WO1996006172A1 - Enzyme d'introduction du groupe ceto, adn codant pour cette enzyme et procede d'elaboration de cetocarotenoide - Google Patents

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Susumu Kajiwara
Norihiko Misawa
Keiji Kondo
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Kirin Beer Kabushiki Kaisha
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones

Definitions

  • Keto group-introducing enzyme DNA encoding it and method for producing ketocarotenoid
  • the present invention is useful for coloring cultured seafood such as sea bream, sea bream, shrimp, etc., and also introduces a keto group necessary for the synthesis of ketocarotenoids such as astaxanthin used in foods as coloring agents and antioxidants.
  • the present invention relates to an enzyme, a DNA encoding the same, a recombinant vector containing the DNA, a microorganism into which the DNA has been introduced, and a method for producing ketocarotenoid using the microorganism.
  • Ketocarotenoid is a general term for carotenoid pigments containing a keto group.
  • Carotenoids are synthesized from mevalonic acid as a starting material through a common isoprenoid biosynthetic pathway halfway to steroids and terpenoids (see Fig. 6).
  • Condensation of the basic unit C5 isopentenyl pyrophosphate (IPP) and its isomer dimethylarylpyrophosphate (DMAPP) produced by the basic isoprene biosynthesis system results in the formation of C10 geranyl pyrophosphate (GPP).
  • the IPP is then condensed to produce funnelsyl pyrophosphate (FPP) at C15.
  • FPP condenses again with IPP to produce geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP) at C20, which then condenses together to form the first carotenoid, a colorless phytoene.
  • Phytoene is converted to phytofluene, ⁇ -carotene, neurosporene, and lycopene by a series of unsaturated reactions.
  • lycopene is converted to S-carotene having two ⁇ -ionone rings by a cyclization reaction, and finally, keto group and hydroxyl group are introduced into ⁇ -carotene to produce astaxanthin and zeaxanthin. It is believed to be synthesized (see Briton, G., "Biosynthesis of carotenoids". Plant Pigments. London, Aca demic Press, 1988, pp. 133-182. (Goodwin, TWed.)).
  • Astaxanthin which is a red ketocarotenoid
  • red fish such as ⁇ and ⁇ of marine organisms and crustaceans such as crabs and shrimp.
  • creatures cannot biosynthesize carotenoids, so carotenoids synthesized by microorganisms and plants must be ingested from the outside world.
  • astaxanthin has been widely used for the purpose of cultivating cultured fish and shellfish such as shrimp, fish and shrimp.
  • astaxanthin has also attracted attention as an antioxidant that removes activated oxygen generated in the body that causes cancer (Takao Matsuno, Wataru Miki, “Physiological functions and biological activities of carotenoids in animals” Chemistry and Biology, 28, pp. 219-227, 1990).
  • Known sources of astaxanthin include crustaceans such as Antarctic krill, cultures of the yeast Phaffia, cultures of the green alga Haematococcus, and compounds obtained by organic synthesis.
  • crustaceans such as Antarctic krill
  • yeast Phaffia the yeast Phaffia
  • green alga Haematococcus the green alga Haematococcus
  • compounds obtained by organic synthesis are difficult to separate lipids and other contaminants during its ingestion and extraction, which requires a great deal of labor and cost.
  • Even in cultures of yeast Phaffia the cell walls are strong and the production of astaxanthin is low, so that ingestion and extraction require large costs.
  • light that is essential for astaxanthin synthesis must be supplied during cultivation, and location conditions for sunlight intake and culture equipment for artificial light supply, etc.
  • the present invention relates to ketocarotino containing keto groups such as astaxanthin. It is an object of the present invention to provide a gene encoding a keto group-introducing enzyme necessary for producing an amide.
  • Another object of the present invention is to provide a keto group-introducing enzyme.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant vector containing a gene encoding the above-described keto group-introducing enzyme.
  • Still another object of the present invention is to provide a microorganism into which a gene encoding the keto group-introducing enzyme has been introduced.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing ketocarotenoid using a microorganism into which the gene encoding the keto group-introducing enzyme has been introduced.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, cloned a gene encoding a keto group transfer enzyme from cDNA of the green alga Haematococcus pl uvial is, and prepared a vector DNA incorporating the gene. And then introducing the vector DNA into Escherichia coli and collecting ketocarotenoids such as echinenone, canthaxanthin, astaxanthin, 4-ketozeaxanthin, etc. from the culture medium obtained by culturing the E. coli thus obtained. And completed the present invention.
  • ketocarotenoids such as echinenone, canthaxanthin, astaxanthin, 4-ketozeaxanthin, etc.
  • the present invention provides a polypeptide having an enzymatic activity for converting a methylene group at the 4-position of 3-ionone Hunch into a keto group in a compound having a ⁇ -ionone ring.
  • the present invention also provides a DNA comprising a base sequence encoding a polypeptide having an enzymatic activity for converting a methylene group at the 4-position of a -ionone ring into a keto group in a compound having a 9-ionone ring.
  • the present invention provides a recombinant vector containing the above DNA.
  • the present invention also provides a microorganism into which the DNA has been introduced.
  • the present invention provides a method for producing ketocarotenoid, which comprises culturing the above-described DNA-introduced microorganism in a medium and collecting ketocarotenoid from the culture.
  • a method for producing ketocarotenoid which comprises culturing the above-described DNA-introduced microorganism in a medium and collecting ketocarotenoid from the culture.
  • the keto group-introducing enzyme of the present invention is a polypeptide having an enzymatic activity for converting a methylene group at the 4-position of a / 5-ionone ring of a compound having a 3-ionone ring into a keto group.
  • This polypeptide substantially has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 1).
  • SEQ ID NO: 1 The amino acid sequence from A to D in Fig. 1; the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (the amino acid sequence from B to D in Fig. 2); or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (C in Fig. 3) To amino acid sequence D to amino acid sequence D).
  • substantially the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3 refers to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
  • SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing as long as the compound having a ⁇ -ionone ring has an enzymatic activity of converting the 4-position methylene group of the 5-ionone ring to a keto group.
  • the keto-introducing enzyme of the present invention can synthesize canthaxanthin via echinenone using 5-carotene as a substrate. It is also possible to convert the methylene group at the 4-position of the 3-hydroquinone / 9-ionone ring to a keto group.
  • astaxanthin can be synthesized via zeaxanthin as a substrate via 4-ketozeaxanthin (see FIG. 8).
  • the carotenoid, ⁇ -carotene-zeaxanthin has two molecules of zionone rings in one molecule, so the methylene group at the 4-position is first converted to a keto group, resulting in echinenone and 4-keto, respectively.
  • zeaxanthin is generated, and further, the methylene group at the 4'-position (equivalent to the 4-position) of the / S-ionone ring is converted to a keto group, thereby generating canthaxanthin and astaxanthin, respectively.
  • the gene encoding the keto group-introducing enzyme of the present invention (hereinafter referred to as “bkt”) is a poly (enzyme) having an enzymatic activity for converting a methylene group at the 4-position of the ⁇ -ionone ring into a keto group in a compound having a ⁇ -ionone ring.
  • This is a DN containing a nucleotide sequence encoding a peptide.
  • a typical example is the bkt ⁇ gene, which can be cloned from the green alga Haematococcus pluvials (NI ES-144), which is essentially the amino acid sequence from A to D in FIG.
  • nucleotide sequences encoding the amino acid sequences shown in 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3 are shown in SEQ ID NOs: 4, 5, 6, and 7, respectively, in the sequence listing.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing contains a non-coding region upstream of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing, which is a coding region.
  • the bkt ⁇ gene of the present invention includes, in addition to those containing the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 4, 5, 6, and 7 in the sequence listing, the same polypeptide that differs only in degenerate codons. Needless to say, those which include degenerate isomers are included.
  • BKT bkt gene product
  • canthaxanthin can be synthesized via echinenone using rosin as a substrate (see FIG. 8).
  • BKT can also convert the methylene group at the 4-position of the 3-hydroquinone-5-ionone ring into a keto group.
  • astaxanthin can be synthesized from zeaxanthin via 4-ketozeaxanthin.
  • polypeptide having such an enzymatic activity and the DNA encoding the same have not been known before, and the polypeptide and the DNA encoding the polypeptide have been known to date. There is no overall homology with any of the polypeptides and DNA. In addition, there is no finding that one enzyme converts a methylene group to a keto group without limitation to a / S-ionone ring or a 3-hydroxy-1-Sionone ring.
  • 3-KT-zeaxanthin a substrate of BKT, is supplied by these crt genes of Erwinia, the large intestine that retains the crt genes of Ennia
  • canthaxanthin can be produced via echinenone in a viable rotin-producing microorganism, and astaxanthin can be produced via 4-ketozeaxanthin in a zeaxanthin-producing microorganism. It is possible (see Figure 8).
  • zeaxanthin-producing microorganisms contain a trace amount of / 3-clibutoxanthin as an intermediate metabolite of zeaxanthin
  • the ⁇ - ⁇ ribtoxanthin is used as a substrate, and in addition to the above-mentioned major metabolic pathways, ))
  • a pathway for producing astaxanthin from butoxanthin via 3-hydroxy- and 4-ketozeaxanthin and ⁇ -cributoxanthin via 3-hydroxy- or 3'-hydroxy-shequinone It is thought that there is also a pathway that produces funicoxanthin, and that as a product of this minor metabolic pathway, it produces 3'-hydroxyxynenone, 3-hydroxyxinenone, and phanicoxanthin. (See Figure 9).
  • One step of obtaining a DN containing a base sequence encoding the amino acid sequence of the keto group-introducing enzyme of the present invention is to chemically synthesize at least a part of the chain length according to a nucleic acid synthesis method.
  • the green alga Haematococcus (typically Haematoc occus pluvial is and Haematococcus lacustris, etc.) was obtained from this chemical synthesis method.
  • a cDNA library is prepared in Escherichia coli, and the library is prepared from this library by a method commonly used in the field of gene engineering, for example, a hybridization method using an appropriate probe or an expression cloning method used by the present inventors. It is preferable to obtain
  • RNAs of Haematococcus pluvialis are isolated, and Boli A + RNA is purified using Oligotex-1 dT30 super (Takara Shuzo Co., Ltd.).
  • This poly A + RNA is transformed into type II, and reverse transcriptase SUPERSCRIPT RT (GIBCO BR is used to synthesize phase capture DNA, followed by E. coli DNA ligase, E. coli DNA polymerase, E. coli DNA RNase H (All use GIBCO BR to synthesize double-stranded cDNA.
  • Escherichia coli that has the Erwinia crt gene group described above. From the change in color tone of the obtained transformant, Escherichia coli carrying the keto group transfer enzyme gene is screened.
  • This method utilizes the fact that the color tone of Escherichia coli changes from the yellow color of 9-carotene to the red color of canthaxanthin when a keto group is introduced and canthaxanthin, one of the ketocarotenoids, is synthesized.
  • a plasmid having the desired cDNA is isolated from the obtained red transformed E. coli, and the cDNA is replaced with E. coli vectors (pBluescript II SK + and pBluescript II KS STRATAGBNE). Deletion mutants having deletions of various lengths are prepared for these brasmids, and their nucleotide sequences are determined.
  • ketocarotenoids such as astaxanthin. It has also been reported that Phaffia rhodozyma, a yeast but the same eukaryote, also synthesizes keto carotenoids such as astaxanthin (Johnson, BA and An, G. -Hwan, "Astaxanthin from microbial sources", Critical Reviews in Biotechnology,
  • Haematococcus pluvial is NIES-144 as a probe, hybridization using the homologous homologue enables the gene transfer of the keto group-introducing enzyme from the other astaxanthin-producing algae or microorganisms. Can be obtained.
  • the present inventors have proposed that Haematococcus pluvial is NIES-144 is two types of Haematococcus capable of synthesizing astaxanthin that differ in their assimilation and light phenotypes, namely, Haematococcus lacustris UTEX 294.
  • ketocarotenoids can be produced by introducing the DNA of the present invention into a microorganism such as a suitable bacterium (for example, Escherichia coli, Zymomonas mobilis, Agrobacterium tumefaciens) or yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a foreign gene and expressing it. .
  • a suitable bacterium for example, Escherichia coli, Zymomonas mobilis, Agrobacterium tumefaciens
  • yeast Sacharomyces cerevisiae
  • Procedures and methods for introducing and expressing a foreign gene into a microorganism include, besides those described herein, those commonly used in the field of genetic engineering.
  • Vectors for cloning genes ", Methods in Enzymology, 216, p.469-631, 1992, Academic Press. And” Other bacterial systems ", Methods in Enzymology, 204, p.305-636, 1991, Academic Press). An equivalent method or method can be used.
  • an E. coli expression vector having a lac promoter and an exogenous gene inserted therein may be introduced into E. coli.
  • the present inventors inserted the Haematococcus bkt gene into a cDNA expression vector pSPORTl (GIBCO BRL) for Escherichia coli having a lac promoter and the like in a direction to receive the lac promoter transcription read-through, This was led to E. coli.
  • a promoter and terminator such as PGK and GPD are used to introduce the foreign gene so that transcription is passed through between the promoter and the terminator.
  • the expression cassette thus constructed is constructed and the expression cassette is transferred to an S. cerevisiae vector, for example, a YRp system (a multicopy vector for yeast using the ARS sequence of the yeast chromosome as an origin of replication), a YEp system (a yeast multicopy vector).
  • a vector such as a multicopy vector for yeast having a 2um DNA origin of replication and a Yip system (vector for integration of yeast chromosome without a yeast origin of replication) and to introduce it into yeast (see above).
  • a vector such as a multicopy vector for yeast having a 2um DNA origin of replication and a Yip system (vector for integration of yeast chromosome without a yeast origin of replication) and to introduce it into yeast (see above).
  • New Biotechnology of Yeast published by the Medical Publishing Center, ABC Series of Japanese Society for Agricultural Chemistry ABC Genetic Engineering for Material Production, Asakura Publishing Co., Ltd., and Yamano, S., Is ii, T., Nakagawa, ⁇ .,
  • Introduction of the foreign gene into the ethanol-producing bacterium Zymomonas mobilis can be performed by a conjugative transfer method common to Gram-negative bacteria.
  • an expression vector into which a foreign gene has been inserted for example, a vector for Zymomonas mobilis pZA22
  • Zymomonas mobilisi a vector for Zymomonas mobilis pZA22
  • Agrobacterium tumefaciens Introduction of a foreign gene into the plant pathogenic bacterium Agrobacterium tumefaciens can be performed by the conjugative transfer method common to Gram-negative bacteria.
  • an expression vector with a foreign gene inserted In order to express a foreign gene in Agrobacterium tumefaciens, an expression vector with a foreign gene inserted
  • Agrobacterium tumefaciens vector pB1121 (Misawa, N., Yamano, S., Ikenaga, H., "Prod uct ion of ⁇ -carotene in Zymomonas mobi lis and Agrobacterium tumefaciens by introduction of the biosynthesis genes from Brwinia uredovora". Ap pl. Environ. Microbiol., 57, p. 1847-1849, 1991).
  • ketocarotenoid synthetic genes including astaxanthin derived from the green alga Haematococcus. It is.
  • FPP Pharnesyl pyrophosphate
  • terdinoids such as sesquiterpenes, triterpenes, sterols, and hopanols.
  • all microorganisms should have FPP as an intermediate metabolite, since microorganisms cannot synthesize carotenoids, but synthesize Terdinoids.
  • the carotenoid synthesis genes of the non-photosynthetic bacterium Erwinia can synthesize substrates of the bkt gene product of Haematococcus, ie, ⁇ -force rotin and zeaxanthin, using FPP as a substrate (see Fig. 7).
