WO1995022968A1 - δ-(S-METHYLSOTHIOUREIDO)-L-NORVALINE ET REMEDE DES TROUBLES CEREBRO-VASCULAIRES PRESENTANT UNE ACTIVITE INHIBITRICE DE LA SYNTHASE DU MONOXYDE D'AZOTE - Google Patents

δ-(S-METHYLSOTHIOUREIDO)-L-NORVALINE ET REMEDE DES TROUBLES CEREBRO-VASCULAIRES PRESENTANT UNE ACTIVITE INHIBITRICE DE LA SYNTHASE DU MONOXYDE D'AZOTE Download PDF

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norvaline
cnos
cerebrovascular disorder
cerebrovascular
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Toshihiko Makino
Toshiaki Nagafuji
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C07C335/00—Thioureas, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C335/30—Isothioureas
    • C07C335/32—Isothioureas having sulfur atoms of isothiourea groups bound to acyclic carbon atoms

Definitions

  • Therapeutic agent for cerebrovascular disorders having nitric oxide metabolic enzyme inhibitory activity
  • the present invention provides an amino acid derivative, more specifically a nitric oxide synthase (NOS) inhibitory action, and suppresses the production of excess NO or N 0
  • NOS nitric oxide synthase
  • the present invention relates to a prophylactic and therapeutic agent characterized by using these as an active ingredient.
  • NO force is one of the vascular endothelium-derived relaxing factors (Nature, 3 27, 5 24-5 26, 1987; Nature, 33 33, 66 4-66, 1 988 8)
  • platelet aggregation and adhesion inhibitory effect it has been clarified that it is involved in maintaining the function of living organisms as an intercellular messenger (Trends Pharmacol. 1 0, 4 2 8—4 3 1, 1 9 8 9; Trends N eurosci. 1, 4, 2 9— 39, 1 987; Trends Bioche m. 1 6, 8 1— 8 3, 1 13 1, 1-6, 1992; Trends Pharmacol. 1 2, 13 0—13 1, 1991; Trends Pharmacol. 12, 8 7— 8 8, 1 9 9 1; Trends Pharmacol. 1 2, 1 2 5— 1 2 8, 1 9 9 1).
  • N_ ⁇ S inhibitor N G - n L tro- L- arginine (L-NNA) was found to show an improvement effect on ischemic cerebral infarction and ischemic cerebral edema (Eur. J. Pharma col. 204, 339—340, 1991; Neurosci. Lett., 147, 159—162. 1992). The path of application to the drug was opened.
  • vascular cerebral edema occurs first, followed by vascular cerebral edema.
  • Vascular cerebral edema appears several hours after cerebral ischemia and continues until one week after onset. After that, cerebral edema gradually decreases and, depending on the extent of the infarction, is fixed as an infarct lesion within one to three months.
  • cerebral edema causes an increase in brain volume. Excessive cerebral edema causes a rapid rise in tissue and intracranial pressure, often resulting in fatal hernia. Cause exacerbation of brain damage and the extent of subsequent infarct lesions
  • L-NNA is associated with cerebral edema that develops after cerebral ischemia, cerebral infarction (Neurosci. Lett., 147, 159-162, 1992), neuronal necrosis ( ⁇ ur. Pharma col. Env. Tox., 248, 325-328, 1993).
  • comparative studies have shown that high doses of NOS inhibitors are not only ineffective against ischemic brain injury, but may even worsen it (J. Cereb. Blood Flow). Me ta b., 14, 175-192, 1994).
  • N-cNOS Neuron 1 constitutive NOS
  • E-cNOS endothelial constitutive ve NOS
  • iNOS Is inducible NOS
  • N0 is one of the main bodies of endothelial um-derivedrelainfactor (EDRF), so that E-cNOS is inhibited to a certain extent or more, decrease in cerebral blood flow and body blood pressure This may cause microcirculatory dynamics to deteriorate and eventually lead to ischemic lesions expanding. Therefore, in the case of a therapeutic agent for ischemic brain disease, it is considered that a NOS inhibitor which has a weak inhibitory effect on E-cNOS and strongly inhibits N-cNOS is desirable (Eur. J. P. harmacol., 20 04, 3 3 9—3 40, 1 9 9 1; ⁇ r ⁇ c Natl. Acad. S ci. U SA, 8 8, 6 3 6 8— 6 3 7 1, 1 9 9
  • 5- (S-methylisothioperido) -L-norvaline or its salt represented by (I) is superior to the above-mentioned L-NNA and other existing NOS inhibitors in N-cNOS.
  • the present inventors have found that the compound has an inhibitory effect on the cerebrovascular disorder and is useful as a therapeutic agent for cerebrovascular disorders, thereby completing the present invention. That is, the present invention provides a novel therapeutic agent for cerebrovascular disease having a completely different mechanism of action (selective / inhibitory effect on N-cNOS present in nerve cells in the brain) from existing therapeutic agents for cerebrovascular disease. Is provided.
  • FIG. 1 is a graph showing the effect of a single intraperitoneal administration of 6- (S-methylisothiolaido) -l-norvaline on cerebral edema after permanent occlusion of rat MCA.
  • FIG. 2 is a graph showing the ameliorating effect of cerebral edema after permanent occlusion of rat MC due to continuous intravenous administration of ⁇ - (S-methylisothiolaido) -l-norvaline.
  • FIG. 3 is a graph showing the cerebral infarction reducing effect after rat MC-temporal occlusion by twice intraperitoneal administration of ⁇ - (S-methylisothiolaido) -l-norvaline.
  • the compound of the present invention can be produced by the method described in the above-mentioned literature (J. Med. Chem. 37, 885-887, 1994). Can also be manufactured. ,
  • R 1 represents a lower alkoxycarbonyl group in which the alkyl moiety may have a substituent, or a lower acyl group optionally having a substituent.
  • R 2 represents a direct-selling or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent.
