WO1995020606A1 - Vaccin anti-allergique - Google Patents

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WO1995020606A1
WO1995020606A1 PCT/FR1995/000034 FR9500034W WO9520606A1 WO 1995020606 A1 WO1995020606 A1 WO 1995020606A1 FR 9500034 W FR9500034 W FR 9500034W WO 9520606 A1 WO9520606 A1 WO 9520606A1
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polypeptide
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ige
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Application number
PCT/FR1995/000034
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English (en)
Inventor
Christian Marcel Hurpin
Mireille Jeanne Marguerite Latour
Original Assignee
Pasteur Merieux Serums Et Vaccins
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
    • C07K16/4291—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig against IgE

Definitions

  • the present invention relates to pharmaceutical compositions mainly intended for the treatment or prevention of allergic reactions in particular mediated by immunoglobulins E (IgE), as well as immune diseases, in particular inflammatory diseases, which result therefrom.
  • these compositions could also be used to modulate the production of IgE by the body, in particular to fight against pathologies linked to the abnormal production of IgE.
  • an immunoglobulin molecule is made up of two light polypeptide chains (L chain) and two heavy chains (H chain) in a "Y" configuration.
  • L chain light polypeptide chains
  • H chain heavy chains
  • G, M, A, D and E different classes of immunoglobulins, G, M, A, D and E, each characterized by a particular heavy chain.
  • IgE has an epsilon (e) type heavy chain.
  • fragment "Fc" will be used to designate a dimer composed essentially of all or part of the region of an IgE going from the CH2 domain to the CH4 domain.
  • IgE has receptors on the surface of cells of the immune system: a high affinity receptor (FccRI) is present on mast cells, basophils and Langherans cells while a low affinity receptor (FceRII) is present on B lymphocytes, eosinophils, platelets and monocytes. IgE binds to their receptors via their Fcc region
  • IgE plays a central role in the allergic phenomenon, in particular they are one of the triggering factors of the acute allergic reaction, also called hypersensitivity reaction of type I.
  • antigen presenting cells transport the allergen and present it to T cells which in turn help B cells to produce allergen specific IgEs.
  • IgEs bind through their Fc region to the Fc ⁇ R1 receptors of mast cells.
  • a bridge is established between the Fc ⁇ RI receptors. This bypass triggers a degranulation reaction which releases mediators responsible for the clinical symptoms of an acute allergic reaction; there is in particular release of histamine.
  • Local allergy symptoms include, for example, allergic rhinitis and asthma, hives, atopic eczema, stimulation of the extremities of the nerves followed by pruritus and pain.
  • the first approach (i) has been studied in particular by RS Geha et al. (Nature Vol. 315, 1985, n ° 6020, 577-578) which describe the blocking of the Prausni tz-Kustner reaction caused by the cutaneous injection into humans of a serum containing the IgE antibodies to grasses, in the presence of an excess of a resulting non-glycosylated polypeptide of a bacterial expression of the human gene fragment encoding essentially the Fc ⁇ fragment, namely for the amino acid sequence 218-547 according to the definition of Bennich (Progress In Immunol. II Vol. I, 1974, 49- 58 and Int. Arch. Allergy App. Immunol. 53, 459), in the presence of the allergen. The authors recommend this approach because these peptide fragments are not immunogenic in humans. Other fragments derived from the Fc ⁇ fragment have been proposed in WO 88/00204.
  • WO 90/15878 (Stanworth) describes an oligopeptide of 10 amino acids of formula Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe; sequence identical to that of the CH4 domain of the ⁇ chain.
  • This oligopeptide behaves like a hapten and therefore must necessarily be conjugated to a carrier element to be used as an anti-allergic vaccine agent.
  • WO 93/5810 (Hellman) describes a peptide whose amino acid sequence is identical to that of the CH2-CH3 region of the ⁇ chain.
  • this peptide is used in a fused form with the glutathiontransferase of Schistosoma japonicum in the presence of complete or incomplete Freund's adjuvant.
  • the present invention relates to pharmaceutical compositions intended to favorably modify the intensity of the immune response against an allergen or the rate of synthesis of IgE. They are particularly suitable for the treatment or prevention of acute allergic reactions and the inflammatory diseases which may result therefrom.
