WO1996012816A1

WO1996012816A1 - Procede de production de proteines

Info

Publication number: WO1996012816A1
Application number: PCT/JP1995/002186
Authority: WO
Inventors: Kaoru Kobayashi; Kenji Tomomitsu; Shinobu Kuwae; Tomoshi Ohya; Toyoo Ohda; Takao Ohmura
Original assignee: The Green Cross Corporation
Priority date: 1994-10-25
Filing date: 1995-10-25
Publication date: 1996-05-02
Also published as: DE69530176T3; ES2191064T3; US6068995A; DE69530176D1; CN1254545C; EP0736605B2; KR100405944B1; DE69530176T2; EP0736605B1; CA2179825C; EP0736605A4; KR970700775A; CA2179825A1; DK0736605T3; EP0736605A1; TW493003B; CN1141652A; JP3661191B2; ES2191064T5

Description

明細書

タンパク質の生産方法

技術分野

本発明は、培養プロセスにおける培地への基質添加速度の制御によるタンパク質の生産方法に関し、かくして、タンパク質の効率的生産が達成される。詳細には、本発明は比増殖速度//を指標とする流加培養系での培養環境の最適化を培地への基質添加速度の制御によって実現し、夕ンパク質を効率的に生產する方法に関する。

背景技術

現在、商業的に価値のあるタンパク質の多くは、その遠伝子を発現し得る宿主細胞を培養することにより生産されている。

培養技術もしくは遺伝子組換え技術を用いるタンパク質の生產は、培養により宿主細胞が指数関数的に増殖するに伴って所望のタンパク質が産生されることを利用するものであるが、夕ンパク質の生産性を向上させるためには宿主細胞の働き（細胞の機能）を最も有効に活用できるようにその培養環境を整備または制御する必要がある。このため、培養プロセスの面から、培養生産に適した、すなわち所望のタンパク質を短時間で高い収率，収量をもって生産する方法が種々検討されている。

宿主細胞の比増殖速度と該宿主細胞が産生するタンパク質の量との間には密接な関係があり、該夕ンパク質の產生量を最大にするためにはその宿主細胞の比増殖速度を至適な値にコントロールすることが必要である。このため、従来より宿主細胞（微生物）の産生量と比増殖速度との関係について種々研究され、数多くのモデルが提案されている。

これらのモデルによると、產生量の増大を図るためには、培養の途中で、紬胞の比増殖速度を少なくとも一回異なる比増殖速度に切り替える必要が生じる場合がある（酸酵工学会 Ιέ、第 7 0巻、第 5号、 395 -404、 1992) 。

しかしながら、本発明者らの研究により、このような培養の最適化を図るがゆえの比増 ¾速度の切り替えによっては、目的生産物の產生量は期待した程上昇しないことが初めて分かった（本明細書、実施例 1参照）。

従って、宿主細胞による目的生産物の生產性を向上させるためには、宿主細胞の比増殖速度の切り替えに際して、宿主細胞の機能に影響を与えることなく生産物を効率よく產生させるような培養方法が求められる。

本発明の目的は、流加培養系において、宿主細胞の比増殖速度を培地への基質の流加速度で制御することにより、短時間で所望のタンパク質を大量に產生し得るタンパク質の生産方法を提供することである。

また、他の面において、本発明は所望のタンパク質を高効率で生產し得る宿主細胞の培養方法を提供することを目的とする。

発明の開示

本発明者らは、フィードバック制卸をしないで宿主紬胞の比増殖速度を最適値（目的値）に調整 ·制御する方法として、流加培養における基質の流加速度と宿主細胞の比増殖速度、ひいては目的生産物（タンパク質）の産生量との関係を検討していたところ、培地への基質の流加速度を連梡的に変化させることにより、培養途中での細胞の比増殖速度; /の切り替えに際して、細胞の機能および目的生産物の生産量に悪影饗を与えることなく、目的生産物の生産性が向上することを見出して本発明を完成した。

