WO1995023220A1 - Procede de production d'acide 2-ceto-l-gulonique - Google Patents

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WO1995023220A1
WO1995023220A1 PCT/JP1995/000285 JP9500285W WO9523220A1 WO 1995023220 A1 WO1995023220 A1 WO 1995023220A1 JP 9500285 W JP9500285 W JP 9500285W WO 9523220 A1 WO9523220 A1 WO 9523220A1
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WO
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expression vector
sorbitol
sorbose
keto
dna encoding
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PCT/JP1995/000285
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English (en)
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Mineo Niwa
Yoshimasa Saito
Yoshinori Ishii
Masaru Yoshida
Hiromi Hayashi
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Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • Y10S435/8215—Microorganisms
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Definitions

  • the present invention relates to a method for efficiently and conveniently producing 2-keto L-gulonic acid (hereinafter also referred to as 2KLGA), which is a precursor of L-ascorbic acid, by genetic manipulation.
  • 2KLGA 2-keto L-gulonic acid
  • the invention further relates to a series of expression systems for efficient production of 2KLGA.
  • 2KLGA is a key intermediate in the synthesis of L-ascorbic acid.
  • 2KLGA is chemically synthesized by oxidizing D-sorbitol according to Reichstein's method.
  • many microorganisms are known, including microorganisms of the genus Gluconobacter, which convert D-sorbitol into 2KLGA by enzymatic oxidation.
  • microorganisms belonging to the genus Gluconobacter have been improved by conjugation transfer methods and genetic engineering techniques using transposons.
  • microbial production of 2KLG A is low and has not yet been applied to industrial production.
  • An object of the present invention is to provide an expression vector containing both a DNA encoding L-sorbose dehydrogenase (hereinafter referred to as SDH) and a DNA encoding L-sorbosone dehydrogenase (hereinafter referred to as SNDH). Transformation capable of high production of 2KLGA from D-sorbitol transformed in vector And an efficient and convenient method for producing 2KL GA by culturing the transformant and the transformant.
  • SDH DNA encoding L-sorbose dehydrogenase
  • SNDH DNA encoding L-sorbosone dehydrogenase
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, succeeded in obtaining an expression vector having the above-mentioned desirable properties, further producing L-sorbose in a high yield, and having a low 2KLGA-degrading activity.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention relates to an expression vector containing both DNA encoding SDH (hereinafter also referred to as SDH gene) and DNA encoding SNDH (hereinafter also referred to as SNDH gene).
  • the present invention provides a method for producing L-sorbose in high yield from D-sorbitol and having no or low 2K LGA decomposition activity, or having no or low L-idonic acid production activity in addition to the above-mentioned properties.
  • a microorganism having The microorganism is useful as a host for introducing the expression vector.
  • the expression vector referred to in the present invention includes not only a vector containing the SDH gene and the SNDH gene on a single vector, but also a set of vectors containing the respective genes in different vectors.
  • the present invention relates to a transformant in which the above-mentioned expression vector has been introduced into the microorganism, which has the ability to produce 2KLGA in high yield from D-sorbitol.
  • the present invention relates to a method for producing 2 KLG A, which comprises culturing the transformant in a medium containing D-sorbitol and collecting 2 KLG A from the resulting culture.
  • the present invention also relates to an expression vector, a host, a brassamide, and a transformation method useful for efficiently and conveniently producing 2KLGA from D-sorbitol in a gene recombination technique.
  • FIG. 1 is a restriction map of plasmid pUC18SD180.
  • FIG. 2 is a restriction map of brassmid pUC 19 SD5.
  • FIG. 3 is a restriction map of plasmids pF2, pF3 and pF4.
  • FIG. 4 is a construction diagram of the shuttle vector pFG5B.
  • FIG. 5 is a construction diagram of the shuttle vector pFG14A.
  • FIG. 6 is a construction diagram of the shuttle vector pFG15A.
  • FIG. 7 is a restriction map of brasmid pSD5-RIBg.
  • FIG. 8 is a construction diagram of the expression vector pSDH145.
  • FIG. 9 is a construction diagram of the expression vector pSDH155.
  • FIG. 10 is a construction diagram of the expression vector PSD33.
  • FIG. 11 is a construction diagram of the expression vector PSD34.
  • FIG. 12 is a construction drawing of the expression vector pSDH155-NC.
  • FIG. 13 is a construction diagram of the expression vector pSDHl55-NN.
  • FIG. 14 is a construction diagram of the expression vector pSDHl65-NN.
  • FIG. 15 is a construction diagram of the expression vector pSDH-tufB1.
  • the expression vector of the present invention contains both the DNA encoding SDH and the DNA encoding SNDH.
  • the expression vector of the present invention is a DNA molecule in which the SDH gene and the SNDH gene are integrated in a state where they can be expressed, and can be replicated autonomously in the host microorganism or can be integrated into the genome of the host microorganism. Includes all media with properties that can be incorporated.
  • an expression vector suitable for transforming a microbial host having the above into a microorganism having a characteristic of producing 2 KLGA from D-sorbitol in high yield preferably contains at least a promoter, an SDH gene, an SNDH gene, and a self-replicating unit that exhibit high promoter activity even in microorganisms that highly produce L-sorbose from D-sorbitol.
  • an expression vector which may further contain a terminator region and is stably present in the microorganism is exemplified. More preferably, they belong to the genus Gluconobacter or Acetobacter, produce high levels of L-sorbose from D-sorbitol, have no or low activity of degrading 2K LGA, or additionally have L-idonic acid in addition to the above properties. It is an expression vector suitable for transforming a microbial host having no or low activity to produce a microorganism that produces high 2KLGA from D-sorbitol.
  • a shuttle containing a self-replicating unit stably functioning in a microbial host as well as a self-replicating unit of a microorganism such as Escherichia coli suitable for cloning of the expression vector is used as such an expression vector. It is particularly advantageous to use vectors.
  • a shuttle vector containing a marker gene such as an antibiotic resistance gene is also advantageous.
  • suitable shuttle vectors include, for example, a combined plasmid pFG14A and pFG14B of PHSG298 and PF3, and a combined plasmid pFG15A and pFG15B of pHSG298 and pF4.
  • marker gene used here examples include kanamycin resistance gene, gamma ampicillin resistance gene, chloramphenicol shochu gene, drug resistance gene such as hygromycin resistance gene, auxotrophic gene, and enzyme genes such as 1acZ. Is mentioned.
  • the promoter used in the expression vector of the present invention is not particularly limited, as long as it is a DNA having a promoter activity for copying the SNDH and Z or SDH genes in a host microorganism.
  • a promoter having a high transcriptional activity with respect to the SNDH gene and / or the SDH gene is desirable even in a microbial host that highly produces L-sorbose from D-sorbitol.
  • Such promoters include, for example, the promoter region of the SNDH gene or the promoter activity.
  • promoter region of the SNDH gene derived from Gluconobacter oxydans T-110 which is contained in base number 111040 of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing, or a sequence thereof. Some of them have promoter activity.
  • a promoter derived from Escherichia coli, for example, tufB, ⁇ PL> trp, tac, iacUV5, iap. £ ac, ompA, phoA, recA, and rrnB promoter can be used as the promoter.
  • c Preferred are tuf B, ⁇ PL, trp and tac promoters. Sequences other than the 135 region and the 110 region of these promoters can be appropriately selected so as to be suitable for, for example, plasmid construction.
  • a self-replicating unit is a DNA compound capable of replicating the DNA sequence belonging to it in a host cell, and is composed of a natural plasmid, an artificially modified plasmid (for example, a natural plasmid). Prepared DNA fragments) and self-replicating units derived from synthetic plasmids.
  • the self-replicating unit can be appropriately selected depending on the microorganism used as a host.
  • a plasmid-derived self-replicating unit obtained from a microorganism of the same species as the host is used.
  • the host is a microorganism of the genus Darconobacter
  • a plasmon derived from Gluconobacter is preferred.
  • a site is a site where a cleavage site for a certain restriction enzyme is limited, and a restriction enzyme site that does not lose the activity of the self-replicating unit even when it is cleaved by the restriction enzyme or when a DNA sequence is inserted into that site.
  • plasmids include, for example, plasmid pF3 derived from Gluconobacter I-AMI 21338 and pF4 derived from Gluconobacter-T100.
  • a self-replicating unit of a microorganism suitable for cloning usually includes a self-replicating unit of a microorganism-derived plasmid used for cloning in the field of genetic engineering.
  • a self-replicating unit of a microorganism-derived plasmid used for cloning in the field of genetic engineering There is no particular limitation as long as it is a nit.
  • DNA fragments DNA fragments
  • yeast-derived yeast 2-plasmid-derived self-replicating units and the like.
  • the mode of existence of the SDH gene and SNDH gene in the expression vector of the present invention is not particularly limited as long as SDH and SNDH can be expressed.
  • the expression vector of the present invention may contain the SDH gene and the SNDH gene in such a manner that the transcription and translation of the gene are controlled by separate expression systems, respectively, or both genes may constitute a set of genes.
  • the gene may be included in a manner governed by the expression system.
  • Examples of the expression vector having the former embodiment include an expression vector in which each gene is constructed so that transcription occurs under the control of a separate promoter, and examples of the expression vector having the latter embodiment include: An expression vector in which the SDH gene and the SNDH gene are constructed so that transcription is continuously generated from one promoter is exemplified.
  • the present expression vector may include a plurality of SDH genes and a plurality of Z or SNDH genes.
  • the DNA encoding SDH and the DNA encoding SNDH used in the present invention may be any gene encoding an enzyme having SDH activity and an enzyme having SNDH activity, such as cytoplasm.
  • a gene encoding a microorganism-derived enzyme and a gene encoding a mutant thereof are used.
  • Gluconobacter as microorganisms include microorganisms belonging to Asetobaku evening one genus, etc., glucono Pakuta-Okishidansu Specific examples thereof T- 1 00 (FERM BP- 4 1 88) can be mentioned c Gluconobacter one-
  • the membrane-bound SDH derived from Oxidans T-110 include enzymes having the following features (1) to (3). (1) Catalyze the conversion of L-sorbose to L-solposon.
  • the SDH gene is more preferably a DNA encoding a protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing below, and still more preferably a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 3. It is.
  • Examples of the cytoplasmic SNDH derived from Gluconobacter oxydans T-110 include enzymes having the following features (1) to (3).
  • amino acid sequence on the N-terminal side is Asn-Val-Val-Ser-Lys-Thr-Val-Xaa-Leu (Xaa is an unidentified amino acid).
  • the SNDH gene is more preferably a DNA encoding a protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing below, and still more preferably a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 4. Is exemplified.
  • Suitable expression vectors of the present invention include pSDH145, pSDH155 (FERM BP-4522) and the like.
  • the expression vector of the present invention can be prepared by a conventional method (eg, digestion using a restriction enzyme, religion using T4 DNA ligase, etc.) using an appropriate DNA fragment, if necessary, using the above-described expression system and DNA encoding SDH. Alternatively, it can also be prepared by circularly linking the DNA encoding SNDH to an appropriate self-replicating unit.
  • the microorganism used as a host in the present invention is a microorganism that produces L-sorbose from D-sorbitol at a high level and does not have the activity of degrading 2KLGA or has a low activity of degrading the same.
  • a microorganism having no or low activity to produce L-idonic acid is, in the present invention, the host has a high conversion efficiency from D-sorbitol to L-sorbose, has a low activity to metabolize L-sorbose, or metabolizes L-sorbose out of the metabolic pathway from L-sorbose to 2KLGA. It is important that the microorganism has low activity of metabolizing into substances and low activity of degrading 2KLGA.
  • microorganisms can grow in an environment with a high D-sorbitol concentration of preferably 5% or more, more preferably 15% or more, and convert D-sorbitol to L-sorbose with an efficiency of about 100%.
  • Microorganisms with convertible properties are preferred. Examples of such microorganisms include microorganisms belonging to the genus Gluconobacter or Acetobacter, for example, Gluconobacter oxydans G 624 (FE R BP—44 15), gluconobacter oxydans NB 693. 9 are examples.
  • the transformant of the present invention can be prepared by introducing the above-described expression vector into the above-mentioned host cell.
  • the transformant of the present invention can also be prepared by introducing the SDH gene and the SNDH gene into separate expression vectors, and introducing each into one of the above-mentioned microbial host cells.
  • the method for preparing the transformant is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the microorganism host.
  • the electoporation method Dower, WJ, Miller, JF and Ragsdale. CW. Nucleic Acid Res. Vol. 16 (1988). P6127
  • the electroporation method may be a conventional method used in the field of genetic engineering, or may be appropriately modified according to the microorganism host to be transformed.
  • the present invention also relates to a method for preparing a competent cell suitable for the electroporation method.
  • the competent cells suitable for the electroporation method belong to the genus Gluconobacter or the genus Acetobacter, from D-sorbitol to L-sorbitol.
  • a microbial host having high or low activity to degrade 2 KLGA, or having, in addition to the above-mentioned properties, no or low activity to produce L-idonic acid, D-mannitol It can be suitably prepared by culturing in a medium containing.
  • the transformant thus produced has the ability to produce 2KLGA in high yield from D-sorbitol.
  • whether or not the host is correctly transformed is determined by a selectable marker possessed by the transformant (for example, an antibiotic resistance gene such as kanamycin resistance, a nutritional requirement, an enzyme gene such as 1acZ).
  • a selectable marker possessed by the transformant for example, an antibiotic resistance gene such as kanamycin resistance, a nutritional requirement, an enzyme gene such as 1acZ.
  • it can be determined by measuring the SDH activity and SNDH activity of the transformant.
  • the method for producing 2KLGA of the present invention comprises culturing the transformant containing the expression vector obtained as described above in a medium containing D-sorbitol, and collecting 2KLGA from the obtained culture. Special.
  • the nutrient medium used may vary in composition depending on the host, but generally contains D-sorbitol and generally contains D-mannitol, D-glucose, D-fructose, L-sorbose. And glycerol and the like. It is also desirable to include an inorganic or organic nitrogen source (for example, ammonium sulfate, ammonium chloride, casein hydrolyzate, yeast extract, bolipeptone, bactotripton, beef extract, corn steep liquor, etc.).
  • an inorganic or organic nitrogen source for example, ammonium sulfate, ammonium chloride, casein hydrolyzate, yeast extract, bolipeptone, bactotripton, beef extract, corn steep liquor, etc.
  • nutrient sources eg, inorganic salts (eg, sodium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, magnesium chloride, magnesium sulfate, calcium carbonate, A medium such as calcium chloride), vitamins (eg, vitamins), antibiotics (eg, ampicillin, potassium namycin, tetracycline, chloramphenicol, etc.) may be added to the medium.
  • inorganic salts eg, sodium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, magnesium chloride, magnesium sulfate, calcium carbonate, A medium such as calcium chloride
  • vitamins eg, vitamins
  • antibiotics eg, ampicillin, potassium namycin, tetracycline, chloramphenicol, etc.
  • a medium containing D-sorbitol, yeast extract, calcium carbonate, and the like can be used.
  • concentration of D-sorbitol in the medium is usually 1 to 30%, preferably 5 to 20%.
  • Culture of the transformant is carried out by appropriately selecting conditions that produce 2 KLGA according to the microorganism host.
  • the pH is usually 5.5 to 8.5, preferably pH 7 to 7.5
  • the culture temperature is usually 18 to 40 ° C, preferably The culture time is usually 20 to 170 hours.
  • Such 2 KLGA produced by the, c therefore purification of 2KLGA in solution fraction usually cultures acquires culture filtrate by first filtration or centrifugation Cultures
  • the culture filtrate The purification can be carried out by using a purification method generally used (for example, column chromatography on an appropriate adsorbent, crystallization, etc.).
  • Enzymes such as plasmid, restriction enzymes, T4 DNA ligase, and other substances used in the following examples and other substances were used according to the instructions in the attached instruction manual. Operations such as DNA cloning, culturing of a transformant, and recovery of 2KLGA from the obtained culture are well known to those skilled in the art or can be known from the literature.
  • Gluconobacter oxydans T-100 (FERM BP-418), Gluconobacter oxydans G 624 (FERM BP-44 15) Gluconobacter oxydans GA-1 (G 624 -P SDH) used in the present invention.
  • 1 55) (FERM BP-4522) and Gluconobacter oxidans N 952 (NB 6939-pSDHl 55) (FERM BP-4580) have been deposited internationally at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, the Ministry of International Trade and Industry.
  • 2KLGA useful for the production of L-ascorbic acid can be produced easily and in large quantities efficiently by a single culture.
  • Example 1 Purification of SDH from Gluconobacter oxydans T-100 (1) Microorganism Gluconobacter oxydans T—100 (FERM BP-418) is high in 2 KLG A derived from gluconobacter oxydans G711 (wild-type) by nitrosoguanidine (NTG) mutation treatment. It was selected as a productivity mutant.
  • a single colony of Gluconobacter oxydans T-010 was isolated from a 2.5-milliliter Erlenmeyer flask containing 2.5% glucose, 1.0% borepeptone, 0.5% yeast extract (manufactured by Diff Laboratories) and 2.0% calcium carbonate. Of each of the six culture media (100 ml each). Culture 3 0 D C, 1 8 hours to carry out a rotary sheet We squid one (25 Orpra). Inoculate the fermentation medium (5% D-sorbitol, 0.5% glycerol, 0.5% yeast extract and 1.0% calcium carbonate) in 30 litter jars with 20 liters of the cultured medium (total amount: 600 ml) did.
  • the membrane fraction obtained in (3) was suspended in 5 Om ⁇ of 1 OmM phosphate buffer (pH 7.0). To the suspension were added 0.75 ml of 20% Triton X-100 (manufactured by Nacalai Tesque) and 1.8 g of L-sorbose, and the mixture was stirred on ice for 3.5 hours. Get The suspension was ultracentrifuged at 4'C at 32, 000 rpm for 60 minutes to obtain a supernatant (about 48 m), which was named as a dissolved SDH fraction.
  • the dissolved SDH fraction (16m ⁇ ) obtained in (4) was equilibrated with 1 OmM phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.3% Triton X-100 and 20 OmM L-sorbose.
  • Ion-exchange chromatography using a TSKg e H DEAE-5 PW column (7.5 mm ID x 75 mm, manufactured by Tosoh Corporation), eluting with a linear gradient of sodium chloride from 0 M to 0.5 M in equilibration buffer did. According to the method of Sugisawa et al., CAgric. Biol. Chem .. Vol. 55.
  • the activity of the enzyme was measured in 0.28 M phosphate buffer (pH 7.0) using 0.2 ml sorbose.
  • 0.1 mM 2,6-dichroic phenol indophenol (DC IP) was used as an electron acceptor.
  • One unit of enzyme was defined as the amount of enzyme that catalyzed the reduction of 1 ⁇ ⁇ of DC IP per minute.
  • the reduction of DCIP was measured by the absorbance at 600 nm using an absorptiometer (model UV-160, manufactured by Shimadzu Corporation).
  • the active fractions were collected, diluted 3-fold with 1 OmM phosphate buffer (pH 7.0), and then equilibrated with 1 OmM phosphate buffer (pH 7.0).
  • DEAE-TOYOPEARL 650 M The mixture was applied to a column (7.0 mm inner diameter x 17 mm, manufactured by Tosoh Corporation) and eluted with an equilibration buffer containing 0.2 M sodium chloride. The eluate obtained was subjected to a further purification step.
  • the concentrated active fraction (15 /) was subjected to SDS-PAGE (12.5% gel), and the separated proteins were blotted on a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane.
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • a membrane containing a protein with a molecular weight of 58 kd stained with ponceauS was cut out and washed with distilled water.
  • the membrane fragment was directly applied to an automatic protein sequencer.
  • Model 47 OA manufactured by Abride Biosystems
  • oligonucleotides listed in Table 2 below were synthesized by a phosphoramidite method using DNA synthesizer model 392 (manufactured by Applied Biosystems). Synthesized oligonucleotides in 28% aqueous ammonia Desorbed from rimer carrier (CPG: controlled pore glass), 60. C, heated for 9 hours to remove all protecting groups. The solvent was distilled off from the reaction mixture under reduced pressure under reduced pressure, and the residue was dissolved in 200 / TE buffer [1 OmM Tris-monohydrochloride ( ⁇ 7.4) -1 mM EDTA]. The resulting solution was washed once with ether and precipitated with ethanol. The oligonucleotide obtained by the precipitation was used as it was as a primer in the polymerase chain reaction.
  • Oligonucleotide encoding NH 2 -terminal sequence (positive primer)
  • Oligonucleotide encoding inner sequence (reverse primer)
  • a single colony of Gluconobacter oxydans T100 was cultured for 24 hours at 37 in a medium of 10% Om ⁇ , consisting of 2% glucose, 1% borepteptone and 0.5% yeast extract. The cells were collected by centrifugation (4,600 rpni, 10 minutes) and suspended in 2.5 m of ⁇ buffer. One part (2.0 m ⁇ ) of the suspension was subjected to STE buffer [20% sucrose-1.5 OmM Tris-HCl (pH 8)-1 mM EDTA]
  • PCR polymerase chain reaction
  • this DNA fragment (180 bp) was considered to encode a part of the SDH gene, this DNA fragment (180 bp) was unfolded by 1.5% agarose gel electrophoresis, and DNA polymerase was synthesized. The sticky end was blunted with Klenow fragment (manufactured by Takara Shuzo) to obtain blunt-ended DNA.
  • the obtained DNA and pUC18 (manufactured by Nippon Gene), which had been digested with SmaI in advance, were ligated in the presence of T4 DNA ligase (manufactured by Takara Shuzo). The ligation mixture was used to transform E.
  • the insert DNA (about 200 bp) was multiplexed by digesting pUC18SD180 with BamHI and EcoRI (Nippon Gene). The approximately 200 bp DNA was purified by 0.5% agarose gel electrophoresis. The purified DNA was labeled with 32 P using a nick translation kit (Takara Shuzo) according to the attached protocol. Labeled specific activity of DNA with 32 P was about 3.7 X 1 0 7 cpra / ⁇ . G.
  • Example 4 Isolation of the SDH gene from Gluconobacter mutans T-100 DNA library (1) Preparation of chromosomal DNA library
  • the chromosomal DNA obtained in Example 3 (2) was partially digested with Mb0I (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.), and the obtained fragment was separated by sucrose gradient to obtain a fragment in the size range of 8 kb to 22 kb.
