WO1995033058A1

WO1995033058A1 - Codage genique pour le recepteur modifie de la proteine morphogenetique osseuse

Info

Publication number: WO1995033058A1
Application number: PCT/JP1995/001009
Authority: WO
Inventors: Naoto Ueno; Toru Natsume
Original assignee: Nippon Meat Packers, Inc.
Priority date: 1994-05-26
Filing date: 1995-05-25
Publication date: 1995-12-07
Also published as: JPH07313169A; EP0771877A1; EP0771877A4; CA2191321A1

Description

明細書骨形成因子受容体改変体の遺伝子技術分野

本発明は、骨形成因子受容体の改変体をコードする遺伝子、並びにそれよリ発現される骨形成因子受容体改変体及びその用途に関する。よリ詳細には. 骨形成因子受容体の細胞外領域に関する改変体をコードする遺伝子、並びにそれより発現され、各種骨疾患の診断、骨形成関連物質のスクリーニング、骨形成因子の精製等に有用な骨形成因子受容体改変体に関する。背景技術

高齢者人口の増加や食生活の変化に伴い、骨粗鬆症、骨軟化症、骨硬化症、骨腫瘍、骨折治癒不全などのような骨組織障害に起因する疾患が増加しておリ、かかる骨組織障害疾患に対する薬剤及び治療法の研究 · 開発が行われている。

骨組織は形成と吸収を一生涯繰り返す動的な器官である。骨形成は間葉系細胞由来の骨芽細胞が、また骨吸収は造血系由来の破骨細胞が主役を果たしており、リモデリングという機構により、古い骨は新しい骨に置換され、骨全体として強度を保っている。休止相にある骨は、まず、破骨細胞により吸収される。次に破骨細胞によって吸収された骨は骨芽細胞によって修復される。 '

この一連のリモデリングの過程に作用する種々の増殖因子等が知られている。その中で、未熟な細胞を骨芽細胞へ分化誘導させる因子を骨誘導因子、骨芽細胞による骨形成を促す因子を骨形成因子と分類すると、例えば、レチノイン酸は前者に属し、 T G F - /9は後者に属すると考えられる。同様な細胞增殖因子と考えられる Bone Morphogenetic Protein (いわゆる骨形成因子、以下 B M Pと称する）は、骨誘導因子と骨形成因子の両作用を有すると考えられている。その m R N Aは、歯や骨等の骨組織の他、心臓、脳、肺、肝臓、腎臓、皮膚、毛根などにも発現が確認されており、組織形成における上皮一間葉系作用の重要な役割を持つと考えられている他、その生物学的役割が注目されている。また、蛋白質レベルでは骨組織、歯牙組織、骨肉腫に存在することが確認されている。

BM Pの利用に関して、例えば、日本国特表平 2— 5 0 0 24 1号公報、特表平 3— 5 0 3 6 4 9号公報及び特表平 3— 5 0 5 0 9 8号公報においては、 BMPを有効成分とする硬骨及び軟骨誘導組成物や骨誘導組成物が開示されている。また、日本国特開平 5— 1 3 2 4 2 6号公報においては骨組織の形成促進剤として骨減少性疾患の予防治療剤などが；日本国特開平 2— 2 8 2 3 9 6号公報においては再 ^骨髄から同定された骨形成成長ポリべプチドが；日本国特表平 5— 5 0 5 4 04号公報においては、 T G F-/9 との共同的組合せによる骨修復のための骨形成蛋白質の使用法が開示されている。現在、 BMPについては、局所投与を目的とする医薬品の開発が検討されているが、将来的には骨折治癒促進、骨欠損の修復、骨粗鬆症等の骨減少疾患の治療などへの臨床応用、並びに骨肉腫における新しい腫瘍マーカー及び B MP産生腫瘍治療剤、口腔疾患治療剤としてもその臨床応用が期待されている。

上記の BMPは 1 9 6 0年代に異所性の骨形成を引き起こす骨基質に存在する蛋白性の分子として命名されたものであり、 1 9 8 9年にその遺伝子配列が判明し、既に構造が判明していた T G F-^ファミリーのメンバ一であることが明らかになつている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81， 371-375； Progress Growth Factor Research 丄， 267-280, 1989)。また、同様のファミリーに属する蛋白質として、今までにァクチビン等も知られている（Natur e 231, 776-778， 1986； Nature 231, 779-782， 1986)。

骨基質から精製された BM P蛋白質の内、 2から 8までが TG F- /9ファミリ一に属するものであり、今までの知見からこれら 7種の BMPは 3種のグループにその類似性から分類できる。即ち、 2 と 4からなるグループ、 3 からなるグループ、 5、 6、 7及び 8からなるグループの 3種である。

