WO1996014734A1 - Organisme dont l'expression du gene de s-adenosylhomocysteine hydrolase est inhibee - Google Patents

Organisme dont l'expression du gene de s-adenosylhomocysteine hydrolase est inhibee Download PDF

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WO1996014734A1
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expression
sahh
genomic
transformed organism
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Chikara Masuta
Kyoko Uehara
Hideo Tanaka
Shigeru Kuwata
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Japan Tobacco Inc.
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)

Definitions

  • the present invention has various characteristics obtained by substantially suppressing the expression of the S-adenosylhomocysteine hydrolase (hereinafter, referred to as “SAHH”) gene using gene recombination technology.
  • SAHH S-adenosylhomocysteine hydrolase
  • Satellite RNA low molecular RN A is a virus depends the duplicate to the parent virus, induces a number of cases, the parent virus to inhibit the growth of disease Significantly reduce symptoms. By applying this property, it is possible to create virus-resistant plants. So far, the introduction of satellite RNA cDNA into plants has led to the development of plants resistant to Cucumber mosaic virus (Harisson et al., Nature 328, 799) and tobacco ring spot virus (Gerlach et al., Nature 328, 802). Was created. In China, plants incorporating the cDNA of Cucumber mosaic virus satellite RNA have already been subjected to field trials for practical use (Saito et al., Theor, Appl. Genet 83, 679). However, this method is applicable only to viruses with satellite RNA.
  • All or part of the viral cDNA is incorporated into the plant so that it is transcribed and expressed by antisense.
  • the antisense RNA and the nucleic acid of the virus form a complex (double-stranded RNA), which is thought to inhibit protein synthesis and, as a result, suppress virus growth.
  • Viral RNA is abundant in cells and has a complex higher-order structure, so it is not considered easy to form a complex. Not big (Cuozzo et al., Bio / Technology 6, 549). Even if the virus is resistant, only the virus from which the cDNA was derived (or a closely related species) can be expected, as in the case of the coat protein method.
  • Ribozymes are autocatalytically cleaved RNAs whose base sequences can be designed to specifically cleave viral RNA when transcribed and expressed in plant cells. Noh. Again, like antisense RNA, it must form a complex with viral nucleic acids to be effective. Although successful examples are not many, for example, have reported that Edington et al. Effect has been filed by the tobacco mosaic virus to the target ( "Vir al Gene and Plant Pathogenesis ”) 0
  • the morphogenesis of a plant can be artificially controlled, the plant can be improved in a form favorable to humans. This is especially important for the flower business. In recent years, research on morphogenesis in higher plants has been rapidly developed by molecular biological techniques.
  • a bacterium called Agrobacterium rhizogenes that infects plants and induces hairy roots contains a giant plasmid called Ri, a part of which is integrated into the plant genome. It has been reported that various forms of morphological changes were observed when three genes called rol A, B, and C in this Ri brassmid were each incorporated into tobacco (Schmulling et al., EMBO J. 7, 2621). . In particular, rol C has been shown to be a gene that increases cytokinin, one of the plant hormones (Estruch et al., EMBO J. 10. 2889).
  • Transformants produced by this gene show changes such as shortening of internodes, reduction of plant height, overhanging styles, increase in number of flowers, and promotion of flowering time.
  • Some companies have already used rol C to develop roses and dwarf eustoma with an increased number of flowers.
  • SAHH binds to cytokinin, a plant hormone, in plants (Mitsui et al., Plant Cell Physiol. 34, 1089).
  • SAHH is an enzyme that catalyzes the next reaction.
  • S- adenosylhomocysteine cystine (SAH) + H 2 O ⁇ methylation at adenosine + homocysteine intracellular microorganisms, both flora and fauna proceeds S- adenosyl-methylol O Nin a (SAM) as a methyl group donor .
  • SAM after donating the methyl group becomes SAH.
  • SAHH an enzyme that hydrolyzes SAH
  • SAHH is a key enzyme that controls the concentration of SAM and SAH in the living body and plays an important role in the methylation reaction. Since several other proteins that bind to cytokinin have been found, it is unclear whether SAHH is a receptor for cytokinin to directly exert bioactivity. However, it is presumed that SAHH is deeply involved in the expression of the physiological activity of cytokinin, and that the endogenous cytokinin concentration regulates the methylation reaction involving SAHH. However, since the above report does not describe any data on the effects of binding of SAHH to cytokinin, it cannot be speculated. On the other hand, the results of the examples of the present invention show that the effect of binding of SAHH to cytokin is opposite to what was estimated in the paper, and that the concentration of SAHH regulates the degree of endogenous cytokinin. It is suggested.
  • Nucleic acid analog Inhibits viral DNAZRNA synthetase and reverse transcriptase.
  • Practical anti-AIDS drugs include dideoxythymidine (ddC), azidothymidine (AZT), and dideoxyinosine (ddl). These can be expected to be effective in terms of their operation, but also have large side effects.
  • antiviral drug R & D The current focus of antiviral drug R & D is on antisense drugs and viral transcription factor inhibitors.
  • drugs for treating eye virus diseases caused by cytomegalovirus and herpesvirus developed by ISIS in the United States have been conducted until clinical trials.
  • a characteristic of antisense drugs is that they specifically target one target.
  • Others are being studied, such as protease inhibitors that inhibit viral proteases.
  • All of the above antiviral agents are characterized by targeting the virus itself.
  • controlling a virus that continues to grow in cells requires not only a considerable amount of drug, but also the ability of the virus to mutate or inactivate the drug to escape from it. There must be.
  • One of them is the SAHH inhibitor, which inhibits intracellular methylation by inhibiting the host's SAHH. As a result, the cap structure is inhibited, and viral translation is suppressed.
  • Sufficient antiviral properties have been confirmed in in vitro experiments at SAHH inhibitor concentrations at which no phytotoxicity was observed (Wolfe et al., J. Med.
  • RNA virus and double-stranded RNA virus are effective, and that some (+) RNA viruses and DNA viruses are also inhibited.
  • SAHH inhibitors that are effective against retroviruses such as the AIDS virus have been reported.
  • An object of the present invention is to solve these problems of the prior art and to provide an organism having various excellent properties by using gene recombination technology.
  • the virus resistance imparting according to the present invention has such a property that it can be expected to be effective against a plurality of viral diseases, which cannot be achieved by conventional techniques.
  • the type of promoter or controlling the degree of antisense inhibition it is possible to minimize the negative effects of inhibiting the expression of the endogenous SAHH gene and to confer practical virus resistance to plants. it is conceivable that.
  • the morphological changes of the plant according to the present invention Similar to C, the mechanism of influence on the amount of endogenous cytokinin is thought to be completely different. Moreover, for example, it has been found that a wide range of virus resistance has been conferred, mainly due to inhibition of methylation, so that an effect far exceeding that observed in r01C plants has been observed. I have. Furthermore, considering that it is an antisense inhibition, expression in the sense direction may induce a completely opposite trait. For example, suppression of side buds and promotion of aging have the potential to be realized sufficiently by devising promoters. Further, when the present invention was realized by antisense inhibition as in the Examples, the transformant did not produce any new exogenous protein, and thus it was considered to be advantageous for obtaining public axebutans. Can be
  • the present inventors have conducted intensive studies on a method for producing an organism using gene recombination technology, and as a result, by suppressing the expression of the SAHH gene present in the genomic gene of the organism, various excellent methods have been developed.
  • the present inventors have found that an organism having excellent characteristics can be produced, and have completed the present invention.
  • the present invention relates to a transformed organism wherein the expression of the SSAHH ⁇ gene present in the genome is substantially suppressed by recombination of the genome ⁇ gene, and a method for producing the same.
  • the present invention will be described in detail.
  • the transformed organism of the present invention may be any organism as long as it can suppress the expression of the SAHH gene, such as a plant severely damaged by a plant virus, or a young or dwarfed male. Plants that want to introduce traits such as fertility and number of flowers, or animals that need serious virus disease control can be targeted.
  • SAHH is generally present in living organisms and that the difference in the nucleotide sequence between species of the gene is small, as described later. Specific species are as follows. Examples of animals include experimental animals such as rats and monkeys.
  • suitable plants include dicotyledonous plants such as tobacco, tomatoes, potatoes, and roses, but monocotyledonous plants such as corn, rice, and lily can also be included in the present invention. Further, not only angiosperms but also gymnosperms can be the target organisms of the present invention.
  • the transformed organism of the present invention is characterized in that the expression of the SAHH gene present in the genome is substantially suppressed. By suppressing the expression of the SAHH gene, the following changes occur in vivo.
  • dwarfing For example, dwarfing, promoting rooting, stigma, immature pollen, etc.
  • the transformed organism of the present invention is produced by recombination of genomic genes.
  • “recombination of genomic DNA” refers to a genetic engineering performed on the genomic DNA in order to substantially suppress the expression of the SAHH gene present in the genome. It includes all of the technology.
  • Substantially suppressing the expression of the SAHH gene means that SAHH, which functions substantially in cells, is reduced, and a method of suppressing mRNA transcription itself. It includes methods of trapping, and methods of synthesizing proteins that bind to SAHH. Preferred methods for substantially suppressing the expression of the SAHH gene are exemplified below.
  • antisense RNA is expressed against the base sequence of the target gene whose expression is to be suppressed, and a double-stranded RNA is formed to trap the target mRNA.
  • the target gene When the target gene is introduced into the genomic DNA in positive sense, the gene will usually be overexpressed. In some cases, the original mRNA level has been reduced. The mechanism is unknown.
  • Ribozyme is an RNA of at most 50 bases and has an antisense sequence to the target gene. The difference from the above-described antisense is that the target mRNA is cleaved after the formation of the double strand. Moreover, the ribozyme binds to the next target and repeats cleavage.
  • This is a method to prevent the protein factor controlling the expression of the target gene from binding to the transcription control region (promoter) of DNA. Specifically, it destroys the promoter DNA sequence or suppresses the expression of the transcriptional regulator itself.
  • the above-mentioned (1) to (4) are characterized by suppressing the expression of the target gene. This is because the expression of the protein that binds to the already expressed target protein is performed. It is a method of inactivating by making
  • SAHH antisense RNA is RNA complementary to the base sequence of mRNA transcribed from the SAHH gene, and binds to specific mRNA to form double-stranded RNA.
  • the trapped mRNA is no longer translated into protein and is digested by nucleases inside the cell.
  • Antisense RNA can be transcribed by simply ligating the SAHH ⁇ gene in the reverse direction downstream of the vector promoter.
  • the SA HH gene used in the present invention has already been elucidated by the present applicant (Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 4-258292), and its nucleotide sequence is as shown in SEQ ID NO: 1. .
  • SAHH is widely distributed in the microorganism, animal and plant kingdoms, and plays an important role in methylation reactions. The following have been reported on the SAHH ⁇ gene.
  • nucleotide sequences of these genes and the amino acid sequences of the encoded proteins are very well conserved across species (60-70%). This is comparable to the protein ubiquitin, whose amino acid sequence is well conserved in all species.
  • the SAHH gene can be obtained, for example, by the following method. First, a section of tobacco axial epithelium is cultured on Murashig e-Skoog medium (flower bud induction medium) containing force inetine and indoleacetic acid. Next, mRNA was extracted from the obtained cultured tissue according to a conventional method, and a cDNA library was extracted from the extracted mRNA. Create one. Next, using the mRNA extracted from the untreated tobacco floral axis and the mRNA obtained from the above cultured tissue, cDNA probes labeled with a radioactive isotope such as 32 P were respectively prepared. Hybridize the probe with the above cDNA library.
  • Expression promoters include those that have strong transcriptional power and are expressed in all cells (35S, 19S, nos, etc.), those that respond to light (such as rbc), those that respond to temperature (such as hsp), Many are known, such as those that react and those that react tissue-specifically.
  • the issues of which effect of the present invention is expected, which stage of growth it is to be expressed in, and in which tissues it is expressed are important.
  • conferring plant virus resistance preferably, it is expressed in whole cells, particularly preferably a strong one such as the 35S promoter. It is also preferable to use a flower-specific promoter in order to render the plant male-sterile so that other traits are not affected.
  • promoters mainly derived from animal viruses are known as strong promoters. In the case of conferring virus resistance by inhibiting SAHH antisense at the cell level, these strong promoters are preferred.
  • the gene to be inserted by antisense is not particularly limited as long as it encodes SAHH since it has 60% to 70% homology at the nucleic acid level across species.
  • the degree of antisense inhibition is considered to be weak.
  • the SAHH gene to be integrated in antisense does not have to be whole. No. In general, it is considered that the degree of antisense inhibition is higher when the whole is included, but a sufficient effect may be exhibited even when a part is used. However, it is preferable to use a DNA fragment containing AUG as a translation initiation site.
  • the choice of expression vector used to transform animals and plants can vary depending on the cellular or individual level.
  • the basic structure (gene cassette) for inserting the target gene between the promoter and the terminator is the same, but a vector is created in which the base sequence necessary for integration into host DNA is located outside the gene cassette. ing.
  • the vectors RB (light border) and LB (left border) used in the agrobacterium-mediated method are applicable, and in animals, the retroviral vector LTR (long terminal repeat) is used.
  • the method of introducing the antisense SAHH gene into the host organism does not require a special method. In plants, it can be carried out by the leaf disk method using Agrobacterium, and in animals, ribosomes can be used. It can be performed by an election port poration, a microinjection method, or the like.
  • a transformed organism can be obtained as follows. The antisense SAHH gene is inserted into a suitable plant expression vector, and this vector is introduced into Agrobacterium. Next, a leaf disk collected from a sterile vegetable of a plant to be transformed is immersed in the above-described culture of Agrobacterium, and a callus is formed. Transformants can be obtained by selection.
  • Transformants can be selected by adding an appropriate antibiotic to a medium for forming a callus and determining whether or not the medium has resistance. It is said that the transformation method using Agrobacterium is applicable only to dicotyledonous plants such as tobacco, and not to monocotyledonous plants (De Cleene M. 1976; Bot. Rev. 42: 389-4 66), according to the method described in International Publication No. WO 94/00977 and Japanese Patent Application No. 6-27320 previously filed by the present applicant.
  • a monocotyledonous plant can be transformed by immersing a cultured tissue in the process of dedifferentiation or a dedifferentiated cultured tissue with a culture solution of a bacterium belonging to the genus Agrobacterium.
  • a known method is used. It is possible to transform. For example, pine, poplar, and eucalyptus have already established stable technologies. It is possible to introduce the gene into other trees by devising the conditions of tissue culture and the transformation method.
  • tree tissue culture refer to p60-p73 of Plant Biotechnology (Tokyo Kagaku Dojin). Transformation of poplar using agrobacterium is reported in Confalonieri et al., Plant Cell Report 13 '256-261 (1994).