即ち、本発明は、宿主細胞、好ましくは所望のタンパク質が構成的に発現するか、もしくは誘導物質により宿主細胞が増殖可能な場合に所望のタンパク質が実質上構成的に発現する宿主細胞を流加培養により増殖させて所望のタンパク質を生産する方法であつて、宿主細胞の比增殖速度を当初の比増逋速度から所定の比増殖速度に切り替えるに際して、その切り替えを、宿主紬胞の増殖を支配する基質の添加速度を連続的に変化させることにより行うことを特徴とする所望の夕ンパク質の生産方法である。

図面の簡単な説明

図 1は、メタノールの培地への添加速度の経時的変化を示す図である（実施例 1 ) o

図 2は、メタノールの添加速度を連铰的に変化させる系（本発明）の比増殖速度の経時的変化（図 a ) 、およびメタノールの添加速度を瞬時に変更する系（対照①〉の比増殖速度//の経時的変化（図 b ) を示す図である。

図 3は、メタノールの添加速度を連较的に変化させる系（本発明一△一）と該添加速度を瞬時に変更する系（対照①一書 -）とで、増殖する菌体濃度を比較した図である。

発明の詳紬な説明

本発明において、「所望のタンパク質が構成的に発現する」とは、所望のタンパク質が宿主紬胞の生育条件とは無関係に常に発現することを意味する。

また、本発明において「誘導物質により宿主細胞が増殖可能な場合に所望の夕ンパク質が実質上様成的に発現する」とは、宿主細胞の生育条件とタンパク質の発現との間に何らかの関係があり、宿主細胞の増殖に必要な物質と誘導物質とが同じである場合に、宿主細胞の増殖と同時に所望のタンパク質も発現することをいう。

また、ここで「誘導物質」とは、所望のタンパク質をコードする遺伝子の転写 - 翻訳を開始させる物質をいい、例えばメタノール、ガラクトース、スクロース等が挙げられる。

本発明で用いられる「所望のタンパク質を発現しうる宿主細胞」（以下、単に宿主細胞という）としては、自然に生じる天然由来の細胞または外来タンパク質を産生することができるように変異した細胞（以下、適宜形質転換細胞ともいう。が挙げられる。

また、宿主細胞の由来も特に限定されず、例えば、微生物〔細菌（例えば、ェシユリキア厲菌，バチルス属菌等），酵母（例えば、サッカロマイセス厲，ピキァ厲等）〕等が挙げられる。具体的には、エシュリキ了厲菌では、エシュリキア ' コリ (Escherichia col i、以下、 E. col i という） K12DH1. M103. JA221, HB101. X600. XL-1 Blue. JM109などが例示される。バチルス厲菌ではバチルス ·サブチリス (Bacillus subtilis) MI114, 207-21などが、また酵母としては、サッカロマイセス · セレピシェ（Saccharomyces cerevisiae) AH22. AH22 - , NA87-11A. DKD- 5D、およびピキア 'パストリス（Pichia pastoris)などが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。好ましくは、酵母である。

また、宿主細胞として酵母を用いる場合、メタノール資化性（methylotrophic) 酵母であってもよい。適切なメタノール資化性酵母としては、ハンセヌラ属またはピキア厲に所厲するメタノール中で増殖しうる酵母が挙げられるが、これらに限定されない CThe Biochemistry of methylotrophs, 269 (1982) ：! 。好ましくは、ピキァ属メタノール资化性酵母であり、例えば栄養要求性ピキア .パストリス GTS 1 1 5 (NRRL Y— 1 5 8 5 1 ) . ビキア ·パストリス GS 1 9 0 (NRRL Y— 1 8 0 1 4 ) , ビキア 'パストリス P P F 1 (NRR L Y— 1 8 0 1 7) 、野生型ビキア 'パストリス株（NRRL Y- 1 1 4 3 0、 NR RL Y- 1 1 4 3 1 ) 等が挙げられる。

