WO1995030412A1 - Potentialisateur de cytokine et remede pour des maladies dans lesquelles l'activite de la cytokine est reduite - Google Patents

Potentialisateur de cytokine et remede pour des maladies dans lesquelles l'activite de la cytokine est reduite Download PDF

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WO1995030412A1
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cytokine
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ethanolamine
serine
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PCT/JP1995/000857
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Yuichi Oishi
Masaki Yoshida
Shintaro Inoue
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Kanebo Limited
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Definitions

  • the present invention relates to a cytokine activity enhancer and a therapeutic agent for diseases in which the activity of cytokine is reduced.
  • the present invention relates to a cytokine activity enhancer and a therapeutic agent for a disease in which the activity of a cytokine is reduced.
  • the present invention particularly provides a cytokine activity that enhances the kinetics of cytokine, thereby activating the kinetics of kinetics decreased by aging or treating abnormalities caused by a decrease in cytokin.
  • the present invention relates to an enhancer and a therapeutic agent for a disease in which the activity of a site cytokine is reduced.
  • Cytokine secretion is known to be closely related to the repair of aging and rough skin. In addition, it has been clarified that cytokines are greatly involved in diseases, and attempts to use cytokines for treatment are being actively conducted.
  • Specific examples include a method of administering cytokine itself to humans as a therapeutic agent orally or parenterally such as by injection or transdermally.
  • cytokine itself to humans as a therapeutic agent orally or parenterally such as by injection or transdermally.
  • the present invention is intended to enhance the responsiveness of a cytokine present in a living body by administering it to a living body.
  • An object of the present invention is to provide a cytokine activity enhancer and a therapeutic agent for a disease in which the activity of cytokine is reduced, which can reduce the dose when administered as CT / JP95 / 00857.
  • the present invention provides a cytokine activity enhancer containing an ethanolamine derivative represented by the following general formula (I) or a salt thereof to achieve the above object.
  • R is H, - CH 3, - CH 2 CH (CH 3) OH or one CH 2 CH OH
  • R 2 is H, - CH 3, - CH 2 CH 3 or - be COOH
  • R 3 is H, - CH 3, - CH 2 CH 3 or - CH 2 NH 2
  • the present invention also provides a therapeutic agent for a disease in which the action of the cytokinetic activity enhancer is reduced, comprising the above-mentioned cytokine activity enhancer.
  • FIG. 1 is a diagram showing the vertical diffusion cell device used in Test Example 1-15.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of a skin permeability test of N-methyl-L-serine in Test Example 15; BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the ethanolamine derivative represented by the above general formula (I) used in the present invention is:
  • R 2 is preferably H, -CH 3 or one CH 2 CH 3 , where R 3 is H, -CH 3 , one CH 2 CH 3 or one CH 2 NH It is better to be 2 .
  • R, is one CH 3 , one CH 2 CH (CH 3 ) OH or one CH 2 CH 2 OH R 2 is preferably H, where R 3 is H, one CH 3 , It is preferably CH 2 CH 3 or —CH 2 NH 2 .
  • the ethanolamine derivative represented by the general formula (I) include N-methylol L-serine, diethanolamine, ethanolamine, and N-methylethanol.
  • Lumin, N-Isopropanoyl 2 _ Chilletanoylamine, D, L-2 -amino 1-propanol, 2-amino 1-butanol, 1,3-Diamino 1-2-propanol, 1-amino 2-butanol can be mentioned.
  • the salt of the ethanolamine derivative represented by the general formula (I) is not particularly limited, but is particularly preferably a pharmaceutically acceptable hydrochloride, hydrobromide, sulfate, phosphate, or the like. Inorganic acid salts and organic acid salts such as acetate, fumarate, maleate, tartrate, citrate and p-toluenesulfonate can be mentioned.
  • the cytokines used in the present invention include platelet-derived growth factor (P latelet-derived gross factor, hereinafter abbreviated as PDGF), fibroblast growth factor (hereinafter, FGF). Abbreviated), epidermal growth factor (Epide rmal lGrowth Factor, hereinafter abbreviated as EGF), transforming growth factor (Transf
  • TGF 0 rming Growth Factor
  • BMP bone morphogenetic factor
  • IFN interferon, abbreviated as IFN
  • G-CSF granulocyte colony Stimulatory factor
  • G-CSF macrophage Zico mouth soil-IJ intense factor
  • M—CSF inulin-like growth factor
  • IGF inulin-like growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • SCF bone marrow stem cell growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • Interleukin 'Network Kodansha, 19992
  • the tyrosine kinase, serine or threonine phosphorylation on the receptor subunit or a cytokine having a kinase activity is particularly preferred because of its high effect.
  • site-active kinases having tyrosine kinase, serine or threonine-phosphorylation or kinase activity on the receptor subunit EGF, IGF, KGF, FGF, PDGF, M-CSF , SCF, VEGF, NGF, HGF, IL-2, TGF and the like.
  • b FGF Basic FGF
  • EGF current chemistry special edition 16; Tokyo Chemical Dojinsha, p. 31
  • PDGF Hexai Chemical special edition 4, Tokyo Chemical Dojinsha, 11) 4 pages, 1985
  • TGF alpha TGFa, Site Force Inn, Medical View, Inc., 10 pages, 1991
  • acidic FGF acidic FGF, molecular dicine, vol. 30, p. 986, 1993
  • stroke, pressure sores, wounds and ulcers as an anti-gastric ulcer, and for improving myocardial infarction in some cases.
  • TGF beta 1 (hereinafter abbreviated as TGF_31) is not only a bone healing agent, but also a matrix other than progelatinase A, which suppresses the production of metalloproteinases, and a tissue inhibitor. It promotes the production of metabolic proteinases (T issue Inhibitor of Metalloproteinases ⁇ TIMP) (Experimental Medicine, Vol. 10, No. 15, No. 15, pp. 1860, 1992). It is expected as a wound healing agent because it promotes type I collagen synthesis as a therapeutic agent for rheumatism.
  • HGF Hepatocyte growth factor
  • IFN7 and G-CSF are used as tumor therapeutics because they enhance the immune system.
  • Interleukin-2 has been reported as a therapeutic agent for malignant vascular cell types and has been used in LAK therapy.
  • LAK therapy can be used to Incubate spheres with IL-12 to increase the number of cytotoxic T cells (CTLs) and natural killer cells (NK cells) and return them to the body, and treat cancer by enhancing immunity. It is a kind of treatment (Iwanami Shinsho Publishing, “Treatment of Cancer", Hiroshi Kobayashi, 2992, pp. 151-154, 1993).
  • Interleukin-12 has a similar effect to IL-2, and has a stronger activity (Experimental Medicine, Vol. 10, No. 3, pp. 395-3) 99 pages, 1992).
  • the application of this cytokine to anticancer drugs and LAK therapy is also being studied (Nikkei Biotech, 277, pp. 2-3, 1993) as a cytokine-promoting substance used in the present invention.
  • glycyrrhizic acid glycyrrhetinic acid and the like.
  • 0K-432 is used as a therapeutic agent for tumors and has been confirmed to produce IFN in spleen cells of mice administered intraperitoneally.
  • Glycyrrhizic acid is used as a therapeutic agent for hepatitis and has an IFN-producing action.
  • a disease in which the activity of cytokine is decreased means a disease in which the amount of cytokine is decreased or the reactivity (responsiveness) of cytokine itself is decreased.
  • pressure sores ulcers such as gastric ulcers, lung fibrosis, organ fibrosis such as cirrhosis, osteoporosis, and diseases such as cancer in which the immune system is reduced.
  • the cytokine activity enhancer of the present invention and the therapeutic agent for diseases in which the activity of cytokine is reduced can be used in combination with known components which are generally used according to the purpose of use to obtain solid preparations, semi-solid preparations, and liquid preparations. It can be prepared into compositions in various dosage forms such as Specifically, solid preparations include tablets, granules, fine granules, powders, powders, hard capsules, etc., and semi-solid preparations include plasters, gels, creams, etc. Examples of the liquid preparation include a syrup, an elixir, a soft capsule, a lotion, a spray, a patch and the like.
  • Commonly used known components include, for example, hydrocarbons such as petrolatum, squalane, and liquid paraffin, and higher alcohols such as stearyl alcohol and ceanol. Lower alkyl esters of higher fatty acids such as isopropyl myristate and isopropyl palmitate; animal fats and oils such as lanolin; polyhydric alcohols such as glycerin and propylene glycol; macrogol 400; macrogol 4 Polyethylene glycol such as 000, glycerin fatty acid esters such as glyceryl monostearate, sodium lauryl sulfate, polyethylene glycol monostearate, and polyoxyethylene alkyl ether phosphate (trade name NIKKOLDDP-2, Japan) Surfactant Industry Co., Ltd.), water, and, if necessary, preservatives such as butyl para-hydroxybenzoate and methyl para-oxybenzoate, and can be produced by an ordinary method.
  • hydrocarbons such as petrolatum, squalane
  • compositions may be in a single dosage form.
  • the ethanololamine derivative represented by the general formula (I) or a salt thereof and a cytokine or a cytokine production promoting substance are separated into a two-dose form. You can also. In the case of a two-dose form, they may be used together at the time of use. In that case, the administration route of the two dosage forms may be different.
  • the content of the ethanolamine derivative represented by the general formula (I) varies depending on the dosage form, but is preferably 0.001 to 2% by weight, more preferably 0. 0 to 2% by weight, based on the total amount of the applied composition. 0.001 to 1% by weight. However, those that are diluted at the time of use, such as bath salts, can be further increased in content.
  • a cytokine activity enhancer containing an ethanolamine derivative represented by the general formula (I) of the present invention when a cytokin is added to a lymphocyte to be cultured in vitro, Can be added to the medium and used as an auxiliary.
  • the amount added is preferably 0.001 to 2% by weight, more preferably 0.001 to 2% by weight, based on the total amount of the medium, as the amount of the ethanolamine derivative represented by the general formula (I). 0.001 to 0.5% by weight.
  • the cytokine activity enhancer of the present invention and the therapeutic agent for a disease in which the activity of cytokine is reduced can be used as a reagent for research and testing by adding it to a cultured cell system, and can be used for ordinary pharmaceuticals and cosmetics. It can also be used as an active ingredient.
  • the therapeutic agent for cytokines of the present invention can be used by adding it to the cultured lymphocyte system in the above-described LAK therapy, or by oral administration, injection, transdermal administration, or the like. Tablets, granules, powders, fine granules, hard capsules for oral administration / In addition to solid preparations such as P95 / 00857, liquid preparations such as syrups, elixirs, and capsules are included.
  • Tablets, granules, powders, and fine granules include a compound of the general formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for example, lactose, starch, crystalline cellulose, magnesium stearate, hydroxypropyl. It is manufactured by mixing with ordinary pharmaceutical additives such as cellulose and talc.
  • Hard capsules are produced by appropriately filling the above-mentioned fine granules and powders into capsules.
  • a syrup is prepared by adding a compound of the formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof to an aqueous solution containing sucrose, D-sorbitol, carboxymethylcellulose, etc., together with a preservative such as methyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate and the like. It is manufactured by dissolution or suspension.
  • Elixirs are produced by mixing glycerin, orange oil, lemon oil, coriander oil, anilice oil, talc, etc., with an ethanol solution of the compound of the general formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof. .
  • the soft capsule is prepared by dissolving or suspending the compound of the formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof in a lipid excipient, for example, vegetable oil, oily emulsion, or glycols. Manufactured by filling.
  • a lipid excipient for example, vegetable oil, oily emulsion, or glycols.
  • Injectables are prepared by dissolving or emulsifying the compound of the general formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof in physiological saline or a lipid excipient such as vegetable oil, oily emulsion, or glycol. It is manufactured by encapsulation in ampoules or vials. In the case of using vials, it is also possible to add a drug that promotes the production of cytokine or cytokine at the time of encapsulation, and then freeze-dry to produce.
  • Dosage forms for transdermal administration include semisolid preparations such as ointments, gels, and creams, and liquid preparations such as mouthwashes, cataplasms, sprays, and patches.
  • the cytokine therapeutic agent of the present invention is administered orally or parenterally.
  • the cytokine enhancer of the present invention is administered orally, dermally or by injection for diseases of organs such as visceral tumors or heart disease, or by dermal or topical injection for diseases of epithelium such as psoriasis or keloid. Is preferably administered.
  • the dosage varies depending on the age, weight, and condition of the patient, the method of administration, and the amount of cytokine or cytokine production enhancer co-administered. In general, when administered to an adult, the compound (I) is administered as a single dose per dose. 0.5 to 1000 mg is administered 1 to 3 times a day.
  • a dose of 30 to 100 mg per dose is appropriate, and organ diseases, psoriasis
  • a dose of 1 to 50 mg per administration is appropriate.
  • the amount of a cytokine or a cytokine production promoting substance used together as a therapeutic agent can be reduced by 20 to 90% from the usual amount.
  • test examples showing the effects of the present invention will be described.
  • the present invention is not limited to the raw materials and compounding ratios described in the test examples.
  • the definitions of the terms used in each test example are described below.
  • MEM medium carbon dioxide
  • Fetal bovine serum Feta1BovineSerum
  • human procollagenase produced in a serum-free and protein-free medium in anchorage-independent cells derived from human fibrosarcoma cells can be treated with C1V [—Sepharose (trademark, manufactured by Pharmacia) and zinc. Purified by Kiring Sepharose (trademark, manufactured by Pharmacia), dissolved in a measurement buffer, and added to it as an activator. After adding Lipsin (Sigma, Type 12) and incubating at 35 ° C for 5 minutes, soybean Lipsin Inhibitor (Merck) is added. The one in which lipsin was inactivated was used (see Japanese Patent Application No. 11-238941).