上述のように、 BM Pは骨誘導及び骨形成を促進する因子であり、骨組織障害の発症 · 治癒とは密接な関係を有しており、生体内における BMPの測定は骨疾患の診断上重要である。また、 BMPに類似する作用を有する物質や BMPに拮抗する物質のスクリーニング方法、 BMPの簡易な精製方法も求められている。

このような目的に対しては、一般的に BMPに特異的な抗体を調製して応用することが広く知られるが、従来までにそのような抗体は知られていないこのことは、 BMP力動物種差をこえて、進化の過程で非常に良く保存されたぺプチドであるため、抗体が作られにくいことが原因であると考えられている。そのため、抗体以外の物質を用いて、上記の問題を解決する技術が広く求められていた。

かかる問題から、本発明者等ほ、 BMPと特異的に反応し得る物質について鋭意研究した結果、 BMPの受容体の改変体を用いることにより問題を解消しえることを見出した。

よリ詳細には、本発明者等は永年にわたり BMP遺伝子に関する研究を実施してきており（Biochem. Biophys. Res. Commun. 186, 1487-1992； Growt h Factor 7, 233-240； Growth Factors 8, 165-172, 1993； Growth Facto rs 10， 173-176, 1993 ; Biochem. J.， 298, 275-280, 1993)、また BMP に対する受容体についても研究を重ねてきた（日本分子生物学会講演要旨集 2175, 1992； 3209, 1993) 。 B M Pの受容体に関して、その選択的な受容体については従来知られていなかつたが、最近、米国の企業及び本発明者等の研究により、 BMPの 2種の受容体（BMP 2と 4) が単離され、その性状が明らかになった（分子薬理学国際シンポジウム 1994年， p27) 。

BMPは、従来広く知られている細胞増殖因子と同様に、細胞表面上に発現されている受容体に結合することにより、その機能を果たす。受容体は、その構造上の特徴として、一般的に、細胞外領域、細胞内領域、そして膜貫通領域の 3種の領域からなリ、 BMP受容体についてもシスティン残基に富む細胞外領域と一つの膜貫通領域からなり、細胞内領域は T G F-^フアミリーに共通するセリンスレオニンキナーゼであることが判明している。

本発明者等は、本 BMP受容体が BMPと特異的に結合し得る性状に着目し、可溶性を有すると推察される細胞外領域に、識別手段として人為的にェピトープタグを付加した改変体を用いれば、 BMPを測定し、 BMPと同様な生物活性を有する物質のスクリ一ニングゃ BM Pの精製を行うことが可能であろうと思料し、鋭意研究を行った結果、上記の改変体が所期の目的を達成し得ることを見出して本発明を完成した。即ち、本発明は、 BMP受容体の細胞外領域にェピトープタグを付加した改変体、当該改変体をコードする遺伝子及び当該改変体の用途を提供することを目的とする。発明の開示

上記の課題を解決するためになされた本発明は、下記に示される BM P受容体改変体をコードする遺伝子、当該遺伝子を発現して得られる BM P受容体改変体及び当該改変体の用途に関する。

① BMP受容体の細胞外領域をコードする遺伝子と、抗体が認識する抗原決定基をコードした遺伝子を結合させた BM P受容体改変体の遺伝子。

②抗体が認識する抗原決定基をコードした遺伝子が、抗癌遺伝子 my c抗体が認識する抗原決定基をコードした遺伝子である上記①記載の BMP受容体改変体の遺伝子。

③後記の配列番号 1で示される塩基配列又は当該塩基配列の一部を有する B MP受容体改変体の遺伝子。

④上記①〜③で規定される遺伝子から発現される BM P受容体改変体。

⑤後記の配列番号 2に示されるアミノ酸配列又は当該配列を含むアミノ酸配列からなる BMP受容体改変体。

⑥上記④又は⑤に記載される BMP受容体改変体を用いることを特徴とする BM Pの測定方法。

⑦上記④又は⑤に記載される BMP受容体改変体を用いることを特徴とする BMP類似物質又は BMPに拮抗する物質のスクリ一ニング方法。

⑧上記④又は⑤に記載される BMP受容体改変体を用いる BMPの精製方法。 ⑨上記④又は⑤に記載される BMP受容体改変体を有効成分として含有する骨疾患治療剤。図面の簡単な説明

図 1は、制限酵素 E c 0 R Iにて消化した m y c - s m B M P Rを、発現ベクタ一 p c DNA I a m pにサブクローニングする工程の概略を示す図である。

図 2は、実施例 3における、生成培養液及びそれをァフィ二ティーカラムで精製した後の試料についての S D S—電気泳動の結果を示す図である。図 3は、実施例 4における、 BMP受容体改変体の BMPに対する競合阻害を示す図である。

