝子を用い ることかできる。
この外来 ¾伝子を形成するには、 少なくとも非霊長喷乳類の糖転移 β素の ¾伝 子配列を知る必要がある。 マウス GT¾伝子は、 既に報告されている （Pr o c , a t l. Acad. Sc i. USA. 86(1989). pp.8227-8231)· また、 ブタ GT遺伝子も既に報告されている （Xeno t r ansp l ant a t i on 1 9 9 4 ； 1 ： PP.81-88) 。
例えば、 GTのアンチセンス DNAを外来遠伝子とする場合には、 GT遺伝子 の c DN Aの一郎又は全部をァンチセンス方向に組み込んだ断片を外来遗伝子と して形成する。
また、 相同的組み換えによる *合には、 例えば GT遗伝子との相同領域を可及 的多く有するように形成するのが好ましい。
なお、 非 S長！ 類の糖転移酵素の発現を抑制するには、 外来遺伝子の導入以 外に従来公知の方法によることもできる。 非霊長類哺乳動物への外来 ¾伝子の導入は、 レトロウィルスを用いる方法やマ イク口インジ クシ 3ンによる方法等多数あるか、 どの方法も採用することがで きる。 子孫を得るという点からは、 生 胞を形 転換することが望ましい。 こ の場合の形質転挨は、 非霊長類 PH 動物の胚敏胞や ES 胞あるいは、 受 ft卵に 対して行うのが望ましい。 このように、 外来遺伝子が導入された非霊長類哺乳動物は、 種々の《Β胞におけ る高等霊長 の糖転移酵素の発現により、 あるいは同時に非霣是呻乳類の糖転移 酵素の発現の抑制により、 組繊 ·血液の扰 BSiが高等 8長類に近似された動物と なる。 したがって、 これらの動物の組織 9を高等霊長類へ移植した際の超急性拒 絶反応を β和することができるようになり、 これらの動物の組織等は、 S等霊長 類への移楦に速したものとなる。 また、 特に、 血管内皮 »胞で発現された場合に は、 β急性拒絶反応が大きく緩和される。 さらに、 赤血球 «3胞における高等霊長 類 Q糖転移酵素の発現により、 血液の抗 か高等 S長類に近似された動物とな り、 これらの動物の血液は高等霊長 Sの代 血液に itしたものとなる。 また、 高等霊長類の «転移酵素 FTが導入された場合には、 非霊長 fL類の 管 ·血球系細跑では、 HS物質が発現されると同時に 物質が低減されること になり、 組織 '血液の抗 1K が高等霊長 Sに近似された動物となる。 加えて、 同 時に G Tの発現を抑制する外来遼伝子も導入された場合には、 より一暦 GSIftlK か低城され、 組維，血液の抗原 が極めて高等霊長類に近似された動物となり、 これらの組繊 ·血液は、 高等霊長類への移植 ·代替物により適したものとなる。 なお、 特に、 F Tが血管内皮細胞表面に発現されれば、 異種 あるいは組 繊移植における超急性拒絶反応が大きく緩和される。 また、 赤血球において発現 されれば、 代糁血液により遼したものとなる。 また、 相面組み換えにより、 G Tのかわりに F Tが発現するように転換された 形 K転換動物においては、 染色体上の 1本以上の G T遣伝子座のうち、 一本が存 在せず、 岡時に F Tが少なく とも 1本存在するようになるため、 交配により染色 体上に G Tか 1本も存在せず、 その代わりに F Tが 2本存在する個体を得ること ができる。 こうした価体はドナーとして、 レシピエントの A B O式の血液型のい かんをとわずに、 ヒト等の移植に した移植材料を提供する。 このように、 かかる形質転換された非 S長類 W乳動物は、 ヒト等の离等霊長類 に移植の可能な組繊 ·血 を有するため、 ヒト等の組織等の代 S物の提供 ®とな る。 また、 これらの動 «Iか安定して鲷育されることにより、 必要時に、 必 Sな組 織等を提供可能となり、 移植組織等の貯蔵体となる。 また、 非 S長類喃轧動物における高等 S長類特有の F T遺伝子の発現により、 異種 M移植の場合に超象性拒絶反応を緩和できる動物や材料を提供する方法は、 従来にない新規なものであるとともに、 異種 n移植における超 性拒絶反応の緩 和のために、 より本質的な解决をもたらすものである。 