WO1996021358A1 - Pilzisolat, präparat zur bekämpfung pflanzenpathogener pilze, verfahren zu seiner herstellung sowie seine verwendung - Google Patents

Pilzisolat, präparat zur bekämpfung pflanzenpathogener pilze, verfahren zu seiner herstellung sowie seine verwendung Download PDF

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Peter Lüth
Ute Eiben
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Prophyta Biologischer Pflanzenschutz Gmbh
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    • A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Definitions

  • Fungus isolate preparation for controlling phytopathogenic fungi. Process for its production and its use
  • the invention relates to the isolate CON / M / 91-08 of the mushroom species Coniothyrium minitans • and its use for combating sclerotic plant pathogens, in particular Sclerotinia ⁇ clerotiorum.
  • the rot on various plant organs caused by the pathogen S. ⁇ clerotiorum occurs in many crop plants, e.g. Sunflower, tomato, tobacco, lettuce and rapeseed. It sometimes causes very high yield and storage losses.
  • the fungus germinates from the sclerotia with its fruiting bodies, the pharmacies, and forms spores that infect the aerial parts of the plant.
  • fungal mycelium can grow out of the sclerotia, which is able to infect both above and underground parts of plants.
  • microbial antagonists which also includes Coniothyrium minitans, which are said to cause the destruction of sclerotia in the soil, could on the one hand dispense with chemical control, where it is still used today, and on the other hand, in many applications, control of S. ⁇ clerotiorum possible in the first place.
  • Coniothyrium minitans is a fungus that occurs naturally in the soil and has a worldwide distribution. There have been numerous reports of the isolation of this fungus from sclerotia from S. ⁇ clerotiorum and S. trifoliorum. Evidence that C. minitans can damage the sclerotia of the fungus genus Sclerotinia is in many laboratory and
  • the invention has for its object to find an isolate of the mushroom type Coniothyrium minitans, which is particularly well suited for controlling phytopathogenic fungi and enables controlled and targeted use.
  • the isolate according to the invention was selected as a single line from 32 single lines and has a particularly high antagonistic activity against S. sclerotiorum and a very good ability to pycnidia.
  • CON / M / 91-08 grows in vitro on different nutrient media.
  • the isolate is characterized as follows, depending on the nutrient medium used and a growth temperature of 22 ° C and culture under the exclusion of light:
  • the fungal isolate to be used according to the invention can be used on suitable substrates, such as cereal grains, cereal bran, straw or other plant materials, or also with the aid of agar culture media customary in mycology, such as potato dextrose agar or malt-peptone agar, or on suitable carrier materials a nutrient additive as well as in liquid nutrient substrates without agar additive.
  • suitable substrates such as cereal grains, cereal bran, straw or other plant materials
  • agar culture media customary in mycology such as potato dextrose agar or malt-peptone agar
  • suitable carrier materials a nutrient additive as well as in liquid nutrient substrates without agar additive.
  • the present invention also relates to crop protection agents which contain the isolate CON / M / 91-08 in the form of its pycnidiospores, its mycelium or other fungal constituents, in addition to conventional additives which serve for suspension or formulation.
  • the agents according to the invention can be used as sprayable solutions (dispersions), emulsifiable concentrates, wettable powders, dusts, mordants, dispersions, granules or microgranules in the usual preparations.
  • the agents commercially available as concentrates are generally diluted for use. This happens with water-dispersible granules, wettable powders, emulsifiable concentrates as well as with dispersions e.g. with water.
  • dispersions e.g. with water.
  • REPLACEMENT LEAF Formulations such as dusts, dressing preparations or granules are not usually diluted before they are used.
  • the agent can also be mixed with other, including chemical, crop protection agents, such as fungicides, insecticides, herbicides or acaricides, or with growth regulators or fertilizers.
  • Isolate VIII 2 was one of the isolates originally obtained and was not subjected to any further selection. 50 ml of suspension / m 2 were applied in each case. In addition to the variants, a variant contaminated with Sclerotinia ⁇ clerotiorum but not treated with antagonists was carried as a control. The test was set up as a block system with 12 m 2 plots in 4 repetitions. Spacers were created between the plots in order to spread the ascospores of S. To keep ⁇ clerotiorum as low as possible with the wind beyond the plot boundaries.
  • Variant infected plot yield plants k ⁇ / Parz. % to contr.
  • Isolate 10 isolate 11, isolate 20, isolate 21 (CON / M / 91-08), isolate 22, isolate 32 with the aim of differentiating isolate 21 from all others.
  • DAF4 and DAF8 clearly differentiated isolate 21 from all others.
  • DAF6 and DAF9 also differentiated between isolate 21 and the other isolates. However, the latter give different patterns with these primers, some of which are similar to the pattern of isolate 21.