  • the subject of the invention is a pharmaceutical composition which comprises, in an effective amount, and as a therapeutic or prophylactic agent for inducing an antiallergic vaccine effect, a polypeptide of which at least part of the amino acid sequence is derived from that of the monomer of the Fc ⁇ fragment of primate IgE, in particular human, and having, with respect to the native IgE naturally present in the human body or of primates, one or more neoantigenic sites or epi topes.
  • neo-oleic epitope (s) that the non-glycosylated polypeptide according to the invention has, compared to the Fc ⁇ fragment of IgE native, could be immunologically hidden epitopes in the native IgE naturally present in the primate's organism and / or neoepitopes resulting from conformational modifications of the polypeptide sequence, even in the case where the primary structure involved in this ear tope is found in native IgE.
  • a neoantigenic epi tope could be demonstrated by showing that a monoclonal antibody reacting with a polypeptide according to the invention (having an amino acid sequence identical to that of a region of the s chain) does not react with native IgE.
  • effective vaccinating quantity is meant, in the sense of the present invention, the quantity making it possible to ensure, in one or more injections, the protective effect sought after stimulation of the immune system.
  • the polypeptide of the composition according to the invention has a sequence of which a significant part, at least, can come from the Fc ⁇ fragment of a natural or monoclonal primate IgE, or else can be obtained by expression, in a recombinant vector , of a nucleic acid sequence encoding the derived sequence, or synthesized in any other way.
  • a nucleic acid sequence encoding the derived sequence or synthesized in any other way.
  • substantially the entire amino acid sequence of the polypeptide is derived from the reference sequence.
  • the sequence of the polypeptide preferably contains, or is constituted by, the integral or partial sequences of a domain, or more or all the domains CH2, CH3 and CH4 of the heavy chain ⁇ of IgE (human or primate). .
  • Examples of peptides used in the preparation of vaccine compositions according to the invention contain the sequence of the Fc ⁇ integral fragment of human IgE called Fc ⁇ CH2-CH4 (218-547); or the partial sequence of the Fc ⁇ CH2-CH4 fragment (Val 224 - Lys 547); Fc ⁇ CH2-CH4 (Ser 225 - Lys 547); Fc ⁇ CH2-CH4 (Val 234 - Lys 547); Fc ⁇ CH2-CH4 (Ser 226 - Lys 547) also designated by the internal reference rE.2.4 (7).
  • Fc ⁇ CH2-CH4 indicates that it contains a sequence corresponding to the fragment of the heavy chain s of human IgE which contains the three complete CH2 to CH4 domains.
  • Fc ⁇ CH2'-CH4 (Ser 226-Lys 547) or Fc ⁇ CH2'-CH4 (226-547) indicates that the fragment contains the human IgE sequence starting from the serine at position 226 and up to the ys i ne in pos iti on 547.
  • the aci of born friends are listed in accordance with the sequence identifier SEQ ID No. 1 which can be compared to the location of Bennich et al., Prog. Immunol.
  • amino acid sequence of the vaccine polypeptide according to the invention is derived from the sequence as shown in ID SEQ No. 1, from the amino acid at position 215 to the amino acid at position 547.
  • amino acid sequence of this polypeptide can consist of or include one of the following sequences, or be derived therefrom:
  • polypeptide has a sequence comprising at least 15, preferably 60 amino acids.
  • sequence of the polypeptides is relatively long.
  • the polypeptide may have a sequence comprising at least 100 amino acids, and in particular at least 220 amino acids.
  • said polypeptide is preferably in dimeric form.
  • amino acid identity of the different polypeptides according to the invention can vary in particular because of conservative substitutions which make it possible to conserve the skeletal conformation of the polypeptide.
  • a substitution in homologous position compared to the sequence of Bennich (1974, see above) is done with an amino acid having equivalent functionality with regard to its hydrophobic properties, load or spacing.
  • polypeptide useful for the purposes of the present invention may be able to present, relative to a native human IgE, at least one epigenome neoantigenic, it is in particular suitable for this polypeptide to be non-glycosylated or to have a glycosylate ion profile. different from a native human IgE.
  • the polypeptide will be non-glycosylated.