  • SAHH gene is incorporated into a plant or animal expression vector so that it can be transcribed as mRNA with its base sequence unchanged.
  • the availability of the SAHH ⁇ gene and the selection of the promoter are as described in (1) above.
  • the probability of achieving SAHH expression inhibition by this method is considered to be fairly low.
  • the exact mechanism is unknown.
  • the introduced nucleotide sequence is significant, and transcription from the promoter is irrelevant.
  • the present invention includes SAH H gene disruption by homologous recombination. Specific examples of the case where a plant is transformed at the individual level so as to express the positive sense S AHH will be specifically described below.
  • the commercially available plant expression vector pB1121 (Toyobo) is cut with an appropriate restriction enzyme to remove the GUS G gene. For example, simultaneous cutting is performed at Sma I and S st I.
  • SAHH cloned into the Ec0RI site of commercially available plasmid SK + (Toyobo) is cut out with SmaI and SstI so as to generate the same cohesive end. At this time, confirm that the SmaI side is the 5 'end of SAHH and that the Smal and Sstl sites are not present in the SAHH gene.
  • the ribozyme is composed of an RNA of at most 50 bases in length and having a phase capture sequence for binding to the target S AHH RNA and a conserved sequence and a higher-order structure (hairpin) required for cleaving the RNA. Mold, hammerhead mold, etc.).
  • the nucleotide sequence is designed so that it binds to and cuts the SAHH gene mRNA as functional RNA, and a DNA fragment having that sequence is synthesized.
  • the gene is ligated to a promoter in a plant or animal expression vector as described above and incorporated into the genome DNA.
  • studies at the cellular level in animals may be used as follows.
  • the ribozyme DNA is cloned downstream of a general transcription vector promoter (T7, ⁇ 3, SP6, etc.), and a large amount of ribozyme molecules are synthesized in an in vitro transcription system. Allow it to be taken directly into cells. Furthermore, it is technically possible to chemically synthesize ribozymes. At this time, the effect can be expected to be further enhanced by synthesizing using a derivative that becomes nuclease resistant. The procedure for knocking out the S gene of a plant individual by this method will be specifically described below.
  • the target site is determined so as to form a secondary structure as shown in FIG. What are the lengths of stem I and II I? ⁇ 10 bases are preferred.
  • the following ribozyme can be designed.
  • a DNA sequence containing the ribozyme sequence is synthesized using a DNA synthesizer with two oligonucleotides, a sense strand and an antisense strand. At this time, it is advisable to add an appropriate restriction site to the 5 'end in order to incorporate it into the vector later.
  • DNA synthesis can be performed using a commercially available DNA synthesizer, for example, ABI model 380A.
  • the two DNAs are mixed and annealed to obtain double-stranded DNA.
  • restriction enzymes for example, the 35S promoter of pBI121 Clone downstream.
  • the plant is transformed using the recombinant brassmid thus obtained.
  • the transformation method here can be performed in plants by the leaf disk method using Agrobacterium sp. Mouth poration, microinjection, etc. can be used.
  • the ribozyme designed here is an example, and the S AHH mRNA can be cleaved at another location.
  • a zymomic library is first prepared using lambda phage vector EMBL 3 (Stratagene) or the like. The above library is screened using a probe obtained by labeling an SAHH cDNA clone with a commercially available random primer labeling kit (Takara Shuzo). The method for preparing this library and the screening method are as described in detail in JP-A-5-236964.
  • epithelial cells of the tobacco floral axis were cultured in Murashige-Skoog medium containing inetine, indoleacetic acid, sucrose, thiamine hydrochloride, and myo-inositol, and then total RNA was extracted from the tissue fragments.
  • To collect a polyRNA and construct a cDNA library from the polyA RNA.
  • cDNA probes were prepared from the poly-A RNA obtained from the cultured tissue and the poly-A RNA extracted from the untreated flower stem, respectively, and obtained from the cultured tissue from the cDNA library. Select a clone that hybridizes only with the probe obtained and does not hybridize with a probe obtained from untreated tissue.
  • the nucleotide sequence of the obtained genomic clone is determined by a conventional method (for example, using a DNA sequencer of ABI), and the promoter region is specified. Next, if this promoter region is destroyed by homologous recombination technology or the like, transcription of the SAHH gene will be completely stopped.
  • Homologous recombination technology also known as gene targeting, is a technology that utilizes the phenomenon of accidental recombination during gene replication by incorporating the same sequence as the base sequence to be destroyed into DNA. It is. Specifically, for example, a target promoter region is incorporated into genomic DNA by the method described above in (2).
  • the presence of a protein that binds to one region of the promoter is confirmed by gel shift assay (Gel Rita-Daneon Atsushi), etc., and the protein (transcription factor) is purified and purified by column chromatography.
  • a probe for detecting a gene encoding this protein is prepared from the purified protein, and the gene is separated using the probe.
  • the expression of the transcription factor protein gene is suppressed using the isolated gene fragment.
  • the experimental procedure for purifying and purifying the transcription factor protein can be performed, for example, in accordance with the experimental example described in “Lab Manual: Functional Analysis of Plant Genes” (Maruzen), p.83-109. That is, first, the nuclear fraction is isolated from the plant tissue by centrifugation. To this is added NaC1 to extract the nuclear protein. The supernatant is collected by centrifugation at 25,000 X g for 30 minutes, and the supernatant is dialyzed against a dialysis buffer to obtain a nuclear extract. Next, a DNA fragment containing the promoter region of the SAHH gene is recovered from the gel by electrophoresis. Label the DNA ends with [ 7-32P ] ATP and polynucleotide force.
  • a sequence that binds to a promoter protein is determined by a DNAse I footprint method or the like, and an oligonucleotide having the sequence is determined.
  • the latter method can be performed, for example, as follows. After determining a part of the amino acid sequence of the protein using an ABI protein sequencer according to its operation manual, the base sequence of the gene is predicted from the information. At the same time, mRNA is prepared from a tissue that frequently expresses SAHH, and a cDNA library is created.
  • the method for preparing the cDNA library is as described in JP-A-4-258282. That is, after culturing epithelial sections of tobacco floral axes in Murashige-Skoog medium containing inetine and indoleacetic acid, total RNA was extracted from the tissue pieces, and poly-A RNA was collected using an oligo dT cellulose column. Then, cDNA is synthesized from the poly A RNA to prepare a cDNA library. A part of the gene is amplified by the PCR method and the library is screened using the DNA fragment as a probe or using an oligonucleotide as a probe.
  • the standard PCR response is as follows.
  • the base sequence corresponding to the 5 'end and the 3' end (the 3 'end side is a phase capture chain) is predicted from the amino acid codon, and a mixed primer is synthesized so that the number of combinations is reduced as much as possible.
  • adding a restriction enzyme site is convenient for subsequent cloning.
  • the composition is 67 mM Tris-HCl buffer (PH 8.8), 16.6 mM ammonium sulfate, 6.7 mM magnesium chloride, 10 mM mercaptoethanol, 200 mM dNTPs, 1 mM each.
  • g Primer and 5 units of tack polymerase (Takara Shuzo).
  • Such a reaction solution was heated at 92 ° C for 1.5 minutes using a DNA thermal cycler (Takara Shuzo), then left at 45 ° C for 2.5 minutes, and further heated at 72 ° C.
  • One cycle of the reaction for 3 minutes is repeated 25 times.
  • the amplified DNA fragment is recovered by agarose gel electrophoresis, and is labeled with an isotope as described above and used as a probe.
  • isotope labeling of oligonucleotides is carried out by a conventional method, but can be easily carried out by using, for example, Takara Shuzo's megalabel kit.
  • the DNA sel footprint method is used to identify the binding region of nuclear proteins. This method is used in detail, and its contents are described in detail in the above-mentioned “Lab Manual: Functional Analysis of Plant Genes” (Maruzen). That is, first, a DNA fragment whose one end is labeled with 32 P and a nuclear extract are mixed, and then partially digested with an appropriate amount of DNase I. Next, the partially digested DNA sample is electrophoresed on a denaturing polyacrylamide gel, and autoradiography is performed. At this time, a ladder-like band is obtained for each base, but the region where the protein specifically binds is protected from cleavage by DNase I, so the band intensity is higher than that of the other regions. Weaker or not at all. By simultaneously running samples for nucleotide sequence determination, the protein binding region can be estimated.
  • the method for suppressing the expression of the transcription factor protein is preferably a method as described in (1) to (3) above, and particularly preferably, because of the simplicity of the technique.
  • p148-p151 can be carried out by a known method. If monoclonal antibody hybridomas can be obtained, use them. The mRNA is adjusted and, for example, a kit (Rec Obtain the recombinant antibody gene using omb 1 nant Phag'e Antibody System). You can easily obtain the target gene if you follow the manual. As described above in (2), in order to overproduce the gene in a cell, the gene is inserted downstream of the promoter of the expression vector in the sense direction and transformed. The transformation at this time can be performed in the same manner as in the above method.
  • the SAHH ⁇ gene isolated from tobacco was ligated downstream of the 35S promoter of the plant expression vector with antisense so as to be expressed in all cells.
  • This recombinant DNA was introduced into tobacco genome by a transformation method using Agrobacterium.
  • the obtained transformed tobacco was analyzed in 100 or more individuals.
  • individuals obtained from R1 seeds by selfing or artificial crossing were also analyzed. The main changes observed in the characteristics are shown below. Most were expected from the principles detailed in "Means to Solve the Problem".
  • the discovery that the suppression of SAHH ⁇ gene expression by antisense inhibition was linked to plant virus resistance is a fact that SAHH inhibitors are being actively studied in animal viruses for use as antiviral agents.
  • the present invention which has been demonstrated to be effective with plant viruses, is expected to be easily applicable to animal viruses. Therefore, the suppression of SAHH expression at the gene level according to the present invention is not limited to plants.
  • the axial epithelial section of tobacco was cultured for one day on Murashige-Skoog agar medium containing force ricetin (1 / M) and indoleacetic acid (1 / M).
  • 10 g of the obtained cultured tissue was disrupted in 20 ml of an extraction buffer (4 M guanidine thiosinate, 5 mM sodium citrate, 0.5% sarkosyl, 2 mM ⁇ -mercaptoethanol) using a polytron homogenizer. Then, the lysate was separated by centrifugation at 4000 xg for 20 minutes, and the supernatant was recovered.
  • the supernatant was placed on 4 ml of a 5.7 M cesium chloride solution placed in a centrifuge tube, centrifuged at 28000 rpm for 20 hours, separated, and the supernatant was discarded to collect a precipitate.
  • This precipitate was dissolved in 1 ml of a buffer solution (10 mM Tris-HC1, ImM EDTA, 0.1% SDS), and an equal amount of phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1) was added. The upper aqueous phase was recovered by centrifugation.
  • RNA solution was dissolved in 500 ul of TE buffer (10 mM Tris-HCK ImM EDTA) to obtain a total RNA solution. After treating this RNA solution at 65 ° C for 5 minutes, it was rapidly cooled on ice. To this was added a 0.5 M sodium chloride solution and applied to an oligo dT cellulose column pre-equilibrated with TE buffer. Next, the column was washed with about 10 volumes of a buffer (0.5 M sodium chloride, 10 mM Tris-HC1, ImM EDTA), and then poly (A) + RNA was eluted with a TE buffer.
  • TE buffer 10 mM Tris-HCK ImM EDTA
  • [3] Library screening Poly obtained from the above cultures (A) + RNA2u and [alpha-32 P] d CTP (3000 Ci / Mi Rimoru, 10 Ci / ul) and 10 ul, reaction of 30ul (50mM Tris-HCl (pH 7.6) , 2mM DTT, 5mM MgCl 2, 40mM KC1, lmM d GTP, d ATP and d TTP, 5uMd CTP, 20 Yuni' bets human placental RNA se inhibitors, 2 ug O oligo dT primer -, 40 Yuni' preparative reverse transcriptase) The reaction was carried out at 37 ° C for 1 hour to prepare a cDNA probe.
  • a cDNA probe was prepared in the same manner for poly (A) + RNA extracted from the untreated flower axis.
  • Escherichia coli was infected with the phage constituting the above cDNA library and grown on LB agar medium, and DNA of about 1,400 phages was copied onto two nylon membranes.
  • the nylon membrane on which the phage DNA was copied and the cDNA probe prepared above were combined with 6 XSSC (0.9 M sodium chloride, 0.09 M sodium citrate), 0.1% SDS, 5 x Denhardt's solution (0.1% Ficoll, Hybridization was carried out at 65 ° C for 20 hours in a solution containing 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% serum albumin) and 50 ug / ml denatured salmon sperm DNA. Thereafter, the membrane was taken out and washed at 65 ° C. for 1 hour using a solution containing 2 ⁇ SSC and 0.5% SDS. After drying the membrane, an X-ray film was brought into close contact and exposed.
  • 6 XSSC 0.9 M sodium chloride, 0.09 M sodium citrate
  • SDS 5 x Denhardt's solution
  • 5 x Denhardt's solution 0.1% Ficoll
  • Hybridization was carried out at 65 ° C for 20 hours in a solution containing 0.1% polyvin
  • the tobacco S AHH ⁇ gene was inserted into the Sma I—Sac I site of the plant expression vector PB1121 (Toyobo) so as to express it in an antisense manner.
  • PB1121 Toyobo
  • transformation of coconut was carried out by leaf disk method using agrobacterium.
  • transformant BY-4 tobacco may be abbreviated as "SHB” and transformant X anthinc tobacco may be abbreviated as "SHX”.
  • SHB transformant BY-4 tobacco
  • SHX transformant X anthinc tobacco
  • the cells were cultured for about 2 days in an antibiotic-free medium to infect them, the leaf disks were washed, and the transformed cells were selected by placing them in an antibiotic-containing medium. Selection was carried out on Murashigesk-Ig medium containing 100 gZml and 250 tgZml, and transformants were grown under illumination at 25 ° C for 16 hours. What was used was transferred to a rooting medium and rooting was induced. As a rooting medium, Murashige squeegee medium was used, and most of the potted individuals had vigorous buds and were able to easily point to cloned individuals.
  • the internodes were shorter and dwarfed compared to the non-transformants, a tendency that was particularly strong in BY-4, with few stems, and some individuals that bloomed in a zetta-like manner.
  • the flowers generally arrived about a week earlier, and the number of flowers increased two- to three-fold, from the light pink color of tobacco to the squeezed red to even deep red.
  • the appearance characteristics of the transformed tobacco will be described below with reference to the drawings.
  • Figure 2 shows the appearance of the transformant Xanthinc tobacco before flowering.
  • the plants in the center and right are transformants, which have more side shoots and darker green leaves than the non-transformants on the left.