「宿主钿胞」として好ましくは、当該宿主細胞に対して異種である所望のタンパク質（以下、適宜異種タンパク質という）を產生し得る形質転換細胞である。当該細胞は、異種タンパク質の了ミノ酸配列をコードし得る外来 DNAを有しており、かつ該 DN A情報により所望の異種タンパク質を発現 ·産生する細胞であればよい。また、その取得方法も特に限定されない。例えば、組換え DNA技術を使用して、所望のタンパク質をコードする DNAを担持するブラスミドまたはファージなどで形質転換することによって取得することができる。

本発明でいう「宿主細胞」の一具体例として、 HS Aを産生する宿主細胞が挙げられるが、当該細胞の調製ならびに該細胞の使用による HS Aの発現 ·産生は、公知ならびにそれに準じた手法により実施することができる。

具体的には、例えば通常のヒト血淸アルブミン遗伝子を用いる方法（特開昭 5 8— 5 6 6 8 4号、同 5 8— 9 0 5 1 5号、同 5 8 - 1 5 0 5 1 7号公報）、新規なヒト血淸アルブミン遺伝子を用いる方法（特開昭 6 2— 2 9 9 8 5号、特開平 1一 9 8 4 8 6号公報）、合成シグナル配列を用いる方法（特開平 1一 2 4 0 1 9 1号公報）、血清アルブミンシグナル配列を用いる方法（特開平 2 - 1 6 7 0 9 5号公報）、組換えブラスミドを染色体上に組み込む方法（特開平 3 - 7 2 8 8 9号公報）、宿主同士を融合させる方法（特開平 3 - 5 3 8 7 7号公報）、メタノール含有培地中で変異を起こさせる方法、変異型 AOX₂ プロモーターを用いる方法（特開平 4— 2 9 9 9 8 4号公報）、枯草菌による HSAの発現（特開平 6 2— 2 5 1 3 3 号公報）、酵母による HS Αの発現（特開昭 6 0 - 4 1 4 8 7号、同 6 3 - 3 9 5 7 6号、同 6 3— 7 4 4 9 3号公報）、ピキア属酵による HS Aの発現（特開平 2— 1 0 4 2 9 0号公報） ^が例示される。

本発明の方法が対象とする所望のタンパク質は、特 ί 定されず、上述の天然由来の宿主細胞が産生する該細胞の構成タンパク質、；：：こ形質転換細胞が産生する外来タンパク質等いずれの夕ンパク質であってもよい。

具体的には、宿主細胞の構成タンパク質としては RNAボリメラ一ゼ，ァクチン，呼吸系または解糖系に関わる酵素等が例示され、また異種タンパク質としてはインターフェロン，ゥロキナーゼ，ブロウ口キナーゼ， t一 ΡΑ (組織ブラスミノーゲン活性化因子）， G— CSF (顆粒球 · コロニー刺激因子）， IV [— CS F (マクロファージ · コロニー刺激因子）， HSA (ヒ卜血清アルブミン）， I GF (インシユリン樣成長因子），尿性トリブシンインヒビター（UT I ) 等か例示される。好ましくは、 HSA, インターフヱロン，ゥロキナーゼ，プロウ口キナーゼ， I GF, UT Iであり、より好ましくは HSAである。

また、宿主細胞と異種タンパク質との組合せについても特に制限はなく、適宜組み合わせることができる。例えば、エシュリキア · コリとインターフロン，サッカロマイセス，セレピシェとブロウ口キナーゼ，サッカロマイセス *セレビシェと HSA，ピキア ·パストリスと HSA等が挙げられる。