  • a non-glycosylated polypeptide means that it lacks the identical polysacchar chains attached to asparagines (Asn) present in the amino acid sequence of natural human IgE.
  • the IgE-derived polypeptide used in the preparation of the vaccine compositions of the present invention is capable of being immunogenic by. itself, and does not require. the use of carrier protein. It can therefore be in free form (uncoupled, non-fused or un-conjugated).
  • the presence of adjuvant is not essential and in particular not that of powerful adjuvants such as Freund's adjuvant, complete or incomplete.
  • the presence of a light adjuvant such as alum is however compatible with the invention.
  • the antibodies induced by the immunogenic agent according to the invention are capable of favorably modifying the intensity of the immune response mediated by IgE during the introduction of an allergen into the human body.
  • the antibodies induced by the vaccine compositions according to the invention are probably specific for epitopes immunologically hidden in the natural IgE present in the organism concerned, and / or specific to the conformation of the polypeptide used. Therefore, the antibodies induced do not recognize natural IgE in the same way as naturally occurring anti-IgE and have the advantage of not forming immune IgE / anti-IgE complexes with natural IgE.
  • the antibodies which can be used in a pharmaceutical composition according to the invention can be human antibodies obtained by immunization of donors whose antibodies can then be used for serotherapy or, preferably, for the preparation of an immunoglobulin composition obtained by purification donor serum, for example by immunoaffinity chromatography using IgE immobilized on columns.
  • the antibodies may however also be heterologous antibodies, for example murine or other antibodies, obtained by immunization from the polypeptides according to the invention.
  • heterologous antibodies can be monoclonal or polyclonal. They can be humanized according to conventional procedures.
  • selections of human antibodies can be made by removing circulating lymphocytes of a human donor immunized with the polypeptides according to the invention, obtaining sequences coding for the V L and H L chains and multi-combinatorial selection according to the techniques described, for example, by P. Waterhouse et al., Nucleic Acids Research, 1993 , Flight. 21 No. 9, 2265-2266.
  • Obtaining the identical polypeptide derivatives of IgE, according to the invention, is preferably carried out by the synthesis route of recombinant polypeptides.
  • a fragment of this gene or the entire gene is transferred into a chosen host cell.
  • a host cell is chosen which makes it possible to obtain non-glycosylated polypeptides.
  • the transformed host is preferably a prokaryote such as E. coli and more particularly the E. coli strains CAG 1139 and BL 21 which make it possible to obtain advantageous production rates.
  • Host cells are transformed by an expression vector ensuring the expression of an isolated DNA fragment coding for the immunogenic agent.
  • isolated DNA fragment is meant a DNA fragment which is no longer associated with all of the natural regions which control its expression in the organism from which it originates, that is to say in the case of examples given below, the human being.
  • vectors already well known to those skilled in the art which are adapted for use in the chosen host and suitable for expressing eukaryotic genes.
  • a prokaryotic type host it is particularly suitable to choose a bicistronic expression vector which makes it possible to guarantee a high level of expression and the production of eukaryotic polypeptides devoid of amino acids of heterologous origin.
  • the basic components of such a bicistronic expression vector system are a multicopy plasmid containing a strong promoter and a ribosome binding site, a synthetic sequence (first cistron) and the coding sequence of the polypeptide to be expressed (second cistron) .
  • the role of the first cistron is to produce an optimized sequence for the initiation of translation.
  • the accessibility of the ribosome to mRNA can be increased if the Shine-Dalgarno sequence and the AUG codon are located in the context of a region rich in AU free of local secondary structure.
  • the first cistron is used to separate the 5 'untranslated region from the coding sequence of the gene of interest. Thus, the possibility of forming a secondary structure between these regions is reduced.
  • Ribosomes attach to the ribosome binding site of the first cistron, initiate translation of the AUG codon, and translate the first cistron. At the end of it, the ribosomes are not dissociated and immediately initiate the translation of the second cistron.
  • the level of expression of the second cistron would be very sensitive to altering changes such as:
  • a particularly preferred bicistronic expression vector for use in E. coli is pWT211 Ncol Bis.
  • the transformed host cells are cultured on an appropriate medium and the recombinant polypeptide is recovered.