  • Figure 3 shows the appearance of the transformant X anthinc tobacco (Fig. 3a) and the transformant BY-4 tobacco (Fig. 3b) with flowers. In each case, the right clause Transformants are short and dwarf.
  • Fig. 4 shows a transformant Xanthinc tobacco with an abnormally large number of buds and many flowers.
  • FIG. 5 shows the flower portion of the transformant Xanthinc tobacco.
  • the stigma was observed to protrude from the flower (male sterility) in about 1/3 of the transformants. ⁇ The pollen of these individuals is also immature and has extremely low germination ability.
  • Table 1 shows the number of flowers of the transformant Xanthinc tobacco.
  • the numerical values in the table are the average values measured for 10 individuals. As described above, since the transformant 1-3 does not have fertility, those individuals were excluded from the target of the seed capsule number measurement.
  • Table 2 shows a detailed observation of 20 individuals, each of tobacco BY-4 and X anthinc, the degree of dwarfism, the number of side buds, and the degree of stigma protrusion This is a summary of
  • Length is less than 1/1/10 0 4
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, a tobacco SAHH ⁇ gene was inserted into a plant expression vector pB1121 so as to express it in an antisense manner. Using the obtained recombinant plasmid, petunia (cultivar: HI and No. 22) was transformed. Transformation was performed by the leaf-disc method in the same manner as in Example 1, except that acetoxyringone was added to the co-culture medium in order to promote the infection of Agrobacterium with petunia leaves.
  • a 35S promoter region was amplified by PCR.
  • the primer sequence and reaction conditions used are as follows.
  • Figure 9 shows the swimming pattern. Arrows in the figure indicate DNA fragments containing the 35S promoter sequence. As shown in FIG. 9, the DNA fragment was detected in the transformants H1-DH and 22-DH, whereas the DNA fragment was detected in the non-transformants H1-DH and 22-C. Is not detected. Therefore, the detection of this DNA fragment confirms that the plant has been transformed.
  • FIG. 1 shows the appearance of the inoculated leaves of transformed Xanthinc tobacco (left plant) and untransformed Xanthinc tobacco (right plant).
  • CMV-N Xanthus mosaic virus N strain
  • CMV-N was inoculated on two leaves, one inoculated to the largest leaf and one inoculated to the leaf one sheet above the largest leaf.
  • SHX-31, SHX-32, SHX-34, SHX-35, SHX-36, SHX_37, SHX-38 only one clone individual was subjected to the experiment.
  • Two clones of the SHX-33, SHX-39 and SHX-40 lines were subjected to the experiment.
  • Non-trait For the transformants the number of lesions was counted for 5% of the transformants, and the average value was calculated.
  • the numbers in parentheses in the table are the percentage of the number of lesions in each strain, based on the number of non-transformed lesions. The difference between the transformants and the non-transformants was significant by analysis of variance (AN OVA).
  • PVY potato virus Y
  • the numerical values in the table are the amounts of PVY in plant tissues measured by the ELISA method. The difference was significant by analysis of variance (ANOVA).
  • yeast transposon Ty1 replicates and forms particles very similar to animal retroviruses, this system can be used to conduct retrovirus research ⁇ ⁇ ⁇ antiviral drug development research model experiments ( Natsoulis et al., Nature 352, 6 32).
  • Propagated Tyl incorporates its own sequence into the yeast nucleus DNA (transposition).
  • SAHH ⁇ gene which is expressed in antisense, is introduced into yeast in advance, S AHH synthesis occurs. Therefore, it is considered that the frequency of transposition of Ty1 decreases depending on the degree of the inhibition. Therefore, by examining the transposition frequency, it is possible to know the degree of inhibition of the expression of the SAHH ⁇ gene.
  • the transposition frequency can be determined by introducing a plasmid containing a Ty1 clone and a neomycin-resistant marker ⁇ gene into yeast, culturing the yeast, and then spreading the culture on a neomycin-containing medium.
  • Yeast YPH499 (a) (manufactured by Stratagene) was suspended in water so that the cell concentration was 6 xlOl fl . This was taken in a cuvette with a gap of 0.2 cm and mixed with the retrotransposon Tyl clone and the plasmid PJEF16878 containing the G418 resistance gene. This brassmid p JEF16678 was provided by Dr. Boeke of the United States. The yeast suspension mixed with brassamide was set in an electric letter (Biopulse Gene Pulser), and 0.6 kV, A single pulse at 25 ° F was applied to introduce the plasmid pJEF1678 into the yeast YPH499 (a).
  • the tobacco SAHHit gene was subcloned (pYEUra3_TobSAHH) into the BamH Xhol site of the yeast plasmid pYEUra3 (manufactured by Clonetech) so that it was transcribed and expressed from the gall promoter in an antisense manner.
  • This plasmid was introduced into yeast YPH500 () (Stratagene) in the same manner as in the above-mentioned PJEF16678.
  • the two strains of yeast into which the plasmid had been introduced in this manner were mated in a minimal synthetic medium for galactose lacking histidine and peracil, and cultured at 30 ° C for 2 days in the presence of the two plasmids.
  • the mated yeast was cultured at 22 ° C for 5-7 days in a minimal glucose synthetic medium lacking histidine and peracil to form colonies. At this time, transposition is induced.
  • the resulting colonies were transferred to a minimal glucose synthetic medium lacking histidine and peracil, and cultured at 30 ° C for 2 days, and then overnight culture at 30 ° C in a synthetic glucose liquid medium lacking only peracil. This treatment results in cells that have shed pJEF16678.
  • the obtained culture solution was diluted with water, spread on a solid medium of glucose lacking only peracil, and cultured at 30 ° C. for 2 days.
  • the yeast after cultivation streaked on the minimum glucose synthetic medium lacking only PERAcil and the minimum synthetic glucose medium lacking histidine and uranium, and did not grow on the minimum synthetic medium of glucose lacking histidine and PERIL, but only PERAXIL
  • By selecting colonies that grew in a glucose-synthesizing minimal medium lacking the yeast only those yeasts from which plasmid pJEF16678 had been eliminated were selected.
  • the reason for selecting the yeast from which brassamide was eliminated was that neomycin resistance had to be derived from transposition, not from brasmid.
  • yeast selected by the above method was streaked in a glucose medium lacking Peracil and supplemented with 500 g / ml of antibiotic G4 18 to count G4 18 resistant colonies and sensitive colonies.
  • yeast YPH499 (a) into which pYEU ra3 was introduced in place of pYEU ra3—Tob S AHH was cultured in a medium containing the AAHH inhibitor aristolomycin. G418 resistant colonies and sensitive colonies were counted as described above.
  • Table 5 shows the results. Table 5 Effect of T A1 transposon S AHH inhibition Aristolomycin concentration Number of resistant colonies Number of sensitive colonies Inhibition rate
  • the amount of endogenous cytokinin in the transformed tobacco was measured. That is, the root exudate of tobacco was collected, and a medium component was added thereto, followed by bioassay using tacallus.
  • A shows the amount of cytokinin in the transformed Xanthinc tobacco
  • B shows the amount of cytokinin in the untransformed X anthinc tobacco
