WO1995025794A1

WO1995025794A1 - Anticorps monoclonal anti-igf-i

Info

Publication number: WO1995025794A1
Application number: PCT/JP1994/001789
Authority: WO
Inventors: Yoshitake Terano; Kazumori Yamamoto; Akiko Tomii; Shinji Harukaze; Kyoichi Matsumoto; Tomohiro Samori
Original assignee: Japan Clinical Laboratories
Priority date: 1994-03-23
Filing date: 1994-10-25
Publication date: 1995-09-28
Also published as: EP0700994A1

Description

明細書抗 I G F— I モノクローナル抗体技術分野

本発明は、モノクローナル抗体に関し、さらに詳細には、免疫反応系においてインシユリン様成長因子一 II、インシユリンおよびプロインシユリンと反応せずに、インシユリン様成長因子一 I の C鎖と特異的に反応するモノクローナル抗体およびその利用に関する。背景技術

インシユリン様成長因子— I (Insul in-1 ike Growth Factor 一 I 以下 I G F— I と略記することがある。）は 7 0個のアミノ酸残基からなるポリペプチドであり、そのアミノ酸配列はすでに知られている。この物質は、インシユリン様活性、成長促進作用、神経系、腎臓、消化器、赤血球、甲状腺、副腎、乳腺、筋肉および血管系等に対して種々の生理活性を示す。また、末端肥大症や下垂体機能低下症、低身長をきたす種々の病態、低栄養状態、肝障害、甲状腺機能低下症、糖尿病等では、 I G F— I の血中濃度が異常を示すことも知られている（医学のあゆみ. 1 6 5巻. 5号. 2 6 4〜 2 6 8 頁. 1 9 9 3年）。さらに、インシユリン抵抗性の糖尿病ではィンシュリンの血中濃度が増加しているにもかかわらず I G F— I の血中濃度が低下している症例が認められ（同 3 5 0〜 3 5 3ページ） - 臨床的に注目されている。このため、血中 I G F— I濃度を測定する方法が種々開発され、現在では、ラジオィムノアッセィ（ザップら，ジャーナルォブクリニカルインべスティゲーシヨン 6 8卷. 1 3 2 1〜 1 3 3 0頁. 1 9 8 1年）が広く行われている。発明の開示

しかしながら、この測定方法では放射性同位元素を使用するため取り扱いには特別の設備を必要とするので、簡便な測定方法の開発が望まれていた。また、 I G F— I は、プロインシュリン、インシュリンおよびインシュリン様成長因子— Π (以下 I G F— Π と略記することがある）と相同性を示すため、これらと交差性を示さないモノクローナル抗体の開発が望まれていた。

従って本発明は、免疫反応法において、実質的にインシュリン様成長因子一 I I、インシユリンおよびプロインシユリンと反応せず、インシュリン様成長因子一 I の C鎖と特異的に反応するモノクロ一ナル抗体（ I ) を提供する。

本発明はさらに、インシユリン様成長因子— I の C鎖以外のェピトープおよび I G F— I Iとの共通ェピトープと反応するモノクローナル抗体（I I ) を提供する。

本発明はまた、上記モノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ細胞ラインを提供する。

本発明はさらに、少なくとも次の工程：

(1 ) インシユリン様成長因子一 I で免疫反応に関与する固相表面を覆う工程；

(2) 予め被検試料を、第 1 抗体として、前記のモノクローナル抗体 ( I ) と反応させる工程；

(3) 第 1 抗体と予め反応させた被検試料を系に添加して、未反応の第 1 抗体を固相表面に固定されたインシユリン様成長因子一 I と反応させる工程；

(4) 固相表面に固定されたインシユリン様成長因子— I を介して固定された第 1 抗体と、第 2抗体として、第 1 抗体のクラスもしくはサブクラスに特異的なピオチン標識抗体を反応させる工程； (5) 固相表面に固定されたインシュリン様成長因子一 I および第 1 抗体を介して固定された第 2抗体のビォチン部分を、標識酵素として、アルカリフォスファターゼまたはパーォキシダーゼで標識したアビジンもしくはストレブトアビジンと反応させる工程；

(6) 固定された標識酵素に基質を加えて酵素反応を行うことにより - 標識をカウン卜する工程；並びに

(7) 被検試料の標識のカウントを、予め測定されたインシュリン様成長因子一 I に対する標準曲線と比較することにより、被検試料中のインシユリン様成長因子— I 濃度を測定する工程；

を含んで成るィンシュリン様成長因子一 I の免疫化学的測定方法を提供する。

本発明はまた、少なくとも次の工程：

(1 ) 第 1 抗体として、前記のモノクローナル抗体（ I ) で固相表面を覆う工程；

(2) 被検試料を系に添加して、固定された第 1 抗体と試料中のインシュリン様成長因子一 I を反応させる工程；

(3) 固相表面に固定された第 1抗体を介して固定されたインシユリン様成長因子一 I と、第 2抗体として、前記モノクローナル抗体

( I I ) を反応させる工程；

(4) 固相表面に固定された第 1抗体およびインシユリン様成長因子一 I を介して固定された第 2抗体と、第 3抗体として、第 2抗体にのみ特異的なピオチン標識抗マウス I g Gサブクラス抗体と反応させる工程；

(5) 固相表面に固定された第 1 抗体、インシュリン様成長因子一 I および第 2抗体を介して固定された第 3抗体のピオチン部分を、標識酵素として、アルカリフォスファターゼまたはパーォキシダーゼで標識したァビジンもしくはストレブトァビジンと反応させる工程 (6) 固定された標識酵素に基質を加えて酵素反応を行うことにより標識をカウントする工程；並びに

(7) 被検試料の標識のカウントを、予め測定されたインシュリン様成長因子一 I に対する標準曲線と比較することにより、被検試料中のインシユリン様成長因子一 I 濃度を測定する工程；

を含んでなるインシユリン様成長因子一 I の免疫化学的測定方法を提供する。

本発明はさらに、少なくとも次の工程：

(1) 第 1 抗体として、前記モノクローナル抗体（I I ) で固相表面を覆う工程；

(2) 被検試料を系に添加して、固定された第 1 抗体と試料中のインシユリン様成長因子— I を反応させる工程；

(3) 固相表面に固定された第 1 抗体を介して固定されたインシユリン様成長因子一 I と、第 2抗体として、モノクローナル抗体（ I ) を反応させる工程；

(4) 固相表面に固定された第 1 抗体およびインシュリン様成長因子 — I を介して固定された第 2抗体と、第 3抗体として、第 2抗体にのみ特異的なピオチン標識抗マウス I g Gサブクラス抗体を反応させる工程；

(5) 固相表面に固定された第 1 抗体、インシュリン様成長因子一 I および第 2抗体を介して固定された第 3抗体のピオチン部分を、標識酵素として、アルカリフォスファターゼまたはパーォキシダーゼで標識したァビジンもしくはストレプトアビジンと反応させる工程

(6) 固定された標識酵素に基質を加えて酵素反応を行うことにより . 標識をカウントする工程；並びに

(7) 被検試料の標識のカウントを、予め測定されたインシュリン様成長因子一 I に対する標準曲線と比較することにより、被検試料中のインシユリン様成長因子一 I 濃度を測定する工程；を含んでなるインシュリン様成長因子— I の免疫化学的測定方法を提供する。

本発明はさらに、少なくとも次の工程：

(1 ) 第 1 抗体として、前記モノクローナル抗体（ I ) で固相表面を覆う工程；

(3) 固相表面に固定された第 1 抗体を介して固定されたインシユリン様成長因子一 I と、第 2抗体として、ピオチン標識した前記モノクローナル抗体（Π ) を反応させる工程；

(4) 固相表面に固定された第 1 抗体およびインシユリン様成長因子 — I を介して固定された第 2抗体のビォチン部分を、標識酵素として、アルカリフォスファターゼまたはパーォキシダーゼで標識したアビジンもしくはストレブトァビジンと反応させる工程；

(5) 固定された標識酵素に基質を加えて酵素反応を行うことにより . 標識をカウントする工程；並びに

(6) 被検試料の標識のカウントを、予め測定されたインシュリン様成長因子一 I に対する標準曲線と比較することにより、被検試料中のインシユリン様成長因子一 I 濃度を測定する工程；

を含んでなるインシュリン様成長因子— I の免疫化学的測定方法を提供する。

本発明はまた、少なくとも次の工程：

(1) 第 1抗体として、前記モノクローナル抗体（I I ) で固相表面を覆う工程；

(2) 被検試料を系に添加して、固定された第 1抗体と試料中のインシュリン様成長因子一 I を反応させる工程； (3) 固相表面に固定された第 1 抗体を介して固定されたインシュリン様成長因子一 I と、第 2抗体として、ピオチン標識した前記モノクローナル抗体（ I ) を反応させる工程；

(4) 固相表面に固定された第 1 抗体およびインシユリン様成長因子一 I を介して固定された第 2抗体のピオチン部分を、標識酵素として、アルカリフォスファターゼまたはパーォキシダーゼで標識したアビジンもしくはストレプトアビジンと反応させる工程；