  • the renaturation of recombinant polypeptides derived from IgE after synthesis by transformed host cells only concerns the formation of disulfide bridges to obtain dimers and excludes the N-glycosylation of asparagines in the amino acid sequence.
  • the concentration relative to the ⁇ xydo-reducing couple used is preferably 2/1.
  • an oxidation-reduction couple which is particularly suitable for the recombinant polypeptides of IgE synthesized in E. coli mention may be made of the oxidized glutathione / DDT couple.
  • polypeptides derived from IgE in non-glycosylated form used according to the invention can also be obtained by enzymatic deglycosyt ion of the amino acid sequence of native IgE.
  • This preparation process is particularly suitable if it is envisaged to use the IgE heavy chain s or its Fc ⁇ CH2-CH4 fragment which is obtained after enzymatic cleavage of IgE by papain as non-gl ycosylated immunogenic agent.
  • the invention also relates to a method for treating or preventing type 1 hypersensitivity reactions, an inflammatory immune disease or a condition related to abnormal production of IgE, which comprises the act of administering, in an effective amount, a composition vaccine or an antibody composition according to the invention to a subject in need of such treatment.
  • the method of treatment or prevention of type 1 hypersensitivity reactions is quite different from a treatment of inhibition by competition with IgE by action on the Fc ⁇ Rl receptor, which requires the administration of high doses, where appropriate in localized areas of the body, of a polypeptide derived from the Fc ⁇ fragment of IgE.
  • a disorder linked to an abnormal production of IgE one can cite the case of patients infected with the HIV virus, who very often have abnormally high levels of IgE. These conditions include, without limitation, severe sinusitis, bronchopneunomias, as well as all allergic manifestations and inflammatory immune diseases frequently encountered in these patients.
  • the present invention also recommends treating subjects infected with HIV and having an abnormally high level of IgE, including in the apparent absence of a disorder linked to these immunoglobulins, since authors have observed a decrease in survival from 24 months in subjects with an IgE level higher than 150 KIU / 1 compared to subjects having a level lower than this value.
  • the vaccine composition according to the invention can be manufactured in a conventional manner.
  • the immunogenic agent used can be combined with a diluent or a pharmaceutically acceptable carrier such as, for example, a pyrogenic physiological saline solution.
  • a vaccine composition according to the invention may contain usual components such as a buffer, a preservative or stabilizer, if necessary, a lyophilization excipient.
  • the immunogenic agent can be stored in the presence of a diluent, a support or a component as previously mentioned. Alternatively, a diluent, carrier or component can be added just before use.
  • composition essentially consisting of an immunogenic agent in the form of said non-glycosylated polypeptide
  • composition comprising at least one component selected from a pharmaceutically acceptable diluent or carrier, a component having a buffering capacity, a preserving or stabilizing agent;
  • a vaccine composition according to the invention may contain an immunogenic agent other than the immunogenic agent in the form of a non-glycosylated polypeptide derived from IgE, as for example in the case of a polyvalent vaccine.
  • a vaccine composition according to the invention can also contain several different immunogenic agents, all being non-glycosylated polypeptides derived from IgE.
  • a vaccine composition according to the invention can be administered by any conventional route used in the field of vaccines.
  • a vaccine composition according to the invention is administered by the general or optionally local, subcutaneous, intramuscular or intravenous route in the form of an injectable suspension for example.
  • the administration can take place in single dose or repeated one or more times after a certain interval of interval.
  • the appropriate dosage varies depending on various parameters, such as the individual to be treated or the method of administration. However, it can be indicated that good results can be obtained with a unit dose of 0.5 to 5 or 10 ⁇ g / kg of immunogenic agent in a volume compatible with the injection.
  • the unit dose may, for example comprise, in a volume of an injectable liquid vehicle, an amount between 10 and 500 ⁇ g polypeptu polypeptide, preferably from 25 to 250 ⁇ g, and in particular from 50 to 125 ⁇ g.
  • a subject of the invention is also the use, as described above, of the polypeptide defined above, for the preparation of a vaccine composition according to the invention.
  • the object of the present invention is illustrated by the following examples, which are given by way of illustration only. They refer to Figures 1 to 5 where Figure 1 shows the restriction map of the expression vector pWT211 Ncol; FIG. 2 comprises the restriction map of the bicistronic expression vector PWT211 Ncol Bis and the sequence of the promoter; FIG. 3 summarizes the different non-glycosylated polypeptides derived from human IgE expressed in the examples; FIG.