  • Mb0I manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.
  • This lambda phage vector was introduced into E.coli NM 538 (manufactured by Clontech) to obtain a Gluconobacter-T100 chromosome DNA library.
  • UC.l9SD5 was digested with EcoRV (Toyobo). Hybridize with a ⁇ 32 P-labeled probe of the three bands separated by 1.5% agarose gel electrophoresis 1.Symbolize 1 kb DNA and clone it into the Sma I site of pUC 18 Brasmid p SD 5RRV was obtained.
  • pUC19SD5 was digested with EcoRV and Eco47III (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), digested with c- large DNA (about 5.700 bp), ligated with T4 DNA ligase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) Ligation was done to get Brasmid P SD 5 RVS.
  • the DNA sequence of type I DNA (30513 ⁇ 413 ⁇ 4 and 30513 ⁇ 43) was analyzed by a DNA termination method using a 370 A DNA sequencer (manufactured by Applied Biosystems) according to the attached protocol.
  • the first sequencing was performed using the M13 sequencing primer, a universal primer and a reverse primer (manufactured by New England Biolabs).
  • the next primer was synthesized and subjected to DNA sequence analysis one after another.
  • the synthetic primers used are listed in Table 3 ai.
  • SDH gene The nucleotide sequence of this SDH gene is shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing below, and the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
  • E. c01iJM109 (E.coi JM109 / pUC19SD5) transformed with pUC19SD5 was transformed into 1% pacttributon (Diff Laboratories), 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride and 0.1% glucose (pH 7.2) were inoculated into 100 m of medium and cultured for 3 hours (TC for 18 hours).
  • the cells were washed twice with physiological saline and suspended in 5 ml of the same solution. Cloudy It was therefore crushed in sonication total treatment time 2 minutes under cooling 30 second intervals. The resulting cell broken ⁇ was stored in one 20 ° C until used for enzyme Atsusi.
  • the activity of the expressed SDH was examined by measuring the amount of the reaction product, L-sorbosone, using high performance liquid chromatography (HPLC). 1% L-sorbose, lmM phenazine meso sulfate, 0.1M phosphate buffer (p H8.0) and sonicated reaction solution consisting of cell disruption product was ⁇ incubated shaking for 5 hours at 30 e C. The reaction was stopped by adjusting the pH to 2 with 6 N sulfuric acid, the reaction mixture was centrifuged at 6000 rpm for 10 minutes at 4 ° C, and a part of the supernatant was directly subjected to HPLC (# 3011 N column, 4.6 mm inner diameter X 300 mm, manufactured by Hitachi, Ltd.).
  • the mobile phase used was 1 M borate buffer (pH 9.5) containing 0.02 M benzamidine hydrochloride and 0.25 M sulfuric acid, which is used as the column chromatography method, and the flow rate was 0.8 m ⁇ Zm in. did.
  • the post-column labeling reaction was performed in a Teflon tube (0.5 mm ID x 10 m) at 80 tubes. Detection of the labeled compound was performed by monitoring the fluorescence (Ex. 315 nm, Em. 405 nm). As shown in Table 4, the sonicated cells containing the plasmid pUC 19 SD5 had the ability to convert L-sorbose to L-sorbosone.
  • the recombinant plasmid pUC19SD5 contains a gene encoding L-sorbose dehydrogenase, which is expressed in E.coI JM109. .
  • Example 7 Purification of SNDH from Gluconobacter oxydans T-100 (1) Preparation of crude enzyme solution
  • Example 1 The cells (about 10 g, wet weight) obtained in 1 (2) were suspended in 4 Om of 1 OmM phosphate buffer (pH 7.0) under ice-cooling and disrupted by ultrasonication. This is 4, 8, The mixture was centrifuged at 00 rpm for 10 minutes, and the supernatant was ultracentrifuged at 4, 32, OOO rpm for 60 minutes. The obtained supernatant was used in subsequent experiments as a crude SNDH enzyme solution.
  • the enzyme solution (about 75m) obtained in (2) is passed through a Brucepharose column (1.0 cm ID x 7 cm, manufactured by Pharmacia) pre-equilibrated with a phosphate buffer, and the force ram is applied to the buffer. After washing with the same solution, elution was performed with a linear gradient at a concentration of 0 M to 0.6 M sodium chloride in the same buffer. Each surface was analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) in the presence of sodium dodecyl sulfate and the enzyme activity measurement method described in Example 7 (2). As a result, it was found that a protein having a molecular weight of 50 kd in SDS-PAGE corresponded to the enzyme activity, and it was inferred that the protein of 5 Okd was a desired SNDH molecule.
  • SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
  • the active fraction (75 /) obtained in Example 7- (3) was subjected to SDS-PAGE, and the separated protein was blotted on a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane.
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • a membrane containing a protein of 50 kd stained with Coomassie Priliable Blue was cut out and washed with distilled water.
  • the membrane fragment was directly subjected to an automatic protein sequencer Pedel 47 OA (manufactured by Abride Biosystems) to obtain an N-terminal amino acid sequence. It was determined. The results are shown below (however, Xaa is an unidentified amino acid).
  • Example 4 The plasmid pUCl9SD5 (FIG. 2) obtained in step (3) was digested with Sa_gI (manufactured by Nippon Jin) and EcoRV (manufactured by Toyobo), and 0.8% was digested. The samples were subjected to agarose electrophoresis. Two DNA fragments of about 6 OO bp and 4,300 bp were isolated from the gel, and the former was inserted into the SmaI site of PUC18 to construct pSD6 RRV.
  • Sa_gI manufactured by Nippon Jin
  • EcoRV manufactured by Toyobo
  • the nucleotide sequence of type I DNA was analyzed by using a 37 OA DNA sequencer (manufactured by Abride Biosystems). Determined by the termination method. Initial analysis was performed using Ml3 sequencing primers, Universal Primer and River Primer (New England Biolabs, USA). Furthermore, based on the DNA sequence found in the initial sequence analysis, the following primers were synthesized and subjected to DNA sequence analysis one after another. The synthetic primers used are shown below.
  • ORF open reading frame
  • the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence following the start codon (ATG) of this ORF is identical to the N-terminal amino acid sequence of SNDH obtained in Example 8, and the theoretical value of the protein encoded by the ORF is The molecular weight of 53 kd was in good agreement with the molecular weight of SNDH of 50 kd (SDS-PAGE). Therefore, this ORF is presumed to be the SNDH gene.
  • C The nucleotide sequence of this SNDH gene is shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing below, and the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • a cell lysate of E. coli JM109 / pUC19SD5 was obtained in the same manner as in Example 6, and was stored at 120 ° C until used for the enzyme assay.
  • the expressed SNDH activity was examined by measuring the amount of the reaction product, 2KLGA, using HPLC.
  • the reaction solution consisting of 1% L-sorbosone, 0.5 mM NAD, 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0) and the sonicated cell lysate was incubated at 30 with shaking for 5 hours.
  • the reaction was stopped by adjusting the pH to 2 with 6N sulfuric acid, the reaction mixture was centrifuged at 6000 rpm for 10 minutes at 4 ° C, and a part of the supernatant was subjected to HP LC (column Capcellpak NH 2 : 4.6). m inner diameter X 25 Omm, manufactured by Shiseido Co., Ltd.).
  • As the mobile phase a 2 OmM sodium phosphate buffer (pH 3.0) containing 30% acetonitrile was used, and the flow rate was 1.2 minutes. Detection was performed by measuring ultraviolet absorption at 210 nm.
  • the recombinant plasmid pUC19SD5 contains the gene encoding SNDH, and the ORF consisting of 1497 bp upstream of the 5 'side of the SDH gene found in Example 9. Was found to be an SNDH gene.
  • Producing bacteria that convert D_sorbitol to L-sorbose in high yield were isolated from fruits. Add a small amount of isolation source to a culture medium consisting of potato dextrose 2.4%, ethanol 0.5%, peptone 0.3%, yeast extract 0.5%, acetic acid 0.03%, and settle at 30 for 5 days. The cells were cultured. For the pure separation of bacteria, use a plate medium consisting of 5% D-sorbitol, 0.5% yeast extract, 0.25% calcium carbonate, and 1.5% agar.
  • the bacteria grown on the plate medium were inoculated into a test tube containing 6 ml of a seed medium consisting of 2.5% glucose, 0.5% yeast extract, 1.0% bolipeptone and 0.5% calcium carbonate, and inoculated at 30'C.
  • a seed medium consisting of 2.5% glucose, 0.5% yeast extract, 1.0% bolipeptone and 0.5% calcium carbonate
  • Time test tube After culturing in a shaking incubator, add 0.5 ml of the culture solution to a volume of 100 ml containing a production medium consisting of 5% of D-sorbitol, 0.5% of yeast extract, and 2% of calcium carbonate.
  • the cells were resuspended in saline and adjusted to a volume of 2.5 ml. Next, the cells were subjected to sonication under ice cooling at intervals of 30 seconds for a total treatment time of 6 minutes to prepare sonicated cells.
  • Ultrasonicated cells 1. Add 1.0m ⁇ of Om ⁇ to a test solution consisting of 2% 2KLGA. 2mM N ADPH, 0.2M phosphate buffer (pH 7.0), and incubate for 30 hours, 3 hours and 5 hours. After shaking for an hour, the pH was adjusted to 2 with 6N sulfuric acid to stop the reaction. The reaction solution was centrifuged at 4 ° C.
  • the bacterium should be Gluconobacter oxydans based on DNA homology. It was determined.
  • G624 was sensitive to kanamycin and was selected as a host cell that can use kanamycin resistance as a selectable marker.
  • Escherichia coli was selected as a microorganism suitable for large-scale acquisition of shuttle vectors and cloning of expression vectors, and a shuttle vector capable of autonomous replication in both Darconobacter oxidans and E. coli was constructed.
  • Gluconobacter Ibu cultivator IF 0328 7, I AMI 213 8 and natural isolate Gluconobacter oxydans T-100 were each added to MB medium (D-mannitol 2.5%, bori peptone). 0.3%, yeast extract 0.5%, pH 6.0) Inoculate 10 test tubes containing 6m ⁇ and 30. Seed culture was performed at 18 C for 18 hours using a test tube shaker. 50 Om ⁇ Erlenmeyer flask 100 ml of the MB medium was added to each of the 10 tubes, and 3 ml of the seed culture was inoculated, and cultured for 30 hours at 30 minutes.
  • MB medium D-mannitol 2.5%, bori peptone
  • the obtained 10 cultures (1 liter) were centrifuged at 600 rpm for 10 minutes at 4 rpm, and the obtained cells were placed in a P1 solution (100 g nom ribonuclease).
  • Zehachi, 1 OmM EDTA, 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0) Suspended in 30 m, 30 ml of P2 solution (1% SDS, 0.2 N sodium hydroxide solution) and 30 ml of P3 solution (3 M potassium acetate Buffer solution 5.5 5.5) 30 ml was added, and centrifugation was carried out at 4 at 130 0 111 for 30 minutes.
  • the supernatant is again centrifuged under the same conditions, and the supernatant is QBT solution (15% ethanol, 0.15% Triton X-100, 75 Om sodium chloride, 5 OmM MOPS buffer pH 7.0) QC solution (15% ethanol, 1 M sodium chloride, 5 OmM MOPS buffer pH 7.0) 1 Om
  • QBT solution 15% ethanol, 0.15% Triton X-100, 75 Om sodium chloride, 5 OmM MOPS buffer pH 7.0
  • QF solution 15% ethanol, 1.25M sodium chloride, 5OmM Tris-HCl buffer pH8.5
  • the mixture was centrifuged at 100 O rpm for 30 minutes at 4 and the precipitate was washed with 70% ethanol and dried under reduced pressure to obtain DNA.
  • the obtained DNA was dissolved in TE buffer (1 mM EDTA, 1 OmM Tris-HCl buffer PH8.0) 150 / £.
  • TE buffer 1 mM EDTA, 1 OmM Tris-HCl buffer PH8.0
  • ⁇ in dill molecular weight marker manufactured by Boehringer Mannheim
  • these DNA solutions are electrophoresed on a 0.8% agarose gel at 100 V for 30 minutes, and then stained with ethidium bromide in the range of 2 kb to 5 kb. After excising a single band from the gel, place it in a dialysis tube and run it at 100 V for 30 minutes, reverse the current direction and run it for 30 seconds, and then transfer the solution in the tube to an Eppendorf tube.
  • pF4 The 4.4 kb plasmid derived from the strain Gluconobacter T-100 was named pF4 (see FIG. 3).
  • pH SG 298 manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. having a kanamycin resistance gene and a ⁇ acZ gene containing a multicloning site was used as a drug resistance plasmid containing an origin of replication that functions in Escherichia coli.
  • the shuttle vector was created as follows. pHSG298 was cleaved with the restriction enzyme Ac cI (Nippon Gene), treated with alkaline phosphatase, and a combined plasmid ligated with pF 2 cut with Ac c I and T4 DNA ligase was prepared and named pFG5B. (See Figure 4). In addition, pHSG298 was partially digested with the restriction enzyme Hindill (manufactured by Nippon Gene), treated with alkaline phosphatase, and ligated to pF3 and pF4 cut with Hindlll using T4 DNA ligase. .
  • the combined brasmids containing the kanamycin resistance gene were named PFG14A and pFG15A, respectively (see FIGS. 5 and 6). These combined plasmids were introduced into E.coli JM109 by a transformation method, and strains having the combined plasmid were selected based on kanamycin resistance and the presence or absence of coloring by ⁇ acZ.
  • Gluconobacter oxydans G 624 (FERM BP-44 15) was inoculated into a 50 Om Erlenmeyer flask containing 100 m ⁇ of a medium consisting of 2.5% glucose, 0.3% bolipeptone, and 0.5% yeast extract. After confirming that the absorbance at 57 O nm of the culture solution was in the range of 0.6 to 1.2, the cells were collected by centrifugation at 6000 rpm for 10 minutes at 4. Transformation was carried out by the electroporation method (Dower, WJ, Miller, JF and Ragsdale, CW, Nucleic Acid Res. Vol. 16 (1988). P6127) according to the case of E. coli.
  • Example 12- (2) The shuttle vector pFG14A obtained was isolated and purified according to the method described in Example 12- (1), and then used as a 4 mg DNA solution in TE buffer. Add 1 ⁇ ⁇ ⁇ of shuttle vector to Combination Cell Suspension 1 and mix. Place the transformant 60 n1 in a cuvette of Gene Pulser (Bio-Rad).
  • the mannitol medium 1500 shuttle vectors pFG5B and pFG15A can be transformed in the same manner by transforming Gluconobacter oxydans G624 with the transformants G624-pFG5B and pFG5B.
  • G 6 24—pFG 15 A could be obtained.
  • the AccI cleavage site of Gluconobacter plasmid pF2 and the Hindill cleavage site of pF3 and pF4 are the self-replicating units of each plasmid. It was also found that it was present in a site unrelated to
  • the stability of the shuttle vector in the host was determined as follows.
  • Liquid culture was passaged for 2 passages in MB medium in the absence of kanamycin, and no broth was added from each broth.Molded on agar plates at 30'C for 2 days, and grown colonies were added with kanamycin 50 / g MB. Agar plates and no additives were added to MB agar plates and stability was examined. The stability was calculated from the following equation. Table 9 shows the results.
  • the sorbose productivity of the transformed strain into which the three types of pFG shuttle vectors were introduced was the same as that of the host, and the effect of plasmid on productivity was not observed.
  • Example 15 DNA sequence derived from Gluconobacter oxydans 100 of pSD5-RIBg
  • PUC 19 SD 5 (Fig. 2) to determine the DNA sequence of the 5 'upstream region (including the promoter) of the SNDH gene and the DNA sequence of the 3' downstream region (including the evening, one and one night) of the SDH gene was analyzed in the same manner as in Examples 5 and 9. The results are shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing. Nucleotide numbers 1 to 1040 contain the promoter region, nucleotide numbers 1041 to 4132 contain the SNDH gene and SDH gene, and nucleotide numbers 4133 and later contain the terminator.
  • the expression vectors pSDH145 and PSDH155 obtained in Example 14 were transformed into Gluconobacter oxydans G62 in the same manner as in Example 13 (1). After the transformation, transformants G34 (G624 pSDH145) and GA-1 (G624-PSDH155) (FERM BP-42522) were obtained.
  • Transformed strain GA-1 was inoculated into a test tube containing medium 6 consisting of 2.5% glucose, 1.0% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.5% calcium carbonate, and 50 figZm ⁇ kanamycin. Seed culture was performed for 18 hours using a test tube shaker. 0.3 m of this seed culture is inoculated into a 10 Om ⁇ volume triangular flask containing 1 Om ⁇ of a medium consisting of 5% D-sorbitol, 0.5% yeast extract, and 2.0% calcium carbonate. The culture was performed for 5 days on a rotary shaker (250 rpm). The supernatant obtained by centrifuging the culture at 4 ° C.
  • the productivity of 2KLGA is clearly higher than that of Gluconobacter oxydans T-100, which is a mutant that improves 2KLGA production of a natural isolate that produces 2KLGA from D-sorbitol. .
  • Example 16 A seed culture solution lm ⁇ of IA1069 cultured according to the method described in (3) was inoculated into a 100 ml Erlenmeyer flask containing novobiocin 0,5 gZm ⁇ supplemented MB medium 20 m ⁇ , The cells were cultured at 30 eC for 24 hours on a rotary shaker (250 rpm) and subcultured 5 times in the same medium.
  • This culture solution was plated on MB agar plate without kanamycin, cultured at 30'C for 2 days, and the grown colonies were replicated on MB agar plate without kanamycin and MB agar plate with kanamycin 50 gZm ⁇ , and the expression vector pSDHl 55 Lost strains were selected. After 5 passages, the loss rate of the expressed vector PSDH155 was 50%. Using the screening method described above, cells were isolated from the expression vector p SDH 155-lossed strain, and it was confirmed that p SDH 155 was completely removed by agarose gel electrophoresis according to the method described in Example 12 (1). confirmed.
  • the resulting expression vector pS DH155 deficient strain NB6939 was examined for its activity to convert D-sorbitol to L-sorbose according to the method described in Example 11 (1). It was found that it showed the same high sorbose productivity.
  • Example 18 Transformation of Gluconobacter oxydans NB 6939 with an expression vector and 2KLGA productivity of the transformed strain
  • the expression vector PSDHl45 and pSDH155 were converted to the Gluconobacter oxydans NB 6939 obtained in Example 17 in the same manner as in Example 13 (1). Transformation was carried out to obtain transformants N 943 (NB 6939-pSDH145) and N 952 (NB 6939-pSDH155) (FERM BP-4580).
  • N 943 and N 952 as in Example 16— (3), 0.3 ml of the seed culture was mixed with 5% D-sorbitol, 0.5% yeast extract, and 2.0% carbonated medium 1 Om The flask was inoculated into a 10 Om ⁇ volume flask containing ⁇ and cultured at 250 ° C for 7 days at 30 ° C.
  • Example 19 Transformation of Gluconobacter oxidans NB 6939 with an Escherichia coli promoter-integrated expression vector and 2 KLG A productivity of the transformed strain
  • the expression vector pSDH155 contains the nucleotide sequence up to 1,040 bp upstream of the SNDH translation initiation codon (ATG) of the Gluconobacter foxdans T100 chromosomal DNA (SEQ ID NO: 5), and By inserting a strong promoter sequence instead of the promoter sequence, it is thought that the expression of SNDH gene and SDH gene can be increased.
  • Nucleotide sequence CCATAG (SEQ ID NO: 5 base number 1017-1022) is modified into an NcoI cleavage site (CCATGG) to utilize this Nc0I cleavage site and the Ec0R] cleavage site of base numbers 16 of SEQ ID NO: 5.
  • CCATAG Nucleotide sequence
  • CCATGG NcoI cleavage site
  • NcoI cleavage site was introduced upstream of the SNDH gene of the expression vector pSDHl55, and the Nc0I cleavage site located downstream of the SDH gene and the ac promoter derived from the shuttle vector pFG15A were removed. Expression vectors were constructed.
  • the DNA sequence was changed using the 1036) and the uI cleavage site (SEQ ID NO: 5, base numbers 870-875), and the Nc0I cleavage site was introduced.
  • FIG. 7 was digested with EcoRI and PstI, and a DNA fragment of about 4.6 kb containing a promoter, SNDH gene and SDH gene was obtained by 0.8% agarose gel electrophoresis.
  • Escherichia coli plasmid PBR322 was digested with EcoRI and Pstl, and a DNA fragment of about 3.6 kb containing a tetracycline-dependent gene and a replication origin was obtained by 0.8% agarose gel electrophoresis. Both DNA fragments were ligated with T4 DNA ligase to obtain an Escherichia coli expression vector pSD33 containing one S sp I cleavage site (FIG. 10).
  • McuI-SspI DNA fragment (see SEQ ID NO: 5, bases 870-1036) into which the Nc0I cleavage site was introduced was prepared by volimerase chain reaction (PCR). That is, using pSD5—RIBG as a template, the primer—P5 [5 ′ CGG TGC GTT ACG CGT CAG GAA
  • This pSDHl55NK was digested with EcoRI and SacI, and a DNA fragment of approximately 8.2 kb from which the SNDH gene upstream, the SNDH gene and a part of the SDH gene had been removed was isolated.
  • pSDH155—NC is cleaved with EcoRI and SacI, and the upstream of the SNDH gene (including the NcoI cleavage site), approximately 3.4 kb DNA containing the SNDH gene and a part of the SDH gene The fragment was isolated. Both DNA fragments were ligated with T4 DNA ligase to construct an expression vector pSDH155-NN having only one Nc0I cleavage site upstream of the SNDH gene (see FIG. 13).
  • this expression vector pSDHl55-NN contains an ac promoter derived from Escherichia coli plasmid pHSG298, the ⁇ ac promoter was then removed (Fig. 14).
  • the shuttle vector pFG15A was partially digested with PvuII to obtain an approximately 7.0 kb DNA fragment in which only one PvuII cleavage site was cut.