(5) 固定された標識酵素の基質を加えて酵素反応を行うことにより . 標識を力ゥン卜する工程；並びに

(6) 被検試料の標識のカウントを、予め測定されたインシュリン様成長因子— I に対する標準曲線と比較することにより、被検試料中のインシユリン様成長因子一 I 濃度を測定する工程；

本発明はさらに、前記モノクローナル'抗体（ I ) と、前記モノクローナル抗体（I I ) の計 2種類のモノクローナル抗体を含んで成る, インシュリン様成長因子一 I の免疫化学的測定に用いるキットを提供する。

本発明はまた、前記モノクローナル抗体（ I ) と、前記モノクローナル抗体（I I ) のうち、どちらか一方がピオチン化されている計 2種類のモノクローナル抗体を含んで成る、インシユリン様成長因子一 I の免疫化学的測定に用いるキットを提供する。図面の簡単な説明

図 1 は、評価例 4 において、抗体 2 1 3 D 9および抗体 1 7 B 2 の抗体の力価を測定した図である。 X軸は用いた抗体の希釈倍数、 Y軸は 4 0 5 n mの吸光度を示す。図中、白丸は第 1 抗体が抗体 2 1 3 D 9、第 2抗体がピオチン化ャギ抗マウス I g G 2 b抗体の場合のデータ、白四角は第 1抗体が抗体 2 1 3 D 9、第 2抗体がピオチン化ヒッジ抗マウス I g抗体の場合のデータ、黒丸は第 1抗体が抗体 1 7 B 2、第 2抗体がビォチン化ャギ抗マウス I g G 1抗体の場合のデータ、黒四角は第 1抗体が抗体 2 1 3 D 9、第 2抗体がビォチン化ヒッジ抗マウス I g抗体の場合のデータを示す。

図 2は、実施例 4における抗体 1 7 B 2を用いる I G F— I定量の標準曲線を示す。 X軸は試料中の I G F— I濃度（n gZin l ) を示し、 Y軸は 4 0 5 nmの吸光度を示す。図中、黒丸は第 1抗体が抗体 1 7 B 2、第 2抗体がピオチン化ャギ抗マウス I g G 1ャギ抗体の場合のデータ、黒四角は第 1抗体が抗体 2 1 3 D 9、第 2抗体がピオチン化ヒッジ抗マウス I g抗体の場合のデータを示す。図 3は、評価例 5における抗体の反応性を検討した図である。 X 軸は添加した抗体の希釈倍数を示し、 Y軸は 4 0 5 nmの吸光度を示す。図中、黒丸は、 I G F— I に抗体 2 7 E 1 0を反応させた場合、黒四角は、 I G F— I 一 Cフラグメント〔3 0— 4 1〕に抗体 2 7 E 1 0 と反応させた場合、白丸は、 I G F— Iに抗体 1 6 G 4 を反応させた場合、白四角は、 I G F— I — Cフラグメント〔3 0 一 4 1〕に抗体 1 6 G 4を反応させた場合のデータである。

図 4は、実施例 6における 2抗体法による I G F— I定量の標準曲線を示す。 X軸は試料中の I G F— I濃度（n gZm l ) を示し. Y軸は 4 0 5 nmの吸光度を示す。図中、黒丸は第 1抗体に抗体 2 7 E 1 0、第 2抗体にピオチン化した抗体 1 6 G 4を用いた場合、黒四角は第 1抗体に抗体 2 1 3 D 9、第 2抗体にピオチン化した抗体 1 6 G 4を用いた場合、白丸は第 1抗体に抗体 2 7 E 1 0、第 2 抗体にピオチン化した抗体 2 2 G 4を用いた場合、白四角は、第 1 抗体に 2 1 3 D 9、第 2抗体にピオチン化抗体 2 2 G 4を用いた場合のデータである。具体的な説明

本発明者らは、放射性同位元素を使用しない測定法として E L I S A (Enzyme- 1 inked immunosorbent assay) に汪目し、 I G F— I に特異的であり、 E L I S Aで充分な力価を示すモノクローナル抗体を生産するハイプリドーマを得るべく鋭意研究した結果、この目的にかなうハイプリドーマを得て、本発明を完成した。すなわち、 I G F - I結合ゥシ血清アルブミン（以下 B S A— I G F - I と略す）および I G F— I結合卵白血清アルブミン（以下 OVA— I G F— I と略す）を免疫原としてマウスを免疫し、感作されたマウスの脾臓細胞をミエローマ株（P₃-X63-Ag₈- ）（以下、 P₃ U 1 と略記することがある）と細胞融合して、ハイプリドーマを作製した。このハイプリドーマの培養上清の抗体価を E L I S A法で測定し、高力価を示すハイプリドーマを選択した。次いで、得られたハイブリドーマをマウスの腹腔内で培養し、その腹水上清を硫安沈澱、セフアデックス G— 2 5 M (フアルマシア製）およびプロテイン G— セファロース（フアルマシア製）で精製して、モノクローナル抗体を得た。これらのモノクローナル抗体は、高い力価を示し、 E L I S A法による I G F— I定量を可能とするものであった。

本発明に従って、モノクローナル抗体を得るには、次のようにすれば良い。すなわち、先ず B A L B c等のマウスを免疫原で免疫する。免疫原としては I G F— Iをそのまま抗原として用いても良いが、好ましくは免疫原性を高めるために、例えばゥシ血清アルブミン、卵白アルブミン、キーホールリンペットへモシァニン（KL H) 、サイログロブリンおよび金属コロイド（例えば、金コロイド, 鉄コロイド等）等の高分子キャリアーと結合させて免疫する。抗体産生を高めるために、免疫は適当なアジュバント〔例えば、初回免疫の場合はフロイントの完全アジュバント（F CA) 、追加免疫の場合はフロイン卜の不完全アジュバント（F I CA) 〕と共に油中水（w/o) 型ェマルジヨンで行い、初回免疫に加えて 1〜 5回

(好ましくは 3〜 4回）の追加免疫を行うことが望ましい。

最終免疫の後、 7〜 1 0 日後に眼底静脈叢より試験採血し、血清抗体の力価を E L I S A法で測定し、感作されたマウスを選択する < 選択したマウスは、細胞融合を実施する 3 日前に、抗原の水溶液を尾静脈内に注射する。細胞融合を実施する直前に、マウスを脱血して血液を回収し、血清を分離してアツセィ用対照血清として凍結保存する。脱血マウスは直ちに腹部切開して、無菌的に脾臓を摘出し- 常法（ケーラーら. ネイチヤー. 2 5 6巻. 4 9 5〜 4 9 7頁. 1 9 7 5年）に従ってハイプリドーマを調製する。

次いで、この得られたハイプリドーマを HAT培地を用いて選択的に培養し、その上清を E L I S A法により I G F— I に対する特異扰体の力価を測定して、瀉カ価のハイプリドーマを選択する。次いでこれを限界希釈法もしくは軟寒天ゲル内コロニー法でクローンを選択し、ハイプリドーマの培養上清について、 I G F— Iの他に. インシュリン、プロインシュリンおよび I G F— IIに対する免疫学的交差反応性を調べて、 I G F— I単独もしくは I G F— Iおよび

I G F— IIを認識し、その他と交差反応しないものを選択する。このようにして得られたハイプリドーマクローンを培養して、その上清の抗体力価を E L I S A法で測定すると共に、 E L I S A法で抗体のクラス、サブクラスおよびタイプを決定する。

このようにして得たハイプリドーマクローンを、予め腹水誘発剤を腹腔内に注射しておいたマウスの腹腔内で培養して得られる腹水上清から、常法に従って抗体を精製してモノクローナル抗体を得ることができる。得られたモノクローナル抗体は、常法に従って E L I S A法による I G F— Iの測定に用いることができる。また、このモノクローナル抗体に加えて、 E L I S Aに用いられる通常の試薬である、ピオチン化抗マウス免疫グロブリンャギ抗体、アルカリホスファターゼで標識アビジンもしくは同標識ストレプトアビジンおよび基質 P—ニトロフヱニルホスフヱ一ト ' 2ナトリウム塩、ぺルォキシダーゼ標識アビジンもしくは同標識ストレプトアビジンおよび 4—クロ口一 1 一ナフトール， 3—アミノー 9—ェチルカルバゾール（AE C) , ジァミノベンチジン（DAB) 等の基質、抗原コーティングに用いるコーティング液、コーティング後のブロッキング液、各反応間での洗浄液、各反応に用いる緩衝液、 E L I S A 用 9 6穴プレート等と組み合わせて、 I G F— Iの E L I S A測定用のキットとすることができる。

なお、このようにして得られた、 1 7 B 2 , 2 1 3 D 9 , 2 7 E 1 0等の 8種類のハイプリドーマの内、ハイブリドーマ 1 7 B 2は, H y b r i d om a 1 7 B— 2と命名されて、 1 9 9 4年 2月 1 7 曰に工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号： F E RM B P— 4 5 7 2 として寄託され、産生する抗体のサブクラスは I g G 1 —だであった。また、ハイプリドーマ 2 1 3 D 9は、 H y b r i d om a 2 1 3 D— 9と命名されて、同日に工業技術院生命ェ学工業技術研究所に受託番号： F E RM B P— 4 5 7 0 として寄託され、産生する抗体のサブクラスは I g G 2 b— Λであった。さらに、ハイプリドーマ 2 7 E 1 0は、 H y b r i d om a 2 7 E 一 1 0と命名されて、 1 9 9 4年 1 0月 7 日に工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号： F E RM B P— 4 8 2 7 として寄託され、産生する抗体のサブクラスは I g G l — Λであった。