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Abstract

Die Erfindung betrifft das Isolat CON/M/91-08 (DSM 9660) der Pilzart Coniothyrium minitans sowie ein Präparat und Verfahren zur Bekämpfung von pflanzenpathogenen Pilzen, die eine fungizid wirksame Menge dieses Isolats enthalten bzw. nutzen.

Description

Pilzisolat, Präparat zur Bekämpfung pflanzenpat ogener Pilze. Verfahren zu seiner Herstellung sowie seine Verwendung
Beschreibung
Gegenstand der Erfindung ist das Isolat CON/M/91-08 der Pilzart Coniothyrium minitans • sowie dessen Anwendung zur Bekämpfung sklerotienbildender Pflanzenkrankheitserreger, insbesondere Sclerotinia εclerotiorum.
Die durch den Krankheitserreger S. εclerotiorum verursachte Fäule an den verschiedensten Pflanzenorganen tritt an vielen Kulturpflanzen, wie z.B. Sonnenblume, Tomate, Tabak, Salat und Raps, auf. Sie verursacht z.T. sehr hohe Ertrags- und Lagerverluste.
Eine chemische Bekämpfung der Krankheit ist in den meisten Fällen unbefriedigend oder überhaupt nicht möglich, da der Krankheitserreger in Form seiner Dauerkörper, den Sklerotien, im Boden überdauert, von wo aus er seine Wirtspflanzen mit Hilfe verschiedener möglicher Infektionsmodi befällt.
So keimt der Pilz einerseits mit seinen Fruchtkörpern, den Apothezien, aus den Sklerotien aus und bildet Sporen, die die oberirdischen Pflanzenteile infizieren. Andererseits kann Pilzmyzel aus den Sklerotien auswachsen, das in der Lage ist sowohl ober- als auch unterirdische Pflanzenteile zu infizieren.
Während im ersten Falle eine chemische Bekämpfung in bestimmten Fällen (z.B. beim Winterraps) eingeschränkt möglich ist, kann eine Infektion über das Myzel bisher chemisch nicht bekämpft werden.
Durch den Einsatz mikrobieller Antagonisten, zu denen auch Coniothyrium minitans gehört, die die Zerstörung der Sklerotien im Boden bewirken sollen, könnte einerseits auf eine chemische Bekämpfung, wo sie heute noch angewandt wird, verzichtet werden, andererseits wäre in vielen Anwendungsfällen eine Bekämpfung von S . εclerotiorum überhaupt erst möglich.
Coniothyrium minitans ist ein im Boden natürlich vorkommender Pilz mit weltweiter Verbreitung. Es gibt zahlreiche Berichte über die Isolierung dieses Pilzes aus Sklerotien von S . εclerotiorum und S . trifoliorum . Der Nachweis, daß C . minitans die Sklerotien der Pilzgattung Sclerotinia zu schädigen vermag, ist in vielen Labor- und
ERSAΪZBLATT Felduntersuchungen erbracht worden. Es gibt auch Untersuchungen (Trut ann, P. et al, Soil Biology and Biochemistry 12, 461-465 (1980), Tiede ann, A. von et al, Mitteilungen aus der Biologischen Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft, Berlin-Dahlem, Heft 301, 361 (1994) und Budge, S.P. et al. Plant Pathologie 40, 59-66 (1991)), mit denen eine Reduzierung der Sklerotien-Verseuchung des Boden nach einer Applikation von C . minitans nachgewiesen wurde.
Ein Nachteil der Verwendung von Coniothyrium minitans besteht jedoch darin, daß zum gegenwärtigen Zeitpunkt eine kontrollierte und gezielte Anwendung nicht möglich ist.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Isolat der Pilzart Coniothyrium minitans zu finden, das besonders gut zur Bekämpfung von pflanzenpathogenen Pilzen geeignet ist und eine kontrollierte und gezielte Anwendung ermöglicht.
Ein solches Isolat wurde mit dem Isolat CON/M/91-08 gefunden und unter der Nummer DSM 9660 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, hinterlegt.
Das erfindungsgemäße Isolat wurde als Einsporlinie aus 32 Einsporlinien selektiert und hat eine besonders hohe antagonistische Aktivität gegen S . sclerotiorum sowie eine sehr gute Befähigung zur Pyknidienbildung. CON/M/91-08 wächst in vitro auf unterschiedlichen Nährböden. Das Isolat ist in Abhängigkeit vom verwendeten Nährboden sowie einer Wachstumstemperatur von 22 °C und Kultur unter Lichtabschluß wie folgt charakterisiert:
Figure imgf000004_0001
ERSATZBLATT
Figure imgf000005_0001
Zum Nachweis des Isolates CON/M/91-08 wurde außerdem eine RAPD-Analyse nach Williams et al., 1990, Nucleic Acid Res. 18, 6531 durchgeführt. Als RAPD-Primer dienten DAF4, DAF6, DAF8, DAF9.
Das erfindungsgemäß einzusetzende Pilzisolat kann auf geeigneten Substraten, wie Getreidekörnern, Getreidekleie, Stroh oder anderen Pflanzenmaterialien, oder auch mit Hilfe von in der Mykologie üblichen Agar-Nährböden, wie Kartoffel- Dextrose-Agar oder Malz-Pepton-Agar, oder auf geeigneten Trägermaterialien mit einem Nährsubstratzusatz sowie in flüssigen Nährsubstraten ohne Agarzusatz kultiviert werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Pflanzenschutzmittel, die das Isolat CON/M/91-08 in Form seiner Pyknidiosporen, seines Myzels oder sonstiger Pilzbestandteile neben üblichen Zusatzstoffen, welche der Suspendierung oder Formulierung dienen, enthalten.
Die erfindungsgemäßen Mittel können als versprühbare Lösungen (Dispersionen), emulgierbare Konzentrate, Spritzpulver, Stäubemittel, Beizmittel, Dispersionen, Granulate oder Mikrogranulate in den üblichen Zubereitungen angewandt werden.
Die handelsüblich als Konzentrat vorliegenden Mittel werden zur Anwendung im allgemeinen verdünnt. Dieses geschieht bei wasserdispergierbaren Granulaten, Spritzpulvern, emulgierbaren Konzentraten sowie bei Dispersionen z.B. mit Wasser. Andere
ERSÄΓZBLATT Formulierungen, wie Stäube, Beizmittelzubereitungen oder Granulate, werden vor ihrer Anwendung gebräuchlicher Weise nicht verdünnt. Das Mittel kann zum Zwecke seiner Anwendung unter bestimmten Umständen auch mit anderen, auch chemischen, Pflanzenschutzmitteln, wie Fungiziden, Insektiziden, Herbiziden oder Akariziden, oder auch mit Wachstumsregulatoren oder Düngemitteln gemischt werden.
Anhand der folgenden Beispiele soll die Erfindung im Hinblick auf einige wichtige Eigenschaften näher charakterisiert werden.
Beispiel 1
Aus Sklerotien der Pilzarten S . Sclerotiorum und S . trifoliorum von verschiedenen Standorten wurden zahlreiche Isolate des Pilzes C. minitanε gewonnen, indem die Sklerotien oberflächlich sterilisiert und auf einen Agarnährboden aufgelegt wurden. Die mit ihrem Myzel auswachsenden Pilze wurden bestimmt und alle zur Art C. minitans gehörenden Isolate in eine Isolatesammlung übernommen. Mit diesen Isolate wurde eine Selektion hinsichtlich ihrer Befähigung zur Sporenbildung durchgeführt. Diese erfolgte in 2 Selektionsschritten. Dazu wurden von den ursprünglich gewonnenen 23 Isolaten Suspensionen aus Pyknidiosporen hergestellt und auf einem Biomalz-Agar mit Zusatz von Hefe-Extrakt ausgestrichen. Nach beginnender Pyknidienbildung auf den verwendeten Agarplatten zeigten sich einige Kolonien mit besonders vielen gut ausgebildeten Pyknidien. Aus diesen wurde je eine Pyknidie gewonnen und als Linie weitergeführt. Insgesamt konnten 528 Linien gewonnen werden, die in einer Folgekultur hinsichtlich ihrer Pyknidienbildungsrate untersucht und selektiert wurden. Dabei wurden 95 Linien gewonnen und in einem 2. Selektionsschritt eingesetzt. Bei der 2. Selektion wurden aus Kolonien mit einer besonders starken Pyknidienbildung Einsporlinien gewonnen und in einer Folgekultur selektiert. Als Ergebnis standen 32 Einsporlinien mit einer sehr guten Befähigung zur
ERSATZBLÄΓT Pyknidienbildung zur Verfügung. Die Befähigung dieser Linien zur Bildung von Pyknidiosporen in Agar-Kultur ist in Abb.l dargestellt.
Beispiel 2