  • the amount of procollagenase produced was quantified as collagenase activity obtained by activation with tribcine.
  • TGF-1 promotes the production of TIMP
  • TGF- ⁇ 1 activity enhancement rate of the compound was calculated by comparing the production of TIMP with the addition of purified water. did.
  • the PDGF activity enhancement rate of the compound was calculated by comparing the production of procollagenase with that of purified water.
  • the bFGF activity of the compound was determined by comparing the amount of hemoglobin in the matrix injected subcutaneously into the rat abdomen without addition of hemoglobin. Produced in comparison.
  • Cell density of normal human fibroblast cell line [CCD 45 SK (AT CC CRL 1 506) collected from white female skin] was 10% (V / V) FBS and 1% (V / V) prepared 1 X 1 0 5 or Zm l at MEM medium containing nonessential ⁇ Mi amino acids (manufactured by Dainippon Pharmaceutical), seeded respectively by 0. 8 m 1 1 2 well plates (8 X 1 0 4 pieces / P95 / 00857
  • the cells were cultured at 37 under 5% carbon dioxide gas and saturated steam.
  • the site potency enhancer (N-methyl-L-serine) described in Example 1 described below was diluted to 1 mM with a MEM medium supplemented with 0.6% (V / V) FBS. The addition solution was used.
  • the culture solution was removed by suction, 0.8 ml of the additional solution was added, and the cells were cultured for two days. This operation was repeated once more, and the cells were treated with a medium containing a cytokine activity enhancer for a total of 6 days.
  • the culture medium was removed by suction, and 0.8 ml of MEM medium containing 3 ng / mlb FGF (Boehringer-Mannheim) and 0.6 (V / V) FBS was added. After culturing for one day, a culture supernatant was obtained.
  • the inhibitor was removed with 0.5 ml of the same buffer containing 125 mM sodium chloride (total 4 times, 2 ml in total), and 500 mM sodium chloride was added.
  • Procollagenase was recovered in 5 ml of the same buffer solution (4 times in total, 2 ml in total), and used as a test solution.
  • Type I collagen (FITC-collagen acetic acid solution at a concentration of 1 mg / m1; Cosmo Bio Inc.) labeled with fluorescein isothiocyanate (hereinafter abbreviated as FITC) was used as a substrate solution.
  • the method of Nagai et al. (Inflammation, Vol. 4, No. 2, 1 2 3
  • the activity (unit: Zm 1) of the collagenase was measured according to the method described in p.
  • the amount of collagenase produced from procollagenase by the above-mentioned trypsin treatment, which degrades l ⁇ g of type I collagen (FITC-collagen) per minute at 35 ° C, is defined as one unit of procollagenase.
  • the amount of procollagenase production (unit / m1 of culture solution) was determined (this value is defined as X,).
  • Comparative Example 1 a procollagenase was prepared in which purified water was added instead of N-methyl-L-serine, and a cytokine activity enhancer (N-methyl-L-serine) was not added in the same manner as above.
  • the production amount (unit culture solution m 1) was determined (this value is Y,).
  • cytokine (bFGF) activity enhancement rate was calculated from these values by the following equation. The results are shown in Table 1 below.
  • the cytokine activity enhancer of Example 1 increased the production of procollagenase and enhanced the activity of cytokine (bFGF).
  • the cytokine activity enhancer (N-methyl_L-serine) described in Example 1 described below was diluted to 0.01 to 10 mM in a MEM medium supplemented with 0.6% (VZV) FBS, An addition solution was used.
  • N_methyl-L-serine increases the production of Proco-Lage
  • Tocaine (bFGF) activity was enhanced in a concentration-dependent manner.
  • the site potency activity enhancer (diethanolamine) described in Example 2 described below was diluted to 1 mM with a MEM medium supplemented with 0.6% (V / V) FBS to obtain an added solution.
  • the cytokine activity enhancer of Example 2 increased the production of procollagenase and enhanced the activity of cytokine (bFGF).
  • VZV 0.6% (VZV) FBS, final concentration 0.1% (WZV) lactalbumin enzyme hydrolyzate, 1% (V / V)
  • the solution was diluted to 1 mM with a MEM medium supplemented with non-essential amino acids and 1 mM sodium pyruvate, and used as an addition solution.
  • the culture solution was removed by suction, and the cells were washed twice with a MEM medium supplemented with a final concentration of 0.6% (VZV) FBS. Then, 0.8 ml of the supplemented solution was added, and the cells were cultured for 4 days.
  • VZV 0.6%
  • the culture was aspirated off and 3 ng Zm lb FGF, 0.6% (V / V) F 83, final concentration 0.1% (W / V) lactalbumin enzyme hydrolyzate, 1% (VZV ) 0.8 ml of MEM medium containing non-essential amino acid and 1 mM sodium pyruvate was added and cultured for 3 days to obtain a culture supernatant.
  • the cytokine activity enhancer of Example 4 increased the production of procollagenase and enhanced the activity of cytokine (bFGF).
  • Normal human fibroblast cell line (Cell density of Detroit-55 1 (ATCC CCL 110) collected from skin of Caucasian female) was 10% (V / V) FBS, final concentration 1% (V / V) MEM medium containing nonessential amino acids and 1 mM sodium pyruvate (or both manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) (hereinafter referred to as MEM 2 medium) at was adjusted to 1 x 1 0 5 cells Roh ml Then, 0.8 ml of each was inoculated into a 12-well plate (8 ⁇ 10 4 wells), and cultured at 37 ° C. under 5% carbon dioxide gas and saturated steam.
  • the cytokine activity enhancer (N-isopropyl-2-methyl-ethanolamine) described in Example 5 described below was diluted with MEM 2 medium containing 0.6% (V / V) FBS to 3 mM. And used as an additive solution.
  • the culture was aspirated off, the cells were washed twice with MEM2 medium supplemented with a final concentration of 0.6% (V / V) FBS, and then 0.8 ml of the supplemented solution was added and cultured for 2 days .
  • the culture solution was removed by suction, and 0.8 ml of the additional solution was added again, and the cells were cultured for 2 days, and cultured for a total of 4 days.
  • aspirate the culture medium add 0.8 ml of MEM 2 medium containing 3 ng / mlb FGF and 0.6% (V / V) FBS, culture for 3 days, and discard the culture supernatant. Obtained.
  • N-isopropanoyl 2-methyl-ethanolamine increased procollagenase production and enhanced cytokine (bFGF) activity.
  • Test Example 1 7 N-isopropanoyl 2-methyl-ethanolamine increased procollagenase production and enhanced cytokine (bFGF) activity.
  • the cytokine activity enhancer (D, L-2-amino-1-propanol) described in Example 6 described below was diluted to 3 mM with MEM 2 medium containing 0.6% (V / V) FBS, An addition solution was used.
  • the cytokine activity enhancer (2-amino-1-butanol) described in Example 7 described below was diluted to 3 mM with MEM 2 medium containing 0.6% (V / V) FBS, and added. The solution was used.
  • 2-Amino 1-butanol increased procollagenase production and enhanced cytokine (bFGF) activity.
  • the cytokine activity enhancer (1,3-diamino-2-propanol) described in Example 8 described below was diluted to 3 mM with MEM 2 medium containing 0.6% (V / V) FBS and added. The solution was used.
  • 1,3-Diamino-2-propanol increased procollagenase production and enhanced cytokine (bFGF) activity.
  • the cytokine activity enhancer (1-amino-2-butanol) described in Example 9 described below was diluted to 3 mM with MEM2 medium containing 0.6% (V / V) FBS to prepare an addition solution. .
  • 1-Amino-2-butanol increased procollagenase production and enhanced cytokine (bFGF) activity.
  • the cytokine activity enhancer (N-methyl-L-serine) described in Example 1 described below was diluted to 1 mM with a MEM medium supplemented with 0.6% (V / V) FBS to prepare an additive solution. .
  • MEM medium containing 30 n gZm l PDGF-BB (Austral's Biologicals) and 0.6% (VZV) FBS was added to 0.811111 [], and cultured for 3 days. The culture supernatant was obtained.
  • cytokines (PDGF) activity ⁇ rate in the same manner as in Test example of 1, the Purokoragena Ichize production amount in the culture supernatant was added Sai Bok force in activity enhancer and X 2, the purified water as Comparative Example 1 added procollagenase production amount in the culture supernatant was was calculated by the following equation as Y 2.
  • Cytokine (PDGF) activity enhancement rate (%) [ ⁇ 2 ⁇ 2 ] ⁇ 100 Procollagenase production in the obtained culture supernatant was quantified. The results are shown in Table 11 below.
  • the cytodynamic activity enhancer of Example 1 increased the production of procollagenase and enhanced cytokine (PDGF) activity.
  • the cytokine activity enhancer (N-methyl-L-serine :) described in Example 1 described below was diluted to 1 mM with MEM medium supplemented with 0.6% (V / V) FBS, and the added solution was added.
  • the amount of TIMP produced in the obtained culture supernatant was measured as follows. First, the culture supernatant is diluted 10- to 1000-fold with a measurement buffer. With each diluent Mix an equal volume of a known amount (0.24 units) of collagenase solution, and measure collagenase activity using FITC-collagen as a substrate in the same manner as in Test Example_1. An inhibition curve was determined from the measurement results, and a dilution factor of the culture supernatant that inhibited 50% was determined from the inhibition curve, and the dilution factor was used as a unit.
  • Comparative Example 1 the same operation as in Test Example 11 was performed. Moreover, Sai Tokay emissions (TGF-1) activity enhancing rate sites force the TI MP production amount of in-activity enhancer culture supernatant was added to a X 3, on the addition cultures of purified water as Comparative Example 1 The amount of production of Cho 1 ⁇ 4? was calculated as ⁇ 3 by the following formula.
  • Cytokines (TGF-1) activity enhancing rate (%) [ ⁇ 3 ⁇ 3] was quantitated TI MP production amount of X 1 00 resulting in the culture supernatant. The results are shown in Table 12 below.
  • the site force-in activity enhancer of Example 1 increased the amount of TIMP production and enhanced the site force-in (TGF-jSl) activity. .
  • the cytokine activity enhancer (ethanolamine) described in Example 3 described below was diluted to 1 mM with a MEM medium containing 0.6% FBS to prepare an addition solution, and the culture supernatant was used in the same manner as in Test Example 1-12. Obtained. However, the culture period with the addition of the cytokine enhancer was set to 4 days, and the amount of TIMP produced in the culture supernatant after the addition of TGF- / 31 was measured.
  • the site force-in activity enhancer of Example 3 increased TIMP production and enhanced cytokine (TGF- / 31) activity.
  • Example 10 [84 mM (1% by weight) N-methyl-L-serine] or Example 11 [75 mM (1% by weight) N-isopropanoyl_2-methyl-ethanolamine] was applied daily to shaved abdominal SD male rats (7 weeks old, weight: 210-230 g, 18--24 animals / group, obtained from CLEA Japan) for 21 days.
  • Matrizil containing 1 ng / m1b FGF (Dainippon Pharmaceutical) and heparin (Gibco BRL) [MATR IGEL (trademark), basement membrane matrix, phenol red-free, [Cat. No. 402234C] was injected subcutaneously in the abdomen at a volume of 1 ml, and collected 8 days later from the abdomen.
  • the collected matrix was homogenized in a phosphate buffer (including physiological saline) with Hiscotron (trademark, manufactured by Nisson Medical Science Instruments Co., Ltd.), centrifuged, and centrifuged. globin amount was measured using the hemoglobin one test Towako one (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (this value and X 4.).
  • cytokine (bFGF) activity enhancement rate was calculated from these values by the following equation.
  • the amount of hemoglobin in the obtained matrix was quantified. The results are shown in Table 15 below.
  • Example 11 (75 mM N-isopro 2 4 5 ⁇ 2 9 1 1 4 ⁇ , ⁇ ⁇ -neuru 2-methyl-ethanolamine)
  • N-methyl-L-serine and N-isopropanoyl 2-methyl-ethanolamine increased the amount of hemoglobin and increased the activity of cytokine (bFGF).
  • FIG. 1 1 is a lid made of tetrafluoroethylene, 2 is a sampling port, 3 is a drug sample, 4 is skin, 5 is a 0-ring, 6 is a receptor phase, and 7 is a stirrer.
  • Figure 2 shows the results for N-methyl-L-serine.
  • Test example-16 (Acute toxicity test)
  • Draitz method (Ap praisa 1 of the Safetyof Chemicals in Foods, Dragsand Cosmetics, 46 shellfish, 1959, editedandpublishedbyt he Deneitoria) 1 Co mm ittee, A ssociationof Foodand D ru
  • test was carried out according to O.sub.f ici.a.al.sof (U.S.A.).
  • a 0.1% (WZV) aqueous solution of a test compound (0.1 ml) was applied to the back (3 x 4 cm) of the cut rabbits once a day for 4 days, once a day. Twenty-four hours later, the application was scored for erythema, edema, eschar and cracks.
  • Moderate stimulation Cumulative stimulation score of 2 to less than 6
  • Intensity stimulus Cumulative stimulus score of 6 or more Table 1 9 Test compound Cumulative stimulus score
  • N-methyl-L-serine, ethanolamine and N-methylethanolamine had a low cumulative irritancy to the skin.
  • Test Example 18 (Primary skin irritation test, see Japanese Patent Application Laid-Open No. H04-113)
  • Aqueous solutions in which N-methyl-l-serine, ethanolamine and N-methylethanolamine were each adjusted to pH 7 with hydrochloric acid were used as test samples.
  • an abrasion site (damaged skin) is made on the back of a rabbit whose hair has been cut, and 0.1 ml of water or 1 ml of a 1% (WZV) aqueous solution of a test compound is applied to each of the damaged skin and normal skin.
