WO1995021914A1 - Procede de preparation d'une banque multicombinatoire de vecteurs d'expression de genes d'anticorps - Google Patents

Procede de preparation d'une banque multicombinatoire de vecteurs d'expression de genes d'anticorps Download PDF

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WO1995021914A1
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gene
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sequence
recombination
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PCT/FR1995/000127
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Régis SODOYER
Luc Aujame
Frédérique GEOFFROY
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Pasteur Merieux Serums Et Vaccins
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • Antibody molecules are made up of two heavy chains (H) and two light chains (L) through disulfide bridges.
  • the two heavy chains are associated with each other according to a Y-shaped structure and the two light chains associate respectively with the two branches of this structure, in such a way that the variable domains of the light (V L ) and heavy (V H ) chains ) are located close to each other.
  • the binding to the antigen results from the properties of the variable parts of the light and heavy chains.
  • a complex rearrangement and selection system then makes it possible to rapidly induce a large quantity of specific antibodies against an antigen.
  • the conventional hybridoma technique allows the selection of clones of hybrid cells expressing genes coding for the light and heavy chains of an antibody molecule.
  • This technique requires the fusion of cells of lymphocyte origin, containing the genes presiding over the formation of antibodies and of cells capable of leading to hybridomas forming immortalized lines.
  • the cells carrying the genes in question are generally obtained by random creation of circulating cell banks, with or without prior immunization with the specific antigen, and the screening for hybridomas is carried out by an antigen-antibody reaction after multiplication and cultures. hybridoma clones. This technique is cumbersome, of limited yield and screening is not easy.
  • This technique consists in inserting, into a vector, a repertoire of genes of antibody variable regions in association with a bacteriophage gene under conditions allowing expression of the gene in the form of a fusion protein appearing on the surface. of the phage, exposing the variable regions of the light and heavy variable chains associated by their disulfide bridges in the manner of an Fab fragment of antibodies, and to select directly the phages by a rapid method of separation using the specific immobilized antigen, for example by immunoaffinity chromatography.
  • the phages selected, after elution, can infect bacteria and be used for direct production or to repeat selection cycles. This method is particularly powerful because it allows the creation, in theory, of very large banks and an extremely fine, efficient and rapid screening of the bank.
  • a phage which lends itself particularly well to this process is the filamentous phage fd, in which the fragment coding for one of the heavy and light chains of the antibody can be fused with the gene for the minor surface protein and insert the fragment coding for the other chain, so that, after infection of bacteria by the phage, a population of phages is obtained carrying on their surface a fusion protein having the heavy and light chains in a configuration capable of recognizing the antigen, and therefore screenable.
  • An objective of the invention is therefore to provide a process for the production of multicombinatory libraries, and in particular in the form of phages or phagemids, from two gene repertoires, one of light chains and the other of heavy chains, allowing to obtain a very high number of clones.
  • Another object of the invention is to provide such a method in which the number of non-recombinant vectors present at the end of the method is reduced.
  • Another object of the invention is to produce such recombinants with increased stability.
  • the subject of the invention is a process for the production of ticombinatory libraries in which, starting from a first repertoire of genes coding for a population of one of two types of polypeptides capable of associating, covalently or not, in particular variable regions of one of the light chain and heavy chain types of antibody, and at least one gene coding for the other type of polypeptide, in particular a variable region of the other type, of antibodies or preferably from a second repertoire of genes coding for a population of said other type, the genes from said first repertoire are introduced into a first vector to form a population of vectors carrying the different genes from said first repertoire, and said gene from said first is introduced another type or the genes of said second directory in a second vector, at least one of said vectors, known as recipient, being arranged to receive, by recombination with the other vector, all or part ie of said other vector, with its gene, under conditions allowing said recipient vector to contain, after recombination, a gene of one of the two types and a gene of the
  • polypeptides are regions, at least in part variable, of chains. light and heavy chains of antibodies.
  • polypeptides capable of combining, and in particular the chains of heterodimeric receptors, such as the ⁇ and ⁇ or ⁇ and ⁇ chains of the receptors for T cells.
  • the vectors preferably circularized, respectively contain the specific recombination sites attB of E. coli and attP of the phage ⁇ arranged so as to allow recombination under the effect of the associated recombinase or integrase by forming, in a single vector resulting from recombination, stable junction sequences such as attL and attR.
  • these sites could also be replaced by specific recombination sites from other recombination systems, phage bacteria or the like.
  • said vector can be arranged to present a selection marker initially non-functional and made functional by the recombination.
  • the selection marker comprises a gene allowing selection, when it is expressed, and a promoter specific to the gene, the promoter being inserted in one of the vectors and the marker gene in the other, so as to be found associated in the recombination vector obtained.
  • the preferred markers are the resistance genes, with their promoter, to chloramphenicol, tetracyclines and gentanycin.
  • the two vectors can also include own markers usable in the specific construction of each of the vectors, so as to allow or improve the selection of each of the vectors during its construction process.
  • these markers can be the genes for resistance to antibiotics such as kanamycin and ampicillin.
  • a heat-inducible recombinase is used to control the recombination step between the first and the second vector, for example by the choice of an appropriate host such as the E. coli D1210 HP strain listed in the catalog of the American company Stratagene.
  • the subject of the invention is the multi-combinatorial banks, formed by the vectors according to the invention and associating, in a random manner, a sequence coding for one of the types of polypeptides, such as a variable part of light chain and a sequence encoding the other type of polypeptide such as a variable part of heavy chain.
  • FIG. 1 schematically represents the stages of construction starting from pM822 to lead to pM825.
  • FIG. 2 schematically represents the stages of construction starting from pM829 and ending at pM833.
  • FIG. 3 schematically represents the step of recombination of pM827 and pM834.
  • FIG. 4 represents a schematic view of the mul icombinatory vector pM835 obtained.
  • FIG. 5 represents the primers for amplification of pACYC177.
  • Figure 6 shows the 30 bp linker sequence.
  • FIG. 9 represents the primers for amplification of the lac promoter.
  • FIG. 10 shows the sequence of the linker
  • FIG. 11 represents the primers for amplification of the V L anti-gp 160 chain.
  • FIG. 12 represents the primers for amplification of pM825.