本発明の非霊長 の形質転摸動物によれば、 その組織 ·血液において、 高 等靈長麵の糖 tt抗厩が生成されるため、 あるいは面時に非霊長 Φ乳類の糖鑲抗原 の生成が抑制されるため、 非霊長蓼哺乳動物の組織を異種面移植となる高等霊長 類に移植した場合に超急性拒絶反 ffiを緩和することができ、 従来の人工血管や人 ェ «»、 あるいは同種 で補充される !««、 組纖等に代わり得る材料を提供する ことができる。 なお、 本発明により非霊長類喃乳動物を形質転換することは、 これらの動物に いかなる被害あるいは虜待を与えることがなく、 また、 本発明は、 形質転換され た非霊長類喃乳動物の生存、 生 »等に慝影響を及ぼすものではない。 さらに、 本 発明は、 ヒトをはじめ他のいかなる動物に対しても ffi影 ·を及ほすものではない o
〔図面の簡単な説明〕
図 1は、 前駆物質 （N—ァセチルラクトサミン） からの ABHStt質と GS物 燹の合成 g路を示す図である。
02は、 実施例 1の FT遗伝子を有するプラスミ ド pMAM/FTを構築操作 する as面である。
H3は、 実施例 1の FT遗伝子導入用断片の模式 Bである。
H4は、 実施例 2の pREP 8 八5/0丁を«築»作する通程図でぁる。 る o 、
05は、 実施例 2の ASZGT遺伝子導入用断片の模式 である。
図 6は、 実施例 3の PREP 9/GT3— 4を槽築»作する通程図である。
E7は、 実施例 3の pREP 9/GT3 - 4ZFT/厶 S s p l / Ώ r a I
I Iを横築攝作する通 及び遗伝子断片 GT S - 4/FT/p o 1 yAの 通
Sを H示したものである。
図 8は、 実施例 3の p GTZFTを構築操作する «程 0である。
B9は、 "C r リリースアツセィの桔果を示すグラフ 0である。
〔発明を実施するための最良の形 〕
以下に本発明の実施例を示す。 本発明に於ける外来 *伝子に Mして、 既に述べ た 2種類の tf転移酵素、 即ち G T遠伝子と F Τ¾伝子の c D Ν Αを例示できる。 ただし、 以下の実施例は、 請求の範 Hを制限するものではない。 (実施例 1 )
導入用遺伝子を含むブラスミ ド （PMAM/FT) の構築及びその ¾伝子導入 用断片の調製
(1〉 PCR法による FT道伝子断片の》δ
Pr o c. Na t l. Ac a d. S c i. USA. 87(1990). pp6674-6678に ¾ 吿されたヒトの FT 〔EC 2. 4. 1. 8 B〕 の DNA 列に基づいて、 そのス 夕一トコドンとストップコドンを含むような形で PC R用の 2種類のプライマー を合成した。 なお、 その 5' 側のブライマーには、 制 酵素 Nhelのサイ トを付け た、 また 3' 側のプライマーには、 制 15酵素 Xholのサイトを付けた。
一方、 健康な成人の血液より白血球を採取し全 RN Aを抽出し、 逆転写酵素を 用いて、 全 RNAに対応する CDNAを合成した。 この cDNAを練 Sにして、 前 のブライマーを用いて PC Rを施行した。
本 PCR¾行により得られた cDNA断片を 1 ァガ π—スゲル «気泳動にか けたところ、 杓 llOObpの長さのバンドを得た。 この PCR産物を pGEM— T ( Promega社製） に捧人した上で自動塩基配列»み取り «で坦基配列を読み取った ところ、 前 EK報の通りの FT¾伝子の «¾ 列を有していた。 そこでこの cD NAを 0. 8 %Low Melting Point (以下、 LMPという。 〉 ゲルで電気泳動し て 製した後、 制 BUS聚 Nhelと Xholで処理し， レジンを用いた Promega社の Wiza rdD.NA«製システム （以下、 Wizardシステムという。 ） により情 ¾ ·分離した 。 なお、 以下各種 DNA断片の精製分雌は、 LMPゲル電気泳動と Wi rdシステ ムとを用いることにより行った。
(2) pMAMZFTの構築