宿主紬胞（形質転換細胞）の培養は、流加培養法により、種々 r、炭素エネルギ —源および/または栄養源を含有する培地を用いて行うことができる。すなわち、一定期間、宿主細胞をその増殖に適した炭素エネルギー源およびまたは栄養源を含有する培地（初期培地）中で培養し、状況に応じてある時点から、宿主細胞の増殖を支配する基質を該培地に追加供給しながら、目的タンパク質を培養終了時まで系外に抜き出さない方法が用いられる（特開平 3— 8 3 5 9 5号公報）。本発明で「宿主細胞の増殖を支配する基質」とは、宿主細胞を増殖させるのに適した基質をいい、好ましくは炭素エネルギー源となりうるものである。

当該基質としては、メタノール，グリセリン，ソルビトール，グルコース，フルクトース. ガラクト一ス，スクロース等が例示される。また、これらは 1成分に限定されず 2成分以上であってもよい。

宿主細胞としてピキア ·パストリスを用いる場合の好ましい基質としては、メ夕ノ一ル，グリセリンおよびそれらの組合せからなる群から選択されるものが例示される。宿主細胞としてサッカロマイセス ·セレビシェを用いる場合の好ましい基質はガラクトース，スクロース等、またエシュリキア ' コリを用いる場合はラクトース等が例示される。

さらに、培地に添加する基質の態様は、基質そのもの単独であってもよいし、また他の成分（例えば、ビタミン，無機塩等）に配合された組成物の態様であつてもよい。また、添加する形態として、固形状、粉体状、顆拉状、液体状等のいずれの形憨であってもよいが、好ましくは、速やかに培地に均一に溶解し得る液体状のものである。

宿主細胞の初期培養に用いられる炭素エネルギー源および Zまたは栄養源としては、培養する宿主紬胞に応じてそれに適した公知の炭素エネルギー源および Z または栄養源が挙げられる。炭素エネルギー源としては、例えばグルコース，グリセリンが挙げられ、栄養源としては、例えば窒素源（例えば、イーストエキストラクト，ノくタトペプトン. カザミノ酸. アンモニア，リン酸アンモニゥム. 酸アンモニゥム等）、ホスフエ一ト源（リン酸，リン酸アンモニゥム等）、無機質源その他微量元素（例えば、鉄，亜鉛. 銅，マグネシウム，マンガン，カルシゥム. モリブデン，コバルトなど）、ならびにビタミン（例えば、ビォチン，パントテン酸，チアミン等）等である。

本発明でいう「基質の添加速度を連梡的に変化させる」とは、培養槽に添加する基質の速度を途切れることなく連なり続くように変えることをいう。この結果、宿主細胞の比増 ¾速度は当初の比増殖速度から所定の比増殖速度へと緩やかに切り替わる。

本発明でいう「宿主細胞の比増殖速度 Zj とは、単位時間（h r) , 単位細胞量当たりの宿主細胞の増殖量をいい、一般に下式のように表される。

1 AXV

u =

XV Δί

〔式中、 Xは菌体濃度（gZL)、 Vは培地量（L) 、 tは培養時間（h r：) 、 ΔΧν, △ tはそれぞれ XV, tの変化量を表す。〕

本発明でいう「当初の比増殖速度から所定の比増殖速度に切り替える」とは、宿主細胞の当初の比増殖速度を、流加培養の途中で異なる所定の比増殖速度に変化させることを意味する。好ましい当初の比増殖速度，所定の比増殖速度および切り替え時間（換言すれば、当初の比増殖速度に保たれる時間）は、比増殖速度と比生産速度 pとの関係から求めることができる（醱酵工学会誌、第 7 C \ 第 5号、 395-404. 1992 ) 。