  • the present inventors introduced not only Escherichia coli but also the aforementioned microorganisms, that is, the yeast Saccharomyces cer evisiae, Ethanore production # rice bacterium Zymomonas mobilis, 3 ⁇ 41 substance ⁇ Agrobacterium mtumefaciens, and introduced the crt gene group of Erwinia into these microorganisms.
  • the carotenoid synthesizing gene group derived from Erwinia and the DNA of the present invention typically, the carotenoid synthesizing gene bkt derived from Haematococcus
  • a gene transfer expression system can be obtained. Is established All microorganisms can produce ketocarotenoids such as astaxanthin.
  • keto carotenoid can be produced by the microorganism. it can.
  • a method for producing various keto carotenoids using microorganisms will be described.
  • coli a plasmid (for example, pACCAR16AcrtX) in which a fragment containing the crtE, crtB, crtl, and crtY genes of Erwinia uredovora is inserted into an E. coli vector (for example, PACYC184) is used.
  • E. coli vector for example, PACYC184
  • a plasmid in which a fragment containing the bkt gene of Haematococcus was inserted into an E. coli vector for example, pBluescript II KS +
  • PHP51 see Fig. 10.
  • Carotenoid pigments thus obtained can include canthaxanthin and echinenone.
  • the final products of Astaxa are obtained by introducing the crtE, crtB, crtl, crtY, crtZ genes of Envinia uredovora and the bkt gene of Haematococcus, which is a keto group transfer enzyme gene, necessary for zeaxanthin synthesis into microorganisms such as Escherichia coli. Can be produced.
  • a synthetic intermediate 4-ketozeaxanthin can be obtained by regulating the expression level of the bkt gene.
  • a fragment containing the crtE, crtB, crtK, crtY, and crtZ genes of Erwinia uredovora is transformed into an Escherichia coli vector.
  • Plasmid for example, pACCAR25AcrtX
  • a plasmid for example, pHP51
  • Escherichia coli e.g., JM101
  • Escherichia coli e.g., JM101
  • a medium such as LB medium containing ampinulin and chloramphenicol or a medium such as 2YT medium at 30 to 37 ° C in a stationary phase.
  • the cells may be collected, the cells may be collected, and carotenoid pigment may be extracted using an organic solvent such as acetone.
  • the carotenoid pigments obtained in this way can include astaxanthin and 4-ketozeaxanthin.
  • crtE, crtB, crtK crtY, crtZ genes of Erwinia uredovora and the bkt gene of Haematococcus which is a keto group transfer enzyme gene, required for zeaxanthin synthesis into microorganisms such as Escherichia coli, Astaxanthin, the ability to produce 4-ketozeaxanthin, ', 3'-Hydroxyshequinoneone, 3-Hydroxyshequinoneone, and phenyloxanthine should be present as minor intermediate metabolites .
  • Escherichia coli DH5a into which the plasmid ps51 incorporating the isolated bkt ⁇ gene, which is the DNA of the present invention, has been introduced, has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as follows.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of the keto group transfer enzyme gene (bkt) of the green alga Haematococcus pluvialis NIES-144 and the amino acid sequence of the encoded polypeptide.
  • FIG. 2 shows the base sequence of the keto group transfer enzyme gene (bkt) of the green alga Haematococcus pluvialis NIES-144 and the amino acid sequence of the encoded polypeptide.
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence of the keto group transfer enzyme gene (bkt) of the green alga Haematococcus pluvialis NIES-144 and the amino acid sequence of the encoded polypeptide.
  • FIG. 4 shows the nucleotide sequence of a DNA chain containing a keto group transfer enzyme gene (bkt) of the green alga Haematococcus pluvialis NIES-144.
  • A, B and C indicate the position of the start codon.
  • FIG. 5 shows the sequence following FIG.
  • FIG. 6 shows the carotenoid biosynthetic pathway up to 9-carotene.
  • FIG. 7 shows the carotenoid biosynthetic pathway and the function of the lipoprotein synthase gene of the non-photosynthetic bacterium Erwinia uredovora.
  • FIG. 8 shows the functions of the ketotransferase gene (bkt) of the green alga Haematococcus pluvialis NIES-144 and the hydroxyltransferase gene (crtZ) of the nonphotosynthetic bacterium Erwinia uredovora, and the main biosynthetic pathway of ketocarotenoid.
  • Figure 9 shows the functions of the ketotransferase gene (bkt) of the green alga Haematococcus pluvialis NIES-144 and the hydroxyltransferase enzyme (crtZ) of the non-photosynthetic bacterium Envinia uredovora, and the minor biosynthetic pathway of ketocarotenoid. Show.
  • FIG. 10 shows two kinds of plasmids pHP5 and pHP51 containing a keto group transfer enzyme gene (bkt) of green alga Haematococcus pluvialis NIES-144.
  • bkt keto group transfer enzyme gene
  • PHP5 is inserted into pSPORT1 and pHP51 is inserted into pBluescript II KS + in a direction to receive the lac promoter through.
  • Restriction enzyme cleavage sites are shown abbreviated as follows. S, Sail; Ss, Sstl; P, Pstl; Sp, Sphl; N, Notl; X, Xbal: K. Kpnl; Sa, Sad.
  • FIG. 11 shows the nucleotide sequence of the region containing the start codon of the keto group transfer enzyme gene (bkt) of the green alga Haematococcus pluvialis NIES-144 and the start sites of various degradation plasmides.
  • Fig. 12 shows a Southern blot analysis of three types of Haematococcus using a 1.7 kb DNA fragment of the bkt ⁇ gene of the green alga Haematococcus pluvialis NIES-144 as a probe. Electrophoresis photograph).
  • Lane 1-3 Haematococcus pluvial is NIES-144
  • Haematococcus pluvialis used for gene acquisition is a NIES-144 strain registered with the Global Environmental Forum.
  • Haematococcus pluvial is a basic medium (yeast extract 0.2%, sodium acetate 0.12%, asparagine 0.04%, magnesium chloride hexahydrate 0.02%, ferrous sulfate 'heptahydrate 0.001%, calcium chloride' dihydrate
  • the culture was cultivated for about 4 days at 20 ° C and 12 hours light / ⁇ 2 hours dark (20 E / m2 ⁇ s).
  • Haematococcus pluvial is NIES-144 strain to a final concentration of acetic acid of 45 mM and ferrous sulfate and heptahydrate to a final concentration of 450 / M.
  • the cells were cultured at 20 ° C and a light intensity of 125 // E / m 2 ⁇ s for about 12 hours to induce cyst formation.
  • Haematococcus pluvialis NIES-144 strain was inoculated into a 400 ml basal medium and cultured at 20 ° C, light intensity of 20 E / m 2 ⁇ s, light-dark cycle 12 hours light 12 hours dark for about 4 days.
  • the cells were collected from the culture solution, frozen with liquefied nitrogen, and crushed in a mortar until the cells became powdery.
  • Add 15 ml of extraction buffer 0.1 M Tris-HCl pH 8.0, 0.1 M EDTA, Add 0.25 M NaCl, 0.1 mg / ml Proteinase K) and stir vigorously. After incubating at C for 2 hours, the precipitate was removed by centrifugation at 6000 xg for 10 minutes at 4 ° C.
  • the supernatant was added with 0.6 volumes of isopropanol, cooled at -20 ° C for 30 minutes, and then centrifuged at 7,500 xg for 15 minutes at 4 ° C.
  • the precipitated DNA content is dissolved in 2 ml of TE bite solution (10 mM Tris-HC1 pH 8.0, 1 mM EDTA), mixed with an equal volume of phenol: black form (1: 1), centrifuged, and the upper layer Was extracted.
  • the precipitate is rinsed with 70% ethanol, dried, dissolved in 0.5 ml of ⁇ buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA), and 2.5 1 of 10 mg / ml RNase A The resulting solution was used as a total DNA solution of Haematococcus pluvia lis.
  • the crtZ genes of Erwinia uredovora and Erwinia herbicola (Misawa, N., Nakagawa, M., Kobayas i, K., Yamano, S., Izawa, Y., Nakamura, K., Harashima, K., n Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia col i.
  • Haematococcus pluvial i using mixed primers of No.1 and No.2 and No.1 and No.3 s PCR was performed using the total DNA solution as type III.
  • Haematococcus pluvialis NIES-144 strain was inoculated into 800 ml of the basic medium and cultured at 20 ° C, light intensity, s, light / dark cycle 12 hours light / 12 hours dark for about 4 days, followed by acetic acid to a final concentration of 45 ⁇ , Ferrous sulfate ⁇ heptahydrate was added to a final concentration of 450 / ⁇ , and the cells were cultured at 20 ° C and a light intensity of 125; / E / m 2 ⁇ s for about 12 hours. The cells were collected from the culture solution, frozen with liquefied nitrogen, and crushed in a mortar until the cells became powdery.
  • the upper eyebrow was extracted by centrifugation at 12000 ⁇ g for 15 minutes at 4 ° C., 2 ml of isopropanol was added, the mixture was left at room temperature for 10 minutes, and then centrifuged at 12000 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C. Subsequently, the precipitate was rinsed with 70% ethanol, dried, and dissolved in 1 ml of TE buffer (10 mM Tris-HC1 (pH 8.0), 1 mM EDTA). The total RNA solution of Haematococcus pluvial is It was decided. This preparation yielded 4.1 mg of total RNA.
  • PolyA + RNA was purified from about lmg of total RNA of Haematococcus pluv ialis using Oligotex-dT30 Super (Takara Shuzo Co., Ltd.). Purification was performed according to the instructions in the attached product manual. About Bori A + mRNA was purified by this purification method.
  • This cDNA expression vector, pSPORT I has a lac promoter upstream of the Sail site and is a vector that can express cDNA in E. coli.
  • all the ligated DNA solutions were used to transform Escherichia coli DH5a competent cells prepared according to the method of Molecular Cloning 2nd edition: Cold Spring Harbor Laboratory, 1.21-1.41 (1989). Approximately 40,000 transformants were obtained. After collecting all of them, plasmid DNA was prepared according to the method of Molecular Cloning 2nd edition: Cold Spring Harbor Laboratory, 1.21-1.41 (1989). As a result, 0.6 mg of plasmid DNA was obtained, which was used as a cDNA expression library for Haematococcus pluvial is.
  • Plasmid PCAR16 (Misawa, N. Nakagawa, M. Kobaya shi, .. Yamano, S. Izawa) having a carotenoid synthesis gene group (crtX, crtE, crtY, crtl, crtB gene) other than crtZ of Erwinia uredovora J. Bacteriol., Y. Nakamura, K. Harashima, K., Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli.
  • the crtX ⁇ gene was inactivated by flame shift by digestion with BstEH, Klenow enzyme treatment, and ligase reaction. 6.
  • the Ok p Asp718 (KpnI) -EcoRI fragment containing the crtE, crtY, crtl, and crtBII genes required for carotene production was cut out. This fragment was inserted into the EcoRV site of the E. coli vector pACYC184 (obtained from ATCC 37033) to obtain the desired plasmid (named pACCAR16A crt X). Escherichia coli having this pACCAR16AcrtX is resistant to chloramphenicol and can produce carotene.
  • Ketocarotenoids are considered to be synthesized via ⁇ -carotene in Haematococcus pluvialis (Britton, G., "Biosynthesis of carotenoids”. Plant Pigments. London, Academic Press, 1988, p.133-182). (See Goodwin, TW ed.)). Therefore, utilizing the fact that E. coli JM101 harboring the above pACCAR16AcrtX produces ⁇ -carotene (yellow), the above cDNA expression library was introduced into this E. coli and the color change of the obtained transformant was determined. Then, Escherichia coli carrying the keto group transfer enzyme gene was screened.
  • the color tone of Escherichia coli was expected to change from the yellow color of / 3-carotene to the red color of dextrin.
  • cDNA from Haematococcus pluvial is inserted into PHP5 is cut out with restriction enzymes Sail and Xbai, and E. coli vectors pBluescript II KS + and pBluescrip Two plasmids (named pHP51 and pHP52) were obtained by inserting into the SalI / Xbal site of tIISK +.
  • Figure 10 shows the restriction map of plasmid PHP51. In pHP51 and PHP52, the cDNA was inserted in the direction in which the lac promoter received read-through and the direction in which it did not.
  • deletion mutants having deletions of various lengths were prepared by the following procedure, and their nucleotide sequences were determined.
  • PHP51 was decomposed with SacI and XbaI
  • pHP52 was decomposed with Kpnl and SalI
  • phenol-nocro-form extraction was performed, and DNA was recovered by ethanol precipitation.
  • Each DNA was dissolved in 100 1 Exoll buffer (50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , 10 mM 2 -mer butanol, pH 8.0), and 180 units of Exo III nuclease was added. And kept at 37 ° C.
  • FIGS. 4 and 5 The determined sequence consisting of 1677 base pairs (bp) is shown in FIGS. 4 and 5 (SEQ ID NO: 4).
  • three open reading frames (A to D in Fig. 1 (sequence listing) which have the liposome binding site necessary for expression in E. coli upstream of the initiation codon are shown. No. 5), B to D in FIG. 2 (shown in SEQ ID No. 6 in the Sequence Listing), and C to D in FIG. 3 (shown in SEQ ID No. 7 in the Sequence Listing).
  • Example 8 when the length is shorter than C, the enzyme activity in E. coli is lost.Therefore, it is considered that there is no initiation codon downstream. For the area, It was omitted from the search for the ding frame.
  • FIG. 11 shows the nucleotide sequence of the upstream portion of the oven reading frame.
  • There are five possible start codon sites (base positions 168-170, 189-191, 264-266, 348-350, 423-425; these positions are boxed in FIG. 11).
  • the base at position 168, the base at position 189, and the base at position 264 in the start codon shown in FIG. 11 are represented by A in FIG. 1, B in FIG. 2, and C in FIG. 3, respectively.
  • Corresponding position. Therefore, in order to determine the minimum region required for a functional protein, a deletion mutant of pHP51 was prepared in the same manner as in Example 5, and several types of plasmids whose upstream region was deleted were prepared.
  • FIG. 11 shows the nucleotide sequence of the upstream portion of the oven reading frame.
  • There are five possible start codon sites base positions 168-170, 189-191, 264-266, 348-350, 423-425; these positions are boxed in FIG. 11
  • FIG. 11 shows the number and upstream terminal position of each deletion plasmid.
  • These plasmids were introduced into Escherichia coli JM101 carrying pACCAR16 AccrtX described in Example 6, and the pigments produced were identified.As a result, the deletion plasmids of numbers 30, 27, 31, 37, and 12 were retained. Escherichia coli produced canthaxanthin, but not in Nos. 10, 6, and 38. In the case of No. 12, the ATG of the start codon ATG at base positions 264 to 266 is deleted, but this ATG becomes a GTG when a deletion mutant is created, and Escherichia coli is also recognized as a start codon by GTG.
  • PHP5 or pHP51 introduced into 5-carotene-producing Escherichia coli JM101 (Escherichia coli (pAC CAR16 ActX, pHP5 or pHP51)) (showing orange) was converted into 150 gZml ampicillin (Ap, Meiji Seika), 30 tz gZml of chloranil Muhu We Nicole (Cm, manufactured by Sankyo), 1 mM of I PTG, 7 mg FeS0 4 ⁇ 7 0 Oyobi 9. 2YT medium containing 3 mg Na 2 ⁇ EDTA (1. 6% tryptone , 1% yeast extract, 0.5% NaCl) 2 liters, 30 ° C, 24 Cultured for ⁇ 30 hours.