  • the lower alkoxycarbonyl group in which the alkyl moiety may have a substituent includes, for example, a benzyloxycarbonyl group, a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, a t-butoxycarbonyl group, and the like.
  • the lower acyl group which may have a substituent includes, for example, an acetyl group. 1 ⁇ is particularly preferably a t-butoxycarbonyl group.
  • the deprotection reaction is carried out under conditions generally used depending on the type of the protecting group. For example, when a benzyloxycarbonyl group and R 2 are a benzyl group, at room temperature, ethyl acetate, methanol And a catalytic reduction reaction in the presence of palladium-carbon in a solvent such as ethanol.
  • R t is t-butoxycarbonyl group and R 2 is t-butyl group
  • a solvent which does not adversely affect the reaction for example, methylene chloride, ethyl acetate, methanol, ethanol, dioxane, water or no solvent
  • a deprotecting agent such as trifluoroacetic acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, or methanesulfonic acid under the conditions of 0 ° C to room temperature, and it is particularly preferable to use trifluoroacid under anhydrous conditions at room temperature.
  • Pharmaceutically acceptable salts of the present invention (I) include, for example, ⁇ acid salt, maleic acid salt, tartrate, methanesulfonate, benzenesulfonate, formate, p-toluenesulfonate And organic acid salts such as trifluoroacetate, for example, inorganic salts such as hydrochloride, sulfate, hydrobromide and phosphate, and dihydrochloride is preferred.
  • the salt is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable salt.
  • the compound of the present invention or a salt thereof may be a suitable excipient, auxiliary agent, lubricant, preservative, disintegrant, buffer, binder, stabilizer, wetting agent, emulsifier, coloring agent, flavoring agent or flavoring agent.
  • auxiliary agent preferably in the form of tablets, granules, fine granules, powders, capsules, syrups, elixirs, suspensions, emulsions, injections, etc.
  • Intravenous injection can be administered by intravenous injection.
  • the dose of the compound of the present invention or a salt thereof can be appropriately selected depending on the patient's body type, age, physical condition, degree of disease, elapsed time after onset, and the like.Preferably, 0.6 to 60 O per day. mg Z b 0 dy.
  • a cellulose derivative or gelatin When formulated as an internal preparation, for example, as a carrier for the formulation, lactose, sucrose, sorbitol, mannitol, potato starch, corn starch, etc. starch or a starch derivative, a cellulose derivative or gelatin can be used normally. Auxiliaries are suitable and, at the same time, lubricating agents such as, for example, magnesium stearate, carbowax or polyethylene glycol can be added. can do.
  • aqueous preparations for example, an effective amount of the main component is dissolved in distilled water for injection, and antioxidants, stabilizers, solubilizers, buffers, preservatives, etc. are added as necessary After it is completely dissolved, it can be filtered, filled, sealed by a conventional method, and sterilized by a high-pressure steam sterilization method, a dry heat sterilization method or the like to prepare an injection.
  • an aqueous solution in which the main component is dissolved in distilled water for injection may be freeze-dried by a conventional method.
  • mannitol is used as an excipient that is easily freeze-dried.
  • Inositol, lactose, maltose, sucrose, etc. or sugar alcohols or glycine etc. and freeze-dried as usual And can be prepared.
  • 5- (S-methylisothioureido) -l-norparin has an excellent selective inhibitory effect on N-cNOS in the brain and a human ischemic brain.
  • the test results on the anti-obstructive cerebrovascular disorder effect using a disease model animal similar to edema and cerebral infarction are shown in Test Examples.
  • NcNOS is the rat cerebral cortex.
  • E-cNOS a homogenate of the pulmonary artery vascular endothelial cell line (CPAE) was used.
  • NOS inhibitors were used as control platforms.
  • N-cNOS A crude enzyme preparation of N-cNOS was prepared by the following procedure. Normally untreated male Sprague dawley (SD) rats (body weight 300-400 g) were decapitated, the whole brain was quickly removed, and the cerebral cortex was collected on ice. Next, a 5-fold volume of a 50 mM Tris-HC1, ImM DTT (pH 7.4) solution was added, homogenized for 3 minutes, and centrifuged at 1,000 X g for 10 minutes. The obtained supernatant was centrifuged at 100,000 ⁇ g for 60 minutes, and the soluble cytoplasmic fraction of the finally obtained supernatant was used as a crude enzyme preparation of N—cNOS.
  • E-cNOS A crude enzyme preparation of E-cNOS was prepared by the following procedure.
  • the pulmonary artery vascular endothelial cell line (CPAE) was cultured in MEM medium containing 20% FBS. A few days later, this was detached from the flask with a 0.25% tripsin, ImM EDTA solution, and diluted with saline to a 0.1 M phosphate buffer solution (pH 7.0 buffered saline, PBS) (pH 7. 4) was added and centrifuged at 1,000 rpm for 5 minutes. Next, the supernatant was discarded, an appropriate amount of PBS was added, and the cells were washed by centrifugation at 1, OO rpm for 5 minutes.
  • CPAE pulmonary artery vascular endothelial cell line
  • This eluate and an eluate obtained by further passing 3 ml of distilled water through a column were placed in a mini vial, and L— [3H] citru11ine was recovered. Thereafter, the scintillator Isseki one 5 m 1 was added, the radioactivity was measured by liquid scintillation one Deployment counter one to quantify L one [3 H] citru 1 1 ine .
  • the protein concentration in the crude enzyme preparation was determined using a Bioassay microassay kit.
  • Table 1 shows the IC 5 for both NO S isoforms for all test platforms. Value (concentration required for 50% activity inhibition) showed split stand IC 5 Q values for E- c NO S IC 50 values for the N-c NO S as an indicator of selectivity. All values in the table are average h- 1 IC50 value of each test compound for each NOS
  • the platform of the present invention has a stronger N-cNOS inhibitory effect than existing NOS inhibitors.