W¾類発現ベクターの一種である pMAM (CL0NBTBCH社 fi、 Lee, F.C1981) N ature 294:228)のマルチクローニング部位 （MCS) を制 R酵素 Nhe【と Xholで処 理し、 この断片を LMPゲル «»泳動及び Wizardシステムで «» ·分離した。 こ のぺクタ一に flffi ·分»した FT*伝子の c DNAを、 T4DNAリガーゼによ り挿入させた。 このプラスミ ド DN Aによって、 コンビテント状 »の JM 1 09 »S»胞を形質転換させて、 得られた形 K転換体をアンピシリンプレートで S折 した。 佃々のコロニー毎に LB培地 （組成； Bacto-tryprone 10g(DIFC0社製） 、 Bacto-yeast extract 5g(DIPC0社製) 、 aCl 10gを水にて 1Lとする、 以下同じ。 ) で增¾させ、 ミニブラスミ ド W製を行った。 抽出したブラスミ ド DNAを種々 の制限酵素を使って消化した後に電«泳動して、 揷入断片のサイズ及び位置方向 を Hベた。 その繪果、 正しい方向に組み込まれているブラスミ ドを、 pMAM/ FTと称した （02参照） 。
(3) ¾伝子導入用断片の
さらに、 «伝子導入のための直 «ft状断片とするために、 大腸菌 JM1 09/p MAM/FT株を LB«地で大量培養した後に、 プラスミ ド 39¾を行った。 さら に、 得られたプラスミ ドを CsC 1密度勾 E遠心法により精製した。 精製したプ ラスミ ド 1 O tf gを、 制! 素 Pvu Iと BamH Iで消化後、 この断片を精製
，分戆し、 FT遠伝子導入用断片とした。 この断片の構築模式図を図 3に示す β
(実施例 2)
導入用遺伝子を含むプラスミ ド （pREP 8ZASZG丁） の構築及びその導 入用遺伝子断片の》製
( 1 ) アンチセンス GTの W製
既報 （Xe no t r an s p l an t a t i on 1 994 ： 1 ： pp 8 1 - 8 8) に報告されたプタ GT«伝子の DNAB2列に基づいて、 そのスタートコ ドン とストップコドンを含むような形で 2 β戮の PC R用のプライマーを合成した。 なお、 その 5' 側のブライマーには、 制限醇 ¾XhoIのサイ トを付けた、 また 3' 側のプライマーには制限 B素 Nhe【のサイトを付けた。
一方、 健康なプタの血液より白血球を採取し、 その全 RN Aを抽出し、 逆転写 酵素を用いて全 RN Aに対応する cDN Aを合成した。 この cDNAを »型にし て、 前記のプライマーを用いて PCRを施行した。
本 PC R施行により得られた c DN A断片を 1 «了ガロースゲル 泳動にか けたところ、 約 llOObpの長さのバンドを得た。 この PCRま物を pGEM— T ( Pronega社製） に捧入した上で、 自動 S配列読み取り機で 基配列を み取つ たところ、 前記既報の通りの GT¾伝子の埴基配列を有していた。 そこでこの c D N Aを L M Pゲルで電気泳動して精 12した後、 制 R酵素 Nhelと Xholで処理し、 Wizardシステムを用いて ft製 '分離した。
(2) pREP 8ZAS/GTの樣築
轆 ft類発現ベクターの一種である P RE P 8 (Invitorogen社 ¾、 George. R., et al. Gene.81.285(1989) ) の MC Sを制 IRB紊 Xholと Nhelで処理し、 精製 ·分 雌した。 このベクターに、 T4DNAリガ一ゼにより、 «I製 ·分饑した GT遣伝 子の cDNAを、 揮入した。 このプラスミ ド DN Aによって、 コンビテント状 1» の JM1 09»菌細胞を形 »転複させて、 得られた形質転換体をアンピシリ ンプ レートで S択した。 ffl々のコロニー毎に LB*地で坳¾させ、 ミニプラスミ ド W »を行った。 抽出したブラスミ ド DNAを種々の制限酵素を使って消化した後に 電気泳動して、 揮入断片のサイズ及び位 fi方向を諝ベた。 その結果、 正しくアン チセンス方向に組み込まれているプラスミ ドを、 PREP 8ZASZGTと称し た （図 4参照） 。