  • FIG. 13 represents the primers for amplification of the resistance gene to chloramphenicol.
  • Figure 14 shows the sequence of the 68 bp linker.
  • Figure 15 shows the sequence of the linker
  • FIG. 16 represents the primers for amplification of gene III.
  • FIG. 17 represents the primers for amplification of the V H anti-gp 160 chain.
  • FIG. 18 represents the primers for amplification of the AttP recombination sequence.
  • FIG. 19 represents the primers for amplification of the heavy chain introducing the Amber mutation.
  • FIG. 20 represents the primers for amplification of the promoter of the chloramphenicol resistance gene.
  • PCR polymerase chain reaction
  • This amplified fragment comprises the kanamycin resistance gene, including its promoter, the origin of replication p15A and an EcoRI site at each end.
  • the PCR amplified fragment is then recircularized to form a plasmid called pM822, of 2056 bp.
  • the primers used for the amplification of the fragment are described in FIG. 5 and in the identifiers SEQ ID No. 1 and 2.
  • a synthetic adapter (linker) of 30 bp comprising the restriction sites Sac1, KpnI, XbaI and SphI is inserted into the unique EcoRI site of the vector pM822, the vector obtained, of 2086 bp being called pM823.
  • the synthetic adapter primer sequences (linker) appear in FIG. 6 and in the identifiers SEQ ID No. 3 and 4.
  • the 23 bp AttB recombination sequence is inserted into the vector pM823 in the form of a synthetic oligonucleotide between the Sacl and KpnI sites, by controlling the 5'-3 'orientation by destruction of the Sacl site by modification of its last based.
  • a plasmid pM824 of 2,107 bp is thus obtained.
  • the synthetic oligonucleotide sequences corresponding to the AttB recombination site are described in FIG. 7 and the identifiers SEQ ID No. 5 and 6.
  • phagemid pBLuescript IISK + (marketed by Stratagene) of 2,961 bp is digested with the enzymes AflIII and KpnI and the elimination of a fragment of 501 bp comprising the lactose promoter and various sites cloning.
  • a 171 bp fragment amplified by PCR from pBluescript (bases 802 to 973) is inserted between the Nhel and EcoRI sites using the primers corresponding to the sequence identifiers SEQ ID No. 9 and 10 (FIG. 9), fragment containing the lac promoter to obtain the phagemid pM837.
  • sequence encoding region V, of light chain of an anti-HIV gp 160 clone of 642 bp amplified by PCR is then inserted between the SacI and XbaI sites, which allows the conservation of the reading phase between PelB and the light chain.
  • the primers (FIG. 11) are defined in the sequence identifiers SEQ ID No. 13 and 14.
  • the phagemid pM452 is obtained (3,427 bp) containing the cassette V L (lac promoter, PelB signal sequence and the sequence (642 bp) coding for the light chain of the anti-gp 160 clone.
  • This fragment is then inserted into the vector pM824 at the KpnI and XbaI sites with destruction of the KpnI site to control the orientation, giving the plasmid pM825 of 3,056 bp.
  • a unique Ascl site is created at position 3 ′ of the AttB sequence by PCR amplification of the entire pM825 plasmid using two primers (FIG. 12) having an Ascl site at their end and having the sequences appearing on the identifiers SEQ ID Nos. 15 and 16.
  • the plasmid thus modified is named plasmid pM826 (3050 bp).
  • the chloramphenicol resistance gene (770 bp), devoid of its promoter, is amplified by PCR from the plasmid pBR328 (Boehringer, Accession Genbank VB0004). The amplification is made with the primers (FIG. 13) whose sequences are indicated on the sequence identifiers SEQ ID No. 17 and 18. The gene for resistance to chloramphenicol is then cloned into the plasmid pM826 at the site. Ascl by determining the correct orientation for its expression after the recombination step, by sequencing. A plasmid called pM827 of 3,816 bp is thus obtained.
  • the heavy chain of a 684 bp anti-gp 160 HIV clone (cDNA) of PCR is amplified by PCR using primers SEQ ID No. 25, 26 (FIG. 17). This heavy chain is then inserted between the Xhol and Spel sites of the phagemid pM830 to lead to the phagemid pM831 of 4,384 bp, with conservation of the reading phase between PelB and the heavy chain and between the latter and the gene III.
  • AttP recombination sequence Insertion of the 250 bp AttP recombination sequence at the Nhel site after amplification by PCR on phage ⁇ from bases 27 571 to 27 820 (Biolabs, Accession Genbank V00636).
  • the primers used (FIG. 18) have the sequences SEQ ID No. 27 and 28.
  • the amplified AttP recombination sequence can be inserted with two possible orientations but only one orientation is retained. This leads to the phagemid pM832 of 4,641 bp comprising the structure shown in FIG. 3.
  • an Amber mutation (identified as a stop codon in non-suppressive bacterial strains) is therefore introduced between the heavy chain and gene III while preserving the phase.
  • the heavy chain is amplified by PCR with a 5 ′ primer having the Xhol site (SEQ ID No. 25) and another 3 ′ (SEQ ID No. 29; see FIG. 19) containing the Spel site followed by the Amber TAG codon then from the XbaI site compatible with Spel. It is then cloned between the Spel and Xhol sites of the vector pM832, resulting in the phagemid pM833 of 4,650 bp.
  • the strain D1210HP-F 'thus transformed has the following genotype: D1210HP-F': HB101, lacI q , lacY + , ⁇ xis- kil- cI857 [F ', proAB, lacI q Z ⁇ M15, Tn10 (Tet R )].
  • the culture After 30 minutes of infection at 30oC, the culture is subjected to a thermal shock at 42oC for one hour to trigger the recombination under the effect of the inducible recombinase.
  • the step of insertion 1.4 of the variable region of the light chain of the anti-gp 160 clone of HIV amplified by PCR is replaced by a similar insertion of the variable regions of the light chains of a library of antibody light chains amplified by PCR using a suitable known primer system specific to the type of light chain sought, or a plurality of primer systems if it is desired to carry out the multiple combination from populations of different types light chains.
  • the primer systems allowing the amplification of light chains are well known and described by W.D. Huse et al., Science, Vol 246 (1989), 1275-1281.