図 4は、実施例 5における、 BMP受容体改変体を用いて BMPを測定した結果を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明にかかる BMP受容体改変体をコードする遺伝子は、 BMP受容体の細胞外領域をコードする遺伝子と、抗体が認識する抗原決定基をコードした遺伝子を結合させた遺伝子である。一般に、蛋白質性物質の識別を可能又は容易にするため、蛋白質性物質に、抗体が認識し得る抗原決定基（ェピ卜 —プ）を付加し、標識化された抗体等を用いて当該蛋白質性物質の識別や同定を行うことは、ェピトープタグ法として広く知られている。かかる方法については、例えば、 Method in Enzymology 194, 509頁， 1991年に抗原決定基の付加方法として詳述されている。上記の本発明の遺伝子は、 BMP受容体の細胞外領域に抗体が認識し得る抗原決定基が付加した蛋白質を発現させるために用いられる遺伝子であリ、かかる遺伝子により発現された蛋白質は抗体により同定ないし識別可能になる。

上記の抗体が認識する抗原決定基（以下、便宜上、ェピトープタグと称する）としては特に限定されず、上記の文献に記載される各種のェピトープタグなどが挙げられ、例えば、癌遺伝子である my cの抗 my cモノクローナル抗体（9 E 1 0) で認識される、この抗体の抗原決定基となるアミノ酸配歹 U (Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu) ；抗インフルエンザへマグルチニン抗体（ 1 2 CA 5) で認識される、この抗体の抗原決定基となるアミノ酸配列（Tyr-Pro- Tyr- Asp- Val- Pro- Asp- Tyr- Ala) が例示される。また、ェピトープタグとして、 1 a c Z遺伝子で発現されるペプチドも利用することができ、この際には、抗体として、抗 3-ガラクトシダ一ゼ抗体が使用される。本発明の BMP受容体改変体をコ一ドする遺伝子においては、 BMP受容体の細胞外領域をコードする遺伝子（例えば、 BMP受容体遺伝子を 5' 末端から 3 8 0番塩基で切断した遺伝子）と、上記のェピトープタグをコードした遺伝子が結合している。より具体的には、例えば、上記の抗癌遺伝子 m y c抗体が認識する抗原決定基の例においては、 BMP受容体の細胞外領域をコ一ドする遺伝子に、抗 my cモノクローナル抗体（ 9 E 1 0) の抗原決定基となる上記のアミノ酸配列をコードした遺伝子を、当該細胞外領域をコードする遺伝子の 3' 末端側に付加した遺伝子が例示される。

BMP受容体をコードする遺伝子は、 BMP受容体の mRN Aより調製することができる。より具体的には、 BM P受容体の mRNAは、 BMP受容体を発現している臓器、組織、細胞などから、フエノール法、グァニジゥムチオシァネー卜法などの慣用の方法により抽出し、オリゴ d Tセルロース力ラムなどの精製手段を用いて精製することにより得ることができる。

かくして得られた mRN Aからランダムプライマー法などの慣用の方法により、 BMP受容体の c DN Aを調製する。

一方、 T G F- 3ゃァクチビンの受容体のアミノ酸配列の相同性の高い部分に基づき、その部分から想定される P CR用プライマー（オリゴヌクレオチド）を合成する。得られたプライマ一を用いて、上記の c DNAを PCR 法によリ増幅する。

P C R法により増幅された c DNAは、ァガロースゲル電気泳動法、ァクリルアミドゲル電気泳動法などのゲル電気泳動法により分離、抽出を行う。抽出された DNA断片を、 M l 3ジデォキン法などの常法に準じ又は市販の塩基配列決定キットなどを用いて、その塩基配列を決定し、 TGF- i9ゃァクチビンの受容体の塩基配列とは異なる配列を有する DN A断片を選択する。得られた DN A断片をプローブとして用いることにより、 c DNAライブラリーから BM P受容体の全長をコードする c DN Aを単離することができ、また単離された c DN Aは常法に準じて塩基配列を決定することができる。本発明にかかる BM P受容体の細胞外領域をコ一ドする遺伝子とェピ卜一プタグをコ一ドした遺伝子を結合させた遺伝子は、上記で調製された BMP 受容体の全長をコードする c DNAを適当なベクターに組み込み、ェピ卜一プタグをコ一ドする塩基配列及び翻訳終止配列に相補的な配列を含む適当なプライマーを用いて、当該ベクターを P CR法で増殖し、増幅された遺伝子を常法に準じて単離 ·精製することによリ、本発明の遺伝子を得ることができる。なお、 BMP受容体の全長をコードする c DNAを適当な制限酵素で切断し、細胞外領域をコードする DNA断片を分離し、これにェピトープタグをコードする DNA断片を結合させることによつても調製することができる。