  • the platform of the present invention has an extremely high selectivity compared to existing NOS inhibitors (IC 50 value ratio (IC so [ E-NO S] NO IC 5. [N-c NO S]) 42.5).
  • a 10-week-old male SD rat was anesthetized by inhalation of 2% halothane (diluted with 70% N 2 O and 30% O 2 ) and maintained by inhalation of 1% halothane.
  • Fixed to A linear skin incision was made between the left external ear canal and the external canthus, and along the anterior edge of the temporal muscle, an incision was made down to the ⁇ arch.
  • the temporal muscle, the orbital adipose tissue, and the eyeballs were excised and immersed in physiological saline containing an antibiotic.
  • the back of the orbit was cauterized using a bipolar coagulator to prevent bleeding.
  • a small electric drill with a diameter of about 3 mrri was placed between the foramen ovale and the orbital fissure, where the third branch of the trigeminal nerve, which runs inside the temporal muscle and appears inside the temporal muscle, appears.
  • Drilled holes One thin bone was left and removed using a microhook and microneedle holder. Slightly cut the dura and arachnoid using a 27 G needle and micro hook, and close the MCA trunk for 48 hours using a miniclip at the bifurcation with the lens striatum artery (lenticulostriateartery y. LSA). Either occlusion or reperfusion by removing the clip for 2 hours after occlusion for 2 hours. During the operation, monitor the temperature of the right temporal muscle and the rectum and keep it constant around 37 ° C Was.
  • the control solvent saline, 2 mlZkg
  • the invented platform 0.1, 0.3, lmgZkg
  • 24.2; gZkg was administered immediately after MCA occlusion from a force catheter attached to the right femoral vein, followed by continuous administration at a flow rate of 84.2 ng kgKmin.
  • the measurement of the water content in the brain was performed by the dry weight method (Neur 0 sc and Lett. 147, 159-162, 1992).
  • the rat was decapitated 48 hours after MCA occlusion and the wet weight of the left cerebral hemisphere removed within 60 seconds was measured within 90 seconds on an analytical balance. Then, it was dried in an oven at 105 ° C for 3 days, and the dry weight was measured. The water content in the brain was calculated as “(wet weight / dry weight) / (wet weight) ⁇ 100%” and is shown in FIGS.
  • the control solvent physiological saline, 2 ml / kg
  • the compound of the present invention 0.1, 0.3, lmgZkg
  • Each was intraperitoneally administered immediately after reperfusion.
  • the brain was perfused transcardially with 10 I UZm1 of heparin-containing saline under ether anesthesia, followed by fixation with a 4% formalin solution.
  • Serial coronal sections at lmm intervals from frontal lobes prepared according to a conventional method were stained with hematoxylin and eosin (Neurosci.
  • FIG. 2 also shows that continuous administration of the compound of the present invention intravenously also The cerebral edema immediately after was significantly reduced.