  • the patch was infiltrated with a patch test patch (1.2 x 1.6 cm, Ribbon Aid®, manufactured by Riva-Tape Pharmaceutical Co., Ltd.). Twenty-four hours later, the bandage was peeled off, and erythema and edema on the skin were observed. Further, 48 hours after the bandage was peeled off, the same observation was made. Erythema and edema scores were assigned according to the evaluation criteria shown in Table 20.
  • Moderate stimulus —Next stimulus score 2 ⁇ j not i ⁇
  • Intensity stimulus Primary stimulus score 5 or more Table 2 3 Test compound Primary stimulus score Irritation degree
  • Aqueous solutions in which ⁇ -methyl-L-serine, ethanolamine and ⁇ -methylethanolamine were each adjusted to ⁇ 7 with hydrochloric acid were used as test samples.
  • 19 healthy subjects were set as subjects.
  • test compound was tested according to the test method (Journal of Society of Cosmetic Chemist, Vol. 31, pp. 97, 1989). 1% of (W / V) 0.05 ml of the aqueous solution was occluded and applied for 24 hours, and the skin reaction was observed 1 hour and 24 hours after patch removal.
  • a 1 M aqueous solution of N-methyl-L-serine was sterilized by filtration through a nitrocellulose membrane having a pore size of 0.2 ⁇ m (manufactured by ADVANTEC TOYO, DISMIC-25) to obtain a cytokine activity enhancer.
  • Cytokine was performed in the same manner as in Example 1 except that a 1 M solution of ethanolamine, ethanolamine or N-methylethanolamine adjusted to pH 7.5 with hydrochloric acid was used, and the reaction was performed under ice cooling. An activity enhancer was obtained.
  • N-isopropanoyl 2-methyl-ethanolamine, D, L- 2-amino-1-propanol, 2-amino-1-butanol, 1,3-diamino-2-propanol and 1-Amino 2-Bubutanol was adjusted to pH 7.5 with hydrochloric acid to make a 1 M solution.
  • Nitrocell membrane with a pore size of 0.2 t / m (Advantec Toyosha) was sterilized by filtration with DISMIC-25) to obtain a cytokine activity enhancer.
  • N-methyl-l-serine or N-isopropanoyl 2-methyl-ethanolamine, methyl para-hydroxybenzoate, hydroxylated lime, concentrated glycerin, 1,3-butylene glycol, sodium cetyl sulfate and purified water The mixture was heated to 80 ° C in a water bath and mixed, and the mixture was heated to 8 (1 ° C warmed stearate, cetanol, lipophilic glyceryl monostearate, lanolin, fluidized
  • the mixture was gradually added with stirring to a mixture of paraffin, methylpolysiloxane and butyl paraoxybenzoate, and then stirred vigorously for 2.5 minutes with a homogenizer (manufactured by TOKU SUKI KAI KOGYO). pm), the components were sufficiently emulsified and dispersed, and then gradually cooled with stirring to obtain a cream.
  • Example 2 A comparison was performed in the same manner as in Examples 10 to 11 except that N-methyl-L-serine or N-isopropanoyl 2-methyl-ethanolamine was not added, and the purified water was changed to 66.38 g. The cream of Example 2 is obtained.
  • Examples 12 to 14 To the mixture of the component (A) in Table 25, the component. (B) dissolved in 30 g of water was added and kneaded sufficiently. This kneaded product is passed through a 20-mesh sieve, granulated into granules, and dried. The obtained granules are mixed with the component (C), and the mixture is compressed into tablets of 20 mg per tablet. As a result, tablets containing 100 mg of the active ingredient in one tablet were prepared.
  • component (B) dissolved in 100 g of water. Kneaded well. The kneaded product was passed through a 20-mesh sieve, granulated, dried and sized to obtain 30 mg of the active ingredient per gram (Examples 21 to 23) or 3 mg. Granules containing 00 mg (Examples 24-26) were prepared.
  • the component (B) in Table 28 was added to and dissolved in 40 Om1 of purified water at 90 ° C, and then the component (C) was added at the same temperature, mixed well, and cooled to 30 ° C.
  • the component (A) was dissolved in 100 ml of purified water and added to this mixture, followed by stirring at 30 ° C. for 30 minutes.
  • the component (D) is added, the mixture is stirred for 20 minutes, purified water is added to make a total amount of 100 Om1, and a syrup containing 100 Omg of the active ingredient in 1 ml is subjected to aseptic filtration. Prepared.
  • the cytotin activity enhancer in the amount shown in Table 29 below was dissolved in purified water for injection (containing 10% human serum albumin and 20% mannitol) to give a solution of 200 ml.
  • the solution was sterilized by sterile filtration.
  • N-methyl-L-serine, ethanolamine and diethanolamine 2 ml of the sterilized solution was dispensed into vials having a capacity of 10 ml.
  • the mixture was aseptically replaced with nitrogen and stoppered to obtain an injection.
  • the sterilized solution was dispensed in 2 ml portions into 3 ml 1 volume brown ampules, and the ampoules were sealed to obtain injections.
  • the amounts of the active ingredients in the table are as follows: N-methyl-1-L-serine, ethanolamine, diethanolamine, N-methylethanolamine, N-isopropanoyl-1-methyl in 1 vial or 1 ampoule.
  • Ethanolamine, D, L 2-Amino 1—Propanol, 2-Amino 1-butanol, 1.3—Diamino 2-propanol or 1—Amino 2-butanol Indicates the amount as knol.
  • Table 2 9 Ethanolamine, D, L—2-Amino 1—Propanol, 2-Amino 1-butanol, 1.3—Diamino 2-propanol or 1—Amino 2-butanol Indicates the amount as knol. Table 2 9
  • N-methyl-L-serine Application Examples 1, 10, and 19
  • Jetanolamine Application Examples 2, 11, and 20
  • ethanolamine Application Examples 3, 100
  • 12 and 21 N-methylethanolamine
  • N-methylethanolamine Application Examples 4, 13 and 22
  • N-isopropanol-12-methyl-ethanolamine Application Examples 5, 14 and 23
  • D L-2-amino-1 _propanol
  • the active ingredients in the table and the component (A) were heated to 80 ° C in a hot water bath and mixed.
  • the component (B) is similarly heated to 80 ° C and mixed, and the former mixture is stirred into this mixture.
  • the mixture was stirred vigorously for 2.5 minutes (2500 rpm).
  • the mixture was gradually cooled to room temperature with stirring to obtain a lotion.
  • a cream was prepared with the composition shown in Table 34.
  • the cytokine activity enhancer of the present invention can act on skin cells, enhance responsiveness to cytodynamics, and activate skin metabolism. Further, since the ethanolamine derivative represented by the general formula (I) or a salt thereof can penetrate the skin, the action of a cytokine can be locally enhanced. Furthermore, the ethanolamine derivative or its salt has low toxicity, and can enhance the action of cytokines even when administered systemically. Therefore, the ethanolamine derivative of the general formula (1) and a salt thereof are useful as a cytokine activity enhancer.