  • the cells collected from the culture solution were extracted with 300 ml of acetone. After concentration, the mixture was extracted twice with 200 ml of form-mouth methanol (91) and concentrated to dryness. Further, after dissolving this in a small amount of chloroform / methanol (9-1), it is developed by chromatography on a silica gel preparative TLC plate manufactured by Merck Co., Ltd. with methanol / methanol (50Z1). Layer chromatography (TLC) was performed. By this TLC, the spot was divided into three spots with Rf values of 0.53, 0.78 and 1. The darkest red dye (Rf 0.53), corresponding to 75% of the total extracted dye, was scraped off the TLC plate.
  • the red pigment (Rf 0.78 by TLC) corresponding to 10% of the first extracted pigment was scraped off the TLC plate and dissolved in a small amount of methanol.
  • UV-visible spectrum of this dye mobility of silica gel TLC (Rf value 0.78 when developed with black-mouthed form Z methanol (501)), and Novapack HR6 // CI 8 (3.9 x 300 mm) (waters) HPLC mobility (acetonitrile / methanol / 2-propanol (90/6/4) at a flow rate of 1.0 ml / min and RT16 min) from echinenone (See Figure 8 for the structural formula).
  • PHP5 or PHP51 introduced into this zeaxanthin-producing Escherichia coli JM101 E. coli (pACCAR25AcrtX, pHP5 or pHP51) (showing orange) was added at 150 g / ml Ap, 30 ⁇ g / ml Cm, 1 mM IPTG , 2YT medium containing 7 mg FeS0 4 ⁇ 7 ⁇ ⁇ 0 and 9.3 mg Na 4 ⁇ EDTA with (1.6% tryptone, 1% yeast extract, 0.5% NaCl) 2 retracement Tsu torr, 30 ° C, and incubated 24-30 h .
  • the cells collected from the culture solution were extracted with 300 ml of acetone.
  • the dye with an Rf of 0.72 which corresponds to about half of the total extracted dye, is the same as astaxanthin from the results of UV-visible spectrum, 'H-NMR, and FD-MS spectrum (mZe 596). It became clear that it had a planar structure. So, Jechiruthete And 2-propanol: ethanol dissolved in 5: 5: 2, and the CD spectrum was measured. As a result, it was found that it had a 3S, 3'S steric structure. (See Fig. 8).
  • the dye with an Rf of 0.54 has its ultraviolet-visible spectrum, 'H-NMR, FD-MS spectrum (mZe 582), and the mobility of silica gel and C (cloth form methanol (15Z1) Based on the Rf value of 0.54), it was identified as 4-ketozeaxanthin (for the structural formula, see Fig. 8).
  • the dye with an Rf of 0.40 is available in the UV-visible spectrum, the mobility of silica gel TLC (Rf value of 0.40 when developed with a chromate form / methanol (15/1)), and Novapac HR6 / zC l 8 (3.9 x 300 mm) HPLC mobility with (Waters) (Asetonitoriru / methanol - RT6 Le / 2-propanol (90/6/4) at 1.0 ml / development in min. 5 min) were all consistent with the standard zeaxanthin standard (manufactured by BASF), indicating that this substance was unreacted zeaxanthin (see Fig. 8 for the structural formula).
  • the function of the keto group-introducing enzyme gene can be considered as follows.
  • Example 9 From Example 9 (1), it was found that the Haematococcus ketotransferase gene (bkt) is a ketotransferase (yS-carotene) that catalyzes the conversion of beta-rotin as a substrate to effexanthine via echinenone. It is clear that it encodes (ketolase) (see Figure 8). This indicates that one enzyme, BKT, immediately converts the methylene group at the 4- and 4'-positions of the ionon ring to a keto group. Enzymes with such functions have not been known until now.
  • bkt is a ketotransferase (yS-carotene) that catalyzes the conversion of beta-rotin as a substrate to effexanthine via echinenone. It is clear that it encodes (ketolase) (see Figure 8). This indicates that one enzyme, BKT, immediately converts the methylene group at the 4- and 4'-positions of the ionon ring
  • the bkt ⁇ gene of Haematococcus in addition to the above-mentioned activity, is a keto group-introducing enzyme that catalyzes the conversion to astaxanthin via 4-ketozeaxanthin using zeaxanthin as a substrate.
  • zeaxanthin ketolase zeaxanthin ketolase
  • the haematococcus keto-transferase gene bkt suddenly changes the methylene group at position 4 (4 ') regardless of whether a hydroxyl group is added at position 3 (3').
  • ⁇ -Ionone or 3-hydroxy-3--3-ionone ring converted to keto group It can be said that it encodes a keto-group-introducing enzyme (/ 5-ionone or 3-hydroxy-oneone ring ketolase). Not only the / 9-ionone ring ⁇ 3-hydroxy-; 3-ionone ring, but no finding that one enzyme immediately converts a methylene group into a keto group has been found.
  • carotenoid synthase genes of Erwinia a plant resident bacterium
  • Rhodobacter a photosynthetic bacterium
  • carotenoid biosynthetic enzymes generally recognize and act on half of the carotenoid molecule as a substrate.
  • crtY Erwinia's lycopene cyclase gene, recognizes and cyclizes half of the lycopene molecule.
  • Rhodobacter phytoene desaturase gene crt I allows Escherichia coli to synthesize neurosporene instead of lycopene, and when this is acted upon by crtY of Erwinia, only half of the molecular structure common to lycopene in neurosporene is obtained.
  • the crtY gene product was recognized and only half cyclized; producing S-zekarotin (Linden, H., Misawa, N., Chamovitz, D., Pecker, ⁇ ⁇ , Hirschberg, J., Sandmann, G , "Functional complementation in Escherichia coli of different phytoene desaturase genes and analysis of accumulate d carotenes".
  • coli having Erwinia's crtE, crtB, crtl, crtY, and crtZ genes, as described above, has the ability to produce zeaxanthin, and, as an intermediate metabolite, one hydroxyl group is introduced into 5-carotene. ⁇ -Cributoxanthin can be detected.
  • BKT is present there, it is possible to synthesize 3'-hide mouth chychekinenone and 3-hydroxyxinequinone using 3-cributoxanthin as a substrate, and BKT acts on these.
  • penicoxanthin can be synthesized.
  • Example 10 Southern analysis of chromosome DNA of other green alga Haematococcus It was examined whether or not a region showing homology to bkt isolated on the chromosome of another green alga Haematococcus was obtained.
  • Haematococcus pluvialis NIES-144 described in Example 2, prepared all the DNAs of Haematococcus Iacustris UTBX 294 and Haemat ococcus Iacustris C-392 in the same manner as the method of preparing all the DNAs of Haematococcus pluvialis NIES-144.
  • the 1.7 kb DNA fragment of the bkt gene was labeled using Megaprime TM DNA labeling systems (Amersham) and [a- 32 P] dCTP (: ⁇ 110 TBq / mmol), and the above hybridization was performed. Add 16 hours to the solution, 55. Hybridization was performed at C. After hybridization, the plate was washed with 2 XSSC, 0.SDS for 60 and 1 hour, and a signal showing homology was detected by autoradiography. As a result, Haematococcus pluvialis NIES-144 showed Strong signals at 15 kb, intestine, 1.9 kb, 6. lkb, 3.3 kb, 2.8 kb, 2.3 kb, 2.
  • the present invention which encodes an enzyme that converts the methylene group at the 4-position of the 0-ionone ring to a keto group, is introduced into a microorganism such as Escherichia coli as a foreign gene and expressed therein, whereby the microorganism can be used as a catalyst for microorganisms such as Escherichia coli. It became possible to confer biosynthesis ability of xanthine, 4-ketozeaxanthin, cantaxanthin, echinenon, and other ketocarotenoids containing a keto group.
  • a ketocarotenoid containing a keto group can be produced in a large amount with less labor and cost.
  • Organism name Haematococcus pluvial is
  • Organism name Haematococcus pluvialis
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Haematococcus pluvial is
  • ATC TGC ATA TCA CTG TAC GCC TGG TTT GAC TAC AGC ATG CTG CAT 495 lie Cys He Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Ser Met Leu His
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Haematococcus pluvial is

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Description

明 細 書
ケト基導入酵素、 それをコードする DNAおよびケトカロチノィ ドの製造法 技術分野
本発明は、 鯛、 鲑、 海老等の養殖魚介類の色揚げに有用であり、 また着色料や 抗酸化剤として食品に利用されるァスタキサンチン等のケトカロテノィ ドの合成 に必要なケト基導入酵素、 それをコードする DNA、 該 DNAを含む組換えべク ター、 該 DNAを導入した微生物、 および該微生物を利用したケトカロテノイ ド の製造法に関するものである。 背景技術
ケトカロチノイ ドとは、 ケト基を含むカロチノィ ド色素の総称である。 カロチ ノイ ドは、 メバロン酸を出発物質として、 ステロイ ドやテルペンノイ ドと途中ま で共通なイソプレノィ ド生合成経路によって合成される （第 6図参照） 。 イソプ レン基本生合成系により生じる、 基本単位の C5のイソペンテニルピロリン酸 （IP P) とその異性体であるジメチルァリルピロリン酸 （DMAPP) が縮合して C 10の ゲラニルピロリン酸 （GPP) が生成され、 更に IPPが縮合して C15のファネルシル ピロリン酸 （FPP) が生成される。 FPPは、 再度 IPPと縮合することによって C20 のゲラニルゲラニルピロリン酸 （GGPP) を生じ、 次に GGPP同士が縮合して、 最初 のカロチノィ ドである無色のフィ トェンが作られる。 フィ トェンは、 一連の不飽 和反応により、 フィ トフルェン、 ^—カロチン、 ノイロスポレン、 リコピンに変 換される。 続いて、 リコピンが環化反応により、 2つの^—ィオノン環を有する S—カロチンに変換され、 最後に、 ^—カロチンにケト基や水酸基などが導入さ れて、 ァスタキサンチンゃゼアキサンチン等が合成されていると考えられている (Bri tton, G. , "Biosynthesis of carotenoids". Plant Pigments. London, Aca demic Press, 1988， p.133-182. (Goodwin, T. W. ed. ) 参照） 。