本発明の BMP受容体改変体は、 BM P受容体の細胞外領域にェピ卜ープタグが結合した蛋白質であリ、上述の BMP受容体の細胞外領域をコードする遺伝子とェピトープタグをコ一ドした遺伝子を結合させた遺伝子を遺伝子工学的に発現させることにより調製することができる。かかる遺伝子工学的発現は、常法に準じて行うことができ、例えば、 BMP受容体の細胞外領域をコ一ドする遺伝子とェピ卜一プタグをコ一ドした遺伝子を結合させた遺伝子又はそれを適当な制限酵素で切断した DN A断片を、適当な発現べクタ一に組み込み、ベクターに対して適当な宿主（例えば、大腸菌、枯草菌等のバクテリア、酵母、カビ、動植物培養細胞など）に挿入して形質転換し、この形質転換体を培養することにより行われ、培養上清（又は培養細胞を破砕した後の上清）から BMP受容体改変体を得ることができる。

かくして得られた BMP受容体改変体は、透析、塩析、イオン交換クロマ卜グラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの慣用の方法により精製することができるが、ェピトープタグを認識する抗体を結合した担体を用いたァフィ二ティクロマトグラフィーに付すことより簡便且つ高度に精製することができる。

また、塩基配列から演繹されるアミノ酸配列に基づき、ペプチドの固相合成法により、本発明の BMP受容体改変体を調製することもできる。

なお、本発明の BMP受容体改変体は、実質的に同効物であるかぎり、そのァミノ酸配列の一部が欠失又は他のアミノ酸で置換されていたり、他のァミノ酸配列が挿入されていたり、 N末端及びノ又は C末端に 1又は 2以上のアミノ酸が結合していてもよく、また同様に糖鎖が付加、欠失又は置換されていてもよい。本発明の BMP受容体改変体が BMPと特異的に反応することは、後記実施例に示されるように、 BM Pとの競争反応により明らかになった。

即ち、マウスの頭蓋冠由来の MC 3 T 3細胞は骨芽細胞に分化することが知られており、その過程は BMPによって促進される。又、その指標としてはアルカリホスファターゼ（A L P a s e ) 活性が上昇することが知られている（蛋白、核酸、酵素， No.2, 186， 1988)。

この細胞の培養系に、牛骨由来の BMPを添加すると A L P a s e活性が増加する。しかし、 BMPと共に BMP受容体改変体を含む培養液を添加すると、添加量依存的に A L P a s e活性は減少した。この結果から、 BMP 受容体改変体は BMPと結合し、競合阻害をもたらしていることが明らかになった。

本発明の BMP受容体改変体は、その BM P受容体細胞外領域部分で B M Pと特異的に反応し、ェピトープタグ部分でそれを認識する抗体と特異的に反応するという特性を有する。

本発明の BMPの測定方法は、かかる特性を利用し、免疫学的測定法に準じた方法により、 BMPを測定（定量及び定性）するものである。例えば、 BMPを含有する試料をマイクロプレー卜に採り、プレー卜に BMPを吸着させ、必要に応じてゥシ血清アルブミン（B SA) などでブロッキングした後、本発明の BMP受容体改変体を添加して BMPと結合させ、次いで標識化抗体を添加して当該改変体のェピトープタグと結合させた後、標識活性を測定することにより BMPを測定することができる。また、この方法において、標識化抗体に代え、非標識化抗体を反応させ、その後、標識化された二次抗体又は標識化されたプロティン Aを反応させてもよい。標識としては特に限定されないが、従来から免疫学的測定法で用いられている酵素（例えば、パ一ォキシダ一ゼ、アルカリホスファタ一ゼ、 /9 _ガラクトシダーゼ等）、放射活性物質（例えば、 ¹²⁵ I、 ³²P、 ³H等）、蛍光性物質などを用いればよい。

なお、本発明の BMPの測定方法は、上記の方法に限定されるものではなく、競争法など免疫学的測定法として知られている各種方法が適用でき、かかる方法は当業者にとって周知である。本発明の測定方法によれば、 BMPを迅速に且つ高感度、高精度で測定することができ、少なくとも 1〜 1 00 n gの間にて定量性が確認されている, また、本発明の測定法の利点として、免疫学的測定法では前駆体と活性型との認別が困難であるのに対して、本測定法では、生理的に意味のある分子として検出することが可能であることが挙げられる。