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Description

明 細 . 書 サイ トカイン活性増強剤およびサイ トカインの働きが低下した疾病の治療剤 技術分野
本発明は、 サイ トカイン活性増強剤およびサイ 卜力インの働きが低下した疾病 の治療剤に関する。 本発明は、 特に、 サイ トカインの応答性を高めることによつ て、 老化等により低下したサイ トカインの反応性を賦活し、 またはサイ 卜力イン の減少により起こる異常を治療できる、 サイ トカイン活性増強剤およびサイ トカ ィンの働きが低下した疾病の治療剤に関する。 背景技術
老化肌や荒れ肌の修復には、 サイ トカインの分泌が密接に関わりをもっている ことが知られている。 また、 サイ トカインは疾病にも大きく関わっていることが 明らかとなり、 サイ トカインを治療に用いる試みが盛んに行われている。
具体的には、 治療薬としてサイ トカイン自体を経口または注射、 経皮等の非経 口でヒ トに投与する方法等が挙げられる。 しかし、 完全治癒までの間、 高価なサ ィ トカインを大量に用いることが必要であり、 治療薬として患者への経済的負担 は大きい。
一方、 これらのサイ ト力インの産生を促進する物質を用いる場合も、 同様に経 口または注射、 経皮等の非経口でヒ トに投与される。 しかし、 やはりこのサイ 卜 力イン産生促進物質であっても、 サイ トカイン使用と同様に、 患者への経済的負 ί旦は大きい。
また、 単独でのサイ ト力インの大量投与は、 代謝バランスを崩す場合があり、 また外用での使用には、 分解や吸収性等の点で局所での効果が期待できない場合 がある等の問題があり、 より安全な皮膚代謝の賦活方法が望まれていた。
発明の開示
従って、 本発明は、 それ自体を生体に投与することによって生体中に存在する サイ トカインの応答性を高めることのできるか、 あるいはサイ トカインを治療薬 CT/JP95/00857 と して投与する際にその投与量を少なくすることのできる、 サイ トカイン活性増 強剤およびサイ トカインの働きが低下した疾病の治療剤を提供することを目的と する。
本発明は、 上記の目的を達成するため、 下記一般式 （ I ) で表されるエタノー ルァミ ン誘導体またはその塩を含有するサイ トカイン活性増強剤を提供する。
R K
R, -NH-CH-CH-OH ( I )
(式中、 R, は H、 - C H3 、 - CH2 C H (C H3 ) OHまたは一 CH2 C H OHであり、 R2 は H、 - C H3 、 - C H2 C H3 または— COOHであり、 R3 は H、 - C H3 、 - C H2 CH3 または— CH2 NH2 である）
本発明は、 また、 上記サイ トカイン活性増強剤を含有する、 サイ 卜力イ ン活性 増強剤の働きが低下した疾病の治療剤を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 試験例一 1 5で使用した垂直型拡散セル装置を示す図である。
図 2は、 試験例一 1 5において、 N—メチル— Lーセリ ンの皮膚透過性試験を 行った結果を表す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明で用いられる上記一般式 （ I ) で表されるエタノールアミ ン誘導体は、
R, が Hである場合、 R2 は H、 - CH3 または一 CH2 CH3 であるのが好ま しく、 このとき R3 は H、 - C H3 、 一 CH2 CH3 または一 CH2 NH2 であ るのがよい。 R, がー CH3 である場合、 R2 は一 C 0 OHであるのが好ましく 、 このとき R3 は H、 一 CH3 、 一 CH2 CH3 または一 CH2 NH2 であるの がよい。 さらに、 R, が一 CH3 、 一 CH2 CH (CH3 ) OHまたは一CH2 C H2 OHである場合、 R2 は Hであるのが好ましく、 このとき R3 は H、 一 C H3 、 一 CH2 CH3 または— CH2 NH2 であるのがよい。
一般式 （ I ) で表されるエタノールァミ ン誘導体の具体例としては、 N—メチ ルー Lーセリ ン、 ジエタノールァミ ン、 エタノールァミ ン、 N—メチルエタノー ルァミ ン、 N—イ ソプロパノィルー 2 _ チルーェタノ一ルァミ ン、 D, L - 2 ーァミ ノ一 1一プロパノール、 2—アミ ノー 1ーブタノール、 1 , 3—ジァミ ノ 一 2 _プロパノール、 1—ァミ ノ一 2—ブ夕ノール等を挙げることができる。 また、 一般式 （ I ) で表されるエタノールァミ ン誘導体の塩としては、 特に限 定されないが、 特に薬学的に許容される塩酸塩、 臭化水素酸塩、 硫酸塩、 リ ン酸 塩等の無機酸塩および酢酸塩、 フマール酸塩、 マレイン酸塩、 酒石酸塩、 クェン 酸塩、 p— トルエンスルホン酸塩等の有機酸塩を挙げることができる。
本発明で用いられるサイ トカインとしては、 血小板由来成長因子 （P l a t e l e t -D e r i v e d G r o t h F a c t o r、 以下 P D G Fと略記す る） 、 線維芽細胞成長因子 （F i b r o b l a s t G r owt h F a c t o r、 以下 F G Fと略記する） 、 上皮成長因子 （Ep i d e rma l G r owt h F a c t o r、 以下 EGFと略記する） 、 形質転換成長因子 （T r a n s f
0 r m i n g G r owt h F a c t o r、 以下 T G Fと略記する） 、 骨形成 因子 (B o n e Mo r p h o g e n e t i c P r o t e i n、 以下 B M Pと 略記する） 、 イ ンターフヱロン （ I n t e r f e r o n、 以下 I F Nと略記する ) 、 顆粒球コロニー刺激因子 （G r a n u l o c y t e C o l o ny - S t i mu l a t i n g F a c t o r、 以下 G— C S Fと略記する） 、 マクロファー ジコ口土ー朿 IJ激因子 (Ma c r o p h a g e C o l o ny— S t i mu l a t
1 n g F a c t o r 以下 M— C S Fと略記する） 、 インシユリ ン様成長因子 ( I n s u l i n— L i k e G r owt h F a c t o r、 以下 I G Fと略記 する） 、 肝細胞成長因子 （H e p a t o c y t e G r owt h F a c t o r 、 以下 HGFと略記する） 、 骨髄幹細胞成長因子 （S t em C e l l F a c t o r, 以下 S C Fと略記する） 、 神経成長因子 （N e r v e G r owt h F a c t o r, 以下 NG Fと略記する） 、 血管内皮成長因子 （Va s c u l a r En d o t h e l i a l C e l l G r owt h F a c t o r、 以下 V E G Fと略記する） 、 インタ一ロイキン （インタ一ロイキン ' ネッ 卜ワーク、 講談 社、 1 992年） 等が挙げられる。 それらのうちでも、 特に、 レセプターのサブ ュニッ トにチロシンキナーゼ、 セリ ンもしく はスレオニンリ ン酸化またはキナー ゼ活性を有するサイ トカインに高い効果が見られるので好ましい。 レセプターのサブュニッ 卜にチロシンキナーゼ、 セリ ンもしく はスレオニンリ ン酸化またはキナーゼ活性を有するサイ 卜力インとしては、 上記サイ 卜力インの うち、 EGF, I G F, KGF, FGF, PDGF, M - C S F, S C F, V E G F, NGF， HGF, I L— 2, TGFなどが挙げられる。
塩基性 FGF (b a s i c FGF、 以下 b FGFと略記する） や E G F (現 代化学増刊 1 6、 東京化学同人社、 1 3 1頁） 、 PDGF (現代化学増刊 4、 東 京化学同人社、 1 1 4頁、 1 985年） または EGFレセプターに結合する TG Fアルファ （TGF a、 サイ ト力イ ン、 メ ジカルビユー社、 1 0頁、 1 9 9 1年 ) 、 酸性 FGF (a c i d i c FGF、 Mo l e c u l a r Me d i c i n e、 3 0巻、 9 86頁、 1 9 9 3年） は、 脳卒中や、 褥創、 創傷、 潰瘍の治療薬 として、 抗胃潰瘍剤として、 また心筋梗塞の改善に用いられている例もある。 一方、 BMPは、 今後老齢化社会を迎えるにあたって増加する骨粗鬆症の治療 薬として期待されている （実験医学 1 0巻、 1 5号、 2010頁、 1 992年） 。 また、 TG Fベータ 1 (以下、 TG F _ 31と略す） は、 骨折治癒剤の他、 プ ロゼラチナーゼ A以外のマ ト リ ックス ' メタロプロテア一ゼ産生抑制、 またティ ッ シユー · イ ンヒビター · ォブ ' メ タ口プロティナーゼス （T i s s u e I n h i b i t o r o f Me t a l l o p r o t e i n a s e s^ 以 T I M P と略記する） の産生を促進する （実験医学、 1 0巻、 1 5号、 1 860頁、 1 9 92年） ので、 リゥマチ治療薬として、 さらに I型コラーゲン合成を促進するこ とから、 創傷治癒剤として期待されている。
肝細胞増殖因子 （H e p a t o c y t e G r ow t h F a c t o r、 以下 HGFと略記する） は、 最近行われている臓器移植の際の臓器再生剤として、 ま た腫瘍細胞の増殖抑制をする （FEB S L e t t e r s、 2卷、 22 9頁、 1 99 1年） ことから、 日本人の死亡率 1位である癌の治療薬と しても期待されて いる。
I F Nガンマ （ I F N 7 ) および G— C S Fは、 免疫系を増強することから、 腫瘍治療薬として使用されている。
インタ一ロイキン— 2 ( I L— 2) は、 悪性血管細胞種の治療薬として報告例 があるほか、 L AK療法に使用されている。 L AK療法は、 体外で患者のリ ンパ 球を I L一 2を添加して培養し、 細胞障書性 T細胞 （CTL) およびナチュラル .キラー細胞 （NK細胞） の数を增加させて体内に戻し、 免疫増強により癌を治療 する免疫賦活癌治療法の 1種である （岩波新書出版 「がんの治療」 、 小林博著、 2 9 2、 1 5 1頁〜 1 5 4頁、 1 9 9 3年） 。
I L - 2と類似の作用があり、 それより強い活性を持つものとして、 インタ一 ロイキン一 1 2 ( I L— 1 2 ) がある （実験医学、 1 0巻、 3号、 3 9 5頁〜 3 9 9頁、 1 9 9 2年） 。 このサイ トカインについても、 抗癌剤や L A K療法等へ の応用が検討されている （日経バイオテク、 2 7 7号、 2頁〜 3頁、 1 9 9 3年 本発明で用いられるサイ トカイン産生促進物質としては、 例えば、 溶連菌 S t r e p t o c o c c u s p y o g e n e sをぺニシリ ンで殺した製剤 （0 K—
4 3 2 ) 、 グリチルリチン酸、 グリチルレチン酸などが挙げられる。 0K— 4 3 2は、 腫瘍治療剤として使用されており、 腹腔内投与したマウスの脾臓細胞にお いて I FNを産生することが確認されている。 また、 グリチルリチン酸は、 肝炎 治療剤として使用されている他、 I FN産生作用を有する。
本発明において、 サイ トカインの働きが低下した疾病とは、 サイ トカインの量 が低下したか、 あるいはサイ 卜力イン自体の反応性 （応答性） が低下した疾病を 意味する。
具体的には、 褥創、 胃潰瘍等の潰瘍、 肺繊維症、 肝硬変などの臓器繊維症、 骨 粗鬆症、 さらにはガン等の免疫系が低下した疾病等が挙げられる。
本発明のサイ トカイン活性増強剤およびサイ トカインの働きが低下した疾病の 治療剤は、 その使用目的に応じて、 通常用いられる公知の成分を配合することに よって、 固形剤、 半固形剤、 液剤等の各種剤形の組成物に調製することが可能で ある。 具体的には、 固形剤としては、 錠剤、 顆粒剤、 細粒剤、 散剤、 粉末剤、 硬 カプセル剤等が挙げられ、 半固形剤としては、 钦膏、 ゲル、 ク リーム等が挙げら れ、 液剤としては、 シロップ剤、 エリキシル剤、 軟カプセル剤、 ローショ ン、 ス プレー剤、 貼付剤等が挙げられる。
通常用いられる公知の成分としては、 例えば、 ワセリ ン， スクヮラン， 流動パ ラフィ ン等の炭化水素、 ステアリルアルコール、 セ夕ノール等の高級アルコール 、 ミ リスチン酸イソプロピル、 パルミチン酸イソプロピル等の高級脂肪酸の低級 アルキルエステル、 ラノ リ ン等の動物性油脂、 グリセリ ン、 プロピレングリ コ一 ル等の多価アルコール、 マクロゴール 4 0 0、 マクロゴール 4 0 0 0等のポリェ チレングリ コール、 モノステアリ ン酸グリセリ ン等のグリセリ ン脂肪酸エステル 、 ラウリル硫酸ナ ト リ ウム、 モノステアリ ン酸ポリェチレングリ コール、 ポリォ キシエチレンアルキルエーテルリ ン酸 （商品名 N I K K O L D D P— 2、 日本 サ一ファクタン ト工業株式会社） などの界面活性剤、 蠟、 樹脂、 水および要すれ ばパラォキシ安息香酸ブチル、 パラォキシ安息香酸メチル等の防腐剤とを混合し 、 常法により製造することができる。
これらの組成物は、一剤形であってもよいが、 一般式 （ I ) で表されるェタノ ールァミ ン誘導体またはその塩と、 サイ トカインまたはサイ トカイン産生促進物 質を分けて 2剤形とすることもできる。 2剤形とした場合は、 使用時に併用すれ ばよい。 その際、 2剤形の投与経路は異なっていてもよい。