  • the insertion step II.1 of the heavy chain of an anti-gp 160 HIV clone is replaced by the insertion of a library of variable regions of heavy chains. amplified by PCR using suitable primer systems described by MJ Campbell et al., Molecular Immunology, Vol. 29, No. 2 (1992), 193-203 or by W.D. Huse et al. above.
  • the clones resistant to chloramphenicol are selected and screening is then carried out intended to select the clones expressing associations of light chain and heavy chain of antibodies having the desired affinities against the determined antigens, in accordance with the techniques described in by example by SF Parmley et al., Gene 73 (1988), 305-318. LIST OF SEQUENCES

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Abstract

Procédé de préparation d'une banque multicombinatoire de vecteurs d'expression de gènes d'anticorps, banque et systèmes d'expression d'anticorps 'coliclonaux' obtenus. Partant d'un premier répertoire de gènes codant pour une population d'un de deux types de polypetides susceptibles de s'associer, notamment de région variable de chaîne légère d'anticorps, et d'au moins d'un gène et de préférence un second répertoire codant pour l'autre type de polypeptide, notamment une région variable de chaîne lourde d'anticorps, on introduit les gènes dudit premier répertoire dans un premier vecteur pour former une population de vecteurs et les gènes dudit second répertoire dans un second vecteur, l'un au moins desdits vecteurs, étant receveur pour exprimer les deux gènes sous forme de polypeptides associés à la surface extérieure du produit dudit vecteur de façon irréversible.

Description

PROCEDE DE PREPARATION D'UNE BANQUE MULTICOMBINATOIRE DE VECTEURS D'EXPRESSION DE GENES D'ANTICORPS
Les molécules d'anticorps sont constituées par l'association de deux chaînes lourdes (H) et de deux chaînes légères (L) par l'intermédiaire de ponts disulfure. Les deux chaînes lourdes sont associées entre elles selon une structure en forme de Y et les deux chaînes légères s'associent respectivement aux deux branches de cette structure, de faςon telle gue les domaines variables des chaînes légères (VL) et lourdes (VH) soient situés à proximité l'un de l'autre. La liaison à l'antigène résulte des propriétés des parties variables des chaînes légères et lourdes. Un système complexe de réarrangement et de sélection permet alors d'induire rapidement une quantité importante d'anticorps spécifiques contre un antigène. La technique classique des hybridomes permet la sélection de clones de cellules hybrides exprimant des gènes codants pour les chaînes légère et lourde d'une molécule d'anticorps. Cette technique demande la fusion de cellules d'origine lymphocyteire, contenant les gènes présidant à la formation des anticorps et de cellules susceptibles de conduire à des hybridomes formant des lignées immortalisées. Les cellules portant les gènes en question sont en général obtenues par création au hasard de banques de cellules circulantes, avec ou sans immunisation préalable par l'antigène spécifique, et le criblage des hybridomes s'effectue par une réaction antigène-anticorps après multiplications et cultures des clones hybridomes. Cette technique est lourde, d'un rendement limité et le criblage n'est pas facile.
Une autre méthode, utilisant des bactériophages recombinants a été récemment mise en oeuvre. Les principes et diverses réalisations de ce procédé sont par exemple décrits par D. R. Burton, Tiptech - mai 1991, vol. 9, 169-175 ; D. J. Chiswell et al., Tiptech - mars 1992, vol. 10, 80-84 ; H. R. Hoogenboom et al., Rev. Fr. Transfus. Hémobiol., 1993, 36, 19-47 (voir également les demandes de brevets PCT WO 92/01047 et 92/20791).
Cette technique consiste à insérer, dans un vecteur, un répertoire de gènes de régions variables d'anticorps en association avec un gène de bactériophage dans des conditions permettant l'expression du gène sous la forme d'une protéine de fusion se présentant à la surface du phage, exposant les régions variables des chaînes variables légère et lourde associées par leurs ponts disulfure à la façon d'un fragment Fab d'anticorps, et à sélectionner directement les phages par une méthode rapide de séparation utilisant l'antigène spécifique immobilisé, par exemple par chromatographie d' immuno-aff ini té. Les phages sélectionnés, après élution, peuvent infecter une bactérie et être utilisés pour une production directe ou pour répéter des cycles de sélection. Cette méthode est particulièrement puissante car elle permet la création, en théorie, de banques très importantes et un criblage extrêmement fin, efficace et rapide de la banque. Un phage qui se prête particulièrement bien à ce procédé est le phage filamenteux fd, dans lequel on peut fusionner le fragment codant pour l'une des chaînes lourde et légère de l'anticorps avec le gène de la protéine mineure de surface et insérer le fragment codant pour l'autre chaîne, de sorte que, après infection de bactéries par le phage, on obtient une population de phages portant à leur surface une protéine de fusion présentant les chaînes lourde et légère dans une configuration capable de reconnaître l'antigène, et donc criblable.
Outre sa simplicité, cette technique présente de grands avantages. En association avec l'amplification préalable de la banque de gènes d'anticorps, on peut arriver à sélectionner un phage présentant un fragment d'anticorps spécifique dans une très grande population de phages, de l'ordre de 10 , ce qui peut permettre de rechercher les gènes d'anticorps humains sans avoir forcément à procéder à l'immunisation préalable du donneur.
Par clivage suivi de religation, ou à partir de deux banques séparées de gènes de chaînes légères et de chaînes lourdes, on peut obtenir des phages associant une chaîne légère et une chaîne lourde au hasard. Le nombre de clones différents que l'on peut obtenir est cependant limité par le rendement de la sélection et par le degré d'efficacité de la transformation bactérienne.
Un moyen d'accroître le nombre d'associations réussies associant les chaînes légères d'une première banque aux chaînes lourdes d'une deuxième banque été décrit par P. WATERHOUSE et al., Nucleic acids Research, 1993, Vol. 21, No. 9, 2265-2266, permettant d'obtenir jusqu'à 1012 clones, en utilisant un système de recombinaison spécifique de sites loxP sensible à l'action d'une recombinase Cre. Cependant l'association reste réversible. De plus il n'existe aucun contrôle de l'action de la recombinase et les vecteurs recombinés n'ont aucun avantage sélectif par rapport aux autres vecteurs.