ここでいう比生産速度 Pとは単位時間 (h r) , 単位綑胞量当たりのタンパク質の生産の増加量をいい、一般に下式のように表される。

1 APV

Ρ= X

XV Δί

〔式中、 Ρはタンパク質の生産量（gZL)、 Vは培地量（L)、 tは培養時間 (h r) 、 ΔΡ V. 厶 tはそれぞれ PV, tの変化量を表す。〕

なお、当該切り替えは複数回行ってもよい。

本発明で用いられる培養温度は、培養する宿主細胞に応じてその増殖および所望夕ンパク質の産生に適した温度であることが好ましい。宿主細胞が大腸菌の場合は 20〜4 6て、好ましくは 3 6〜3 8'Cであり、酵母の場合は約 20〜3 5 'C、好ましくは約 23〜3 (TCであり、枯草菌の場合は 2 8〜4 0^eC、好ましくは 3 6〜3 8'Cである。

また、培地の pHも、培養する宿主紬胞に応じてその増殖および所望タンパク質の産生に適した pHを適宜採用することができる。さらに、培養槽の溶存酸素含量は飽和の約 1 0〜7 0 %の範囲で適宜選択採用することができる。

以下、実施例および参考例に基づいて本発明をより詳紬に説明する。しかし、本発明はこれによってなんら限定されるものではない。

実施例 1

HS Aを発現 ·産生し得るピキア厲酵母 UHG 4 2 - 3株（特開平 4 - 2 9 9 8 4号公報にその作成方法が記載されている。）の比増殖速度を当初の比増殖速度；/' = 0. 0 2 5から所定の比増殖速度^'' = 0. 0 0 2に切り替える培養系を用いて、 HSAの產生を行った。具体的には、下記の方法で行った。

( 1 ) 培養方法

①前培養

前培養は YPDブロス（2%バクトペプトン、 1 %酵母抽出物、 2 %ダルコ一ス）を用いて行った。詳細には、 20 %グリセロール中に凍結保存したピキア厲酵母 UHG 4 2一 3株の菌体懸濁液 l mL (OD_s<。 0) を 5 0mLの YP Dブロスを含むバッフル付き 3 0 OmL容三角フラスコに植菌して、 3 0°Cにて 2 4時間振盪培養した。

②本培養

本培養は、一定時間、表 1に示す組成からなる培地（初期培地）を用いて回分培養した後、メタノールを図 1に示す流加速度で連続的に添加しながら行った。表 1 初期培地の組成

YTM溶液 * の組成成分濃度 z/ m

FeS0₄ 2H₂0 6 5. 0

CuSO, 5H₂0 6. 0

MnS0« 4-5H₂0 4. 1 1 ZnS0₄ 7H₂0 2 0. 0

H₂S0₄ 5. 0 (m ）詳細には、バッチ培地 1. 7 Lを含む 1 0 L容ジャ一フアーメン夕一（バイオマスタ一 D型、 1 0 L) に前培養液を 3 4 mL植菌し通気攪拌培養した。培養温度は 3 O'Cとした。 «拌速度は 9 0 0 r pmで一定にして回分培養を行った。 p Hは pH 5. 8 5に定値制御した。消泡のため、消泡剤を必要に応じて添加した。回分培養において初期培地中のグリセロールが全て消費された時点（培養 2 4 時間目）からメタノールの添加を開始した。

メタノールの添加速度は、下式に従って制御した〔但し、 tはメタノール添加開始後の経過時間（h r) を示す。〕。

0 ≤ t <72 のとき、 F(t) =3.712 x exp(0.025 t) (g/hr)

72≤ t <92 のとき、 F(t) =22.456 x exp[-0.025 x (t-72)]

92≤ t のとき、 F(t) =13.62 exp[0.002x (t-92)]

図 1 にメタノールの添加速度の柽時的変化を示す（培養約 2 4〜9 6時間目は実棣、培養約 9 6〜！ 1 6間目は紬か t、破線、および培養約 1 1 6〜 3 6 0時間目は実線で表される）。

メタノ一ルの添加開始時の培養約 2 4時間目から培養約 9 6時間目まではビキァ属酵母の当初の比増殖速度 ' が 0. 0 2 5となるようにメタノールを添加し、ついでメタノールの添加速度を一旦図中紬かい破線で示すように穏やかに減少させ、引き続きピキア厲酵母の所定の比増¾速度 '' か 0. 0 0 2となるようにメタノ一ルを添加した。