  • the infarct lesion generated when MCA was occluded for 2 hours and reperfusion was performed for 2 hours was improved in a dose-dependent manner by intraperitoneal administration of the invented platform twice. This was significant in the lmgZkg administration group.
  • ⁇ - (S-Methylisothioperido) -L-norvaline has an existing inhibitory effect on (1) N-cNOS inhibitory action and (2) selectivity for N-cNOS and E-cNOS. It has significantly better effects than NOS inhibitors and is useful as a therapeutic agent for cerebrovascular disorders.

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Description

δ— (S—メチルイソチォゥレイ ド） 一 Lーノルバリ ンおよび
一酸化窒素台成酵素阻害作用を有する脳血管障害治療剤 技術分野
本発明は、 Ύミノ酸誘導体、 さらに詳しくは一酸化窒素台成酵素 （n i t r i c o x i d e s y n t h a s e, NO S) 阻害作用を有し、 一酸化窒素 （ n i t r i e o x i d e, NO) 生成を抑制することにより、 過剰な NO或いは N 0代謝産物の関与が考えられている脳血管障害に伴う病態に対して有用な 5— ( . S—メチルイソチォゥレイ ド） 一L—ノルバリン、 または、 医薬として許容され るそれらの塩とこれらを有効成分とすることを特徴とする予防及び治療剤に関す る。
背景技術
近年、 NO力 血管内皮由来弛緩因子の一つであり （N a t u r e, 3 2 7, 5 2 4— 5 2 6, 1 9 8 7 ； N a t u r e, 3 3 3, 6 6 4— 6 6 6， 1 9 8 8) 、 血管弛緩作用、 血小板凝集 ·粘着抑制作用の他、 細胞間の情報伝達物質として 生体の機能維持に関与していることが明らかになってきている （T r e n d s P h a r m a c o l . 1 0, 4 2 8— 4 3 1, 1 9 8 9 ； T r e n d s N e u r o s c i . 1 4, 2 9— 3 9, 1 9 8 7 ； T r e n d s B i o c h e m. 1 6, 8 1— 8 3, 1 9 9 1 ； T r e n d s N e u r o s c i . 1 3， 1— 6, 1 9 9 2 ; T r e n d s P h a r m a c o l . 1 2, 1 3 0— 1 3 1, 1 9 9 1 ； T r e n d s P h a r m a c o l . 1 2， 8 7— 8 8, 1 9 9 1 ; T r e n d s P h a r m a c o l . 1 2, 1 2 5— 1 2 8, 1 9 9 1) 。
また、 NOが、 血管内皮細胞のみならず、 神経細胞、 グリア細胞、 マクロファ —ジ等からも産生されることが明らかになり、 各々の NO Sをコ一ドする遺伝子 が単離されている （N a t u r e. 3 5 1, 7 1 4— 7 1 8， 1 9 9 1 ; P r o c N a t l . A c a d. S c i . U SA, 8 9, 1 1 1 4 1— 1 1 1 4 5, 1 9 9 2 ; P r o c. N a t l . A c a d. S c i . U S A, 8 9, 6 3 4 8— 6 3 5 2. 1 9 9 2 ; F E B S L e t t . , 3 0 7, 2 8 7— 2 9 3, 1 9 9 2 ； J. C l i n. I n v. , 90. 2092— 2096. 1992 ; S c i e n c e， 256, 225— 228. 1992 ; J. B i o l. C h e m. , 267, 6370— 6374. 1992 ;
P r o c. N a t l . A c a d. S c i . U SA, 90, 11419— 1142 3， 1993 ; B i o c h e m. . 32, 11600— 11605， 1993 ; P r o c. N t l . A c a d. S c i. USA, 90. 3491-3495, 1993 ； F E B S L e t t. , 316. 175— 180, 1993 ; B i o c h em. B i o p h y s. R e s. C ommu n. , 191. 89— 94， 1 993 ; P r o c . N a t l . A c a d. S c i. U SA, 89, 6711— 6 715, 1992 ; B i o c h em. B i o p h y s. Re s. C ommun. , 191, 767— 774, 1993 ; P r o c. N a t l. A c a d. S c i. USA, 90. 9730-9734. 1993) 。
さらに、 NOの病態生理学的役割が、 急速に解明されつつある （P h a r ma c o l . R e v. , 43, 109— 142, 1991 ; Ne u r o l . P r o g. . 32. 197— 311. 1992 ； FAS E B J. , 6, 3051-306 4， 1992) o
そして、 N〇 S阻害剤の一つである NG— n L t r o— L— a r g i n i n e (L-NNA) が、 虚血性脳梗塞及び虚血性脳浮腫に対して改善効果を示すこと が見いだされた （E u r. J. P h a rma c o l . 204, 339— 340, 1991 ; N e u r o s c i . L e t t. , 147, 159— 162. 1992) ことから、 N O S阻害活性を有する物質の脳血管障害治療剤への応用の道が開か れた。
脳血流の途絶した領域では、 まず、 細胞性の脳浮腫が起こり、 続いて血管性の 脳浮腫が起こってくる。 血管性の脳浮腫は脳虚血後数時間後に出現し、 発症 1週 間後までその進行が続く。 その後、 脳浮腫は次第に減少し、 梗塞巣の範囲にもよ るが、 1ヶ月から 3ヶ月の間に梗塞巣病変として固定する。 脳は固い頭蓋に被わ れているため、 脳浮腫は脳の容量増大を引き起こす。 脳浮腫がある程度を越える と急激な組織圧及び頭蓋内圧の上昇を引き起こし、 しばしば致命的なヘルニアを 招来し、 結果的に脳障害を増悪し、 その後の梗塞巣病変の範囲を決定してしまう