Or, compte-tenu du rendement de l'étape de sélection des phages recombinés, qui, en réalité, ne retient qu'une fraction des phages intéressants, il est souhaitable d'obtenir les plus hauts rendements possibles de vecteurs recombinés avec le moins possible de vecteurs non-recombinés.
Un objectif de l'invention est donc de fournir un procédé de production de banques mul ticombinatoires, et notamment sous forme de phages ou phagemides, à partir de deux répertoires de gènes, l'un de chaînes légères et l'autre de chaînes lourdes, permettant d'obtenir un nombre de clones très élevé.
Un autre objectif de l'invention est de fournir un tel procédé dans lequel le nombre de vecteurs non-recombinés présents à la fin du procédé soit réduit.
Un autre objectif de l'invention est de produire de tels recombinants ayant une stabilité accrue.
L'invention a pour objet un procédé de production de banques mul ticombinatoires dans lequel, partant d'un premier répertoire de gènes codant pour une population d'un de deux types de polypeptides susceptibles de s'associer, de manière covalente ou non, notamment de régions variables de l'un des types chaîne légère et chaîne lourde d'anticorps, et d'au moins d'un gène codant pour l'autre type de polypeptide, notamment une région variable de l'autre type, de chaîne d'anticorps ou de préférence d'un second répertoire de gènes codants pour une population dudit autre type, on introduit les gènes dudit premier répertoire dans un premier vecteur pour former une population de vecteurs portant les différents gènes dudit premier répertoire, et on introduit ledit gène dudit autre type ou les gènes dudit second répertoire dans un second vecteur, l'un au moins desdits vecteurs, dit receveur, étant agencé pour recevoir, par recombinaison avec l'autre vecteur, tout ou partie dudit autre vecteur, avec son gène, dans des conditions permettant audit vecteur receveur de contenir, après recombinaison, un gène de l'un des deux types et un gène de l'autre type et d'exprimer les deux gènes sous forme de polypeptides associés susceptibles d'apparaître à la surface extérieure du produit dudit vecteur en y restant maintenus et en étant associés entre eux de façon multimérique ou simulant un multimère, caractérisé en ce que lesdits vecteurs présentent des moyens permettant à la recombinaison des chaînes de deux types d'être effectué de façon irréversible.
Par la suite l'invention sera décrite dans l'application dans laquelle les deux types de polypeptldes sont des régions, au moins en partie variables, de chaînes légères et de chaînes lourdes d'anticorps. Cependant on comprend qu'elle s'applique à d'autres types de polypeptides susceptibles de s'associer, et notamment les chaînes de récepteurs hétérodimériques, tels que les chaînes α et β ou γ et δ des récepteurs des cel Iules T.
De façon particulièrement avantageuse les vecteurs, de préférence circularisés, contiennent respectivement les sites de recombinaison spécifiques attB de E. coli et attP du phage λ agencés de façon à permettre la recombinaison sous l'effet de la recombinase ou intégrase associée en formant, dans un vecteur unique résultant de la recombinaison, des séquences de jonction stables telles que attL et attR.
Bien entendu on pourrait également remplacer ces sites par des sites de recombinaison spécifiques d'autres systèmes de recombinaison, bacterie-phage ou autres.
De façon à permettre l'élimination des vecteurs ne comportant qu'une chaîne unique et obtenir en conséquence un accroîssement supplémentaire de la teneur relative en vecteurs recombinés, ledit vecteur peut être agencé pour présenter un marqueur de sélection initialement non fonctionnel et rendu fonctionnel par la recombinaison.
De préférence le marqueur de sélection comporte un gène permettant la sélection, lorsqu'il est exprimé, et un promoteur propre au gène, le promoteur étant inséré dans l'un des vecteurs et le gène marqueur dans l'autre, de façon à se retrouver associés dans le vecteur de recombinaison obtenu. Parmi les marqueurs préférés figurent les gènes de résistance, avec leur promoteur, au chloramphenicol, aux tétracycl ines et à la gentanycine.
Bien entendu les deux vecteurs peuvent également comporter des marqueurs propres utilisables dans la construction spécifique de chacun des vecteurs, de façon à permettre ou améliorer la sélection de chacun des vecteurs pendant son processus de construction. A titre d'exemple ces marqueurs peuvent être les gènes de résistance à des antibiotiques tels que la kanamycine et l'ampicilline.
De façon préférée on utilise, pour contrôler l'étape de recombinaison entre le premier et le second vecteur, une recombinase thermo-inductible, par exemple par le choix d'un hôte approprié tel que la souche E. coli D1210 HP figurant au catalogue de la société américaine Stratagène.
L'invention a également pour objet les vecteurs obtenus par le procédé selon l'invention, et notamment les vecteurs de type plasmide ou phagemide, et qui se caractérisent par la présence d'une séquence codant pour une partie variable de chaîne légère d'anticorps, et une séquence codant pour une partie variable de chaîne lourde d'anticorps, lesdites séquences étant accompagnées, dans des cadres convenables, des éléments permettant leur expression dans un hôte, lesdites séquences de chaîne légère et de chaîne lourde, avec lesdits moyens qui leur sont associés, étant respectivement séparées par des sites uniques d'intégration irreversibles tels que, notamment, attP ou attB.
Enfin l'invention a pour objet les banques multicombinatoires, formées par les vecteurs selon l'invention et associant, de façon aléatoire, une séquence codant pour l'un des types de polypeptides, tel qu'une partie variable de chaîne légère et une séquence codant pour l'autre type de polypeptide tel qu'une partie variable de chaîne lourde.
On va maintenant décrire un exemple de construction d'un vecteur recombiné selon l'invention combinant les parties variables de la chaîne légère et de la chaîne lourde d'un même clone anti-gpl60 de HIV, vecteur qui s'avère capable d'exprimer les gènes desdites parties variables légères et lourde et de présenter leurs produits d'expression à sa surface ou, en variante, de les relarguer sous forme d'une association chaîne lourde-chaîne légère reconnaissant l'antigène gpl60.
La même technique pourra être utilisée pour réaliser les construct ions multicombinatoires associant les gènes d'un répertoire de parties variables de chaîne légère à un gène de partie variable de chaîne lourde, ou un répertoire de parties variables de chaîne lourde à un gène de partie variable de chaîne légère, ou deux répertoires de parties variables lourdes et légères.