また、本発明の BMP受容体改変体を用いれば、上記の測定法に準じた方法によリ、 BMPと類似した生理活性を有する物質のスクリ一二ング又は B MPと拮抗する作用を有する物質のスクリーニングを行うことができる。例えば、本発明の BMP受容体改変体のェピトープタグに標識抗体が結合した複合体を調製しておき、ある試験物質を上記の複合体と反応させ、反応が生じれば、その試験物質は BMPと類似の生理活性を有する物質であることが推察される。

更に、本発明の BM P受容体改変体は、 BMPと特異的に結合するので B MPの単離 ·精製に利用することができ、本発明の BM Pの精製方法はかかる特性を利用したァフィ二ティクロマ卜グラフィ一法による BMPの精製方法に関する。

より詳細に一例をもって説明すると、ェピトープタグを認識する抗体を不溶性担体に化学的又は物理的に結合させた担体を調製し、これに本発明の B MP受容体改変体を接触させて担体に固定化する。次いで、この担体と BM Pを含有する試料と接触させることにより BMPを担体に固定化し、その後適当な溶出液にて BMPを溶出することにより、 BMPを精製することができる。上記の不溶性担体としては、セファロースなどの慣用の担体を用いることができ、また不溶性担体への抗体の結合も、ホルミル化セルロースゲルを用いる方法などの慣用の方法にて行うことができる。更に、上記の精製法はカラム法、バッチ法の何れにても行うことができる。

なお、本発明の BM Pの精製方法は、上記の方法に限定されるものではなく、ァフィ二ティクロマトグラフィー法として知られている各種方法が適用でき、かかる方法は当業者にとって周知である。

本発明の精製方法によれば、 BMPを簡便、迅速且つ高度に精製することができる。本発明の骨疾患治療剤は、 B M P受容体改変体を有効成分として含有することからなり、前述のように、本発明の B M P受容体改変体は B M Pと特異的且つ競合的に反応することから、 B M P産生腫瘍などの B M Pが関与する骨疾患の治療 · 予防に有用である。

上記の治療剤は、種々の製剤形態（例えば、液剤、固形剤、カプセル剤等）で投与し得るが、一般的には有効成分である B M P受容体改変体のみ又はそれと慣用の担体と共に注射剤又は経口剤とされる。当該注射剤は常法によリ調製することができ、例えば、 B M P受容体改変体を適切な溶剤（例えば、滅菌された水、緩衝液、生理食塩水等）に溶解した後、フィルタ一等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。また、経口薬としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟又は硬カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤などの剤形に製剤化され、これらの製剤は製剤化の常法に準じて調製することができる。

製剤中の B M P受容体改変体含量は、剤形、適用疾患などに応じて適宜調整することができる。

製剤化に際して、好ましくは安定化剤が添加され、安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、グリシン、マンニトール、グルコース、デキストラン、ソルビトール、エチレングリコールなどが挙げられる。さらに、本発明の製剤は製剤化に必要な添加物、例えば、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤等を含んでいてもよい。液状製剤とした場合は凍結保存、または凍結乾燥等によリ水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加え、再溶解して使用される。

本発明の骨疾患治療剤は、その製剤形態に応じた適当な投与経路により投与され得る。その投与量は、患者の症状、年齢、体重などにより適宜調整される。産業上の利用可能性

本発明によれば、 B M P受容体改変体をコードする遺伝子が提供され、それを発現することにより B M P受容体改変体を効率的に得ることができる。得られた BM P受容体改変体を用いることによリ、 BM Pを簡便且つ高精度で測定することができ、また BM Pと同様な生理活性を有する物質又は B M Pと拮抗する物質のスクリ一ニングが可能となり、更に BM Pを迅速且つ高度に精製に精製することができる。また、 BM P受容体改変体は、 BM P と特異的に結合することから、 BM Pに起因する骨疾患の治療 ' 予防を図るための骨疾患治療剤としても有用である。従って、本発明の BM P受容体改変体は、 BM Pの精製、 BM Pに関係する各種疾患の診断試薬、研究試薬、医療用医薬品などとして広く利用することができる。実施例

以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。

実施例 1

マウス BM P受容体の作製

T G F-βゃァクチビンの受容体間で最も相同性が高い細胞内キナーゼ領域 V I I I と X Iのアミノ酸配列（Thr-Met-Ala-Pro-Glu- Valと Glu- Cys- Trp -Asp-His-Asp) を基に、下記の 2種類の合成オリゴヌクレオチドを合成した _c その合成ォリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。

合成ォリゴヌクレオチド 1 ：

5 ' - T A (T C) A T G G C (T CA G) C C (T CA G) G A (AG) G T - 3 '

合成ォリゴヌクレオチド 2 ：

5，一 (AG) T C (A G) T G (AG) T C C CA (AG) C A (T C) T C一 3 '