一般式 （ I ) で表されるエタノールァミ ン誘導体の含有量は、 剤形により異な るが、 適用する組成物全量を基準として、 好ましくは 0 . 0 0 0 1 ~ 2重量％、 さらに好ましく は 0 . 0 0 1 ~ 1重量％でぁる。 ただし、 入浴剤のように使用時 に希釈されるものはさらに含有量を増やすことができる。
また、 前記 L A K療法において、 体外で培養するリ ンパ球にサイ ト力インを添 加培養する場合に、 本発明の一般式 （ I ) で表されるエタノールァミ ン誘導体を 含有するサイ トカイン活性増強剤を培地中に添加して、 補助剤として使用するこ ともできる。 この場合の添加量は、 一般式 （ I ) で表されるエタノールアミ ン誘 導体量と して、 培地全量を基準として、 好ましく は 0 . 0 0 0 1〜2重量％, さ らに好ましく は 0 . 0 0 1〜0 . 5重量％である。
本発明のサイ 卜カイン活性増強剤およびサイ トカインの働きが低下した疾病の 治療剤は、 研究 ·試験用試薬として培養細胞系に添加して用いることができるほ 力、、 通常の医薬品および化粧品の有効成分として用いることもできる。
本発明のサイ トカイン治療剤は、 前記 L A K療法において培養リ ンパ球系に添 加して用いるほか、 経口投与、 注射、 経皮投与等の方法で用いることができる。 経口投与する際の剤形と しては、 錠剤、 顆粒剤、 散剤、 細粒剤、 硬カプセル剤 / P95/00857 等の固形剤のほか、 シロップ剤、 エリキ^ル剤、 钦カプセル剤等の液剤が含まれ 'る。
錠剤、 顆粒剤、 散剤および細粒剤は、 一般式 （ I ) の化合物またはその薬学的 に許容される塩と、 例えば、 乳糖、 でんぶん、 結晶セルロース、 ステアリ ン酸マ グネシゥム、 ヒ ドロキシプロピルセルロース、 タルク等の通常の医薬添加物とを 混合して製造される。
硬カプセル剤は、 上記の細粒剤や散剤を適宜カプセルに充塡して製造される。 シロップ剤は、 白糖、 D—ソルビトール、 カルボキシメチルセルロース等を含 む水溶液に、 パラォキシ安息香酸メチル、 パラォキシ安息香酸プロピル等の防腐 剤とともに一般式 （ I ) の化合物またはその薬学的に許容される塩を溶解または 懸濁して製造される。
エリキシル剤は、 一般式 （ I ) の化合物またはその薬学的に許容される塩のェ タノール溶液に、 グリセリ ン、 オレンジ油、 レモン油、 コリアンダー油、 ァニス 油、 タルク等を混合して製造される。
軟カプセル剤は、 脂質賦形剤、 例えば、 植物油、 油性ェマルジヨ ン、 グリ コー ル類等に、 一般式 （ I ) の化合物またはその薬学的に許容される塩を溶解または 懸濁し、 軟カプセルに充塡して製造される。
注射剤は、 一般式 （ I ) の化合物またはその薬学的に許容される塩を生理食塩 水または、 例えば、 植物油、 油性ェマルジヨ ン、 グリ コール等の脂質賦形剤に溶 解または乳化させ、 無菌的にアンプルまたはバイャルに封入することによって製 造される。 バイャルを用いる場合には、 封入する際に、 サイ 卜力インまたはサイ トカイン産生を促進する薬剤を同時に添加後、 凍結乾燥して製造することも可能 である。
経皮投与する際の剤形としては、 軟膏剤、 ゲル剤、 ク リーム等の半固形剤、 口 ーシヨ ン剤、 パップ剤、 スプレー剤および貼付剤等の液剤等が含まれる。
本発明のサイ トカイン治療剤は、 経口または非経口で投与される。 例えば、 臓 器腫瘍、 心臓病等の臓器の疾病には経口、 経皮または注射により、 乾癬、 ケロイ ド等の上皮の疾病には経皮または局所注射により、 本発明のサイ トカイン活性增 強剤を投与するのが好ましい。 投与量は、 患者の年齢、 体重、 症状、 投与方法または共に投与するサイ トカイ ンまたはサイ トカイン産生促進物質の量により異なるが、 成人に投与する場合、 一般には、 1回当り化合物 （ I ) として 0. 5~ 1 0 0 0 m gの量を、 1日 1〜 3回投与する。 そして、 例えば、 臓器腫瘍、 心臓病等の臓器の疾病に対して経口 または注射により全身投与する場合には 1回当り 3 0~1 0 0 Omgの投与量が 適当であり、 臓器の疾病、 乾癬、 ケロイ ド等の上皮の疾病に対して経皮により局 所投与する場合には 1回当り 1 ~ 5 0 m gの投与量が適当である。 これらの場合 、 共に使用するサイ トカインまたはサイ トカイン産生促進物質の治療薬と しての 量は通常より 2 0〜 9 0 %減らして使用できる。
次に、 実施例に先立ち、 本発明の効果を示す試験例を記載する。 ただし、 本発 明は、 試験例中に記された原料および配合比に限定されるものではない。 なお、 各試験例中に用いる語句の定義を下記に記載する。
( a ) ME M培地
M i n i mum E s s e n t i a l Me d i um (大日本製薬社製、 1 0 一 1 0 1 ) 1 0. 6 gに 1. 2 g炭酸水素ナト リウムを添加し、 蒸留水を加えて 1 1 とした後、 炭酸ガスを吹き込んで p Hを約 7にした （以下、 MEM培地と略 記する） 。
(b) F B S
牛胎仔血清 （F e t a 1 B o v i n e S e r um)
( c ) 測定用緩衝液
0. 2M塩化ナト リウム、 5 mM塩化カルシウムおよび 0. 0 5% (\νΖν) ブリ ッジ一 3 5 (商標、 ナカライテスク （株） 製、 ポリオキシエチレン（23Ε.0. ) ラウリルエーテル） を含有する 5 0 mMト リス水溶液を塩酸にて室温で p H 7. 5に調整した緩衝液。
( d ) コラゲナーゼ
コラゲナ一ゼとしては、 ヒ ト線維肉腫細胞由来の足場非依存性細胞に、 無血清 無タンパク質培地中で産生させたヒ 卜プロコラゲナーゼを C1V [—セファロ一ス （ 商標、 フアルマシア社製） および亜鉛キレ一ティ ングセファロース （商標、 ファ ルマシア社製） により精製して測定用緩衝液に溶解し、 これに活性化剤として 卜 リプ'シン （シグマ社製、 Ty p e 1 2) を添加して、 3 5 °Cにて 5分間ィ ンキュ ベ一 ト した後、 ダイズト リプシンィンヒビタ一 （メルク社製） を添加して卜 リプ シンを失活させたものを用いた （特願平 1一 2 3 894 1号公報参照） 。
(e) プロコラゲナ一ゼ産生量
本試験では、 プロコラゲナーゼ産生量は、 卜リブシンで活性化して得られるコ ラゲナーゼ活性として定量した。
( f ) T I MP産生量
本試験では、 T I MP産生量は、 コラゲナ一ゼの阻害活性として定量した。
(g) b FGF応答性増強率
本試験では、 b FGFがプロコラゲナーゼ産生量を促進することが知られてい るので、 化合物の b FGF活性増強率は、 プロコラゲナ一ゼ産生量を精製水添加 と比較して算出した。
(h) TG F - 1応答性増強率
本試験では、 TG F— 1が T I MP産生量を促進することが知られているの で、 化合物の TG F— ^ 1活性増強率は、 T I MP産生量を精製水添加と比較し て算出した。
( i ) PDG F応答性増強率
本試験では、 P DG Fがプロコラゲナーゼ産生量を促進することが知られてい るので、 化合物の PDGF活性増強率は、 プロコラゲナ一ゼ産生量を精製水添加 .と比較して算出した。
( j ) 動物実験における b FGF応答性増強率
本試験では、 b FGFが血管新生を促進することが知られているので、 化合物 の b F G F活性增強率は、 ラッ ト腹部皮下に注入したマ ト リ ジヱル中のへモグロ ビン量を無添加と比較して産出した。
試験例一 1
正常ヒ ト線維芽細胞株 〔白人女性の皮膚より採取された C CD 4 5 SK (AT C C CRL 1 506 ) 〕 の細胞密度を 1 0 % (V/V) F B Sおよび 1 % ( V/V) 非必須ァミ ノ酸 （大日本製薬社製） を含む MEM培地にて 1 X 1 05 個 Zm lに調製し、 1 2穴プレー トにそれぞれ 0. 8 m 1ずつ播種 （ 8 X 1 04 個 / P95/00857
/穴） して、 5 %炭酸ガス、 飽和水蒸気下、 3 7 で培養した。
後述する実施例 1に記載のサイ 卜力ィン活性増強剤 （N—メチルー L—セリ ン ) を 0. 6 % (V/V) F B Sを添加した MEM培地で希釈して 1 mMと し、 添 加溶液とした。
2 4時間後培養液を吸引除去し、 終濃度 0. 6 % (V/V) F B Sを添加した MEM培地で細胞を 2回洗浄した後、 添加溶液 0. 8m lを加え、 2日間培養し た。
2日後、 培養液を吸引除去し、 添加溶液 0. 8m lを加え、 2日間培養した。 この操作をさらにもう一度繰り返し、 サイ トカイン活性増強剤を含む培地で細胞 を計 6日間処理した。
上記操作の終了後、 培養液を吸引除去し、 3 n g/m l b FGF (ベーリ ンガ — · マンハイム社製） および 0. 6 (V/V) F B Sを含む MEM培地を 0. 8m l添加し、 3日間培養して培養上清を得た。
得られた培養上清 5 0 0 1に 1 0 mMト リス塩酸緩衝液 〔 4 °Cで p H 7. 8 に調整、 I mM塩化カルシウム、 0. 0 5 % (WZV) ブリ ッジ— 3 5を含む〕 を 3. 5m l加え、 同緩衝液で平衡化した CM—セファロース C L— 6 B (商標 、 フアルマシァ社製、 ベッ ド容量 0. m 1 ) に供した。
次に、 1 2 5 mM塩化ナト リウムを含む上記と同じ緩衝液 0. 5m lにてイン ヒビタ一を除去 （計 4回、 総量 2 m 1 ) し、 5 0 0 mM塩化ナト リ ゥムを含む同 緩衝液 5m 1にてプロコラゲナ一ゼを回収 （計 4回、 総量 2m 1 ) し、 試験 液とした。
試験液を測定用緩衝液で適宜希釈後、 2 5 1を測定用緩衝液 2 5 1 と混合 してト リプシン溶液 （シグマ社、 T y p e 1 2を測定用緩衝液にて濃度 1 mg/ m 1に調整） 2 0〃 1を添加し、 3 5 °Cにて 5分間イ ンキュベー トした後、 ダイ ズト リプシンイ ンヒビター溶液 （測定用緩衝液にて濃度 3 m gZm 1 に調整） 3 0 n 1を添加してト リプシンを失活させ、 コラゲナーゼ溶液を得た。
フルォレツセンイソチオシァネー ト （以下、 F I TCと略記する） で標識され た I型コラーゲン （濃度 1 mg/m 1の F I T C一コラーゲン酢酸溶液、 コスモ バイオ社製） を基質溶液として用い、 永井等の方法 （炎症、 4巻、 2号、 1 2 3 頁、 ' 1 984年参照） に準じて上記コラゲナーゼの活性 （単位 Zm 1 ) を測定し た。 そして、 上記のト リプシン処理によりプロコラゲナーゼから生じるコラゲナ —ゼが、 35°Cにて 1分間当り l〃 gの I型コラーゲン （F I TC—コラーゲン ) を分解する量をプロコラゲナーゼの 1単位とし、 プロコラゲナ一ゼ産生量 （単 位/培養液 m 1 ) を求めた （この値を X, とする） 。
一方、 比較例 1として、 N—メチルー Lーセリ ンの代わりに精製水を加え、 上 記と同様の操作によりサイ トカイン活性増強剤 （N—メチルー L—セリ ン） を添 加しない場合のプロコラゲナーゼ産生量 （単位 培養液 m 1 ) を求めた （この値 を Y, とする） 。
次いで、 これらの値から下式によりサイ トカイン （b FGF) 活性増強率を算 出した。 結果を下記表 1に示す。
b F G F活性増強率 （％) = 〔X, ZY, 〕 X 1 00
表 1 サイ トカイン プロコラゲナーゼ産生量 b F G F活性 活性増強剤 (単位/ m 1 ) 増強率 （％) 比較例 1 (精製水） 6. 8 ± 1. 6 1 00
実施例 1 ( I mM N— 1 5 ± 1. 0 220
メチルー L—セリ ン）
平均値土標準偏差 （n = 3) 実施例 1のサイ トカイン活性増強剤は、 プロコラゲナーゼ産生量を増加させて おり、 サイ トカイン （b FGF) 活性を増強していた。
試験例 - 2 (濃度依存性）
.後述する実施例 1に記載のサイ トカイン活性増強剤 （N—メチル _Lーセリ ン ) を 0. 6% (VZV) F B Sを添加した MEM培地で希釈して 0. 0 1~1 0 mMとし、 添加溶液とした。
試験例一 1と同様にして培養後、 培養上清を得た。
得られた培養上清中のプロコラゲナ一ゼ産生量を定量した。 結果を下記表 2に 示す。 朴ノ k " rノ プロニラゲナ- H D F r Ρ (j Τ r ν /ϊ5+ ttΑ
¾ kf王k^曰 ¾ \リ\ ί I — フ ノ ίしレ一 (単位 Zm 1 ) 1曰 5虫半
L—セリ ン） 濃度 （mM)
比較例 （OmM) 】 5 ± 2. 0 1 0 0
0. 0 1 1 5 ± 3. 3 1 0 0
0. 1 1 7 ± 2. 9 1 1 0
0. 3 2 4 ± 3. 5 1 6 0
1. 0 i 9 ± 1. 3 1 3 0
3. 0 2 6 ± 1. 5 1 7 0
1 0 3 2 ± 2. 2 2 1 0 平均値土標準偏差 （n = 3)
N_メチル— Lーセリ ンは、 プロコ表ラゲナーゼ産生量を増加させており、 サイ
2.
トカイン （b F GF) 活性を濃度依存的に増強していた。
試験例一 3
試験例一 1と同様に、 正常ヒ ト線維芽細胞株を播種した。
後述する実施例 2に記載のサイ ト力ィン活性増強剤 （ジエタノールァミ ン） を 0. 6% (V/V) F B Sを添加した MEM培地で 1 mMに希釈して添加溶液と した。
試験例— 1と同様にして培養後、 培養上清を得た。 ただし、 ここでは、 b FG Fの添加量を 1 0 n gZm 1 とした。 測定の結果を下記表 3に示す。
表 3 サイ トカイン プロコラゲナ一ゼ庠生量 b FGF活性 活性増強剤 (単位 Zm 1 ) 増強率 （％) 比較例 1 (精製水） 7. 3 ± 0. 3 1 0 0
.実施例 2 ( 1 mM 1 4 ± 1. 3 1 9 0
ジエタノールアミ ン）
平均値土標準偏差 （n = = 3) 実施例 2のサイ トカイン活性増強剤は、 プロコラゲナーゼ産生量を増加させて おり、 サイ トカイン （b FGF) 活性を増強していた。
試験例一 4