La figure 1 représente schémat iquement les étapes de constructions partant de pM822 pour aboutir à pM825.
La figure 2 représente schémat iquement les étapes de construction partant de pM829 pour aboutir à pM833.
La figure 3 représente schémat iquement l'étape de recombinaison de pM827 et pM834.
La figure 4 représente une vue schématique du vecteur mul t icombinatoire pM835 obtenu.
La figure 5 représente les amorces d'amplification du pACYC177.
La figure 6 représente la séquence du linker 30 pb.
La figure 7 représente l'oligonucléot ide incorporant la séquence de recombinaison AttB. La figure 8 représente la séquence du linker 70 pb.
La figure 9 représente les amorces d'amplification du promoteur lac.
La figure 10 représente la séquence du linker
98 pb.
La figure 11 représente les amorces d'amplification de la chaîne VL anti-gp 160.
La figure 12 représente les amorces d'amplification de pM825.
La figure 13 représente les amorces d'amplification du gène de résistance au chloramphénicol.
La figure 14 représente la séquence du linker 68 pb.
La figure 15 représente la séquence du linker
115 pb.
La figure 16 représente les amorces d'amplification du gène III.
La figure 17 représente les amorces d'amplification de la chaîne VH anti-gp 160.
La figure 18 représente les amorces d'amplification de la séquence de recombinaison AttP.
La figure 19 représente les amorces d'amplification de la chaîne lourde introduisant la mutation Ambre.
La figure 20 représente les amorces d'amplification du promoteur du gène de résistance au chloramphénicol.
I - Création d'un plasmide possédant une origine de répl ication p15A, un gène de résistance à la kanamycine et une séquence de recombinaison AttB pour l'insertion du gène ou de banque de gènes régions variables de chaîne légère.
1) On procède à l'amplification par PCR (réaction en chaîne de polymérase) d'un fragment de 2 050 pb couvrant les bases 759 à. 2 810 du plasmide pACYC177. Ce plasmide
(ATCC 37031), diffusé par la firme Biolabs, est répertorié, et sa séquence décrite, dans les banques de données (GenBank
Accession nº X06402). Ce fragment amplifié comprend le gène de résistance à la kanamycine, y compris son promoteur, l'origine de réplication pl5A et un site EcoRI à chaque extrémité. Le fragment amplifié par PCR est ensuite recircularisé pour former un plasmide appelé pM822, de 2 056 pb.
Les amorces utilisées pour l'amplification du fragment sont décrites sur la figure 5 et dans les identif icateurs SEQ ID No. 1 et 2.
2) Dans le site EcoRI unique du vecteur pM822 on insère un adap teur (linker) synthétique de 30 pb comprenant les sites de restriction Sacl, KpnI, XbaI et SphI, le vecteur obtenu, de 2 086 pb étant appelé pM823. Les séquences d'amorce adapteur (linker) synthétique apparaissent sur la figure 6 et dans les identificateurs SEQ ID No. 3 et 4.
3) On insère dans le vecteur pM823 la séquence de recombinaison AttB de 23 pb sous forme d'ol igonucléotide synthétique entre les sites Sacl et KpnI, en contrôlant l'orientation 5'-3' par destruction du site Sacl par modification de sa dernière base. On obtient ainsi un plasmide pM824 de 2 107 pb. Les séquences oligonucléotidiques synthétiques correspondant au site de recombinaison AttB sont décrites sur la figure 7 et les identif icateurs SEQ ID No. 5 et 6.
4) Insertion de la cassette permettant le clonage des parties variables des chaînes légères V,.
- pour construire un phagemide appelé pM452 on procède à la digestion du phagemide pBLuescript IISK+ (commercialisé par Stratagène) de 2 961 pb par les enzymes AflIII et KpnI et à l'élimination d'un fragment de 501 pb comprenant le promoteur lactose et différents sites de clonage. On synthétise un adapteur de 70 pb représenté sur la figure 8, dont les séquences d'amorces sont décrites dans les identificateurs SEQ ID No. 7 et 8 comprenant les sites de restriction BglII, Nhel, EcoRI, Sacl, XbaI et NotI, et on insère le linker entre AflIII et KpnI pour aboutir à un phagemide pM836 de 2 530 pb.
- On insère entre les sites Nhel et EcoRI un fragment de 171 pb amplifié par PCR à partir du pBluescript (bases 802 à 973) en utilisant les amorces correspondant aux identif icateurs de séquence SEQ ID No. 9 et 10 (figure 9), ce fragment contenant le promoteur lac pour obtenir le phagemide pM837.
- On insère entre EcoRI et Sacl de pM837, un adapteur synthétique de 98 pb contenant la séquence signal PelB (figure 10 et identif icateurs SEQ ID No. 11 et 12) pour obtenir finalement un phagemide pM838 de 2 795 pb.
- On insère ensuite la séquence codant pour la région V, de chaîne légère d'un clone anti-gp 160 de HIV de 642 pb amplifiée par PCR (banque d'ADNc) entre les sites Sacl et XbaI, ce qui permet la conservation de la phase de lecture entre PelB et la chaîne légère. Les amorces (figure 11) sont définies dans les identif icateurs de séquence SEQ ID No. 13 et 14. On obtient le phagemide pM452 (3 427 pb) contenant la cassette VL (promoteur lac, séquence signal PelB et la séquence (642 pb) codant pour la chaîne légère du clone anti-gp 160.
- Le phagemide pM452 est digéré par Nhel et XbaI pour libérer un fragment de 960 pb correspondant à la cassette Vγ, fragment que l'on purifie.
- Ce fragment est ensuite inséré dans le vecteur pM824 au niveau des sites KpnI et XbaI avec destruction du site KpnI pour contrôler l'orientation, donnant le plasmide pM825 de 3 056 pb.
5) Un site Ascl unique est créé en position 3' de la séquence AttB par amplification par PCR du plasmide pM825 entier à l'aide de deux amorces (figure 12) possédant un site Ascl à leur extrémité et ayant les séquences figurant sur les identificateurs SEQ ID No. 15 et 16. Le plasmide ainsi modifié est nommé plasmide pM826 (3 050 pb).