(3) 導人用 »伝子断片の W製
さらに、 «伝子等入のための直 «状断片とするために、 大 Β苗 JM1 09/ρ REP 8/ASZGT株を LB*地で大量 ¾養した後に、 プラスミ ド》製を行つ た。 さらに、 得られたプラスミ ドを Cs C l*度勾 Ε«心法により精 »した。 锖 製したプラスミ ド 1 0 gを、 制 R»素 Xba Iと Ps t Iで消化後、 この断片 を LMPゲル «気泳勳及び Wizardシステムで精製 ·分離し、 ASZGT*伝子導 入用断片とした。 この断片の構築模式図を図 5に示す。
(実施例 3)
相 組換え用遺伝子を含むプラスミ ド （PREP 9ZGTZFT) の槽築及び 導入用遺伝子断片 （pGT/FT) の W» 以下、 マウスの例を示すがプ夕においても基本的な考え方は同じである。
(1) pREP 9ZGT3— 4の構築
以下、 PREP 9ZGT3— 4の槽築を図 6に基づいて K明する。
既挛 H (Pr o c. Na t l . Ac a d. Sc i. USA, 86(1989). pp.8227-8 231)のマウスの GT 〔EC 2. 4. 1. 151〕 の配列に づいてェキソン 3か ら 4までの部分を PC R法にて抽出するために、 ェキソン 3內のセンスプライマ 一として制 Κβ索 Kpn Iの切断部位をつけたプライマー （pZAとする） 、 又 アンチセンスプライマーとしてェキソン 4內のスタートコドンの部位に制限酵素 S 8 p Iの切断部位を含み、 その下流に制 R酵素 H i n d I I 1の切断部位をつ けたプライマー （p/B) を合成した。
これらのプライマー p/A及び p/Bを用いて PC R法を施行し、 得られた断 片を、 制限酵素 Kpn I及び Hi n d I I Iで切断した後、 精製 ·分龌し、 これ を GT3— 4と称した。 一方、 発現ベクターである pREP 9 (Invitrogen社） を制 β酵索 BamH I で切断し、 T4 DNAポリメラーゼによりその断靖を平滑にし、 T4DNAリガ ーゼにより se 一 ligationし、 制 IS酵索 B amH Iの切断部位が欠失した発現べ クタ一を、 pREP 9/厶 B amH Iと称した。
これを更に制限酵素 Dr a I I Iで切断し、 T4DNAボリメラーゼによりそ の断 «を平滑にし、 T4DNAリガーゼにより self— ligationし、 制限酵素 D r a I I Iの切断郎位が欠失した発現ベクターを、 pREP 9/AB amH I /△ D r a I I Iと称した。 このベクターを制 R酵素 Kp η I及び H i n d I I Iで 切断し、 上 GT 3— 4を揮入したプラスミ ドを p RE P 9ZGT 3— 4と称し た β
(2) pREP 9/GT3 - 4/FT/AS s IZADr a I I Iの槽築 以下、 pREP 9ZGT 3 - 4/FT AS β p I /厶 D r a I I Iの構築 を 07に基づいて説明する。
ヒト FT CPr o c. a t l. Ac a d. S c i. USA. 87(1990). pp667 4-6678) の配列に基づき、 そのスタートコドンとストップコドンを含む発現部位 を PCR法にて抽出するために、 スタートコドンを含む 5' flfのセンスブライマ 一 (p/C) には制 IS酵素 Nh e Iと Dr a I I I切断部位を、 この JEで付けた 一方、 FTのストップコドンを含むアンチセンスプライマー （P/D〉 にはそ の 3' 側に制 ISB«Xho I切断抑位を付けた。 これらのプライマーを用いて P CR法を »行し、 得られた断片を制限酵素 Nh e I及び Xho Iで切断し、 pR EP 9/G丁 3— 4を制 R»素 Nh e I及び Xho Iで切断したプラスミ ドに挿 入する。 これを PREP 9/GT 3— 4ZFTと称した。 このプラスミ ド pREPZGT 3— 4/?丁を制¾»素3 s p I及び D r a I I Iで切断すると平滑末燔が生成された。