最近、 発明者等は、 植物常在非光合成細菌 Envinia uredovoraのカロチノィ ド 生合成遣伝子群を、 その黄色の色調を指標にして、 大腸菌の染色体 DNAライブラ リーからクローニングした。 さらに、 これらの遺伝子の色々な組合わせを大腸菌 等の微生物で発現させることにより、 大腸菌等の微生物にフィ トェン、 リコピン、 —カロチン、 及び 9—力ロチンに水酸基が導入された黄色のカロチノィ ド色素 であるゼアキサンチンを生産させることを可能にした （第 7図参照） （Misawa，N. ， Nakagawa, M. , Kobayashi, K. , Yamano, S. , Izawa, Y. , Nakamura, Κ. , Harashi ma, Κ. , "Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pat hway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia co li."， J. Bacteriol. , 172, p.6704-6712, 1990. 、 Misawa, N. , Yamano, S. , Ik enaga, H. , "Production of β -carotene in Zymomonas mobi 1 is and Agrobacter ium tumefaciens by introduction of the biosynthesis genes from Erwinia u redovora. Appl. Environ. Microbiol., 57, p.1847-1849, 1991 及び特開平 3-58786号公報参照)
ところで、 赤色のケトカロチノィ ドであるァスタキサンチンは、 特に海洋生物 の鲷、 鲑等の赤色魚類や、 蟹、 海老等の甲殻類に広く存在する代表的な動物カロ チノィ ドである。 一般に、 勦物はカロチノィ ドを生合成することができないので、 微生物や植物によって合成されたカロチノィ ドを外界より摂取する必要がある。 そのため、 従来より蜩、 鲑、 海老等の養殖魚介類の色揚げの目的にァスタキサン チンは広く用いられてきた。
また、 ァスタキサンチンは食品用着色料として使用されている他、 癌の原因と なる生体内で発生する活性化酸素を除去する抗酸化剤としても注目を集めている (松野隆男、 幹渉、 「動物におけるカロチノィ ドの生理機能と生物活性」 化学と 生物、 28， p.219-227, 1990参照） 。
ァスタキサンチンの供給源としては、 南極ォキアミ等の甲殻類、 酵母 Phaffia の培養物、 緑藻 Haematococcusの培養物、 及び有機合成法により得られた化合物 が知られている。 しかし、 南極ォキアミ等の申殻類を用いる場合、 その摂取ゃ抽 出の際に脂質を始めとする夾雑物との分離が困難であり、 多大な労力とコス トを 要する。 酵母 Phaffiaの培養物でも、 その細胞壁が強固でしかもァスタキサンチ ンの生産量が低いため、 摂取や抽出に多大なコス トを要する。 また、 緑藻 Haemat ococcusの培養物の場合、 培養時にァスタキサンチン合成に不可欠な光を供給し なければならず、 太陽光摂取のための立地条件や人工光供給のための培養装置等 の 備が必要であり、 さらに混在するクロロフィルや副生産物の脂肪酸エステル との分離が困難である。 これらのことから上記の生物起源のァスタキサンチンは、 コスト的に有機合成法により得られたものに勝てないのが現状であった。 しかし ながら、 有機合成法による場合、 ァスタキサンチンが魚介類の飼料や食品添加物 として用いられることを考慮すると、 反応時に生ずる副生成物等の面で問題が残 り、 かつ消費者の天然物嗜好にも反している。
以上のことより、 昨今、 安全でかつ消費者の天然物嗜好に合致した生物起源の 安価なァスタキサンチンの製造法の開発が望まれている。
そこで、 ァスタキサンチンの生合成を担う遺伝子群を取得することができれば 非常に有用であると考えられる。 なぜなら、 ァスタキサンチンの生産能の有無に かかわりなく、 食品としての安全性ゃァスタキサンチンの潜在的生産能の面で最 適な微生物にァスタキサンチン合成遺伝子群を導入、 発現させることにより、 そ の生産能を微生物に与えることができるからである。 この場合、 混在する副生産 物の問題もなく、 今日の進歩した遺伝子操作の手法をもってすれば、 有機合成法 を凌駕するレベルまでァスタキサンチンの生産: Sを上げることも難しくないと考 えられる。 ゼアキサンチンまでを合成する遺伝子群は、 前述したように、 発明者 等により、 すでに非光合成細菌 Envin ia uredovora から取得されている。 しか しな力くら、 ァスタキサンチンを合成するのに必要なケ卜基導入酵素をコードする 遺伝子等の取得は、 前述したようなァスタキサンチンの産業上の有用性の故に、 多くの研究機関で試みられてきているにもかかわらず、 未だ誰も成功に至っては いないのが現状である。 この原因としては、 ケト基導入酵素等のカロチノイ ド生 合成に関与する下流の酵素は膜タンパク質であり、 それらの酵素の精製や活性測 定が不可能であったために、 それらの酵素の知見が無かったことが挙げられる。 特に、 ケト基導入酵素については、 酵素の知見だけでなく、 それをコードする遺 伝子の知見も皆無であった。 したがって、 今日まで、 ァスタキサンチンを遺伝子 工学的手法を用いて、 微生物等に生産させることは不可能であつた。 発明の開示
従って、 本発明は、 ァスタキサンチンを始めとするケト基を含むケ卜カロチノ ィ ドを生産するために必要なケト基導入酵素をコードする遺伝子を提供すること を目的とする。
また、 本発明は、 ケト基導入酵素を提供することも目的とする。
さらに、 本発明は、 前記のケト基導入酵素をコードする遣伝子を含む組換えべ クタ一を提供することも目的とする。
さらにまた、 本発明は、 前記のケト基導入酵素をコードする遺伝子を導入した 微生物を提供することも目的とする。
また別に、 本発明は、 前記のケト基導入酵素をコードする遺伝子を導入した微 生物を利用するケトカロチノィ ドの製造法を提供することも目的とする。
本発明者等は、 上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、 緑藻 Haematococcus pl uvial i s の c D N Aからケト基導入酵素をコードする遗伝子をクローニングし、 該遗伝子を組み込んだベクター D N Aを作製し、 該ベクター D N Aを大腸菌に導 入し、 かく して得られた大腸菌を培養した培地からェキネノ ン、 カンタキサンチ ン、 ァスタキサンチン、 4一ケ トゼアキサンチン等のケ トカロチノイ ドを採取す ることに成功し、 本発明を完成させるに至った。 すなわち、 本発明は、 ^一ィォ ノン環を有する化合物の ;3—ィオノン琿の 4位のメチレン基をケト基に転換する 酵素活性を有するポリペプチドを提供する。 また、 本発明は、 ；9—ィオノ ン環を 有する化合物の —ィオノン環の 4位のメチレン基をケト基に転換する酵素活性 を有するポリベプチドをコ一ドする塩基配列を含む D N Aを提供する。 さらに、 本発明は、 前記の D N Aを含む組換えベクターを提供する。 さらにまた、 本発明 は、 前記の D N Aを導入した微生物も提供する。 また別に、 本発明は、 前記の D N Aを導入した微生物を培地で培養し、 培養物からケトカロチノィ ドを採取する ことを特徴とする、 ケトカロチノイ ドの製造法を提供する。 以下、 本発明を詳細に説明する。
1 . ケト基導入酵素
本発明のケト基導入酵素は、 3—ィオノン環を有する化合物の /5—ィオノン環 の 4位のメチレン基をケト基に転換する酵素活性を有するポリぺプチドである。 このポリペプチドは、 実質的に配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列 （第 1図の Aから Dまでのアミノ酸配列） 、 配列番号 2に示されるアミノ酸配列 （第 2図の Bから Dまでのアミノ酸配列） 、 または、 配列番号 3に示されるアミノ酸 配列 （第 3図の Cから Dまでのアミノ酸配列） を含むものであってもよい。 ここ で、 「実質的に配列表の配列番号 1、 配列番号 2、 または、 配列番号 3に示され るアミノ酸配列」 とは、 配列表の配列番号 1、 配列番号 2、 または、 配列番号 3 に示されるアミノ酸配列の他、 ^—ィオノン環を有する化合物の 5—ィオノン環 の 4位のメチレン基をケト基に転換する酵素活性を有する限りにおいて、 配列表 の配列番号 1、 配列番号 2、 または、 配列番号 3に示されるアミノ酸配列のいく つかについて欠失、 置換、 付加等の変異があってもよいアミノ酸配列を意味する たとえば、 配列表の配列番号 1、 配列番号 2、 または配列番号 3に示されるアミ ノ酸配列の第 1番目のアミノ酸 （Met) が欠失しているものなども包含される。 本発明のケト基導入酵素は、 ある実施態様において、 ；5—カロチンを基質とし てェキネノンを経てカンタキサンチンを合成することができる。 また、 3—ヒ ド 口キン一 /9ーィオノン環の 4位のメチレン基をケ卜基に転換することもできる。 その具体的な例の 1つとして、 ゼアキサンチンを基質として 4-ケトゼアキサンチ ンを経てァスタキサンチンを合成することができる （第 8図参照） 。 カロチノィ ドである^—カロチンゃゼアキサンチンは 1分子中に 2分子の ーィオノン環を 有しているので、 まず 4位のメチレン基がケト基に転換されることにより、 それ ぞれェキネノン及び 4ーケトゼアキサンチンが生じ、 更に/ S—ィオノン環の 4 ' 位 （4位と同等） のメチレン基がケト基に転換されることにより、 それぞれカン タキサンチン及びァスタキサンチンが生じるからである。
2 . ケト基導入酵素遺伝子 （bkt)
本発明のケト基導入酵素をコードする遺伝子 （以下、 「bkt」 と称する。 ） は β—ィオノン環を有する化合物の^ーィオノン環の 4位のメチレン基をケト基に 転換する酵素活性を有するポリぺプチドをコ一ドする塩基配列を含む D N Αであ る。 この典型的な例は、 緑藻 Haematococcus pl uv i al i s (NI ES-144)よりクロ一二 ングできる bkt遗伝子であり、 これは実質的に第 1図の Aから Dまでのァミノ酸 配列 （配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列） 、 第 2図の Bから Dまでの アミノ酸配列 （配列表の配列番号 2に示されるアミノ酸配列） 、 または第 3図の Cから Dまでのアミノ酸配列 （配列表の配列番号 3に示されるアミノ酸配列） を 含むポリぺブチドをコ一ドする塩基配列を含む D N Aである。 配列表の配列番号
1、 配列番号 2、 および配列番号 3に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配 列の一例を、 それぞれ、 配列表の配列番号 4と 5、 6、 および 7に示す。 なお、 配列表の配列番号 4に示す塩基配列は、 コード領域である配列表の配列番号 5に 示す塩基配列の上流に非コード領域を含むものである。 また、 本発明の bkt遗伝 子は、 配列表の配列番号 4、 5、 6、 および 7に示される塩基配列を含むものの 他に、 縮重コ ドンにおいてのみ異なる同一のポリべプチドをコ一ドする縮重異性 体を含むものも包含することはいうまでもない。
bk t遺伝子産物 （以下、 「BKT」 と称する。 ） 、 すなわち、 本発明のケト基導入 酵素は、 前記したように、 ；δ—ィオノン環を有する化合物の ^—ィオノン環の 4 位のメチレン基をケト基に転換する酵素活性を有しており、 ある実施態様におい て、 ；9一力ロチンを基質としてェキネノンを経てカンタキサンチンを合成するこ とができる （第 8図参照） 。 また、 BKTは、 3—ヒ ドロキン一 5—ィオノン環の 4位のメチレン基をケト基に転換することもでき、 例えば、 ゼアキサンチンを基 質として 4-ケトゼアキサンチンを経てァスタキサンチンを合成することができる
(第 8図参照） 。 なお、 このような酵素活性を有するポリペプチド及びこれをコ ードする D N Aは、 従来知られていなかつたものであり、 このポリペプチドおよ びこれをコードする D N Aは、 現在までに知られているどのようなポリぺプチド および D N Aとも全体的なホモロジ一は有していない。 また、 /S—ィオノン環や 3—ヒ ドロキシ一 S—ィオノン環に限らず、 1つの酵素がメチレン基をいきなり ケト基に変換するという知見は今まで存在しなかったものである。
ところで、 非光合成細菌 Erwi ni aのカロチノィ ド合成遗伝子群、 crtE、 cr tB、 cr t l 及び cr tYを用いることにより、 大腸菌等の微生物に ^—カロチン生産能を 与えることができ、 更に上記の 4つの遺伝子に加え cr tZ遺伝子も用いることによ り、 大腸菌等の微生物にゼアキサンチン生産能を与えることができる （第 7図及 び前記の W091/13078号公開公報参照） 。
したがって、 BKTの基質である 3—力ロチンゃゼアキサンチンはこれら Erwi ni a の cr t遺伝子群により供袷されるので、 Envi n i aの cr t 遗伝子群を保持する大腸 菌 の微生物に更に本発明の DNA (bkt遺伝子） を導入すると、 一力ロチン 産生微生物ではェキネノンを経てカンタキサンチンを、 ゼアキサンチン産生微生 物では 4-ケトゼアキサンチンを経てァスタキサンチンを生産することが可能とな る （第 8図参照） 。 ただし、 ゼアキサンチン産生微生物では、 ゼアキサンチンの 中間代謝産物として /3-クリブトキサンチンが微量含まれることから、 さらにこ の β—ゥリブトキサンチンを基質として、 上記の主要代謝経路の他に、 β—ク 、) ブトキサンチンから 3 -ヒ ドロキシェキネノン、 4 -ケトゼアキサンチンを経てァ スタキサンチンを生産する経路および^—クリブトキサンチンから 3—ヒ ドロキ シェキネノンまたは 3 ' —ヒ ドロキシェキネノンを経てフヱニコキサンチンを生 産する経路も存在すると考えられ、 このマイナーな代謝経路の産物として、 3'- ヒ ドロキシェキネノン、 3—ヒ ドロキシェキネノン及びフヱニコキサンチンを生 産することができると考えられる （第 9図参照） 。
3. DNAの取得
本発明のケト基導入酵素 ΒΚΤのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む DN Αを取得する一つの丰段は、 核酸合成の方法に従って、 その鎖長の少なく とも一 部を化学合成することである。 しかし、 結合アミノ酸が多数であるということを 考えれば、 この化学合成法よりも緑藻 Haematococcus (代表的なものに Haematoc occus pluvial is や Haematococcus lacustris等がある) 力ヽり mRNAを取得し、 そ れから大腸菌で cDNAライブラリーを作製し、 このライブラリーから遗伝子工学 の分野で慣用されている方法、 たとえば適当なプローブによるハイプリダイゼー ション法または本発明者等が用いた発現クローニング法により、 これを取得する ほうが好ましいと言える。
具体的には、 Haematococcus pluvialis の全 RN Aを分離し、 オリゴテックス 一 dT 3 0スーパー （宝酒造 （株） ） を用いてボリ A+ RNAを精製する。 この ポリ A+ RN Aを铸型にして、 逆転写酵素 SUPERSCRIPT RT (GIBCO BRいで相捕鎖 DNAを合成し、 続いて E. coli DNA リガーゼ、 E. coli DNA ポリメラ一ゼ、 E. coli DNA RNase H (全て GIBCO BRいを用いて 2本鎖 c D N Aを合成する。 合成 した c DNAを大腸菌用発現ベクター PSP0RTKG1BC0 BRL)に組み込み、 c DNA ライブラリーを作製する。 この c DNAライブラリーを用い、 β—力ロチンを産 生する大腸菌 （上記した Erwinia の crt 遣伝子群を保持する大腸菌） を形質転換 する。 得られた形質転換体の色調変化から、 ケト基導入酵素遺伝子を保持した大 腸菌をスクリーニングする。 この方法は、 ケト基が導入され、 ケトカロチノイ ド のひとつであるカンタキサキンチンが合成されると大腸菌の色調が ;9—カロチン の黄色からカンタキサンチンの赤色に変わることを利用したものである。 得られ た赤色の形質転換大腸菌から目的の c DNAを持つプラスミ ドを単離し、 c DN Aを大腸菌ベクター pBluescript II SK+および pBluescript II KS STRATAGBNE) につなぎ換える。 これらブラスミ ドについて種々の長さの欠失を有する欠失変異 体作成を行い、 それらについて塩基配列の決定を行う。
4. bkt遺伝子にハイブリダィズする DNA
現在までに数種類の緑藻 Haematococcus が分離、 同定されており、 これらは全 てァスタキサンチン等のケトカロチノィ ドを合成すると考えられている。 また、 酵母ではあるが同じ真核生物の Phaffia rhodozyma もァスタキサンチン等のケト カロチノイ ドを合成することが報告されている（Johnson, B. A. and An, G. -Hwan, "Astaxanthin from microbial sources", Critical Reviews in Biotechnology,
11, 297-326， 1991) 。 前述した Haematococcus pluvial is NIES-144の bkt遗伝 子をプローブとして用い、 そのホモロジ一を利用したハイブリダィゼーションに よって他の上記ァスタキサンチン産生藻類あるいは微生物から、 ケト基導入酵素 の遗伝子を取得することができる。 発明者等は、 ァスタキサンチンを合成できる Haematococcus の中から、 Haematococcus pluvial is NIES— 144とはその資化性や 光に対する表現型の異なる 2種、 すなわち、 Haematococcus lacustris UTEX 294
(The Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austinカヽ ら分譲） 、 Haematococcus lacustris C-392 〔東京大学応用微生物研究所 （現 分子細胞生物学研究所） 付属微生物微細藻類総合センターより分讓〕 を選択し、 これらの染色体 DNAを調製し、 Haematococcus pluvialis NIES-144の bkt遗伝 子をプローブとして、 サザンハイブリダィゼーシヨンを行った。 その結果は発明 者等の予想通り、 bktのプローブは 2種類の緑藻 Haematococcus のいずれの染色 体 DN Aに由来する特定の DN A断片にも強くハイプリダイズした。 従って本発 明は、 このような前記 DNA (配列番号 4、 5、 6及び 7) とハイブリダィズす る PNAをも包含する。
5. 大腸菌等の微生物の形質転換
本発明の DNAを外来遺伝子として適当な細菌 （例えば、 大腸菌、 Zymomonas mobilis、 Agrobacterium tumefaciens) や酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 等 の微生物に導入して発現させることにより、 種々のケトカロチノィ ドを製造する ことができる。
以下に、 好ましい微生物への外来遗伝子の導入法の概要について記載する。 大腸菌等の微生物への外来遺伝子の導入および発現のための手順ないし方法とし ては、 本明細書において記載したもの以外にも、 遺伝子工学の分野により慣用さ れているわの、 例えは、 "Vectors for cloning genes", Methods in Enzymology, 216, p.469-631, 1992, Academic Press. および、 "Other bacterial systems", Methods in Enzymology, 204, p.305-636， 1991， Academic Press 参照） に準 じた手法ないし方法を用いることができる。
ぐ大腸菌への遗伝子導入〉