32 Einsporlinien von C . minitans mit einer besonders guten Befähigung zur Pyknidienbildung (Beschreibung unter Beispiel 1) waren Ausgangspunkt für die Selektion einer Linie, die sowohl eine gut Befähigung zur Pyknidienbildung als auch eine gut antagonistische Wirkung in sich vereinigt. Zur Selektion dieser Linie wurden Versuchsgefäße mit Quarzsand befüllt und mit einer Pyknidiosporensuspension (Konzentration lx 104 Sporen/ml) befeuchtet (erdfeucht). Im Anschluß daran wurden je 25 natürlich gebildete Sklerotien vom Winterraps in 4 Wiederholungen 1 cm tief eingebettet und bei folgenden Temperaturen im Klimaschrank inkubiert:
4 Wochen - 15 "c 8 Wochen - 12 "c
Damit wurden die im Boden herrschenden Temperaturbedingungen des Zeitraumes von Mitte August bis Mitte November simuliert. Die Wirkungsbedingungen für die zu bewertenden Coniothyrium- Isolate wurden mit Absicht ungünstig gestaltet, um solche Isolate selektieren zu können, die auch bei ungünstigen äußeren Einflüssen eine gute Wirkung aufweisen. Die Bewertung der antagonistischen Befähigung der Einsporlinien erfolgte anhand der Zerstörung der Sklerotien nach Ablauf der Inkubation (Abb.2) .
Die Einsporlinie CON/M/91-08 verursachte mit einem Index von 60,8 die stärkste Schädigung der Sklerotien. Über 90 % der Sklerotien war geschädigt, die meisten davon stark.
Beispiel 3
Nach Ausbringung von 300 Sklerotien pro m2 sowie ihrer flachen Einarbeitung mittels Ackerfräse in den Erdboden wurden
ERSATZBLATT Suspensionen von Pyknidiosporen in folgenden Varianten auf die Bodenoberfläche gesprüht und ebenfalls eingearbeitet.
1. CON/M/91-08 Konz.: 1 x 106
2. CON/M/91-08 Konz. : 5 x 106
3. CON/M/91-08 Konz. : 1 X 107
4. Isolat VIII 2 Konz.: 5 x 106
Bei dem Isolat VIII 2 handelte es sich um eines der ursprünglich gewonnenen Isolate, das keiner weiteren Selektion unterworfen war. Es wurden jeweils 50 ml Suspension/m2 ausgebracht. Zusätzlich zu den Varianten wurde eine mit Sclerotinia εclerotiorum verseuchte aber nicht mit Antagonisten behandelte Variante als Kontrolle mitgeführt. Die Prüfung wurde als Blockanlage mit 12 m2 großen Parzellen in 4facher Wiederholung angelegt. zwischen den Parzellen wurden Distanzstreifen angelegt, um die Verbreitung der Ascosporen von S . εclerotiorum mit dem Wind über die Parzellengrenzen hinaus möglichst gering zu halten.
Die Auswertung erfolgte im Juli/August des darauffolgenden Jahres anhand des Befalls der Parzellen (Anteil befallener Pflanzen in %) sowie des Parzellenertrages. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle dargestellt.
Tabelle 1
Variante befallene Parzellenertrag Pflanzen kα/Parz. % zur Kontr.
CON/M/91-08 (1 X 106) 20,3 % 5,89 106,3 CON/M/91-08 (5 X 106) 7,4 % 6,65 120,0 CON/M/91-08 (1 X 107) 5,3 % 6,77 122,2 Isolat VIII 2 (5 X 106) 18,8 % 5,91 106,7 Kontrolle 32,5 % 5,54 100,0
Durch die Einarbeitung von 50 ml des Isolates CON/M/91-08 in die oberste Bodenschicht konnte bereits bei Anwendung einer
ERSATZBLATT Pyknidiosporenkonzentration von 5 x 106 Sporen/ml eine deutliche Reduzierung des Sclerotinia-Befalls festgestellt werden. Diese hatte signifikante Erhöhung des Parzellenertrages zur Folge.
Beispiel 4
RAPD-Analyse:
Williams et al., 1990, Nucleic Acid Res. 18, 6531
Es wurden durch TÜV Energie und Umwelt, Fachgruppe Biologische Sicherheit mittels RAPD-Analyse 6 Isolate des Coniothyrium minitans Pilzes untersucht,
Isolat 10, Isolat 11, Isolat 20, Isolat 21 (CON/M/91-08) , Isolat 22, Isolat 32 mit dem Ziel der Unterscheidung des Isolates 21 von allen anderen.
Ergebnis: Im Vortest wurden 8 RAPD-Primer auf Differenzierungs¬ fähigkeit zwischen Isolat 21 und 22 geprüft. Drei der Primer differenzierten nicht. Für die Analyse aller Isolate wurden anschließend die Primer DAF4, DAF6, DAF8 und DAF9 eingesetzt.
Die mit DAF4 und DAF8 erzeugten Muster differenzierten Isolat 21 eindeutig von allen anderen. DAF6 und DAF9 differenzierten ebenfalls zwischen Isolat 21 und den anderen Isolaten. Letztere ergeben aber mit diesen Primern unterschiedliche Muster, die z.T. dem Muster von Isolat 21 ähnlich sind.
Abb. 3 - Elektrophorese-Gele
ERSATZBLATT