( J . N e u r o s u r g. 77, 169— 184， 1992) 。 この様に、 患 者の生命予後を左右する脳浮腫の治療は、 臨床上極めて重要な課題である。 現在 のところ、 脳浮腫に対する治療法は、 過呼吸や脳脊髄液ドレナ一ジと平行して高 張液ゃステロイ ド剤等の使用が主流であるが、 これらの効果はほとんどの場合一 過性であり、 最終的な治療効果にそれ程大きな期待は持てない （J. N e u r 0 s u r g. 77, 337 - 354, 1992 ) 。 従って、 虚血性脳血管障害に対 する'冶療法として従来とは異なる全く新しい作用機序の薬剤を開発することが望 まれる。
本発明者らは、 L一 NNAが、 脳虚血後に発症する脳浮腫、 脳梗塞 （Ne u r o s c i. L e t t. , 147, 159 - 162, 1992) 、 神経細胞壊死 （Ε u r . J. P h a rma c o l. E n v. T o x. ， 248， 325 - 328, 1993) を改善する作用を有することを見いだした。 しかしながら、 比較旳高 用量の NO S阻害剤は、 虚血性脳損傷に対して無効であるばかりか場合によって はかえつて増悪させることも報告されている （J. C e r e b. B l o o d F l ow Me t a b. , 14, 175 - 192, 1994) 。
N O Sのァイソフォームは少なくとも三種類存在するという説が、 D N A解析 から現在のところ有力である。 即ち、 神経細胞中に構成的に存在する n e u r o n a 1 c o n s t i t u t i v e NOS (N— cNOS) 、 血管内皮細胞中 に構成的に存在する e n d o t h e l i a l c o n s t i t u t i v e NO S (E - c NO S) 、 そしてマクロファージゃその他多くの細胞でサイ トカイン やリポポリサッカライ ドにより誘導合成される i n d u c i b l e NO S ( i NO S) である。 この中で、 N— c NO Sと E— c NO Sはカルシウム依存性で あり、 i NO Sはカルシウム非依存性である （FAS EB J . 16, 3051 一 3064, 1992) 。
脳虚血に伴う脳組織障害の有力な機序として、 細胞外グルタミン酸濃度の上昇、 シナプス後部に存在するグルタミン酸受容体の過剰な活性化、 細胞内カルシウム 濃度の上昇、 カルシゥム依存性酵素の異常な活性化と 、う一連の経路が提唱され ている （J . C e r e b. B l o o d F l ow M e t a b . 1, 1 5 5— 1 8 5, 1 9 8 1 ; J . N e u r o s u r g. 6 0, 8 8 3 - 9 0 8, 1 9 8 4 ； T r e n d s N e u r o s c i . 1 1, 4 6 5 - 4 6 9. 1. 9 8 8 ; J . C e r e b. B l o o d F l o w M e t a b. 9, 1 2 7 - 1 4 0, 1 9 8 9) 。 前述した様に、 N— c NO Sはカルシウム依存性であるので、 このタイプの NO Sァイソフォームの異常な活性化を阻害することが、 NO S阻害剤による神経細 胞の保護作用を発揮しているものと考えられている （An n a l s N e u r o 1. 3 2, 2 9 7 - 3 1 1, 1 9 9 2) 0
—方、 N 0は血管内皮由来弛緩因子 （e n d o t h e l i um - d e r i v e d r e l a i n f a c t o r , EDRF) の本体の一つであるため、 E - c NO Sをある程度以上に阻害した場台、 脳血流量の低下と体血圧の上昇が生 じ、 微小循環動態を悪化し、 最終的には虚血病変が拡大してしまうことが考えら れる。 従って、 虚血性脳疾患の治療剤の場合、 E— c NO Sに対する阻害作用が 弱く、 N— c NO Sを強く阻害する NO S阻害剤が望ましいと考えられている （E u r . J . P h a r m a c o l . , 2 0 4, 3 3 9— 3 40, 1 9 9 1 ; Ρ r ο c N a t l . A c a d. S c i . U SA, 8 8, 6 3 6 8— 6 3 7 1, 1 9 9
1) o
最近、 本発明らの物質特許出願 （出願日 ： 1 9 9 4年 2月 2 5日） 後に本発明 化合物である 5— （S—メチルイソチォウレイ ド） 一 Lーノルバリンが、 N— c NO Sと i NO Sの両者に対して濃度依存的阻害作用を有することが報告された ( J. M e d. C h e m. 3 7， 8 8 5 - 8 8 7, 1 9 9 4 [発行日： 1 9 9 4 年 4月 1日、 抄録 （A d V a n c e AC S A b s t r a c t s ) 発行日 ： 1 9 9 4年 3月 1日] ) 。 該論文には、 i NO Sおよび N— c NO Sに相当する b NO Sに対する阻害率が記述されているものの、 E— c NO Sに対する作用に関 しては何等記載がなく、 また、 脳血管障害治療剤としての可能性についても何等 言及されていない。
発明の開示
本発明者らは、 これらの課題に鑑み、 鋭意研究を重ねた結果、 下記式 （ I )
Figure imgf000007_0001
C〇〇H
(I) で示される 5— （S—メチルイソチォゥレイ ド） 一 L—ノルバリンまたはその塩 が、 前述の L— NNAをはじめとする既存の NO S阻害剤に優る N—c NO Sに 対する阻害作用を有し、 脳血管障害治療剤として有用であることを見いだし、 本 発明を完成させた。 すなわち、 本発明は、 既存の脳血管障害治療剤とは全く異な る作用機序 （脳内の神経細胞中に存在する N— c NO Sに対する選択旳阻害作用） を有する新規脳血管障害治療剤を提供するものである。
図面の簡単な説明
図 1は、 6— (S—メチルイソチォゥレイ ド） 一L—ノルバリンの単回腹腔内 投与によるラッ ト MC A永久閉塞後の脳浮腫改善作用を示した図である。
図 2は、 δ— (S—メチルイソチォゥレイ ド） 一 L一ノルバリンの持続旳静脈 内投与によるラッ ト MC Α永久閉塞後の脳浮腫改善作用を示した図である。
図 3は、 δ— (S—メチルイソチォゥレイ ド） 一L—ノルバリンの 2回腹腔内 投与によるラッ 卜 MC Α—時的閉塞後の脳梗塞縮小作用を示した図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明化合物は、 先の文献 （J. M e d. C h e m. 3 7, 8 8 5 - 8 8 7, 1 9 9 4) 記載の方法に従って製造することができる力 例えば以下のようにし ても製造することができる。 ，
すなわち、 一般式 （Π)
NH
H2): NHF^
H3CS人 (C