  • C shows the addition of anti-cytokinin to the vascular fluid to suppress the cytokinin activity. Shows the amount of cytokinin in each case. As shown in the figure, the cytokinin amount (A) of the transformant is about three times as large as that of the non-transformant (B).
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Nicotiana tabacum (Nicotiana tabacum)
  • Tissue type Flower axis (cultured tissue)
  • cDNA library from tobacco stem culture tissue Array cDNA library from tobacco stem culture tissue Array
  • CAC ACT C TC CAG CAG TAT TCC TCC TCT ACT GAG AGG GCA CTT CAC TCC Hi
  • CAA GTC ATT GCC CAA CTC GAG TTG TCC AAT Qkk AAG AGC ACT GGG AAG 1356 TAT GAG AAC AAA CTG TAT GTC TTC CCA AAA CAC CTC GAC GAG AAC CTT
  • the present invention provides an organism in which the expression of the SAHH gene is substantially suppressed.
  • Organisms in which expression of the SA HH gene has been substantially suppressed have excellent characteristics such as virus resistance and are industrially useful.
  • FIG. 1 is a photograph showing the morphology of an organism of transformed Xanthinc tobacco, and shows a local lesion when the transformant was inoculated with tobacco mosaic virus.
  • FIG. 2 is a photograph showing the morphology of the transformed Xanthinc tobacco organism, showing the appearance of the transformant.
  • FIG. 3 is a photograph showing the morphology of the transformed Xanthinc tobacco organism, and shows the appearance when the transformant is flowered.
  • FIG. 4 is a photograph showing the morphology of the transformed Xanthinc tobacco organism, which shows an abnormally large number of shoots and many flowers.
  • FIG. 5 is a photograph showing the morphology of the transformed Xanthinc tobacco organism, showing the flower portion of the transformant.
  • FIG. 6 is a photograph showing electrophoresis of mRNA extracted from transgenic tobacco.
  • FIG. 7 is a diagram showing the amount of endogenous cytokinin in transformed tobacco.
  • FIG. 8 is a diagram showing a hammerhead type ribozyme used in the present invention.
  • FIG. 9 is a photograph showing electrophoresis of DNA extracted from transformed petunia.

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Description

明糸田
S—アデノ シルホモシスティンハイ ドロレース遗伝子の発現を抑制した生物
発明の技術分野
本発明は、 遗伝子組み換え技術を用いて、 S—アデノ シルホモシスティンハイ ドロレース （以下、 「S A H H」 という。 ） 遺伝子の発現を実質的に抑制するこ とによって得られる種々の特性を有した形質転換生物、 及びその作出方法に関す る。
発明の背景技術
(植物への利用）
植物の改良 （好ましい形質の導入） は、 これまで野生種や突然変異体とのかけ あわせによる古典的育種法に大きく依存してきた。 現在市場にでまわつている花 卉、 野菜栽培用の品種のほとんどは、 こうした育種家の努力によって作出された ものである。 しかし、 野生種の遺伝子源が存在しないため育種がいっこうに進ま ないことは稀ではない。 たとえ遺伝子源が存在したとしても育種には総じて長期 間を要するため、 近年、 遺伝子工学的手法による植物の改良が盛んに試みられる ようになつてきた。 例えば、 ウィルス病抵抗性の品種を従来の育種法で付与する ことは、 適当な遺伝子源が見つからなかったり、 野生種とのかけあわせが容易で なかったり、 多くの困難を伴う。 また、 植物ホルモンの微妙なバランスを調節し てわい性植物を作出したり、 花数を大幅に増大させたりするなどのドラスチイ ッ クな改良は従来の育種法ではほとんど不可能である。 近年、 遺伝子組み換え技術 や植物組織培養技術が発展し、 この技術を使ってウィルス抵抗性植物やわい性植 物の作出が可能になつてきた。 現在までに試みられた主な戦略は以下の通りであ る o
( 1 ) ウィルス抵抗性植物の作出
1 ) ウィルスコートタンパク遗伝子の導入
1 9 8 6年に Powe l Abel ら （Sci ence 232, 738) によって、 タバコモザイク ウィルス （T M V ) のコートタンパク遗伝子を導入した植物体が作出され、 これ が TMV抵抗性となることが示された。 それ以来世界中で種々の植物とウィルス の組み合わせにおいて同様の報告が数多くなされている。 ただし、 この方法によ つて得られた形質転換体は、 導入されたコートタンパクのウィルスに対して （あ るいはきわめて近縁種） のみ抵抗性となる。 また、 その抵抗性の程度は接種濃度 に大きく左右される。
2 ) サテライ ト RN Aの利用
いくつかのウィルスにはサテライ ト RN Aと呼ばれる低分子 RN Aが存在する c このサテライ ト RNAは、 親ウィルスにその複製を依存し、 多くの場合、 増殖を 阻害して親ウィルスの誘導する病徴を著しく軽減する。 この性質を応用してウイ ルス抵抗性植物を作出することが可能である。 これまで、 サテライ ト RNAの c DN Aを植物に導入することによって、 キユウリモザイクウィルス （Harissonら、 Nature 328， 799) とタバコ輪点ウィルス （Gerlach ら、 Nature 328， 802) に 対して抵抗性植物が作出された。 中国では、 既にキユウリモザイクウィルスのサ テライ ト RNAの c D N Aを組み込んだ植物体が実用化のための圃場試験に供さ れている （Saito ら、 Theor, Appl. Genet 83, 679) 。 ただし、 この方法が適用 できるのは、 サテライ ト RN Aを有するウィルスに限定される。
3 ) アンチセンス RN Aの利用
ウィルスの c DN Aの全部あるいは一部をァンチセンスで転写発現するように 植物体に組み込む。 ターゲッ トのウィルスが感染したときに、 アンチセンス RN Aとウィルスの核酸が複合体 （二本鎖 RNA) を形成し、 タンパク合成が阻害さ れると考えられ、 結果としてウィルス增殖を抑える。 し力、し、 ウィルス RNAは 細胞内に多量に存在する上、 複雑な高次構造をとっていることから複合体の形成 が容易とは考えられず、 その効果は、 期待に反してそれはど大きくない （Cuozzo ら、 Bio/Technology 6, 549) 。 また、 ウィルス抵抗性はあったとしても、 コー トタンパクの方法と同様、 c DNAの由来となったウィルスのみ （あるいは近縁 種） に期待できるにすぎない。
4 ) リボザィムの利用
リボザィムは、 自己触媒切断する RNAでこれが植物細胞内で転写発現したと きに、 ウィルス RNAを特異的に切断するよう塩基配列をデザインすることが可 能である。 これもアンチセンス RNA同様、 効果を発揮するためにはウィルス核 酸と複合体を形成する必要がある。 成功例は多くないが、 例えば、 Edingtonらが タバコモザイクウィルスをターゲッ トにして効果があつたと報告している （"Vir al Gene and Plant Pathogenesis")0
5) 非構成タンパク遗伝子の導入
最近、 ウィルスの複製酵素遗伝子の完全な c DNAあるいは変異をいれたもの を組み込んだ形質転換体が高度ウィルス抵抗性になることがいくつかのウィルス で報告されている （Golemboskiら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6311; Car r ら、 Virology 199, 439) 。 ただし、 この方法では、 ターゲッ 卜としているゥ ィルスの系統が異なる場合、 抵抗性が容易に打破される例も報告されている （Za irl in ら、 Virology 201, 200) 。
(2) 内在性サイ トカイニン濃度を変化させて植物の形態を変える
植物の形態形成を人為的にコントロールすることができれば、 人間にとって好 ましい形に植物を改良することができる。 これは特に花ビジネスにとって重要で ある。 近年、 高等植物における形態形成に関する研究は、 分子生物学的手法によ り急速に発展しつつある。
植物に感染して毛状根を誘導するァグロバクテリゥム · リゾジェネスという細 菌には Riと呼ばれる巨大ブラスミ ドが存在し、 この一部が植物ゲノムへ組み込ま れる。 この Riブラスミ ドにある rol A, B, Cと呼ばれる 3つの遺伝子をそれぞ れタバコに組み込んだところ様々な形態変化が観察されるという報告がある （Sc hmullingら、 EMBO J. 7, 2621) 。 特に rol Cは、 植物ホルモンの一つであ るサイ トカイニンを増加させる遗伝子であることが判明している （Estruch ら、 EMBO J. 10. 2889) 。 この遗伝子による形質転換体は、 節間の短縮、 草丈の 低下、 花柱の突出、 花数の増加、 開花期の促進などの変化を示す。 既に、 企業の 中には、 この rol Cを利用して花数の増加したバラやわい性トルコギキヨウなど の開発を行っているところがある。
最近、 植物において SAHHが、 植物ホルモンの一つであるサイ トカイニンに 結合することが報告されている （Mitsuiら、 Plant Cell Physiol. 34, 1089) 。 本来、 SAHHは、 次の反応を触媒する酵素である。 S—アデノ シルホモシスチン （SAH) +H2 O→アデノ シン +ホモシスチン 細胞内でのメチル化は、 微生物、 動植物を問わず、 S—アデノシルメチォニン (SAM) をメチル基供与体として進行する。 メチル基を供与した後の SAMは, SAHとなる。 従って、 S AHを加水分解する酵素である S AHHは、 生体内の SAM、 S AHの濃度をコン トロールして、 メチル化反応に重要な役割を果たし ているキー酵素である。 他にもサイ トカイニンと結合するタンパクが複数見つか つていることから S AHHがサイ 卜カイニンが直接、 生理活性を発揮するための 受容体であるかどうかは不明である。 ただし、 SAHHがサイ トカイニンの生理 活性発現に深く関与し、 内在性サイ トカイニン濃度が SAHHの関与するメチル 化反応を調節しているものと推測される。 しかし、 上記報告の中には、 SAHH とサイ トカイニンとの結合による効果について、 何らデータが記載されていない ため、 推測の域をでない。 一方、 本発明の実施例の結果は、 SAHHとサイ トカ ィ二ンの結合の効果が論文で推測されたものと逆で、 S A H Hの濃度が内在性サ ィ トカイニン溏度を調節していることを示唆するものである。
(動物への利用）
動物ウィルスの感染や増殖を阻害するために、 現在、 ウィルス病の治療薬とし て使われているものについて以下に説明する。
1 ) ワクチン
ゥィルス抗原に対する動物の免疫系による抗体生産を利用して、 侵入してきた ウィルスを不活化する主として予防的手段である。 近年、 急激に進歩した遺伝子 工学やタンパク工学を駆使して各種ワクチンの改良がなされた （ "生命科学を推 進する分子ウィルス学" 、 石浜ら編、 1992年、 共立出版） 。 しかし、 ウィルスの 中には、 免疫系を巧みに逃れてワクチンが効かないものが多数存在する。
2 ) ィンタ一フェロン
ウィルス感染によって誘導されるタンパクで周辺細胞に作用して、 ウィルス抵 抗性となるよう働きかけるだけでなく、 多岐にわたる生理作用があり、 サイ ト力 インの一つとして考えられている。 日本では、 C型肝炎の治療薬として臨床応用 に効果を上げているが副作用も大きいため、 限定的使用にとどまつている。
3) 核酸アナログ ウィルスの DNAZRNA合成酵素や逆転写酵素を阻害する。 抗エイズ薬とし て実用化されているのは、 ジデォキシチミジン （d d C) 、 アジドチミジン （A ZT) 、 ジデォキシイノシン （d d l) などがある。 これらはその作用操作から 考えると、 薬効を期待できるが副作用もまた大きい。
4 ) その他
現在の抗ウイルス剤研究開発の焦点は、 ァンチセンス医薬とゥィルスの転写調 節因子阻害剤である。 前者の中で、 米国 I S I S社が開発したサイ トメガロウイ ルスやヘルぺスゥィルスによる目のウイルス病の治療薬は、 臨床試験まで行われ ている。 アンチセンス医薬の特徴は、 特異的に一つのターゲッ 卜をねらうところ にある。 その他のものとしては、 ウィルスのプロテアーゼを阻害するプロテア一 ゼインヒビターなどが研究の対象になっている。
5) SAHHインヒビター
以上の抗ウィルス剤は、 すべてウィルスそのものをターゲッ 卜としているとこ ろに特徴がある。 しかし、 細胞内で増殖し続けるウィルスを抑制するためには、 相当量の薬量を必要とするだけでなく、 ウィルスがそれらから逃れるために変異 したり、 薬剤を不活化することに備えておかなければならない。 一方、 ウィルス が感染した細胞の酵素を阻害してウィルスの増殖を抑制しょうとする考えがある。 その一つが S AHHィンヒビターであり、 宿主の S A HHを阻害することによつ て細胞内のメチル化阻害を引き起こす。 その結果、 キャップ構造が阻害され、 ゥ ィルスのトランスレーションが抑えられる。 薬害が観察されない濃度の SAHH インヒビター投与で十分な抗ウィルス性が試験管内の実験で確認されている （Wo lfe ら、 J. Med. C em. 34， 2521) 。 特に （一） R N Aウィルや 2本鎖 R N Aゥ ィルスに効果があり、 一部 （+ ) RN Aウィルスや DNAウィルスも阻害するこ とが報告されている。 最近では、 エイズウイルスなどのレトロウイルスにも効果 がある SAHHインヒビターが報告されている。
発明が解決しょうとする課題
以上のように従来からウィルス抵抗性植物やわい性植物の作出、 あるいはウイ ルス病の治療等に遺伝子組み換え技術が利用されてきたが、 上述したように多く の問題点を有していた。 本発明の目的は、 これらの従来技術の問題点を解決し、 遗伝子組換え技術を用 いて、 種々の傻れた特性を有する生物を提供することにある。
以下に本発明の特徴を従来技術と対比して簡単に述べる。
(植物への利用）
( 1 ) ウィルス抵抗性植物の作出
本発明によるウイルス抵抗性の付与は、 複数のゥィルス病に対して効果が期待 できるという従来技術では達成できない特性を持っている。 今後、 プロモーター の種類を変えたり、 アンチセンス阻害の程度をコントロールすることによって内 在性 S A H H遺伝子の発現阻害による負の影響を最小限にして、 実用的なウィル ス抵抗性を植物に付与できるものと考えられる。