また、比較対照実験として、 ①/ を 0. 0 2 5から 0. 0 0 2に切り替えるに際して添加速度を瞬時に変更する系での培養、および、 ② を切り替えない系での培養を行った。

①の切り替えに際して、メタノールの添加速度を瞬時に変更する系でのメ夕ノールの添加速度は、下式に従って制御した〔但し、 tはメタノール添加開始後の経過時間（h r) を示す。〕。なお、当該系のメタノール添加速度の経時的変化は、図 1中の実線および太い実線で表される。

0≤ t < 72 のとき、 F(t) =3.712 X exp(0.025 xt) (g/hr) l o 72≤ t のとき、 F(t) =13.086 exp[0.002x(t-72)]

すなわち、メタノールの添加開始時の培養約 24時間目から培養約 9 6時間目まではピキア属酵母の当初の比増殖速度〃' が 0. 0 2 5となるようにメタノールを添加し、ついでビキア属酵母の所定の比増殖速度 " を 0. 0 0 2に切り替えるに際して、メタノールの添加速度を瞬時に変更し、引き铳きが 0. 0 0 2 となるように制御した。

また、 ②の〃を切り替えない系でのメタノールの添加速度は、下式に従って制御した〔但し、 tはメタノール添加開始後の経過時間（h r) を示す。〕。当該式による制御が、を切り替えない系での好適な培養方法である。すなわち、 = 0. 0 1 5となるようにフィ一ドを開始し、溶存酸素濃度（培養液中に溶け込んでいる酸素濃度）が一定 S度より低くなつた時点で定速流加にする方法である。なお、当該系のメタノール添加速度の経時的変化は、図〗中の破棟で表される。

0≤ t <127 のとき、 F(t) =2.176 x exp(0.015x t) + 1.632 (g/hr) 127≤ t のとき、 F(t) =16.253

図 2に、メタノールの添加速度を連铙的に変化させる系（本発明）での ^の切り替わり方〔図 2 (a) 〕と、添加速度を瞬時に変更させる系（比較対照①）でのの切り替わり方〔図 2 (b) 〕を比較した結果を示す。

また、各塔養の結果として、図 3に菌体濃度の経時変化（本発明と比較対照①）を、また表 2に培養終了時点での HS A産生割合（本発明、比較対照①および②）を示す。

表 2

培養系

ri S A

切替えの有無添加速度の切替え產生割合切替え無（対照②） 100 % 切替え有瞬時変更（対照①） 107 %

〃連 ¾的変化（本発明） 156 %

培養後約 3 6 0時間目の産生 HS A量を比較すると、の切り替えをする場合 (本発明、比較対照①）としない場合（比較対照②）とでは切り替えをした方がいいが、切り替えをする場合であっても、流加速度の瞬時の変更を実施した場合 (比較対照①）の HS Aの產生量（ 1 0 7%) に比べて、流加速度の連铙的変化の系を実施した場合（本発明）での HSAの産生量は 1 5 6 %と大きく、の切り替えに際して基質（メタノール）の添加速度を連铙的に変化させることにより、所望のタンパク質（HSA) の産生量が向上することが判明した。

実施例 2

本培養に際してメタノールの代わりに表 3に記載のフィ一ド培地を用いることのみを異にして、あとは実施例 1 と同じ方法で培養を行った。

その結果、実施例 1 と同様な結果が得られた。表 3 フィード培地組成

参考例 1 菌体濃度の測定

任意の培養時間で培養液をサンプリングし、蒸留水で则定時の OD₅₄。値が 0. 3以下となるように希釈したのち、分光光度計（UV 2 20 0型、島津製作所）を用いて 5 4 0 nmにおける吸光度を測定し、その値に希积率をかけて、培養液の吸光度とした。さらに、 OD₅₄₍₎ 5. 6を指標として、該吸光度から乾燥菌体饞度を算出した。