COOR;
(Π) (式中、
R ,は、 アルキル部分が置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル基、 置換基を有していてもよい低級ァシル基を示す。
R 2は、 置換基を有していてもよい直銷または分岐鎖状の炭素数 1〜6のアルキ ル基を示す。 ）
を加水分解または脱保護剤で直接処理して脱保護することにより、 式 （ I ) で表 される S— （S—メチルイソチォウレイ ド） 一Lーノルバリンまたはその塩が得 られる。
一般式 （Π ) の定義中、
アルキル部分が置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル基とは、 例 えばベンジルォキシカルボニル基、 9一フルォレニルメチルォキシカルボニル基、 tーブ卜キシカルボニル基等が挙げられ、 置換基を有していてもよい低級ァシル 基とは、 例えばァセチル基等が挙げられる。 1^としては、 特に t—ブトキシカ ルポニル基が好ましい。 置換基を有していてもよい直鎖または分岐鎖状の炭素数 1〜 6のアルキル基とは、 例えばメチル基、 ェチル基、 ベンジル基、 t—ブチル 基等が挙げられ、 特に t一ブチル基が好ましい。
脱保護反応は、 保護基の種類に応じて通常使用される条件で行なわれ、 例えば、 がべンジルォキシカルボニル基、 R 2がべンジル基の場台は、 室温下、 酢酸ェ チル、 メタノール、 エタノール等の溶媒中パラジウム一炭素の存在下の接触還元 反応が挙げられる。 特に R tが t一ブトキシカルボニル基、 R 2が t一ブチル基の 場合、 反応に悪影響を及ぼさない溶媒例えば、 塩化メチレン、 酢酸ェチル、 メタ ノ" "ル、 エタノール、 ジォキサン、 水中または無溶媒で 0 °Cから室温の条件下で トリフルォロ酢酸、 塩酸、 硫酸、 メタンスルホン酸等の脱保護剤を用いて行うの が好ましく、 特に室温下無水条件で卜リフルオロ^酸を用いるのが好ましい。 本発明化台物 （I ) の医薬として許容される塩は、 例えば、 ^酸塩、 マレイン酸 塩、 酒石酸塩、 メタンスルホン酸塩、 ベンゼンスルホン酸塩、 蟻酸塩、 p—トル エンスルホン酸塩、 卜リフルォロ酢酸塩等の有機酸塩、 例えば、 塩酸塩、 硫酸塩、 臭化水素酸塩、 燐酸塩等の無機酸塩が挙げられ、 二塩酸塩が好ましい。 また、 その塩としては、 医薬上許容し得る塩であれば特に制限は無いが、 例え ば、 塩酸、 硫酸、 硝酸、 臭化水素酸、 燐酸との無機酸塩、 酸、 シユウ酸、 酒石 酸、 マレイン酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 蟻酸、 ρ—トルエン スルホン酸、 トリフルォロ酢酸等との有機酸塩、 ナトリウム、 カリウム等とのァ ルカリ金属塩、 カルシウム、 マグネシウム等とのアルカリ土類金属塩等が挙げら れ、 二塩酸塩が好ましい。
本発明化合物またはその塩は、 適当な賦形剤、 補助剤、 滑沢剤、 防腐剤、 崩壊 剤、 緩衝剤、 結台剤、 安定剤、 湿潤剤、 乳化剤、 着色剤、 風味剤または芳香剤等 を加えて、 錠剤、 顆粒剤、 細粒剤、 散剤、 カプセル剤、 シロップ剤、 エリキシル 剤、 懸濁剤 ·乳剤、 注射剤等の形態にして、 経口または非経口的に、 好ましくは、 筋肉内注射ある ゝは静脈内注射で投与することができる。
本発明化合物またはその塩の投与量は、 患者の体型、 年齢、 体調、 疾患の度合 い、 発症後の経過時間等により、 適宜選択することができる力 好ましくは、 1 日当たり 0. 6〜6 O m g Z b 0 d yである。
内服剤として製剤化する場合は、 例えば製剤用担体としては、 乳糖、 ショ糖、 ソルビッ ト、 マンニッ 卜、 ジャガイモデンプンまたはトウモロコシデンプン等の デンプンまたはデンプン誘導体、 セルロース誘導体もしくはゼラチンの様な通常 使用し得る助剤が適当であり、 同時に例えばステアリン酸マグネシウム、 カルボ ワックスまたはポリエチレングリコールの様な滑沢剤を添加することができ、 こ れらの混合物を常法により、 顆粒剤、 錠剤、 カプセル剤等にすることができる。 水性製剤として製剤化する場台は、 例えば注射用蒸留水に有効量の主成分を溶 解し、 必要に応じて、 抗酸化剤、 安定剤、 溶解補助剤、 緩衝剤、 保存剤等を加え、 完全に溶解した後、 常法によりろ過、 充填、 密封し、 高圧蒸気滅菌法、 乾熱滅菌 法等により滅菌して注射剤を調製することができる。
凍結乾燥剤として製剤化する場台は、 注射用蒸留水に主成分を溶解した水溶液 を常法により凍結乾燥してもよく、 また必要に応じて、 凍結乾燥の行いやすい賦 形剤として、 マンニトール、 イノシトール、 ラク 卜一ス、 マルト一ス、 スクロ一 ス等の糖または糖アルコール類あるいはグリシン等を添加して常法通り凍結乾燥 を行い、 調製することができる。
以下に本発明の化台物の製造について、 実施例にさらに詳細に説明するが、 本 発明はこれらの例によつて何ら制限されるものではない。
また、 本発明の有用性を示すために、 5— （S—メチルイソチォウレイ ド） 一 L—ノルパリ ンの優れた脳内 N— c NO Sに対する選択的阻害作用と、 ヒトの虚 血性脳浮腫と脳梗塞に類似した病態モデル動物を用 、た抗閉塞性脳血管障害作用 に関する試験結果を試験例に示す。
実施例
【実施例 1】
δ— (S—メチルイソチォウレイ ド） 一L一ノルバリン ·二塩酸塩の台成
P a u l L. F e 1 d m a nの方法 （T e t r a h e d r o n L e t t. , 32, 7, 875— 878, 1991) に従って台成した a— N— t—ブトキシ カルボ二ルー 5— (S—メチルイソチォゥレイ ド） 一 Lーノルバリン一 t—ブチ ルエステル （1. 03 g) およびトリフルオロ^酸 （10m l ) の混合物を室温 下 2時間撹拌した後、 減圧下濃縮した。 残留物をエタノール （5m l ) に溶解し た後、 塩化水素のジォキサン溶液 （4規定、 2m l) を室温下加え、 反応液を減 圧下留去した。 残留物を水に溶解後、 凍結乾燥して (S—メチルイソチォゥ レイ ド） 一 L一ノルバリン ·二塩酸塩を 0. 60 g得た。
Ή-NMR (D20)
δ ： 1. 78— 2. 36 (4 H， m) , 2. 63 (3 H, s) , 3. 47
(2 H, t , J = 6. 60 H z) , 4. 17 (1H， t , J = 5. 9 7 H z )
FAB— MS (m/z ) 206 (M++ 1)
試験例
【試験例 1】
実施例 1の化合物の N _ c NOSと E— c NOSに対する阻害作用を、 既存の NO S阻害剤と比較検討した。
各 NO Sァイソフォームの粗酵素画分として、 N— c NO Sはラッ 卜大脳皮質 可溶性画分、 また、 E— c NO Sはゥシ肺動脈血管内皮細胞株 （CPAE) のホ モジネートを用いた。
対照化台物として、 以下の NO S阻害剤を使用した。
L-NNA.