( 2 ) 内在性サイ トカイニン濃度を変化させて植物の形態を変える
本発明による植物の形態変化 （頂芽優勢の喪失、 わい化、 花柱の突出、 未熟花 粉、 花数の増加、 開花期の促進、 老化抑制、 茎からの発根など） は、 上記 r o 1 Cと同様に内在性サイ トカイニンの量に影響を及ぼした結果と考えられる力 そ こにいたるまでのメカニズムは全く異なるものである。 しかも、 例えば、 メチル 化阻害が主因となつて広範なゥィルス抵抗性が付与されていることなども判明し ているため、 r 0 1 C植物で観察されたものをはるかに越える効果が認められて いる。 さらに、 アンチセンス阻害であることを考慮するとセンス方向の発現によ つて全く反対の形質を誘導できる可能性がある。 例えば、 わき芽抑制や老化の促 進などはプロモーターを工夫することによって十分実現できる可能性を持ってい る。 また、 実施例のようなアンチセンス阻害で本発明を実現した場合には、 その 形質転換体は何ら新規の外来タンパクを生産していないため、 パブリックァクセ ブタンスを得るのに有利であると考えられる。
(動物への利用）
本発明の酵母の実施例に示すようなアンチセンス阻害によつて細胞へのウイル ス抵抗性を付与する場合、 細胞毒性があるとすれば、 それは単純に S A H Hの特 異的阻害によるものである。 一方、 S A H Hインヒビターによってウィルスの增 殖を抑える時には、 S A H H阻害の他にもインヒビターそのものが代謝されて細 胞毒性を示すことが数多く報告されている。 発明の開示
本発明者等は、 遗伝子組み換え技術を利用して生物を作出する方法について鋭 意検討を行った結果、 生物のゲノム遺伝子中に存在する S A H H遺伝子の発現を 抑制することにより、 種々の優れた特性を有する生物を作出できることを見出し、 本発明を完成した。
即ち、 本発明は、 ゲノム遗伝子の組み換えにより、 当該ゲノム中に存在する S S A H H遗伝子の発現を実質的に抑制した形質転換生物及びその作出方法である。 以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明の形質転換生物としては、 S A H H遗伝子の発現を抑制することができ る生物であればどのようなものでもよく、 植物ウィルスの被害が甚大な植物、 若 しくはわい化、 雄性不稔、 花数增などの形質を導入したい植物、 または、 深刻な ウィルス病対策を必要とする動物などを対象とすることができる。 このように本 発明が広範な生物種を対象とするのは、 後述するように S A H Hが生物に普逦的 に存在し、 かつ、 その遺伝子の種間における塩基配列の差異が小さいためである。 具体的な生物種は、 以下の通りである。 動物では、 ネズミ、 サル等の実験動物を 挙げることができる。 植物では、 タバコ、 トマト、 ジャガイモ、 バラなどの双子 葉植物を好適な植物として例示することができるが、 トウモロコシ、 イネ、 ユリ などの単子葉植物も本発明の対象とすることができる。 さらに、 被子植物だけで なく、 裸子植物も本発明の対象生物とすることができる。
次に、 本発明の形質転換生物の特徴となる遗伝子若しくは特性について説明す る o
本発明の形質転換生物は、 ゲノム中に存在する S A H H遺伝子の発現が実質的 に抑制されていることに特徴がある。 S A H H遺伝子の発現が抑制されることに より、 生体内では以下のような変化が生じる。
( 1 ) メチル化反応抑制
前述した S A H Hのインヒビターは、 動物ウィルスに対して優れた増殖抑制効 果を示すことが、 数多く報告されている （Wol fe ら、 Med. Chem. 34, 2521) 。 動物細胞に薬害を及ぼさない濃度でのメチル化反応の阻害は、 十分、 ウィルス増 殖を抑制する。 これは、 ウィルス R N Aの 5 ' 末端に付加され、 トランスレーン ョンに極めて重要なキャップ構造が直接メチル化阻害の影響を受けるためと信じ られている。 本発明は、 この現象を S A H Hのインヒビタ一による阻害ではなく. 遗伝子レベルで発現を抑制することによってつくりだしたものである。
このようにメチル化反応抑制は、 動物及び植物にウィルス抵抗性を付与する。 しかし、 形質転換体の外観上のその他の形質に影響を及ぼすかどうかについては, 不明である。
( 2 ) 内在性サイ トカイニン量の増加
本発明の実施例から、 サイ トカイニン結合タンパクでもある S A H Hの発現を 抑制することによつて相対的に遊離型の活性サイ トカイ二ン量が増大することが 確認された （図 7 ) 。 したがって、 サイ トカイニンは S A H Hと結合することに よって不活化状態にあるものと考えられる。 S A H Hの濃度によって調節されて いるサイ トカイニンは、 植物ホルモンであるため微量な変化であっても植物の形 態に大きな影響を及ぼすものと考えられる。 具体的には、 以下のような形質変化 が期待される。
1、 オーキシンとの相互作用 （カルス形成の促進、 細胞の拡大成長、 細胞分裂や 分化）
例えば、 わい化、 発根促進、 柱頭突出、 未熟花粉など、
2、 頂芽優勢の喪失 （わき芽増加）
例えば、 花芽増に伴う花数增、 分けつ增など
3、 老化防止 （葉緑素減衰抑制）
例えば、 光合成能増、 花もちを良くするなど
4、 気孔の開口 （蒸散促進、 光合成促進）
5、 植物ウィルス抵抗性
上記の形質転換体の表現型について、 様々な特性を有するものの中から好まし い形質を獲得したもののみを選抜することができる。
一方、 動物については、 植物ホルモンであるサイ トカイニンが機能分子として 存在しないことと S A H Hインヒビターの研究がまだ細胞レベルから脱していな いことから、 形質転換体の形質変化については不明である。
次に本発明の形質転換生物の作出工程について説明する。 本発明の形質転換生物は、 ゲノム遺伝子の組み換えにより作出される。 本発明 において、 「ゲノム遗伝子の組み換え」 とは、 ゲノム中に存在する S AHH遗伝 子の発現を実質的に抑制するために、 このゲノム DN Aに対してなされる遗伝子 工学的技術の全てを含むものである。
また、 SAHH遗伝子の発現の実質的な抑制とは、 細胞内において実質的に機 能する S A HHを減少させることを意味し、 mRN Aの転写自体を抑制する方法、 転写された mRNAをトラップしてしまう方法、 さらには、 SAHHと結合する タンパク質を合成する方法などを含むものである。 SAHH遺伝子の発現を実質 的に抑制する方法として好ましい方法を以下に例示する。
( 1 ) アンチセンスを用いる方法
これは、 発現を抑制しょうとする標的遗伝子の塩基配列に対してアンチセンス RN Aを発現させ、 2本鎖 RN Aを形成させて檫的 mRN Aをトラップしてしま う方法である。
(2) ブラスセンスを用いる方法
プラスセンスで標的遗伝子をゲノム DN Aに導入した場合、 通常、 その遺伝子 は、 過剰発現することになる。 し力、し、 まれに本来の mRNA量が減少してしま う例が観察されている。 メカニズムについては、 不明である。
(3) リボザィムを用いる方法
リボザィムは、 せいぜい 50塩基の RNAで標的遺伝子に対してアンチセンス の配列を持つ。 上述のアンチセンスとの違いは、 2本鎖を形成した後、 檩的 mR NAが切断されるところにある。 しかも、 リボザィムは次の標的に結合して切断 を繰り返す。
(4) 転写制御因子とプロモーター領域を利用する方法
これは、 標的遺伝子の発現を制御しているタンパク因子が D N Aの転写制御領 域 （プロモーター） に結合できないようにする方法である。 具体的には、 プロモ 一ターの DN A配列を破壊するか転写制御因子そのものの発現を抑制する。
(5) 標的タンパクに結合するタンパクを利用する方法
上述した （1) から （4) では、 標的遗伝子の発現を抑制することを特徴とし ているが、 これは、 既に発現した標的タンパクをそれと結合するタンパクを発現 させることによって、 不活化する方法である。
以上例示した方法の中でも、 本発明においては、 （2) アンチセンスを用いる 方法を適用するのが好ましい。
次に、 上記 （ 1 ) 〜 （5 ) の方法を具体的に説明する。
( 1 ) アンチセンスを用いる方法
SAHHアンチセンス RNAとは、 S AHH遺伝子から転写される mRNAの 塩基配列に対して相補的な RNAのことで、 檫的 mRNAと結合し、 2本鎖 RN Aを形成する。 トラップされた mRNAは、 もはやタンパクに翻訳されず、 細胞 内でヌクレアーゼによって消化されてしまう。
アンチセンス RNAは、 S AHH遗伝子を単純に逆向きにベクターのプロモー ターの下流に連結することにより転写させることができる。
本発明で用いる S A HH遗伝子については、 既に本出願人により明らかにされ ており （特開平 4一 2 5 8 2 9 2号公報） 、 その塩基配列は配列番号 1に示す通 りである。 前述したように S AHHは、 微生物、 動植物界に広く分布し、 特に、 メチル化反応では重要な役割を果たしている。 これまで S A HH遗伝子について 報告されているものは以下のとおりである。
ヒ ト（Coulter- Karisら、 Ann. Hum. Genet.53, 169)、 ねずみ（Ogawaら、 Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA 84,719)、 細菌（Sgamgaら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89， 6328)、 線虫 (Genbank accession no. M64306) 、 粘菌 (Kasirら、 Biochem. Biophys. Res. co mmun.153, 359) 、 トリバノゾーマ（Genbank accession no. M76556) 、 タバコ（ 特 開平 4- 258292;Mitsui ら、 Plant Cell Physiolo.34, 1089)、 日日草（Schr1 der ら、 Plant Physiol.104, 1099)
これらの遺伝子の塩基配列及びコードするタンパクのアミノ酸配列は、 種を越え て非常に良く保存されている （ 6 0— 7 0 %) 。 これは、 あらゆる生物種でアミ ノ酸配列が良く保存されているュビキチンというタンパクに匹敵するものである。
SAHH遺伝子は、 例えば、 以下に示す方法によって得ることができる。 まず、 タバコの花軸上皮の切片を力イネチンおよびィンドール酢酸を含有する Murashig e-Skoog 培地 （花芽誘導培地） 上で培養する。 次いで、 得られた培養組織から常 法に従って mRNAを抽出し、 さらに抽出した mRNAから c DN Aライブラリ 一を作成する。 次に、 無処理のタバコ花軸から抽出した mRN Aおよび上記の培 養組織から得た mRN Aを用いて、 32P等の放射性同位体で標識した c DNAプ ローブをそれぞれ作成し、 これらのプローブと上記の cDNAライブラリーとの ハイブリダィゼーシヨンを行う。 ハイブリダィゼーシヨンの結果、 無処理花軸由 来のプローブとはハイプリダイズせず、 培養組織由来のプローブとのみハイプリ ダイズする c DNAクローンを選択する。 なお、 この S AHH遺伝子を有する大 腸菌 Jm l 0 9は、 To b— SAHH— 1という名称で、 工業技術院生命工学ェ 業技術研究所 （曰本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号） に、 寄託番号 FERM
B P— 4 8 7 3 (寄託日平成 6年 1 1月 4日） として寄託されており、 該微生 物から S A H H遗伝子を入手することも可能である。
発現プロモーターには、 転写力が強く全細胞で発現させるもの （3 5 S、 1 9 S、 n o sなど） 、 光に反応するもの （r b cなど） 、 温度に反応するもの （h s pなど） 、 ホルモンに反応するもの、 そして組織特異的に反応するものなど多 数知られている。 植物体での発現を考える場合、 本発明のどの効果を期待する力、、 成長のどの時期に発現させるか、 どの組織でだけ発現させるかという問題が重要 になってくる。 例えば、 植物ウィルス抵抗性を付与する時には、 好ましくは、 全 細胞で発現させるもの、 特に好ましくは 3 5 Sプロモーターなどの強力なものが 挙げられる。 また、 植物を他の形質に影響がでないように雄性不稔にするために は、 花特異的プロモーターを使用するのが好ましい。 動物では、 主に動物ウィル ス由来のプロモーター （SV 4 0 e a r l y、 SV 4 0 1 a t e、 MMTV— LTR、 RSVLTRなど） が強力なプロモーターとして知られている。 細胞レ ベルでの S A H Hァンチセンス阻害によるゥィルス抵抗性の付与の場合は、 これ らの強力なプロモーターが好ましい。
アンチセンスで入れる遗伝子は、 SAHHが種を越えて核酸レベルで、 6 0 % から 7 0 %の相同性があることからこれをコードするものであれば特に限定され ない。 また、 形質転換体を作出しようとする生物種と、 アンチセンスで入れる S A HH遗伝子の起源生物とが、 近緣にあるほど、 アンチセンス阻害の程度は強く なり、 逆に遠縁であるほど、 アンチセンス阻害の程度は弱くなると考えられる。 さらに、 アンチセンスで組み込む S A H H遺伝子は必ずしも全体である必要はな い。 一般的に、 全体を入れた方がアンチセンス阻害の程度が高いものと考えられ るが、 一部を用いた場合でも十分な効果が示される場合もある。 ただし、 好まし くは、 翻訳開始点の A U Gを含む D N A断片を用いる方がよい。
動植物の形質転換に使用される発現べクターの選択は、 細胞レベルか個体レべ ルかによつて異なってくる場合がある。 プロモーターとターミネーターの間に檩 的遗伝子を入れる基本構造 （ジーンカセッ ト） は同じであるが、 宿主 D N A中に 組み込むために必要な塩基配列をジーンカセッ トの外側に配置したベクターが作 り出されている。 例えば、 植物ではァグロパクテリゥムを介した方法に使用され るベクターの R B (ライ トボーダー） と L B (レフ トボーダー） がこれに当たり、 動物ではレトロウイルスベクターの L T R (ロングターミナルリピート） などが ある。
アンチセンス S A H H遺伝子を宿主生物に導入する方法は、 特別な方法を用い る必要はなく、 植物では、 ァグロバクテリウム属菌を用いたリーフディスク法な どにより行うことができ、 動物では、 リボゾーム、 エレク ト口ポーレーシヨン、 マイクロインジヱクシヨン法などにより行うことができる。 リーフディスク法に よる場合は、 以下のようにして形質転換生物を得ることができる。 アンチセンス S A H H遺伝子を適当な植物発現ベクターに揷入し、 このベクターをァグロパク テリゥム属菌に導入する。 次に、 形質転換しょうとする植物の無菌菜から採取し たリーフディスクを、 前記のァグロパクテリゥム菌の培養液に浸 ¾した後、 カル スを形成させ、 形質転換が生じ もののみを選抜することにより形質転換生物を 得ることができる。 形質転換体の選抜は、 カルス形成させる培地に適当な抗生物 質を添加し、 その耐性の有無により行うことができる。 なお、 ァグロバクテリウ ム属菌を用いた形質転換法は、 タバコなどの双子葉植物にのみ適用でき、 単子葉 植物には適用できないとされているが (De Cl eene M. 1976； Bo t. Rev. 42 : 389-4 66) 、 本出願人により先に出願されている国際公開番号 WO 94/00977 号公報、 特 願平 6- 27320 号明細書に記載されている方法に従えば、 単子葉植物にも適用可能 である。 即ち、 脱分化過程にある培養組織又は脱分化した培養組織を、 ァグロバ クテリウム属菌の培養液で浸潰することにより、 単子葉植物についても形質転換 することが可能となる。 また、 作出する植物が樹木の場合も公知の方法に従い、 形質転換することが可能である。 例えば、 マツ、 ポプラ、 ユーカリなどでは、 既 に安定技術として確立している。 その他の樹木においても組織培養の条件や形質 転換法を工夫することによつて本遗伝子を導入することが可能である。 樹木の組 織培養については、 ' 植物バイオテクノロジ一 ΙΓ (東京化学同人） の p 60— P 73に詳しい。 また、 ァグロパクテリゥムを利用したポプラの形質転換法につ いては、 Confalonieriら， Plant Cell Report 13' 256-261(1994) などに報告さ れている。
(2) プラスセンスを用いる方法 （相同組換え）