さらに本発明者等は、 1 6 G 4 , 2 2 G 4 , 2 5 D 4等の 2 5種類の、 I G F— I と I G F— IIの分子構造上の共通ェピトープを認識するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを得た。これらの内、 1 6 G 4および 2 2 G 4の産生する抗体のサブクラスはいずれも I g G l — だ、 2 5 D 4の産生する抗体のサブクラスは I g G 2 a— Λであった。これらのハイブリドーマの内、ハイブリドーマ 2 5 D 4は、 H y b r i d om a 2 5 D— 4 と命名されて、 1 9 9 4年 2月 1 7 日に工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号： F E RM B P— 4 5 7 1 として寄託され、ハイプリドーマ 1 6 G 4は、 H y b r i d om a 1 6 G— 4 と命名されて、 1 9 9 4年 1 0月 7 日に工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号： F E RM B P— 4 8 2 6 として寄託されている。

本発明のハイブリドーマ 1 7 B 2、ハイブリドーマ 2 7 E 1 0およびハイプリドーマ 2 1 3 D 9が産生するモノクローナル抗体（以下、抗体 1 7 B 2， 2 7 E 1 0および抗体 2 1 3 D 9のように、ノヽイブリドーマの番号でこれらのハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を表記することがある。）は、インシュリン、プロインシユリンおよび I G F— IIと交差せずに I G F— Iにのみ特異的に反応する抗体であり、 E L I S A法において、 R I A法に匹敵する検出感度を有する。また、抗体 2 5 D 4および 2 2 G 4は I G F— IIと交差するが、サブタイプとェピトープが上記の抗体と異なるので、抗体 1 7 B 2 もしくは抗体 2 1 3 D 9 と組み合わせることにより、 2抗体法（サンドイッチ法）を構築する事が出来、さらに検出感度を上げることが可能である。従って、本発明によれば、放射性同位元素を用いることなく I G F— Iを特異的に測定することがでさる実施例

次いで、実施例に基づき、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。

実施例 1. 免疫原の調製

a . ゥシ血清アルブミン結合 I G F— I (B S A— I G F— I ) の調製

h I G F - Iは分子量 7 , 6 4 9 と低分子であるため抗原性が低く、 h I G F— Iそのものはハプテン抗原と考えられるので、免疫原性を高めるために適切なキヤリァー蛋白質と結合させて分子量を高めた複合体を調製し、これを免疫原とすることが適切と考えた。キャリアー蛋白質としてゥシ血清アルブミン（B S A) および卵白アルブミン（OVA) を選択し、それぞれ蛋白— I G F— I複合体を調製した。

B S A— I G F— Iの調製は D C C法に従って行った。即ち、ゥシ血清アルブミン（B S A, シグマ . コード A— 7 5 1 1 ) 2. 5 mgを 4 0 0 a 1の蒸留水に溶解し、これに 1 0 0 β 1の蒸留水で溶解した 1 —ェチルー 3— ( 3—ジメチルァミノプロピル）カルポジイミド · 塩酸塩（WS D C C, ナカライテスク · コード 1 5 0— 2 2 ) 5 m gを攪拌しながら加え、 3 7 °Cで 1時間静置した。その後- 1. 2 mlの蒸留水に溶解した遺伝子組み替えヒト I G F— I ( r h 一 I G F— I , 藤沢薬品 · コード FK 7 8 0 ) 0. 8 mgを攪拌しながら加え、 3 7 °Cで 1時間静置した。反応終了後、蛋白精製用セフアデックス G— 2 5 ミニカラム（P D 1 0，フアルマシア社製）で蛋白画分を集めて凍結乾燥して B S A— I G F— Iを調製した。 b . 卵白アルブミン結合 I G F— I (OVA— I G F— I ) の調製 OVA— I G F— Iの調製も B S A— I G F— I と同様に D C C 法に従って行った。即ち、卵白アルブミン（OVA, 生化学工業 · コード 2 5 0 4 4 0 ) 2. 5 mgを 4 0 0 l の蒸留水に溶解し、これに 1 0 0 〃 1 の蒸留水で溶解した W S D C C 6. 8 m gを攪拌しながら加え、 3 7 °Cで 1 時間静置した。その後、 1 . 2 mlの蒸留水に溶解した r h— I G F— I 0. 8 mgを攪拌しながら加え、 3 7 °Cで 1 時間静置した。反応終了後、蛋白精製用セフアデックス G— 2 5 ミニカラムで蛋白画分を集めて凍結乾燥して O V A— I G F - I を調製した。

実施例 2. ハイプリドーマの調製

a . B S A— I G F - I によるマウスの感作

実施例 1 において調製した凍結乾燥した B S A— I G F— I をダルべッコの P B S (—）， p H 7. 4 〔ニッスィ . コード 0 5 9 1 3，以下、 D'— P B S (—）と略記することがある。〕で溶解して 1 m g/m 1 の抗原溶液を調製した。フロイントの完全アジュバント（F C A, カルビオケムーベーリング ' コード 2 5 0 4 4 0 ) と前記抗原溶液とを 3 ： 2の割合で混合して 0型ェマルジヨンを調製した。このェマルジヨンを B A L B Z cマウス（雌性， S P F グレード、 2 6〜2 9 曰齢. 日本クレアより購入） 8匹に抗原 1 2 5 匹の量で皮下に注射して初回免疫を行った。 2週間後に、フロイントの不完全ァジュバント（ F I C A, ディフコ ' コード 0 6 3 9 - 6 0 - 6 ) と前記抗原溶液とを 3 ： 2の割合で混合して w ノ ₀型ェマルジヨンを調製し、これを腹腔内に抗原 6 3 gZ匹の量で注射することにより、追加免疫を行った。さらに 1週間の間隔で 2回、 3 ノ匹の追加免疫を行った（初回免疫を含めて 4回）感作したマウスについては、最終免疫の 1週間後に眼底静脈叢から試験採血し、後述の E L I S A法で、免疫原を構成するキャリア一蛋白の種類が異なる O V A— I G F - I に対する血清抗体の力価を測定し、抗体産生の指標とした。感作したマウス全てに抗体産生が認められたので、細胞融合に供するマウス 4匹に対して、 D'— P B S (一）に溶解した抗原 3 7 gZ匹を静脈内に注射した後 3 日目に脱血、屠殺して脾臓を摘出し、 1 回目のハイプリドーマ調製に用いた。

残りの 4匹については、 4回目の免疫注射から 1 0 日後に 5回目の追加免疫を行い、最終免疫の 2週間後に同様に眼底静脈叢から試験採血し、同様に、 O VA— I G F— I にに対する血清抗体の力価を測定し、抗体産生の指標とした。 4匹全てに抗体産生が認められたので、さらに D'— P B S (-) に溶解した抗原 3 匹を静脈内に注射した後 3 日目に脱血、屠殺して脾臓を摘出し、 2回目のハイプリドーマ調製に用いた。

b . 卵白アルブミン結合抗原によるマウスの感作

実施例 1 において調製した凍結乾燥した O V A— I G F— I を D' 一 P B S (—）で溶解して 1 m gZm 1 の抗原溶液を調製した。ステツプ a と同様にして、免疫原を構成するキャリァー蛋白の種類が異なる B S A— I G F - I に対する抗体力価を指標に、 4匹ずつ 2 回のハイプリドーマ調製に用いた。

c . ハイプリドーマの調製

a . または b . で免疫して得られた感作マウスを脱血して血液を回収し、血清を分離してアツセィ用対照血清として凍結保存した。脱血マウスを直ちに腹部切開して、無菌的に脾臓を摘出し、 7. 5 %炭酸水素ナトリウム溶液で P H 7. 4に調製した R P M I — 1 6 4 0培地（二ッスィ · コード 0 5 9 1 8 ) を入れた容器に収納した, 以後の操作はすべてクリーンベンチ内で行った。摘出した脾臓を R PM I — 1 6 4 0培地で 2回洗浄してから、付着している脂肪組織片を切除した後、ハサミで縦に 2分して切片としてからピンセットで培地液中でよくほぐした。この細胞浮遊液を、オートクレープ殺菌したステンレス網で細胞浮遊液を濾過回収した。得られた低速遠心（ 8 0 0 r p m, 3分間）して上清を除去し、沈殿としてパックされた細胞塊を得た。これをフイコールペイク法で赤血球を除去し R PM I — 1 6 4 0培地で 1 回洗浄してから、細胞を同じ培地に再浮遊させて細胞数を計測した。

一方、 G I T培地（日本製薬，コード 3 9 8 - 0 0 5 1 5 ) で 2 〜 3 日間で急速に増殖させた新鮮なミエローマ細胞（P ₃ U 1 ) を円底遠心チューブを用いて低速遠心（ 1， 0 0 0 r p m， 3分間）して上清を捨て、沈殿物としてパックされている細胞塊をタツピングによりよくほぐしてから、 3 7 °Cに加温した R P M I — 1 6 4 0 培地（ P H 7. 4 ) で 2回洗浄してから同じ培地に再浮遊させて、同様に細胞数を計測した。