ここで T 4 DNAリガーゼにて処理すると seli— lieationにより両者末 が連 轄し、 GTの ¾現闥始部位に FT cDNAの発現開始部位が位置された。
このプラスミ ドを pREP 9ZGT 3 - 4/FT/AS s p I /AD r a i l Iと称した。 以上に於いてこれら制 15醇素 Kp n Hl nd l l Ss p I 、 Nhe I、 Dr a I I I、 及び Xho 1がいずれもェキソン 3からェキソン 4 までの断片及び FT c DNAの発現 «位の断片を切断しないことか Hに《かめら れている。
(3)導入用 ¾伝子断片 PGT FTの W製
以下、 p GT/FTの «製について B7及び 08に基づいて K明する。
pREP 9の p 01 y Aの 3' 伽を含みかつ制 ISB素 B a mH I切断部位を含 む形でアンチセンスブライマー （p/E)を合成し、 これとセンスブライマー （ p/A) とを用いて、 pREP 9/GT 3— 4 /FT/厶 S s p I /AD r a I I Iに対し、 ？ 1¾法を«行し、 得られた断片を制 R»素 Kp n I及び BamH Iで切断して Λ¾ ·分 «し、 得られた断片を GT 3— 4/FT/p 01 yAと称 した 參履） 。
一方、 発 ¾ベクター pREP 9を制 IRB素 Kpn Iと BamHIで切断し、 上 おの断片 GT 3— 4/FT/p 01 y Aを揮入した。 これを pREP9/GT3 一 4/FT/p o】 y Aと称した。
GTのェキソン 4からェキソン 6又はェキソン 7までの »分を、 センスプライ マー （p/F〉 、 アンチセンスブライマー （PZG) とも制限酵素 B amH Iの 切断部位を付け、 PC 法にて抽出し、 この断片を制 K»*BamH Iで切断し 、 得られた断片を、 制 R酵素 BamH Iで開列したプラスミ FpREPSZGT 3— 4/FT/p 01 y Aに禅人した （B amH Iが、 GT 3— 4、 FT、 p o 1 y A及び T4一 7を切断しないことは既に確かめられている） 。
得られたプラスミ ドを 1¾£ 9 (?丁3— 4/ 丁/ 01 yA/GT4 - 7、 或いは «!車に、 pREP 9/GTZFTと称した。 このプラスミ ドに対し、 ブライマー p/A及び pZGを用いて PCR法を施行 した。 ft製後得られた断片を受精卵への導入用断片とし、 GT3— 4ZFTZP 01 A/GT4-7, 或いは ffi単に p G TZF Tと称した。 このようにして作成"した導入用 ¾伝子断片は、 GTの染色体の *伝子と相同性 が高く、 相同組み換えを起こすことが期待される。 相同組み換えを起こした場合 は、 GTの代わりに FTが発現するのでその偭体 （Fo) は GTも FTも発現す る。 しかし交配を 1、 2世代行うと、 メンデルの法則により、 FTのみを持った 価体を得ることが出来る。 この価体こそが、 非霊長類喷乳動物に特有な抗原を持 たずに高等霊長類特有の抗原を持つに至った、 形 転換 »物である。 マウスの G Tとブ夕の GTとではホモロジ一が高いのでマウスの GTに基づいた相同組み换 え «伝子をプ夕に速用することかできる。
(実施例 4)
導入用遺伝子断片 （pMAM FT及び PRE P 8ZASZGT) のプ夕受 ft 卵への注入及びその受精卵の移植
( 1 )導人用遺伝子断片 （pMAMZFT及び pREP 8 GT) のブタ受精卵 への注入 実 動物として家畜豚を用いた。 受精卵提供用のブタとして Landraceと Whi te Yorkshire の交 豚で、 生 ft約 6ヶ月の、 まだ自然発情を来す前の ttプ夕を用い た。 この 81プタに排卵 R¾剤 P M S (妊馬血清、 シグマ社製、 G4877)及び h C G (ヒト絨毛ゴナドトロピン、 シグマ社製、 CG5)を注射し、 Duroc 系の成熟 ttブ夕 から採取した精液により人工受精を行い、 卵管を M 2培地で?！流することにより 受 «卵を採取した。 