大腸菌への外来遺伝子の導入法としては、 ハナハンの方法、 ルビジウム法など すでに確立されたいくつかの効率的方法があり、 それらを用いることができる 、たとえは、 Sambrook, J., Fritsch, B. F. , Maniatis, T.， "Molecular clon ing -A laboratory manual. " Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第 1章第 7 4頁〜第 8 4頁， 1989 参照） 。 大腸菌で外来遺伝子を発現させるためには、 常法 {こ ¾Eレ、 (たとえ（ま'、 B，J述の "Molecular cloning 一 A laboratory manual. 第 1 7章第 3頁〜第 4 1頁" ） 。
参照） 、 たとえば、 lac のプロモータ一を有する大腸菌発現ベクターに外来遗伝 子を挿入したものを大腸菌に導入するとよい。 本発明者等は、 lac のプロモータ —等を有する大腸菌用 cDNA発現ベクター pSPORTl (GIBCO BRL 社） 中に、 lac のプロモーターの転写のリードスルーを受ける方向に、 Haematococcus の bkt 遺 伝子を挿入し、 これを大腸菌に導人した。
ぐ酵母への遺伝子導入〉
酵母 Saccharomyces cerevisiae への外来遺伝子の導入法としては、 リチウム 法などすでに確立された方法があり、 それを用いることができる （たとえば、 秋 山裕一監修バイオインダストリ一協会編集、 「酵母のニューバイオテクノ口ジ
-J 医学出版センタ一 刊参照） 。 酵母で外来遗伝子を発現させるためには、 PG K や GPD 等のプロモーターおよびターミネータ一を用いて、 外来遗伝子をこの プロモーターとターミネーターの間に転写のリ一ドスルーを受けるように揷入し た発現カセッ トを構築し、 この発現カセッ トを、 S. cerevisiae のベクター、 たとえば、 YRp系 （酵母染色体の ARS配列を複製起点とする酵母用マルチコピーべ クタ一） 、 YEp系 （酵母の 2um DNAの複製起点を持つ酵母用マルチコピーべクタ 一） 、 Yip系 （酵母の複製起点を持たない酵母染色体組込み用ベクター） 等のベ クタ一に挿入し、 これを酵母に導入するとよい （前述の 「酵母のニューバイオテ クノロジー」 医学出版センター刊、 日本農芸化学会 ABCシリーズ 「物質生産のた めの遺伝子工学」 朝倉窨店刊、 および、 Yamano, S. , Is ii, T. , Nakagawa, Μ. ,
Ikenaga, Η. , Misawa, Ν. , "Metabolic engineering for production of β -car otene and lycopene in Saccharomyces cerevisiae". Biosci. Biotech. Bioc hem., 58， P.1112-1114, 1994 参照） 。
く Zymomonas mobi 1 i'sへの遗伝子導入〉
エタノール生産細菌 Zymomonas mobilis への外来遗伝子の導入は、 グラム陰 性菌に共通な接合伝達法により行うことができる。 Zymomonas mobilisで外来遗 伝子を発現させるためには、 外来遗伝子を挿入した発現ベクター （たとえば、 Z ymomonas mobilis 用べクタ一 pZA22) ¾· Zymomonas mobilisiこ導入するとよ ヽ
(中村克己、 「Zymomonas 細菌の分子育種」 、 日本農芸化学会誌， 63， p.1016-1 018, 1989、 および、 Misawa, N. , Yamano, S.， Ikenaga, H. , "Production of b- carotene in Zymomonas mobilis and Agrobacterium tumefaciens by introduc tion of the biosynthesis genes from Erwinia uredovora". Appl. Environ. Microbiol. , 57， p.1847-1849, 1991参照） 。
< Agrobacterium t蒙 faciensへの遗伝ナ導入 >
植物病原細菌 Agrobacterium tumefaciens への外来遗伝子の導入は、 グラム 陰性菌に共通な接合伝達法により行うことができる。 Agrobacterium tumefacie ns で外来遗伝子を発現させるためには、 外来遺伝子を挿入した発現ベクター
(たとえば、 Agrobacterium tumefaciens 用べクタ一 pB1121) を Agrobacterium tumefaciens{こ導入するとよレ、 (Misawa, N. , Yamano, S.， Ikenaga, H. , "Prod uct ion of β -carotene in Zymomonas mobi lis and Agrobacterium tumefaciens by introduction of the biosynthesis genes from Brwinia uredovora". Ap pl. Environ. Microbiol., 57, p.1847-1849, 1991 参照） 。
6. 微生物によるケトカロチノイ ド生産 （bkt 遗伝子発現）
前述した、 微生物への外来遗伝子の導入のための手法ないし方法によって、 緑 藻 Haematococcus由来のァスタキサンチンを始めとするケトカロチノィ ド合成遗 伝子群を導入し、 これを発現させることが可能である。
フアルネシルピロリン酸 （FPP) はカロチノイ ドだけでなく、 セスキテルペン、 トリテルペン、 ステロール、 ホパノール等のテルぺノイ ドと共通な基質である。 一般に、 微生物は、 カロチノィ ドを合成できないものでも、 テルぺノィ ドは合成 しているので、 すべての微生物は基本的に中間代謝産物として FPP を有してい るはずである。 一方、 非光合成細菌 Erwinia のカロチノィ ド合成遺伝子群は、 FPP を基質として、 Haematococcus の bkt 遺伝子産物の基質、 すなわち、 β- 力 ロチン、 ゼアキサンチンまで合成させることが可能である （第 7図参照） 。 発明 者等は、 大腸菌だけでなく前記した微生物、 すなわち、 酵母 Saccharomyces cer evisiae、 エタノーノレ生産 #田菌 Zymomonas mobilis, ¾1物两原糸田菌 Agrobacteriu m tumefaciens に Erwinia の crt 遺伝子群を導入し、 これらの微生物が、 予想 どおり、 5—力ロチン等のカロチノイ ドを生産できるようになることを、 すでに 確認している (Yamano, S.， Ishii, T. , Nakagawa, M. , Ikenaga, Η.， Misawa, N.， "Metabolic engineering for production of /S- carotene and lycopene i n Saccharomyces cerevisiae". Biosci. Biotech. Biochem. , 58, p.1112-111 4, 1994、 Misawa, N. , Yamano, S. , Ikenaga, H.， "Production of β -caroten e in Zymomonas mobi 1 is and Agrobacterium tumefaciens by introduction of the biosynthesis genes from Brwinia uredovora". Appl. Environ. Microbio 1., 57, p.1847-1849, 蘭、 および、 特開平 3-58786号公報参照） 。
したがって、 Erwinia 由来のカロチノィ ド合成遗伝子群と本発明の D N A (典 型的には Haematococcus 由来のカロチノィ ド合成遺伝子 bkt) を組み合わせて同 一の微生物に同時に導入することにより、 遺伝子導入発現系が確立しているすべ ての微生物にァスタキサンチン等のケトカロチノィ ドを生産させることが可能と なる。 あるいは、 本来カロチノイ ド合成遺伝子群を有している微生物や予めカロ チノィ ド合成遺伝子群を導入した微生物に、 本発明の DNAを導入することによ り、 該微生物にケトカロチノィ ドを生産させることもできる。 以下に、 各種ケト カロチノィ ドの微生物による生産法について説明する。
くカンタキサンチン、 ェキネノンの生産〉
9—カロチン合成に必要な Erwinia uredovora の crtE、 crtB、 crtK crtY 遗 伝子およびケト基導入酵素遺伝子である Haematococcusの bkt 遺伝子を大腸菌等 の微生物に導入し発現させることにより、 最終産物としてカンタキサンチンを生 産させることができる。 また、 bkt 遗伝子の発現レベルの調節等により合成中間 体のェキネノンも得ることができる。 例えば、 大腸菌を用いてカンタキサンチン、 ェキネノンを生産するためには、 Erwinia uredovora の crtE、 crtB、 crtl、 crtY 遗伝子を含む断片を大腸菌ベクター （例えば、 PACYC184) に挿入したブラスミ ド （例えば、 pACCAR16AcrtX) 、 および、 Haematococcusの bkt 遺伝子を含む断 片を大腸菌べクタ一 （例えば、 pBluescript II KS+) に挿入したブラスミ ド （例 えば、 PHP51 (第 1 0図参照） ） の両プラスミ ドを大腸菌 （例えば、 JM101) に導 入し、 それを、 例えば、 アンピシリンとクロラムフヱニコールを含む LB培地ま たは 2 YT培地等の培地で 3 0〜3 7 °Cの培養条件で定常期まで培養し、 菌体を 集め、 アセトン等の有機溶媒を用いてカロチノイ ド色素を抽出すればよい。 この ようにして得られるカロチノィ ド色素には、 カンタキサンチンおよびェキネノン が含まれうる。
くァスタキサンチン、 4 -ケトゼアキサンチンの生産〉
ゼアキサンチン合成に必要な Envinia uredovora の crtE、 crtB、 crtl、 crtY, crtZ 遺伝子およびケト基導入酵素遗伝子である Haematococcusの bkt 遺伝子を 大腸菌等の微生物に導入し発現させることにより、 最終産物として、 ァスタキサ ンチンを生産させることができる。 また、 bkt 遗伝子の発現レベルの調節等によ り合成中間体の 4 -ケトゼアキサンチンも得ることができる。 例えば、 大腸菌を 用いてァスタキサンチン、 4 -ケトゼアキサンチンを生産するためには、 Erwinia uredovora の crtE、 crtB、 crtK crtY 、 crtZ遺伝子を含む断片を大腸菌べクタ — (例えば、 PACYC184) に揷入したプラスミ ド （例えば、 pACCAR25AcrtX) 、 お よび、 Haematococcusの bkt 遺伝子を含む断片を大腸菌ベクター （例えば、 pBlue script II KS+) に挿入したブラスミ ド （例えば、 pHP51) の両プラスミ ドを大腸 菌 (例えば、 JM101) に導入し、 それを、 例えば、 アンピンリンとクロラムフエ 二コールを含む L B培地または 2 YT培地等の培地で 3 0〜 3 7 °Cの培養条件で 定常期まで培養し、 菌体を集め、 アセ トン等の有機溶媒を用いてカロチノイ ド色 素を抽出すればよい。 このようにして得られるカロチノイ ド色素には、 ァスタキ サンチンおよび 4 -ケトゼアキサンチンが含まれうる。
<3' -ヒ ドロキシェキネノ ン、 3-ヒ ドロキシェキネノ ン、 フエニコキサンチンの 生産 >
ゼアキサンチン合成に必要な Erwinia uredovora の crtE、 crtB、 crtK crtY、 crtZ 遗伝子およびケト基導入酵素遺伝子である Haematococcusの bkt 遗伝子を 大腸菌等の微生物に導入し発現させることにより、 主要産物として、 ァスタキサ ンチン、 4 -ケトゼアキサンチンを生産させることができる力、'、 マイナー中間代 謝産物として、 3'-ヒ ドロキシェキネノン、 3-ヒ ドロキシェキネノン及びフヱニ コキサンチンが存在するはずである。
これらの色素の生産方法は、 上記の方法に準じるが、 詳細は実施例を参照され たい。
7. 微生物の寄託
本発明の DNAである単離された bkt遗伝子を組み込んだブラスミ ド PHP51 を 導入した大腸菌 DH5aは、 工業技術院生命工学工業技術研究所に下記の通りに寄 託されている。
寄託者が付した識別のための表示： DH5a(pHP51)
寄託番号： FERM BP- 4757
受託年月日 ：平成 6年 7月 26日 図面の簡単な説明
第 1図は、 緑藻 Haematococcus pluvialis NIES-144 のケト基導入酵素遗伝 子 （bkt) の塩基配列とコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 第 2図は、 緑藻 Haematococcus pluvialis NIES-144 のケト基導入酵素遗伝 子 （bkt) の塩基配列とコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
第 3図は、 緑藻 Haematococcus pluvialis NIES-144 のケト基導入酵素遗伝 子 （bkt) の塩基配列とコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
上記の第 1〜3図においては、 開始コドンが異なっている。
第 4図は、 緑藻 Haematococcus pluvialis NIES-144 のケト基導入酵素遗伝 子 （bkt) を含む DNA鎖の塩基配列を示す。 図中、 A、 Bおよび Cは開始コドンの 位置を示す。
第 5図は、 第 4図に続く配列を示す。
第 6図は、 ；9—カロチンまでのカロチノイ ド生合成経路を示す。
第 7図は、 非光合成細菌 Erwinia uredovora のカロチノィ ド生合成経路と力 口チノィ ド合成遗伝子の機能を示す。
第 8図は、 緑藻 Haematococcus pluvialis NIES-144 のケト基導入酵素遗伝 子 （bkt) と非光合成細菌 Erwinia uredovora の水酸基導入酵素遺伝子 （crtZ) の機能とケトカロチノィ ドの主要生合成経路を示す。
第 9図は、 緑藻 Haematococcus pluvialis NIES-144 のケト基導入酵素遗伝 子 （bkt) と非光合成細菌 Envinia uredovora の水酸基導入酵素遗伝子 （crtZ) の機能とケトカロチノィ ドのマイナーな生合成経路を示す。
第 1 0図は、 緑藻 Haematococcus pluvialis NIES-144 のケト基導入酵素遗 伝子 （bkt) を含む 2種のブラスミ ド pHP5および pHP51 を示す。
PHP5は pSPORT 1に、 pHP51は pBluescript II KS+に、 lac のプロモーターのリ 一ドスルーを受ける方向に挿入されている。 制限酵素切断部位は次のように省略 されて示されている。 S, Sail; Ss， Sstl; P, Pstl; Sp, Sphl; N, Notl; X, Xb al: K. Kpnl； Sa, Sad.
第 1 1図は、 緑藻 Haematococcus pluvialis NIES-144 のケト基導入酵素遗 伝子 （bkt) の開始コドンを含む領域の塩基配列と各種デレーシヨンブラスミ ド の開始部位を示す。
第 1 2図は、 緑藻 Haematococcus pluvialis NIES-144 の bkt遗伝子の 1.7kb DNA断片をプローブとした、 3種類の Haematococcusに対するサザン分析 （電 泳動写真） を示す。
レーン 1〜 3 Haematococcus pluvial i s NIES-144
レーン 4〜 6 Haematococcus lacustris UTEX294
レーン 7〜 9 Haematococcus lacustris C - 392
レーン 1、 4 7 Hindlll消化物
レーン 2、 5 8 Pstl 消化物
レーン 3、 6 9 Xbal 消化物 発明を実施するための最良の方法
以下、 本発明を実施例により具体的に説明する。 本発明の範囲はこれらの実施 例により限定されるものではない。
[実施例 1 ] 生物材料と培地組成
遺伝子取得に用いた Haematococcus pluvialisは、 財団法人 地球 ·人間環境 フォーラム （ Global Environmental Forum ：)に登録されている NIES- 144 株で ある。 Haematococcus pluvial isを基本培地 （酵母エキス 0.2%、 酢酸ナトリウ ム 0.12%、 ぃァスパラギン 0.04%、 塩化マグネシウム ·六水和物 0.02%、 硫酸第一鉄 '七水和物 0.001%、 塩化カルシウム '二水和物 0.002%) を用い、 20°C、 12時間明/ ^2時間暗 （20 E/m2 · s)で約 4日間培養した。 又、 Haematococc us pluvial is のァスタキサンチン合成 ¾¾5導する為に、 Haematococcus pluvial is NIES- 144 株に酢酸を最終'濃度 45mM、 硫酸第一鉄 ·七水和物を最終濃度 450 / Mになるように加え、 20°C、 光強度 125//E/m2 · sで約 12時間培養して、 シスト化 を誘導した。
[実施例 2] Haematococcus pluvial isの全 DNAの調製
Haematococcus pluvialis NIES- 144 株を 400mlの基本培地に植菌して 20°C、 光 強度 20 E/m2 · s、 明暗サイクル 12時間明 12時間暗で約 4日間培養した。 培養液 から菌体を集菌し、 液化窒素で凍結して、 乳鉢で菌体が粉末状になるまで破砕し た。 粉末状の破砕菌体に 15mlの抽出緩衝液（0.1 M Tris-HCl pH8.0, 0.1 M EDTA, 0.25 M NaCl, 0.1 mg/ml Proteinase K )を加えて激しく攪拌し、 55。Cで 2時間 保温した後、 6000xg、 10分間、 4°Cで遠心して沈殿物を取り除いた。 上清に 0.6 倍量のイソプロパノールを加え、 - 20°Cで 30分間冷却した後、 7500xg、 15分間、 4°Cで遠心した。 沈殿した DNA含有物を 2mlの TE緩銜液（10mM トリス- HC1 pH8.0, 1 mM EDTA)で溶解し、 等量のフヱノール： クロ口ホルム（1： 1)と混合して遠心し、 上層を抽出した。 続いて 80//1の 5M NaClと 5mlのエタノールを加えて- 20°Cで 30分 間冷却した後、 12000xg、 15分間、 4eCで遠心した。 更に 70%エタノールで沈殿 物をリンスした後、 乾燥して 0.5 mlの ΤΈ緩衝液（10 mM Tris-HCl pH8.0, 1 mM ED TA)に溶解し、 2.5 1の 10 mg/mlの RNase Aを加えたものを Haematococcus pluvia lisの全 DNA溶液とした。
[実施例 3] PCRによる Haematococcus pluvialis からの crtZ相同領域の単離 の試み
Erwinia uredovoraと Erwinia herbicolaの crtZ遗伝ナ (Misawa, N. , Nakagawa, M. , Kobayas i, K. , Yamano, S. , I zawa, Y. , Nakamura, K.， Harashima, K. , n Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia col i. J.
Bacterid., 172, p.6704-6712, 1990、 Hundle, B. S. , Beyer, P., Kleinig, H.