正常ヒ ト線維芽細胞株 〔白人女性の皮膚より採取された D e t r 0 i t - 5 5 1 (AT C C C C L 1 1 0) 〕 の細胞密度を 1 0% (V/V) F B S、 終濃 度 0. 1 % (wzv)ラク トアルブミ ン酵素水解物 （シグマ社製） 、 1 % (V/ V) 非必須アミ ノ酸および 1 mMピルビン酸ナ ト リウム （以上いずれも大日本製 薬社製） を含む MEM培地にて 1 X 1 05 個 Zm 1に調整し、 1 2穴プレー 卜に それぞれ 0. 8 m 1ずつ播種 （ 8 X 1 04 個 穴） して、 5%炭酸ガス、 飽和水 蒸気下、 37 °Cで培養した。
後述する実施例 3に記載のサイ トカイン活性増強剤 （エタノールァミ ン） を 0 . 6% (VZV) F B S、 終濃度 0. 1 % (WZV) ラク トアルブミ ン酵素水解 物、 1 % (V/V) 非必須アミ ノ酸および 1 mMピルビン酸ナ ト リウムを添加し た MEM培地で希釈して 1 mMとし、 添加溶液とした。
24時間後培養液を吸引除去し、 終濃度 0. 6% (VZV) F B Sを添加した MEM培地で細胞を 2回洗浄した後、 添加溶液 0. 8m lを加え、 4日間培養し た。
4日後、 培養液を吸引除去し、 3 n gZm l b FGF、 0. 6% (V/V) F 83、 終濃度0. 1 % (Wノ V) ラク トアルブミ ン酵素水解物、 1 % (VZV) 非必須ァミ ノ酸および 1 mMピルビン酸ナト リゥムを含む MEM培地を 0. 8 m 1添加し、 3日間培養して培養上清を得た。
得られた培養上清 250 1に 1 OmMトリス塩酸緩衝液 〔4°Cで pH 7. 8 に調整、 I mM塩化カルシウム、 0. 05 % (W/V) ブリ ッジ— 35を含む〕 を 1. 5m l加え、 同緩衝液で平衡化した CM—セファロース C L _ 6 B (商標 、 べッ ド容量 0. 5m l ) に供した。
CM—セファロース C L一 6 B (商標） からのプロコラゲナーゼの回収および プロコラゲナーゼ量の測定を、 試験例— 1と同様にして行った。 結果を下記表 4 に示す。
表 4 サイ トカイン プロコラゲナ一 b F G F活性 活性増強剤 (単位 1 ) 増強率 （％) 比較例 1 (精製水） 1 2 ± 1. 7 1 00
実施例 3 ( 1 mM 2 1 ± 1. 3 1 80
ェタノールァミ ン）
平均値土標準偏差 （n= 3) / 7 実施例 3のサイ トカイン活性増強剤は、.プロコラゲナ一ゼ産生量を増加させて おり、 サイ 卜力イ ン （b FGF) 活性を増強していた。
試験例一 5
後述する実施例 4に記載のサイ トカイン活性増強剤 （N—メチルエタノールァ ミ ン） について、 試験例— 4と同様にして b F G F活性増強を調べた。 測定の結 果を下記表 5に示す。
表 5 サイ 卜力イ ン プロコラゲナーゼ産生量 b F G F活性 活性増強剤 (単位/ m 1 ) 増強率 （ ） 比較例 1 (精製水） 6. 8 ± 0. 7 1 0 0
実施例 4 ( 1 mM N- 1 2 ± 1. 7 1 8 0
メチルエタノールァミ ン）
平均値土標準偏差 （n= 3) 実施例 4のサイ トカイン活性増強剤は、 プロコラゲナ一ゼ産生量を増加させて おり、 サイ トカイン （b FGF) 活性を増強していた。
試験例一 6
正常ヒ ト線維芽細胞株 〔白人女性の皮膚より採取された D e t r o i t - 5 5 1 (ATCC CCL 1 1 0〕 の細胞密度を 1 0% (V/V) FB S、 終濃度 1 % (V/V) 非必須アミ ノ酸および 1 mMピルビン酸ナトリウム （以上いずれ も大日本製薬社製） を含む MEM培地 （以下、 MEM 2培地と呼ぶ） にて 1 x 1 05 個ノm lに調整し、 1 2穴プレートにそれぞれ 0. 8m lずつ播種 （8 X 1 04 個ノ穴） して、 5%炭酸ガス、 飽和水蒸気下、 3 7°Cで培養した。
.後述する実施例 5に記載のサイ トカイン活性増強剤 （N—ィソプロパイル— 2 ーメチルーエタノールァミ ン） を 0. 6% (V/V) F B Sを含む MEM 2培地 で希釈して 3 mMとし、 添加溶液とした。
2 4時間後培養液を吸引除去し、 終濃度 0. 6% (V/V) F B Sを添加した MEM2培地で細胞を 2回洗浄した後、 添加溶液 0. 8m lを加え、 2日間培養 した。
2曰後、 培養液を吸引除去し、 再度添加溶液 0. 8 m 1を加えて 2日間培養し 、 計 4日間培養した。 2日後、 培養液を吸引除去し、 3 n g/m l b FGF、 0. 6% (V/V) F B Sを含む MEM 2培地を 0. 8m l添カΠし、 3日間培養して培養上清を得た。
CM—セファロース C L— 6 B (商標） からのプロコラゲナーゼの回収および プロコラゲナ一ゼの測定を、 試験例— 1 と同様にして行った。
得られた培養上清中のプロコラゲナ一ゼ産生量を定量した。 結果を下記表 6に 示す。
表 6 サイ トカイン プロコラゲナーゼ産生量 b F G F活性 活性増強剤 (単位/ m 1 ) 増強率 （％) 比較例 1 (精製水） 8. 6土 2. 3 1 0 0 実施例 5 ( 3 mM N—イソプロパノ 6 5 ± 1 3 7 6 0 ィルー 2—メチルーエタノールアミ ン）
平均値土標準偏差 （n= 3)
N—イソプロパノィルー 2—メチルーエタノールアミ ンは、 プロコラゲナーゼ 産生量を増加させており、 サイ トカイン （b FGF) 活性を増強していた。 試験例一 7
試験例一 6と同様に、 正常ヒ ト線維芽細胞株を播種した。
後述する実施例 6に記載のサイ トカイン活性増強剤 （D, L— 2—アミ ノー 1 一プロパノール） を 0. 6% (V/V) F B Sを含む MEM 2培地で希釈して 3 mMとし、 添加溶液とした。
試験例一 6と同様にして培養後、 培養上清を得た。
得られた培養上清中のプロコラゲナーゼ産生量を定量した。 結果を下記表 7に 示す。
表 7 サイ ト力イン プロコラゲナ一 b FGF活性 活性増強剤 （単位 Zm 1 ) 増強率 （％) 比較例 1 (精製水） 8. 6 ± 2 . 3 1 0 0 実施例 6 (3 mM D， L— 3 3 ± 4 . 7 3 8 0
2—アミ ノー 1一プロパノール）
平均値土標準偏差 （n = 3 ) D, L— 2—アミ ノー 1一プロパノールは、 プロコラゲナ一ゼ産生量を増加さ せており、 サイ ト力イン （b FGF) 活性を増強していた。
試験例一 8
試験例一 6と同様に、 正常ヒ ト線維芽細胞株を播種した。
後述する実施例 7に記載のサイ トカイン活性増強剤 （2—ァミ ノ— 1ーブタノ ール） を 0. 6% (V/V) F B Sを含む MEM 2培地で希釈して 3 mMとし、 添加溶液とした。
試験例 - 6と同様にして培養後、 培養上清を得た。
得られた培養上清中のプロコラゲナーゼ産生量を定量した。 結果を下記表 8に 示す。
表 8 サイ トカイン プロコラゲナーゼ産生量 b F G F活性 活性増強剤 (単位/ m 1 ) 増強率 （％) 比較例 1 (精製水） 1 2 ± 2. 2 1 0 0 実施例 7 ( 3 mM 2 - 2 2 ± 2. 4 1 9 0 アミ ノー 1—ブタノール）
平均値土標準偏差 （n = 3 )
2—アミ ノー 1ーブタノールは、 プロコラゲナーゼ産生量を増加させており、 サイ トカイン （b FGF) 活性を増強していた。
試験例一 9
試験例一 6と同様に、 正常ヒ ト線維芽細胞株を播種した。
後述する実施例 8に記載のサイ トカイン活性増強剤 （ 1 , 3—ジァミ ノー 2— プロパノール） を 0. 6% (V/V) F B Sを含む MEM 2培地で希釈して 3 m Mとし、 添加溶液とした。
試験例一 6と同様にして培養後、 培養上清を得た。
得られた培養上清中のプロコラゲナーゼ産生量を定量した。 結果を下記表 9に 示す。 サイ トカイン プロコラゲナー b F G F活性 活性增強剤 (単位 1 ) 増強率 （％) 比較例 1 (精製水） 1 2 ± 2 . 2 1 0 0 実施例 8 ( 3 mM 1 , 3— 1 8 ± 0 . 9 5 1 5 0 ジァミ ノー 2—プロパノール）
平均値 ±標準偏差 （n = 3)
1 , 3—ジァミ ノ— 2—プロパノールは、 プロコラゲナーゼ産生量を増加させ ており、 サイ トカイン （b FGF) 活性を増強していた。
試験例一 1 0
表
試験例一 6と同様に、 正常ヒ ト線維芽細 9.胞株を播種した。
後述する実施例 9に記載のサイ トカイン活性増強剤 （ 1—アミ ノー 2—ブタノ —ル） を 0. 6% (V/V) F B Sを含む MEM2培地で希釈して 3mMとし、 添加溶液とした。
試験例一 6と同様にして培養後、 培養上清を得た。
得られた培養上清中のプロコラゲナーゼ産生量を定量した。 結果を下記表 1 0 に示す。
表 1 0 サイ トカイン プロコラゲナーゼ産生量 b FGF活性 活性増強剤 (単位/ m 1 ) 増強率 （％) 比較例 1 (精製水） 8. 2 ± 2 . 0 1 0 0 実施例 9 ( 3 mM 1 - 2 4 ± 2 . 3 2 9 0 アミ ノー 2—ブタノール）
平均値土標準偏差 （n= 3)
1一アミ ノー 2—ブタノールは、 プロコラゲナーゼ産生量を增加させており、 サイ トカイン （b FGF) 活性を増強していた。
試験例一 1 1
後述する実施例 1に記載のサイ トカイン活性増強剤 （N—メチルー Lーセリ ン ) を 0. 6% (V/V) F B Sを添加した MEM培地で希釈して 1 mMとし、 添 加溶液とした。 CT/JP95/00857 試験例— 1 と同様にして添加溶液で 6日間培養した。 6曰後、 30 n gZm l P D G F - B B (オース トラル 'バイオロジカルズ社製） および 0. 6% (VZ V) F B Sを含む MEM培地を 0. 81111添カ[]し、 3日間培養して培養上清を得 た。
サイ トカイン （PDGF) 活性增強率を、 試験例一 1と同様に、 サイ 卜力イン 活性増強剤を添加した培養上清中のプロコラゲナ一ゼ産生量を X2 とし、 比較例 1として精製水を添加した培養上清中のプロコラゲナーゼ産生量を Y2 として下 式により算出した。
サイ トカイン （PDGF) 活性増強率 （％) = 〔Χ2 ΖΥ2 〕 X 1 00 得られた培養上清中のプロコラゲナ一ゼ産生量を定量した。 結果を下記表 1 1 に示す。
表 1 1 サイ トカイン プロコラゲナ一ゼ産生量 P D G F活性 活性増強剤 (単位/ m 1 ) 増強率 （％) 比較例 1 (精製水） 0. 6 1 ± 0. 1 0 1 00 実施例 1 ( 1 mM N - 4. 2 ± 2. 0 690
メチルー Lーセリ ン）
平均値土標準偏差 （n= 3) 実施例 1のサイ 卜力イ ン活性増強剤は、 プロコラゲナーゼ産生量を増加させて おり、 サイ トカイン （PDGF) 活性を増強していた。
試験例一 1 2
後述する実施例 1に記載のサイ トカイン活性増強剤 （N—メチルー Lーセリ ン ：).を 0. 6% (V/V) F B Sを添加した MEM培地で希釈して 1 mMとし、 添 加溶液とした。
試験例一 1と同様に添加溶液を添加して 6日間培養した。 培養後、 培地を除去 し、 3 n gZm I TG F— 1 (オース 卜ラル 'バイオロジカルズ社製） および 0. 6% (VZV) FB Sを含む MEM培地を 0. 8m l添力 Πし、 3日間培養し て培養上清を得た。
得られた培養上清中の T I MP産生量の測定を、 以下のようにして行った。 先ず、 培養上清を測定用緩衝液にて 1 0〜1 000倍に希釈する。 各希釈液と 既知量 （0. 24単位） のコラゲナ一ゼ溶液とを等量混合し、 F I TC—コラー ゲンを基質として、 試験例 _ 1と同様にコラゲナ一ゼ活性を測定する。 この測定 結果から阻害曲線を求め、 この阻害曲線から 50 %阻害する培養上清の希釈倍率 を求め、 この希釈倍率を単位とした。
一方、 比較例 1として、 試験例一 1と同様の操作を行った。 また、 サイ トカイ ン （TGF— 1 ) 活性増強率は、 サイ ト力イン活性増強剤を添加した培養上清 中の T I MP産生量を X3 とし、 比較例 1として精製水を添加した培養上清中の 丁 1 ^4?産生量を丫3 として下式により算出した。
サイ トカイン （TGF— 1 ) 活性増強率 （％) = 〔Χ3 ΖΥ3 〕 X 1 00 得られた培養上清中の T I MP産生量を定量した。 結果を下記表 1 2に示す。
表 1 2 サイ トカイン T I MP産生量 T G F - β 1 活性増強剤 (単位 1 ) 増強率 (%) 比較例 1 (精製水） 99 ± 9. 0 1 00 実施例 1 ( 1 mM N- 24 0 ± 2 1 2 4 0 メチルー Lーセリ ン）
平均値土標準偏差 （n= 3) 実施例 1のサイ ト力イン活性増強剤は、 T I MP産生量を増加させており、 サ イ ト力イン （TGF— jS l ) 活性を増強していた。
試験例一 1 3
後述する実施例 3に記載のサイ トカイン活性増強剤 （ェタノールァミ ン） を 0 . 6 %F B Sを含む MEM培地で 1 mMに希釈して添加溶液とし、 試験例一 1 2 と同様に培養上清を得た。 ただし、 サイ トカイン活性増強剤添加での培養期間を 4日間とし、 また TGF— /31添加 6曰後の培養上清の T I MP産生量を測定し た。
得られた培養上清の T I MP産生量を定量した。 結果を下記表 1 3に示す。 表 1 3 サイ 卜力イ ン T I MP産生量 TG F一 β 1 活性増強剤 (単位 1 ) 増強率 (%) 比較例 1 (精製水） 1 6 0 ± 3. 0 1 0 0 実施例 3 ( 1 mM 2 5 0 ± 9. 0 1 6 0 ェタノールァミ ン）
平均値土標準偏差 （n = 3 ) 実施例 3のサイ ト力イン活性増強剤は、 T I MP産生量を増加させており、 サ ィ トカイン （TGF— /3 1 ) 活性を増強していた。
試験例一 1 4
実施例 1 0 〔 8 4 mM ( 1重量％) N—メチルー L—セリ ン〕 または実施例 1 1 〔 7 5 mM ( 1重量％) N—イソプロパノィル _ 2—メチルーエタノールアミ ン〕 のク リームを、 腹部毛剃した SD系雄性ラッ ト （7週齢、 体重 2 1 0〜2 3 0 g、 1群 1 8〜2 4匹、 日本クレア社より入手） に 2 1 日間にわたり毎日塗布 後、 1 n g/m 1 b F G F (大日本製薬社製） およびへパリ ン （G i b c o B RL社製） を含むマ トリ ジヱル 〔MATR I G E L (商標） 、 基底膜マ ト リ ック ス · フヱノールレツ ドフリー、 カタログナンバー 4 0 2 3 4 C] を腹部皮下に 1 m lずつ注入し、 8日後に腹部から採取した。