S AHH遺伝子の全部または、 一部をその塩基配列のまま、 mRNAとして転 写されるように植物あるいは動物発現べクタ一に組み込む。 S A H H遗伝子の入 手、 プロモーターの選択については、 上記 （1 ) で述べたとおりである。 この方 法によって、 S AHHの発現阻害が達成される確率は、 かなり低いものと考えら れるカ <、 皆無ではない。 はっきりしたメカニズムは不明である力 相同組換えが 考えられる。 その場合、 導入した塩基配列に意味があり、 プロモーターからの転 写は関係ないことになる。 いずれにしても、 本発明は、 相同組換えによる SAH H遺伝子破壊についても含むものである。 プラスセンス S AHHを発現するよう、 植物を個体レベルで形質転換する場合について以下に具体的に例示する。 まず、 市販の植物発現ベクター pB 1 1 2 1 (東洋紡） を適当な制限酵素で切断し、 G US遗伝子をはずす。 例えば、 Sma Iと S s t Iで同時切断する。 次に市販の プラスミ ド S K+ (東洋紡） の E c 0 R I部位にクローニングされている S AH Hを同じ接着末端を生じさせるよう Sma Iと S s t Iで切り出す。 この時、 S m a I側が S A H Hの 5 ' 末端側であることと Sma lと S s t l部位が SAH H遺伝子中に存在しないことを確認する。 市販のライゲ一ションキッ ト （宝酒 造） のマニュアルに従いながらベクターと SAHH断片を結合させた後、 大腸菌 (JM 1 09など） を形質転換して、 組み換えプラスミ ドを得る。 このブラスミ ドを常法に従い増幅、 回収して植物を形質転換する。 形質転換法については、 上 記の （1) で述べたように植物では、 ァグロバクテリウム厲菌を用いたリーフデ イスク法などにより行うことができ、 動物では、 リボゾーム、 エレク ト口ボーレ ーシヨン、 マイクロインジ Xクション法などにより行うことができる。 (3) リボザィムを用いる方法
リボザィムは、 長さがせいぜい 5 0塩基程度の RNAで檫的 S AHH RNA に結合するための相捕鎖配列を持つ部分と RN Aを切断するために必要な保存配 列および高次構造 （ヘアピン型、 ハンマーへッ ド型など） を形成する部分からな る。 まず、 檫的 RNAとして S AHH遗伝子の mRNAに結合し、 切断するよう に塩基配列をデザインして、 その配列を持つ DN A断片を合成する。 次に （1 ) に上述したような植物あるいは動物発現ベクター中のプロモーターに連結してゲ ノム DN A中に組み込む。 また、 動物における細胞レベルでの研究は、 以下のよ うに利用してもよい。 リボザィムの DN Aをまず一般的な転写べクタ一のプロモ —ター （T 7， Τ 3, S P 6など） の下流にクロ一ニングし、 試験管内転写系で リボザィム分子を多量に合成して、 直接細胞に取り込ませる。 さらにはリボザィ ムを化学合成することも技術的に可能である。 この時、 ヌクレアーゼ耐性となる ような誘導体を用いて合成すれば、 効果がいっそう高まるものと期待できる。 以 下に、 この方法によって植物個体の S ΑΗΗ遗伝子をノックァゥ卜する場合の手 順について具体的に述べる。 例えば、 ハンマーへッ ド型リボザィムで S ΑΗΗ遗 伝子の mRNAの切断を計画した場合、 まず、 標的 S AHH遺伝子の mRNA中 の GU Cを狙ってリボザィムをデザィンする。 このデザィンの方法については、 例えば、 "実験医学" v o l . 12， p 8 3— p 8 8に詳しく紹介されている。 即 ち、 図 8のような 2次構造を形成するようにタゲッ ト部位を定める。 stem I， II I の長さは？〜 10塩基が好ましい。 ここで配列番号 1に示すタバコ SAHHの塩 基配列を参考に、 6 6 0— 6 6 3の GUCを標的とした場合には、 以下のような リボザィムをデザィンすることができる。
5' GAAACACCCUGAGUCCNNNNGCACGAAACGGUCU3' ( はどの塩基でもよい）
デザインした後、 リボザィムの配列を含む DNA配列をセンス鎖、 アンチセンス 鎖の 2本のオリゴヌクレオチドを DN A合成機で合成する。 この時、 後でべクタ 一に組み込むことを考えて 5' 末端に適当な制限サイ トを付加しておくとよい。
DNA合成は、 市販の DNA合成機、 例えば、 AB I社モデル 3 8 0 A等を用い て行うことができる。 この 2本の DN Aを混合してァニールさせ、 2本鎖 DNA とする。 制限酵素で切断した後、 例えば、 p B I 1 2 1の 3 5 Sプロモーターの 下流にクローニングする。 こうして得た組み換えブラスミ ドを使用して植物を形 質転換する。 ここでの形質転換法も上記 （1) 及び （2) で述べたように、 植物 では、 ァグロバクテリウム属菌を用いたリーフディスク法などにより行うことが でき、 動物では、 リボゾーム、 エレク ト口ポーレーシヨン、 マイクロインジェク シヨン法などにより行うことができる。 なお、 ここでデザインしたリボザィムは 一例であり、 S AHHmRNAの切断を別の箇所で実行することもできる。
(4) 転写制御因子とプロモーター領域を利用する方法
A. プロモーター領域を利用する方法
まず、 ゲノム遺伝子を分離して、 SAHH遗伝子の転写を制御するプロモータ —領域を明らかにする。 タバコの場合であれば、 まず、 ラムダファージべクタ一 EMBL 3 (ストラタジーン社） などを使用してジヱノ ミ ックライブラリ一を作 成する。 SAHHの cDN Aクローンを市販のランダムプライマーラベリングキ ッ ト （宝酒造） などでァイソ トーブラベルしたものをプローブとし、 上記ライブ ラリーをスクリーニングする。 このライブラリーの作成方法とスクリーニング法 については、 特開平 5 - 236964号公報に詳しく述べてあるとおりである。 即ち、 タバコ花軸の上皮細胞を力イネチン、 インドール酢酸、 シユークロース、 チアミ ン塩酸、 ミオイノシトールを含むムラシゲ · スクーグ培地で培養した後、 該組織片より全 RNAを抽出し、 次いで、 オリゴ dTカラムを用いてポリ A RN Aを集め、 このポリ A RNAから c DNAライブラリーを作成する。 次に前記培 養組織から得たポリ A RNAと無処理の花軸より抽出したポリ A RNAから、 そ れぞれ c DN Aプローブを作製し、 前記 c DNAライブラリ一の中から培養組織 から得たプローブとのみハイプリダイズし、 無処理の組織から得たプローブとは ハイプリダイズしないクローンを選択する。
得られたジュノ ミ ッククローンの塩基配列を常法によって （例えば AB Iの D NAシーケンサ一などによって） 決定し、 プロモーター領域を特定化する。 次に、 相同組み換え技術などによってこのプロモーター領域を破壊すれば SAHH遺伝 子の転写は完全にストップする。 相同組み換え技術については、 別名ジーンター ゲティングともよばれ、 破壊しょうとする塩基配列と同じ配列を D N A中に組み 込むことによって、 遺伝子の複製時に偶然組み換えが起きる現象を利用したもの である。 具体的には、 例えば、 （2 ) で上述したような方法で標的プロモーター 領域をゲノム D N A中に組み込む。
B . 転写制御因子を利用する方法
まず、 プロモータ一領域に結合するタンパクが存在するかをゲルシフ トアツセ ィ （ゲルリタ一デーンヨンアツセィ） などによって確認し、 カラムクロマトグラ フィ一によつてそのタンパク （転写因子） を純化精製する。 次に、 精製されたタ ンパクから、 このタンパクをコードする遗伝子を検出するプローブを作成し、 こ のプローブにより遺伝子を分離する。 最後に、 分離された遗伝子断片を利用して 転写因子タンパク遺伝子の発現を抑制する。
ここで、 転写因子タンパク質を純化精製する実験手順については、 例えば、 "ラボマニュアル植物遺伝子の機能解析" （丸善） の p 8 3— 1 0 9に記載の実 験例に従って行うことができる。 即ち、 まず、 植物組織から核画分を遠心分離に よって単離する。 これに N a C 1を加え、 核タンパク質を抽出する。 25000 X g で 30分遠心して上清を回収し、 これを透析用緩衝液で透析し、 核抽出物を得る。 次に、 S A H H遺伝子のプロモーター領域を含む D N A断片を電気泳動によって ゲルから回収する。 D N A末端を 〔7 - 3 2 P〕 A T Pとポリヌクレオチド力イネ ースを用いて標識する。 核抽出物と標識 D N Aを混合し、 室温で、 30分間インキ ュペートする。 反応生成物を 5 %ポリアクリルアミ ドゲルで電気泳動し、 ゲルを ろ紙に移して乾燥させ、 オートラジオグラフィーを行う。 ゲルシフ トを確認した 場合、 D N A結合タンパクの存在を意味する。 このタンパクの精製には溶解度の 差を用いた塩析 （硫安塩析など） 、 有機溶媒による画分 （アセトン、 エタノー ル） 、 分子の大きさを利用した分離法 （超遠心法、 ゲルろ化） 、 免疫学的方法な どの種々の方策が用いられる。 カラムクロマトグラフィー （イオン交換、 疎水性、 ァフィ二ティーなど） の組み合わせによって D N A結合タンパクを部分精製する。 いずれのカラムクロマトグラフィーを使用するかは、 ターゲッ トタンパクの性質 によって決定する。 まず、 試料の一部を用いて少量のスケールの予備実験を行い、 最適条件を決めておく必要がある。
上記のプローブを作成する方法としては、 プロモーターのタンパクと結合する 配列を D N A s e Iフッ トプリント法などによって決定し、 その配列を持つオリ ゴヌクレオチドを合成してプローブとする方法とタンパクを精製してそのァミノ 酸配列からプローブを作成する方法などがある。 後者の方法は、 例えば、 以下の ようにして行うことができる。 タンパクのァミノ酸配列の一部を A B Iのプロテ インシーケンサーなどでその操作マニュアルに従い、 決定した後、 その情報から 遺伝子の塩基配列を予想する。 同時に、 S AHHをよく発現している組織から m RNAを調整し、 c DNAライブラリーを作出しておく。 c DNAライブラリー の作成方法については、 特開平 4— 2 5 8 2 9 2に記載のとおりである。 即ち、 タバコ花軸の上皮切片を力イネチン及びィンドール酢酸を含有するムラシゲ ·ス クーグ培地で培養した後、 該組織片より全 RNAを抽出し、 オリゴ dTセルロー スカラムを用いて、 ポリ A RNAを集め、 このポリ A RNAから c DNAを合成 し、 c DNAライブラリーを作製する。 PCR法によって遗伝子の一部を増幅さ せ、 その DN A断片をプローブとするかあるいは、 オリゴヌクレオチドをブロー ブとしてライブラリーをスクリーニングする。 標準的な P CR反応は、 以下のと おりである。 アミノ酸配列の情報から 5' 末端と 3' 末端に相当する塩基配列 (3' 末端側は、 相捕鎖） をアミノ酸コ ドンから予想し、 なるべく組み合わせが 少なくなるように混合ブライマーを合成する。 この時、 制限酵素サイ トを付加し ておくと後からのクローニングに便利である。 タバコ DNA (2 // g) と上記 2 種類のプライマーを混合し、 2分間沸騰するなどして変性させる。 これに緩衝液 やポリメラーゼなどを添加し、 反応液とする。 一般的に、 組成は 6 7mMトリス 塩酸緩衝液 （PH 8. 8) 、 1 6. 6mM硫酸アンモニゥム、 6. 7 mM塩化マ グネシゥム、 1 0 mMメルカブトエタノール、 2 0 0 mMdNTP s、 各 1 〃 g プライマ一および 5単位のタックポリメラーゼ （宝酒造） である。 このような反 応液を DNAサーマルサイクラ一 （宝酒造） を用いて、 9 2°Cで 1. 5分間加熱 した後、 4 5°Cで 2. 5分間静置し、 さらに 7 2 °Cで 3分間反応させる工程を 1 サイクルとし、 これを 2 5回繰り返す。 増幅した DN A断片をァガロースゲル電 気泳動で回収し、 前述のようにアイソト一ブで標識してプローブとして使用する。 一方、 オリゴヌクレオチドのアイソトープ標識は常法によるが、 例えば、 宝酒造 のメガラベルキッ トなどを使用すれば容易に実行できる。
なお、 DNA s e lフッ トプリント法は、 核タンパクの結合領域を同定するた めに使われる方法であり、 その内容は前述した "ラボマニュアル植物遺伝子の機 能解析" （丸善） に詳述されている。 即ち、 はじめにどちらか一方の末端を32 P で標識した DNA断片と核抽出物を混合した後、 適量の DNa s e Iで部分消化 する。 次に、 部分消化した DN Aサンプルを変性ポリアクリルアミ ドゲルで電気 泳動し、 オートラジオグラフィーを行う。 この時、 1塩基ごとに梯子状になった バンドが得られるが、 タンパクが特異的に結合した領域は DN a s e Iによる切 断から保護きれているため、 バンドの強さが他の領域に比べ弱くなるか、 あるい は全くなくなる。 塩基配列決定のためのサンプルを同時に泳動することによって、 タンパクの結合領域が推定できる。
転写因子タンパク遗伝子の発現を抑制する方法は、 好ましくは、 前述した （ 1) 〜 （3) のような方法であるが、 特に好ましくは、 その技術の簡潔さから
(2) で述べたアンチセンス法である。
(5) 標的タンパクに結合するタンパクを利用する方法
現時点では、 SAHHと結合するタンパクが存在するかどうかは、 不明である。
SAHHをラベルし、 動植物の組織からの抽出液と混合し静置した後、 ゲルシフ トアツセィによって結合タンパクが存在するか確かめる。 もし存在するなら、 そ のタンパクを純化精製し、 （4) で説明したようにタンパクの遺伝子を得る。 こ の遗伝子を発現ベクターのプロモーターの下流にセンス方向で発現するように組 み込み、 形質転換する。 ここでの形質転換法も上述したように、 植物では、 ァグ ロバクテリウム属菌を用いたリーフディスク法などにより行うことができ、 動物 では、 リボゾーム、 エレク ト口ポーレーシヨン、 マイクロインジェクション法な どにより行うことができる。 得られた形質転換体は、 SAHH結合タンパクを過 剰生産し、 SAHHの活性を阻害する。 もし、 SAHH結合タンパクが容易に得 られなかった場合は、 SAHHの抗体の遗伝子を利用することができる。 まず、 SAHHをネズミに何度か注射し免疫した後、 脾臓を得る。 ネズミへの免疫方法 ゃ脾細胞採取法については、 例えば、 "バイオテクノロジー実験マニュアル"
(三共出版） p 1 48— p 1 5 1に記載されているような公知の方法により行う ことができる。 モノクローナル抗体のハイプリ ドーマが獲得できるのであればそ れを使う。 mRNAを調整し、 例えば、 フアルマシア社で市販のキッ ト （Re c o m b 1 n a n t P h a g'e An t i b o d y S y s t em) を使用して リコンビナント抗体の遗伝子を得る。 マニュアルどおりに実行すれば容易に檫的 遗伝子を獲得できる。 この遺伝子を （2) で上述したように、 細胞で過剰生産さ せるため、 センス方向で発現ベクターのプロモーターの下流に組み込み、 形質転 換する。 この時の形質転換 も上記の方法と同様に行うことができる。
実施例
以下に実施例をあげて本発明についてさらに具体的に説明するが本発明の範囲 は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例 1〕 タバコ形質転換体の作出
〔 1〕 実験結果の概要
タバコから分離した SAHH遗伝子を植物発現ベクターの 3 5 Sプロモーター の下流にアンチセンスで全細胞において発現するように連結した。 この組み換え DN Aをァグロパクテリゥムを用いた形質転換法によってタバコのゲノムに導入 した。 得られた形質転換タバコを 1 0 0個体以上解析した。 また、 それら形質転 換体の各形質が後代に遗伝することを確認するため、 自殖あるいは人工交雑によ る R 1種子から得られた個体についても解析した。 その結果観察された主な形質 変化を以下に示す。 そのほとんどについては、 "課題を解決するための手段" で 詳述した原理から予想されたものであった。
( 1 ) 複数のウィルスに対する抵抗性 （図 1、 表 3、 表 4) 、 (2) わい性植物 (図 2、 図 3) 、 (3) わき芽の数が増大 （図 2、 図 4) 、 （4) 花数が増える (表 1 ) 、 （5) 開花期が早くなる （7— 1 0日間） 、 （6) 老化抑制 （図 2、 図 3) 、 （7) 雄性不稔 （図 5) 、 （8) 花色の変化 （白—赤）
ここで特に S A H H遗伝子のアンチセンス阻害による発現抑制が、 植物ウィル ス抵抗性に結びついた発見は、 動物ウィルスにおいて SAHHインヒビタ一が抗 ウィルス剤としての使用を目指して盛んに研究されている事実にヒン卜を得たも のであるが、 植物ウィルスで効果が実証された本発明は、 動物ウィルスにも容易 に応用できるものと予想される。 したがって、 本発明による遺伝子レベルでの S A HH発現抑制は、 植物にのみ限定されるものではない。
実験の方法と手順について以下に項目ごとに説明する。 〔2〕 c DNAライブラリ一の作成