  • This DNA fragment and the EcoRI linker (5 'CCG GAA TTC CGG 3') were ligated with T4 DNA ligase, and then heat-treated to inactivate the enzyme. Next, cut the ligated DNA with EcoRI and isolate a DNA fragment of about 6.8 kb. Then, the obtained DNA was subjected to self-closure with T4 DNA ligase to obtain a shuttle vector pFG16A from which the ⁇ ac promoter had been removed.
  • PFG16A was digested with EcoRI and Pstl, and a DNA fragment of about 6.8 kb was isolated.
  • pSDHl55-NN is cleaved with EcoRI and PstI, and an approximately 4.6 kb DNA fragment containing the upstream SNDH gene (including the Nco1 cleavage site), the SNDH gene and the SDH gene is isolated. did. Both DNA fragments were ligated with T4 DNA ligase to obtain the desired promoter-inserting expression vector PSDH165-NN (see FIG. 14).
  • the Escherichia coli promoter was designed so that the Ec0RI cleavage site was connected upstream of one 35 region of each open-ended motor, and the Nc0I cleavage site was connected downstream of the 110 region.
  • the promoter-constituting DNA oligomer is divided into two regions between the 35 region and the 110 region.
  • the DNA oligomer contains the 35 region, the DNA oligomer containing the 110 region, and each complementary DNA oligomer.
  • DNA oligomer was synthesized using DNA Synthesizer 1 'model 392 (manufactured by Applied Biosystems). Table 14 shows the DNA oligomer composition of each process.
  • TUFB3 (29) CAT GTC TCC ATA GAA TGC GCG CTA CTT GC
  • LAMBDA PL1 (30) AAT TCT CTC D GG CGG TGT TGA CAT kk TAC
  • LAMBDA PL3 (Z9) CAC TGG CGG TGA Ding AC TGA GCA CAT CAG CC
  • LAMBDA PL4 (26) CAT GGG CTG ATG TGC TCA GTA TCA CC .lac UV-5 promoter name size sequence (5 ' ⁇ 3)
  • LAC UV5-1 (30) AAT TCG GCA CCC CAG GCT TTA CAC TTT ATG
  • LAC UV5-Z (35) AGC CGG AAG CAT AAA GTG TAA AGC CTG GGG TGC CG
  • LAC UV5-3 (30) CTT CCG GCT CG cho ATA ATG TGT GGA ATT GTC
  • TAC4 (25) CAT GGA CAA TTC CAC ACA TTA TAC G. 1 pp Promo evening-name size sequence (5 ⁇ 3)
  • LPP2 (33) AAA GTT TTT TAT GTT GAG AAT AT Ding Ding Ding TTG ATG
  • TAC4 (25) CAT GGA CAA Choc C CAC ACA TTA TAC G.
  • the expression vector PSDH-tufB1 incorporating the tufB promoter sequence was prepared as follows (FIG. 15).
  • T4 DNA ligase buffer 8 to 250 mM TrisHC ( ⁇ 7.6), 5 OmM MgC 2 5 mM DTT, 25% PEG-6 000], 1 OmM ATP (2 u £) and distilled water
  • the expression vector pSDH-t6 incorporating the trp promoter sequence uses the DNA oligomers p29, ⁇ 30, ⁇ 31 and ⁇ 32 of Table 14; and the expression vector pSDH- incorporating the PL promoter sequence.
  • PL1 is the DNA oligomer of Table 14 LAMBDA PL K LAMBDA PL2, LAMBDA PL3 and LAMBDA PL4, and the expression vector P SDH- a cUV5-2 incorporating the ac UV5 promoter sequence is the DNA oligomer of Table 14 Using LA C UV5-K LAC UV5-2, LAC UV5-3 and TAC-4, the expression vector pSDH-gpp1 incorporating the ⁇ pp promoter sequence is the DNA oligomer LPP and LPP2, LPP3 of Table 14
  • the expression vector pSDH-tac8 using LPP4 and LPP4 and incorporating the tac promoter sequence was prepared using the DNA oligomers P29, TAC2, TAC3 and TAC4 shown in Table 14 and the above-mentioned PSDH-tufB1. It was prepared in the same manner as described above.
  • the L-idonic acid low-producing host NB6939 obtained in Example 17 was used in the same manner as in Example 13- (1) by using the Escherichia coli promoter-incorporated expression vector obtained in Example 191-1 (3).
  • NB 6939 -pSDH-t ⁇ f B NB 6939 -p SDH- trp 6.
  • NB 6939 -p SDH-PL 1, NB 6939— pSDH— £ a cUV5—2, NB 6939- pSDH-ppl and NB6939-pSDH-tac8 were obtained.
  • NB6939-pSDH-tuf BK NB6939-pSDH-trp6 and NB6939-pSDH-PL1 were subjected to seed culture according to the method described in Example 16- (3), and then this seed culture was used.
  • 0.3 m is inoculated into a 10 Om ⁇ Erlenmeyer flask containing 1 Om ⁇ medium containing 10% D-sorbitol, 1.0% corn steep liquor and 2.0% calcium carbonate, and rotary at 32 for 5 days. Culture was performed on a shaker (250 rpm). The supernatant obtained by centrifuging the culture at 6000 rpm for 10 minutes at 4 ° C was used to determine the amount of 2KLGA produced by HPLC. Beta. The results are shown in Table 15 together with the culture results of N952 (NB6939-PSDH155) and NB6939-PSDH165-NN simultaneously performed.
  • this seed culture solution is mixed with 10% D-sorbitol, 1.5% corn steep liquor, 0.15% magnesium sulfate, and 2.0% calcium carbonate.
  • Organism name Gluconobacter
  • Organism name Gluconobacter oxydance
  • Leu Leu Ala Glu lie Leu Ala Asp Ala Gly Leu Pro Lys Gly Val
  • Glu Thr Gin He Gly Ala lie Thr Thr Glu Ala Gin Asn Lys Thr 335 340 345 l ie Leu Asp Tyr lie Ala Lys Gly Lys Ala Glu Gly Ala Lys Leu
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Gluconobacter
  • CTGCGTCCGG CTCTGGGGCG GAAGAACCTG ACGGTTGTGA CGCGGGCGCT GGTCCTGAAG 660
  • ATGTCCGTCG TCGATCCGCG TCTGAAGGTT CATGGCCTTG AGGGCATCAG GATCTGTGAC 1500
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism Gluconobacter
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Gluconobacter oxydance
  • GGCAAACTCC TTCTTCGCCG CTTCGAGAAT GCGTAATTTC GTGGCCTCAG CGTCCCTGAC 660

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Description

明細書
2—ケトー L一グロン酸の製造方法
〔技術分野〕
本発明は、 Lーァスコルビン酸の前駆体である 2—ケトー L—グロン酸 （以下、 2KLGAともいう） を遺伝子操作によって効率よくかつ簡便に生產する方法に 関する。
さらに本発明は、 2 KL G Aの効率よい生産に係る一連の発現系に関する。
〔背景技術〕
2KLGAは、 L—ァスコルビン酸の合成における重要な中間体である。 工業 的生産においては、 2KLGAはライヒシュタイン （Reichstein) の方法に従つ て D—ソルビトールを酸化することにより化学的に合成される。 一方、 酵素的酸 化により、 D—ソルビトールを 2 KLGAに変換するグルコノバクタ一属の微生 物をはじめ多くの微生物が知られている。 さらに、 グルコノバクタ一属の微生物 においては、 接合伝達法やトランスポゾンを用いた遺伝子工学技術によりこれら の微生物の改良が為されてきた。 しかしながら、 微生物による 2 KLG Aの生産 量は低く、 いまだ工業的生産には応用されていない。
従って、 従来より 2 KLG Aの製造において、 より効率的かつ簡便な方法が所 望されている。
また、 2KLGAの生産のような微生物による 2次代謝産物生産において、 そ の物質の生合成に関係する遺伝子 （群） を単にブラスミ ドに挿入し、 このブラス ミ ドで組み換えた微生物細胞を培養しても、 目的の物質の生産性が改善されると は限らず、 逆に生産性が落ちることもよく知られている （Thomas, D.I. et al.. J. Gen. Microbiol.. 137(1991), p2331 - 2337)。
〔発明の開示〕
本発明の目的は、 L一ソルボースデヒドロゲナーゼ （以下、 SDHという。 ） をコードする DNAおよび L—ソルボソンデヒドロゲナーゼ （以下、 SNDHと いう。 ） をコードする DNAの双方を含む発現べクタ一、 該発現べクタ一で形質 転換された D—ソルビトールから 2 K L G Aを高生産する能力を有する形質転換 体、 および該形質転換体を培養することによる 2KL G Aの効率的かつ簡便な製 造方法を提供することである。
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、 上記の望ましい 性質を持つ発現ベクターの取得に成功し、 更に L一ソルボースを高収率で生産し 2 KL G A分解活性の低い微生物宿主もしくは前記性質に加えて Lーィドン酸生 産活性の低い性質を有する微生物宿主に該発現ベクターを導入することにより、 —連の培養系で効率よく D—ソルビトールから 2 K L G Aを製造できることを見 出して本発明を完成した。
すなわち、 本発明は SDHをコードする DNA (以下 SDH遺伝子ともいう） と SNDHをコードする DNA (以下 SNDH遺伝子ともいう） の両者を含む発 現べクタ一に関する。
また、 本発明は D—ソルビトールから L一ソルボースを高収率で生産し、 2K LG A分解活性がないかもしくは低く、 または前記性質に加えて Lーィドン酸の 生産活性がないかもしくは低いという性質を有する微生物に関する。 該微生物は 上記発現べクタ一を導入する宿主として有用である。 本発明でいう発現べクタ一 には、 1つのベクター上に SDH遺伝子および SNDH遺伝子を含むものばかり ではなく、 異なるベクターにそれぞれの遺伝子を含んだ 1組のベクターも含まれ ο
さらに、 本発明は、 前記微生物に上記発現ベクターが導入された形質転換体で あって、 D—ソルビトールから 2 K L G Aを高収率で生産する能力を有する形質 転換体に関する。
また、 本発明は、 当該形質転換体を D—ソルビトールを含む培地で培養して、 得られる培養物より 2 KLG Aを採取することを特徵とする 2 KLG Aの製造方 法に関する。
また、 本発明は、 遺伝子組換え技術において、 D—ソルビトールから 2KLG Aを効率よくかつ簡便に生産させるために有用な発現ベクター、 宿主、 ブラスミ ド、 形質転換法に関する。
〔図面の簡単な説明〕 図 1は、 プラスミ ド pUC 1 8 SD 1 80の制限酵素地図である。
図 2は、 ブラスミ ド pUC 1 9 SD 5の制限酵素地図である。
図 3は、 プラスミ ド pF 2, p F 3および p F 4の制限酵素地図である。 図 4は、 シャトルベクター pFG5 Bの構築図である。
図 5は、 シャトルベクター pFG 1 4 Aの構築図である。
図 6は、 シャ トルベクター pFG 1 5 Aの構築図である。
図 7は、 ブラスミ ド pSD5— R I Bgの制限酵素地図である。
図 8は、 発現ベクター pSDH l 45の構築図である。
図 9は、 発現ベクター pSDHl 55の構築図である。
図 1 0は、 発現ベクター PSD33の構築図である。
図 1 1は、 発現べクタ一 PSD34の構築図である。
図 1 2は、 発現べクタ一 pSDH l 55— NCの構築図である。
図 1 3は、 発現ベクター pSDHl 55— NNの構築図である。
図 1 4は、 発現べクタ一 pSDHl 65— NNの構築図である。
図 1 5は、 発現べクタ一 p SDH— t u f B 1の構築図である。
〔発明の詳細な説明〕
(1) 発現ベクター
本発明の発現ベクターは SDHをコードする DNAと SNDHをコードする D N Aとの両者を含むものである。
本発明の発現べクタ一は、 S D H遺伝子および S N D H遺伝子が発現可能な伏 態で組み込まれた DNA分子であり、 宿主微生物中で自律的に複製することがで きるか、 または宿主微生物のゲノムに組み込まれうる性質を有する媒体を全て包 含する。
好ましくは、 D—ソルビトールから L一ソルボースを高生産し、 2KLGAを 分解する活性がないかもしくは低 t、微生物宿主、 または前記性質に加えてさらに Lーィドン酸を生産する活性がないかもしくは低い性質を有する微生物宿主を、 D—ソルビトールから 2 K L G Aを高レ、収率で生産する特性をもつ微生物に形質 転換するのに適した発現ベクターである。 ' このような発現べクタ一としては、 好ましくは、 少なくとも、 D—ソルビトー ルから L一ソルボースを高生産する微生物中でも高いプロモーター活性を示すプ 口モーター、 SDH遺伝子、 SNDH遺伝子および自己複製ユニットを含んでお り、 さらにターミネータ一領域を含んでいてもよく、 かつ該微生物中に安定に存 する発現ベクターが例示される。 より好ましくは、 グルコノバクター属またはァ セトバクター属に属し、 D—ソルビトールから L—ソルボースを高生産し、 2K L G Aを分解する活性がないかもしくは低く、 または前記性質に加えてさらに L ーィドン酸を生産する活性がないかもしくは低い性質を有する微生物宿主を、 D 一ソルビトールから 2 K L G Aを高生産する微生物に形質転換するのに適した発 現ベクターである。
この様な発現べクタ一として、 微生物宿主中で安定に機能する自己複製ュニッ トの他に、 例えば該発現べクタ一のクローニングに適した大腸菌等の微生物の自 己複製ュニッ トを含んだシャトルベクターを用いるのが特に有利である。 また、 さらに抗生物質耐性遺伝子のようなマーカ一遺伝子を含んだシャトルべクタ一が 有利である。
本発明において、 好適なシャトルベクターとしては、 例えば PHSG 298と P F 3の合体プラスミ ド pFG 1 4A、 pFG 14 Bや pHSG298と pF4 の合体プラスミ ド pFG 1 5 A、 pFG 1 5 B等が挙げられる。
ここで用いられるマーカー遺伝子としては、 例えばカナマイシン耐性遺伝子、 了ンピシリン耐性遺伝子、 クロラムフエ二コール酎性遺伝子、 ハイグロマイシン 耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、 栄養要求性遺伝子および 1 a cZなどの酵素遺 伝子が挙げられる。
本発明の発現ベクターに用いられるプロモーターとしては、 宿主微生物中で S NDHおよび Zまたは SDH遺伝子を耘写させるプロモーター活性を有する DN Aであれば特に限定されない。 特に、 D—ソルビトールから L一ソルボースを高 生産する微生物宿主においても SNDH遺伝子および または SDH遺伝子に対 して高い転写活性を有するプロモーターが望ましい。 このようなプロモーターと しては、 例えば SNDH遺伝子のプロモーター領域、 またはプロモーター活性を 有するその一部が挙げられ、 その具体的な配列としては、 配列表の配列番号 5の 塩基番号 1一 1 040に含まれるグルコノバクタ一 ·ォキシダンス T一 1 00由 来の SNDH遺伝子のプロモーター領域またはそのプロモーター活性を有するそ の一部が挙げられる。 また、 プロモーターとして大腸菌由来のプロモーター、 例 えば t uf B、 λ P L> t rp、 t a c、 i a c UV 5, i a p. £ a c、 om pA、 phoA、 r e c Aおよび r r n Bプロモーター等も用いることができる c 好ましくは t u f B、 λ PL, t r pおよび t a cプロモーターである。 これら のプロモーターの一 35領域、 一 1 0領域以外の配列はブラスミ ド構築等に好適 なように、 適宜選択することができる。
自己複製ユニットとは、 宿主細胞中で、 そこに属する DNA配列を複製するこ とができる DNA化合物をいい、 天然のプラスミ ド、 人工的に修飾されたプラス ミ ド （例えば、 天然のブラスミ ドから調製された DNA断片） および合成プラス ミ ド由来の自己複製ュニッ トが挙げられる。
本発明において自己複製ュニットは、 宿主として用いる微生物に応じて適宜選 択することができる。 好ましくは、 宿主と同種の微生物から得られるブラスミ ド 由来の自己複製ュニットが用いられる。 例えば宿主がダルコノバクタ一属の微生 物である場合は、 グルコノバクター属由来のブラスミ ドが好適である。
かかる自己複製ュニットを含むブラスミ ドとしては、 1〜10 Okb、 好まし くは 1〜1 O kbの大きさを持ち、 有用な制限酵素部位を持つものが有利である c ここで有用な制限酵素部位とは、 ある制限酵素に対する切断部位が限定されて おり、 その制限酵素によって切断されても、 またその部位に DNA配列が挿入さ れても自己複製ュニッ トの活性がなくならない制限酵素部位をいう。 従って、 か かる部位での切断および任意の DN A挿入等の操作が自由に行えるなどの点で有 用である。 この様なプラスミ ドとして、 例えばグルコノバクタ一 I AMI 21 3 8由来のプラスミ ド p F 3およびグルコノバクタ一 T 1 00由来の p F 4などが 挙げられる。
クローニングに適した微生物の自己複製ュニッ トとしては、 通常、 遺伝子工学 の分野でクローニングのために用いられる微生物由来のプラスミ ドの自己複製ュ ニッ トであれば特に限定されない。 例えば、 大腸菌由来のプラスミ ド pBR32 2、 pUC 1 8、 pHSG 298、 pHSG396、 pACYC 1 84および p AC YC 1 77もしくはその人工的修飾物 （p BR 322を適当な制限酵素で処 理して得られる DNA断片など） 、 酵母由来の酵母 2〃プラスミ ド由来の自己複 製ュニットなどが挙げられる。
本発明の発現ベクターにおける SDH遺伝子および SNDH遺伝子の存在様式 は、 SDHおよび SNDHが発現しうる態様であれば特に限定されない。
例えば、 本発明の発現べクタ一は S D H遺伝子および S N D H遺伝子の転写お よび翻訳がそれぞれ別個の発現システムによって支配される態様で該遺伝子を含 んでいてもよいし、 また両方の遺伝子が 1組の発現システムによって支配される 態様で該遺伝子を含んでいてもよい。
前者の態様を有する発現べクタ一としては、 それぞれの遺伝子がそれぞれ別個 のプロモーターの支配により転写が起こるように構築されている発現べクタ一が 例示され、 また後者の態様を有する発現ベクターとしては、 SDH遺伝子および SNDH遺伝子が、 1つのプロモーターから連続して転写が起こるように構築さ れている発現ベクターが例示される。
また、 本発現べクタ一は S D H遺伝子および Zまたは S N D H遺伝子を複数含 んでいてもよい。
本発明で用いられる SDHをコードする DN Aおよび SNDHをコードする D NAとは、 SDH活性を持つ酵素および SNDH活性を持つ酵素をコードする遺 伝子であればどの様なものでもよく、 例えば細胞質型もしくは膜結合型の S D H または S N D H、 補酵素依存型もしくは非依存型の SDHまたは SND Hが挙げ られる。 好ましくは、 微生物由来の酵素をコードする遺伝子およびその変異体を コ一ドする遺伝子が挙げられる。 該微生物としては例えばグルコノバクター属、 ァセトバク夕一属等に属する微生物が挙げられ、 これらの具体例としてグルコノ パクター ·ォキシダンス T- 1 00 (FERM BP— 4 1 88) が挙げられる c グルコノバクタ一 ·ォキシダンス T一 1 00由来の膜結合型 SDHとしては、 下記 （1：)〜 (3) の特徵を有する酵素が挙げられる。 (1) L一ソルボースから L一ソルポソンへの変換を触媒する。