得られた脾細胞浮遊液および親細胞（p₃ u > ) 浮遊液を、計算量で細胞数がおおよそ 5 ： 1程度の割合で細胞融合用の丸底チューブに分注し、低速遠心して上清を除去した後、沈殿物としてパックされている細胞塊をタッビングによりょくほぐした。ここに予めォ一トクレーブ滅菌後 5 0 °C程度に冷却したポリエチレングリコール ( P E G) を同容量の R PM I — 1 6 4 0培地に溶解した後、 7. 5 %炭酸ナトリウムで p H 7. 4に調整した溶液 2 m 1 を、 3 7 °C で保温した状態で 2 0〜 3 0秒でゆつくり分注しながら混和した。続いてこれに 3 7 °Cの R PM I — 1 6 4 0培地 8 m l を徐々に加えながらピぺッ卜でゆつくり混和した。

次いでこれを 2 5〜 3 7 °Cで低速遠心（ 8 0 0 r p m， 3分間）して上清を捨て、細胞塊を 1 0 m l の H T培地〔ヒポキサンチン (ナカライテスク * コード 1 9 0 — 0 1 K 0 j i n ) 、チミジン (ナカライテスク ' コード 3 3 8 — 2 5 K o j i n) および 1 0 % ゥシ胎児血清を含有する R P M I - 1 6 4 0培地〕を徐々に加えながらよくほぐして再浮遊させて 1回洗浄操作をした後、ミエローマ細胞の数が計算量で 1 X 1 0⁶ /m l になるように H T培地を用いて再浮遊させた。これを細胞培養用の 9 6穴プレートに 0. 1 m l ウエルずつ分注し、炭酸ガスインキュベータ（炭酸ガス濃度 5 %_: 3 7 °C) で培養した。

培養 2 日目に HAT培地〔ヒポキサンチン、アミノプテリン（シグマ · コード A— 1 7 8 4 ) 、チミジンおよび 1 0 %ゥシ胎児血清を含有する R PM I — 1 6 4 0培地）を 1 ゥエルにつき 5 0 1添加した。更に 3 日目毎に HAT培地 1 0 0 1 ウエルで培地交換した。 2週間後に顕微鏡下にハイプリドーマコロニーの増殖度を観察して、ハイブリドーマコロニーの確認されたゥエルについては、培地交換の際に得られた培養上清について、 E L I S A法による血清抗体力価測定と同様の方法で抗体価を測定した。目的とする抗体の産生が確認された細胞は、培地を H A T培地から H T培地に変更して細胞を増殖させた後、 G I T培地を'用いて順次 l m l /ゥエル. 1 O m l ZTフラスコへとスケールアップした。

雌性マウス（BAL BZ c, 4週齢）の胸腺を摘出して、ヒポキサンチンおよびチミジンを添加した G I T培地中に 5 X 1 0⁶ 細胞 /m 1 に浮遊させた。この胸腺細胞を用いて、得られたハイプリド一マを、 5細胞 Z0. 1 m lノウエル， 2. 5細胞 Z0. l m l / ゥエル， 1. 2 5細胞 0. 1 m l ウエルおよび 0. 6 2 5細胞 / 0. 1 m 1 Zゥエルとなるように限界希釈して、炭酸ガスインキュベータ（炭酸ガス濃度 5 3 7 °C) で 1 0〜 2週間培養し、細胞増殖度および上清の抗体力価を測定した。必要に応じて再度ク口一二ングを行い、 OVA— I G F— Iを免疫したマウスから 4 5個の B S A— I G F— Iに反応するクローンが得られ、このクローンから 3個の I G F— Iそのものに反応するク口ーンが得られた。この中から、後述の特異性同定により I G F— I特異的なクローンが 2個得られた。また、 B S A— I G F— Iを免疫したマウスから 1 6 1個の OVA— I G F— I に反応するクローンが得られ、これらのクローンから 5 8個の I G F— Iそのものに反応するクローンが得られた。この中から、後述の特異性同定により I G F— I特異的なクローンが 6個得られた。即ち、合計で 6 1個の I G F— Iに反応するクローンが得られ、うち 8個は I G F— I特異的なクローンであった。

得られたハイプリドーマは、継代培養の後、低速遠心（ 1 0 0 0 r p m, 1 5〜2 5 °C， 3分間）して上清を除去した後、沈殿物としてパックされている細胞塊をタッビングによりょくほぐした。ここに 4 °Cに冷却した凍結保存液（ 1 0 %ジメチルスルフォキシド、 2 0 %ゥシ胎児血清）を含む R PM— 1 6 4 0培地を加えて 5 X 1 0⁶ 細胞 Zm l に浮遊させた。これを 1. 8 m l容の凍結保存用チユーブに l m lずつ分注して、一 8 0 °Cで予め一晚予備凍結の後、液体窒素中（— 1 9 4 °C) に保存した。

評価例 1. E L I S A法による抗体の測定

a . 抗原コーティングプレートの作成

測定すべき各抗原（B S A— I G F— Iで感作したクローンの培養上清には OVA— I G F— Iを、 OVA— I G F— Iで感作した場合は B S A— I G F— Iを用いた）を蒸留水に溶解して l mgノ m lの水溶液とした。これを— 8 0 °Cで保存した。これを用時、コ一ティング緩衝液（ 0. 1 M炭酸 · 重炭酸緩衝液， p H 9. 6 ) を用いて濃度 1 0 gZm l に希釈して、 E I A用 9 6穴マイクロタイタ一プレート（コースター . コード 3 5 9 0 ) の各ゥエルに 1 0 0 1ずつ分注し、室温で 2時間放置した。各ゥエルから抗原溶液を吸引除去し、プレートを洗浄液〔0. l wZv%のッウィーン 2 0 (バイオラッド ' コード 1 7 0 — 6 5 3 1 ) および 0. 1 w Z V %の N a N ₃ を含有する D'— P B S (—）〕で 3 回洗浄した。次にブロッキング液〔 0. l w/v %のゼラチン（バイオラッド ' コ一ド 1 7 0 — 6 5 3 7 ) および 0. 1 v %の N a N ₃ を含有する D'— P B S (—）〕を各ゥエルに 1 5 0 n 1 ずつ加えて 3 7 °Cで 3 0分間インキュベートした。各ゥエルからブロッキング液を除去した後、プレートを洗浄液で 3回洗浄して、抗原コーティングプレートを作成した。

b . 抗原一抗体反応

次に検定すべき試料（第 1 抗体）を希釈し、 1 0 0 z l Zゥエル加えて 3 7 °Cで 1 時間インキュベー卜して、コ一ティングした抗原と反応させた。次いで該サンプルを除去した後、プレートを洗浄液で 3 回洗浄した。これに、第 2抗体溶液（アマ一シャム · コード R P N 1 0 0 9 , ヒッジのピオチン化抗マウス免疫グロブリン抗体の 5 0 0倍希釈液）を 1 0 0 / 1 ウエル添加して 3 7 °Cで 1 時間ィンキュペートした。上清を除去した後、プレートを洗浄液で 3回洗浄した。これらの操作により、試料中の第 1 抗体の活性に応じて、第 2抗体が固定化された。

c . ピオチン一アビジン反応

次に、アルカリホスファターゼ標識アビジン溶液（ダコパッッ ' コード D 3 6 5を 5 0 0倍希釈しともの）を 1 0 0 / 1 ノウエル添加して 3 7 °Cで 3 0分間インキュベートした。上清を除去した後、プレートを洗浄液で 3回洗浄した。これらの操作により、試料中の第 1 抗体の活性に応じて、アルカリホスファターゼが固定化された, d . アル力リホスファターゼ反応

次に、基質溶液〔 0. 5 mMM g C l ₂ を含有する 1 O mMのジエタノールァミン緩衝液（ p H 9. 5 ) に l m g/m l の濃度に p —ニトロフヱニルホスフェート 2ナトリウム塩（P NP P ' 和光純薬 ' コード 1 4 9— 0 2 3 4 2 ) を溶解したもの〕を 1 0 0 〃 1ノゥエル添加して室温で 2 0分間放置した後、反応停止液（ 3 NN a OH) を 5 0 1 /ゥエル添加して酵素反応を停止し、吸光度自動計測装置を用いて 4 0 5 nmにおける吸光度を測定した。酵素反応陽性の試料を抗体陽性と判断し、吸光度シグモイド曲線の直線濃度勾配の中点に対応する試料の希釈倍率を抗体力価の指標（UZm 1 ) とした。