参考例 2 HS A濃度の測定

任意の培養時間で培養液をサンプリングし、， 000r pmで 5分間遠心した。得られた上淸をウルトラフリー C 3HVにより清澄濾過後、下記条件下での H P L Cによるゲル據過分析を実施した。

カラム： TSKg e l G 3 0 0 0 SWxi

移動相： 0.3 M Na C】， 50 mM リン酸ナトリウム. 0.1 % NaN ₃. pH6.5 流速：】 . 0 m】 Zm i n

インジェクション量： 5 0 /z l

*. A 2 0 八 350 ( 2波長）

参考例 3 メタノール澀度の測定

任意の培養時間で培養液をサンプリングし、 15.000 r pmで 5分間遠心した。得られた上淸をウルトラフリー C 3 H Vにより清澄據過後、下記条件下での H P L Cによる定量分折を実施した。

カラム： Sugar-pak Ca (Waters 社製）

移動相： 0.02 % NaN 3

カラム温度： 8 O 'C

インジェクション量： 2 8 1

検出：示差屈折計

産業上の利用可能性

本発明の培地への基質添加速度の変化憨様によれば、流加培養系の最適化を念頭において求められる比増殖速度 //や比生產速度 pの最適パターンを実現することかできる。また、この実現により、流加培養による宿主細胞の高密度培養が可能となり、短時間で効率よく所望のタンパク質を生產することができる。

従って、本発明の方法は、 HSA, I GF, ブロウ口キナーゼ. UT I等の商業的価値の高いタンパク質の工業的製法として極めて有用である。

Claims

請求の範囲

1 . 所望の夕ンパク質を発現しうる宿主細胞を流加培養により增殖させて所望夕ンパク質を生産する方法であって、宿主細胞の比増殖速度を当初の比増殖速度から所定の比増殖速度に切り替えるに際して、その切り替えを、宿主細胞の増殖を支配する基質の添加速度を連铙的に変化させることにより行うことを特徴とする前記夕ンパク質の生産方法。

2 . 宿主細胞か、所望のタンパク質を構成的に発現するか、もしくは誘導物質により増殖可能な場合に所望の夕ンパク質を実質上構成的に発現する宿主細胞である請求項 1記載のタンパク質の生產方法。

3 . 宿主細胞が、酵母由来の細胞であることを特徴とする請求項 1記載のタンパク質の生産方法。

4 . 宿主細胞が、メタノール資化性酵母由来の細胞であることを特徴とする請求項 1記載のタンパク質の生産方法。

5 . 宿主細胞が、ビキア属酵母由来の細胞であることを特徴とする請求項 1記載のタンパク質の生産方法。

6 . 所望のタンパク質が、宿主钿胞に対して異種タンパク質であることを特徴とする請求項 1乃至 5のいずれかに記載の夕ンパク質の生産方法。

7 . 異種タンパク質が、ヒト血清アルブミンであることを特徴とする請求項 6に記裁のタンパク質の生産方法。

8 . 宿主細胞の増殖を支配する基質が、炭素エネルギー源である請求項 1記載の夕ンパク質の生産方法。

9 . 炭素エネルギー源がメタノール. グリセリン，ソルビトール. グルコース. フルクト一ス，ガラクトース，スクロースから選ばれる請求項 8記載のタンパク質の生産方法。

1 0 . 宿主細胞が、ビキア属酵母由来であり、宿主細胞の增逋を支配する基質がメタノール、グリセリンおよびそれらの組合せからなる群から選ばれる請求項 1 記載のタンパク質の生産方法。

1 1 . 宿主細胞が、サッカ πマイセス属由来であり、宿主細胞の増殖を支配する基質がガラクトース、スクロースおよびそれらの組合せからなる群から選ばれる請求項 1記載の夕ンパク質の生產方法。