Le gène de résistance au chloramphénicol (770 pb), dépourvu de son promoteur, est amplifié par PCR à partir du plasmide pBR328 (Boehringer, Accession Genbank VB0004). L'ampl if ication est faite avec les amorces (figure 13) dont les séquences sont indiquées sur les identif icateurs de séquences SEQ ID No. 17 et 18. On clone ensuite le gène de résistance au chloramphénicol dans le plasmide pM826 au niveau du site Ascl en déterminant l'orientation correcte pour son expression après l'étape de recombinaison, par séquençage. On obtient ainsi un plasmide dénommé pM827 de 3 816 pb.
II - Création d'un vecteur de type phagemide portant deux origines de réplication ColE1 et f1, un gène de résistance à l'ampicilline et une séquence de recombinaison AttP pour l'insertion d'une banque de régions variables de chaînes lourdes.
1) Modification du vecteur pBluescript SKII+ (Stratagène, Accession Genbank X52328) pour obtenir un phagemide capable de présenter un Fab fusionné au niveau du gène III (protéine de surface) à sa surface :
- Après digestion du pBluescript par Sacl et destruct i on du s i te Sacl par act ion de l a mung bean nucléase puis digestion par KpnI pour éliminer le site de clonage multiple (polylinker) (107 pb), on insère un adapteur synthétique de 68 pb (figure 14) contenant les sites SacII, Xhol, Spel, Nhel et Notl (séquences SEQ ID nº 19 et 20), obtenant le phagemide pM828 de 2 922 pb.
- On crée un adapteur synthétique 115 pb (SEQ ID No. 21 et 22) contenant la séquence signal PelB. Ce linker (figure 15) est inséré entre les sites Sacll et Xhol pour donner le phagemide pM829 de 3 034 pb.
- On procède à l'insertion, entre les sites Spel et Nhel de pM828 d'un adapteur flexible de 15 pb (fig 16 et identificateurs SEQ ID No. 23 et 24) et du gène III du phage M13 (663 pb) après amplification par PCR sur le phage M13 mplδ des bases 2 223 à 2 885 (Biolabs, Accession Genbank X02513), obtenant le phagemide pM830 de 3 709 pb.
- On amplifie par PCR la chaîne lourde d'un clone (ADNc) anti-gp 160 de HIV de 684 pb à l'aide des amorces SEQ ID No. 25, 26 (figure 17). Cette chaîne lourde est ensuite insérée entre les sites Xhol et Spel du phagemide pM830 pour aboutir au phagemide pM831 de 4 384 pb, avec conservation de la phase de lecture entre PelB et la chaîne lourde et entre celle-ci et le gène III.
2) Insertion de la séquence de recombinaison AttP de 250 pb au niveau du site Nhel après amplification par PCR sur le phage λ des bases 27 571 à 27 820 (Biolabs, Accession Genbank V00636). Les amorces utilisées (figure 18) possèdent les séquences SEQ ID No. 27 et 28. La séquence de recombinaison AttP amplifiée peut être insérée avec deux orientations possibles mais seule une orientation est retenue. On aboutit ainsi au phagemide pM832 de 4 641 pb comprenant la structure représentée sur la figure 3.
3) Modification du vecteur pour la production de Fab solubles.
Pour produire facilement des Fab solubles, une mutation Ambre (identifiée comme un codon stop dans les souches bactériennes non suppressives) est donc introduite entre la chaîne lourde et le gène III en conservant la phase. La chaîne lourde est amplifiée par PCR avec une amorce en 5' possédant le site Xhol (SEQ ID No. 25) et une autre en 3' (SEQ ID No. 29 ; voir figure 19) contenant le site Spel suivi du codon Ambre TAG puis du site XbaI compatible avec Spel. Elle est ensuite clonée entre les sites Spel et Xhol du vecteur pM832, aboutissant au phagemide pM833 de 4 650 pb.
4) Insertion du promoteur du gène de résistance au chloramphénicol au niveau du site unique KpnI situé en 3' de la séquence de recombinaison AttP. Une seule orientation confère une nouvelle résistance au vecteur recombiné. Le promoteur (177 pb) est amplifié préalablement par PCR à partir des bases 3270 à 3440 du vecteur pBR328 (commercial isé par Biolabs) à l'aide des amorces (figure 20) dont les séquences sont indiquées dans les identif icateurs de séquence SEQ ID No. 30 et 31. On obtient ainsi le phagemide pM834 de 4 827 pb.
III Recombinaison entre les deux vecteurs pM827 et pM834. Les deux plasmides précités serviront de point de départ pour obtenir des banques d'anticorps multicombinatoires. Dans l'exemple représenté la recombinaison s'effectuera entre les chaînes VL et VH du clones anti-gp 160 de HIV utilisé. Cependant si les deux vecteurs sont construits à partir de banques de gènes de chaînes lourdes et/ou de gènes de chaînes légères d'anticorps ils permettront d'obtenir une banque mul ticombinatoire d'anticorps que l'on pourra ensuite cribler.
Transformés dans une souche adéquate (D1210HP), les deux vecteurs pourront s'associer grâce aux séquences AttP et AttB, cibles d'un facteur de recombinaison int inductible. Les mécanismes de recombinaison sont décrits dans le chapitre 9 du livre "The recombination of genetic material" (Miller H. V., Viral and cellular control of site-specif ic recombination, 1988, p 360-384, edited by Brooks Low K., Académie Press). Le vecteur mul ticombinatoire (8 643 pb) ainsi créé possèdera trois origines de répl ication différentes, trois résistances aux antibiotiques et les deux cassettes permettant l'expression des chaînes VL et VH.
1) On procède à la transformat ion par électroporation de la souche de E. coli D1210HP (diffusée par Stratagène), et qui contient la recombinase inductible int, avec l'épisome F' sous forme d'ADN provenant de la souche bactérienne XLl-Blue (diffusée par Stratagène). Les bactéries sont ainsi infectables par un phage filamenteux. L'épisome F' est maintenu dans la souche grâce à sa résistance à la tétracycl ine. La souche D1210HP-F' ainsi transformée possède le génotype suivant : D1210HP-F' : HB101, lacIq, lacY+, λxis- kil- cI857 [F', proAB, lacIqZΔM15, Tn10(TetR)].