, Englert, G. , Hearst, J. E. , "Carotenoids of Erwinia herbicola and an E scherichia col i HB101 strain carrying the Erwinia herbicola carotenoid g ene cluster. Phytochem. Phytobiol. , 54, p.89-93, 1991) にコードされる ァミノ酸配列を比較することから相同性の高い領域を見つけだし、 その領域のァ ミノ酸配列から予想される使用コ ドンを組合わせて、 以下の混合プライマーを 3 種類合成した。
No.1 5' -GGNTGGGGNTGGCAYAARTCNCAYCA-3'
No.2 5* -CANCGYTGRTGNACNAGNCCRTCRTG-3'
No.3 5' -GCRTASATRAANCCRAARCTNACRCA-3'
〔N: A，G，Cまたは T , R: Aまたは G ， Y: Cまたは T , S : A, G または T〕
No.1と No.2及び No.1と No.3の混合プライマーを使って Haematococcus pluvial i s 全 DNA溶液を铸型として PCR (polymerase chain reaction) を行った。 最終 濃度がそれぞれ、 約 100 ngの Haematococcus pluvialis の全 DNA溶液、 各 100 M の混合プライマ一、 10 mM MgSO" lxVent BufferClO mM KC1, 20 mM Tris-HCl ( pH8.8), 10 mM (NHO2SO , 2 mM MgSO" 0.1 ¾ Triton X - 100)， 250 / M dNTP, 2 U Vent DNA polymerase (New England Biolabs, Inc. ) ίこなるよう ίこ混合し、 9 4°C 30秒間、 55°C 30秒間、 72°C 30秒間で 30サイクル、 及び 94。C 30秒間、 6 0°C 30秒間、 72°C 30秒間で 30サイクルの反応条件で PCRを行い、 電気泳動法で 反応生成物の有無を確認した。 しかし、 いずれの場合も、 明確な単一の生成物を 検出することは出来なかった。
[実施例 4] Haematococcus pluvial isの全 RNAの調製
Haematococcus pluvialis NIES-144 株を 800 mlの基本培地に植菌して 20°C、 光強度 · s、 明暗サイクル 12時間明 /12時間暗で約 4日間培養し、 続いて 酢酸を最終濃度 45πιΜ、 硫酸第一鉄 ·七水和物を最終濃度 450 / Μになるように加え、 20°C、 光強度 125;/ E/m2 · sで約 12時間培養した。 培養液から菌体を集菌し、 液化 窒素で凍結して、 乳鉢で菌体が粉末状になるまで破砕した。 粉末状の破砕菌体に 3 mlの IS0GEN-LS ((株）二ツボンジーン） を加え、 室温で 5分間放置し、 更に 0.8 mlのクロ口ホルムを加えた後、 15秒間激しく搜拌して 3分間、 室温で放置した。
12000xg、 15分間、 4°Cで遠心して上眉を抽出し、 2 mlのイソブロパノールを加 えて 10分間、 室温で放置後、 12000xg、 10分間、 4°Cで遠心した。 続いて 70%ェ タノールで沈殿物をリンスした後、 乾燥して lmlの TE緩衝液（10mM トリス- HC1 (p H8.0), 1 mM EDTA)に溶解したものを Haematococcus pluvial isの全 RNA溶液とし た。 この調製法で 4.1 mgの全 RNAが得られた。
[実施例 5] Haematococcus pluvial isの cDNA発現ライブラリーの作製
オリゴテックス一dT30スーパ一 （宝酒造 （株） ） を用いて Haematococcus pluv ialisの全 RNA約 lmgからポリ A+RNAを精製した。 精製方法は、 添付の製品説明書の 使用方法に従った。 この精製方法で約 のボリ A+mRNAを精製した。
cDNAの作製は、 スーパ一スクリプト TMブラスミ ドシステム （GIBC0 BRL社） を用 い、 添付の説明書の使用方法を一部改変して以下の通りに行った。 約 5tzgのポリ A+RNA を用い、 制限酵素 Notlの認識配列と 15mersのオリゴ dTからなる合成 DNAを プライマ一として逆転写酵素 SUPERSCRIPT RTで相補鎖 DNAを合成し、 続いて E. col i DNA リガーゼ、 E. coli DNA ポリメラ一ゼ、 E. coli DNA RNase Hを用いて 2本鎖 cDNAを合成した後、 制限酵素 Sailのリ ンカ一を T4 DNA リガーゼで結合させ、 最 終的に cDNAの上流末端が Sail部位、 ポリ Aの下流が Notl部位になるようにした。 電気泳動法を用いて、 これら cDNAのサイズ分画を行い、 0.7kb〜3.5kbの範囲の分 画を集めた。 この分画の cDNA約 28 ngと 35ngの cDNA発現ベクター pSPORT I (GIBC0 BRL 社） を Notl と Sailで消化したものとを上キッ 卜に含まれているライゲー ショ ンバッファ一（50mM 卜リス -HC1 pH 7.6, 10mM MgC12, lmM ATP, ΙπΜ DTT, 5 % PEG 8000)及び T4 DNA リガーゼを用いてライゲーシヨンした。 この cDNA発現べ クタ一 pSPORT Iは、 Sail部位の上流に lacプロモーターをもち、 大腸菌内で cDNA を発現させることができるベクターである。 次にライゲーションした DNA溶液を 全て使って、 Molecular Cloning 2nd edition ： Cold Spring Harbor Laborator y , 1.21-1.41 (1989)の方法に従って調製した大腸菌 (Escherichia coli) DH5a のコンビテントセルの形質転換を行った。 約 4万個の形質転換株が得られ、 これ らを全て集めた後、 Molecular Cloning 2nd edition ： Cold Spring Harbor Lab oratory , 1.21-1.41 (1989)の方法に従い、 プラスミ ド DNAを調製した。 その結果、 0.6 mgのブラスミ ド DNAが得られ、 これを Haematococcus pluvial isの cDNA発現ラ ィブラリーとした。
[実施例 6] ケト基導入酵素遺伝子を保持した大腸菌の色調変化を利用したス クリーニング
(1) -カロチン産生大腸菌の作製
Erwinia uredovoraの crtZ以外のカロチノイ ド合成遗伝子群（crtX, crtE, crtY, crtl, crtB遗伝子） を有するプラスミ ド PCAR16 (Misawa, N. Nakagawa, M. Kobaya shi, . Yamano, S. Izawa, Y. Nakamura, K. Harashima, K. , Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysi s of gene products expressed in Escherichia coli. J. Bacteriol. , 172, p. 6704-6712, 1990, 及び特開平 3-58786号公報参照） の BstEH消化、 Klenow酵素処 理、 リガーゼ反応を行うことにより、 crtX遗伝子をフレームシフ トにより失活さ せた後、 ^-カロチン産生に必要な crtE, crtY, crtl, crtB遗伝子を含む 6. Okbの As p718(KpnI)- EcoRI断片を切り出した。 この断片を大腸菌ベクター pACYC184 (ATCC 37033 より入手） の EcoRV部位に挿入し、 目的とするプラスミ ド （pACCAR16A crt Xと命名） を得た。 この pACCAR16AcrtXを有する大腸菌は、 クロラムフヱニコー ル耐性を示し、 カロチンを生産することができる。
(2) ケト基導入酵素遺伝子のスクリーニング
ケトカロチノイ ドは、 Haematococcus pluvialis内では^-カロチンを経て生合 成されると考えられる (Bri tton, G. , "Biosynthesis of carotenoids". Plant P igments. London, Academic Press, 1988, p.133-182. (Goodwin, T. W. ed. ) 参 照） 。 そこで上記の pACCAR16AcrtXを保持する大腸菌 JM101が^-カロチン （黄 色） を産生することを利用して、 この大腸菌に上記の cDNA発現ライブラリーを導 入し、 得られた形質転換体の色調変化から、 ケト基導入酵素遺伝子を保持した大 腸菌をスクリーニングした。 ケト基が導入され、 ケトカロチノイ ドのひとつであ るカンタキサンチンが合成されると大腸菌の色調が /3-カロチンの黄色から力ン タキサンチンの赤色に変わると予想された。
まず、 Molecular Cloning 2nd edition ： Cold Spring Harbor Laboratory , 1.
21-1.41 (1989)の方法を用い、 pACCAR16厶 crtXを保持する大腸菌 JM101のコンビ テントセルを作製した。
次に、 このコンビテントセル 1 mlに対して 100 ngの cDNA発現ライブラリーを導 入し、 約 4万個の形質転換体に対してスクリーニングを行い、 他の株と色調がや や異なる赤みがかった株を 1株単離した。 （この株の色素は、 実施例 7において カンタキサンチンと同定） なお、 この株が保 している cDNA発現ブラスミ ドを pH P5と命名した。 ブラスミ ド pHP5の構成を第 10図に示す。
[実施例 7 ] ケト基導入酵素遺伝子の塩基配列決定
PHP5に挿入されている Haematococcus pluvial is由来の 1.7 kb cDNAを制限酵素 Sailと Xbai で切り出し、 大腸菌ベクター pBluescript II KS +および pBluescrip t I I SK +の Sal l/Xba l部位に揷入して、 2種のブラスミ ド （pHP51および pHP52と 命名） を得た。 このうちプラスミ ド PHP51の制限酵素地図を第 10図に示す。 pHP51 及び PHP52は、 それぞれ、 上記 cDNAが lacのプロモータ一のリードスルーを受ける 方向及び受けない方向に揷入されてたものである。
作製したプラスミ ド pHP51、 pHP52について以下の手順で種々の長さの欠失を有 する欠失変異体作製を行い、 それらについて塩基配列の決定を行った。 PHP51は S ac lと Xba lとで分解し、 pHP52は Kpn lと Sal Iとで分解した後、 フヱノールノクロ口 ホルム抽出を行い、 エタノール沈殿により DNAを回収した。 それぞれの DNAを 100 1の Exo l l lバッファー （50mM Tr i s-HCl, 100mM NaCl, 5mM MgCl 2， lOmM 2-メル 力ブトエタノール、 pH8. 0) に溶解し、 180ユニッ トの Exo I I Iヌクレアーゼを加え て 37°Cで保温した。 30秒ごとに 10 1 の反応溶液をサンプリングして、 10 u 1 の MBバッファー （40mM NaCl, 2mM ZnCh, 10%グリセロール、 pH4. 5) の入った 氷上のチューブに移した。 サンプリング終了後、 得られた 10本のチューブを 65。C、 10分間保温して酵素を失活させた後、 5ュニッ トのマングビーンヌクレアーゼを 加えて 37°Cで 30分保温した。 反応後、 ァガロースゲル電気泳動により、 1つのブ ラスミ ドのついて 10種のそれぞれ欠失の程度が異なる DNA断片を回収した。 回収 した DNAは Kl enow 酵素により末端を平滑化し、 16。C、 一晚ライゲーシヨン反応し た後、 大腸菌 DH5なを形質転換した。 得られた種々のクローンについてブラスミ ドを調製し、 アプライ ドバイオシステム （株） の蛍光ブライマーサイクルシーク エンスキッ トを用いてシークェンス反応を行い、 自動シークェンサ一を用いて塩 基配列を決定した。
決定した 1677 塩基対 （bp) からなる配列を第 4図および第 5図 （配列番号 4 ) に示す。 オープンリーディ ング ' フレーム検索の結果、 大腸菌内で発現する のに必要なリポソ一ム桔合部位を開始コ ドンの上流に持つ 3つのオープンリーデ イ ングフレーム （第 1図の A〜D (配列表の配列番号 5に示す） 、 第 2図の B〜 D (配列表の配列番号 6に示す） 、 第 3図の C〜D (配列表の配列番号 7に示 す） ） が見いだされた。 なお、 実施例 8で示すように、 Cより短くすると大腸菌 内での酵素活性が無くなるので、 これより下流には、 開始コ ドンは存在しないと 考えられることから、 第 3図の Cより下流の領域については上記のオープンリ一 ディングフレームの検索からは省略した。
[実施例 8 ] ケト基導入酵素遺伝子の開始コドンの決定
第 11図に上記オーブンリーディングフレームの上流部分の塩基配列を示す。 開 始コドンの可能性がある部位は、 5ケ所 （塩基位置 168〜170、 189〜191、 264〜26 6、 348〜350、 423〜425、 これらの位置は第 11図において枠で囲われている。 ） 存在する。 第 11図に示す開始コ ドンにおける 168 位の塩基、 189 位の塩基、 およ び 264 位の塩基は、 それぞれ、 第 1図の A、 第 2図の B、 および第 3図の Cで示 した位置に相当する。 そこで機能タンパク質として必要な最小領域を決定するた めに、 実施例 5と同様の方法により pHP51の欠失変異体作成を行い、 上流領域が 欠失したブラスミ ドを数種作製した。 第 11図には、 それぞれの欠失ブラスミ ドの 番号と上流末端位置を示す。 これらブラスミ ドを実施例 6に記した pACCAR16 A cr tXを保持する大腸菌 JM101にそれぞれ導入し、 その産生色素を同定した結果、 番号 30、 27、 31、 37、 12の欠失ブラスミ ドを保持する大腸菌では、 カンタキサンチ ンの産生が認められたが、 番号 10、 6、 38では認められなかった。 また、 番号 12 の場合、 塩基位置 264〜266の開始コドン ATGの Aまでが欠失しているが、 欠失変異 体を作成した際にこの ATGが GTGとなり、 大腸菌は GTGでも開始コドンと認識しう ることから、 この位置の開始コドンからぺブチド合成が始まっていると考えられ る。 したがって 264〜266の開始コドン以下のオーブンリーディングフレーム （第 3図の C〜D (配列表の配列番号 7に示す。 ） ） からコードされるポリペプチド鎖 であれば十分ケト基導入酵素活性を示すことが明らかになった。
[実施例 9 ] ケトカロチノィ ド色素の同定
( 1 ) カンタキサンチンの同定
PHP5または pHP51を 5 -カロチン産生大腸菌 JM101に導入したもの （大腸菌 （pAC CAR16 A cr tX, pHP5または pHP51 )) (橙色を呈している） を 150 gZmlのアン ピシリ ン （Ap、 明治製菓製） 、 30 tz gZmlのクロラムフヱニコール （Cm、 三共 製） 、 1 mMの I PTG、 7 mg FeS04 · 7 0ぉょび9. 3 mg Na 2 · EDTAを含む 2YT培地 ( 1. 6 % ト リプトン、 1 %ィース トエキス、 0. 5% NaC l ) 2リッ トルで、 30°C、 24 〜30時間培養した。 培養液から集菌した菌体を、 300 ml のアセトンにより抽出 した。 これを濃縮後、 200 ml のクロ口ホルム Zメタノール （9 1) で 2回抽出 し、 濃縮乾固した。 さらに、 これを小量のクロ口ホルム/メタノール （9ノ 1) に 溶解後、 メルク社製の分取用シリカゲル TLCプレートを用いて、 クロ口ホルム Z メタノール （50Z1) で展開することにより、 薄層クロマトグラフィー （TLC) を 行った。 この TLC により、 スボッ トは Rf値 0. 53、 0. 78および 1 の 3スポッ トに分 かれた。 抽出された色素全体の 75%に相当する最も濃い赤色色素（Rf 値 0. 53) を、 TLCブレー卜からかきとった。 この赤色色素をさらに小量のクロ口ホルム/メタ ノール （9 1 ) に溶解後、 セフアデクス LH- 20カラムクロマトグラフィ一 （15 X 3 00 mm) にかけ、 クロ口ホルム/メタノール （9Z1) で展開溶出することにより、 純品を 2 mg得た。 本物質の紫外—可視スぺク トル、 ' H-NMR FD-MSスぺク トル （m Ze 564) 、 および、 シリカゲル TLCの移動度 （クロ口ホルム メタノール （50ノ 1) で展開で Rf値 0. 53) が、 カンタキサンチンの檫準品 （BASF社製） とすべて一 致したため、 本物質をカンタキサンチン （構造式は第 8図参照） と同定した。 また、 最初に抽出された色素の 10%に相当する赤色色素 （TLC で Rf値 0. 78) を、 TLC プレートからかきとり、 少量のメタノールに溶かした。 この色素の紫外一可 視スぺク トル、 シリカゲル TLCの移動度 （クロ口ホルム Zメタノール （50 1) で 展開で Rf値 0. 78) 、 および、 ノバパック HR6 // C I 8 (3. 9 x 300 mm) (ウォーター ズ社製） を用いた HPLCの移動度 （ァセトニトリル/ メタノール /2- プロパノール (90/6/4)で 1. 0 ml/ 分の速度での展開で RT16分） よりェキネノン （構造式は第 8 図参照） であると考えられた。
次いで、 最初に抽出された色素の残り 1 5 %に相当する黄色色素 （TLC で Rf値 1)を TLC プレートからかきとり、 少量のメタノールに溶かした。 この色素の紫外 —可視スぺク トル、 および、 ノバパック HR 6 C , 8 (3. 9 X 300 mm) (ウォータ ーズ社製） を用いた HPLCの移勦度 （ァセトニトリル メタノール 2-プロパノー ル （90ノ 6Z4) で 1. 0 ml/ 分の速度での展開で RT62分） 力、'、 S—カロチンの檩準 品 （オールトランス型、 S i gma 社製） とすべて一致したため、 本物質は未反応の ；3—力ロチン （構造式は第 8図参照） であることがわかった。