  • FIG. 4 represents the chromatogram obtained by reverse phase chromatography of the renatured extract of Fc ⁇ CH2'-CH4 (226-547) eluted at 70 mM NaCl on a Q-Sepharose column containing 220 ⁇ g of total proteins;
  • FIG. 5 shows the chromatogram obtained by reverse phase chromatography of the Fc ⁇ CH2'-CH4 (226-547) purified after removal of the contaminant of 14,000 daltons by chromatography on Superdex 75.
  • RNA was isolated from a human myeloma 266BL which synthesizes ND type IgE as described in JH Kenten, Proc. Natl. Acad. Sci. US 79, (1982), p 6661.
  • the messenger RNA (mRNA) is purified by chromatography on an oligo dT column. After separation of MRNA on a sucrose gradient, a fraction enriched in mRNA coding for the heavy chain s is copied into complementary DNA (cDNA). This cDNA is cloned into a plasmid and transformed into E. coli.
  • a synthetic probe (ol igonucl éot ide) deduced from the N-terminal protein sequence of IgE which is described in Bennich, Progress in Immunology II, Vol I, (1974), p 49, is used to screen the library of CDNA.
  • a synthetic probe (ol igonucl éot ide) deduced from the N-terminal protein sequence of IgE which is described in Bennich, Progress in Immunology II, Vol I, (1974), p 49, is used to screen the library of CDNA.
  • a synthetic probe (ol igonucl éot ide) deduced from the N-terminal protein sequence of IgE which is described in Bennich, Progress in Immunology II, Vol I, (1974), p 49, is used to screen the library of CDNA.
  • a cDNA of 2 Kb coding for the complete heavy chain s In other words, coding for the 5 'and 3' untranslated regions of the mRNA,
  • the plasmid expressing the fcs CH2-CH4 fragment (218-547) is selected and called pSC213.
  • the Fc ⁇ fragment analyzed by electrophoresis after staining with Coomassie blue has a molecular weight of 40 KD (Keuton J. PNAS 1984 - 81 p 2955).
  • the Fc ⁇ CH2-CH4 fragment (218-547) maintained a cysteine which in natural IgE forms a disulfide bridge with a cysteine from the CH1 domain, absent in Fc ⁇ CH2-CH4. This cysteine 225 is replaced by a serine 225.
  • the HindIII restriction site and the BglII restriction site which has the cloned Fc ⁇ CH2-CH4 (218-547) gene are used to replace cysteine with serine.
  • a 59 bp HindIII-BglII fragment is deleted, which contains the triplet coding for cysteine 225.
  • the deleted fragment is replaced by a 35 bp synthetic "linker" having a mutation from a G base to C at codon level of interest.
  • the fragment Fc ⁇ CH2'-CH4 (Ser 225-Lys 547) represented in FIG. 5 is thus obtained.
  • Expression in pSC213 results in a fusion polypeptide which contains seven amino acids of the trpE gene plus two amino acids which result from the creation of the Hind III restriction site.
  • an Ncol cloning site is created by site-directed mutagenesis at the ATG codon. This site can be used for cloning polypeptides derived from IgE according to the invention in place of the HindIII site.
  • the creation of the Ncol site is carried out from the starting vector pWT211.
  • the plasmid pWT211 has two unique restriction sites (PstI and BamHI) located on either side of the initiation codon, sites which are also present in the polylinker of phage M13.
  • PstI and BamHI Two unique restriction sites located on either side of the initiation codon, sites which are also present in the polylinker of phage M13.
  • a 1500 bp PstI-BamHI fragment is therefore cloned into M13mp18 (J. Messing, Methods Enzymol. 101, (1983), p 20).
  • Figure 1 shows the good clones obtained (9 out of 18) after preparation of single-stranded DNA.
  • the insertion of the fragment to be mutated is also controlled by sequence with the universal primer M13.