Nc— n i t r o— L— a r g i n i n e me t hy 1 e s t e r ( L— N AME) ,
NG— ami no— L— a r g i n i n e ( L— A A) ,
NG— imi n o e t hy l— o r n i t h i n e (L -N I O) ,
Nc-m o n o m e t h 1 - L - a r g i n i n e (L -NMMA) ,
NG- a l l y l -L-a r g i n i n e (L-ALA) ,
7— n i t r o i nd a z o l e (7— N I)
ami no gu an i d i n e (AG) 。
N-cNOSの粗酵素標品は、 以下の手順で調製した。 正常無処置の雄性 S p r a gue Daw l e y (SD) 系ラッ ト （体重 300- 400 g) を断頭し、 素早く全脳を取り出し、 氷上で大脳皮質を分取した。 次いで、 5倍量の 50mM T r i s -HC 1 , ImM DTT (pH7. 4) 溶液を加え、 3分間ホモゲ ナイズし、 これを 1， 000 X gで 10分間遠心した。 得られた上清を、 100, 000 X gで 60分間遠心し、 最終的に得られた上清の可溶性細胞質画分を N— c NO Sの粗酵素標品とした。
E-cNOSの粗酵素標品は、 以下の手順で調製した。 ゥシ肺動脈血管内皮細 胞株 （CPAE) を 20%F B S含有の MEM倍地中で培養した。 数日後、 これ を 0. 25%t r i p s i n， ImM E D T A溶液でフラスコから剥離し、 生 理食塩水で希釈した 0. 1 Mリン酸緩衝溶液 （ph o s ph a t e— b u f f e r e d s a l i n e, PBS) (p H 7. 4) を加え、 1 , 000 r p mで 5 分間遠心した。 次に上清を捨て、 PBSを適当量加え、 1, O OO r pmで 5分 間遠心することによって細胞を洗淨した。 さらに、 50mM T r i s -HC 1 , ImM DTT (pH 7. 4) でもう一度同様な操作を行い細胞を洗净した。 沈 查の細胞に適当量の 5 OmM T r i s— HCし ImM DTT (pHT. 4) 溶液を加え、 3分間ホモゲナイズしたものを E— c N O Sの粗酵素標品とした。
NO S活性の測定は、 基本的に本発明者らが報告した方法に従い、 基質の一つ である L— [3H] a r g i n i n eから反応産物の一つである L— [3H] c i t r u 1 1 i n eへの変換量を定量することによって求めた （B r a i n E d e m a I X ( I t o e t a l. e d s. ) 6 0. p . 28 5 - 28 8, 19 94， A c t a N e u r o c h i r. , S p r i n g e r -V e r 1 a g) 反応液は、 Ι Ο Ο ηΜ L- [3H] a r g i n i n e, N_ c N〇Sまたは E— c NO Sの粗酵素標品 （6— 20 gZm 1蛋白） ， 1. 25mM C a C 12, ImM EDTA, 1 g/m 1 c a l mo d u l i n. ImM N AD PH, 100 M t e t r a h y d r o b i o p t e r i n e, 10
FAD, 10 FMN, 5 OmMT r i s -HC 1 (pH 7. 4) から構 成され、 これに、 本発明化台物、 あるいは対照化台物を加えた。
L一 [3H] a r g i n i n eを加えて反応を開始し、 37°Cで 10分間イン キュベ一ションした後、 50 mM T r i s— HC 1 (pH 5. 5) , ImM EDTAを 2m l加え、 氷中に置いて反応を停止させた。 反応溶液を陽イオン交 換樹脂カラム （D owe x AG 50WX— 8. N a+ f o rm, 3. 2m l ) に通して、 未反応で残存する基質 L— [3H] a r g i n i n eと反応産物であ る L— [3H] c i t r u 1 1 i n eを分離した。 この溶出液と、 さらに蒸留水 3 m 1をカラムに通して得た溶出液をミニバイアルに入れ、 L— [3H] c i t r u 1 1 i n eを回収した。 その後、 5 m 1のシンチレ一夕一を加え、 放射能を 液体シンチレ一ションカウンタ一で計測し、 L一 [3H] c i t r u 1 1 i n e を定量した。 粗酵素標品中の蛋白濃度は、 バイオラッ ド社のマイクロアツセィキッ 卜を用いて決定した。
表 1に、 全ての試験化台物の両 NO Sァイソフォームに対する I C5。値 （50 %活性阻害に必要な濃度） と、 選択性を示す指標として N— c NO Sに対する I C 50値の E— c NO Sに対する I C 5Q値の割台を示した。 表中の値は、 全て平均 h-1 試験化合物の各 NOSに対する IC50値
1し 5 O 値 〖nM) IC5 o 値の比
V-CVUo c-c/VU E-cNOS /
試験化合物
N-cNOS
実施例 1 5.6 ± 0.3 (5) 238.1 ±82.3 (3) 42.5
L-NNA 16.9 ±3.6 (4) 89.8士 28.7 (3) 5.3
L-NAME 79.4 ±11.6 (3) 985.4 ±389.8 (3) 12.4
L-AA 152.5 ±55.7 (3) 523.5 ±61.4 (3) 3.4
し NIO 277.0 ± 58.7 (3) 2,225.5 ± 112.6 (3) 8.0
L-NMMA 337.8 ± 24.7 (3) 950.7 ±232.1 (3) 2.8
L-ALA 992.0 ±162.4 (3) 15,053.4 ±8,529.6 (3) 15.2
7-NI 4,823.6 ± 985.2 (3) 2,132.7 ±793.8 (3) 0.4
AG 20,262.9 ±4,172.6 (3) > 100,000 (3) >4.9
; 表 1より、
1. 本発明化台物は、 既存の NO S阻害剤より強い N— c NO S阻害作用を有す る。
2. N - c NO Sと E— c NO Sに対する選択性において、 本発明化台物は既存 の NO S阻害剤に比較して極めて高い選択性を有する （I C50値の比 （I C so [E 一 NO S] ノ I C5。 [N— c NO S] ) で 42. 5) 。