( 2 ) ァスタキサンチン、 4 -ケトゼアキサンチンの同定 アキサンチン産生大腸菌を次のようにして作製した。 すなわち、 Er. uredov ora の 全力口チノィ ド合成遺伝子群を有するプラスミ ド pCAR25 (Misawa, N. , Nakagawa, M. , Kobayashi, Κ. , Yamano, S.， Izawa, Y. , Nakamura, ， Harash ima ， "Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic p athway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli". J. Bacteriol., 172, p.6704-6712, 1990および特開平 3- 58786 号） の 制限酵素 BstElI 消化、 Klenow fragment 処理、 ライゲーシヨン反応を行うこと により、 crtX 遗伝子をフレームシフ トにより失活させた後、 ゼアキサンチン産 生に必要な crtE、 crtB、 crtK crtY、 crtZ 遗伝子を含む 6.5 kb Asp718 (Kpnl) -EcoRI 断片を切りだした。 そして、 この断片を大腸菌ベクター PACYC184 の E coRV部位に挿入し、 目的とするプラスミ ド （pACCAR25AcrtXと命名） を得た。
PHP5または PHP51をこのゼアキサンチン產生大腸菌 JM101に導入したもの （大腸 菌 （pACCAR25AcrtX、 pHP5または pHP51)) (橙色を呈している） を 150 g/ml Ap、 30 〃g/mlの Cm、 1 mMの IPTG、 7 mg FeS04 · 7Η<0および 9.3 mg Na4 · EDTAを 含む 2YT培地 （1.6%トリプトン、 1%イーストエキス、 0.5% NaCl) 2リ ッ トルで、 30°C、 24〜30時間培養した。 培養液から集菌した菌体を、 300 ml のアセトンに より抽出した。 これを濃縮後、 200 ml のクロ口ホルム メタノール （9Z1) で 2回抽出し、 濃縮乾固した。 さらに、 これを小量のクロ口ホルムノメタノール (9/1) に溶解後、 メルク社製の分取用シリカゲル TLCプレートを用いて、 クロ 口ホルム メタノール （15Z1) で展開することにより、 薄層クロマトグラフィ 一 (TLC) を行った。 元の橙色色素は、 この TLCにより、 主要スボッ トは、 Rf 値 0.40、 0.54、 0.72の 3スポッ 卜に分かれた。 これらの色素を、 TLCプレートから、 かきとった後、 少量のクロ口ホルム Zメタノール （9Z1) に溶解し、 セフアデク ス LH-20カラムクロマトグラフィー （15 X 300 mm) にかけ、 クロ口ホルム メタ ノール （9Z1) で展開溶出することにより、 各々の純品を、 それぞれ、 約 1 mg、 1 mg、 2 mg得た o
抽出された色素全体の約半分に相当する Rf 0.72の色素は、 紫外一可視スぺク トル、 'H- NMR、 FD- MSスぺク トル （mZe 596) の結果より、 ァスタキサンチンと 同一の平面構造を持つものであることが明かになった。 そこで、 ジェチルエーテ ル： 2 -プロパノール：ェタノール 5 : 5 : 2 に溶解し、 CDスぺク トルを測定した ところ、 3S, 3' Sの立体構造をとることがわかったため、 本物質をァスタキサン チン （構造式は第 8図参照） と同定した。 また、 Rf 0.54の色素は、 その紫外— 可視スぺク トル、 'H-NMR、 FD- MSスぺク トル （mZe 582) 、 および、 シリカゲルお Cの移動度 （クロ口ホルム メタノール （15Z1) での展開で Rf値 0.54) から、 4 -ケトゼアキサンチン （構造式は第 8図参照） と同定された。 なお、 Rf 0.40 の色素は、 紫外—可視スぺク トル、 シリカゲル TLCの移動度 （クロ口ホルム / メ タノ一ル （15/1) で展開での Rf値 0.40) 、 および、 ノバパック HR6/zCl 8(3.9 x 300 mm) (ウォーターズ社製） を用いた HPLCの移動度 （ァセトニトリル/ メタノ —ル /2- プロパノール（90/6/4)で 1.0 ml/ 分の速度での展開で RT6.5 分） がゼァ キサンチンの檩準品 （BASF社製） とすべて一致したため、 本物質は未反応のゼァ キサンチン （構造式は第 8図参照） であることがわかった。
以上のことから、 ケト基導入酵素遗伝子の機能について以下のように考えるこ とができる。
実施例 9 (1) より、 Haematococcusのケト基導入酵素遗伝子 （bkt) は、 β- ロチンを基質として、 ェキネノンを経て力ンタキサンチンへの変換を触媒するケ ト基導入酵素 （yS -carotene ketolase) をコードしていることは明かである （第 8図参照） 。 このことは 1つの酵素 BKTが ィオノン環の 4位及び 4 ' 位のメ チレン基をいきなりケト基に変換してしまうことを示している。 このような機能 を持つ酵素は今まで知られていなかったものである。 さらに、 実施例 9 (2) より、 Haematococcusの bkt遗伝子は、 上記の活性以外に、 ゼアキサンチンを基質とし て、 4 -ケトゼアキサンチンを経てァスタキサンチンへの変換を触媒するケト基 導入酵素 （zeaxanthin ketolase) をコードしていることは明かである （第 8図 参照） 。 このことは 1つの酵素 BKTが 3 -及び 3' —ヒ ドロキシ -yS-ィオノン環の 4位および 4' 位のメチレン基をいきなりケト基に変換してしまうことを示して いる。 このような機能を持つ酵素も今まで知られていなかったものである。 した がって、 Haematococcusのケト基導入酵素遺伝子 bkt は、 3位 （3' 位） の位置 に水酸基が付加しているしていないにかかわりなく、 4位 （4' 位） のメチレン 基をいきなりケト基に変換する^-ィオノンまたは 3-ヒ ドロキシ - 3-ィオノン環 ケ卜基導入酵素 (/5-ionone or 3 - hydroxy - onone ring ketolase) をコ一ド しているということができる。 なお、 /9-ィオノン環ゃ 3 -ヒ ドロキシ -;3-ィオノ ン環に限らず、 1つの酵素がメチレン基をいきなりケト基に変換するという知見 は今まで存在しなかったものである。
一方、 植物常在細菌 Erwiniaや光合成細菌 Rhodobacterのカロチノィ ド合成遗伝 子を用いた我々の研究により、 一般に、 カロチノィ ド生合成酵素は、 基質となる カロチノィ ド分子の半分を認識して作用することが明かになってきた。 たとえば、 Erwiniaのリコピン環化酵素遺伝子である crtYはリコピン分子の半分ずつを認識 して環化する。 したがって、 Rhodobacterのフィ トエンデサチユラ一ゼ遗伝子 crt Iを用いることによりリコビンの変わりにノィロスポレンを大腸菌に合成させ、 これに Erwiniaの crtYを作用させると、 ノイロスポレンにおけるリコピンと共通 な半分の分子構造だけを crtY遺伝子産物は認識し、 半分だけ環化した; S-ゼァカ ロチンを産生する （Linden, H.， Misawa, N. , Chamovitz, D. , Pecker, Ι·， Hir schberg, J. , Sandmann, G. , "Functional complementation in Escherichi a col i of different phytoene desaturase genes and analysis of accumulate d carotenes". Z. Naturforsch. , 46c, p.1045-1051, 1991) 。 また、 本発明に おいても、 -カロチンに BKTを作用させると、 まず 1っケト基が導入されたェキ ネノンが合成されるし、 ゼアキサンチンに BKTを作用させると、 まず 1つケト基 が導入された 4 -ケトゼアキサンチンが合成される。 これは、 BKTが基質の半分の 分子を認識して 4位の位匱にケト基を導入するからと考えることができる。 一方、 Erwiniaの crtE、 crtB、 crtl、 crtY、 crtZ 遗伝子を有する大腸菌は、 前述したよ うに、 ゼアキサンチンを産生する力、'、 その中間代謝産物として、 5-カロチンに 1つ水酸基が導入された^-クリブトキサンチンを検出することができる。 この ことは、 そこに BKTが存在すると、 3-クリブトキサンチンを基質として 3'-ヒ ド 口キシェキネノンや 3-ヒ ドロキシェキネノンを合成することができ、 さらに、 こ れらに BKTが作用してフヱニコキサンチンを合成することができると考えること ができる。 今回、 我々は、 培養物中にこれらのケトカロチノィ ドを同定するには 至っていないが、 その理由は、 今回行われた条件では、 これらが微量しか存在し ないためであると思われる。 事実、 Haematococcusと並んで代表的ァスタキサン チン産生微生物である Phaffia rhodozymaにおいては、 ァスタキサンチン中間代 謝産物として 3-ヒ ドロキシェキネノンゃフヱニコキサンチンが検出されている (Andrewes, に G.， Phaff, H. J. , Starr, M. P., "Carotenoids of Phaffia rhodozyma, a red- pigmented fermenting yeast". Phytochemistry, 15, p.100 3-1007, 1976) 。 以上のことより、 第 8図に示したァスタキサンチンの主要代謝 経路の他に、 第 9図に示したマイナーな代謝経路も存在すると考えることができ る。
[実施例 1 0] 他の緑藻 Haematococcus の染色体 DN Aに対するサザン分析 他の緑藻 Haematococcus の染色体上に単離した bktと相同性を示す領域が得ら れるか否かを検討した。 実施例 2に記した Haematococcus pluvialis NIES-144力、 らの全 DN Aの調製法と同じ方法で Haematococcus Iacustris UTBX 294と Haemat ococcus Iacustris C-392 の全 DN Aを調製し、 Haematococcus pluvialis NIES -144の全 DN Aと共に制限酵素 Hindi II、 Pst Iあるいは Xbalで消化してァガロー スゲル電気泳動法で分離した。 分離した DNA断片を 0.5N NaOH 、 1.5M NaCl の アル力リ溶液で変性した後、 一晚かけてナイ口ンメンブレンにトランスファーさ せた。 DN Aが吸着したナイロンメンブレンをハイブリダィゼーシヨン溶液 （6 xDenhardt. 5 xSSC 、 0.2% SDS、 100//g/ml ssDNA) に浸し、 4時間、 55°Cで ブレハイブリダィゼーシヨンを行った。 次に bkt遺伝子の 1.7kb DNA断片を Meg aprime™ DNA labelling systems (アマシャム） と [a— 32P]dCTP (：〜 110 TBq/ mmol) とを用いて標識化し、 上記のブレハイブリダィゼーシヨン溶液に加えて 16 時間、 55。Cでハイブリダィゼ一シヨンを行った。 ハイブリダィゼーシヨン後、 2 XSSC 、 0. SDS で 60 、 1 時間洗浄し、 オートラジオグラフィ一によつて相同 性を示すシグナルを検出した結果、 Haematococcus pluvialis NIES-144では、 Hi ndlll 消化物で 15kb、 腸、 1.9kb 、 Pst I消化物では 6. lkb 、 3.3kb 、 2.8kb 、 2.3kb 、 2. Okb 、 1.4kb 、 0.8kb 、 Xbal消化物で 5. lkb の位置にそれぞれ強いシ グナルが得られた。 これに対して、 Haematococcus Iacustris UTEX 294では、 Hi ndlll 消化物で 15kb、 7.7kb 、 1.9kb 、 Pstl消化物で 10kb、 5. Okb 、 4. Okb 、 3. 4kb 、 2.9kb 、 1.5kb 、 0.82kb、 Xbal消化物では 20kb以上の D N Aの位置だけに そ ぞれ強いシグナルが得られ、 Haematococcus lacustris C-392 では、 Hindi I I 消化物で 15kb、 12kb、 1.9kb 、 PsH消化物では 6.5 kb、 3. Okb 、 2.3kb 、 2. Ok b 、 1.4kb 、 0.8kb 、 Xba 肖化物では 5.3 kbの位置にそれぞれ強いシグナルが得 られた （第 12図） 。 産業上の利用可能性
0—ィオノン環の 4位のメチレン基をケト基に転換する酵素をコードする本発 明 0DNAを外来遺伝子として大腸菌等の微生物に導入し、 発現させることによ り、 大腸菌等の微生物にァスタキサンチン、 4 -ケトゼアキサンチン、 カンタキ サンチン、 ェキネノ ン、 その他のケト基を含むケトカロチノイ ドの生合成能を付 与することが可能となった。 ケト基を含むケトカロチノィ ドの生合成能を付与さ れた大腸菌等の微生物を用いることにより、 ケト基を含むケトカロチノィ ドを少 ない労力およびコストで大量に製造することができる。
配列表
配列番号： 1
配列の長さ ： 3 2 0
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
起源
生物名 ： Haematococcus pluvial is
株名 ： NIES- 144
配列
Met His Val Ala Ser Ala Leu Met Val Glu Gin Lys Gly Ser Glu
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ser Ser Pro Asp Val Leu Arg Ala Trp Ala Thr Gin
20 25 30
Tyr His Met Pro Ser Glu Ser Ser Asp Ala Ala Arg Pro Ala Leu
35 40 45
Lys His Ala Tyr Lys Pro Pro Ala Ser Asp Ala Lys Gly lie Thr
50 55 60
Met Ala Leu Thr He He Gly Thr Trp Thr Ala Val Phe Leu His
65 70 75
Ala lie Phe Gin lie Arg Leu Pro Thr Ser Met Asp Gin Leu His
80 85 90
Trp Leu Pro Val Ser Glu Ala Thr Ala Gin Leu Leu Gly Gly Ser
95 100 105
Ser Ser Leu Leu His He Ala Ala Val Phe He Val Leu Glu Phe
110 115 120
Leu Tyr Thr Gly Leu Phe lie Thr Thr His Asp Ala Met His Gly
125 130 135
Thr lie Ala Leu Arg His Arg Gin Leu Asn Asp Leu Leu Gly Asn z： ^m
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S!H na jaw J3S J^l dsy aqd dj丄 BIV JA丄 "31 J3S 911 SXQ an
OSI O
Of9IO/S6df/X3d 190/96 OAV トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
起源
生物名 ： Haematococcus pluvialis
株名 ： N1ES-144
配列
Met Val Glu Gin Lys Gly Ser Glu Ala Ala Ala Ser Ser Pro Asp
1 5 10 15 Val Leu Arg Ala Trp Ala Thr Gin Tyr His Met Pro Ser Glu Ser
20 25 30 Ser Asp Ala Ala Arg Pro Ala Leu Lys His Ala Tyr Lys Pro Pro
35 40 45
Ala Ser Asp Ala Lys Gly lie Thr Met Ala Leu Thr He lie Gly
50 55 60
Thr Trp Thr Ala Val Phe Leu His Ala lie Phe Gin He Arg Leu
65 70 75
Pro Thr Ser Met Asp Gin Leu His Trp Leu Pro Val Ser Glu Ala
80 85 90
Thr Ala Gin Leu Leu Gly Gly Ser Ser Ser Leu Leu His lie Ala
95 100 105
Ala Val Phe lie Val Leu Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe lie
110 115 120
Thr Thr His Asp Ala Met His Gly Thr lie Ala Leu Arg His Arg
125 130 135
Gin Leu Asn Asp Leu Leu Gly Asn lie Cys lie Ser Leu Tyr Ala
140 145 150
Trp Phe Asp Tyr Ser Met Leu His Arg Lys His Trp Glu His His
155 160 165
Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp Phe His Lys Gly
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SJH sAq naq ¾iv OJJ 3JV ¾1V ¾1V dsV J3S J3s njo jas OJJ jaw ID«I Z.I90/96OAV 215 220 225
Pro Ala Ala Gly Ser Gin Val Met Ala Trp Phe Arg Ala Lys Thr
230 235 240
Ser Glu Ala Ser Asp Val Met Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe
245 250 255
Asp Leu His Trp Glu His His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp
260 265 270
Gin Leu Pro His Cys Arg Arg Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro
275 280 285
Ala Leu Ala
288 配列番号： 4
配列の長さ ： 1 6 7 7
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： c DNA
起源
生物名 ： Haematococcus pluvial is
株名 ： NIES- 144
配列