これらの合成ォリゴヌクレオチドの合成は常法に従い、 Milligen Biosear ch社製の装置を用いて行った。

次に、 BM Pに反応して骨芽細胞に分化することが知られている MC 3 T 3— E 1細胞から、文献（Anal. Biochem. 162, 156-157, 1987)に記載された方法を用いて全 RN Aを分離 ' 精製した。更に、この得られた RN Aを銬型として常法（ランダムプライマー法）を用いて c DN Aを合成した。

この c DN Aと前述の合成したォリゴヌクレオチドをプライマ一として用いて、文献（Science ^， 1350-1354, 1985など）に記載された P C R法を用いて、上記の TG F-/9ゃァクチビンの受容体に類似した遺伝子断片を増幅した。

この増幅された遺伝子断片の塩基配列を決定し、 TGF-^ゃァクチビンの受容体とは異なる配列を持つ遺伝子断片を同定した。

更に、この遺伝子断片をプローブとして、目的とするマウス BMP受容体を完全にコードする遺伝子を、マウス c DN Aライブラリ一から単離した。得られたクローンの中で、 mT F R l 1 と称する全長 3. 9 k bのクローンがマウス BM P受容体であることが判明した。実施例 2

ッメガエル BM P受容体の作製

ッメガエル初期胚から作製した全 RNAを鐃型として実施例 1 と同様の方法.によってッメガエル BMP受容体遺伝子断片を同定し、 xT F R l 1 と命名した。この遺伝子断片をプローブとして、ッメガエル BM P受容体を完全にコードする遺伝子を、ッメガエルステージ 3— 5の c DNAライブラリ一から単離した。実施例 3

受容体改変体の作製及びその発現

実施例 1 と同様な方法で以下に示すォリゴヌクレオチドを合成した。

オリゴヌクレオチド 3 ：

5 ' - TGAATTCCTACAGGTCCTCCTCGGAGAT CAG

CTT CTGCTCTCGGATGCTGCCATCAAAG- 3' ォリゴヌクレオチド 4 ：

5 ' 一 CAGGAAACAGCT ATGAC— 3'

次に、実施例 1で得られた mT'F R 1 1 c DN Aを Bluescript KS (-)べクターにサブクローニングし、このべクタ一とオリゴヌクレオチド 3及び 4を用いて P C R法を行い、 BM P受容体の細胞外領域に対応する遺伝子配列の 3' 側に、抗癌遺伝子 my c抗体（9 E 1 0) が認識する抗原決定基のアミノ酸配列（Glu-Gln- Lys- Leu- Ile-Ser- Glu- Glu- Asp- Leu) をコードする塩基配列（ 5' -GAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACC TG— 3' ) と蛋白質翻訳終止配列（TAG) を付加した遺伝子断片を増幅し、その塩基配列を決定した。当該遺伝子断片（my c- s mBMP Rと称する）の塩基配列を配列番号 1に示す。配列番号 1において、下線を付した部分がェピト一プタグをコードする配列である。

また、当該塩基配列から推定される BMP受容体改変体のアミノ酸配列を配列番号 2に示す。

この遺伝子断片を、制限酵素 E c 0 R Iにて消化した後、動物細胞用発現ベクターである P c D A I a mpにサブクローニングした。この工程の概略を図 1に示す。 .

次に、上記ベクターを DEAE— d e X t r a n法で CO S 7細胞を形質転換し、発現させるこどによリ本発明の BMP受容体改変体を得た。

より詳細には、 CO S 7細胞を、ダルベッコ改変培地を用い、底面積 6 0 00 c m ²の培養皿にて 1 X 1 0^B個培養した。 1 O ^ gの DNAを 3 m lの DEAE- d e x t r a nと混和し培養皿に添加し、室温にて 1 5分放置した後、洗净し、 1 0 %血清を含むダルベッコ改変培地で一日培養した。その後、無血清のダルベッコ改変培地に置換し、更に 3日間培養し合計 5 Lの培養上清を回収した。回収した培養上清は、分子量 1 00 0 0 Dのフィルタ一 (旭化成）で限外濾過濃縮し、等量の T r i s系緩衝液（20mM Tris-HCl(pH7. 4)/0.15 NaCl, 以下、 T B S緩衝液という）に混合し、抗癌遺伝子 my c モノクローナル抗体 9 E 1 0を担体（ァフィゲル）に結合させて調製したァフィニティーカラム（ 5 m JL ) に吸着させた。

吸着画分は p H 3. 0のクェン酸緩衝液で溶出し、溶出後、 T r i s系緩衝液に透析することにより、本発明の BMP受容体改変体が得られ、これを 4 °Cで保存した。