(2)分子量が 58， 000ダルトン （SDS— PAGE) である。 かつ
(3) N末端側のァミノ酸配列が、
Thr-Ser-Gly-Phe-Asp-Tyr-Ile-Val-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-である。 また該 SDH遺伝子は、 より好ましくは後記配列表の配列番号 1に記載のアミ ノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNAであり、 さらに一層好適には、 配列 番号 3に記載の塩基配列を有する DNAである。
グルコノバクタ一 ·ォキシダンス T一 1 00由来の細胞質型 SNDHとしては、 下記 （1)〜(3) の特徵を有する酵素が挙げられる。
(1) L一ソルボソンから 2—ケトー L一グロン酸への変換を触媒する。
(2)分子量が 50， 000ダルトン （SDS— PAGE) である。 かつ
(3) N末端側のアミノ酸配列が、 Asn-Val-Val-Ser-Lys-Thr-Val-Xaa-Leu (Xaa は未同定のァミノ酸） である。
また該 SNDH遺伝子は、 より好ましくは後記配列表の配列番号 2に記載のァ ミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNAが、 さらに一層好適には、 配列番 号 4に記載の塩基配列を有する D N Aが例示される。
本発明の好適な発現ベクターの例としては、 具体的には pSDH l 45、 pS DH 1 55 (FERM BP- 4522) などが挙げられる。
本発明の発現ベクターは、 常法 （例えば、 制限酵素を用いる消化、 T4DNA リガーゼを用いるリゲ一シヨン等） により、 必要ならば適当な DNA断片を用い て、 上述の発現システム、 SDHをコードする DNA、 SNDHをコードする D N Aを環状に適当な自己複製ュニットに連結させることによつても調製すること ができる。
( 2 ) 宿主微生物
本発明で宿主として用いられる微生物は、 D—ソルビト一ルから L—ソルボー スを高生産し、 2 KLGAを分解する活性がないか、 もしくは該分解活性が低い 微生物である。 好ましくは、 前記特性に加えてさらに L一イドン酸を生産する活 性がないかもしくは該活性が低い微生物である。 すなわち本発明で、 宿主は D—ソルビトールから Lーソルボースへの変換効率 が高く、 L一ソルボースを代謝する活性が弱いか、 代謝しても L一ソルボースか ら 2 KLG Aへの代謝経路外への物質へ代謝する活性が低く、 かつ、 2KLGA の分解活性が低い微生物であるということが重要である。
このような微生物としては、 好ましくは 5 %以上、 より好ましくは 1 5%以上 の高い D—ソルビトール濃度の環境下で生育でき、 ほぼ 1 0 0%の効率で D—ソ ルビトールを L一ソルボースに変換しうる性質を有する微生物が好ましい。 この ような微生物の例としては、 グルコノバクタ一属またはァセトパクター属に属す る微生物が挙げられ、 例えば、 グルコノバクタ一 ·ォキシダンス G 624 (FE R BP— 4 4 1 5) 、 グルコノバクタ一'ォキシダンス NB 6 9 3 9が挙げ られる。
( 3 ) 形質転換体
本発明の形質転換体は、 前述の発現ベクターを上記の宿主細胞に導入すること により調製することができる。 また、 本発明の形質転換体は SDH遺伝子および SNDH遺伝子をそれぞれ別個の発現ベクターに導入して、 それぞれを 1つの上 記微生物宿主細胞に導入することによつても調製できる。
形質転換体の調製方法は特に限定されず、 微生物宿主により適宜選択すること ができる。 例えば、 形質転換する宿主としてグルコノバクター属またはァセトバ クター属の微生物を用いる場合は、 通常の形質転換法では形質転換効率が低いの で、 エレクト口ポレーシヨン法 （Dower, W.J，， Miller, J. F. and Ragsdale. C. W.. Nucleic Acid Res. Vol. 16(1988). p6127 ) を用いることが有利である。 当該エレクトロボレーシヨン法は、 遺伝子工学の分野において用いられる通常の 方法が用いられるほか、 形質転換すべき微生物宿主に応じて適宜変形して用いる こともできる。
本発明はまた、 上記エレクトロポレーシヨン法に適したコンビテント細胞の調 製法に関する。
すなわち、 エレクトロボレーシヨン法に適したコンビテント細胞は、 グルコノ バクター属またはァセトバクタ一属に属し、 D—ソルビトールから L一ソルボー スを高生産し、 2 K L G Aを分解する活性がないかもしくは低く、 または前記性 質に加えてさらに Lーィドン酸を生産する活性がないかもしくは低い性質を有す る微生物宿主を、 D—マンニトールを含む培地で培養することによつて好適に調 製することができる。
かく して製造される形質転換体は、 D—ソルビトールを原料として 2 K L G A を高収率で生産する能力を有する。
本発明において、 宿主が正しく形質転換されているか否かは、 形質転換体の有 する選択マーカー （例えば、 カナマイシン耐性等の抗生物質耐性遺伝子、 栄養要 求性、 1 a c Zなどの酵素遺伝子により） 、 または形質転換体が有する S D H活 性および S ND H活性を測定することにより調べることができる。
( 4 ) 2 K L G Aの製造方法
本発明の 2 K L G Aの製造方法は、 上記のようにして得られた発現ベクター含 有形質転換体を D -ソルビトールを含む培地中で培養し、 得られた培養物より 2 K L G Aを採取することを特徵とする。
用いられる栄養培地としては、 宿主により好適な培地の組成は異なるが、 一般 的には D -ソルビトールを含有するものであり、 D—マンニトール、 D—グルコ —ス， D—フルク トース、 L一ソルボース、 グリセロール等の炭素源を含有して いてもよい。 また、 無機もしくは有機窒素源 （例えば硫酸アンモニゥム， 塩化ァ ンモニゥム， カゼインの加水分解物， 酵母抽出物， ボリペプトン， バクトトリプ トン， ビーフ抽出物， コーンスティープリカ一等） を含んでいるのが望ましい。 さらに所望により、 他の栄養源 〔例えば、 無機塩 （例えば、 リン酸水素ニナトリ ゥム、 リン酸二水素ナトリウム、 リン酸水素二カリウム， リン酸二水素カリウム, 塩化マグネシウム， 硫酸マグネシウム、 炭酸カルシウム、 塩化カルシウム等） 、 ビタミン類 （例えば、 ビタミン 等） 、 抗生物質 （例えば、 アンピシリン， 力 ナマイシン、 テトラサイクリン、 クロラムフエ二コール等） など〕 を培地中に添 加してもよい。
例えば、 グルコノバクター属の微生物を宿主とする場合には、 D—ソルビトー ル、 酵母エキス、 炭酸カルシウム等を含有する培地を用いることができる。 また、 培地中の D—ソルビトールの濃度は、 通常 1〜30%、 好ましくは 5〜 20 %である。
形質転換体の培養は、 微生物宿主に応じて、 2 KLG Aを高產生するような条 件を適宜選択して行われる。 例えば、 グルコノバクタ一属に属する微生物を用い る場合 (こは、 pHは通常 5. 5〜8. 5、 好適には pH7〜7. 5、 培養温度は 通常 1 8〜40°C、 好適には 20〜30で、 培養時間は通常 20〜1 70時間で あ 。
このようにして生産された 2 K L G Aは、 通常培養物の溶液画分中に存在する c 従って 2KLGAの精製は、 まず培養物を濾過または遠心分離することにより培 養濾液を取得し、 該培養濾液から一般に用いられる精製方法 （例えば、 適当な吸 着材上でのカラムクロマトグラフィー， 晶析など） を用いて行うことができる。 なお、 下記の実施例で用いるブラスミ ド， 制限酵素， T4DNAリガーゼ等の 酵素および他の物質に関して市販のものについては添付の説明書記載の指示に従 つて使用した。 また DNAのクローニング、 形質転換体の培養、 得られる培養物 からの 2 KLG Aの回収などの操作は、 当業者においてよく知られているもので あり、 もしくは文献により知ることができるものである。
また、 本発明で用いるグルコノバクタ一 ·ォキシダンス T一 1 00 (FERM BP— 4 1 88)、 グルコノバクタ一 ·ォキシダンス G 624 (FERM BP -44 1 5) グルコノバクタ一 ·ォキシダンス G A— 1 (G 624 -P SDH 1 55) (FERM BP— 4522) 、 グルコノバクタ一ォキシダンス N 952 (NB 6939 -pSDHl 55) (FERM B P— 4580 ) は、 通商産業 省工業技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託されている。
本発明によれば、 Lーァスコルビン酸の製造に有用な 2 KLG Aを一回の培養 によつて簡単にかつ大量に効率よく製造することができる。
以下、 本発明を具体的に説明するため実施例を示すが、 本発明はこれら実施例 によって何ら制限されるものではない。
実施例 1 ： グルコノバクタ一 ·ォキシダンス T一 1 00からの SDHの精製 ( 1 ) 微生物 グルコノバクタ一 ·ォキシダンス T— 1 0 0 (FERM BP- 4 1 8 8) は、 ニトロソグァ二ジン （NTG) 変異処理によってグルコノバクタ一 ·ォキシダン ス G 7 1 6 (野生株） から誘導された 2 KLG A高生産性変異株として選択され た。
(2) ダルコノバクタ一 ·ォキシダンス T一 1 0 0の培養
グルコノバクタ一 ·ォキシダンス T一 1 0 0のシングルコロニーを、 5 0 0 m ^容量の三角フラスコ中の 2.5%グルコース， 1.0%ボリペプトン， 0.5½酵母 抽出物 （ディフコラボラトリーズ社製） および 2.0 %炭酸カルシウムからなる、 6つのそれぞれの培地 （各 1 0 0m£) に植菌した。 培養は 3 0DC, 1 8時間， ロータリーシヱイカ一 （25 Orpra ) で行った。 培養した培地 （全量 6 0 0 m£) を、 3 0 リツタージャーに入った発酵培地 （5%D—ソルビトール， 0.5%グリ セロール， 0.5%酵母抽出物および 1.0%炭酸カルシウム） 20 リツ夕一に接種 した。 2 0リッター/分の通気下で 3 0 Orpniで攪拌しながら、 3 (TCで 4 2時 間培養を行った。 得られた培養ブロス （20リツ夕一） を 4'C、 6, 0 0 0 rpm で 1 0分間遠心した。 これにより得られた細胞を冷生理食塩水で 1回洗浄し、 先 と同条件で再び遠心した。 得られた細胞を使用するまで一 20DC下に保存した。
(3) 膜画分の調製
(2) で得られた細胞 （ 1 7.7 g, 湿重量） を、 氷冷下 1 OmMリン酸緩衝液
( p H 7. 0 ) 5 0ΙΏ·Πこ懸濁し、 超音波で破砕した。 そして 4°C、 8, 0 0 0 rpm で 1 0分間遠心し上淸を得た。 一方、 沈澱物を 4 0ΙΏ^の 1 OmMリン酸緩衝液
(pH7.0 ) に懸濁して、 超音波で破砕後、 先と同条件で遠心した。 得られた上 清を合わせて 4で、 32, 0 0 Orpmで 6 0分間、 超遠心に付した。 得られた沈 澱物をリン酸緩衝液 （5 Om^) で 1回洗浄して先と同条件で超遠心に付し、 粗 膜蛋白質 （膜画分） を得た。
(4) 膜画分からの SDHの溶解
(3) で得られた膜画分を 1 OmMリン酸緩衝液 （pH7.0) 5 Om^に懸濁 した。 該懸濁液に 0.75m ^の 20%トライトン X— 1 0 0 (ナカライテスク社 製） および L一ソルボース 1.8 gを添加して、 3. 5時間氷上で攙拌した。 得ら れた懸濁液を 4'C、 32， 0 00 r pmで 6 0分間超遠心して上清 （約 4 8m ) を得、 溶解 SDH画分と名付けた。
(5) イオン交換クロマトグラフィー
(4) で得られた溶解 SDH画分 （ 1 6m^) を、 0.3%トライトン X— 1 0 0および 20 OmM L—ソルボースを含有する 1 OmMリン酸緩衝液 （pH7. 0) で平衡化した TSKg e H DEAE- 5 PWカラム （7.5 mm内径 x 75 mm, 東ソ一社製） を用いたイオン交換クロマトグラフィーに付し、 平衡緩衝液 中、 0Mから 0.5Mの塩化ナトリウム直線グラジヱントにて溶出した。 酵素の活 性を、 杉沢らの方法 CAgric. Biol. Chem.. Vol.55. 363-370(1991) 参照〕 に従 い、 0.28Mリン酸緩衝液 （pH7.0) 中で 0.2M L—ソルポースを基質とし て、 0. l mM 2, 6—ジクロ口フエノールインドフエノール （DC I P) を 電子受容体として用いて測定した。 酵素 1ュニッ トを、 1分あたり 1 πιο ^の DC I Pの還元を触媒する酵素の量として定義した。 DC I Pの還元は、 吸光光 度計 （モデル UV - 1 6 0, 島津製作所社製） を用いて、 6 00 nmでの吸光度 の減少度により測定した。 活性画分を集めて、 1 OmM リン酸緩衝液 （pH7. 0) で 3倍に希釈した後、 1 OmMリン酸緩衝液 （pH7.0) で平衡化しておい た DEAE— TOYOPEARL 6 5 0 Mカラム （7.0mm内径 x 1 7 mm, 東ソ一社製） に付し、 0.2Mの塩化ナトリウムを含有する平衡化緩衝液にて溶出 した。 得られた溶出液を、 更なる精製ステップに供した。
(6) ゲル濾過クロマトグラフィー
濃縮した活性画分の一部分 （300〃 ） を 0.3%トライトン X— 1 0 0, 2 0 OmM L一ソルボース及び 0.2M塩化ナトリウムを含有する 1 OmMリン酸 緩衝液 （pH7.0) で平衡化した Sup e r 0 s e 1 2 HR 1 0/3 0カラム ( 1 0 mm内径 x 3 0 cm, フアルマシア社製） を用いたゲル濾過クロマトグラ フィ一に供した。 同緩衝液を用いて溶出し、 各画分 （0.4m^) をドデシル硫酸 ナトリウム存在下でのボリアクリルアミ ドゲル電気泳動 （SDS— PAGE : 1 2.5 %ゲル） 、 および実施例 1 (5) 記載の酵素アツセィによって分析した。 S DS— PAGE分析の結果から、 SDH活性は分子量 5 8 k dの蛋白質に対応し ており、 当該 58 kdの蛋白質が所望の SDH分子であると推測された。
実施例 2 ： SDHのアミノ酸配列分析
濃縮した活性画分 （1 5 / ） を SDS— PAGE (12.5 %ゲル） に付し、 分離した蛋白質をボリビニリデンジフルオラィド （PVDF) 膜上にブロットし た。 p o n c e a u Sにより染色された分子量 58 k dの蛋白質を含む膜を切り 出し、 蒸留水で洗浄した。 該膜片を直接自動プロテインシーケンサー .モデル 4 7 OA (アブライドバイオシステムズ社製） にかけて、 N末端アミノ酸配列を分 折した。
内部のァミノ酸配列を決定するために、 膜の表面上でァクロモバクタ一プロテ ァーゼ I (和光純薬工業社製） を用いてフラグメンテーションを行った。 得られ たフラグメントを 8 %ァセトニトリルを含む 5 OmMトリス塩酸 （pH9.0 ) で 膜から溶出し、 Cosmosil 5C4-300 (4.6 mm內径 x 5 Omm、 ナカライテスク社 製） を用いた逆相クロマトグラフィーで、 0.05%トリフルォロ酢酸中ァセトニ トリル 8%から 83%の直線グラジヱント溶出 （75分） により分離した。 これ により 2種類のペプチド （ペプチド 1およびペプチド 2) を単離し、 自動プロテ インシーケンサー ·モデル 470 Aによりそれらのァミノ酸配列を決定した。 そ の結果を表 1に記す。
一表 1一
Figure imgf000015_0001
実施例 3 ： DN Aブローブの調製
(1) DNAオリゴマーの合成
DN Aシンセサイザー ·モデル 392 (アプライドバイオシステムズ社製） を 用いたホスホアミダイト法によって、 下記表 2に挙げる各々のォリゴヌクレオチ ドを合成した。 合成されたォリゴヌクレオチドを 28 %ァンモニァ水で C P Gポ リマー担体 （CPG： controlled pore glass)から脱離して、 6 0。C、 9時間加 熱して全保護基を外した。 該反応混液から溶媒を真空下で減圧留去し、 残澄を 2 0 0 / の TE緩衝液 〔 1 OmMトリス一塩酸 （ρΗ7· 4) - 1 mM EDTA〕 に溶解した。 得られた溶液をエーテルで 1回洗浄し、 エタノールで沈澱させた。 沈澱により得られたオリゴヌクレオチドを、 そのままポリメラーゼチヱーンリ了 クションのブライマーとして用いた。
一表 2—
NH2-末端配列をコードするオリゴヌクレオチド （正ブライマー）
5* > ACC (TA)(GC)C GGC TT(TC) GA(TC) TA(TC) AT(TCA) GT< 3'
内側の配列をコードするオリゴヌクレオチド （逆プライマー）
5' > TC CCA (ATCG)GT (AG)TG (ATCG)GG (ATCG)CG < 3'
(2) 染色体 DNAの調製
グルコノバクタ一 'ォキシダンス T一 1 0 0のシングルコロニーを、 2 %グル コース、 1 %ボリペプトン及び 0.5%酵母抽出物からなる培地 1 0 Om^中で 3 7 で 24時間培養した。 細胞を遠心 （4, 6 00 rpni , 1 0分間） により集め て、 ΤΕ緩衝液 2.5m に懸濁した。 該懸濁液の 1部分 （2.0m^) を STE緩 衝液 〔20%スクロース一 5 OmMトリスー塩酸 （pH8) — 1 mM EDTA〕
2 0ΙΏ^で希釈し、 リブチーム溶液 （5mgZm^) と混合し、 37 で
3 0分間ィンキュベ一ションした。 サルコシル溶液 〔 1 %ラウロイルサルコシレ —トー l O OmM EDTA (pH9.0) ) 5 0 m ^及びプロティナーゼ K 4 0 mgを添加した後、 該混合液を 5 0てで 1.5時間インキュベーションした。 セシ ゥムクロライド 93.8 g及びェチジゥムブ口ミ ド （5mg/m 0 6 m ·βを該混 合液 75m 1に溶解し、 該セシウムクロライド溶液を 20。C、 5 0， 0 0 0 rpm で 1 4時間超遠心した。 染色体 DNAを含有する部分を単離し、 生理食塩水で飽 和させたィソプロピルアルコールで 2回洗浄して TE緩衝液 2リッ夕一で 4時間 透析した。 透析物をフヱノール 20m で抽出し、 2リッターの TE緩衝液で 2 回透析して所望の染色体 DNA溶液 （14mi, 91.5 gZm^) を得た。
( 3 ) ボリメラーゼチェーンリアクション
グルコノバクタ一 ·ォキシダンス T— 1 00の染色体 DNA 1 80 n gおよび 表 2記載の各プライマ一 2.5 pmo ^を用いて、 ポリメラ一ゼチェーンリアクシ ヨン （PCR) をハイバイドサ一マルリアクター， モデル HB— TR1 (ハイバ イド社製， イギリス） を使用して行った。 反応混液 （PCR緩衝液中、 200 M 各 dNTP sおよび Ta qDNAポリメラーゼ 2.5ユニット） （パーキンェ ルマ— .シ一夕ス社製） を、 95 eCでの変性 0.5分間、 42ででのアニーリング 1分間、 および 72ででのボリメリゼーシヨン 2分間からなる PCRに 50回供 した。 PCRにより単一の DNAフラグメントが得られた。 この DNAフラグメ ント （ 1 80 b p) は SDH遺伝子の一部をコードしていると考えられたので、 この DNAフラグメント （1 80 b p) を 1.5 %ァガロースゲル電気泳動によつ て単雜し、 DNAポリメラーゼクレノーフラグメント （宝酒造社製） で付着端を 平滑化して平滑末端 DN Aを得た。 得られた DNAと予め Sma Iで消化してお いた pUC l 8 (日本ジーン社製） を T4 DNAリガーゼ （宝酒造社製） の存在 下で連結した。 該結合混合物を用いて、 重定らの方法 （細胞工学 2， 616-626. 1983) に従って、 E. c 0 ^ i JM 109 (日本ジーン社製） を形質転換した。 該形質転換体の 1つから所望のブラスミ ド pUC l 8 SD 1 80 (図 1参照） を 取得して制限酵素マッビングにより特性を調べた。
(4) 32P—ラベル化ブローブの調製
pUC l 8 SD 1 80を BamHIおよび Ec oR I (日本ジーン社製） で消 化することにより、 インサート DNA (約 200 bp) を単雜した。 該約 200 b pの DNAを 0· 5 %ァガロースゲル電気泳動により精製した。 精製した DNA を、 ニックトランスレーションキッ ト （宝酒造社製） で添付のプロトコールに従 つて、 32Pラベル化した。 32Pでラベルした DNAの比活性は、 約 3.7 X 1 07 cpra / μ. gであった。
実施例 4 ： グルコノバクタ一■ォキシダンス T一 100 DNAライブラリーか らの SDH遺伝子の単離 (1)染色体 DNAライブラリーの調整
実施例 3 (2) で得られた染色体 DNAを Mb 0 I (日本ジーン社製） で部分 消化し、 得られたフラグメントをスクロースグラジェントで分離して 8 kbから 22 kbのサイズ範囲にあるフラグメントを取得し、 ラムダファージベクター E MBL-.3 (クローンテック社製） の B amH I部位にクローニングした。 この ラムダファージベクタ一を E. c 0 i NM 538 (クローンテック社製） に導 入し、 グルコノバクタ一 T 1 00染色体 DNAライブラリーとした。
(2) ブラ一クハイブリダィゼーシヨン
平板固定化細菌として、 E. c oi iN 538 (クローンテック社製） を用 いたラムダファージプラークの調製、 及び該プラークのニトロセルロースフィル ター上への固定化をモレキュラークローニング第 1卷第 2章第 108頁 （Molecular cloning Vol. 1. Chapter 2, pl08.1989 ) に記載のブロトコールに従って実施 した。 ラムダ DN Aを含むフィルターをハイブリダィゼーシヨン緩衝液 （50% ホルムァミ ドー 1 %ゥシ血清アルブミンー 0.1 %ポリビニルピロリ ドン一 0.1 % フイコール一 5 XSSPE (モレキュラークローニング参照） 一 0.1 %SDS— 1 00 gZm^サケ精子 DNA) 中で、 42。Cで 4時間インキュベーションし、 32Pラベル化プローブ （約 200 bp, 約 1 X 1 07 cpra/ml) を含む同緩衝液中 で 42°C1 8時間、 次に 0.05 SDSを含む 2 XSSC (モレキュラークロー ニング参照） 中、 42.°Cでインキュベーションして過量のプローブを除去した。 該フィルターを X線フィルム HR— H (富士フィルム社製） に- 80°Cで 1 8時 間露光させた。 ラムダファージライブラリーの最初のスクリーニングの結果、 7 2, 000個のプラークから約 30個のポジティブファージが得られた。
(3) サザンブロッティング
ポジティブファージ DNAの 1つを Ec oR Iと Sai I (日本ジーン社製） で消化し、 0.8%ァガロースゲル電気泳動に供した。 ゲル上で分離された DNA フラグメントを電気プロッティングによりニトロセルロースフィルター上に移し た。 およそ 6 kbの DNAフラグメントが、 32Pラベル化プローブとハイブリダ ィズするのが認められた。 それを pUC 1 9 (日本ジーン社製） の E c oR Iお よび S a ^ I部位の間にクローニングして、 pUC 1 9 SD 5を得た （図 2) 。 実施例 5 ： ≤011遺伝子の0 八配列分析
( 1 ) DNAシークェンス用のブラスミ ドの構築
ブラスミ ド p SD 5RRVの構築
UC.l 9 SD 5を E c oRV (東洋紡社製） で消化した。 1.5 %ァガロース ゲル電気泳動で 3つにわかれたバンドの內 32 Pラベル化プローブとハイプリダイ ズする 1. 1 kbの DNAを単雜し、 それを pUC 1 8の Sma I部位にクロ一 ニングしてブラスミ ド p SD 5RRVを得た。
(2) ブラスミ ド P SD 5RVSの構築
pUC 1 9 SD 5を E c oRV及び E c o 4 7III (東洋紡社製） で消化した c 大型 DNA (約 5. 70 0 b p) を単雜して T 4 DNAリガーゼ （宝酒造社製） でセルフ一ライゲーシヨンして、 ブラスミ ド P SD 5 RVSを得た。
(3) DNA配列分析