Claims

Patentansprüche
1. Das Isolat CON/M/91-08 - DSM 9660 der Pilzart Coniothyrium minitans Campbell einschließlich jeder von diesem Isolat abstammenden Mutante.
2. Präparat zur Bekämpfung von pflanzenpathogenen Pilzen, dadurch gekennzeichnet, daß eine fungizid wirksame Menge des Isolates CON/M/91-08 nach Anspruch 1 darin enthalten ist.
3. Präparat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die fungizid wirksame Menge des Isolates CON/M/91-08 aus Konidien, Chlamydosporen, Fragmenten von Hyphen oder aus einer Mischung dieser Bestandteile besteht.
4. Präparat nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Isolat CON/M/91-08 mit an sich üblichen Hilfs- und Trägerstoffen formuliert ist.
5. Verfahren zur Bekämpfung von pflanzenpathogenen Pilzen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Präparat nach Anspruch 2 bis 4 auf den zu bekämpfenden Pilz oder Pilzorgane oder auf die vor einem Pilzbefall zu schützenden Pflanzen oder Pflanzenteile einschließlich Saatgut oder auf bzw. in den Boden gebracht wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Isolat CON/M/91-08 als Konidiensuspension im Sprühverfahren angewandt wird.
7. Verwendung des Präparates nach Anspruch 2 bis 4, zur Bekämpfung sklerotienbildender Pilze.
8. Verwendung nach Anspruch 7 , dadurch gekennzeichnet, daß die Pilzart Sclerotinia εclerotiorum bekämpft wird.
ERSÄΓZBLATT
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