なお、培養液と上記のァフィ二ティーカラムで精製した後の試料について. S D S—電気泳動法で分析した結果を図 2に示す。図 2に示されるように、精製前と比較して、カラム吸着画分は分子量 1 8 KDの蛋白質のみであり、これは理論上の分子量とよく一致した。このことから、抗体を結合したァフィニティクロマトグラフィーにより、 BMP受容体改変体を精製できることが確認された。実施例 4

生物活性の測定

4 8穴のマイクロプレートに 1穴あたり 1 0⁴個の MC 3 T 3細胞を播種した（培地： 1 0 % 83を含有する 0： MEM培地）。 2 日間培養した後、 1 0 n gZm 1の BMPを含む培地に交換し、 4 8時間培養を行った。このとき、実施例 1で調製した BMP受容体改変体を 1 0又は 5 O n gZm lの濃度で添加し、アル力リホスファタ一ゼ（A L P a s e) 活性を BM P無添加群と比較した。

A L P a s e活性の測定は、まず培養上清を廃棄した後、リン酸緩衝液でよく洗浄し、次いで発色基質である p—二トロフエノール溶液（0.56M 2 -ァミノ- 2-メチルプロパン-卜オール， ImM MgC ， ΙΟπιΜ ソジゥム p-ニトロフェニルホスフェート）を各ゥエルに添加し、 1時間反応後、 4 0 5 nmの吸光度を測定することによって行った。

その結果を図 3に示す。図 3に示されるように、 BMP受容体改変体を添加することにより BMP活性の阻害が認められた。実施例 5

E L I S A測定の実施

1 0から 1 O O n gの BMPを含む T B S緩衝液を 9 6穴マイクロプレー卜に 4 °Cにて 1 2時間吸着させる。洗浄後、 5 % B S Aでプロッキング後、実施例 1で得た BMP受容体改変体を 1穴あたり 2 00 n g加え、室温にて 2時間反応し、上清を除去後、洗浄した。

次いで、一次抗体として抗癌遺伝子 my cモノクローナル抗体 9 E 1 0 ( 1 %85 及び0. 1 %ツイン 2 0含有する T B S溶液）を 1 0 0 n g ゥエル添加し、室温にて 1時間反応させ、上清の除去 ·洗浄を行った。その後、二次抗体として西洋ヮサビパーォキシダーゼ標識抗マウス I g G抗体

( 1 % B S A及び 0. 1 %ツイン 2 0含有する T B S溶液）を 1 0 0 n g / ゥエル添加して、更に室温にて 1時間反応させた後、上清の除去 · 洗浄を行つた。発色は 0. 1 % 0 -フエ二レンジァミン（ 0. 1 Mクェン酸塩緩衝液、 p H 4. 5 ) により行い、 4 9 0 n mの吸光度を測定した。

その結果を図 4に示す。図 4において、 A bは一次抗体を意味する。図 4 に示されるように、本発明の B M P受容体改変体を用いることにより、 BM Pを定量できることが判明した。

【配列表】

配列番号： 1

配列の長さ： 6 3 5

配列の型：核酸

鎖の数： 2本鎖

トポロジー：直鎖状

配列

GAA TTC TGA AGA AAG CAG CAG GTG AAA GTC ATT GCC AAG TGA TTT TGT 48 TCT GTA AGG AAG CCT CCC TCA TTC ACT TAC ACC AGT GAG ACA GCA GGA 96 CCA GTC ATT CAA AGG GCC GTG TAC AGG ACG CGT GCG AAT CAG ACA ATG 144

Met

• 1

ACT CAG CTA TAC ACT TAC ATC AGA TTA CTG GGA GCC TGT CTG TTC ATC 192 Thr Gin Leu Tyr Thr Tyr lie Arg Leu Leu Gly Ala Cys Leu Phe lie

5 10 15

ATT TCT CAT GTT CAA GGG CAG AAT CTA GAT AGT ATG CTC CAT GGC ACT 240 lie Ser His Val Gin Gly Gin Asn Leu Asp Ser Met Leu His Gly Thr

20 25 30

GGT ATG AAA TCA GAC TTG GAC CAG AAG AAG CCA GAA AAT GGA GTG ACT 288 Gly Me Lys Ser Asp Leu Asp Gin Lys Lys Pro Glu Asn Gly Val Thr 35 40 45

TTA GCA CCA GAG GAT ACC TTG CCT TTC TTA AAG TGC TAT TGC TCA GGA 336 Leu Ala Pro Glu Asp Thr Leu Pro Phe Leu Lys Cys Tyr Cys Ser Gly 50 55 60 65 CAC TGC CCA GAT GAT GCT ATT AAT AAC ACA TGC ATA ACT AAT GGC CAT 384 His Cys Pro Asp Asp Ala l ie Asn Asn Thr Cys l ie Thr Asn Gly Hi s