铸型 DNA ( 3051¾1¾ 及び 3051¾¥3) の DN A配列分折を 37 0 A DNAシークェンサ一 （アプライドバイオシステムズ社製） にて、 ダイデォ キシターミネーシヨン法により、 添付のプロトコールに従って行った。 M 1 3シ 一クェンシングブライマ一であるユニバーサルプライマーおよびリバースプライ マー （ニューイングランドバイオラボ社製） を用いて、 最初のシークェンシング を行った。 さらに、 最初の配列分析で判明した DN A配列に基づき、 次のブライ マーを合成して次々に DNA配列分析を行った。 使用した合成ブライマーを表 3 に ai載し 。
一表 3— ブライマ- - 1 (12 mer) 5' > CTG TGT TCT CGC < 3'
プライマ- -2 (15 mer) 5' > TCG GTT TCG CGA AGA < 3"
ブライマ- - 3 (16 mer) 5' > CGT CTT CAA CGG AAC G < 3*
プライマ- - 4 (16 mer) 5' > GGA GTG ACG TCC GTT C < 3'
ブライマ- -5 (16 mer) 5' > GAG ATG TTC TCC CAG C < 3' 分析の結果、 1 596塩基対よりなるオーブンリーディングフレーム （ORF) が見いだされた。 この ORFの開始コドン （ATG) より続く塩基配列によって コードされるァミノ酸配列は実施例 2で得られた SDHのァミノ酸配列と一致し、 また ORFにコ一ドされる蛋白質の理論上の分子量 58 k dは、 SDHの分子量 58 k d (SDS— PAGE) とよく一致した。 従って、 この OR Fは、 SDH 遺伝子であると判断した
この S D H遺伝子の塩基配列を後記配列表の配列番号 3に、 塩基配列より推定 されるアミノ酸配列を配列番号 1に示す。
実施例 6 : E. c 0 i中での SDH遺伝子の発現
( 1 ) 形質転換 （移入） された E. c 0 ^ 〖の培養
pUC 1 9 SD 5で形質転換した E. c 01 i JM1 09 (E. c o i JM 1 09/pUC 1 9 SD 5) のシングルコロニーを、 50 Om^容フラスコ中の、 1 %パクトトリブトン （ディフコラボラトリーズ社製） ， 0.5%酵母抽出物， 0. 5%塩化ナトリウムおよび 0. 1%グルコース （pH7. 2) からなる培地 1 0 0m に植菌し、 3 (TCで 1 8時間培養した。 該培養ブロスの一部 （各 3m£) を、 1 %パクトトリブトン， 0.5%酵母抽出物， 0.5%塩化ナトリウム， 1 %グ リセロール， 0.3%KH2 P04 , 0.8% a2 P04 · 1 2H2 〇 (pH6.8) 1 %L—ソルボースおよび 1 00〃gZm^アンピシリンからなる培地各 1 00 m を入れた 500 m _ί容の 2つの三角フラスコに移し、 25 eCで 3日間培養し た。 該培養ブロス （全容量 200 m ） を 4 'Cで 6, 000 rpm、 1 0分間遠心 することにより細胞を採取した。 細胞を生理食塩水で 2回洗浄し、 同溶液 5m^ に懸濁して、 氷冷下 30秒間隔でトータル処理時間 2分間超音波処理することに よって破砕した。 得られた細胞破碎產物を酵素アツセィに使用するまで一 20°C で保存した。
(2) SDH活性の測定
発現された SDHの活性を、 高速液体クロマトグラフィー （HPLC) を用い て反応生成物である L一ソルボソンの量を測定することによつて調べた。 1 % L 一ソルボース， lmM フエナジンメソサルフェート， 0.1Mリン酸緩衝液 （p H8.0) および超音波処理した細胞破砕産物よりなる反応液を 30eCで 5時間振 盪インキュベーションした。 該反応を 6 N硫酸で p H 2に調整することにより止 め、 反応混液を 4 °Cで 6000 r pm、 1 0分間遠心分離し、 その上清の一部を 直接 HPLC (#30 1 1 Nカラム、 4.6mm内径 X 300 mm, 日立製作所製） に付して分析した。 移動相として、 ボストカラムラべリング法として用いられる 0.02 Mベンズァミジンヒドロクロライドと 0.25M硫酸力リウ厶を含む 1 Mホ ゥ酸緩衝液 （pH9.5) を用い、 流速を 0.8m^Zm i nとした。 ポストカラム ラベリング反応は、 テフロンチューブ （0.5mm内径 X 1 0m) 中で 80てで実 施した。 ラベル化化合物の検出は、 蛍光 （Ex. 3 1 5 nm, Em. 405 nm) をモニターすることによって行った。 表 4に示すように、 プラスミ ド pUC 1 9 S D 5を含む超音波処理钿胞は、 L一ソルボースを Lーソルボソンに変換する能 力を有していた。 しかしながら、 1 00 で処理した細胞破砕物、 または該プラ スミ ドを含まぬ細胞には活性は検出されなかった。 これらの結果から、 組換プラ スミ ド pUC 1 9 SD 5が L一ソルボースデヒドロゲナーゼをコ一ドする遺伝子 を含有し、 この遺伝子が E. c 0 i JM1 09中で発現することが明らかとな つた。
—表 4一
菌株 処理 L一ソルボソン
^g/ml)
J 109 (PUC19SD5) 超音波処理 2,310
JM109 (pUC19SD5) 超音波処理， 沸騰処理 24
J 109 超音波処理 21
Basal 33
実施例 7 ： グルコノバクタ一 ·ォキシダンス T一 1 00からの SNDHの精製 ( 1 ) 粗酵素液の調製
実施例 1一 (2) で得られた細胞 （約 1 0 g、 湿重量） を氷冷下 1 OmMリン 酸緩衝液 （pH7.0) 4 Om に懸濁し、 超音波で破砕した。 これを 4で、 8, 0 0 0 r pmで 1 0分間遠心し、 さらにその上清を 4で、 32, O O O r pmで 6 0分間超遠心に付した。 得られた上清を SNDH粗酵素液として以後の実験に 用いた。
(2) イオン交換クロマトグラフィー
SNDH粗酵素液 （4 5m ) を、 予め 1 0 mM リン酸緩衝液 （ρΗ7· 0) で平衡化した QAE—トヨパール 5 5 0 Cカラム （1.6 cm内径 x 3 0 cm、 東 ソ一社製） に通液し、 カラムを同緩衝液で洗浄した後、 同緩衝液中 0Mから 0.4 Mの塩化ナトリゥム濃度による直線グラジヱントにて溶出した。 酵素の活性を、 杉沢らの方法 (Agric. Biol. Chem.. 55, 665-670, 1991)に従い、 1 3.7 M L—ソルポソン及び 0.7 3 juM NADを含む 5 0mM リン酸緩衝液中で溶出 画分を加え反応させ、 生成する NADHの量を 340 nmの吸光度を測定するこ とで求めた。 活性画分 （約 1 5m^) を集めて、 リン酸緩衝液で 5倍に希釈して 次の精製ステップに供した。
(3) ブルーセファロースクロマトグラフィー
(2) で得られた酵素液 （約 75m ) を、 予めリン酸緩衝液で平衡化したブ ルーセファロースカラム （1.0 cm内径 X 7 cm, フアルマシア社製） に通液し、 力ラムを同緩衝液で洗浄した後、 同緩衝液中 0 Mから 0.6 Mの塩化ナトリウム濃 度による直線グラジユントにて溶出した。 各面分をドデシル硫酸ナトリゥム存在 下でのポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 （SDS— PAGE) 及び実施例 7 (2) 記載の酵素活性測定法にて分折した。 その結果、 SDS— PAGEで 5 0 k dの 分子量を示した蛋白質が酵素活性に対応していることが判明し、 当該 5 O k dの 蛋白質が所望の S N D H分子であると推測された。
実施例 8 ： SNDHのアミノ酸配列分析
実施例 7— （3) で得られた活性画分 （75 / ） を SDS— PAGEに供し、 分離した蛋白質をボリビニリデンジフルオラィド （PVDF) 膜上にブロッ 卜し た。 クマシ一プリリアントブル一により染色された 5 0 k dの蛋白質を含む膜を 切り出し、 蒸留水で洗浄した。 該膜片を直接自動プロテインシーケンサー .乇デ ル 4 7 OA (アブライドバイオシステムズ社製） に供して、 N末端アミノ酸配列 を決定した。 その結果を下に示す （但し、 Xaa は未同定のアミノ酸である） 。
N末端ァミノ酸配列 Asn-Val-Val-Ser-Lys-Thr-Val- Xaa-Leu- 実施例 9 ： SNDH遺伝子の DNA配列分析
( 1 ) 塩基配列分析用のブラスミ ドの構築
実施例 4一 (3) で得られたプラスミ ド pUC l 9 SD 5 (図 2) を S a _g I (日本ジ一ン社製） と E c oRV (東洋紡社製） で消化し、 0.8 %ァガロース電 気泳動に供した。 分雜された DNA断片のうち約 6 O O bp及び 4, 30 0 bp の二種をゲルより単離し、 前者を PUC 1 8の Sma I部位に挿入し、 p SD 6 RRVを構築した。 後者は DNAボリメラーゼクレノーフラグメント （宝酒造社 製） 処理をして S a ^ I切断部位を平滑化した後、 セルフライゲージヨンにより 環状ブラスミ ド p SD 5R I RVを構築した。 さらに本ブラスミ ド pSD 5 R I RVを E c oR I及び M£ u Iで消化し、 約 3, 4 0 O b p断片を単離、 いて 上記の方法で平滑化及び環状化を行い P S D 5 MR Vを構築した。
( 2 ) 塩基配列分析
錶型 DNA (p SD 5MRV. p S D 6 RR V及び S DH塩基配列分析で用 いた P SD 5 RRV) の塩基配列を 37 OA DNAシーケンサー （アブライド バイオシステムズ社製） を用いて、 ダイデォキシターミネーシヨン法により決定 した。 Ml 3シーゲンシングブライマーであるユニバーサルブライマー及びリバ —スブライマ一 （ニューイングランドバイオラボ社製、 USA) を用いて、 最初 の分析を行った。 さらに、 最初の配列分析で判明した DN A配列に基づき、 次の プライマ一を合成して次々に DNA配列分析を行った。 使用した合成プライマー を下記に示す
ブライマー 1 (15mer) 5' > TGATGGAGAATGGCG <3'
ブライマー 2 (15mer) 5' > GTAATCAGACCGACG く 3'
ブライマー 3 (15mer) 5' > TTCATTCTCGCATCC く 3'
プライマー 4 (15mer) 5' > GATCTCACCTTTCGC <3'
プライマー 5 (15mer) 5' > CACGGATGTGAAGCC <3'
ブライマ一 6 (15mer) 5' > GATCCTGTGTGAGCG <3' ブライマ一 7 (15mer) 5' > GCGATGTCATCACGG <3'
以上の解析の結果、 SDH遺伝子の 5' 上流には 1, 497bpより成るォー プンリーディングフレーム （ORF)が見いだされた。 この OR Fの開始コドン (ATG) より続く塩基配列によってコードされるアミノ酸配列は、 実施例 8で 得られた SNDHの N末端アミノ酸配列と一致し、 また ORFにコードされる蛋 白質の理論上の分子量 53 k dは、 SNDHの分子量 50 kd (SDS-PAG E) とよく一致した。 従ってこの ORFは、 SNDH遺伝子であると推定された c この S N D H遺伝子の塩基配列を後記配列表の配列番号 4に、 塩基配列より推定 されるアミノ酸配列を配列番号 2に示す。
実施例 10 : E. c i中での SNDH遺伝子の発現
(1)形質転換された E. co^ iの培養
実施例 6と同様ににして E. c o£ i JM109/pUC l 9SD5の細胞破 砕物を得、 酵素アツセィに使用するまで一 20°Cで保存した。
(2) SNDH活性の測定
発現された SNDH活性を、 HPLCを用いて反応生成物である 2KLGAの 量を測定することによって調べた。 1% L—ソルボソン、 0.5mM NAD, 0.1Mリン酸緩衝液 （pH8.0) および超音波処理した細胞破砕物よりなる反応 液を 30てで 5時間振とうインキュべ一ションした。 該反応を 6 N硫酸で pH 2 に調整することにより止め、 反応混液を 4°Cで 6000 r pm, 1 0分間遠心分 離し、 その上清の一部を HP LC (カラム Capcellpak NH2： 4.6 m内径 X 25 Omm、 資生堂社製） に付して分析した。 移動相として、 30%ァセトニトリル を含む 2 OmMリン酸ナトリウム緩衝液 （pH3.0) を用い、 流速は 1.2ΙΏ£Ζ 分で行った。 検出は 21 0 nmの紫外部吸収を測定することにより行った。
その結果、 プラスミ ド pUC 1 9 SD 5で形質転換した E. c o^ i J l 0 9ZpUC 1 9 SD 5の超音波処理細胞を加えたものは、 5， 690 zg/mi の 2 KLG Aを生成しており、 L一ソルボソンを 2 KLG Aに変換する能力を有 していることが確認された。 また、 該形質転換体の宿主である E. c 0 i J 1 09自身も、 2 KLG A変換能力を有していたが、 その能力は形質転換体の約 1Z2 (2, 1 7 O yt/ gZm^) であり、 明らかに形質転換体の 2KLGA変換 能すなわち SNDH活性が増強されていた。 このことから、 組換えブラスミ ド p UC 1 9 SD 5が SNDHをコードする遺伝子を含有し、 実施例 9で判明した S DH遺伝子の 5' 側の上流に存在する 1 4 9 7 b pよりなる ORFが SNDH遺 伝子であることが明らかとなつた。
実施例 1 1 ：宿主の選別
( 1 ) ソルボース高生產菌の選別
D _ソルビトールを高収率で L—ソルボースに変換する生產菌を果物より分離 した。 ポテトデキストロ一ス 2· 4 %、 エタノール 0.5%、 ペプトン 0.3%、 酵母 抽出物 0.5%、 酢酸 0.0 3%の組成よりなる集殖培養培地に分離源を少量加え、 3 0でで 5日間静置培養した。 菌の純粋分雜には D—ソルビトール 5 %、 酵母抽 出物 0.5%、 炭酸カルシウム 0.25%、 寒天 1.5 %よりなるプレート培地を用い、 3 (TCで 5日間培養して生じたコロニーを釣菌した。 ブレート培地で生育した菌 をグルコース 2.5%、 酵母抽出物 0.5%、 ボリペプトン 1.0%および炭酸カルシ ゥム 0.5 %からなる種培地 6 m £を含む試験管に接種し 3 0 'Cで 1 8時間試験管 振とう培養器で培養した後、 その培養液 0.5m£を D—ソルビトール 5%、 酵母 抽出物 0.5%、 炭酸カルシウム 2%からなる生産培地 1 5m^を含む 1 0 0m£ 容の三角フラスコに接種した。 このフラスコをロータリ一シェーカー （25 0 r pm) で、 3 0°Cで 4日間培養後、 生成した L一ソルボースを HPLC (カラム OA KC 7.8111111内径 3 0 0111111， メルク社製、 移動相 0. 0 5 N硫酸、 流速 0.4 m ノ分、 検出は示差屈折計） で測定して高収率の L一ソルボース生産 能を有する菌抹を選別した。 これら各選別株を、 D—ソルビトール濃度のみを 1 0 %、 1 5 %および 20%に変更した培地でスクリーニングし、 D—ソルビトー ルが高濃度の場合でも L一ソルボースを高収率で生産する菌株 5株を選別した。 これら 5株のうち最も耐糖性が高く、 高収率で D—ソルビトールを Lーソルボー スに変換したのは G 6 24 (FER B P— 44 1 5 ) であった （表 5 ) 。 -表 5—
Figure imgf000026_0001
ルビトール、 0.5 %酵母抽出物、 2.0%炭酸カルシウムからなる培地 1 O Orn^ を入れた 5 0 Om^容の三角フラスコに接種し、 30でで4 8時間、 ロータリ一 シェーカー （25 0 r pm) で培養を行った。 4でで5 0 0 111、 1 0分間遠 心分離し炭酸カルシウムを除き、 その上清を 4でで 6 0 0 0 r pm、 1 0分間の 遠心分雜により集菌した後、 生理食塩水による洗浄、 同条件での遠心分離操作を
2回操り返した後、 菌体を再び生理食塩水に懸濁し 2.5 m £に容量をあわせた。 次に氷冷下、 3 0秒間隔でトータル処理時間 6分間で、 超音波処理し、 超音波 破砕細胞を調製した。 超音波破砕細胞 1. Om^に 2% 2KLGA. 2mM N ADPH、 0.2Mリン酸緩衝液 （pH7.0) から成る試験液 1.0 m ^を加えて試 験管中で 3 0 、 3時間および 5時間振とうした後、 6N硫酸で pH2に調整し 反応を停止させた。 反応液を 4°Cで 6 0 0 0 r pm, 1 0分間遠心分離を行った 後、 その上清を実施例 1 0— （2) に記載した HPLC法により 2KLGAおよ び、 Lーィドン酸の測定を行った。 反応時間 0時間の場合および NADPH無添 加の場合とあわせてその結果を表 6に示す。 G 6 24には 2KLGAの分解能が ないことが判明した。
一表 6— G 6 24による 2KLGAの分解試験 （ 1 % 2KLGA)
NAD PHの添加 反応時間 2KLGA Lーィドン酸
(m.M) (時間） (m g/m £ ) (m g/m & )
0 0 9.30 0.0 0
3 9.0 0 0.0 0
5 9.2 1 0.0 0
1 0 9.0 0 0.0 0
3 9.23 0.0 0
5 9.37 0.0 0
(3) ソルボース高生産性で 2KLGA低分解性である菌株 G 6 24の同定 G 6 24の菌学的性質を Bergey' s Manual of Systematic Bacteriology
CThe Williams & Wilkins Company (1989)) に基づき分析した結果、 G 6 24は グラム陰性短かん菌、 G + C= 57.4%、 ォキシダーゼ陰性、 カタラーゼ陽性、 エタノールを利用し、 好気的に発育することから、 F am i y Ac e t o— b a c t e r i a c e a eに属し、 菌体イソブレノィドキノンとしてュビキノン 10のみを含有することからグルコノバクター属と確定した。 また、 基準株として グルコノバクタ一 ·ォキシダンス I FO 3287および I FO 32 9 3を用いて マイクロブレートによる DNA— DNAハイプリダイゼーシヨン手法を用い、 D NA相同性から本菌がグルコノバクタ一 ·ォキシダンスであることを決定した。
(4) 選択マーカーの選定
宿主として選別した G 6 24の各種抗生物質感受性を寒天希釈法により調べ、 形質転換の選択マーカーとして薬剤 W性遺伝子が使用できるかを検討した。 結果 を表 7に記載する。 -表 7— 寒天希釈法による M I C ( g m£
Figure imgf000028_0001
SY培地： D—ソルビトール 5. 0 %
酵母エキス 0. 5 %
C a C 03 0. 2 b %
寒天 1. 0 % 以上の結果より G 6 24はカナマイシンに対して感受性を示し、 選択マーカー としてカナマイシン耐性を利用できる宿主菌として選別された。
実施例 1 2 ： シャ トルベクターの構築
シャ トルベクタ一の大量取得や発現べクタ一のクローニングに適した微生物と して大腸菌を選び、 ダルコノバクタ一 ·ォキシダンスと大腸菌の両者で自律的に 複製することができるシャトルべクタ一を構築した。
( 1 ) ダルコノバクタ一のプラスミ ドの取得
グルコノバクタ一の自己複製ュニットを得るために、 グルコノバクタ一のタイ ブカルチャーおよび天然分離株からブラスミ ドの取得を試みた。
グルコノバクタ一の夕イブカルチヤァ I F 0328 7、 I AMI 2 1 3 8およ び天然分離株グルコノバクタ一 ·ォキシダンス T一 1 00 (FERM BP- 4 1 8 8) をそれぞれ MB培地 （D—マンニトール 2.5 %、 ボリペプトン 0.3%、 酵母抽出物 0.5 %、 p H 6.0 ) 6m ^の入った試験管 1 0本に接種し、 3 0。Cで 1 8時間、 試験管振とう培養機で種培養を行った。 5 0 Om^容の三角フラスコ 1 0本にそれぞれ 1 00m lの MB培地を入れ、 種培養を 3 m ^ずつ接種し 3 0 てで、 6時間培養した。 得られた 1 0本分の培養液 （ 1 リツ夕一） を 4てで 6 0 0 0rpm、 1 0分間遠心後、 得られた菌体を P 1溶液 （ 1 0 0 gノ m リボ ヌクレア一ゼ八、 1 OmM EDTA、 5 0 mMトリスー塩酸緩衝液 p H 8.0 ) 3 0m に懸濁し、 P 2溶液 （ 1 %SDS、 0.2 N水酸化ナトリウム溶液） 3 0 m lおよび P 3溶液 （3M 酢酸カリウム緩衝液 pH5. 5) 3 0m^を添加し、 4でで1 3 0 0 0 111、 3 0分間遠心分離をおこなった。 上清をもう一度同条件 で遠心分離し、 その上清を QBT溶液 （ 1 5 % エタノール、 0, 1 5%トライト ン X— 1 0 0、 75 Om 塩化ナトリウム、 5 OmM MOPS緩衝液 pH7. 0) で平衡化したキア一ゲンカラム T i p 1 0 0 〔キア一ゲン（Quagen)社製〕 に 吸着させ、 QC溶液 （ 1 5% エタノール、 1 M 塩化ナトリウム、 5 OmM MOPS緩衝液 pH7.0) 1 Om^で 2回洗浄後、 QF溶液 （ 1 5 %エタノール、 1, 25M塩化ナトリウム、 5 OmMトリスー塩酸緩衝液 pH8.5) 1 0m で溶 出した。 溶出液に、 その 0.7倍容のイソプロパノールを加えた後、 4でで 1 0 0 0 Orpm、 3 0分間遠心分雜後、 沈殿を 7 0%エタノールで洗浄し、 減圧乾燥し DNAを得た。 得られた DNAを TE緩衝液 （ 1 mM EDTA、 1 OmMトリ スー塩酸緩衝液 PH8.0) 1 5 0 / £に溶解した。 λΗ i n dill 分子量マーカ 一 （ベーリンガーマンハイム社製） を指標にして、 これらの DNA溶液を 0.8 % ァガロースゲルで 1 0 0V、 3 0分間泳動後、 ェチジゥムブ口マイドで染色され る 2 kbから 5 kbの範囲に存在する単一のバンドをゲルから切り出し、 透析チ ユーブに入れて 1 0 0V、 3 0分間泳動後、 電流の向きを逆にして 3 0秒間泳動 後、 チューブ内の液をエツペンドルフチューブに移した。 水飽和フエノールにて 2回抽出後、 水層をブタノールで洗浄、 脱水を繰り返し 5 0 0 / まで濃縮した 後、 3M酢酸ナトリウム 5 0 ^および 1 のエタノールを加えて、 一 20。Cで 一夜放置した。 この溶液を、 4°C、 1 4 0 0 Orpmで 3 0分間遠心後、 沈殿を 7 0 %エタノールで洗浄後、 減圧乾燥を行った。 これを TE緩衝液に溶解してブラ スミ ド溶液を得た。 ダルコノバクタ一 I FO 328 7由来の 2.6 kbブラスミ ド を pF 2、 I AM I 2 1 3 8由来の 3.7 k bブラスミ ドを pF 3および天然分雜 株グルコノバクタ一 T一 1 00由来の 4. 4 kbプラスミ ドを p F 4と命名した (図 3参照） 。
(2) グルコノバクタ一と大腸菌とのシャトルベクターの構築
—方、 大腸菌で機能する複製起点を含む薬剤耐性ブラスミ ドとしてカナマイシ ン耐性遺伝子およびマルチクローニングサイト含有^ a c Z遺伝子を有する pH SG 298 (宝酒造社製） を用いた。
シャトルベクターは次の如く作成した。 pHSG 298を制限酵素 Ac c I ( 日本ジーン社製） で切断後アルカリホスファタ一ゼ処理し、 Ac c Iで切断した pF 2と T4DNAリガーゼで連結した合体ブラスミ ドを作成し、 pFG5Bと 命名した （図 4参照） 。 また、 pHSG 298を制限酵素 Hi n dill (日本ジ —ン社製） で部分的に切断し、 アルカリホスファターゼ処理し、 Hi ndlll で 切断した p F 3および pF 4に T4 DNAリガ一ゼで連結した。 カナマイシン耐 性遺伝子を保有するそれぞれの合体ブラスミ ドを PFG 1 4 Aおよび pFG 1 5 Aと命名した （図 5および図 6参照） 。 これらの合体プラスミ ドを形質転換法に より E. c 0 i JM 1 09に導入してカナマイシン耐性と^ a cZによる発色 の有無で合体ブラスミ ド保有菌株の選別を行った。
実施例 1 3 ： グルコノバクタ一の形質転換
(1) コンビテントセルの調製と形質転換