これらの受精卵の W核は 肪 »に覆われているために直視出 来ないため、 受精卵を 10000Bで 1 0分 1¾遠心することにより、 胆肪 Λと前 6Tを分 離し、 徵分干步 »»ttで 視下においた。 受«卵への遗伝子の注入に於いては、 マウス受精卵に於ける遗伝子導入の既報 ( Hogan. et al. . In manipulating the House Embryo. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1988、 Pinkert, et al. . Transgenic animal, technology. . Ac adeoic press , Inc. 1994 )に記載されているマイクロインジェクシ sン法を、 ブ タ受 W卵に遑用した。 即ち、 培養液中で受精卵を保持用ガラスビぺッ トで固定後 、 ft小ガラスピペッ トを用いて導入用 *伝子断片の溶液 2 p 1を雄性前筏に注入 した。
2種類の遠伝子導入用断片を含む は、 これらの導入用断片を T E «¾¾ ( 0. 25mM EDTA、 5mM Tris(pH7.4))に IB濯して、 それぞれ 1. 0 になるよ うに《I製したものを用いた。
( 2 ) ¾伝子注入をした受精卵の移植
注入操作後、 CO. インキュベーター内にて、 M 2培地で 2〜 3時間培養後、 受 精卵を発情している β成熟豚の卵管へ移植した。 移植は、 全身麻 »下にて Mffift 、 卵管内移 ttにより行った。 卵管移《後分娩満期まで匍育し、 産仔を得た。
なお、 遠伝子注入した受精卵は、 速やかに移植されるのが好ましい。
(実施例 5 )
遺伝子導入プ夕に於ける導入遺伝子の同定
分娩後約 1通目に、 得られた仔プ夕の尾部の先 *部分約 1 cmを切断採取した。 尾部の tt胞より高分子 DNAを抽出 '精製した後、 サザンプロッティング法及び フィルターハイプリダイゼイシ sン法によって、 導入した遺伝子断片がプ夕の染 色体に組み込まれているかを 51ベた。 即ち、 制ほ醇 «BcoRI と BaoiHI で完全に消 化させた 10tf gの高分子 DNAを 1 ¾ァガロースゲル電気泳動した後、 ナイロン フィルター （HybondN. Amershan)に DN Aを転写した。 フィルタ一は風乾後、 U V照射を行い DN Aを固定させて、 フィルターハイプリダイゼーシ 3ンに供した 0 なお、 プ o—プとして、 pMAMZFTを制 K 素 C I と Nhe I で完全に消 化させた断片を FT用に用いた β これらの結果を下 3Ξ¾1に示した。 肝1 S回の実 ϋで 550個の受棺卵に遗伝 子注入を行い、 同数を 1 9頭のレシピエントに移植した。 この結果 7¾が妊娠し 、 27頭の仔プ夕を分娩した。 これらのうち、 サザンプロッティング法及びフィ ルターハイプリダイゼイシ 3ン法によって、 FTに関して 1頭が »性であった。 なお、 遺伝子導入していないコント o—ルプ夕 1 5頭に対しても同様の検索を行 つたが、 いずれも乾性であった。 ほ 1】
Figure imgf000021_0001
(実施例 6 )
導入遺伝子の ¾現の »g
jt伝子等入が されている仔プタの尾部の先 «を約 1 cm切断し、 また血液を 採取し、 導入 ¾伝子発現の検出の試料とした。 採取した尾 «より AG PC法 (Aci d Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Method) を用いて、 全 RNAを 分讎した。 次にこの全 RNAを使った RT— PCR法によって、 FT遺伝子の発 現の解析を行った。
即ち、 全 RNAから逆転写酵素によって cDNAを合成し、 前述の FT¾伝子 抽出のために用いたプライマーを用いて PCR法を施行した。 その糖果、 27頭 中 1 ¾が »性と判定された。 すなわち、 導入した FT*伝子が mRNAに翻 さ れ、 FTの酵素タンパク Kを産生していることを確ほした。 なお、 遣伝子導入し ていないコントロールプタ 1 5Kに対しても同様の検索を行ったが、 いずれも險 性であった。