70 75 80

TGC TTT GCC ATT ATA GAA GAA GAT GAT CAG GGA GAA ACC ACA TTA ACT 432 Cys Phe A la l ie l ie Glu Glu Asp Asp Gin Gly Glu Thr Thr Leu Thr

85 90 95

TCT GGG TGT ATG AAG TAT GAA GGC TCT GAT TTT CAA TGC AAG GAT TCA 480 Ser Gly Cys Met Lys Tyr Glu Gly Ser Asp Phe Gin Cys Lys Asp Ser

100 105 1 10

CCG AAA GCC CAG CTA CGC AGG ACA ATA GAA TGT TGT CGG ACC AAT TTG 528 Pro Lys Ala Gin Leu Arg Arg Thr l ie Glu Cys Cys Arg Thr Asn Leu

1 15 120 125

TGC AAC CAG TAT TTG CAG CCT ACA CTG CCC CCT GTT GTT ATA GGT CCG 576 Cys Asn Gin Tyr Leu Gin Pro Thr Leu Pro Pro Val Val l ie Gly Pro 130 135 140 145 TTC TTT GAT GGC AGC ATC CGA GAG CAG AAG CTG ATC TCC GAG GAG GAC 624 Phe Phe Asp Gly Ser l ie Arg Glu Gin Lys Leu He Ser Glu Glu Asp

- 150 155 160

CTG TAG AAT TC 635

Leu

162 配列番号： 2

配列の長さ： 1 6 2

配列の型：蛋白質

トポロジー：直鎖状丄 7

配列

Met Thr Gin Leu Tyr Thr Tyr l ie Arg Leu Leu Gly Ala Cys Leu Phe

1 5 10 15 l ie l ie Ser His Val Gin Gly Gin Asn Leu Asp Ser Met Leu His Gly

20 25 30

Thr Gly Met Lys Ser Asp Leu Asp Gin Lys Lys Pro Glu Asn Gly Val

35 40 45

Thr Leu Ala Pro Glu Asp Thr Leu Pro Phe Leu Lys Cys Tyr Cys Ser 50 55 60

Gly Hi s Cys Pro Asp Asp Ala l ie Asn Asn Thr Cys l ie Thr Asn Gly 65 70 75 80

His Cys Phe Ala l ie l ie Glu Glu Asp Asp Gin Gly Glu Thr Thr Leu

85 90 95

Thr Ser Gly Cys Met Lys Tyr Glu Gly Ser Asp Phe Gin Cys Lys Asp

100 105 1 10

Ser Pro Lys Ala Gin Leu Arg Arg Thr l ie Glu Cys Cys Arg Thr Asn

115 120 125

Leu Cys Asn Gin Tyr Leu Gin Pro Thr Leu Pro Pro Val Val He Gly 130 135 140

Pro Phe Phe Asp Gly Ser l ie Arg Glu Gin Lys Leu He Ser Glu Glu 145 150 155 160

Asp Leu

162

Claims

請求の範囲

1 . 骨形成因子（B M P ) 受容体の細胞外領域をコードする遺伝子と、抗体が認識する抗原決定基をコードした遺伝子を結合させた骨形成因子受容体改変体の遺伝子。

2 . 抗体が認識する抗原決定基をコードした遺伝子が、抗癌遺伝子 m y c抗体が認識する抗原決定基をコードした遺伝子である請求の範囲第 1項記載の骨形成因子受容体改変体の遺伝子。

3 . 配列番号 1で示される塩基配列又は当該塩基配列の一部を有する骨形成因子受容体改変体の遺伝子。

4 . 請求の範囲第 1 、 2又は 3項で規定される遺伝子から発現される骨形成因子受容体改変体。

5 . 配列番号 2で示されるアミノ酸配列又は当該配列を含むアミノ酸配列からなる骨形成因子受容体改変体。

6 . 請求の範囲第 4又は 5項に項記載される骨形成因子受容体改変体を用いることを特徴とする骨形成因子の測定方法。

7 . 請求の範囲第 4又は 5項に記載される骨形成因子受容体改変体を用いることを特徴とする骨形成因子類似物質又は骨形成因子に拮抗する物質のスクリーニング方法。

8 . 請求の範囲第 4又は 5項に記載される骨形成因子受容体改変体を用いる骨形成因子の精製方法。

9 . 請求の範囲第 4又は 5項に記載される骨形成因子受容体改変体を有効成分として含有する骨疾患治療剤。