タバコ（Nicotiana tabacum BY-4)の花軸上皮切片を力イネチン （ 1 / M ) およ びィンドール酢酸 （ 1 /M ) を含有する Murashige-Skoog の寒天培地上で 1 日培 養した。 得られた培養組織 10gを、 20 ml の抽出用緩衝液 （4M グァニジンチォ シァネー ト、 5mMクェン酸ナトリウム、 0.5 %ザルコシル、 2mM β- メルカブト エタノール） 中においてポリ トロンホモジェナイザーを用いて破砕した。 その後、 破砕液を 4000xg で 20分間遠心して分離し、 上清を回収した。
この上清を、 遠心管に入れた 5.7M塩化セシウム溶液 4ml 上に重眉し、 28000rpm で 20時間遠心して分離した後、 上清を捨てて沈殿を回収した。 この沈殿を lml の 緩衝液 （10mM Tris- HC1 、 ImM EDTA、 0.1 %S D S) に溶解し、 さらに等量 のフヱノール： クロロホルム ： イソアミルアルコール （25： 24： 1 ) を添加して 良く混合した後、 遠心分離を行って上層の水相を回収した。 得られた水相に、 5M の塩化ナトリゥムを 0.25 Mとなるように添加し、 さらに 2.5 倍量のエタノールを 添加してよく混合し、 — 20°Cで一晚静置した。 その後、 10, 000 X gで 20分間遠心 して分離し、 得られた沈殿を 70%ェタノールで洗浄して減圧乾燥した。
この乾燥標品を 500 ulの TE緩衝液 （10 mM Tris-HCK ImM EDTA) に溶解 し、 全 RN A溶液を得た。 この RNA溶液を 65°Cで 5分間処理した後、 氷上で急 冷した。 これに塩化ナトリウム溶液を 0.5 M となるように添加し、 TE緩衝液で 予め平衡化したオリゴ d Tセルロースカラムにかけた。 次いで、 カラムを約 10倍 量の緩衝液 （0.5 M塩化ナトリウム、 10mM Tris- HC1 、 ImM EDTA) で洗浄し た後、 TE緩衝液で poly (A) + RNAを溶出した。
得られた溶出液に 1 / 1 0量の 5M 塩化ナ卜リゥム溶液および 2.5 倍量のエタ ノールを添加して混合し、 — 70°Cで静置した。 その後、 10，000Xg で遠心分離を 行い、 得られた沈殿を 70%エタノールで洗浄して乾燥することにより poly (A) + RNAlOugを得た。 この poly (A) + R N Aを水 10ulに溶解し、 そのうちの 2u 1 を用いて c DNAライブラリーを作成した。 c DNAライブラリーの作成は、 アマシャム社製の； I g t 1 1 c DNA合成システムおよび c DNAクローニング システムを使用し、 その仕様睿に従うことにより行った。
〔3〕 ライブラリーのスクリーニング 上記の培養組織から得た poly (A) + RNA2u および 〔α— 32 P〕 d CTP (3000 Ci/ミ リモル、 10 Ci/ul ) 10ulを、 30ulの反応液 （50mM Tris-HCl (pH 7.6 ) 、 2mM DTT、 5mM MgCl2 、 40mM KC1、 lmM d GTP、 d ATPおよび d TTP、 5uMd CTP、 20ュニッ トのヒ ト胎盤 RNA s eインヒビター、 2ug ォ リゴ dTプライマ—、 40ュニッ トの逆転写酵素） 中において、 37°Cで 1時間反応 させて c D N Aプローブを作成した。
無処理の花軸から抽出した poly (A) + RNAについても、 同様の方法で、 c DN Aプローブを作成した。
次に、 上記の c DNAライブラリ一を構成するファージを大腸菌に感染させて L B寒天培地上で増殖させ、 約 1400個のファージの DNAをそれぞれ 2枚のナイ ロンメンブレンに写し取った。
ファージ DNAを写し取ったナイロンメンブレンと上で作成した c DNAプロ ーブとを、 6 X S S C (0.9M塩化ナトリウム、 0.09M クェン酸ナトリウム） 、 0. 1 %S D S、 5 xデンハルト溶液 （0.1 %フィコール、 0.1 %ポリビニルピロリ ドン、 0.1 %ゥシ血清アルブミ ン） 、 および 50ug/ml 変性サケ精子 DNAを含有 する溶液中において、 65°Cで 20時間ハイブリダィズさせた。 その後、 メンブレン を取出し、 2 X S S Cおよび 0.5 %S D Sを含有する溶液を用いて 65°Cで 1時間 洗浄した。 このメンブレンを乾燥した後、 X線フィルムを密着させて感光させた。 その結果、 培養組織から得たプローブとのみハイブリダイズして無処理の花軸 から得たプローブとはハイプリダイズしないクローンを 10個選択することができ た。 そのうちの 1個のクローンについて解析を進めたところ、 このクローンのィ ンサ一トは約 300 塩基対と小さいものであることが判明した。 そこで、 より長い インサートを有するクローンを得るために、 このクローンのインサート部分をブ ローブとして、 さらに c DN Aライブラリーのスクリ一二ングを行った。
このスクリーニングにより、 約 1.8 K塩基対のインサートを有するクローンが 得られた。 このクローンのインサート部分をブラスミ ドベクター （Bluescript、 Stratagene社製） にサブクローニングし、 ダイデォキシ法によりその塩基配列を 決定した。 決定されたインサート部分の塩基配列を配列番号 1 として示す。 この ィンサートの長さは 1812塩基対である。 〔4〕 植物発現ベクターへのクローニング及び植物の形質転換
植物発現ベクター P B 1 1 2 1 (東洋紡） の Sma I— S a c I部位にタバコ S A HH遗伝子をアンチセンスで発現するように挿入した。 得られた組み換えブ ラスミ ドを使用してタノく'コ（Nicotiana tabacum し cv. B Y— 4及び N. tabacumし cv. X a n t h i n c ) の形質転換をァグロパクテリゥムを用いたリーフディ スク法によって行った （以下、 形質転換体 BY— 4タバコを 「SHB」 と、 形質 転換体 X a n t h i n cタバコを 「SHX」 と略記することがある。 ） 。 本実 施例では "植物バイオテクノロジー ΙΓ' (山田康之、 岡田吉美編、 1 9 9 1年、 東京化学同人） の Ρ. 1 6 4 - 1 6 5に記載されている方法を用いた。 すなわち、 タバコのリーフディスクを滅菌し、 目的のプラスミ ドを凍結融解法によって獲得 させたァグロパクテリゥム .チュメファシエンス （L B A 4 4 0 4 ) の懸濁液に 約 3 0秒浸すことによって接種した。 約 2日間抗生物質を含まない培地で培養し て感染させた後、 リーフディスクを洗浄し、 抗生物質を含む培地に置いて形質転 換細胞を選抜した。 形質転換カルスは、 カナマイシン （ 1 0 0 gZm l) とク ラフオラン （2 5 0 t gZm l ) を含むムラシゲスク一グ培地で選抜された。 形 質転換体は、 2 5°C、 1 6時間照明下で育成された。 シユーティングしたものは、 発根培地に移し、 発根を誘起した後、 鉢上げした。 発根培地としては、 ムラシゲ スク一グ培地を使用した。 ほとんどの鉢上げ個体は、 わき芽が旺盛で容易にクロ ーン個体をさし芽できた。 また、 大半の個体が非形質転換体に比較して、 節間が 短くわい化していた。 この傾向は BY— 4で特に強く、 茎がほとんどたたず、 口 ゼッタ状のまま花を付ける個体もいくつか見受けられた。 花は、 一般的に一週間 ほど早くつき、 花数も 2倍から 3倍に増加した。 花は、 タバコ本来のうすいピン ク色のもの、 しぼり状の赤色、 さらには濃い赤色まで様々なものが観察された。 以下、 図表を用いて形質転換体タバコの外観的な特性について説明する。
図 2は、 花をつける前の形質転換体 X a n t h i n cタバコの外観を示すも のである。 中央と右の植物が形質転換体であり、 これらは左の非形質転換体に比 ベ、 わき芽が多く、 葉の緑が濃い。
図 3は、 花を付けた形質転換体 X a n t h i n cタバコ （図 3 a) 及び形質 転換体 BY— 4タバコ （図 3 b) の外観を示すものである。 いずれも、 右側の節 間が短く、 わい化している方が形質転換体である。
図 4は、 わき芽が異常に多く、 多数の花を付けた形質転換体 X a n t h i n cタバコを示すものである。
図 5は、 形質転換体 X a n t h i n cタバコの花の部分を示すものである。 形質転換体の約 1 / 3で柱頭が花から突出 （雄性不稔） しているのが観察された < これらの個体の花粉も未熟で発芽能力がきわめて低い。
表 1は、 形質転換体 X a n t h i n cタバコの花数を示すものである。 表中 の数値は、 10個体について測定した値の平均値である。 なお、 前述したように形 質転換体の 1ノ 3が稔性を有しないので、 それらの個体については種子カプセル 数測定の対象から除外した。
表 1 形質転換体の花数と種子カプセルの数 植物 花芽数 種子カプセル数
S H X ( R。 ） 31. 1 ±6. 7 25. 1 ±4. 5
コントロール 17. 2±4. 5 13. 5±2. 4 表 2は、 タバコ B Y— 4と X a n t h i n cそれぞれ 2 0個体を詳細に観察 し、 わい化の程度、 わき芽の数、 柱頭突出の程度についてまとめたものである。
表 2 形質転換タバコの表現型 指数 表現型 Xanthi nc BY-4
(N=20) (N = 20) 柱頭突出
1 長さが雄蘂と同じか短い 1 3 9
2 雄蘂より若干長い 2 3
3 雄蘂より明らかに長い 3 5
花弁から露出 2 2
平均指数 1. 7 2. 1 わい化
1 丈が非形質転換体と同じ 4 3
2 若干わい化 1 4 8
3 丈が半分以下 2 5
4 丈が 1 / 1 0以下 0 4
平均指数 1. 9 2. 5
わき芽
1 数が非形質転換体と同じ 0 0
2 伸長しないがわき芽形成 3 3
3 わき芽多い 1 5 1 2
4 嫿生 2 5
平均指数 3. 0 3. 1
〔実施例 2〕 ペチュニア形質転換体の作出
〔 1〕 植物発現べクタ一^ ^のクローニング及び植物の形質転換
実施例 1 と同様にして、 植物発現ベクター p B 1 1 2 1にタバコ SAHH遗伝 子をアンチセンスで発現するように挿入した。 得られた組み換えプラスミ ドを使 用してペチュニア （品種： H I及び No. 2 2) の形質転換を行った。 形質転換 は、 実施例 1 と同様にリーフディスク法によって行ったが、 ァグロパクテリゥム のペチュニアの葉への感染を促進するため共存培養の培地にァセトシリンゴンを
1 0 0 Mになるように加えた。 形質転換細胞の選抜、 再分化等も実施例 1 と同 様にして行ったが、 発根培地の塩濃度はムラシゲスクーグ培地の 1 / 2の塩濃度 になるようにした。
〔2〕 3 5 Sプロモータ一配列をもつ DNA断片の検出
得られた形質転換ペチュニアにタ一ゲッ ト DN Aが揷入されていることを確認 するため、 P CR法によって 3 5 Sプロモータ一領域を増幅した。 用いたブライ マーの配列と反応条件は、 以下の通りである。
3' end プライマー： GGATAGTGGGATTGTGCGTC. 5' end プライマー： GGATCTAACAGA ACTCGCCG. 9 4てで 2分間、 6 5 で 3 0秒間、 7 2 で 2分間の 3ステップを 2 5回繰り返した。
上記方法で增幅された DN A断片について電気泳動を行った。 図 9は、 その泳 動パターンを示す。 図中の矢印が 3 5 Sプロモーター配列を含む DNA断片を表 す。 図 9に示すように形質転換体である H 1 一 DH、 2 2—DHでは前記 DNA 断片が検出されるが、 非形質転換体である H 1 — C、 2 2— Cでは前記 DNA断 片は検出されない。 従って、 この DN A断片の検出でその植物が形質転換された ことを確認できる。
〔実施例 3〕 形質転換タバコのウィルス接種試験
鉢上げ後、 約 2— 3週間ほど温室 （2 4— 2 7 °C) で育成した後、 ウィルス接 種試験に供した。 タバコの葉に、 カーボランダムをふりかけ、 純化ウィルスを燐 酸バッファーで希釈して、 1 — 5 g/m 1の濃度で塗抹接種した後、 水でリン スした。
タバコモザィクウィルス （TMV) を X a n t h i n cに接種したときには、 3日後、 接種葉の局部病斑数を数えて非形質転換体 （コン トロール） のものと比 較した。 図 1に、 形質転換 X a n t h i n cタバコ （左の植物） と非形質転換 X a n t h i n cタバコ （右の植物） の接種葉の外観を示す。
キユウリモザイクウィルス N系統 （CMV— N) を X a n t h i n cに接種 したときには、 4日後、 接種葉の局部病斑数を数えてコントロールのものと比較 した。 この結果を表 3に示す。
表 3 形質転換体の C MX— Nに対する抵抗性 系統 病斑数 最大の葉の一枚上の葉に接種 最大の葉に接種
SHX- 3 1 7 1 ( 1 0 8) 4 8 (7 9)
SHX- 3 2 1 7 (2 6) 1 8 (3 0)
S HX- 3 4 1 4 (2 1 ) 9 ( 1 5)
S HX- 3 5 1 9 (2 9) 6 ( 1 0)
S HX- 3 6 1 4 (2 1 ) 1 3 (2 1 )
S HX- 3 7 2 0 (3 0) 1 5 (2 5)
S HX- 3 8 7 (1 1 ) 1 0 ( 1 6)
SHX- 3 3 1 3 (2 0) 1 1 (1 8)
7 ( 1 1 ) 5 (8)
S HX- 3 9 5 ( 1 8) 4 (7)
8 ( 1 2) 6 ( 1 0)
S HX- 4 0 1 6 (2 4) 1 3 (2 1 )
1 6 (2 4) 1 0 (1 6) コ ン ト ロ一ノレ 6 6 6 1
CMV— Nの接種は、 最大の葉に接種した場合と、 最大の葉の 1枚上の葉に接 種した場合の 2つの葉について行った。 SHX— 3 1、 SHX— 3 2、 SHX— 3 4、 SHX— 3 5、 SHX— 3 6、 SHX_ 3 7、 SHX— 3 8の 7系統につ いては、 1 クローン個体についてのみ実験に供し、 SHX— 3 3、 SHX— 3 9、 SHX- 4 0の 3系統については 2クローン個体について実験に供した。 非形質 転換体については、 5侗体について病斑数を数え、 その平均値を求めた。 なお、 表中のかっこ内の数値は、 非形質転換体の病斑数を基準としたときの、 各系統の 病斑数を百分率で表したものである。 形質転換体と非形質転換体の数値差は分散 分析 （AN OVA) で有意であった。
ポテトウィルス Y (P V Y) を BY— 4及び X a n t h i n cに接種したと きには、 約 2週間後、 上葉のウィルス増殖量を E L I SA法によって検定した。 この結果を、 表 4に示す。
表 4 形質転換体の P V Yに対する抵抗性 系統 外観形態 P VY濃度
(Ro ) ( g/g 新鲜重） コン トローノレ 4. 2
3. 7 病徵が現れたもの（7/10)
SHB 1 8 S S 3， 9
S H B 1 9 S S 2. 8 無病徴のもの（3/10)
S HB 4 S S, G, R 2. 1
S HB 1 3 S S, G, R 1. 2
S HB 1 4 S S, G, R 1. 4
S S ：わき芽， G ：老化遅延， R ：わい化
表中の数値は、 EL I S A法で測った植物組織中の PVY量である。 数値差は, 分散分析 （ANOVA) で有意であった。
以上の結果、 SAHH形質転換体は、 タバコの 3大ウィルス病害である TMV、 CMV、 PVYに抵抗性となったことが判明した。 〔実施例 4〕 酵母における S A HH遺伝子の阻害
以上の実施例から、 S A HH遗伝子をアンチセンスで発現するように植物のゲ ノム遗伝子に組み込むことにより、 植物に種々の変化が生じることが確認された c しかし、 上記実施例における変化は、 いずれも個体レベル、 即ち、 多細胞系で観 察されたものであるため、 上記変化は、 アンチセンス遺伝子の導入以外の他の要 因によって生じたものである可能性もある。 そこで、 細胞レベルで S A HH遗伝 子の発現阻害が生じているか否かを確認するため、 Ty l トランスポゾンを用い て以下の実験を行った。
酵母のトランスポゾン Ty 1は、 動物のレトロウィルスと極めて類似した複製、 粒子形成を行うため、 このシステムを利用してレトロウィルスの研究ゃ抗ウィル ス剤の開発研究のモデル実験を行うことができる （Natsoulisら、 Nature 352,6 32) 。
増殖した Ty lは、 酵母の核 DN A中に自らの配列を組み込む （トランスポジ シヨン） が、 予め酵母中にアンチセンスで発現する SAHH遗伝子を導入してお く と、 S AHHの合成が阻害されるので、 その阻害の度合いに応じて Ty 1のト ランスポジションの頻度は低くなると考えられる。 従って、 トランスポジション の頻度を調べることにより、 S AH H遗伝子の発現阻害の程度を知ることができ る。 なお、 トランポジションの頻度は、 Ty 1のクローンとネオマイシン耐性の マーカー遗伝子とを含むプラスミ ドを酵母に導入し、 酵母を培養後に、 ネオマイ シン入りの培地にまく ことにより知ることができる。