(実施例 7)
実施例 6で BB性と判定された、 即ち FTの S白質を S生していると考えられる 仔プ夕から血液を採取し、 遠心後、 血球を分 »し、 S光抗体を使った F I TC法 でプタ血球を染色した。 一方、 コントロールプタ （遠伝子導人していないブ夕） からも血液を採取し、 同様に染色した。
即ち、 一次抗体として抗 抗体を、 2次抗体として蛍光色素かラベルしてあ るマウス 7グロブリン （P(ab),) を用いた。 この結果、 実施例 6の »性の仔ブ夕 は K性と判定された。 一方、 コント D—ルプ夕のそれは全て陰性だった。 即ち、 導入された FTがブ夕細胞の中で正しく機能していることが確かめられた。
(実施例 8 )
ブ夕の IF由来の袖胞系 PK 15に pMAM FTを感染させたコロニーを S択 し、 llC rを加えた培 中にて、 一定時 18培養し、 その後健康な成人ヒト血液 (A. B, 0、 ABの 4つの血液型を含む） から採取した血«を加えることによ り、 "C rリ リースアツセィを行った。
この桔果、 図 9に示すように、 24時面 の後、 放出された11 C rを W定し た,. その艙梁、 コント o—ルプ夕の血 ftはほぼ 100 κ»Ι»が «壞されたのが « 察されたか、 FTを導入したプタの敏 Κは 24時 ΙΒβつても »8 &破壞は 1 以 下しか観あされなかった。
このように、 プ夕 に FTを導入することによりいわゆる血 tt が転 ftされ 、 その結果ヒトの 0型と同じ HSftKが生成されることになり、 ヒトか持つブ夕 に対する自然抗体と抗原抗体反応を形成しないか、 あるいは抗原抗体反応を形成 しても低 «度であることが示された。 なお、 この発明は、 その本質的特性から逸脱することなく数多くの形式のもの として具体化することかできるから、 これらの実施態様はもっぱら K明上のもの で制約的なものではない。 また、 この発明の ¾囲は、 求の範囲以外の Ε載によ るものでなく、 請求の範囲によって限定するものであるから、 »求の e囲の要件 内のあらゆる g更、 またはその要件に対する均等物は諝求の ¾囲に包含されるも のである。

Claims

請求の Ι&Β
1. 高等霊長類の糖転移酵素を »現させる外来遺伝子を有することを特 aとする 非 S長哺 9 顔の形 K転後動物。
2. 高等霊長類の糖転移酵素を発現させる第 1の外来遺伝子と、
非 J{長喵乳 ¾9の糖転移酵素の発現を抑制する第 2外来 «伝子、
とを有することを特黴とする非 S長哺孔類の形質転換動物。
8. 前記高等霊長 Sの «転移酵素か、 GDP-いフコース： ガラク トシド 2- な- L-フコシルトランスフ tラーゼである蹐求項 1に £載の動物。
4. 前 Ε高等霊長 »の糖転移 が、 GDP—し-フコース： /8+ ガラクトシド 2- a-し-フコシルトランスフェラ一ゼであり、
前記非霊長嘴 の糖転移醇素が、 UDPガラクトース ガラク トシル -1.4- N- ァセチル ダルコサミニド a -1.3- ガラク トシルトランスフェラ ーゼである請求項 2に 裁の動物。
5. 前記外来遗伝子か、 ホモの状 »で保持されていることを特 aとする精求項 1 又は 3に記載の動物。
6. 前記第 1の外来 伝子と、 前 E第 2の外来 ¾伝子がいずれもホモの状 SSで保 持されていることを特徴とする猜求項 2又は 4に記載の動物。
7. 前お非 S長啼乳類の形 K転換動物がプタである Ϊ»求項 1から 6のいずれかに 記載の動物。
8. Ϊ»求項 1から 7のいずれかに E載の非霊長" II乳類の形質お換動物から得られ た高等霊長類への移植用材料。
Θ . 高等霊長類の糖転移酵素を発現させる第 1の外来 ft伝子及び/又は非 S長哺 乳類の «転移酵素の発現を抑制する第 2の外来遺伝子を非霊長哺乳類に導入する ：とを特徵とする高等 S長類 9の抗原 &を発現した非 2县喃乳 Sの形質転換動物 の作出方法。
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