評価例 2. モノクローナル抗体のサブクラスの同定

得られたモノクロナール抗体のサブクラスの同定は、 E L I S A 法で行った。即ち、得られたハイプリドーマを G I T培地で培養した培養上清を、コバインドプレート（マイクロメンブレン · コード C B— P L— 1 ) に、 1 0 0 〃 1 Zゥエル添加して 3 7。Cで 1時間インキュベートして抗体をプレ一トに結合させた。続いて 1 5 0 u 1 Zゥエルのブロッキング液を加え、 3'7。Cで 1時間ィンキュベートした後、液を除去し、プレートを洗浄液で 3回洗浄した。次に各プレート毎に別々に、抗体溶液〔マウス免疫グロブリンの各クラス、サブクラスおよびタイプに対するャギ由来の特異抗体をピオチン化したもの〔いずれもアマ一シャム製、抗 I g G l (コード R PN 1 1 8 0 ) , 抗 I g G 2 a (同 R PN 1 1 8 1 ) , 抗 I g G 2 b (同 R PN 1 1 8 2 ) , 抗 I g G 3 (同 R P N 1 1 8 3 ) , 抗 I gA (同 R PN 1 1 7 5 ) , 抗 I gM (同 R PN 1 1 7 6 ) , 抗 Λ鎖 (同 R PN 1 1 7 9 ) ，抗 λ鎖（同 R PN 1 1 7 8 ) } の 5 0 0倍希釈溶液〕を 1 0 0 jtz 1 Zゥエル添加して 3 7 °Cで 1時間インキュペートし、液を除去した後、プレートを洗浄液で 3回洗浄した。次いで、評価例 1の c， dと同様に、アル力リホスファターゼ標識ァビジン溶液添加、インキュベーション、洗浄、基質溶液添加、反応停止液添加の後、同様に吸光度自動計測装置を用いて 4 0 5 n mにおける吸光度を測定した。酵素反応陽性のゥエルに添加した抗体溶液のクラス、サブクラスおよびタイプをモノクローナル抗体のクラス、サブクラスおよびタイプと同定した。

評価例 3. モノクローナル抗体の特異性の判定

実施例 2で得られた I G F— I に反応する 6 1個のハイプリドーマの培養上清の、 I G F— I， I G F— II, プロインシュリンおよびィンシュリンに対する特異性の判定は、 E L I S A法で行った。即ち、抗原として、 2種類の遺伝子組み換えヒト I G F— I (藤沢薬品工業 ' コード FK 7 8 0およびアマ一シャム ' コード ARM 4 0 5 0 ) 、遺伝子組み換えヒト I G F— II (アマ一シャム · コード ARM 2 4 0 5 0 ) 、遺伝子組み換えヒトプロインシュリン（シグマ · コード P 4 6 7 2 ) および遺伝子組み換えヒトインシュリン (シグマ ' コード I 0 2 5 9 ) を、それぞれの濃度に. 0. 1 Mの炭酸ナトリウム緩衝液（p H 9. 6 ) に溶解し、 9 6穴 E I Aプレート（コースター ' コード 3 5 9 0 ) に 8 0 〃 1 /ゥェルずつ加えて 3 7 °Cで 1 時間放置した。評価例 1 と同様にブロッキング、洗浄を行った後、次に検定すべき試料（第 1抗体，ハイプリドーマの培養上清）を希釈し、 1 0 0 / 1 Zゥエル加えて 3 7でで 1 時間インキュベートし、該サンプルを除去した後、プレートを洗浄液で 3回洗浄した。

以下、評価例 1の b, c, dと同様に処理した。すなわち、第 2 抗体溶液を添加してインキュベート後、上清を除去して洗浄した。次に、アルカリホスファターゼ標識アビジン溶液を添加してインキュペート後、上清を除去して洗浄した。次に、基質溶液を添加して室温で 2 0分間放置した後、反応停止液（3 NN a OH) を 5 0

1 zゥエル添加して酵素反応を停止し、吸光度自動計測装置を用いて 4 0 5 n mにおける吸光度を測定した。酵素反応陽性を抗体陽性と判定した。

I G F— I に反応する 6 1 個のクローンの産生する抗体の、 I G F— II、インシユリンおよびプロインシユリンに対する反応性を表 1 に示す。

1 . られた抗体の反応性

反応性該当する該当する

クローンの数クローンの番号

Ant 1 - IGF- 1 specific 8 13B2, 213D9, 17B2, 21D3,

25C8， 25F2, 27E10, 29G6.

Anti-IGF-I+II 25 12E10, 15D4, 16G4, 21D2,

21F7, 22C3, 22D7, 22F4, 22G4, 23D9, 23E6, 24D5, 25B6, 25D4, 27E9, 28C8, 28C10, 29C2, 29D4, 29F6, 29F7, 29F8, 210C2, 210D2, 210D2-2

Anti-IGF - I+II+ln 21C7, 21G5, 22F3, 23F11,

23G6, 24E8, 25C7, 210E11.

Anti-IGF-HIHIn+Pr 19 21C9, 25B7, 25D5, 26E3,

26F9, 26F11, 27B5, 27C2, 27C11, 27D10, 28D8, 28E6, 28F5, 29B6, 210B6, 210B7, 210E9, 210F10, 210G6.

Anti-IGF-HIn+Pr 28F11.

略号 In インシュリン， Pr プロインシュリン

2 l 実施例 3 , イン ' ビボ培養によるモノクローナル抗体の製造

H y b r i d om a 1 7 B— 2および H y b r i d om a 2 1 3 D— 9を G I T培地で培養し、 P RM I — 1 6 4 0基本培地で洗浄して 1 0⁷ 細胞 Zm 1の細胞懸濁液を調製した。 5〜 6週齢の雌性 B A L BZcマウスに 0. δ πι Ι Ζマウスの腹水誘発剤プリスタン（2， 6， 1 0 , 1 4—テトラメチルペンタデカン，アルドリツチ ' コード Τ 2 2 8 0 - 2 ) を腹腔内に 2回注射し、約 2週間後に前記ハイプリドーマ細胞懸濁液を 0. 5 m l Zマウス（ 5 X 1 0 細胞/マウス）腹腔内に注射した。 1〜 1 0 日間で腹水が貯留したので、腹部が肥大するのを待って注射器により腹水を採取した。こうして、マウス 1匹あたり 5〜 1 0 m lの腹水を得た。

得られた腹水を 4 °C， 3 0 0 0 r p mで 1 0分間遠心分離して上清を集め、飽和硫安水溶液（p H 7. 4 ) を腹水上清と等容量加えて硫安沈殿を行った（5 0 %飽和）。沈殿操作終了後、 4 °C, 1 0 , 0 0 0 X gで 3 0分間遠心分離して上清を除去し、沈殿画分を少量の生理食塩水に溶解し、セフアデクックス G— 2 5 M (フアルマシァ製）のカラムで硫安を除去した。次に氷冷した清澄剤フリーゲン ( トリクロ口トリフルォロェタン，ベーリング研究所 . コード O S VW 1 9 6 0 5 1 8 9 /E u ) で脱脂した後に、蛋白濃度を約 5 m g Z m 1 に調整した。

次にこのサンプルを、結合緩衝液（A f f i 一 G e 1 P r o t e i n G MA P S— II緩衝液，ノ<ィォラッド · コード 1 5 3— 6 1 6 0 , p H 9. 0 ) で 1 : 1に希釈して、 2 0べッド量の結合緩衝液で洗浄したプロテイン G—セファロース（フアルマシア一 L ΚΒ · コード 1 7— 0 6 1 8 - 0 1 ) のカラムクロマトグラフィーに付し、 1 5ベッド量の結合緩衝液で洗浄した後、 1 0ベッド量の溶出緩衝液（結合緩衝液と同一の組成を有し、 ρ Ηを 3. 0に調整 O 9

したもの）で溶出して I g G画分を溶出した。溶出液は p Hを中性に調節するため、 8 m l の 1 M T r i s - H C 1緩衝液（ p H 9.

5 ) を予めいれておいた受器に 2 5 m 1ずつ分画した。回収した抗体成分を集め、限外濾過膜（カツトオフ 3 0， 0 0 0 ) を用いて溶媒を生理食塩水に置換し、凍結乾燥した。

評価例 4. モノクローナル抗体の抗体力価の定量

a . 抗原プレートの作製

実施例 3で得られた精製モノクローナル抗体の力価の測定は、評価例 1 と同様に E L I S A法で実施した。即ち、遣伝子組換え h— I G F— I (アマ一シャム ' コード A RM 4 0 5 0 ) をコーティング緩衝液（ 0. 1 M炭酸緩衝液， p H 9. 6 ) に 1 gZm 1 に溶解して 9 6穴 E I Aプレート（コースター . コード 3 5 9 0 ) の各ゥエルに 1 0 0 / 1ずつ分注し、 3 7 °Cで 1 時間インキュベートした。溶液を吸引回収した後、プレートを洗浄液〔 0. l wZv %のツイーン 2 0および 0. l wZv %の N a N ₃ を含有する D'— P B S (―) 〕で 3回洗浄した。次に、ブロッキング液〔 0. l wZv %のゼラチンおよび 0. l w/v %の N a N ₃ を含有する D，— P B S (一）〕を各ゥエルに 1 5 0 {1 1ずつ加えて 3 7 °Cで 3 0分間ィンキュペートした。各ゥエルからブロッキング液を除去した後、プレートを洗浄液で 3回洗浄して抗原プレートを作製した。

b. 抗原一抗体反応

実施例 3で得た試料は、ブロッキング液に 1 m gZm 1 の濃度に溶解し、これを 4 5 0倍、 1 , 3 5 0倍、 4， 0 5 0倍、 1 2， 1 5 0倍、 3 6 , 4 5 0倍および 1 0 9， 3 5 0倍に希釈した。これを抗原プレートに 1 0 1 /ゥエルずつ分注して、 3 7 °Cで 4 5分間インキュベートした。上清を除去、 3回洗浄した後、第 2抗体溶液（ヒッジのピオチン化抗マウス免疫グロブリン抗体、もしくは、 1 7 B 2の場合にはヒッジのビォチン化抗マウス I g G 1抗体、 2