以下、 本実験の具体的な方法を説明する。 なお、 本実験は、 " Yeast, a practi cal approach" (Campell ら編、 1988, IRL PRESS ) の記載の方法に従ったもの である。
細胞濃度を 6 xlOl flになるように酵母 YPH 4 9 9 (a) (ストラタジーン社 製） を水に懸濁した。 これを 50〃1 とり、 ギャップが 0.2cm のキュベッ トに入れ て、 レトロ トランスポゾン Ty lのクローンと G 4 1 8耐性遺伝子を含むプラス ミ ド P J EF 1 6 7 8と混合した。 このブラスミ ド p J E F 1 6 7 8は、 米国の Boeke 博士から分譲してもらったものである。 ブラスミ ドと混合した酵母懸濁液 をエレク トロボレター （バイオラ ド社製のジーンパルサー） にセッ トし、 0.6 kV， 25〃F で 1回パルスをかけ、 プラスミ ド p J E F l 6 7 8を酵母 YPH 4 9 9 (a) に導入した。
次に、 タバコ SAHHit伝子を、 酵母用ブラスミ ド pYEU r a 3 (クローン テック社製） の BamH卜 Xhol部位に gallプロモーターからアンチセンスで転写発現 するようにサブクローニングした （pYEU r a 3 _To b SAHH) 。 このブ ラスミ ドを上記の P J E F 1 6 7 8同様の方法で、 酵母 YPH 5 0 0 ( ) (ス トラタジーン社製） に導入した。
このようにしてプラスミ ドを導入した 2系統の酵母を、 ヒスチジンとゥラシル を欠いたガラク トースの合成最小培地でメイティングし、 2つのプラスミ ドを共 存させ、 30°Cで 2日間培養した。 次に、 メイティングした酵母を、 ヒスチジンと ゥラシルを欠いたグルコースの合成最小培地に 22°Cで 5〜 7日間培養し、 コロニ 一を形成させた。 この時トランスポジショ ンが誘導される。 でてきたコロニーを ヒスチジンとゥラシルを欠いたグルコースの合成最小培地に移し、 30°Cで 2日間 培養し、 さらにゥラシルのみを欠いたグルコースの合成液体培地で 30°Cでオーバ ナイ ト培養した。 この処理によって p J EF 1 6 7 8を脱落した細胞がでてくる。 得られた培養液を水で希釈して、 ゥラシルのみを欠いたグルコースの固体培地に まき、 30°Cで 2日間培養した。 培養後の酵母をゥラシルのみを欠いたグルコース の合成最小培地とヒスチジンとウランルを欠いたグルコースの合成最小培地にス トリークし、 ヒスチジンとゥラシルを欠いたグルコースの合成最小培地で増殖せ ず、 ゥラシルのみを欠いたグルコース合成最小培地で増殖したコロニーを選択す ることにより、 プラスミ ド p J EF 1 6 7 8が脱落した酵母のみを選抜した。 こ こで、 ブラスミ ドが脱落した酵母を選抜したのは、 ネオマイシン耐性がブラスミ ド由来ではなく、 トランスポジショ ン由来である必要があるからである。
上記方法により選抜された酵母をゥラシルを欠き抗生物質 G 4 1 8を 500 fig/ ml加えたグルコースの培地にストリークして、 G 4 1 8耐性コロニーと感受性コ ロニーを数えた。 また、 対照として、 pYEU r a 3— To b S AHHの代わり に p YEU r a 3を導入した酵母 YPH 4 9 9 (a) を、 S AHH阻害剤である アリストロマイシンを含む培地中で培養し、 前記と同様に G 4 1 8耐性コロニー と感受性コロニーを数えた。 この結果を表 5に示す。 表 5 Ty l トランスポゾンの S AHH阻害の影響 アリストロマイシン濃度 耐性コロニー数 感受性コロニー数 阻害率
0 (/z /ml) 7 3 7 NA 100 6 6 1 4 1 0 500 5 0 3 0 3 2 導入プラスミ ド 耐性コロニー数 感受性コロニー数 阻害率 pYEUra3 7 4 6 NA pYBUra3-TobSAHH 6 6 1 4 1 2 表 5が示すように、 酵母に pYEU r a 3— To b S A H Hを導入した場合に は、 コントロールに比べ、 感受性コロニー数の増加が認められた。 このことは、 アンチセンス SAHH遺伝子の導入が、 Ty l トランスポゾンの核 DN Aへの転 移 （トランスポジション） を阻害したことを意味する。 このように細胞自体にお いて、 S AHH遺伝子の発現の阻害が生じたことは、 本発明の SAHH阻害が、 実施例にある植物だけでなく、 菌類や動物において可能であることを示唆するも のである。
〔実施例 5〕 内在性サイ トカイニンに対する SAHHの影響
形質転換タバコのァンチセンス SAHH RN Aの発現とそれに伴うセンス R NAの減少をノーザンブロッテイング法により分析した。 即ち、 タバコ葉から m RNAを抽出し、 ァガロースゲルで分離した後、 RNAをナイロンメンブランに トランスファーし、 次いで、 SAHHmRNA (センス） またはアンチセンス R N Aを試験管内で合成し、 これらのリボブローブを使用してハイプリダイゼーシ ヨンを行った。 この結果を図 6に示す。 図中の Bは非形質転換体 BY— 4を示し、 Xは非形質転換体 Xa n t h i n cを示す。 また、 Cはコントロールの花頭部 から抽出した mRNAを示す。 図が示すように形質転換体では、 アンチセンス R NAが合成されており、 また、 センス RNAの減少が観察された。
また、 この時の形質転換タバコの内在性サイ トカイニンの量について測定した < 即ち、 タバコの導管液 （root exudate) を回収し、 これに培地成分を加えて、 タ カルスによるバイオアツセィを行った。 Aは形質転換 Xa n t h i n cタ のサイ トカイニン量を示し、 Bは非形質転換 X a n t h i n cタバコのサ ィ トカイニン量を示し、 Cは導管液に抗サイ トカイニンを加えて、 サイ トカイ二 ン活性を抑えた場合のサイ トカイニン量を示す。 図が示すように形質転換体のサ ィ トカイニン量 （A) は、 非形質転換体のサイ トカイニン量 （B) の約 3倍の量 に增加している。
以上の図 6及び図 7に示された結果を考察すれば、 S AHHのアンチセンス阻 害によって S AHHが減少し、 その結果、 内在性サイ トカイニンが増加したもの と推論できる。
配列表
配列番号 1
配列の長さ ： 1 8 1 2塩基
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： c DNA t o mRNA
ハイポセティカル配列： N o
ァンチセンス ： N o
起源
生物名：ニコチアナ · タバカム （Nicotiana tabacum)
株名： BY— 4
分化の程度： ジャームライン
ハブロタイブ： ジブロイ ド
組織の種類：花軸 （培養組織）
直接の起源
ライブラリ一名： タバコ花軸培養組織由来 c DN Aライブラリ一 配列：
GAAGAGAAAA AACCCTCTCA AATCTCATCT CTAACCACCC AATTTCTCAT ACTCCCTCTA 60 CCC ATG CCT CTA TTA CTC GAG JUG ACC ACC TCT GGC CCC GAG TAC KKQ 1 08
CTC AA G CAC ATC TCT CAC CCC CAT TTC GGC CGG CTT GAA ATC GAG CTC 1 56
CCC CAA CTT CA A ATC CCT CCT CTC ATC CCT TCT CCT ACT Qkk TTT CCC 2(M
CCT TC A CAC CCA TTT AAA CCT GCT AAG ATT ACT CCA TCT TTA CAT ATC 252
ACC ATT CAA ACT CCA CTT TTC ATT CAA ACC CTT ACT CCT TTG CCT CCT 300
CAA CTT ACA TCC TCT TCT TCC A AC ATC TTC TCC ACT CAA CAT CAC CCC 348
CCT CCT CCC ATT CCA CCT GAC AGC CCC CCC CTG TTC GCG TCC AAG CCT 396
CAC ACT C TC CAG CAG TAT TCC TCC TCT ACT GAG AGG GCA CTT CAC TCC H i
CCT CC A CCT GCT GGC CCC CAC TTC ATC CTC GAC CAT CCT CCT CAT CCT 492
AC A CTC TTC ATT CAT GAG CCT CTT AAG CCA GAA Qkk GAG TTT CCT AAC 540
JUT GGG ACA ATC CCA CAT CCT AAC TCT ACC CAT AAT CCT GAG TTT CAG S88
CTT GTA CTT ACT ATT ATT AAG GAA ACT TTC AAG ACT CAT CCT TTA AAA ( 36
TAT ACC AAG ATC AAG GAA AGA CTC CTC CGT CTT TCT GAG GAA ACT ACC (84
ACT GGA CTT AAG AGG CTT TAT CAG ATC CAC CCT AAT GGA ACT TTC CTT 732
TTC CCT CCT ATT AAT CTT AAT CAT TCT CTT ACC A AG ACC AAG TTC GAC 780
AAC TTG TAC GGA TCC CCC CAC TCA CTC CCC CAT CCT CTC ATC AGG GCT 828
ACT G AT GTT ATC ATT CCC GGA AAC CTT CCC CTT CTT CCT CCT IAT GCA 87i
CAT CTC CCC AAG CCT TCT CCT GCT CCC TTG AAA CAA CCC CCT CCC CCT 924
CTC ATT CTC ACC GAG ATT GAC CCT ATC TCT CCT CTC CAG CCT ACC ATC 972
GAA GGC CTC CAG CTC CTT ACT CTA GAG CAT CTC CTT TCT CAT CTT CAT 1 020
ATC TTT GTC ACC ACG ACC CCT AAC AAG GAC ATT ATC /TG CTT GAC CAC 1 068 ATC AGG JUG ATG AAG AAC AAT CCC ATT CTT TCC AAC ATT CCT C AC TTT 1 1
GAC AAC GA A ATC GAC ATfi CTT GCT CTC G AG ACC TAC CCT GCT GTC AAG 1 1 64
AGG ATC ACA ATT AAG CCT CAA ACC CAC AGA TCC CTC TTC CCT CAC ACC 1 21 2
AAC AGT GGC ATC ATT CTC TTC CCT GAG CGT CCT CTC ATG AAC TTC GGA 1 260
TGT CCC AC A GGA CAC CCT ACT TTT GTG ATC TCC TCC TCC TTC ACT AAC 1 308
CAA GTC ATT GCC CAA CTC GAG TTG TCC AAT Qkk AAG AGC ACT GGG AAG 1356 TAT GAG AAC AAA CTG TAT GTC TTC CCA AAA CAC CTC GAC GAG AAC CTT
CCT GCA CTT CAT CTC GGA AAG CTC GGA GCC AAG CTT ACC AAA CTT TCG 14S2
AAC GAT CAA CCT CAC TAC ATT AGC CTT CCA CTT GAG CCT CCT TAC AAC ISOO CCT CCT CAC TAC ACC TAC TGAGCGAAAA CAAATCCACA GAGGAGAACA me
CCATTCTCCC CCCATCATTC TTTTCCATTT AATACTTTCA TTTTCTTTAC CATACTACTA 08
TTTTCAATAT TCCTCCTCAT ATATTTCCCA GGAAGTCGCA TCTTTTGCTC GAAAAGAAAT l"8
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TCAAACCAAC ACTTTTACCT TTTC IS12 発明の効果
本発明は、 S A HH遗伝子の発現が実質的に抑制された生物を提供する。 SA HH遗伝子の発現が実質的に抑制された生物は、 ウィルス抵抗性などの優れた特 性を有し、 産業上有用である。
図面の簡単な説明
図 1は形質転換 X an t h i n cタバコの生物の形態を示す写真であり、 該 形質転換体にタバコモザイクウィルスを接種したときの局部病斑部を表す。
図 2は形質転換 X an t h i n cタバコの生物の形態を示す写真であり、 該 形質転換体の外観を表す。
図 3は形質転換 X a n t h i n cタバコの生物の形態を示す写真であり、 該 形質転換体の花を付けたときの外観を表す。
図 4は形質転換 X a n t h i n cタバコの生物の形態を示す写真であり、 わ き芽が異常に多く多数の花を付けたものを表す。
図 5は形質転換 X an t h i n cタバコの生物の形態を示す写真であり、 該 形質転換体の花の部分を表す。
図 6は形質転換タバコから抽出した mRN Aの電気泳動を示す写真である。 図 7は形質転換タバコ中の内在性サイ トカイニン量を示す図である。
図 8は本発明に用いるハンマーへッ ド型のリボザィムを示す図である。
図 9は形質転換ペチュニアから抽出された DN Aの電気泳動を示す写真である。

Claims

請求の範囲
1 . ゲノム遗伝子中に存在する S —アデノ シルホモシスティンハイ ドロレース遗 伝子の発現が実質的に抑制されていることを特徴とする形質転換生物。
2 . ゲノム遗伝子中に S —アデノ シルホモシスティンハイ ドロレース遺伝子に対 するアンチセンス R N Aを転写する塩基配列が組み込まれていることを特徴とす る請求項 1記載の形質転換生物。
3 . ゲノム遗伝子中に S —アデノシルホモシスティンハイ ドロレース遺伝子に対 するブラスセンス R N Aを転写する塩基配列が組み込まれていることを特徴とす る請求項 1記載の形質転換生物。
4 . ゲノム遗伝子中に S —アデノシルホモシスティンハイ ドロレース遗伝子の m R N Aを切断するリボザィムを転写する塩基配列が組み込まれていることを特徴 とする請求項 1記載の形質転換生物。
5 . S—アデノシルホモシスティンハイ ドロレース遗伝子の発現を制御する領域 あるいは該遗伝子の制御因子が不活性化されていることを特徴とする請求項 1記 載の形質転換生物。
6 . ゲノム遗伝子中に S—アデノシルホモシスティンハイ ドロレースと結合する 蛋白質を合成する塩基配列が組み込まれていることを特徴とする請求項 1記載の 形質転換生物。
7 . ゲノム遗伝子の組換えにより、 当該ゲノム遺伝子中に存在する S —アデノシ ルホモシスティンハイ ドロレース遺伝子の発現を実質的に抑制することを特徴と する S —アデノシルホモシスティンハイ ドロレース遗伝子の発現が実質的に抑制 されている形質転換生物の作出方法。
8 . 前記ゲノム遺伝子の組換えが、 ゲノム遺伝子中に S —アデノシルホモシステ ィンハイ ドロレース遗伝子に対するアンチセンス R N Aを転写する塩基配列を組 み込むことである請求項 7記載の S —アデノシルホモシスティンハイ ドロレース 遺伝子の発現が実質的に抑制されている形質転換生物の作出方法。
9 . 前記ゲノム遗伝子の組換えが、 ゲノム遺伝子中に S—アデノシルホモシステ ィンハイ ドロレース遠伝子に対するブラスセンス R N Aを転写する塩基配列を組 み込むことである請求項 7記載の S —アデノシルホモシスティンハイ ド口レース 遗伝子の発現が実質的に抑制されている形質転換生物の作出方法。
1 0 . 前記ゲノム遗伝子の組換えが、 ゲノム遺伝子中に S—アデノシルホモシス ティンハイ ドロレース遺伝子の m R N Aを切断するリボザィムを転写する塩基配 列を組み込むことである請求項 7記載の S—アデノシルホモシスティンハイ ドロ レース遗伝子の発現が実質的に抑制されている形質転換生物の作出方法。
1 1 . 前記ゲノム遗伝子の組換えが、 S —アデノシルホモシスティンハイ ドロレ ース遺伝子の発現を制御する領域あるいは該遗伝子の制御因子を不活性化するこ とである請求項 7記載の S—アデノシルホモシスティンハイ ドロレース遺伝子の 発現が実質的に抑制されている形質転換生物の作出方法。
1 2 . 前記ゲノム遺伝子の組換えが、 ゲノム遗伝子中に S —アデノ シルホモシス ティンハイ ドロレースと結合する蛋白質を合成する塩基配列を組み込むことであ る請求項 7記載の S —アデノシルホモシスティンハイ ドロレース遺伝子の発現が 実質的に抑制されている形質転換生物の作出方法。
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