  • the ol igonucleot ide muteur as identified under SEQ ID no 2 allowing the creation of the Ncol site differs from two bases around the initiation codon compared to the original sequence. Mutagenesis is carried out according to the T.A. Kunkel protocol, Methods Enzymol. 154, (1987), p 367. Vector pWT211
  • This method uses single-stranded template DNA (phage M13) where part of the thymine residues are replaced by uracils.
  • This recombinant bacteriophage is produced in the strain of E. coli CJ 236 (TA Kunkel et al., Methods Enzymol. 15'4, (1987), p 367) carrying the mutations dut- and ungA
  • This strain is deficient in uracyl-N-glycosylase, an enzyme replacing uracils by thymines in normal time.
  • the uracilated single-stranded DNA containing the mutant fragment is used as a template in a standard mutagenesis process to generate a heteroduplex formed of a uracyl strand and a strand synthesized in vitro containing thymines.
  • the transformation of this DNA into a JM101 strain in Maniatis ung causes the destruction of the template strand, which results in a consequent decrease in the production of wild phages; most of the phages formed are derived from the non-uracyl strand.
  • these recombinant phages carry the desired mutations.
  • sequencing is one of the methods for verifying the presence of mutations. For example, out of 13 single strands isolated after mutagenesis, 7 of 13 clones have the mutations, seen on two tracks C and G.
  • the mutated 1500 bp fragment is reinserted into the vector pWT211 between the PstI and BamHI sites after PCR (polymer chain reaction) on the single-stranded DNA M13.
  • the 1,500 bp are amplified using universal and reverse primers M13 and digested by the two enzymes used for cloning.
  • the good clones are checked on agarose gel after digestion with PstI and Ncol (bands of 1,200 and 2,800 bp) and sequenced at the Ncol site.
  • the correctly mutated plasmid is selected and named pWT211 Ncol and its restriction map is shown in Figure 1.
  • Fc ⁇ CH2 '-CH4 (Val 224 - Lys 547) in the plasmid pWT211 Ncol
  • the vector is cut with Ncol and Bam HI, sites chosen for their ease of digestion after amplification by PCR.
  • a 371 bp portion of plasmid located in the tetracycline resistance gene is thus eliminated.
  • Fc ⁇ CH2 '-CH4 (Val 224 - Lys 547) is amplified by PCR to create the Ncol and BamHI sites.
  • the sequence of the oligonucleotide ide located at the level of NcoI is chosen so that the open reading phase and the integrity of the cloning site are preserved.
  • Fc ⁇ CH2 '-CH4 (Val 224 - Lys 547) is expressed in the layers of E. coli CAG 1139 (AD Grossman et al., Cell 32, (1983), p 151) or BL 21 (FW Studier, J. Mol. Biol. 189, (1986), p 113); the protein is free of amino acids of E. coli.
  • Example 2 Construction of an expression vector
  • a bicistronic vector which makes it possible to express the non-glycosylated polypeptide derived from IgE in E. coli is the
  • PWT211 Ncol Bis To prepare it, the plasmid pWT211NcoI is digested with the restriction enzyme NcoI at the site created by mutagenesis directed according to example 1. This is followed by insertion of a 42 bp synthetic double-stranded "linker" containing the seven amino acids of trpE, a second Shine-Dalgarno sequence and TAA termination codons in the three phases. The insertion is easily controlled on agarose gel after digestion by
  • FIG. 2 gives the restriction map of the plasmid pWT2 llNcoIBi s and the sequence SEQ ID No. 3 at the level of the bicistronic promoter.
  • Example 3 Preparation of a bicistronic vector coding for the polypeptides derived from Ige.
  • bicistronic vector we use pWT211 Ncol
  • Fc ⁇ CH2'-CH4 (Ser 226 - Lys 547) is also expressed.
  • the plasmid thus expressed is called pE2-4 (7).
  • Fc ⁇ CH2'-CH4 (226-547) corresponds to the sequence of the respective native human IgE and is expressed at 20% in the form of inclusion bodies.
  • the microsequencing of the 5 ′ end of the recombinant polypeptides shows that the N-terminal methionine is quantitatively cleaved in vivo in the bacterium.
  • FIG. 3 summarizes the constructions made as an illustration of the present invention.