1 3 D 9の場合にはヒッジのビォチン化抗マウス I g G 2 b抗体

(いずれもアマ一シャム製）の 5 0 0倍希釈物）を 1 0 0 〃 1ノウエル添加して 3 7 °Cで 4 5分間インキュベートした後、上清を除去してプレートを洗浄液で 3回洗浄した。

c . ピオチン一アビジン反応

次に、アルカリホスファターゼ標識アビジン溶液（ダコパッッ · コード D 3 6 5の 5 0 0倍希釈溶液）を 1 0 0 / 1ノウエル添加して 3 7 °Cで 3 0分間インキュベートした後、上清を除去してプレートを洗浄液で 3回洗浄した。

d . アル力リホスファターゼ反応

次に、基質溶液〔 0. 5 mMM g C 1 ₂ を含有する 1 O mMのジエタノールァミン緩衝液（ p H 9. 5 ) に l m gZm l の濃度に P N P Pを溶解したもの〕を 1 0 0 〃 1 ウエル添加して室温で 3 0 分間放置した後、反応停止液（ 3 NN a O H) を 5 0 1 Zゥエル添加して酵素反応を停止し、吸光度自動計測装置を用いて 4 0 5 n mにおける吸光度を測定した。

e . 抗体力価の計算

得られたデータを、 Y軸に吸光度、 X軸（対数目盛）に試料の希釈倍数を片対数グラフにプロットして、図 1のようなシグモイド曲線を作成した。

特異抗体の希釈試料では、このようなシグモイド曲線が描かれるので、この曲線の直線的濃度勾配領域の中点に対応する希釈倍数で力価を表示する。図 1 において、直線的濃度勾配領域の中点に対応する希釈倍数は、抗体 1 7 B 2の場合は 8， 0 0 0倍、抗体 2 1 3 D 9の場合は 3 0， 0 0 0倍であるので、抗体 1 7 B 2の力価は 8 , O O O U n i t /m g、抗体 2 1 3 D 9の力価は 3 0 , 0 0 0 U n i t /m gと定義される。

実施例 4. E L I S Aによる I G F— I の定量

a . 標準曲線の作成

標準試料（遺伝子組み換えヒト I G F— I , アマ一シャム · コード A RM 4 0 5 0 ) を 1 0 O n gZm l に希釈し、これを倍数希釈 ( 1， 2， 4， 8， 1 6 , 3 2および 6 4倍希釈）して、試料調製用の 9 6穴 V底プレートに 6 0 1 ウエルづっ分注する。これに. 実施例 3で得られた抗体 1 7 B 2を、 4 U n i t Z m l に調製したものを 6 0 p. 1ノウエルづっ分注し、 3 7 °Cで 3 0分間反応させる, 反応終了液を 1 0 0 z 1 /ゥエルづっ、評価例 3 — a と同様にして作製した抗原プレートに分注し、 3 7 °Cで 4 5分間インキュベートした。上清を除去、 3回洗浄した後、第 2抗体溶液（ヒッジのピオチン化抗マウス免疫グロプリン抗体もしくはピオチン化抗マウス I g G 1抗体：いずれもアマ一シャム製の 5 0 0倍希釈液）を 1 0 0 IX 1 ウエル添加して 3 7 °Cで 4 5分間インキュベートした後、上清を除去してプレートを洗浄液で 3回洗浄した。これに評価例 3 — cおよび dと同様にして吸光度を測定した。得られたデータを、 Y 軸に吸光度、 X軸（対数目盛）に試料の希釈倍数を片対数グラフにプロットして、図 2のような標準曲線を作成した。この標準曲線から、第 2抗体にピオチン化抗マウス I g G 1抗体を使用した場合、約 1. 6〜5 0 n gZm l の範囲の I G F— I を定量できることが明らかである。

b . ヒト血清中の I G F— I の定量

正常 ' 成人ヒトプール血清 1 0 0 // 1 を 4 0 0 z l の前処理剤 ( 1 2 N塩酸 2 5 m l，水 1 0 O m l にエタノールを加えて全量 1 0 0 0 m 1 にしたもの）を加えて、 3 0分間攪拌した後、し 5 0 0 X Gで 3 0分間遠心分離し、この上清 1 0 0 ^ 1 を採り、これに 6 0 0 〃 1の中和剤（KH₂ P 0₄ 1. 7 4 g, N a ₂ H P 0₄ · H 01 5. 5 2 g, N a N 0. 5 gに水を加えて全量 1 0 0 0 m l にしたもの）を加えて中和した。この操作で蛋白と結合した I G F— Iを分離して単離型の I G F— I とすると共に、 3 5倍希釈したことになる。

次いでこの試料を、そのまま、 2倍および 4倍（通算で 3 5倍、 7 0倍および 1 4 0倍）希釈して、ステップ a. と同様に、試料調製用の 9 6穴 V底プレートに 6 0 1 /ゥエルづっ分注した後、第 2抗体にピオチン化抗マウス I g G 1抗体を使用してステップ a . と同様に処理して吸光度を測定した。得られた吸光度はそのままの試料が 1. 2 4 5， 2倍希釈の試料が 1. 4 2 5， 4倍希釈の試料が 1. 4 9 7であった。この値を図 2の吸光度の濃度勾配領域で交差する時にその値に当てはめて、対応する I G F— Iの濃度を読み取り、これに通算の希釈倍数を乗じて血清中の I G F— I濃度とした。この例では、単離そのままの試料（通算 3 5倍希釈）から読み取った値を用いて、 6. 1 8 X 3 5 = 2 1 6. 6 5 (n g/m l ) と定量された。

評価例 5. モノクローナル抗体の認識するェピトープの決定

抗ー I G F— I特異抗体の認識するェピトープの検討は、評価例 1 と同様に、 E L I S A法で行った。即ち、コーティング緩衝液に溶解した 1 〃 g/m 1の r h— I G F— I (藤沢薬品）溶液または 5 // gZm lの I G F— Iの C—領域〔3 0— 4 1〕フラグメント (バッケム）溶液を、 E I A用 9 6穴マイクロタイター（コースタ一）の各ゥヱルに 1 0 0 1づっ分注し、ゥヱルをコーティングした。次いで評価例 1 と同様に洗浄およびブロッキングを行った。次いで、抗体 2 7 E 1 0および抗体 1 6 G 4を、 1 mgZmlの濃度に調製し、これを 3 0 0倍、 9 0 0倍、 2, 7 0 0倍、 8， 1 0 0 倍および 2 4 , 3 0 0倍に希釈して、それぞれ 1 0 0 n 1 Zゥエル添加して反応させた。免疫反応終了後、評価例 1 と同様に、酵素標識導入、酵素反応を行って、 4 0 5 nmの吸光度を測定した。

結果を図 3に示す。図に示すように、固相に I G F— Iを固定し. I G F - I に特異的である抗体 2 7 E 1 0を反応させた場合（黒丸 ·) は、 I G F— Iは濃度依存的に抗体 2 7 E 1 0 と反応した。また、固相に C領域に相当する I G F— I 〔3 0— 4 1〕フラグメントを固定した場合（黒四角匪）も、 I G F— I 〔3 0— 4 1〕フラグメントは、感度に差があるものの、濃度依存的に抗体 2 7 E 1 0 と反応することが明らかとなった。これに対して、固相に I G F— Iを固定し、 I G F— Πに交差する抗体 1 6 G 4を反応させた場合

(白丸〇）は、 I G F— Iは濃度依存的に抗体 1 6 G 4 と反応するが、固相に I G F— I 〔 3 0— 4 1〕フラグメントを固定した場合

(白四角□) は、同フラグメントは全く抗体 1 6 G 4 と反応しないことが判明した。即ち、 I G F— I に特異的な抗体 2 7 E 1 0の抗原認識部位は、 I G F— Iの C領域に存在し、 I G F— Πに交差する抗体 1 6 G 4の抗原認識部位は C領域以外の箇所に存在することが明らかとなつた。

図 3から明らかなように、抗体 2 7 E 1 0は、 C鎖ペプチドと用量依存的に反応し、この抗体のェピトープが I G F— Iの C鎖であることが判明した。さらに、抗体 1 7 B 2の産生するモノクローナル抗体についても同様の結果が得られ、この抗体のェピトープも I G F— Iの C鎖であることが判明した。さらに、後記実施例 6に示す 2抗体法で、固相に抗体 1 7 B 2を固定し、第 2抗体にピオチン化した抗体 2 1 3 D 9を用いた場合は、第 2抗体にピオチン化した抗体 1 7 B 2を用いた場合と同様に第 2抗体とは反応しなかった。これとは逆に、固相に抗体 2 1 3 D 9を固定し、第 2抗体にビォチン化した抗体 1 7 B 2を用いた場合も、第 2抗体にピオチン化した抗体 2 1 3 D 9を用いた場合と同様に第 2抗体とは反応しなかった, このことから、抗体 1 7 B 2 と、抗体 2 1 3 D 9および抗体 2 7 E 1 0 とは、 I G F— Iの C鎖を認識し、かつ、 C鎖中の同一のェピトープを認識することが明らかとなった。なお、抗体 2 5 D 4は、後記実施例 6に示す 2抗体アツセィが構築できるので、抗体 1 7 B 2および抗体 2 1 3 D 9のェピトープとは異なるェピトープを認識することは明らかである。