採取したマ ト リ ジエルをリ ン酸緩衝液 （生理食塩水含） 中でヒスコ トロン （商 標、 日音医理科器械製作所 （株） ） にてホモゲナイズ後、 遠心し、 上清中のへモ グロビン量をヘモグロビン一テス トヮコ一 （和光純薬社製） を用いて測定した （ この値を X4 とする。 ） 。
一方、 後述する比較例 2のク リームを用い、 上記と同様の操作を行った後、 サ イ トカイン活性増強剤 （Ν—メチルー Lーセリ ン） を添加しない場合のへモグロ ビン量を測定した （この値を Υ4 とする。 ） 。 0857 表 1 4 yj し ¥乂 l'J o L
フ 11 Q
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ま兄目 - fHmi刑 ^"^ ノゾ ^フ s千ノ ァゾ ϊソ 1 ン B¾ゲノ 1ソ ί «^: ソ 《^ 0 C . π u
ノ 11 0 Λ
ノ ノ V ノ 乙 u
流動パラフ ィ ン 6. 0
メチルポリ シロキサン 0. 1
パラォキシ安息香酸プチル 0. 0 4
水酸化力リウム 0. 3 4
濃グリセリ ン 6. 0
1 3 —プチレングリコール 7. 0
セチル硫酸ナト リウム 0. 1
パラォキシ安息香酸メチル 0. 0 4
精製水 6 6. 3 8
表中の数値は gを表す。 次いで、 これらの値から下式によりサイ トカイン （b FGF) 活性増強率を算 出した。
b F G F活性増強率 （％) = 〔X4 ZY4 〕 X 1 0 0
得られたマ トリ ジ ル中のヘモグロビン量を定量した。 結果を下記表 1 5に示 す。
表 1 5 サイ トカイン へモグロビン量 b FGF活性 活性増強剤 (m ) 増強率 (%) 比較例 2 (無添加） 2 1 5 ± 2 2 1 0 0 実施例 1 0 ( 8 4 mM N-メチルー 2 6 2 ± 4 2 1 2 2
L—セリ ン）
実施例 1 1 (7 5mM N-イソプロ 2 4 5 ± 2 9 1 1 4 ノ、°ノィルー 2—メチル一エタノールアミ ン）
平均値土標準誤差 （比較例 ； n = 2 4、 実施例 1 0 ~ 1 1 ； n― 1 8)
N—メチルー Lーセリ ンおよび N—イソプロパノィルー 2—メチル一エタノー ルァミ ンは、 それぞれへモグロビン量を増加させており、 サイ トカイン （b FG F) 活性を増強していた。
試験例一 1 5 (皮膚透過性試験）
試験前日に剃毛した W i s t a r系雄性ラッ トをエーテルで屠殺後、 すみやか に腹部皮膚を剝離した。 後述する応用例— 2 8〜 3 0のク リ一 を試料と し、 図 1に示す垂直型拡散セ ル装置 （ゲルコソ · エンジニアリ ング社製、 有効面積 8 cm2 ) を用いた。 図 1に おいて、 1はテトラフルォロエチレン製ふた部、 2はサンプリ ング口、 3は薬物 試料、 4は皮膚、 5は 0—リ ング、 6はレセプター相、 7は攪拌子である。
上記の垂直型拡散セル装置を用い、 セルを 3 2 °Cの空気恒温槽中に置き、 レセ プター側には等張リ ン酸緩衝液 （ 1. 4 4 %炭酸水素ナトリウムと 2. 3 3%リ ン酸ニ水素力リゥムで調製） 4 5m lを入れ、 ドナー側のラッ ト腹部剥離皮膚に 試料 1 gを塗布し （n = 3 ) 、 1、 2、 4および 6時間後にレセプター槽の緩衝 液を 0. 2m lずつ採取し、 直ちに一 2 0°Cで冷凍保存した。
凍結試料を融解後、 1 0 mM塩酸で適当な濃度に希釈し、 ァスパラチルグリ シ ン （終濃度 4 0 M) を内部標準として加えた。 外部標準にはアミ ノ酸分析標準 液 （AN型） に、 同濃度のァスパラチルグリシンおよび N—メチルー L—セリ ン 、 エタノールァミ ンおよび N—メチルエタノールァミ ン （終濃度 1 0 /M) を添 加して用いた。 これらの検体の定量を、 0—フタルアルデヒ ド法を用いたポス ト カラム · アミ ノ酸分析法 （リチウム法） （An a l y t i c a l B i o c h e m i s t r y、 9 6巻、 2 9 8頁、 1 9 7 9年） により行った。
N—メチルー Lーセリ ンに対する結果を図 2に示す。 N—メチルー L—セリ ン
(応用例 2 8) はラッ ト皮膚を透過し、 ク リーム塗布後 2 ~ 6時間の透過速度は 約 0. 1 2〃 mo 1 /cm2 /時間であった （図 2) 。 また、 エタノールァミ ン （ 応用例 2 9) および N—メチルエタノールアミ ン （応用例 3 0) も皮膚を透過す ることが分かった （表 1 6 ) 。
表 1 6 レセプター槽中のエタノールアミ ンまたはモノメ
応用例 チルエタノールア ミ ン濃度 （ m 0 1 /m 1 )
2時間後 6時間後
2 9 0 1 5 0. 6 3
3 0 0 1 8 0. 6 9 試験例 - 1 6 (急性毒性試験）
水、 および N—メチルー Lーセリ ンの水溶液 （検体として 5 k g体重とな るように調製） を 0. 2m 1 Zk g体重 O割合で I CR系雄性マウス （5週齢、 体重 24 ~28 g、 一群 5匹） に経口投与し、 その後 7日間マウスを観察した。
N—メチルー Lーセリ ン投与群には、 対照群 （水だけを投与） と同様に、 全く 死亡例は認められなかった。
試験例一 1 Ί (皮膚累積刺激試験）
N—メチル一 L—セリ ン、 エタノールァミ ンおよび N—メチルエタノールアミ ンを、 それぞれ、 塩酸にて p H 7に調整した水溶液を試験試料とした。
日本在来種雄性家兎 （体重約 3 k g) を用い、 ドレイツ法 （Ap p r a i s a 1 o f t h e S a f e t y o f Ch em i c a l s i n F o o d s， D r a g s a n d C o sme t i c s、 4 6貝、 1 959年、 e d i t e d a n d p u b l i s h e d b y t h e D e i t o r i a 1 Co mm i t t e e, A s s o c i a t i o n o f F o o d a n d D r u
O f f i c i a l s o f U. S. A. ) に準じて試験した。
すなわち、 毛を刈り取った家兎背部 （ 3 X 4 cm) に、 試験化合物の 0. 1 % (WZV) 水溶液 0. 1 m 1を開放適用にて 1日 1回ずつ 4日間塗布した。 24 時間後、 塗布の紅斑、 浮腫、 痂皮および亀裂スコアを付けた。
表 1 7 評価基準 紅斑スコア 浮腫スコア 痂皮スコア 亀裂スコァ
A 0 0 0 0
B 1 1 1 1
C 2 2 2 2
D 3 3 3 3
A ：紅斑なし、 浮腫なし、 痂皮なしおよび亀裂なし
B ：軽度の紅斑、 浮腫、 痂皮または亀裂
C ： 中程度の紅斑、 浮腫、 痂皮または亀裂
D ： 強度の紅斑、 浮腫、 痂皮または亀裂 表 1 7に挙げた紅斑スコア、 浮腫スコア、 痂皮スコアおよび亀裂スコアを合計 して累積刺激スコアとした。
次に、 この累積刺激スコアより、 下記表 1 8の基準に基づき、 N—メチルー L ーセリ ン、 ェタノールァミ ンおよび N―メチルエタノールァミ ンの刺激度を判定 した。 結果を下記表 1 9に示す。 表 1 8 軽度刺激： 累積刺激スコア 0〜 2未満
中程度刺激 ： 累積刺激スコア 2 ~ 6未満
強度刺激 ： 累積刺激スコァ 6以上 表 1 9 試験化合物 累積刺激スコア 刺激度
N—メチル一 Lーセリ ン 0 軽 度
ェタノールァ ミ ン 0 軽 度
N—メチルエタノールアミ ン 0 軽 度
N—メチルー Lーセリ ン、 ェタノールァミ ンおよび N -メチルエタノ一ルァミ ンの皮膚に対する累積刺激性は低いことが認められた。
試験例一 1 8 (皮膚一次刺激試験、 特開平 0 4 - 1 1 3 0号公報参照）
N—メチル一 Lーセリ ン、 エタノールアミ ンおよび N—メチルエタノールアミ ンを、 それぞれ、 塩酸にて p H 7に調整した水溶液を試験試料とした。
日本在来種雄性家兎 （体重約 3 k g ) を用い、 前述のドレイツ法に準じて試験 した。
すなわち、 毛を刈り取った家兎背部に擦傷部位 （損傷皮膚） を作成し、 損傷皮 膚と正常皮膚のそれぞれに、 水 0 . l m l 、 または試験化合物の 1 % (WZ V ) 水溶液 1 m 1を、 パッチテス ト用絆創膏 （ 1 . 2 x 1 . 6 c m、 リボンエイ ド登録商標、 リバ一テープ製薬製） に浸潤させて貼付した。 2 4時間後、 絆創膏 を剥離し、 皮膚の紅斑および浮腫状態を観察し、 さらに絆創膏剥離の 4 8時間後 にも同様に観察した。 そして、 表 2 0の評価基準にてそれぞれ紅斑および浮腫ス コアを付けた。
表 2 0 評価基準 紅斑スコア 浮腫スコァ
紅斑なしおよび浮腫なし 0 0
極軽度の紅斑または浮腫 1 1
軽度の紅斑または浮腫 2 2
中程度の紅斑または浮腫 3 3
強度の紅斑または浮腫 4 4 /JP95/00857 表 2 1に挙げた各スコアを求め、 下記式により一次刺激スコアを計算した。
ADGHBCEF A + B C + D E + F G + H
一次刺激スコア = + + +
2 2 2 2
表 2 1 正常皮膚に絆創膏を貼付してから、 2 4時間後の紅斑スコア
正常皮膚から袢創膏を剥離してから、 4 8時間後の紅斑スコア 正常皮膚に絆創膏を貼付してから、 2 4時間後の浮腫スコア
正常皮膚から拌創膏を剝離してから、 4 8時間後の浮腫スコア 損傷皮膚に絆創膏を貼付してから、 2 4時間後の紅斑スコア
損傷皮膚から絆創膏を剝離してから、 4 8時間後の紅斑スコア 損傷皮膚に絆創膏を貼付してから、 2 4時間後の浮腫スコア
損傷皮膚から絆創膏を剝離してから、 4 8時間後の浮腫スコァ 次に、 一次刺激スコアより下記表 2 の基準に基づき、 N—メチルー Lーセリ ンの刺激度を判定した。 結果を下記表 2 3に示す。
表 2 2 軽度刺激 ： 一次刺激スコア 0〜 未満
中程度刺激 ： —次刺激スコア 2 ~ j未 i¾
強度刺激 ： 一次刺激スコア 5以上 表 2 3 試験化合物 一次刺激スコア 刺激度
N—メチル一 Lーセリ ン 0 軽度
エタノールアミ ン ΰ 軽度
N -メチルエタノールァミ ン 0. 2 5 軽度
Ν—メチル一L—セリ ン、 エタノールァミ ンおよび Ν—メチルエタノールアミ ンの皮膚刺激性は低いことが認められた （特開平 4 - 1 1 3 0号公報参照） 。 試験例 - 1 9 (皮膚刺激性試験）
Ν—メチルー Lーセリ ン、 エタノールァミ ンおよび Ν—メチルエタノールアミ ンを、 それぞれ、 塩酸にて ρ Η 7に調整した水溶液を試験試料とした。 また、 健 常人 1 9名を被検者とした。
クローズドハ。ツチテス ト法 （J o u r n a l o f t h e S o c i e t y o f C o sme t i c C h em i s t、 3 1巻、 9 7頁、 1 9 8 0年） に より、 被検者の前腕部に K Iチヤ ンバーを用いて、 試験化合物の 1 % (W/V) 水溶液 0 . 0 5 m 1 を 2 4時間閉塞貼付し、 パッチ除去 1時間後および 2 4時間 後の皮膚反応を観察した。
N —メチル一 L—セリ ン、 エタノールァミ ンおよび N—メチルエタノールアミ ンのいずれのパッチテス 卜においても、 パッチ除去 1時間後および 2 4時間後の 両時点で 1名の被検者に軽微な紅斑が認められただけで、 皮膚刺激性はほとんど ないと判断された。
以下に、 本発明の実施例を挙げて、 さらに説明する。
実施例 1 ( N—メチルー Lーセリ ン）
1 Mの N —メチルー Lーセリ ン水溶液をポア一サイズが 0 . 2 〃mのニトロセ ルロース膜 （ア ドヴアンテツク東洋社製、 D I S M I C— 2 5 ) で濾過滅菌し、 サイ トカイン活性増強剤を得た。
実施例 2〜 4 (ジエタノールァミ ン、 エタノールァミ ンおよび N _メチルェタノ ールァミ ン）
塩酸で p H 7 . 5に調整したジェタノ一ルァミ ン、 エタノールァミ ンまたは N -メチルエタノールァミ ン 1 M溶液を用い、 氷冷下にて行う以外は、 実施例 1 と 同様にして、 サイ トカイン活性増強剤を得た。
実施例 5〜9 ( N—イソプロパノィルー 2—メチルーエタノールァミ ン、 D , L 一 2 —アミ ノー 1 一プロパノール、 2—ァミ ノ一 1 ーブタノ一ル、 1 , 3—ジァ ミ ノー 2 —プロパノールおよび 1 ーァミ ノ _ 2—ブ夕ノール）
氷冷下に、 N—イソプロパノィルー 2 —メチル—エタノールァミ ン、 D , L— 2 —アミ ノー 1 一プロパノール、 2—ァミ ノ一 1 ーブタノール、 1 , 3—ジアミ ノ一 2 _プロパノールおよび 1 —アミ ノー 2 —ブ夕ノールを、 それぞれ、 p H 7 . 5に塩酸で調整して 1 M溶液とし、 ポア一サイズが 0 . 2 ;t/ mのニトロセル口 ース膜 （ァドヴァンテツク東洋社製、 D I S M I C— 2 5 ) で濾過滅菌し、 サイ トカイン活性増強剤を得た。
実施例 1 0 ~ 1 1 (ク リーム）
1 0 0 g中に有効成分と して N—メチル— L—セリ ン （実施例 1 ) または N— イソプロパノィルー 2 —メチルーエタノールアミ ン （実施例 5 ) 1 0 0 0 m gを 含有するクリ一ムを表 2 4の通りに調製した。 表 2 4
Figure imgf000029_0001
N—メチル一 L—セリ ンまたは N—イソプロパノィルー 2—メチルーエタノー ルァミ ンと、 パラォキシ安息香酸メチル、 水酸化力リゥム、 濃グリセリ ン、 1 , 3—ブチレングリ コール、 セチル硫酸ナト リウムおよび精製水とを湯浴で 8 0 °C に加温して混合し、 この混合物を、 8 (1 °Cに加温したステアリ ン酸、 セタノール 、 親油型モノステアリ ン酸グリセリ ン、 ラノ リ ン、 流動パラフィ ン、 メチルポリ シロキサンおよびパラォキシ安息香酸ブチルの混合物中に攪拌しながら徐々に加 えた。 次に、 ホモジナイザー （TOKU S HUK I KA I KOGYO製） で 2. 5分間激しく攪拌し （ 2 5 0 0 r pm) 、 各成分を十分乳化分散させた後、 攪拌 しながら徐々に冷却してク リームを得た。 .