ことが明らかである。
【試験例 2】
本発明化合物を用いてラッ 卜の局所脳虚血モデルに対する作用を検討した。 ラッ ト左中大脳動脈 （mi d d l e c e r e b r a l a r t e r y, MC A) 閉塞による局所脳虚血モデルは、 本発明者らが報告した方法に従って作製し た （Ne u r o s c i. L e t t. 147, 159 - 162, 1992 ； B r a i n Ed ema I ( I t o e t a l. e d s. ) 60, p p. 285 — 288, 1994， Ac t a Ne u r o c h i r. , S p r i ng e r— V e r 1 a g) 。
即ち、 10週齢の雄性 SD系ラッ トを 2%ハロセン （70%N2Oと 30%O2 で希釈） 吸入にて麻酔導入、 1%ハロセン吸入にて維持し、 手術台上に側臥位に 固定した。 左外耳孔と外眼角の中間に線上皮膚切開をおき、 側頭筋の前縁に沿つ て下方は娣骨弓まで切開した。 側頭筋、 眼窩内脂肪組織、 及び眼球は摘出し、 抗 生剤含有の生理食塩水に浸した。 眼窩の奧は、 出血を防ぐために双極性凝固器を 用いて焼灼した。 手術用顕微鏡下で、 側頭骨底部の奥に認められ側頭筋内側を走 行する三叉神経第 3枝が出る卵円孔と眼窩裂の中間に、 歯科用電気ドリルで径 3 mrri位の小孔を開けた。 薄い骨を一層残し、 マイクロフックとマイクロ持針器を 用いてこれを除去した。 27 G針とマイクロフックを用いて硬膜とクモ膜を僅か に切り、 レンズ核線条体動脈 （ l e n t i c u l o s t r i a t e a r t e r y. L S A) との分岐部の位置で MCA本幹をミニクリップを用いて 48時間閉 塞するか、 あるいは、 2時間閉塞後 2時間クリップを除去することにより再灌流 させた。 術中は、 右側頭筋と直腸内温度をモニターし、 37°C付近で一定に保つ た。
48時間 MCA閉塞モデルに於いて、 対照溶媒 （生理食塩水、 2m lZkg) あるいは本発明化台物 （0. 1, 0. 3， lmgZk g) は、 MC A閉塞直後に 単回腹腔内投与、 あるいは右大腿静脈に装着した力テ一テルから M C A閉塞直後 に 24. 2 ; gZk gを投与し、 続いて 84. 2 n gノ k gZm i nの流速で持 続投与した。 脳内水分含量の測定は、 乾燥重量法で行なった （Ne u r 0 s c し L e t t. 147, 159 - 162, 1992 ) 。 M C A閉塞 48時間後にラッ トを断頭し、 60秒以内に取り出した左大脳半球の湿重量を、 化学天秤で 90秒 以内に測定した。 その後、 105 °Cのオーブン中で 3日間乾燥し、 乾燥重量を測 定した。 脳内水分含量を、 「 （湿重量一乾燥重量） / (湿重量） X 100%」 で 求めて、 図 1、 2に表示した。
2時間 MC A閉塞後 2時間再灌流させるモデルに於いて、 対照溶媒 （生理食塩 水、 2m 1ノ k g) あるいは本発明化合物 （0. 1, 0. 3, lmgZkg) は、 MC A閉塞直後と再灌流直後に各々腹腔内投与した。 再灌流 2時間後、 エーテル 麻酔下で 10 I UZm 1のへパリン含有の生理食塩水で経心的に脳を灌流し、 続 いて 4%ホルマリン溶液で固定した。 常法に従って作製した前頭葉から lmm間 隔の冠状断連続切片をへマ卜キシリンとェォシンで染色した （Ne u r o s c i. L e t t. , 147, 159— 162, 1992 ; E u r . J. P h a r ma c o 1. E n v. T o x. ， 248, 325— 328， 1993) 。 梗塞巣の面積 は、 画像解析装置を用いて、 「患側の梗塞巣の面積」 = 「健常側の正常域の面積」 一 「患側の正常域の面積」 で求めて、 図 3に表示した。
図中の値は、 全て平均値土標準誤差で表示し、 動物の例数を括弧内に示した。 統計学的解析は、 Dunn e t tの多重比較検定を行い、 危険率 （P値） が 0. 05未満である場台を統計学的に有意であると見なした。
図 1より、 48時間の MC A閉塞により増大した左大脳半球内の水分含量は、 本発明化台物の単回腹腔内投与により用量依存的に改善され、 その作用は 1 m g /k gの投与群では有意であつた。
また、 図 2より、 本発明化合物の静脈内への持続投与によっても MC A 48時 間後の脳浮腫が有意に軽減された。
さらに、 図 3より、 2時間 MCAを閉塞し、 2時間再灌流した際に発生する梗 塞巣は、 本発明化台物の 2回腹腔内投与によって用量依存的に改善され、 その作 用は lmgZk gの投与群では有意であった。
産業上の利用の可能性
δ- (S—メチルイソチォゥレイ ド） 一 L一ノルバリ ンは、 （1) N— cNO S阻害作用および （2) N— c NO Sと E— c NO Sに対する選択性において、 既存の NO S阻害剤より格段に優れた効果を有し、 脳血管障害治療剤として有用 である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. δ— (S—メチルイソチォウレイ ド） 一L—ノルパリンまたは医薬として 許容されるその塩。
2. δ- (S—メチルイソチォゥレイ ド） 一L一ノルバリンまたは医薬として 許容されるその塩を有効成分として含有することを特徴とする脳血管障害治療剤。
3. 脳血管障害の病型が脳梗塞であることを特徴とする請求項 2記載の治療剤。
4. 脳血管障害の病型が脳出血であることを特徴とする請求項 2記載の治療剤。
5. 脳血管障害の病型がくも膜下出血であることを特徴とする請求項 2記載の 治療剤。
6. 脳血管障害の病型が脳浮腫であることを特徴とする請求項 2記載の治療剤。
7. N_ c NO Sの選択的阻害剤であって、 その選択性が I C 5Q値の比 （ I C so [E-NOS] / I Cso [N- cNOS] ) で 30以上である化合物を含有す ることを特徴とする脳血管障害治療剤。
8. 化合物が S— （S—メチルイソチォウレイ ド） 一 L—ノルパリンまたは医 薬として許容されるその塩である請求項 7記載の脳血管障害治療剤。
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