実施例 5. ビォチン化抗体の作製

モノクローナル抗体のピオチン化は、新生化学実験講座 1 2巻 (日本生化学会編集 · 東京化学同人 1 9 9 2年） 1 0 3〜 1 0 4 頁および、 A n t i b o d i e s , A L a b o r a t o r y M a n u a 1 (E d H a r l ow a n d D a v i d L a n e 編 C o l d S p r i n g H a b o r L a b o r a t o r y 1 9 8 8年） 3 4 1頁に記載の方法に準じて行った。即ち、実施例 3 と同様の方法で作製した抗体 2 5 D 4の l mgを l m lの D'— P B S (一）に溶解し、これに 2 0 0 / 1の 1 M N a H C 0 を加えて P H 9. 0とした。これにピオチン化試薬〔N—ヒドロキシサクシニミド（シグマ ' コード B 2 6 4 3 ) を 1 O m gZm lの濃度にジメチルスルフォキシドに溶解したもの〕を 2 5 1添加し 4 °C で 1 6時間振蘯した。 1 M N H C 1を 2 0 1加えて 1 0分間室温でインキュベーションして反応を停止し、反応液を D'— P B S (-) で平衡化したセフアデックス G— 2 5 ミニカラム（P D— 1 0 ) にかけて蛋白画分を集め、ビォチン化抗体を作製した。同様にして、抗体 1 6 G 4 もピオチン化した。実施例 6. 2抗体ァッセィ（サンドウイツチアツセィ）系の構築 a. 抗体プレートの作製

2抗体ァッセィ（サンドウイツチアツセィ）系の構築は、前記 A n t i b o d i e s , A L a b o r a t o r y Ma n u a lの 5 8 0〜 5 8 1頁に準拠して行った。先ず、評価例 4に記載の方法に準じて、抗体プレートを作製した。即ち、実施例 3で得られた抗体 2 7 E 1 0をコーティング緩衝液に 1 0〃 g/m l に溶解して、 9 6穴 E I Aプレート（コースター ' コード 3 5 9 0 ) の各ゥエルに 1 0 0〃 1ずつ分注し、 3 7でで 1 時間ィンキュペートした。溶液を吸引回収した後、プレートを洗浄液で 3回洗浄した。次に、ブロッキング液を各ゥエルに 1 5 0〃 1 ずつ加えて 3 7 で 3 0分間インキュベートした。各ゥエルからブロッキング液を除去した後、プレートを洗浄液で 3回洗浄して抗体プレートを作製した。

b . 抗原—抗体反応（その 1 )

r h - I G F - I (アマ一シャム · コード ARM 4 0 5 0 ) をブロッキング液で 2 0 0， 1 0 0， 5 0および 1 2. 5 n gZm l に溶解した。これを各ゥエルに 1 0 0 1 Zゥエル添加し、 3 7 で 1 時間インキュベーションして固定化された抗体を抗原と反応させた。反応後、上清を除去して洗浄液で 3回洗浄した。

c . 抗原一抗体反応（その 2 )

ゥエルに固定された第 1抗体を介して固定された I G F— Iに、実施例 5で作製したビォチン化した抗体 1 6 G 4の 1 0 /z gZm l の D'— P B S (-) 溶液を 1 0 0 〃 1 ウエルづっ加え、 3 7てで 1 時間インキュベーションして、ゥエルに固定された第 1抗体を介して固定された抗原を第 2抗体と反応させた。反応後、上清を除去して洗浄液で 3回洗浄した。 d . ピオチン一アビジン反応

次に、アルカリホスファターゼ標識アビジン溶液（ダコパッッ · コード D 3 6 5の 5 0 0倍希釈液）を 1 0 0 〃 1 /ゥエル添加して 3 7 °Cで 3 0分間インキュベートした後、上清を除去してプレートを洗浄液で 3 回洗浄した。

e . ァル力リホスファターゼ反応

次に、基質溶液〔 0. 5 mMM g C l ₂ を含有する 1 O mMのジエタノールァミン緩衝液（ p H 9. 5 ) に l m g/m l の濃度に P N P Pを溶解したもの〕を 1 0 0 〃 1 Zゥエル添加して室温で 3 0 分間放置した後、反応停止液（ 3 N N a O H) を 5 0 z l Zゥエル添加して酵素反応を停止し、吸光度自動計測装置を用いて 4 0 5 n mにおける吸光度を測定した。

f . 標準曲線の作製

同様にして、第 1 抗体に抗体 2 1 3 D 9 を用いた場合、第 2抗体にピオチン化した抗体 2 2 G 4 を用いた場合についても 2抗体ァッセィを行い、これらの 4通りのアツセィで得られたデータを、 Y軸に吸光度、 X軸に試料濃度をプロットして、〔図 4〕のような標準曲線を作成した。黒丸（）は、第 1 抗体に 2 7 E 1 0、第 2抗体にピオチン化抗体 1 6 G 4を用いた場合、白丸（〇）は、第 1 抗体に 2 7 E 1 0、第 2抗体にピオチン化抗体 2 2 G 4 を用いた場合、黒四角（匪）は、第 1抗体に 2 1 3 D 9、第 2抗体にピオチン化抗体 1 6 G 4 を用いた場合、白四角（□) は、第 1 抗体に 2 1 3 D 9. 第 2抗体にピオチン化抗体 2 2 G 4 を用いた場合のデータである。これらの結果から、第 1抗体に 2 7 E 1 0、第 2抗体にピオチン化抗体 1 6 G 4 を組み合わせるのが最適であり、この標準曲線の直線性から、測定濃度範囲は、 1 〜 1 0 0 n g/m 1 であることが判明した。さらに、本発明の抗体のうち、抗— I G F— I 特異抗体である、抗体 1 7 B 2，抗体 2 7 E 1 0および抗体 2 1 3 D 9 は、 I G F— I一 C領域をェピトープとするモノクローナル抗体であるので、 I G F— I — C領域以外にェピトープを有するモノクローナル抗体 (例えば、抗体 2 5 D 4 または抗体 1 6 G 4 ) と組み合わせて、 ― 方をそのまま第 1抗体とし、他方を実施例 5 の方法に従ってビォチン化して第 2抗体とすれば、 2抗体アツセィ（サンドウイツチアツセィ）系を構築することができる。また、この組み合わせに於いて、互いにクラスまたはサブクラスが異なる 2種類の抗体を組み合わせて、これに第 2抗体のクラスおよびサブクラスに特異的なピオチン化抗マウス I g抗体を組み合わせれば、モノクローナル抗体をピオチン化することなしに、 2抗体アツセィ（サンドウイツチアツセィ）系を構築することも可能である。産業上の利用可能性

本発明によれば、 I G F— I に特異的なモノクローナル抗体および該抗体を用いた E L I S A法による I G F— I の定量法を提供することができる。この E L I S A法は放射性同位元素を用いないため、 I G F— I の定量を簡便化する効果を有している。さらに該抗体は I G F— I に特異性が高く、類似成長因子である I G F— II、インシユリンおよびプロインシユリンとを区別して定量すること力《できる。正常ヒト血清中の I G F— I 濃度は約 2 0 0 n g /m 1 と報告されている（医学のあゆみ. 1 6 5卷. 5号 2 6 8頁 1 9 9 3年）ので、該抗体を用いる E L I S A法は、臨床的にも充分使用できる方法である。

また、本発明によれば、ェピトープの異なる種々のモノクローナル抗体が提供できるので、その一つを第 1 抗体とし、これとェピトープが異なるモノクローナル抗体をピオチン化して第 2抗体とすれば、 2抗体ァッセィ（サンドウイツチアツセィ）系を構築することができる。さらに、ェピトープと抗体クラスまたはサブクラスが異なる 2種類の抗体を組み合わせて、これに第 2抗体のクラスおよびサブクラスに特異的なピオチン化抗マウス I g抗体を組み合わせれば、モノクローナル抗体をピオチン化することなしに、 2抗体アツセィ（サンドウイツチアツセィ）系を構築することができる。さらに、試料の希釈倍率を検討することにより、検出限度を更に改善することができる。

本発明で得られたモノクローナル抗体は、常法に従って酵素標識. ピオチン標識、蛍光標識または金属コロイド標識などの種々の標識を導入することができるので、 I G F— Iの、蛍光抗体法、 F A C S (F l u o r e s c e n c e A c t i v a t i n g C e l l

S o r t e r) 等の免疫組織化学的研究にとって重要な試薬として用いることができる。規則第 1 3規則の 2の寄託された微生物への言及および寄託機関寄託機関：工業技術院生命工学工業技術研究所