2) Etapes de la recombinaison.
- On procède à la transformation de cette souche par le plasmide pM 827 (contenant les chaînes VL et résistant à la kanamycine), et en parallèle on transforme une souche compatible, par exemple, XL-1 Blue par le phagemide pM834 (résistant à l'ampicilline et portant les chaînes VH).
A partir de la souche transformée par le phagemide pM 834; on prépare celui-ci sous forme de phage puis on infecte la culture de D1210 HP-F' contenant le plasmide pM 827, à 30ºC (DO = 0,6).
Après 30 mn d'infection à 30ºC, on soumet la culture à un choc thermique à 42ºC pendant une heure pour déclencher la recombinaison sous l'effet de la recombinase inductible.
Après avoir remis la culture à 30ºC et ajouté du chloramphénicol (50 à 100 μg/ml final), on étale les clones sur milieu gélose contenant du chloramphénicol. On ajoute une heure après le phage helper VCSM13 (KanR) de Stratagène à raison de 10 12 pfu/100 ml de culture. Puis on ajoute, deux heures après, la kananycine à 70 pg/ml final et la culture est laissée quelques heures à 30ºC.
L'analyse des clones après recombinaison des vecteurs pM827 et pM834 montre que l 'association s'est bien déroulée. On obtient un phagemide recombiné pM835 de 8 643 pb stable, exprimant un Fab et toujours capable d'infecter la souche D1210HP-F. Les points de jonction AttL et AttR ont été vérifiés par séquençage.
IV - Préparation d'une banque multicombinatoire à partir d'une banque de chaïnes légères et d'une banque de chaînes lourdes.
L'étape d'insertion 1.4 de la région variable de la chaîne légère du clone anti-gp 160 de HIV amplifié par PCR est remplacé par une insertion similaire des régions variables des chaînes légères d'une banque de chaînes légères d'anticorps amplifiée par PCR à l'aide d'un système d'amorces connu convenable propre au type de chaîne légère recherchée, ou d'une pluralité de systèmes d'amorces si l'on souhaite effectuer la mul ti combinai son à partir de populations de différents types de chaînes légères. Les systèmes d'amorce permettant l'amplification des chaînes légères sont bien connus et décrits par W.D. Huse et al., Science, Vol 246 (1989), 1275-1281.
De la même façon, pour le clonage des chaînes lourdes, on remplace l'étape d'insertion II.1 de la chaîne lourde d'un clone anti-gp 160 HIV par l'insertion d'une banque de régions variables de chaînes lourdes amplifiée par PCR à l'aide des systèmes d' amorce convenables décrits par M.J. Campbell et al., Molecular Immunology, Vol. 29, No. 2 (1992), 193-203 ou par W.D. Huse et al. ci-dessus.
Après les étapes de recombinaison les clones résistant au chloramphénicol sont sélectionnés et on procède ensuite au criblage destiné à sélectionner les clones exprimant des associations de chaîne légère et chaîne lourde d'anticorps ayant les affinités recherchées contre les antigènes déterminés, conformément aux techniques décrites dans par exemple par S. F. Parmley et al., Gène 73 (1988), 305-318. LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT
(A) NOM PASTEUR MERIEUX Sérums et Vaccins
(B) RUE 58 avenue Lee 1ère
(C) VILLE: LYON
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 69007
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Procédé de préparation d'une banque
mul ticombinatoire de vecteurs d'expression de gènes d'anticorps, banque et systèmes d'expression d'anticorps "col iclonaux" obtenus.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 31
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 26 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce pACYC+
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GGGAATTCCC CTTAATAAGA TGATCT 26
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 28 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce pACYC- (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
GGGAATTCCA TTCAACAAAG CCGCCGTC 28
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce linker pAC Link+
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
AATTCGAGCT CGGTACCTCT AGAGCATGCG 30
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce linker pAC Link-
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
AATTCGCATG CTCTAGAGGT ACCGAGCTCG 30
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : OIigonucléotide de synthèse :
séquence de recombinaison AttB Sac-Kpn+
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
GCCTGCTTTT TTATACTAAC TTGGTAC 27 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
séquence de reccmbinaison AttB Sac-Kpn-
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
CAAGTTAGTA TAAAAAAGCA GGCAGCT 27
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 79 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléot ide de synthèse :
amorce linker pVL Link+
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
CATGTGCAGA TCTTAGCTAG CATGAATTCC AGAGCTCGTC AGTTCTAGAG TTAAGCGGCC 60
GCAATCGAGG GGGCGGTAC 79
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 71 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce linker pVL Link-
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
CGCCCCCTCG ATTGCGGCCG CTTAACTCTA GAACTGACAG ACTCTGGAAT TCATGCTAGC 60
TAAGATCTGC A 71 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce Pro Lac+
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
CTAGCTAGCT AACACGACAG GTTTCCCGAC 30
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 26 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce Pro Lac-
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
CGGAATTCGT AATCATGGTC ATAGCT 26
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 108 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce linker pVL PelB+
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
AATTCTAAAC TAGCTAGTCG CCAAGGAGAC AGTCATAATG AAATACCTAT TGCCTACGGC 60
AGCCGCTGGA TTGTTATTAC TCGCTGCCCA ACCAGCCATG GCCGAGCT 108 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 100 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce linker pVL PelB-
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
CGGCCATGGC TGGTTGGGCA GCGAGTAATA ACAATCCAGC GGCTGCCGTA GGCAATAGGT 60
ATTTCATTAT GACTGTCTCC TTGGCGACTA GCTAGTTTAG 100
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce VL5
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:
CAGTCTGAGC TCACGCAGCC GCCC 24
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce CL2
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
CGCCGTCTAG AACTATGAAC ATTCTGTAGG 30 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce pAC Asc+
(xi) DESCRIPTION DF LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
TTGGCGCGCC TAGTAACACG ACAGG 25
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce pAC Asc-
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:
TTGGCGCGCC GGTACCAAGT TAGTA 25
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 26 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce Gène Cm Asc+
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:
TTGGCGCGCC GAGTTATCGA GATTTT 26
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce Gène Cm Asc-
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:
TTGGCGCGCC ATTCATCCGC TTAT 24
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 19:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 73 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce linker pVH Link+
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19:
TGGCCACCGC GGTGCTCGAG GATACTAGTC AGCTAGCTAG AGAGTTAAGC GGCCGCAATC 60
GAGGGGGCGG TAC. 73