CGGGGCAACT CAAGAAATTC AACAGCTGCA AGCGCGCCCC AGCCTCACAG CGCCAAGTGA 60 GCTATCGACG TGGTTGTGAG CGCTCGACGT GGTCCACTGA CGGGCCTGTG AGCCTCTGCG 120 CTCCGTCCTC TGCCAAATCT CGCGTCGGGG CCTGCCTAAG TCGAAGAATG CAC GTC 176
Met His Val
1
GCA TCG GCA CTA ATG GTC GAG CAG AAA GGC ACT GAG GCA GCT GCT TCC 224 Ala Ser Ala Leu Met Val Glu Gin Lys Gly Ser Glu Ala Ala Ala Ser 5 10 15
AGC CCA GAC GTC TTG AGA GCG TGG GCG ACA CAG TAT CAC ATC CCA TCC 272 Ser Pro Asp Val Leu Arg Ala Trp Ala Thr Gin Tyr His Met Pro Ser
20 25 30 35
GAG TCG TCA GAC GCA GCT CGT CCT GCG CTA AAG CAC GCC TAC AAA CCT 320 Glu Ser Ser Asp Ala Ala Arg Pro Ala Leu Lys His Ala Tyr Lys Pro
40 45 50
CCA GCA TCT GAC GCC AAG GGC ATC ACG ATG GCG CTG ACC ATC ATT GGC 368 Pro Ala Ser Asp Ala Lys Gly lie Thr Met Ala Leu Thr He lie Gly
55 60 65
ACC TGG ACC GCA GTG TTT TTA CAC GCA ATA TTT CAA ATC AGG CTA CCG 416 Thr Trp Thr Ala Val Phe Leu His Ala lie Phe Gin lie Arg Leu Pro
70 75 80
ACA TCC ATG GAC CAG CTT CAC TGC TTG CCT CTG TCC GAA GCC ACA GCC 464 Thr Ser Met Asp Gin Leu His Trp Leu Pro Val Ser Glu Ala Thr Ala
85 90 95
CAG CTT TTG GGC GGA AGC AGC AGC CTA CTG CAC ATC GCT GCA GTC TTC 512 Gin Leu Leu Gly Gly Ser Ser Ser Leu Leu His lie Ala Aia Val Phe
100 105 110 115
ATT GTA CTT GAG TTC CTG TAC ACT CGT CTA TTC ATC ACC ACA CAT GAC 560 lie Val Leu Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe lie Thr Thr His Asp
120 125 130
GCA ATG CAT GGC ACC ATA GCT TTG AGG CAC AGG CAG CTC AAT GAT CTC 608 Ala Met His Gly Thr He Ala Leu Arg His Arg Gin Leu Asn Asp Leu
135 140 145
CTT GGC AAC ATC TGC ATA TCA CTG TAC GCC TGG TTT GAC TAC AGC ATG 656 Leu Gly Asn lie Cys lie Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Ser Met
150 155 160
CTG CAT CGC AAG CAC TGG GAG CAC CAC AAC CAT ACT GGC GAA GTG GGG 704
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0^9lO/!i6<If/X3d "Ϊ90/96 OAV AAG CAC GCC TAC AAA CCT CCA GCA TCT GAC GCC AAG GGC ATC ACG 180 Lys His Ala Tyr Lys Pro Pro Ala Ser Asp Ala Lys Gly lie Thr
50 55 60
ATG GCG CTG ACC ATC ATT GGC ACC TGG ACC GCA GTG TTT TTA CAC 225 Met Ala Leu Thr lie lie Gly Thr Trp Thr Ala Val Phe Leu His
65 70 75
GCA ATA TTT CAA ATC AGG CTA CCG ACA TCC ATG GAC CAG CTT CAC 270 Ala lie Phe Gin lie Arg Leu Pro Thr Ser Met Asp Gin Leu His
80 85 90
TGG TTG CCT GTG TCC GAA GCC ACA GCC CAG CTT TTG GGC GGA AGC 315 Trp Leu Pro Val Ser Glu Ala Thr Ala Gin Leu Leu Gly Gly Ser
95 100 105
AGC AGC CTA CTG CAC ATC GCT GCA GTC TTC ATT GTA CTT GAG TTC 360 Ser Ser Leu Leu His lie Ala Ala Val Phe lie Val Leu Glu Phe
110 115 120
CTG TAC ACT GGT CTA TTC ATC ACC ACA CAT GAC GCA ATG CAT GGC 405 Leu Tyr Thr Gly Leu Phe lie Thr Thr His Asp Ala Met His Gly
125 130 135
ACC ATA GCT TTG AGG CAC AGG CAG CTC AAT GAT CTC CTT GGC AAC 450 Thr He Ala Leu Arg His Arg Gin Leu Asn Asp Leu Leu Gly Asn
140 145 150
ATC TGC ATA TCA CTG TAC GCC TGG TTT GAC TAC AGC ATG CTG CAT 495 lie Cys He Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Ser Met Leu His
155 160 165
CGC AAG CAC TGG GAG CAC CAC AAC CAT ACT GGC GAA GTG GGG AAA 540 Arg Lys His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys
170 175 180
GAC CCT GAC TTC CAC AAG GGA AAT CCC GGC CTT GTC CCC TGG TTC 585 Asp Pro Asp Phe His Lys Gly Asn Pro Gly Leu Val Pro Trp Phe
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BIV naq ¾iv OJd \ \ S96 V91 VOO Oil 033103 010
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992 OSZ
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99i OVO X30 OVV OVO V30 013 OVX IOV 000 Oil OVI 311 310 303 311
O 982 0 Z
¾IV J9S nsq sn OJd BJV BJV ¾IV l^N 9Md Ι¾Λ "91 "31 usy ¾1
02i VOO VOX Oil OIV VOO 309 VOO 100 9XV Oil 310 VID DID IVV VDO
S2Z 0Z2 SI2
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S6I 061 S8I
OWlO/S6df/13J ^"096 OAV 配列番号： 6
配列の長さ ： 9 4 2
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： c DN A
起源
生物名 ： Haematococcus pluvial is
株名 ： NIES- 144
配列
ATG GTC GAG CAG AAA GGC AGT GAG GCA GCT GCT TCC AGC CCA GAC 45 Met Val Glu Gin Lys Gly Ser Glu Ala Ala Ala Ser Ser Pro Asp 1 5 10 15
GTC TTG AGA GCG TGG GCG ACA CAG TAT CAC ATG CCA TCC GAG TCC 90 Val Leu Arg Ala Trp Ala Thr Gin Tyr His Met Pro Ser Glu Ser
20 25 30
TCA GAC GCA GCT CGT CCT GCG CTA AAG CAC GCC TAC AAA CCT CCA 135 Ser Asp Ala Ala Arg Pro Ala Leu Lys His Ala Tyr Lys Pro Pro
35 40 45
GCA TCT GAC GCC AAG GGC ATC ACG ATG GCG CTG ACC ATC ATT GGC 180 Ala Ser Asp Ala Lys Gly He Thr Met Ala Leu Thr lie lie Gly
50 55 60
ACC TGG ACC GCA GTG TTT TTA CAC GCA ATA TTT CAA ATC AGG CTA 225 Thr Trp Thr Ala Val Phe Leu His Ala lie Phe Gin He Arg Leu
65 70 75
CCG ACA TCC ATG GAC CAG CTT CAC TGG TTG CCT GTG TCC GAA GCC 270 Pro Thr Ser Met Asp Gin Leu His Trp Leu Pro Val Ser Glu Ala
80 85 90
ACA GCC CAG CTT TTG GGC GGA AGC AGC AGC CTA CTG CAC ATC GCT 315 Thr Ala Gin Leu Leu Gly Gly Ser Ser Ser Leu Leu His lie Ala
95 100 105
GCA GTC TTC ATT GTA CTT GAG TTC CTG TAC ACT GGT CTA TTC ATC 360 Ala Val Phe lie Val Leu Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe lie
110 115 120
ACC ACA CAT GAC GCA ATG CAT GGC ACC ATA GCT TTG AGG CAC AGG 405 Thr Thr His Asp Ala Met His Gly Thr lie Ala Leu Arg His Arg
125 130 135
CAG CTC AAT GAT CTC CTT GGC AAC ATC TGC ATA TCA CTG TAC GCC 450 Gin Leu Asn Asp Leu Leu Gly Asn He Cys lie Ser Leu Tyr Ala
140 145 150
TGG TTT GAC TAC AGC ATG CTG CAT CGC AAG CAC TGG GAC CAC CAC 495 Trp Phe Asp Tyr Ser Met Leu His Arg Lys His Trp Glu His His
155 160 165
AAC CAT ACT GGC GAA GTG GGG AAA GAC CCT GAC TTC CAC AAG GGA 540 Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp Phe His Lys Gly
170 175 180
AAT CCC GGC CTT GTC CCC TGG TTC GCC AGC TTC ATG TCC AGC TAC 585 Asn Pro Gly Leu Val Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met Ser Ser Tyr
185 190 195
ATG TCC CTG TGG CAG TTT GCC CGG CTG GCA TGG TGG CCA CTG GTG 630 Met Ser Leu Trp Gin Phe Ala Arg Leu Ala Trp Trp Ala Val Val
200 205 210
ATG CAA ATG CTG GGG GCG CCC ATG GCA AAT CTC CTA GTC TTC ATG 675 Met Gin Met Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu Leu Val Phe Met
215 220 225
GCT GCA GCC CCA ATC TTG TCA GCA TTC CGC CTC TTC TAC TTC GGC 720 Ala Ala Ala Pro lie Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly
230 235 240 SI 01 S I siH sAq n9 ¾i OJJ 3JV BJV BIV dsy jas J3S n Q jas OJ^
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Claims

請求の範囲
1 . 3—ィオノン環を有する化合物の/ δ—ィオノン環の 4位のメチレン基をケト 基に転換する酵素活性を有するポリべプチド。
2 . 実質的に配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列を含む請求の範囲第 1 項記載のポリぺブチド。
3 . 実質的に配列表の配列番号 2に示されるアミノ酸配列を含む請求の範囲第 1 項記載のポリベプチド。
4 . 実質的に配列表の配列番号 3に示されるアミノ酸配列を含む請求の範囲第 1 項記載のポリペプチド。
5 . ?—ィォノン環を有する化合物が) 9—カロチンである請求の範囲第 1〜4項 のいずれかに記載のポリぺプチド。
6 . S—ィオノン環がその 3位の位置で 1つの水素原子が水酸基により置換され ていてもよい請求の範囲第 1〜4項のいずれかに記載のポリベプチド。
7 . 3位の位置で 1つの水素原子が水酸基により置換されている / S—ィオノン環 を有する化合物がゼアキサンチンである請求の範囲第 6項記載のポリぺプチド。
8 . yS—ィオノン環を有する化合物の —ィオノン環の 4位のメチレン基をケ卜 基に転換する酵素活性を有するポリベプチドをコ一ドする塩基配列を含む D N A C
9 . /S—ィオノン環を有する化合物の —ィオノン環の 4位のメチレン基をケト 基に転換する酵素活性を有するポリベプチドであって、 実質的に配列表の配列番 号 1に示されるアミノ酸配列を含むポリべプチドをコ一ドする塩基配列を含む請 求の範囲第 8項記載の D N A。
10. 配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列を含むポリぺプチドをコ一ドす る塩基配列が配列表の配列番号 4に示されるものである請求の範囲第 9項記載の D N A。
1 1. 配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを コードする塩基配列が配列表の配列番号 5に示されるものである請求の範囲第 9 項記載の D N A。
12. β—ィオノン環を有する化合物の^ーィオノン環の 4位のメチレン基をケト 基に転換する酵素活性を有するポリべプチドであって、 実質的に配列表の配列番 号 2に示されるアミノ酸配列を含むポリベプチドをコ一ドする塩基配列を含む請 求の範囲第 8項記載の D N A。
13. 配列表の配列番号 2に示されるアミノ酸配列を含むポリベプチドをコ一ドす る塩基配列が配列表の配列番号 6に示されるものである請求の範囲第 12項記載の D N A。
14. 0 -ィオノン環を有する化合物の 9ーィオノン環の 4位のメチレン基をケト 基に転換する酵素活性を有するポリべプチドであって、 実質的に配列表の配列番 号 3に示されるアミノ酸配列を含むポリべプチドをコ一ドする塩基配列を含む請 求の範囲第 8項記載の D N A。
15. 配列表の配列番号 3に示されるアミノ酸配列を含むポリベプチドをコ一ドす る塩基配列が配列表の配列番号 7に示されるものである請求の範囲第 14項記載の D N A。
16. ーィオノン環を有する化合物が 3—力ロチンである請求の範囲第 8〜15項 のいずれかに記載の D N A。
17. 3—ィオノン環がその 3位の位置で 1つの水素原子が水酸基により置換され ていてもよい請求の範囲第 8〜15項のいずれかに記載の D N A。
18. 3位の位置で 1つの水素原子が水酸基により置換されている / S—ィオノン環 を有する化合物がゼアキサンチンである請求の範囲第 17項記載の D N A。
19. 請求の範囲第 8〜18項のいずれかに記載の D N Aにハイブリダィズし、 β— ィオノン環を有する化合物の 5—ィオノン環の 4位のメチレン基をケト基に転換 する酵素活性を有するポリべプチドをコ一ドする塩基配列を含む D N A。
20. ブラスミ ド pHP51 に挿入されていて、 S—ィオノン環を有する化合物の iS— ィオノン環の 4位のメチレン基をケト基に転換する酵素活性を有するポリべプチ ドをコ一ドする塩基配列を含む D N A。
21. 請求の範囲第 8、 19および 20項のいずれかに記載の D N Aを含む組換えべク ター。
22. 請求の範囲第 8、 19および 20項のいずれかに記載の D N Aを導入した微生物。
23. 請求の範囲第 22項記載の微生物を培地で培養し、 培養物からケトカロチノィ ドを採取することを特徴とする、 ケトカロチノイ ドの製造法。
24. ケトカロチノィ ドがェキネノンおよびカンタキサンチンからなる群より選択 される少なく とも一種の化合物である請求の範囲第 23項記載の方法。
25. ケトカロチノイ ドが 4—ケトゼアキサンチンおよびァスタキサンチンからな る群より選択される少なく とも一種の化合物である請求の範囲第 23項記載の方法 c
26. 請求の範囲第 22項記載の微生物が細菌または酵母である請求の範囲第 23項記 載の方法。
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