比較例 2
N—メチルー Lーセリ ンまたは N—イソプロパノィルー 2—メチルーエタノー ルアミ ンを加えず、 精製水を 6 6. 3 8 gとする以外は、 実施例 1 0 ~ 1 1 と同 様にして、 比較例 2のク リームを得た。
実施例 1 2~ 1 4 (錠剤） 表 2 5の成分 （A) の混合物に、 成分 .（B) を 3 0 gの水に溶解して加え、 十 分練合した。 この練合物を 2 0メ ッシュの篩に通して顆粒状に造粒粒し、 乾燥し た後、 得られた顆粒に成分 （C) を混合し、 1錠 2 0 O mgに打錠することによ つて、 1錠中に有効成分を 1 0 O mg含有する錠剤を調製した。
表 2 5
Figure imgf000030_0001
実施例 1 5~2 0 (カプセル剤）
表 2 6の各成分を充分混合し、 混合物の 3 0 0 mgずつを 2号カプセルに充塡 して、 1カプセル中に有効成分を 1 0 0 m g (実施例 1 5 ~ 1 7 ) または 2 0 0 mg (実施例 1 8~2 0 ) 含有するカプセル剤を調製した。
表 2 6
Figure imgf000030_0002
実施例 2 1 ~2 6 (顆粒剤）
表 2 7の成分 （A) の混合物に、 水 1 0 0 0 gに溶解した成分 （B) を加え. 十分練合した。 この練合物を 2 0メ ッ シ の篩に通して造粒し、 乾燥し、 整粒を 行うことによって、 1 g中に有効成分を 3 0 m g (実施例 2 1 ~2 3) または 3 00 mg (実施例 24 - 26 ) 含有する顆粒剤を調製した。
表 2 7
Figure imgf000031_0001
実施例 27 ~29 (シロップ剤）
精製水 4 0 Om 1に 90°Cで表 28中の成分 （B) を加えて溶解し、 次いで成 分 （C) を同温で加え、 十分混合してから 30°Cまで冷却した。 この混合物に成 分 （A) を精製水 1 00m lに溶解して加え、 30°Cで 30分間攪拌した。 次に 、 成分 （D) を加え、 20分間攪拌し、 精製水を加えて全量 1 00 Om 1とし、 無菌濾過を行うことによって、 1 m l中に有効成分を 1 0 Omg含有するシロッ プ剤を調製した。
表 2 8
Figure imgf000032_0001
実施例 3 0~5 3 (注射剤）
下記の表 2 9に示す量のサイ ト ィン活性増強剤を、 注射用精製水 （ 1 0 %ヒ ト血清アルブミ ンおよび 2 0 %マンニトールを含む） に溶解して 2 0 0 m 1の溶 液と し、 無菌濾過による除菌を行った。 N—メチルー L—セリ ン、 エタノールァ ミ ンおよびジエタノールァミ ンの場合は、 除菌した溶液 1 0 m l容量のバイャル 瓶に 2 m lずつ分注した。 無菌的に窒素置換し、 打栓し、 注射剤を得た。 N—メ チルエタノールアミ ン、 N—イソプロパノィル一 2 _メチル一エタノールアミ ン 、 D, L— 2—ァミ ノ _ 1 一プロパノール、 2—アミ ノ ー 1 ーブ夕ノール、 1 , 3—ジアミ ノ ー 2—プロパノールおよび 1 一アミ ノ ー 2—ブタノールの場合は、 除菌した溶液を 3 m 1容量の褐色アンプルに 2 m 1ずつ分注し、 アンプルを溶封 して注射剤を得た。 尚、 表中の有効成分量は、 1バイャル中または 1 アンプル中 の N—メチル一 Lーセリ ン、 エタノールァミ ン、 ジエタノールァミ ン、 N—メチ ルエタノールアミ ン、 N—イソプロパノィル一 2—メチルーエタノールアミ ン、 D, L— 2—ア ミ ノ ー 1 —プロパノール、 2—ァミ ノ 一 1 ーブ夕ノール、 1. 3 —ジアミ ノー 2—プロパノールまたは 1 —ァミ ノ一 2—ブ夕ノールとしての量を 表す。 表 2 9
Figure imgf000033_0001
実施例 5 4〜7 1 (軟膏剤）
表 3 0および 3 1中の成分 （A) を湯浴で 8 0°Cに加温して混合し、 この混合 物を、 8 0°Cに加温した成分 （B) 中に攪拌しながら徐々に加えた。 次に、 ホモ ジナイザー （TOKU S HUK I KAKOGYO製） で 2. 5分間激しく攪拌し ( 2 5 0 0 r pm) 、 各成分を十分乳化分散させた後、 攪拌しながら徐々に冷却 し、 最後にエタノールァミ ン誘導体と b F G Fまたは a F G Fとを添加すること によって、 1 0 0 g中に有効成分 5 0 O mgと b F G F 2 mgとを （実施例 5 4 〜 6 2 ) 、 または有効成分 l O O O m gと a F G F O . 2 m gとを （実施例 6 3 〜7 1 ) 含有する軟膏を調製した。
表 3 0
Figure imgf000035_0001
1 ) 商品名 N I K K 0 L M Y S 4 5、 日本サ一ファ クタ ン ト工業株式会社製
2 ) 商品名 N I K K 0 L D D P 2、 日本サーフ ァ ク タ ン ト工業株式会社製 表中の数値は gを表す。
表 3 1 実 施 例
Figure imgf000036_0001
1 ) 商品名 N I KKOL MYS - D > 小"r—ノ アング ノ 卜丄荣休；！
2) 商品名 N I KKOL DDP _ 2、 日本サーファクタント工業株式会社製
表中の数値は gを表す。
以下に、 応用例を示す。 表中の数値は、. 特記しない限り、 重量％を表す。 用例 1〜 2 7
1 0 0 g中に有効成分として N—メチル— L—セリ ン （応用例 1、 1 0および 1 9 ) 、 ジェタノールァミ ン （応用例 2、 1 1および 2 0 ) 、 エタノールァミ ン (応用例 3、 1 2および 2 1 ) 、 N—メチルエタノールァミ ン （応用例 4、 1 3 および 2 2 ) 、 N—イソプロパノィル一 2 _メチル一エタノールァミ ン （応用例 5、 1 4および 2 3 ) または D, L— 2—ァミ ノ— 1 _プロパノール （応用例 6
、 1 5および 2 4 ) 、 2—アミ ノー 1 —ブ夕ノ ール （応用例 7、 1 6および 2 5
) 、 1 , 3—ジアミ ノー 2—プロパノール （応用例 8、 1 7および 2 6 ) または 1 一アミ ノー 2—ブタノール （応用例 9、 1 8および 2 7 ) を 1 0 0、 2 0 0ま たは 4 0 O mg含有するローショ ンを表 3 2および 3 3の通りに調製した。
表 32 応 用 例
Figure imgf000038_0001
1)商品名ピナソール ΝΑΑ 48. 曰棚旨 会翻
表中の数値は gを表す。
表 33 応 用 例
Figure imgf000039_0001
1 )商品名ピナソール N A A 48- 曰棚旨赋会簡
表中の数値は gを表す。
表中の有効成分と、 成分 （A) を湯浴で 8 0°Cに加温して混合した。 一方、 成 分 （B) も同様に 8 0°Cに加温して混合し、 この混合物へ前者の混合物を攪拌し 合
ながら徐々に加え、 ホモジナイザー （TOKUSHUK I KA I KOGYO製）
-一
で 2. 5分間激しく攪拌した （2 5 0 0 r pm) 。 攪拌しながら徐々に室温まで 冷却してローショ ンを得た。
応用例 2 8~3 0
表 3 4に示す組成でク リームを調製した。
表 3 4 応 用 例
成 分
2 8 2 9 3 0 セタノ一ル 3 3
親油型モノステアリ ン酸グリセ 1ノ ン 2.5 2.5
A ポリオキシエチレンセチルエー亍ル 1.5 1.5
( 2 0 E. 0. ')
流動パラフィ ン 10 10 10
ト リ— 2—ェチルへキサン酸グリセリ ン 5 5 5
メチルポリ シロキサン 1 1 1
B パラォキシ安息香酸ブチルエステル 0.1 0.1 0.1
パラォキシ安息香酸メチルエステル 0.15 0.15 0.15
C ェデト酸ニナ ト リ ウム 0.1 0.1 0.1
N—ステアロイルー Lーグルタ ミ ン酸 0.9 0.9 0.9 ナ ト リ ウム
ジプロピレングリ コール 5 5 5
D N—メチル一 L—セリ ン 2 0 0
ェタノールァミ ン 0 2 0
N—メチルェタノールァミ ン 0 0 2
水 残量
100 100 100 表中の数値は重量％を示す。 成分 （Α) を 8 0°Cで均一に混合溶解した後、 それに成分 （B) を混合溶解し た （混合液 I ) 。 これとは別に、 成分 （D) を 8 0 °Cで均一に混合溶解後、 それ に成分 （C) を混合溶解した （混合液 II) 。 次に、 混合液 Iに、 徐々に混合液 II を加え、 十分攪拌しながら 3 0°Cまで冷却し、 ク リームを得た。 応用例 3 1 トニック）
表 3 5 サリチル酸 0. 1
ジエタノールアミ ン 0. 0 1
プロピレングリ コール 3. 0
グリチルレチン酸 0. 0 1
1一メ ン トール 0. 1
エタノール 5 0. 0
ヒ ト P D G F (Collaborative Res. Inc.社製 ： 0. 0 5
0. 0 1 %水溶液）
香料 適量
精製水 残量
1 0 0重量％ 応用例 3 2 (ヘアー トニック）
表 3 6
N—メチル一Lーセリ ン 0. 1
ェタノールァミ ン 0. 0 0 1
エタノール 4. 0
イソプロパノール 1. 0
香料、 防腐剤 適量
精製水 残量
1 応用例 3 3 (エアゾルタイプの皮膜剤）
表 3 7 ェチルセルロース 7. 5
N—メチルー L—セリ ン 0. 2
グリセリ ン 1. 0
ハッ力油 0. 3
エタノール 3 0. 9 8
ヒ ト P D G F (Collaborative Res. Inc.社製 ： 0. 0 2
0. 0 1 %水溶液）
噴射剤 （ジメチルエーテル） 6 0. 0
1 0 0重量％ 応用例 3 4 (入浴剤）
N—メチルー Lーセリ ン 3 gと下記成分とを混合し、 入浴剤 1 0 0 gを得た, 表 3 8
香料 0 . 1
有機色素 0 . 0 1
炭酸水素ナ ト リウム 1 4 . 9
硫酸ナ ト リウム 8 1 . 6 9
ァスコルビン酸硫酸エステル 2ナ ト リ ゥム塩 0 . 3 尚、 この入浴剤は使用時に約 3 0 0 0倍に希釈される。
産業上の利用可能性
本発明のサイ トカイン活性増強剤は、 皮膚細胞に作用して、 サイ 卜力インに対 する応答性を高め、 皮膚代謝を賦活することができる。 また、 一般式 （ I ) で表 されるエタノールァミ ン誘導体またはその塩は、 皮膚を透過しうるので、 局所的 にサイ トカインの作用を増強することができる。 さらに、 エタノールアミ ン誘導 体またはその塩は、 毒性は低く、 全身投与においてもサイ トカインの作用を増強 することができる。 従って、 一般式 （ 1 ) のェタノールァミ ン誘導体およびその 塩は、 サイ トカイン活性増強剤として有用である。

Claims

請 求 の. 範 囲
1. 下記一般式 （ I ) で表されるエタノールアミ ン誘導体またはその塩を含有 するサイ トカイン活性増強剤。
1\ 2 IS.3
R, -NH-CH-CH-OH ( I )
(式中、 は H、 一 CH3 、 一 CH2 CH (C H3 ) OHまたは一 CH2 CH 2 OHであり、 R2 は H、 一 CH3 、 一 CH2 CH3 または— COOHであり、 R3 は H、 - C H3 、 — CH2 CH3 または一 CH2 NH2 である）
2. 一般式 （ I ) において、 が Hであり、 R2 が H、 - C H3 または— C H2 CH3 であり、 R3 が H、 - CH3 、 一 CH2 CH3 または一 CH2 NH2 である、 請求項 1記載のサイ トカイン活性増強剤。
3. —般式 （ I ) において、 R, がー CH3 であり、 R2 が _ C 00Hであり 、 R3 が H、 - CH3 、 一 CH2 CH3 または— CH2 NH2 である、 請求項 1 記載のサイ トカイン活性増強剤。
4. 一般式 （ I ) において、 が— CH3 、 - CH2 CH (CH3 ) OHま たは一 CH2 CH2 OHであり、 R2 が Hであり、 R3 が H、 —CH3 、 _CH 2 CH3 または一 CH2 NH2 である、 請求項 1記載のサイ 卜力イン活性増強剤
5. 下記一般式 （ I ) で表されるエタノールアミ ン誘導体またはその塩と、 サ ィ トカインまたはサイ トカイン産生促進物質とを含有するサイ トカイン活性増強 剤。
K 2 1\ 3
R, -NH-CH-CH-OH ( I )
(式中、 R, は H、 - CH3 、 一 CH2 CH (C H3 ) OHまたは一 CH2 CH 2 OHであり、 R2 は H、 一 CH3 、 - C H2 CH3 または—COOHであり、 R3 は H、 一 CH3 、 一 CH2 CH3 または _CH2 NH2 である）
6. 一般式 （ I ) で表されるエタノールアミ ン誘導体が、 N—メチルー Lーセ リ ン、 ジェタノールァミ ン、 エタノールァミ ン、 N—メチルエタノールアミ ン、 N—イソプロパノィルー 2 —メチル一エタノールァミ ン、 D, L— 2 —アミ ノー 1 —プロパノール、 2 —アミ ノー 1 —ブ夕ノール、 1， 3 —ジアミ ノー 2 —プロ パノールおよび 1 ーァミ ノ— 2 —ブタノールからなる群から選ばれる、 請求項 1 ~ 5のいずれかに記載のサイ ト力ィン活性増強剤。
7. 請求項 1 ~ 6のいずれかに記載のサイ トカイン活性増強剤を有効成分とし て含有する、 サイ トカインの働きが低下した疾病の治療剤。
8. サイ ト力インが、 レセプターの少なく とも 1つのサブユニッ トにチロシン キナーゼ、 またはセリ ンもしく はスレオニンリ ン酸化またはキナーゼ活性を有す るものである、 請求項 7記載のサイ トカインの働きが低下した疾病の治療剤。
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