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 20:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 69 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce linker pVH Link-
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20:
CGCCCCCTCG ATTGCGGCCG CTTAACTCTC TAGCTAGCTG ACTAGTATCC TCGAGCACCG 60
CGGTGGCCA 69
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 21:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 117 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce linker pVH PelB+
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21:
GGTGGCGGCC GCAAATTCTA TTTCAAGGAG ACAGTCATAA TGAAATACCT ATTGCCTACG 60
GCAGCCGCTG GATTGTTATT ACTCGCTGCC CAACCAGCCA TGGCCCAGGT GAACTGC 117
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 22:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 123 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce linker pVH PelB-
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 22:
TCGAGCAGTT CACCTGGGCC ATGGCTGGTT GGGCAGCGAG TAATAACAAT CCAGCGGCTG 60
CCGTAGGCAA TAGGTATTTC ATTATGACTG TCTCCTTGAA ATAGAATTTG CGGCCGCCAC 120
CGG 123
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 23:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 39 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce linker pVH GIII+
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23:
GGACTAGTGG TGGCGGTGGC TCTCCATTCG TTTGTGAAT 39 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 24:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 31 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce linker pVH GIII-
(xi) DESCRIPTION DF LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 24:
CTAGCTAGCA TAATAACGGA ATACCCAAAA G 31
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 25:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce linker VH4f
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 25:
CAGGTGCAGC TGCTCGAGTC GGG 23
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 26:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce linker CGlz
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 26:
GCATGTACTA GTTTTGTCAC AAGATTTGGG 30
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 27:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce AttP Nhe+
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 27:
CTAGCTAGCC GCGCTAATGC TCTGTTACAG 30
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 28:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE :01 igonucl éot ide de synthèse :
amorce AttP Nhe-
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 28:
CTAGCTAGCA TCAAATAATG ATTTTATTT 29
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 29:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce Amb PCR
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 29:
GCTCTAGACT AACTAGTTTT GTCACAAGAT TTG 33
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 30:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce Pro Cm Kpn+
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 30:
GGGGTACCGA ATAAATACCT GTGA 24
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 31:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : Oligonucléotide de synthèse :
amorce Pro Cm Kpn-
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 31:
GGGGTACCAA AAAATACGCC CGGTA 25

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de production de banques multicombinatoires dans lequel, partant d'un premier répertoire de gènes codant pour une population d'un de deux types de polypeptides susceptibles de s'associer, notamment de régions variables de l'un des types chaîne légère et chaîne lourde d'anticorps, et d'au moins d'un gène codant pour l'autre type de polypeptide, notamment une région variable de l'autre type de chaîne d'anticorps, ou de préférence d'un second répertoire de gènes codants pour une population dudit autre type, on introduit les gènes dudit premier répertoire dans un premier vecteur pour former une population de vecteurs portant les différents gènes dudit premier répertoire, et on introduit ledit gène dudit autre type ou les gènes dudit second répertoire dans un second vecteur, l'un au moins desdits vecteurs, dit receveur, étant agencé pour recevoir, par recombinaison avec l'autre vecteur, tout ou partie dudit autre vecteur, avec son gène, dans des conditions permettant audit vecteur receveur de contenir, après recombinaison, un gène de l'un des deux types et un gène de l'autre type et d'exprimer les deux gènes sous forme de polypeptides associés susceptibles d'apparaître à la surface extérieure du produit dudit vecteur en y restant maintenus et en étant associés entre eux de façon multimérique ou simulant un multimère, caractérisé en ce que lesdits vecteurs présentent des moyens permettant à la recombinaison des chaînes de deux types d'être effectuéede façon irréversible.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits premier et second vecteurs contiennent respectivement l'un des sites de recombinaison spécifique d'un système de recombinaison spécifique, notamment les sites attB de E. coli et attP du phage λ, agencé de façon à permettre la recombinaison sous l'effet d'une recombinase ou intégrase associée en formant, dans un vecteur unique résultant de la recombinaison, des séquences de jonction stables telles que attL et attR.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le vecteur recombinant obtenu à partir desdits premier et second vecteurs est agencé pour présenter un marqueur de sélection initialement non fonctionnel et rendu fonctionnel par la recombinaison.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le marqueur de sélection comporte un gène permettant la sélection, lorsqu'il est exprimé, et un promoteur propre au gène, le promoteur étant inséré dans l'un desdits premier et second vecteurs et le gène marqueur dans l'autre.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le marqueur est le gène de résistance à un antibiotique, notamment un gène du groupe formé par les gènes de résistance aux tétracycl ines, à la gentamycine et au chloramphénicol, avec son promoteur.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on utilise, pour contrôler l'étape de recombinaison entre le premier et le second vecteur, une recombinase thermo-inductible.
7. Vecteurs obtenus par le procédé selon l'une des revendications 1 à 6, et notamment les vecteurs de type plasmide ou phagemide, et qui se caractérisent par la présence d'une séquence codant pour l'un de deux types de polypeptides susceptibles de s'associer, notamment une partie variable de chaîne légère d'anticorps, et une séquence codant pour l'autre desdits deux types, notamment une partie variable de chaîne lourde d'anticorps, lesdites séquences étant accompagnées, dans des cadres convenables, des éléments permettant leur expression dans un hôte, lesdites séquences de chaîne légère et de chaîne lourde, avec lesdits moyens qui leur sont associés, étant respectivement séparées par des séquences relatives à des sites uniques d'intégration tels que, notamment, attP ou attB.
8. Banques mul ticombinatoires de vecteurs, formées par les vecteurs selon la revendication 7 et associant, de façon aléatoire, une séquence codant pour l'un de deux types de polypeptides susceptibles de s'associer, notamment une partie variable de chaîne légère d'anticorps et une séquence codant pour l'autre desdits deux types, notamment une partie variable de chaîne lourde d'anticorps .
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