グルコノバクタ一 ·ォキシダンス G 624 (FERM BP— 44 1 5) を 2. 5%グルコース、 0.3%ボリペプトン、 0.5%酵母抽出物からなる培地 1 00m ^の入った 50 Om 容の三角フラスコに接種し、 25でで約 20時間培養後、 培養液の 57 O nmの吸光度が 0.6から 1.2の範囲であることを確認後、 4 で 6000 r pm, 1 0分間遠心分離して集菌した。 形質転換はエレクトロポレー シヨン法 （Dower, W. J., Miller, J. F. and Ragsdale, C. W. , Nucleic Acid Res. Vol. 16(1988). p6127)により、 大腸菌の場合に準じて実施した。 コンビテ ントセルは上記の遠心分離菌体を 1 0%グリセロールで洗浄後、 再び 4てで 60 00 r pm, 1 0分間遠心分離して集菌し、 顕微鏡下で 1 01 D個 iの懸濁液 を調製した。 形質転換に用いるブラスミ ドとしては、 実施例 1 2— （2) で得ら れたシャトルベクター pFG 1 4 Aを実施例 1 2— （ 1) 記載の方法に準じて単 離精製した後、 TE緩衝液で DNA4mgZm^溶液として使用した。 コンビテ ントセル懸濁液 1 にシャ トルベクター 1 〃^を加えて混合し、 この形質 転換液 6 0 n 1をジーンパルサー （バイオラッド社製） のキュべットに入れる。 キュベッ ト幅 0. 1 cm、 抵抗 2 0 0 Ω、 電圧 1. 8 K V、 容量 25 / Fでエレ クトロポレーシヨンを行い、 キュべッ ト内の形質転換液に MB培地 1 m£を加え て懸濁させ、 全量を 1 5m 容のコ一ニングチューブに移して、 3 O'Cで 2時間、 恒温温水槽中で振とう （8 0 r pm) インキュベーションした後、 カナマイシン 1 0 0 // gZm^を含む MB寒天プレートに搐き、 生育コロニー数を調べた。 そ の結果、 上記条件ではグルコノバクタ一は殆ど形質転換されないことが判明した c グルコノバクタ一 ·ォキシダンス G 624の培養条件およびエレクトロボレー シヨンの条件について種々検討した。 その結果、 培地の炭素源として D—マンニ トールを使用することにより高い形質転換効率が得られることが判明した。 エレ ク トロボレーションの条件については上記条件が最も効率が良いことがわかった c すなわち、 上記培地のグルコースの代わりに D—マンニトールを使用し、 キュべ ッ ト幅 0.1 cm、 抵抗 20 0 Ω、 電圧 1.8 KV、 容量 25 zFでエレク トロポレ ーションを行った結果、 表 8に示すように G 624 -pFG 1 4 Aを効率よく得 ることができた。
一表 8—
培地の種類 形質転換体の個数 （個数// zgDNA) グルコース培地 0
マンニトール培地 1 5 0 0 シャ トルベクター pFG 5 Bおよび p FG 1 5 Aについても同様の方法で、 グ ルコノバクタ一 ·ォキシダンス G 624を形質転換することにより形質転換体 G 6 24— p FG 5 Bおよび G 6 24— pFG l 5 Aを得ることができた。 これら の結果よりグルコノバクタ一のブラスミ ド pF 2の Ac c I切断部位、 pF 3お よび p F 4の H i n dill 切断部位はそれぞれのブラスミ ドの自己複製ュニッ ト とは無関係な部位に存在することも明らかとなつた,
(2) シャ トルベクターの宿主中での安定性
シャ トルべクターの宿主中での安定性は次のようにして調べた。
カナマイシン非存在下で M B培地にて液体培養を 2代継代し、 各ブロスより力 ナマイシン無添加 MB寒天プレートにまき 30'C、 2日間培養後、 生育したコロ ニーをカナマイシン 50 / g添加 MB寒天ブレートと無添加 MB寒天プレートに レブリカし安定性を調べた。 なお、 安定性は下記の式より算出した。 結果を表 9 に示す。
カナマイシン Βί性コロニー数
安定性 （％) = X 100
試験コロニーの総数 一表 9一 シャトルベクターの宿主中での安定性
シャ トルベクター 継代培養 安定性％
PFG5B 1代 100
2代 100
pFG 14 A 1代 100
2代 100
pFG 15 A 1代 1 00
2代 1 00
3種類の p F Gシャトルべク夕一を導入した形質転換株のソルボース生産性は 宿主と同じでプラスミ ドによる生産性への影響は認められなかった。
実施例 14 ： SDHおよび SNDH遺伝子を含有する発現べクタ一の構築 (1) pSD5-R I Bgの構築
シャ トルベクターに挿入する SDH遺伝子および SNDH遺伝子を含む DNA 断片の大きさを小さくするために、 pUC l 9SD5の Sa£ I部位から Bg^ II部位までの約 2 kbを削除した。 すなわち、 PUC 1 9SD5を Sa £ I (日本ジーン社製） 及び Bg^II (フ アルマシア社製） にて消化し、 生じた約 7, 000及び 2, 000のDNA断片 を 0.8 %ァガロース電気泳動で分雜した。 約 7, 000の断片を単離し、 DNA ボリメラーゼクレノウフラグメントにより DN A末端を平滑化した後、 T4 DN Aリガーゼによりセルフライゲーシヨンを行ってプラスミ ド pSD5— R I B g を得た （図 7参照） 。
(2) 発現ベクターの構築
PSD5-R 1 Bgを制限酵素 E c oR I (日本ジーン社製） および P s t I
(日本ジーン社製） で切断して SDHおよび SNDH遺伝子を含む約 4.4 kbの DNA断片を取得した。 この DNA断片と実施例 1 2で構築したシャ トルベクタ 一 pFG 1 4 Aを制限酵素 E c oR Iと P s t Iで切断して得られる DNA断片 とを、 T4DNAリガ一ゼにより結合させ、 新しく SDHおよび SNDH遺伝子 を含む発現ベクター pSDHl 45を構築した （図 8参照） 。 また同様にシャト ルベクター pFG l 5Aと結合させ発現べクタ一 pSDHl 55を構築した
(図 9参照） 。
実施例 1 5 ： p SD 5— R I B gのグルコノバクタ一 ·ォキシダンス丁 1 00由 来の DNA配列
SNDH遺伝子の 5' 上流領域 （プロモーターを含む） の DNA配列および S DH遺伝子の 3' 下流領域 （夕一ミネ一夕一を含む） DNA配列を決定するため、 pUC 1 9 SD 5 (図 2) を実施例 5および実施例 9と同様の手法で分析した。 これらの結果を配列表配列番号 5に示す。 塩基番号 1一 1 040にはプロモ一夕 —領域が、 塩基番号 1 04 1— 4 1 32には SNDH遺伝子および SDH遺伝子 が、 また塩基番号 4 1 33以降にターミネータ一が含まれる。
実施例 1 6 ：発現ベクターによるグルコノバクタ一 ·ォキシダンス G 624の形 質転換
( 1 ) 形質転換株の取得
実施例 1 4で得られた発現ベクター p SDH 145および PSDH 1 55を実 施例 1 3 ( 1 ) と同様にしてグルコノバクタ一 ·ォキシダンス G 62 に形質転 換を行い形質転換株 G 34 (G 6 24 p SDH 1 4 5) および GA - 1 (G 6 24 -P SDH 1 5 5) (FERM B P— 4 5 22 ) を取得した。
(2) 発現べクタ一の宿主中での安定性
発現ベクター P SDH 1 4 5および p SDH 1 5 5が、 宿主であるグルコノバ クタ一 'ォキシダンス G 624中で、 シャ トルベクター p FG 1 4 Aおよび p F G 1 5 Aと同様に安定であるかどうか、 実施例 1 3— （2) に記載した方法によ り調べた。 結果を表 1 0に示す。
一表 1 0— 発現ベクターの宿主中での安定性
発現ベクター 継代培養 安定性％ pSDH 1 4 5 1代 9 8
2代 9 3
p SDH 1 5 5 1代 1 0 0
2代 1 0 0
( 3 ) 形質転換株の 2 K L G A生産性
形質転換株 GA— 1を、 2.5%グルコース、 1.0%ポリペプトン、 0.5%酵母 抽出物、 0, 5 %炭酸カルシウムおよび 50 fi gZm^カナマイシンからなる培地 6 の入った試験管に接種し 3 0でで1 8時間、 試験管振とう培養機で種培養 を行った。 この種培養液 0.3m を 5%D—ソルビトール、 0.5%酵母抽出物、 2.0 %炭酸カルシウムからなる培地 1 Om^の入った 1 0 Om^容の三角フラス コに接種し、 3 0°Cで 5日間、 ロータリ一シェーカー （250 r pm) で培養を 行った。 培養液を 4°Cで 6 0 0 0 r pm、 1 0分間遠心分離した上清について、 実施例 1 0— （2) に記載した HPLC分析を行い、 2KLGAの生成量を調べ た。 SDH遺伝子および SNDH遺伝子のクローニングに使用した 2 KLGA高 生産菌であるグルコノバクタ一 ·ォキシダンス T一 1 0 0についても上記と同条 件で培養を行い 2 KLG Aの生成量を調べた。 結果を表 1 1に示す。 菌 株 2KLGA生成量 Lーィドン酸生成量
m g/m £ ) (mg/mi)
GA- 1 1 7 1 2
T 1 00 g 7 形質転換株 G A— 1は D—ソルビトールから 2 K L G Aを生産するようになつ ており、 GA - 1中で SDH遺伝子および SNDH遺伝子が発現し、 宿主 G 62 4のソルビトールデヒドロゲナーゼの働きで D—ソルビトールから作られた L一 ソルボースが、 SDHおよび SNDHの働きで酸化されて 2 KLG Aが生産され たことは明らかである。
D—ソルビトールから 2 K L G Aを生産する天然分離菌株の 2 K L G A生産力 価向上変異株であるグルコノバクタ一 ·ォキシダンス T一 1 00と比較しても明 らかに 2 KL G A生産性が向上している。
21^1^〇 の分析と同時に：1—ィドン酸の生成の有無を、 実施例 1 0— （2) 記載した 2KLGAの HPLC分析法に従い実施した。 結果を表 1 1に示したが、 GA— 1はかなりの量の Lーィドン酸を生成していることが明らかとなった。 L ーィドン酸の生成経路は明らかでないが、 Lーィドン酸生成経路を遮断すること により 2 K L G Aの生産量が増加すると考えられる。
実施例 1 7 ： L—ィ ドン酸低生産性宿主の取得
( 1 ) Lーィドン酸低生産性形質転換株の取得
形質転換株 GA— 1をニトロソグァ二ジン （NTG) 変異処理をすることによ り、 Lーィドン酸生産能を著しく低下させた 2KLGA生産株ダルコノバクタ一 ォキシダンス I A 1 069を取得した。
実施例 1 6— （3) に記載した方法に従い、 I A1 069を培養した後、 培養 液中の 2KLGAおよび L—ィドン酸を HP LCで分析した結果を表 1 2に示す c
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000036_0002
(2) L—イドン酸低生産性形質転換株から発現べクタ一の除去
I A 1069をノボピオシン処理することにより、 D—ソルビトールから L一 ソルボースの生産性および L一イドン酸低生産性に影響を与えることなく発現べ クタ一 pSDHl 55だけを除去することができた。
実施例 1 6 (3) に記載した方法に従い培養した I A 1 069の種培養液 lm ^をノボビォシン 0， 5 gZm ^添加 MB培地 20 m ^の入った 100 m 1容の 三角フラスコに接種し、 30eCで 24時間、 ロータリーシェーカー （250 r p m)で培養を行い同じ培地で 5回継代培養を行った。 この培養液をカナマイシン 無添加 MB寒天プレートに播き、 30'Cで 2日間培養後、 生育したコロニーを力 ナマイシン無添加 MB寒天プレートとカナマイシン 50 gZm^添加 MB寒天 プレートにレブリカし、 発現ベクター pSDHl 55喪失株を選択した。 5回継 代することにより発現べクタ一 P SDH 155の喪失率は 50%であった。 発現 ベクター p SDH 155喪失株について上記したスクリーニング法を用いて単紬 胞分離を行い、 実施例 12 (1) に記載した方法に従い、 ァガロース電気泳動で p SDH 1 55が完全に除去されたことを確認した。 得られた発現ベクター pS DH155喪失株 NB 6939について、 実施例 1 1 (1) に記載した方法に従 い、 D—ソルビトールから L—ソルボースへの変換活性を調べたところグルコノ パクター■ォキシダンス G 624と同等のソルボース高生産性を示すことが判つ た。
実施例 18 ：発現ベクターによるグルコノバクタ一 ·ォキシダンス NB 6939 の形質転換と形質転換株の 2 K L G A生産性
発現べクタ一 PSDHl 45および p SDH 155を実施例 1 3 (1) と同様 にして、 実施例 1 7で得られたグルコノバクタ一 ·ォキシダンス NB 6939に 形質転換を行い、 形質転換株 N 943 (NB 6939 -pSDHl 45) および N 952 (NB 6939-pSDH1 55) (FERM B P— 4580 ) を取 得した。 形質転換株 N 943および N 952について実施例 1 6— （3) と同様， 種培養液 0.3m^を、 5%D—ソルビトール、 0.5%酵母抽出物、 2.0 %炭酸力 ルシゥ からなる培地 1 Om^の入った 1 0 Om^容フラスコに接種し、 30 °C で 7日間、 口一夕リーシヱ一力一 （250 r pm) で培養を行った。
培養液を 4 °Cで 6000 r pm. 1 0分間遠心分雜した上清について、 HPL C法により 2KLGAおよび Lーィドン酸の生成量を調べた。 同時に実施した G A— 1の培養結果とともに、 結果を表 1 3に示す。
一表 1 3—
Figure imgf000037_0001
かかる結果から、 L一ソルボース高生産性で 2KLGA低分解性かつ Lーィド ン酸低生産性宿主に発現べクタ一を導入することにより、 D—ソルビトールから 2KLGAの生産収率が著しく向上したことは明らかである。
実施例 1 9 ：大腸菌プロモーター組み込み発現ベクターによるグルコノバクタ一 ォキシダンス NB 6939の形質転換と形質転換株の 2 KLG A生 産性
( 1) ブロモ一夕一挿入用発現ベクターの構築
発現べクタ一 p SDH 1 55は、 グルコノバクタ一■ォキシダンス T一 1 00 染色体 DNAの SNDH翻訳開始コドン （ATG) の上流 1 040 bp迄の塩基 配列を含んでおり （配列番号 5) 、 SNDH遺伝子のプロモータ一配列のかわり に強力なプロモータ一配列を挿入すれば、 S N D H遺伝子および S D H遺伝子の 発現を増大させることができると考えられる。 塩基配列 CCATAG (配列番号 5の塩基番号 1 017 - 1022) を Nc o I切断部位 （CCATGG) に改変 することにより、 この Nc 0 I切断部位と配列番号 5の塩基番号 1一 6の E c 0 R】切断部位を利用して、 プロモーター配列の入れ替えが可能となる。
発現ベクター pSDHl 55の SNDH遺伝子上流に Nc o I切断部位を導入 し、 SDH遺伝子下流に存在する Nc 0 I切断部位およびシャトルべクタ一 pF G 15 Aに由来する a cプロモータ一を除去したプロモーター揷入用発現べク ターの構築を行った。
i ) SNDH遺伝子上流の S s p I切断部位 （配列番号 5、 塩基番号 1 031 -
1036 ) と u I切断部位 （配列番号 5、 塩基番号 870 - 875 ) を利用 して DNA配列を入れかえ、 Nc 0 I切断部位を導入した。 pSD5— R I Bg
(図 7) を Ec oR Iと Ps t Iで切断し、 プロモーター、 SNDH遺伝子、 S DH遺伝子を含む約 4， 6 kbの DNA断片を 0.8%ァガロースゲル電気泳動に より取得した。 一方、 大腸菌ブラスミ ド PBR322を Ec oR Iと Ps t lで 切断し、 テトラサイクリン ¾性遺伝子と複製開始点を含む約 3.6 k bの DNA断 片を 0.8 %ァガロースゲル電気泳動により取得した。 両 DNA断片を T 4 DNA リガーゼにより連結し、 S s p I切断部位を 1箇含む大腸菌での発現ベクター p SD 33を取得した （図 1 0)。
ii) ボリメラーゼチェインリアクション （PCR) により Nc 0 I切断部位を導 入した M£ u I -S s p I DNA断片 （配列番号 5、 塩基番号 870 - 1036 参照） を調製した。 すなわち、 p SD 5— R I B gをテンプレートとして、 ブラ イマ— P 5 〔5' CGG TGC GTT ACG CGT CAG GAA
G 3' 、 £ υ I切断部位 （下線） を含む配列〕 と P 6 〔5' 丁 CA TGA GAA ATA TTC CTA CTG ACC ATG GTG CTG CC 3' 、 CS s p I切断部位 （5' 側下線） と Nc o I切断部位 （3' 側下線） を含む配列〕 を用いて PCRを行った。 PCR産物をクイックスピンカラム G—
25 (ベーリンガーマンハイム社製） で精製し、 Ssp Iと M^u Iで消化した 後、 2%ァガロースゲル電気泳動で 161 bpの Nc 0 I切断部位を含む u I—S sp I DNA断片を取得した。 一方、 pSD33を M£u Iと Ss p I で切断し、 約 8· 0 kbの DNA断片を単離し、 この DNA断片と上記 I 61 bp の u I -S s p I DNA断片を T 4 DNAリガ一ゼで連結し、 Nc o I切 断部位を導入した大腸菌での発現べクタ一 PSD 34を取得した （図 1 1) 。 iii) p SD 34を Ec oR Iと Ps t Iで切断して、 Nc o I切断部位を有する SNDH遺伝子上流配列、 SNDH遺伝子、 S DH遺伝子を含む約 4.6 k bの D NA断片を単離し、 発現ベクター pSDHl 55の相当部位と入れかえることに より、 SNDH遺伝子の上流に Nc 0 I切断部位を導入した発現ベクター pSD HI 55— NCを取得した （図 12)。
iv) この発現ベクター p SDH 155— NCは SNDH遺伝子上流の N c o I切 断部位以外に、 SDH遣伝子下流にもう 1箇所 Nc 0 I切断部位を有しているの で、 次に、 この SDH遺伝子下流の Nc 0 I切断部位の除去を行った （図 1 3参 照） 。 まず、 pSDHl 55を Nc o Iで切断し、 DN Aボリメラーゼクレノウ フラグメントで平滑化した後、 T 4 DNAリガーゼを用いて閉環し、 Nc 0 I切 断部位を含まぬ発現ベクター pSDH 155— NKを作製した。 この pSDHl 55NKを E c oR Iと S a c Iで切断し、 SNDH遺伝子上流、 SNDH遺伝 子および SDH遺伝子の一部を除去した約 8.2 kbの DNA断片を単離した。 一 方、 pSDH155— NCを Ec oR Iと Sa c Iで切断し、 SNDH遺伝子上 流 （Nc o I切断部位を含む） 、 SNDH遣伝子および SDH遺伝子の一部を含 む約 3.4 k bの DNA断片を単離した。 両 DNA断片を T 4 DNAリガーゼで連 結し、 SNDH遺伝子上流に 1箇所だけ Nc 0 I切断部位を有する発現ベクター pSDH 155— NNを構築した （図 13参照） 。
V) この発現ベクター pSDHl 55— NNには、 大腸菌ブラスミ ド pHSG2 98由来の a cブロモーターが含まれているので、 次に、 この^ a cプロモー ターの除去を行った （図 14)。 シャ トルベクタ一 pFG 15 Aを PvuIIで部 分消化し、 1箇所の PvuII切断部位のみが切断された約 7.0 kbDNA断片を 取得した。 この DNA断片と E c oR Iリンカ一 （5' CCG GAA TTC CGG 3' ) を T 4 DNAリガーゼで連結した後、 加熱処理して酵素を失活さ せた。 次に、 連結 DNAを E c oR Iで切断し、 約 6.8 kbの DNA断片を単離 し、 得られた DNAを T 4 DNAリガ一ゼで自己閉環させることにより、 ·β a c プロモーターを除去したシャトルべクタ一 p F G 1 6 Aを取得した。
PFG 1 6Aを Ec oR Iと Ps t lで切断し、 約 6.8 k bの DNA断片を単 離した。 また、 pSDHl 55— NNを Ec oR Iと Ps t Iで切断し、 SND H遣伝子上流 （Nc o 1切断部位を含む） 、 SNDH遺伝子および SDH遺伝子 を含む約 4.6 k bの DNA断片を単離した。 両 DN A断片を T 4 DNAリガーゼ で連結し、 目的とするプロモーター揷入用発現ベクター PSDH 1 65一 NNを 取得した （図 1 4参照） 。
(2)大腸菌プロモーター構築用の DNAオリゴマーの調製
大腸菌プロモーターは、 それぞれのブ口モーターの一 35領域の上流に E c 0 R I切断部位を連結し、 一 1 0領域の下流に Nc 0 I切断部位を連結した形にな るように設計した。 プロモータ一構成 DNAオリゴマーは、 一 35領域と一 1 0 領域の中間で 2分し、 一 35領域を含む DNAオリゴマー、 一 1 0領域を含む D NAォリゴマ一およびそれぞれの相補 DNAオリゴマーの 4本の DNAオリゴマ 一を DN Aシンセサイザ一 'モデル 392 (アプライドバイオシステムズ社製） を用いて合成した。 各プロ乇一夕一の構成 DNAオリゴマーを表 1 4に示す。
衣 1 4 台成大腸菌プロ モ ー タ ー の D N A オ リ ゴマ ー 1. tufBプ ロ モー 夕 一 name size sequence ( 5 '→ 3 ' )
TUFBl (30) AAT 丁 CG CAA TTT TTT AGT TGC ATG AAC TCG
TUFB2 (33) ACA CAT GCG AGT TCA TGC AAC 丁 AA AAA A丁丁 GCG
TUFB3 (29) CAT GTC TCC ATA GAA TGC GCG CTA CTT GC
TUFB4 (26) CAT GGC AAG TAG CGC GCA TTC TAT GG . trpプロ モー タ ー name size sequence ( 5 "→ 3 " )
PZ9 (30) AAT TCT GAA ATG AGC TGT TGA CAA TTA ATC
P30 (33) GTT CGA TGA TTA ATT GTC AAC AGC TCA TTT CAG
P31 (29) ATC GAA CTA GTT AAC TAG TAC GCA AGT TC
P3Z (26) CAT GGA ACT TGC GTA CTA GTT AAC TA
3. λ PLプ ロ モー タ ー name size sequence ( 5 '→ 3 '
LAMBDA PL1 (30) AAT TCT CTC 丁 GG CGG TGT TGA CAT kk TAC
LAMBDA PL2 (33) GCC AGT GGT A丁丁 TAT GTC AAC ACC GCC AGA GAG
LAMBDA PL3 (Z9) CAC TGG CGG TGA 丁 AC TGA GCA CAT CAG CC
LAMBDA PL4 (26) CAT GGG CTG ATG TGC TCA GTA TCA CC . lac UV-5プロ モー タ ー name size sequence ( 5 ' ·→ 3 )
LAC UV5-1 (30) AAT TCG GCA CCC CAG GCT TTA CAC TTT ATG
LAC UV5-Z (35) AGC CGG AAG CAT AAA GTG TAA AGC CTG GGG TGC CG
LAC UV5-3 (30) CTT CCG GCT CG丁 ATA ATG TGT GGA ATT GTC
TAC4 (25〉 CAT GGA CAA TTC CAC ACA TTA TAC G . 1 ppプロ モ ー 夕 - name size sequence (5· → 3· )
LPPl (30) AAT TCA TCA AAA AAA TAT TCT CAA CAT AAA
LPP2 (33) AAA GTT TTT TAT GTT GAG AAT AT丁 丁丁丁 TTG ATG
LPP3 (29) AAA CTT TGT GTA ATA CTT GTA ACG CTA CC
LPP4 (26) CAT GGG TAG CG丁 TAC AAG 丁 AT TAC AC
3 Θ 6. tacプロ モー タ ー name size sequence (5· - 3' )
P29 (30) AAT 丁 CT GAA ATG AGC TGT TGA CAA TTA ATC
TAC2 (33) AGC CGA TGA TTA ATT GTC AAC AGC 丁 CA T丁丁 CAG
TAC3 ' (28) ATC GGC TCG TAT AAT GTG TGG AAT TGT C
TAC4 (25) CAT GGA CAA 丁丁 C CAC ACA TTA TAC G .