あて名：日本国（ 3 0 5 ) 茨城県つくば市 1丁目 1番 3号

( 1 ) H y b r i d om a 1 7 B - 2

受託番号： F E RM B P— 4 5 7 2

寄託日： 1 9 9 4年 2月 1 7日

( 2 ) H y b r i d om a 2 1 3 D - 9

受託番号： F E RM B P— 4 5 7 0

寄託日： 1 9 9 4年 2月 1 7 曰 ( 3 ) H y b r i d o m a 2 7 E - 1 0 受託番号： F E RM B P— 4 8 2 7 寄託日： 1 9 9 4年 1 0月 7 日

( 4 ) H y b r i d o m a 2 5 D - 4

受託番号： F E RM B P— 4 5 7 1 寄託日： 1 9 9 4年 2月 1 7 日

( 5 ) H y b r i d o m a 1 6 G - 4

受託番号： F E RM B P— 4 8 2 6 寄託日： 1 9 9 4年 1 0月 7 日

Claims

請求の範囲

1. 免疫反応法において、実質的にインシュリン様成長因子一 Π. インシユリンおよびプロインシユリンと反応せず、インシュリン様成長因子— Iの C鎖と特異的に反応するモノクローナル抗体。

2. 抗体のクラスが I g G 1で、鎖を有する請求項 1 に記載のモノクローナル抗体。

3. 抗体のクラスが I g G 2 bで、 c鎖を有する請求項 1 に記載のモノクローナル抗体。

4. H y b r i d om a 1 7 B - 2 (F E RM B P - 4 5 7 2 ) 、 H y b r i d om a 2 7 E - 1 0 (F E RM B P— 4 8 2 7 ) 又は H y b r i d om a 2 1 3 D- 9 (F E RM B P— 4 5 7 0 ) もしくはそれらから誘導された細胞ラインにより生産される請求項 1に記載のモノクローナル抗体。

5. H y b r i d om a 2 5 D- 4 (F E RM B P— 4 5 7

1 ) 又は H y b r i d om a 1 6 G - 4 (F E RM B P— 4 8 2 6 ) もしくはそれらから誘導された細胞ラインにより生産される. インシユリン様成長因子— Iの C鎖以外のェピトープおよび I G F - IIとの共通ェピトープと反応するモノクローナル抗体。

6. H y b r i d om a 1 7 B - 2 (F E RM B P - 4 5 7

2 ) 、 H y b r i d om a 2 7 E - 1 0 (F ERM B P— 4 8 2 7 ) 、 H y b r i d om a 2 1 3 D- 9 (F ERM B P— 4 5 7 0 ) およびそれらから誘導された細胞ライン。

7. Hy b r i d oma 2 5 D- 4 (F E RM B P— 4 5 7 1 ) 又は H y b r i d oma 1 6 G- 4 (F E RM B P— 4 8 2 6 ) もしくはそれらから誘導された細胞ライン。

8. 少なくとも次の工程： (1) ィンシュリン様成長因子一 I で免疫反応に関与する固相表面を覆う工程；

(2) 予め被検試料を、第 1抗体として、請求項 1 〜 4 に記載のモノクローナル抗体から選ばれた 1種類の抗体と反応させる工程；

(3) 第 1抗体と予め反応させた被検試料を系に添加して、未反応の第 1抗体を固相表面に固定されたインシュリン様成長因子一 I と反応させる工程；

(4) 固相表面に固定されたインシユリン様成長因子一 I を介して固定された第 1抗体と、第 2抗体として、第 1抗体のクラスもしくはサブクラスに特異的なピオチン標識抗体を反応させる工程；

(5) 固相表面に固定されたインシュリン様成長因子— I および第 1 抗体を介して固定された第 2抗体のピオチン部分を、標識酵素として、アルカリフォスファターゼまたはパーォキシダーゼで標識したアビジンもしくはストレプトアビジンと反応させる工程；

(6) 固定された標識酵素に基質を加えて酵素反応を行うことにより . 標識をカウン卜する工程；並びに

(7) 被検試料の標識のカウントを、予め測定されたインシュリン様成長因子一 I に対する標準曲線と比較することにより、被検試料中のインシユリン様成長因子一 I濃度を測定する工程；

を含んでなるインシユリン様成長因子— Iの免疫化学的測定方法。

9. 請求項 1 〜 4のいずれか 1項に記載のモノクローナル抗体を含んで成る、請求項 9に記載のィンシュリン様成長因子一 I の免疫化学的測定に用いる試薬。

10. 少なくとも次の工程：

(1) 第 1抗体として、請求項 1 〜 4 に記載のモノクローナル抗体から選ばれた 1種類の抗体で固相表面を覆う工程；

(2) 被検試料を系に添加して、固定された第 1抗体と試料中のインシュリン様成長因子— I を反応させる工程；

(3) 固相表面に固定された第 1 抗体を介して固定されたインシユリン様成長因子— I と、第 2抗体として、請求項 5 に記載の抗体を反応させる工程；

(4) 固相表面に固定された第 1 抗体およびインシュリン様成長因子一 I を介して固定された第 2抗体と、第 3抗体として、第 2抗体にのみ特異的なピオチン標識抗マウス I g Gサブクラス抗体と反応させる工程；

(5) 固相表面に固定された第 1 抗体、インシユリン様成長因子一 I および第 2抗体を介して固定された第 3抗体のピオチン部分を、標識酵素として、アルカリフォスファターゼまたはパーォキシダーゼで標識したアビジンもしくはストレプトアビジンと反応させる工程

(6) 固定された標識酵素に基質を加えて酵素反応を行うことにより標識をカウン卜する工程；並びに

(7) 被検試料の標識のカウントを、予め測定されたインシュリン様成長因子— I に対する標準曲線と比較することにより、被検試料中のインシユリン様成長因子— I 濃度を測定する工程；

を含んでなるインシユリン様成長因子— I の免疫化学的測定方法。

11. 少なくとも次の工程：

(1) 第 1 抗体として、請求項 5 に記載のモノクローナル抗体で固栢表面を覆う工程；

(3) 固相表面に固定された第 1 抗体を介して固定されたィンシユリン様成長因子— I と、第 2抗体として、請求項 1 〜 4 に記載のモノクローナル抗体から選ばれた 1 種類の抗体を反応させる工程；

(4) 固相表面に固定された第 1 抗体およびインシュリン様成長因子一 I を介して固定された第 2抗体と、第 3抗体として、第 2抗体にのみ特異的なピオチン標識抗マウス I g Gサブクラス抗体を反応させる工程；

(5) 固相表面に固定された第 1 抗体、インシュリン様成長因子一 I および第 2抗体を介して固定された第 3抗体のピオチン部分を、標識酵素として、アルカリフォスファターゼまたはバーオキシダ一ゼで標識したァビジンもしくはストレブトァビジンと反応させる工程

を含んでなるインシユリン様成長因子一 I の免疫化学的測定方法。

12. 少なくとも次の工程：

(1) 第 1 抗体として、請求項 1 〜 4 に記載のモノクローナル抗体から選ばれた 1種類の抗体で固相表面を覆う工程；

(3) 固相表面に固定された第 1抗体を介して固定されたインシユリン様成長因子一 I と、第 2抗体として、ピオチン標識した請求項 5 に記載の抗体を反応させる工程；

(4) 固相表面に固定された第 1 抗体およびインシユリン様成長因子 — I を介して固定された第 2抗体のピオチン部分を、標識酵素として、アルカリフォスファターゼまたはパーォキシダーゼで標識したアビジンもしくはストレブトァビジンと反応させる工程；

(5) 固定された標識酵素に基質を加えて酵素反応を行うことにより標識をカウントする工程；並びに (6) 被検試料の標識のカウントを、予め測定されたインシュリン様成長因子一 I に対する標準曲線と比較することにより、被検試料中のインシユリン様成長因子一 I 濃度を測定する工程；

を含んでなるインシュリン様成長因子一 I の免疫化学的測定方法。

13. 少なくとも次の工程：

(1) 第 1 抗体として、請求項 5 に記載のモノクローナル抗体で固相表面を覆う工程；

(3) 固相表面に固定された第 1 抗体を介して固定されたインシユリン様成長因子— I と、第 2抗体として、ピオチン標識した請求項 1 〜 4 に記載のモノクローナル抗体から選ばれた 1 種類の抗体を反応させる工程；

(5) 固定された標識酵素の基質を加えて酵素反応を行うことにより . 標識をカウン卜する工程；並びに

14. 請求項 1 〜 4 に記載のモノクローナル抗体から選ばれた 1 種類の抗体と、請求項 5 に記載のモノクローナル抗体から選ばれた 1 種類の抗体の計 2種類のモノクローナル抗体を含んで成る、請求項 1 0 または請求項 1 1 に記載のィンシユリン様成長因子一 I の免疫化学的測定に用いるキット。

15. 請求項 1 〜 4 に記載のモノクローナル抗体から選ばれた 1種類の抗体と、請求項 5 に記載のモノクローナル抗体から選ばれた 1 種類の抗体のうち、どちらか一方がピオチン化されている計 2種類のモノクローナル抗体を含んで成る、請求項 1 2 または請求項 1 3 に記載のインシユリン様成長因子— I の免疫化学的測定に用いるキッ卜

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