(3)大腸菌プロモーター配列を組み込んだ発現ベクターの構築
t u f Bプロモーター配列を組み込んだ発現ベクター P SDH— t u f B 1は 次のようにして作製した （図 15)。
DNAオリゴマー TUFB 2及び TUFB 3 (各 1〃 ^、 約 40pmo l) 、
1 0倍濃度リン酸化緩衝液 〔2 l、 660mM Tr i s - HC (pH7.5)
1 0 OmM MgCi2 , 1 50 πιΜ DTT〕 、 1 OmM ATP (2 ） 、 蒸留水 （12;/ ^) 、 T 4ボリヌクレオチドキナーゼ ヽ 20単位） から なる混合液を 37でで 1時間加温した後、 65°Cにて 30分加熱して酵素を失活 させた。 反応混合物 （20 £ に DNAオリゴマー TUFB 1及び TUFB4
(各 l u^、 ¾40 pmo l) 、 5倍濃度の T 4 DNAリガーゼ緩衝液 〔8 し 250 mM T r i s · HC (ρΗ7·6) 、 5 OmM Mg C 2 5 mM DTT、 25%PEG— 6, 000〕 、 1 OmM ATP (2 u £) 及び蒸留水
(4 z^) を加え、 7 CTCにて 5分加熱した後、 30分を要して 4°Cまで冷却し た。 得られた反応混合物に T 4 DN Aリガーゼ （2 ^、 600単位、 宝酒造） と 1 0mM ATP (4 / ） を加え、 1 6 にて 2時間静置した後、 65°Cに て 30分加熱して酵素を失活させた。 pSDHl 65— NNを Ec oR I及び N c o Iで消化し、 約 10.4 kbの DNA断片を回収した。 得られた DNA断片 （ H &、 200 n g) にオリゴマーのリゲーシヨン混合物 （1 ^：) 、 1 0倍濃 度の T4DNAリガ一ゼ緩衝液 （2〃·^) 、 蒸留水 （1 O/ ^)、 1 OmM A TP (2 ^ ) と T 4 DNAリガーゼ < υ 、 600単位） を加え、 1 6 に て 2時間リゲーシヨン反応を行い、 目的とする発現べクタ一 p SDH— ΐ υ f Β 1を調製した （図 1 5参照） 。
t r pプロモータ一配列を組み込んだ発現べクタ一 p SDH— t 6は表1 4の DNAオリゴマー p 29、 ρ 30、 ρ 3 1および ρ 32を用い、 ； PLプロ モーター配列を組み込んだ発現ベクター pSDH— PL 1は表 1 4の DNAオリ ゴマー LAMBDA PL K LAMBDA PL 2, LAMBDA PL 3 および LAMBDA PL4を用い、 a c UV 5プロモーター配列を組み込ん だ発現ベクター P SDH— a cUV5— 2は表 1 4の DNAオリゴマー LA C UV 5 - K LAC UV5— 2、 LAC UV 5— 3および TAC— 4を 用い、 ^ ppプロモーター配列を組み込んだ発現ベクター pSDH— g pp 1は 表 1 4の DNAオリゴマー LPPし LPP2、 L P P 3および L P P 4を用 い、 t a cプロモーター配列を組み込んだ発現ベクター p SDH— t a c 8は、 表 1 4の DNAオリゴマ一 P 29、 TAC 2、 T A C 3および T A C 4を用い、 上記 P SDH— t u f B 1と同様にして調製した。
(4) 大腸菌プロモーター組み込み発現ベクターによるグルコノバクタ一 ·ォキ シダンス NB 6939の形質転換と形質転換株の 2 KLG A生産性
実施例 1 7で得られた Lーィドン酸低生産性宿主 NB 6939を、 実施例 1 9 一 （3) で得られた大腸菌プロモータ一組み込み発現ベクターにより、 実施例 1 3— （1) と同様の手法で形質転換し、 形質転換株 NB 6939 -pSDH- t υ f B NB 6939 -p SDH- t r p 6. NB 6939 -p SDH-PL 1、 NB 6939— pSDH— £ a cUV5— 2、 NB 6939 -p SDH- pp lおよび NB 6939— pSDH— t a c 8を取得した。
NB 6939 -pSDH- t u f B K NB 6939 - pSDH - t r p 6お よび NB 6939— p SDH— PL 1について実施例 1 6— (3) に記載した方 法に従い種培養を行った後、 この種培養液 0.3m を 1 0%D—ソルビトール、 1.0 %コーンスティ一プリカ一および 2.0 %炭酸カルシウムからなる培地 1 Om ^の入った 1 0 Om^容の三角フラスコに接種し、 32でで 5日間、 ロータリー シェーカー （250 r pm) で培養を行った。 培養液を 4てで 6000 r pm. 1 0分間遠心分離した上清について、 HPLC法により 2KLGAの生成量を調 ベた。 結果を同時に実施した N 9 5 2 (NB 6 9 3 9— P SDH 1 5 5) および NB 6 9 3 9 -P SDH 1 6 5— NNの培養結果と共に表 1 5に示す。
一表 1 5—
Figure imgf000044_0001
NB 6 9 3 9 -p SDH- t u f B K NB 6 9 3 9 -pSDH- a c U V 5 - 2、 NB 6 9 3 9— p SDH - p iおよび NB 6 9 3 9 - p SDH - t a c 8について実施例 1 6— （3) に記載した方法に従い種培養を行った後、 この種培養液 0.3m を 1 0%D-ソルビトール、 1.5 %コーンスティ一プリカ ―、 0.1 5 %硫酸マグネシウムおよび 2.0 %炭酸カルシウムからなる培地 1 0 m ^の入った 1 0 Om^容の三角フラスコに接種し、 32°Cで 5日間、 ロータリー シェーカー （25 0 r pm) で培養を行った。 培養液を 4 'Cで 6 0 0 0 r pm、 1 0分間遠心分離した上清について、 HPLC法により 2KLGAの生成量を調 ベた。 結果を同時に実施した N 952 (NB 6 9 3 9 -p SDH 1 5 5) および NB 6 9 3 9 -p SDH l 6 5— NNの培養結果と共に表 1 6に示す。
一表 1 6—
菌 株 2KLGA生成量 Ong/ml)
N952 73
NB6939-PSDH165-NN 56
NB6939-pSDH-tufBl 91
NB6939-pSDH-lacUV5-2 61
NB6939-pSDH-lppl 33
NB6939-pSDH-tac8 85 〔配列表〕
配列番号： 1
配列の長さ ： 5 3 0
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
起源
生物名 ： グルコノバクタ一 ·ォキシダンス
株名 ： T-100
配列の特徵
特徴を決定した方法： E
配列
Thr Ser Gly Phe Asp Tyr l ie Val Val Gly Gly Gly Ser Ala Gly 1 5 10 15
Cys Val Leu Ala Ala Arg Leu Ser Glu Asn Pro Ser Val Arg Val
20 25 30
Cys Leu l ie Glu Ala Gly Arg Arg Asp Thr His Pro Leu l ie His
35 40 45
Met Pro Val Gly Phe Ala Lys Met Thr Thr Gly Pro His Thr Trp
50 55 60
Asp Leu Leu Thr Glu Pro Gin Lys His Ala Asn Asn Arg Gin l ie
65 70 75
Pro Tyr Val Gin Gly Arg l ie Leu Gly Gly Gly Ser Ser l ie Asn
80 85 90
Ala Glu Val Phe Thr Arg Gly His Pro Ser Asp Phe Asp Arg Trp
95 100 105
Ala Ala Glu Gly Ala Asp Gly Trp Ser Phe Arg Asp Val Gin Lys
110 115 120 Tyr Phe l ie Arg Ser Glu Gly Asn Ala Val Phe Ser Gly Thr Trp
125 130 135
Hi s Gly Thr Asn Gly Pro Leu Gly Val Ser Asn Leu Ala Glu Pro
140 145 150
Asn Pro. Thr Ser Arg Ala Phe Val Gin Ser Cys Gin Glu Met Gly
155 160 165
Leu Pro Tyr Asn Pro Asp Phe Asn Gly Ala Ser Gin Glu Gly Ala
170 175 180
Gly l ie Tyr Gin Met Thr 〖 le Arg Asn Asn Arg Arg Cys Ser Thr
185 190 195
Ala Val Gly Tyr Leu Arg Pro Ala Leu Gly Arg Lys Asn Leu Thr
200 205 210
Val Val Thr Arg Ala Leu Val Leu Lys He Val Phe Asn Gly Thr
215 220 225
Arg Ala Thr Gly Val Gin Tyr l ie Ala Asn Gly Thr Leu Asn Thr
230 235 240
Ala Glu Ala Ser Gin Glu l ie Val Val Thr Ala Gly Ala He Gly
245 250 255
Thr Pro Lys Leu Met Met Leu Ser Gly Val Gly Pro Ala Ala His
260 265 270
Leu Arg Glu Asn Gly l ie Pro Val Val Gin Asp Leu Pro Gly Val
275 280 285
Gly Glu Asn Leu Gin Asp His Phe Gly Val Asp He Val Ala Glu
290 295 300
Leu Lys Thr Asp Glu Ser Phe Asp Lys Tyr Arg Lys Leu His Trp
305 310 315
Met Leu Trp Ala Gly Leu Glu Tyr Thr Met Phe Arg Ser Gly Pro
320 325 330 s t
Οδ9
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9Md dsv BIV BIV 3JV nij) J3S 9Π d\\ BIV BIV usy J 1
0Ϊ9 909 009
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dsy J dJi
Figure imgf000047_0001
S8l00/S6dT/I3d 0 ε S60AV 配列番号： 2
配列の長さ ： 4 9 7
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺブチド
起源
生物名 ： グルコノバクタ一■ォキシダンス
株名 ： T-100
配列の特徵
特徵を決定した方法： E
配列
Asn Val Val Ser Lys Thr Val Ser Leu Pro Leu Lys Pro Arg Glu 1 5 10 15
Phe Gly Phe Phe l ie Asp Gly Glu Trp Arg Ala Gly Lys Asp Phe
20 25 30
Phe Asp Arg Ser Ser Pro Ala His Asp Val Pro Val Thr Arg l ie
35 40 45
Pro Arg Cys Thr Arg Glu Asp Leu Asp Glu Ala Val Ala Ala Ala
50 55 60
Arg Arg Ala Phe Glu Asn Gly Ser Trp Ala Gly Leu Ala Ala Ala
65 70 75
Asp Arg Ala Ala Val Leu Leu Lys Ala Ala Gly Leu Leu Arg Glu
80 85 90
Arg Arg Asp Asp 【le Ala Tyr Trp Glu Val Leu Glu Asn Gly Lys
95 100 105
Pro l ie Ser Gin Ala Lys Gly Glu He Asp Hi s Cys l ie Ala Cys
110 115 120
Phe Glu Met Ala Ala Gly Ala Ala Arg Met Leu Hi s Gly Asp Thr 125 130 135
Phe Asn Asn Leu Gly Glu Gly Leu Phe Gly Met Val Leu Arg Glu
140 145 150
Pro l ie Gly Val Val Gly Leu l ie Thr Pro Trp Asn Phe Pro Phe
155 160 165
Met l ie Leu Cys Glu Arg Ala Pro Phe lie Leu Ala Ser Gly Cys
170 175 180
Thr Leu Val Val Lys Pro Ala Glu Val Thr Ser Ala Thr Thr Leu
185 190 195
Leu Leu Ala Glu l ie Leu Ala Asp Ala Gly Leu Pro Lys Gly Val
200 205 210
Phe Asn Val Val Thr Gly Thr Gly Arg Thr Val Gly Gin Ala Met
215 220 225
Thr Glu His Gin Asp He Asp Met Leu Ser Phe Thr Gly Ser Thr
230 235 240
Gly Val Gly Lys Ser Cys l ie His Ala Ala Ala Asp Ser Asn Leu
245 250 255
Lys Lys Leu Gly Leu Glu Leu Gly Gly Lys Asn Pro l ie Val Val
260 265 270
Phe Ala Asp Ser Asn Leu Glu Asp Ala Ala Asp Ala Val Ala Phe
275 280 285
Gly l ie Ser Phe Asn Thr Gly Gin Cys Cys Val Ser Ser Ser Arg
290 295 300
Leu l ie Val Glu Arg Ser Val Ala Glu Lys Phe Glu Arg Leu Val
305 310 315
Val Pro Lys Met Glu Lys l ie Arg Val Gly Asp Pro Phe Asp Pro
320 325 330
Glu Thr Gin He Gly Ala l ie Thr Thr Glu Ala Gin Asn Lys Thr 335 340 345 l ie Leu Asp Tyr l ie Ala Lys Gly Lys Ala Glu Gly Ala Lys Leu
350 355 360
Leu Cys Gly Gly Gly l ie Val Asp Phe Gly Lys Gly Gin Tyr l ie
365 370 375
Gin Pro Thr Leu Phe Thr Asp Val Lys Pro Ser Met Gly l ie Ala
380 385 390
Arg Asp Glu He Phe Gly Pro Val Leu Ala Ser Phe His Phe Asp
395 400 405
Thr Val Asp Glu Ala l ie Ala l ie Ala Asn Asp Thr Val Tyr Gly
410 415 420
Leu Ala Ala Ser Val Trp Ser Lys Asp He Asp Lys Ala Leu Ala
425 430 435
Val Thr Arg Arg Val Arg Ala Gly Arg Phe Trp Val Asn Thr l ie
440 445 450
Met Ser Gly Gly Pro Glu Thr Pro Leu Gly Gly Phe Lys Gin Ser
455 460 465
Gly Trp Gly Arg Glu Ala Gly Leu Tyr Gly Val Glu Glu Tyr Thr
470 475 480
Gin He Lys Ser Val Hi s l ie Glu Thr Gly Lys Arg Ser Hi s Trp
485 490 495 l ie Ser 配列番号： 3
配列の長さ ： 1596
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名 ： グルコノバクタ一 ·ォキシダンス
株名： T-100
配列の特徵
特徵を表す記号： CDS
存在位置： 4. . 1593
特徵を決定した方法： E
配列
ATGACGAGCG GTTTTGATTA CATCGTTGTC GGTGGCGGTT CGGCTGGCTG TGTTCTCGCA 60
GCCCGCCTTT CCGAAAATCC TTCCGTCCGT GTCTGTCTCA TCGAGGCGGG CCGGCGGGAC 120
ACGCATCCCC TGATCCACAT GCCGGTCGGT TTCGCGAAGA TGACCACGGG GCCGCATACC 180
TGGGATCTTC TGACGGAGCC GCAGAAACAT GCGAACAACC GCCAGATCCC CTATGTGCAG 240
GGCCGGATTC TGGGCGGCGG ATCGTCCATC AACGCGGAAG TCTTCACGCG GGGACACCCT 300
TCCGACTTCG ACCGCTGGGC GGCGGAAGGT GCGGATGGCT GGAGCTTCCG GGATGTCCAG 360
AAGTACTTCA TCCGTTCCGA AGGCAATGCC GTGTTTTCGG GCACCTGGCA TGGCACGAAC 420
GGGCCGCTCG GGGTGTCCAA CCTCGCGGAG CCGAACCCGA CCAGCCGTGC CTTCGTGCAG 480
AGCTGTCAGG AAATGGGGCT GCCCTACAAC CCTGACTTCA ACGGCGCATC GCAGGAAGGC 540
GCAGGCATCT ATCAGATGAC GATCCGCAAC AACCGGCGCT GCTCGACGGC TGTGGGGTAT 600
CTGCGTCCGG CTCTGGGGCG GAAGAACCTG ACGGTTGTGA CGCGGGCGCT GGTCCTGAAG 660
ATCGTCTTCA ACGGAACGCG GGCGACGGGC GTGCAGTATA TCGCCAACGG CACCCTGAAT 720
ACCGCCGAAG CGAGCCAGGA AATCGTTGTG ACGGCCGGAG CGATCGGAAC GCCGAAGCTG 780
ATGATGCTGT CGGGCGTCGG GCCTGCCGCG CATCTTCGCG AAAATGGTAT CCCGGTCGTG 840
CAGGATCTGC CGGGCGTGGG CGAGAACCTT CAGGATCATT TCGGTGTGGA TATCGTAGCC 900
GAGCTCAAGA CGGATGAGAG CTTCGACAAG TACCGGAAAC TGCACTGGAT GCTGTGGGCA 960
GGTCTTGAAT ATACCATGTT CAGATCCGGT CCCGTTGCAT CCAACGTGGT TGAGGGCGGC 1020
GCGTTCTGGT ACTCGGACCC GTCATCGGGT GTTCCTGATC TCCAGTTCCA TTTTCTTGCG 1080
GAGGCTGGGG CTGAGGCTGG AGTGACGTCC GTTCCCAAGG GAGCGTCCGG GATTACGCTG 1140 AACAGCTATG TGCTGCGTCC GAAGTCTCGT GGAACTGTCC GGCTCCGTTC GGCAGATCCA 1200
AGGGTCAATC CGATGGTCGA TCCCAATTTC CTTGGAGACC CGGCCGACCT TGAGACGTCT 1260
GCGGAAGGTG TGCGCCTGAG CTACGAGATG TTCTCCCAGC CGTCTTTGCA GAAGCACATC 1320
CGGAAAACCT GTTTCTTTAG CGGTAAACAG CCGACGATGC AGATGTATCG GGACTATGCG 1380
CGGGAACATG GCCGGACGTC CTATCATCCG ACATGCACCT GCAAGATGGG TCGTGATGAC 1440
ATGTCCGTCG TCGATCCGCG TCTGAAGGTT CATGGCCTTG AGGGCATCAG GATCTGTGAC 1500
AGTTCGGTTA TGCCGTCGCT GCTCCGTTCC AACACCAATG CTGCGACGAT CATGATCAGT 1560
GAGCGGGCAG CGGATTTCAT TCAGGGGAAC GCCTGA 1596 配列番号： 4
配列の長さ ： 1497
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名： グルコノバクタ一 ·ォキシダンス
株名： T-100
配列の特徴
特徵を表す記号： CDS
存在位置： 4. . 94
特徵を決定した方法： E
配列
ATGAATGTTG TCTCAAAGAC TGTATCTTTA CCGTTAAAGC CGCGTGAGTT CGGATTCTTT 60 ATTGATGGAG AATGGCGCGC AGGTAAGGAT TTCTTCGATC GTTCCTCGCC GGCTCATCAT 120 GTTCCCGTCA CCCGTATTCC ACGCTGCACC CGTGAAGACC TTGATGAGGC AGTCGCTGCT 180 GCACGTCGTG CTTTCGAGAA CGGAAGCTGG GCGGGTCTGG CAGCCGCGGA TCGTGCGGCG 240 GTTCTTCTGA AACCCGCGGG CCTTCTGCGC GAGCGCCGTG ATGACATCGC TTACTGGGAA 300
5 o GTTCTCGAAA ACGGGAAGCC CATCAGCCAG GCGAAAGGTG AGATCGATCA CTGTATCGCC 360
TGTTTCGAGA TGGCGGCCGG CGCTGCGCGG ATGCTGCATG GTGATACGTT CAACAATCTG 420
GGCGAGGGGC TGTTTGGCAT GGTCCTGCGG GAGCCCATCG GTGTCGTCGG TCTGATTACG 480
CCGTGGAACT TCCCGTTCAT GATCCTGTGT GAGCGGGCGC CTTTCATTCT CGCATCCGGC 540
TGCACGCTGG TCGTCAAGCC TGCCGAAGTC ACGAGTGCCA CGACCCTTCT TCTGGCAGAA 600
ATCCTTGCCG ATGCCGGGCT GCCGAAGGGT GTCTTCAATG TCGTGACAGG CACGGGGCGC 660
ACGGTCGGTC AGGCCATGAC CGAGCATCAG GATATCGACA TGCTGTCCTT CACGGGCTCC 720
ACGGGCGTCG GCAAGTCCTG TATCCACGCG GCGGCTGACA GCAACCTGAA GAAACTTGGC 780
CTCGAACTGG GCGGCAAGAA CCCGATTGTC GTGTTCGCTG ACAGCAACCT TGAGGATGCG 840
GCCGACGCGG TAGCCTTCGG GATCAGCTTT AATACCGGGC AGTGCTGTGT GTCGTCGAGC 900
CGCCTGATCG TAGAGCGGTC CGTGGCGGAG AAGTTCGAGC GCCTCGTCGT GCCAAAAATG 960
GAGAAGATCC GCGTTGGTGA TCCGTTTGAT CCCGAAACGC AGATTGGCGC CATCACGACG 1020
GAAGCGCAGA ACAAGACCAT TCTGGACTAT ATCGCGAAAG GCAAGGCCGA GGGCGCCAAG 1080
CTGCTCTGTG GTGGCGGGAT CGTCGATTTC GGCAAGGGAC AGTATATCCA GCCCACGCTT 1140
TTCACGGATG TGAAGCCCTC GATGGGCATC GCGCGTGACG AGATTTTTGG GCCGCTTCTG 1200
GCGTCCTTCC ACTTCGATAC CGTCGATGAG GCGATCGCGA TTGCCAATGA CACGGTTTAC 1260
GGCTTGGCCG CATCGGTCTG GAGCAAGGAT ATCGACAAGG CGCTTGCCGT GACCCGTCGT 1320
GTTCGTGCCG GCCGCTTCTG GGTGAACACC ATCATGAGCG GTGGTCCCGA GACGCCGCTG 1380
GGTGGTTTCA AGCAGTCGGG CTGGGGCCGT GAGGCCGGTC TGTACGGCGT TGAGGAATAT 1440
ACGCAGATCA AATCTGTCCA TATCGAAACT GGCAAACGTT CGCACTGGAT TTCGTAA 1497 配列番号： 5
配列の長さ ： 4 6 2 4
配列の型：核酸
鎖の数： 2本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源 生物名 ： グルコノバクタ一■ォキシダンス
株名 ： T-100
配列
GAATTCAGGG GGGTGAGATG TATGTTTGTA AGAAAAACTG CGCCTTAATT CTTGCAGACC 60 AGGCGGCATA TCGTTTCGAT ATTAAAGGAA ATTCTTTCTT CAAGCGCTTC GGGGGCTGTA 120 AAATCCCGCT CGAAGATTAC CGATCCCGTG AAGCGGTTTG TGAAATAATA ATAATTGATC 180
GAGGCGATCG TGATGTTCAG CTGGGCTGCG TCAATGCCAT CGCGGAAGAC GTTTTCCCGA 240
ACCCCCCGAT CCAGAAGAGA CTGGATGCGG CGGACGAATT TCTGACTGAT CGTCTTCAGT 300
GTGGGCGAGT TCCGGATATG GGCGGCCTGA CAGAGGTTCT CGCTGTTCAC AAGGGTGATG 360
AACTCCGGAT TGGCGATATA GTATTCCCAT GTGAAACGGA CGAGCGTTTC GGAGTGCTGT 420
CCTGGGGGGC AGGTTCTCCA GATCCAGTCT GGTCTCTTCC TCCCGAATGT TGAGGTATTT 480
CCGCTCCAGG ACGGTGCGGA AGAGCCCGTC CTTACTTTTG AAGTAGTGGT AGAGCATCCT 540
CTTGTTGGCC TTGGCATCGA GGGCGATCGT ATCGACCCGC GCGCCTTCAA GCCCGTTTCG 600
GGCAAACTCC TTCTTCGCCG CTTCGAGAAT GCGTAATTTC GTGGCCTCAG CGTCCCTGAC 660
ACGCTTTTTC GTAGAGGAGG ACGCTCTGCT TTTCTCAAGG GGCATCAGGG GTTTGTTCCG 720
CTCTCAGTAG GGGCGCTCTT TCTGGGGGAA ACCGCCCCAA AAGAAAAGCG GATCATAAAA 780
TCACACTTAA AGTACGAAAA AATATCAACG TAACGTGATT TCATGCTGGC GTACCCCTGC 840
GATATGTGTA AGTAACTACA CGGTGCGTTA CGCGTCAGGA AGTTGGAACC CGAGCGTCTG 900
TGGTCAAATG CAGGTGAGGG TCGTCCGTGA TTAAGAATTG CATGTTGTAA TATCTCTCGG 960
GGTTTCCAGT TCATAAGAGT AAAACCGGGC TGTTCATCGG AAAAGGGATG GCAGCACCAT 1020
AGTCAGTAGG AATATTTCTC ATGAATGTTG TCTCAAAGAC TGTATCTTTA CCGTTAAAGC 1080
CGCGTGAGTT CGGATTCTTT ATTGATGGAG AATGGCGCGC AGGTAAGGAT TTCTTCGATC 1140
GTTCCTCGCC GGCTCATGAT GTTCCCGTCA CCCGTATTCC ACGCTGCACC CGTGAAGACC 1200
TTGATGAGGC AGTCGCTGCT GCACGTCGTG CTTTCGAGAA CGGAAGCTGG GCGGGTCTGG 1260
CAGCCGCGGA TCGTGCGGCG GTTCTTCTGA AAGCCGCGGG CCTTCTGCGC GAGCGCCGTG 1320
ATGACATCGC TTACTGGGAA GTTCTCGAAA ACGGGAAGCC CATCAGCCAG GCGAAAGGTG 1380
AGATCGATCA CTGTATCGCC TGTTTCGAGA TGGCGGCCGG CGCTGCGCGG ATGCTGCATG 1440
GTGATACGTT CAACAATCTG GGCGAGGGGC TGTTTGGCAT GGTCCTGCGG GAGCCCATCG 1500 liii lVV33o誠 m o
3S331S3V 1313;1V3E s 39f0v33U3v5JJ3v S113VVV
3301U010V J.33V3VV0V3V 3 αί3¾3-0V9Vν 19353JVVνννν3331
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GTGC C TGCAG CA AGC TCTGGCAGGCC CT GAAAAT0CG 456CGCCCG GA TCAGCCG AGAAT GTGC ATGATTG GCCTACCTCCGGGTAG ATCAGGCCTT T- 4CCCATCC GA TCGCGC500 CATTGCCAGACAGC¾GGA CATCTT GGCTGT GG- CG2TAGA 4440 CCTTGACTACTG AGACTGG CATTGCTAA ATCTCCACT AAGAGCGTCG AGCAA
40CCGACG38CG CGCGTGGTCC TCATAGGAGACG ¾CGCGTCT GGTCT TGCATGCTCA ATTCGT
4TACAGAGCC320 GGATA AGT AGTTAGCATGG AAGATGAACGACGACCGA GCTGCGA¾AGC AG 4CGCACC20GGAAAA GTTTGC CACCCAAAAGACAA6 TATGCTGCGGGC TTTAT GTTAT TATTTT
4 CACAACGCAA20TCCCCATACCTAAG CGC GCAACTGACG0 TGATGATCGGATTTCC TCCAC AC
GATGGAT 4140AGATG AGCGCCCG GCATCTCAGTGAGCGCAGCA TCATTA GGGAACT GGGGTTC 4GCT080CATTGC CTAGGC TGTGCAG CG¾TCC GCCTTTCCACA CCAAAATTATGTCGTGC GGA C¾TCGGG 420 GATGGGT GACAG CSCTGTCAT GCTTGA0TGATTG TCCCGCT AAGGTGCGAGT C CTGC 3960ATCGCA GACAA ¾GGAC TATGCGGAGCCG GACCCTCCGG ACATGAC2CTT CATGA-
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GACTCAGAACCAAGTACC G TGTGGTC GTACAC TC TGGAGTT GAATAGCGGCAGAGGAACA CTCTTGGCTCAGG AATCCACC CG AACT TGGTACCG GTCGGG ATCTGGGGTGGGCGATGTG CAAA TTGCGACATAAC AAGTA TG2C CCGCCT GCC CGGCGCGCTGAGCGGGGTGG iT- G 30GAGCT30CGG CCGA CACG CCCTCJGAAGCACC CTGAATACCGAGCGAG CCGAAAT GTTGAAG

Claims

請求の範囲
1 . L—ソルボースデヒドロゲナ一ゼをコードする DNAおよび L一ソルボソン デヒドロゲナーゼをコ一ドする DNAを含む発現ベクター。
2 . L—ソルボースデヒドロゲナ一ゼをコ一ドする DNAおよび L一ソルボソン デヒドロゲナーゼをコ一ドする D NAが、 1つのプロモー夕一から連続して転写 が起こるように構築されているか、 またはそれぞれ別個のプロモ一夕一の支配に より転写が起こるように構築されている請求の範囲第 1項記載の発現べクタ一。
3 . プ α乇一夕一として、 L一ソルボソンデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモー夕 一領域またはプロモータ一活性を有するその一部を有する請求の範囲第 1項また は第 2項記載の発現ベクター。
4 . プロ乇一夕一として、 大腸菌由来のプロモーターを有する請求の範囲第 1項 または第 2項記載の発現べクタ一。
5 . プロモータ一として、 大腸菌プロモーター t u ί B、 A P L, t r pまたは t a cを有する請求の範囲第 1項または第 2項記載の発現べクタ一。
6 . D—ソルビトールから L—ソルボースを高生産し、 かつ 2—ケト一 L一グロ ン酸を分解する活性がないかもしくは低い微生物宿主を形質転換するのに適する 請求の範囲第 1項〜第 5項のいずれかに記載の発現べクタ一。
7 . D—ソルビトールから L -ソルボースを高生産し、 2—ケト— Lーグロン酸 を分解する活性がないかもしくは低く、 かつ Lーィドン酸を生産する活性がない かもしくは低い微生物宿主を形質転換するのに適する請求の範囲第 1項〜第 5項 のいずれかに記載の発現ベクター。
8 . L—ソルボ一スデヒドロゲナ一ゼをコ一ドする DNAおよび L一ソルボソン デヒドロゲナーゼをコ一ドする D NAがグルコノバクタ一 ·ォキシダンス T 1 0 0由来の該酵素をコードする D NAであることを特徴とする請求の範囲第 1項〜 第 7項のいずれかに記載の発現べク夕一。
9 . L一ソルボースデヒドロゲナーゼをコ一ドする DN Aおよび L—ソルボソン デヒドロゲナーゼをコードする D N Aがそれぞれ配列表の配列番号 1および 2に 記載のァミノ酸配列を有する該酵素をコードする D NAであることを特徴とする 請求の範囲第 1項〜第 8項のいずれかに記載の発現ベクター。
1 0 . L一ソルボースデヒドロゲナーゼをコードする D NAおよび L一ソルポソ ンデヒドロゲナ一ゼをコ一ドする D N Aがそれぞれ配列表の配列番号 3および 4 に記載の塩基配列を有する D NAであることを特徵とする請求の範囲第 1項〜第 8項のいずれかに記載の発現べクタ一。
1 1 . D—ソルビトールから L一ソルボースを高生産し、 かつ 2—ケトー Lーグ 口ン酸を分解する活性がないかもしくは低い微生物宿主を、 請求の範囲第 1項〜 第 1 0項のいずれかに記載の発現べク夕一で形質転換した D—ソルビトールから
2—ケト— L一グロン酸を生産する能力を有する形質転換体。
1 2 . D—ソルビトールから L一ソルボースを高生産し、 かつ 2—ケトー Lーグ ロン酸を分解する活性がないかもしくは低い微生物宿主を、 L一ソルボースデヒ ドロゲナーゼをコ一ドする D N Aを含む発現べクタ一および L一ソルポソンデヒ ドロゲナーゼをコードする D N Aを含む発現べクタ一で形質転換した D—ソルビ トールから 2—ケトー L一グロン酸を生産する能力を有する形質転換体。
1 3 . D—ソルビトールから L一ソルボースを高生産し、 2—ケトー L一ダロン 酸を分解する活性がないかもしくは低く、 かつ Lーィ ドン酸を生産する活性がな いかもしくは低い微生物宿主を、 請求の範囲第 1項〜第 1 0項のいずれかに記載 の発現べクタ一によって形質転換した D—ソルビトールから 2—ケトー L—グロ ン酸を生産する能力を有する形質転換体。
1 4 . D—ソルビトールから L一ソルボースを高生産し、 2—ケトー L—グロン 酸を分解する活性がないかもしくは低く、 かつ Lーィドン酸を生産する活性がな いかもしくは低い微生物宿主を、 L一ソルボースデヒドロゲナーゼをコードする D N Aを含む発現ベクターおよび L一ソルポソンデヒドロゲナ一ゼをコ一ドする D NAを含む発現べクタ一で形質転換した D—ソルビトールから 2—ケトー L— グロン酸を生産する能力を有する形質転換体。
1 5 . D—ソルビトールから L—ソルボースを高生産し、 かつ 2—ケトー Lーグ 口ン酸を分解する活性がないかもしくは低い微生物宿主。
1 6 . D—ソルビトールから L一ソルボースを高生産し、 2—ケトー； L一ダロン 酸を分解する活性がないかもしくは低く、 かつ Lーィドン酸を生産する活性がな いかもしくは低い微生物宿主。
1 7. グルコノバクタ一属またはァセトバクタ一属に属する請求の範囲第 1 5項 または第 1 6項に記載の微生物宿主。
1 8. グルコノバクタ一 ·ォキシダンス G 6 24。
1 9. グルコノバクタ一 'ォキシダンス NB 6 9 3 9。
2 0. 請求の範囲第 1 1項〜第 1 4項のいずれかに記載の形質転換体を D—ソル ビトールを含む培地で培養し、 得られる培養物より 2—ケトー L一グロン酸を採 取することを特徵とする 2—ケトー L—グロン酸の製造方法。
2 1. 請求の範囲第 1 7項に記載する微生物宿主をエレクトロボレーシヨン法を 用いて形質転換する方法。
22. 請求の範囲第 1 7項に記載する微生物宿主を D—マンニトールを含む培地 で培養することを特徵とする、 エレクトロポレーシヨン法に適したコンビテント 細胞の製造法。
23. グルコノバクター属由来のプラスミ ド pF 2、 p F 3、 pF 4。
24. シャトルベクター pFG 5 B、 pFG 1 4A、 pFG 1 5A。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998033885A1 (en) * 1997-01-31 1998-08-06 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Method for producing an oxide with a fermentation process
WO1999020772A1 (fr) * 1997-10-16 1999-04-29 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Vecteurs plasmidiques
US8945864B2 (en) 2006-06-22 2015-02-03 Ikeda Food Research Co., Ltd. Method of determining 1,5-anhydroglucitol, and reagent composition for determining 1,5-anhydroglucitol

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2215263T3 (es) 1997-12-01 2004-10-01 Dsm Ip Assets B.V. Aldehido deshidrogenasa.
JP2000050869A (ja) * 1998-08-11 2000-02-22 Ajinomoto Co Inc グルコノバクター属細菌由来プラスミド及びベクター
DE19907115A1 (de) * 1999-02-19 2000-08-24 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von L-Sorbose
US6825018B1 (en) 1999-03-17 2004-11-30 Fujisawa Pharmaceutical Co. Ltd. Sorbitol dehydrogenase, gene encoding the same and use thereof
US6204040B1 (en) 1999-04-22 2001-03-20 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Gluconobacter suboxydans sorbitol dehydrogenase, genes and methods of use thereof
DE19963126A1 (de) * 1999-12-24 2001-07-12 Suedzucker Ag Verfahren zur Herstellung von 6-O-alpha-D-Glucopyranosyl-D-sorbit
AU2002328843A1 (en) * 2001-07-13 2003-03-03 Basf Aktiengesellschaft Method for producing 2-keto-l-gulonic acid and vitamin c while using l-sorbose dehydrogenase and l-sorbosone dehydrogenase
CN100395332C (zh) * 2003-11-28 2008-06-18 华北制药集团有限责任公司 一种l-山梨酮脱氢酶及其编码基因与应用
BRPI0607604A2 (pt) * 2005-02-11 2009-09-15 Dsm Ip Assets Bv gene sms 13
BRPI0608321A2 (pt) * 2005-02-11 2009-12-29 Dsm Ip Assets Bv gene sms 12
US9090920B2 (en) * 2005-09-08 2015-07-28 Dsm Ip Assets B.V. Gene SMS 27
CN102108343B (zh) * 2009-12-29 2013-03-13 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 一种l-艾杜糖脱氢酶及其编码基因与应用
CN102851252B (zh) * 2012-08-03 2014-11-26 江南大学 一种高产山梨酮的氧化葡萄糖酸杆菌工程菌及其构建方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6248389A (ja) * 1985-08-28 1987-03-03 エフ．ホフマン　―　ラ　ロシュ　アーゲー 発酵方法
JPS63202389A (ja) * 1987-01-30 1988-08-22 エフ．ホフマン　―　ラ　ロシュ　アーゲー ２−ケト−ｌ−グロン酸の微生物学的製造方法
WO1994020609A1 (en) * 1993-03-08 1994-09-15 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Novel l-sorbose dehydrogenase and novel l-sorbosone dehydrogenase obtained from gluconobacter oxydans t-100

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3684533D1 (de) * 1985-08-28 1992-04-30 Hoffmann La Roche Verfahren zur herstellung von ketogulonsaeure.
DK269987A (da) * 1986-06-03 1987-12-04 Hoffmann La Roche Enzym og fremgangsmaade til fremstilling deraf
DK270087A (da) * 1986-06-03 1987-12-04 Hoffmann La Roche Enzym og fremgangsmaade til fremstilling deraf
WO1989006688A2 (en) * 1988-01-14 1989-07-27 F. Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft Novel enzyme
US5399496A (en) * 1989-02-02 1995-03-21 Hoffman-Laroche Inc. DNA shuttle vectors for E. coli, Gluconobacter, and Acetobacter
RU2102481C1 (ru) * 1991-06-13 1998-01-20 Ф.Хоффманн-Ля Рош, Аг Способ получения 2-кето-l-гулоновой кислоты или ее соли

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6248389A (ja) * 1985-08-28 1987-03-03 エフ．ホフマン　―　ラ　ロシュ　アーゲー 発酵方法
JPS63202389A (ja) * 1987-01-30 1988-08-22 エフ．ホフマン　―　ラ　ロシュ　アーゲー ２−ケト−ｌ−グロン酸の微生物学的製造方法
WO1994020609A1 (en) * 1993-03-08 1994-09-15 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Novel l-sorbose dehydrogenase and novel l-sorbosone dehydrogenase obtained from gluconobacter oxydans t-100

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AGRIC. BIOL. CHEM., Vol. 54, No. 5, 1990, HOSHINO T. et al., "Metabolic Pathway for 2 Keto-L-Gluconic Acid Formation in Gluconobacter-Melanogenus IFO 3293", p. 1211-1218. *
AGRIC. BIOL. CHEM., vol. 55, No. 2, 1991, SUGISAWA T. et al., "Isolation and Characterization of Membrane-Bound L-Sorbose Dehydrogenase from Gluconobacter Melanogenus UV 10", p. 363-370. *
See also references of EP0758679A4 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998033885A1 (en) * 1997-01-31 1998-08-06 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Method for producing an oxide with a fermentation process
WO1999020772A1 (fr) * 1997-10-16 1999-04-29 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Vecteurs plasmidiques
EP1024194A1 (en) * 1997-10-16 2000-08-02 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Plasmid vectors
US6399340B1 (en) * 1997-10-16 2002-06-04 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Vector derivatives of gluconobacter plasmid pF4
EP1024194A4 (en) * 1997-10-16 2002-10-16 Fujisawa Pharmaceutical Co Plasmid vectors.
US8945864B2 (en) 2006-06-22 2015-02-03 Ikeda Food Research Co., Ltd. Method of determining 1,5-anhydroglucitol, and reagent composition for determining 1,5-anhydroglucitol

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CN1332249A (zh) 2002-01-23
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