  • Polongides derived from IgE in nonglycosylated form are obtained by enzymatic deglycosylation. For this purpose, 200 ⁇ g / ml of IgE in 0.55 M sodium phosphate pH 8.6 are incubated with 15 U / ml N-glycosydase F (N-Glycanase, Genzyme Corp.) overnight at 37oC. The deglycosylated IgE is then absorbed with an excess of Lentil Lectin Sepharose 4B (Sigma Chemical Comp.) At 4 ° C. on a rotator.
  • IgE can be fragmented with papain into Fab and Fc fragments (Ishizaka et al. 1970, Immunochem., Vol. 7: p 687).
  • Example 5 Preparation of non-recombinant polypeptides glycosylates derived from human IgE.
  • the E. coli BL21 or CAG 1139 strain is transformed with the bicistronic expression vector WT211NcoIBis prepared in Example 2 according to the transformation methods well known to those skilled in the art.
  • 100 ⁇ l of a preculture cultivated at 37 ° C. in LB medium plus ampicillin for 18 to 24 hours are seeded in 10 ml of M9 medium (Miller JH (1972) Experiments in Molecular Genetics (Cold Springer NY) containing 50 ⁇ l / ml of ampici 11 ine or carbenici 11 ine 50 ⁇ g / ml.
  • Two 10 ml tubes of preculture are used to inoculate 1 liter of culture which is incubated at 37 ° C. with shaking until the OD (600 nM) reaches 0, 2 - 0.3.
  • the cultures are again incubated at 37 ° C. with shaking in an incubator for 5 to 6 hours until an optical density measured at 600 nm equal to 2.0.
  • the expressed recombinant IgE derivatives are aggregated in the form of inclusion bodies in the bacteria and present 20% of the total proteins.
  • the recombinant IgE derivatives thus synthesized are recovered by extraction according to D. Bohmann et al (1988), Transcriptional regulation by the AP-1 family of enhancer bindings proteins: a nuclear targer for signal transduction. Cold Spring Harbor Symp Quant. Bio 53, 695-700.
  • the bacteria are collected by centrifugation at 4,200 rpm for 15 min.
  • the pellets are resuspended in 7.2% of the initial culture volume using buffer A (10 mM Tris HCl; pH 7.9; 25% sucrose, 100 mM KC1, PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) 2 mM) then, after complete dissolution, solution B is added (Tris HCl 300 mM; pH 7.9 ; EDTA 100 mM, lysozyme 4 mg / ml). It is left in contact for 10 min at 0 ° C. before adding solution C (1M LiCl; 20mM EDTA, 0.5% NP40 (Nonidet nonylphenyl polyethylene glycol).
  • buffer A 10 mM Tris HCl; pH 7.9; 25% sucrose, 100 mM KC1, PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) 2 mM
  • solution B Tris HCl
  • the bacterial suspension is sonicated for 3 min in ice.
  • the inclusion bodies containing the recombinant proteins rE2-4 (7) are collected by centrifugation at 10,000 rpm for 10 min at 4oC.
  • the pellets are washed twice in buffer D (10 mM Tris HC1; pH 7.9; 0.1 mM EDTA; 0.5 M LiCl; 0.5% NP40, 1 mM DTT, 1 mM PMSF). After resuspension, the solution is sonicated as above, then washed twice in buffer E (10 mM Tris HCl, (pH 7.9) 0.1 M EDTA, 0.5% NP40.1 mM DTT, 1 mM PMSF. After resuspension, the pellet obtained is frozen and stored at -80oC.
  • buffer D 10 mM Tris HC1; pH 7.9; 0.1 mM EDTA; 0.5 M LiCl; 0.5% NP40, 1 mM DTT, 1 mM PMSF.
  • the frozen pellet is thawed in crushed ice and then dissolved at 30 ° C. with PEB buffer (Pellet Extraction Buffer, Tris HC1 50 mM; pH 7.9; 8M urea; 1 mM EDTA; 0.5 M NaCl (fig 3) PMSF 25 ⁇ g / ml) at a rate of 20 ml of buffer per liter of culture. After dissolution, DTT is added to the final concentration of 10 mM and left in contact for 1 hour at room temperature.
  • PEB buffer Phase Extraction Buffer, Tris HC1 50 mM; pH 7.9; 8M urea; 1 mM EDTA; 0.5 M NaCl (fig 3) PMSF 25 ⁇ g / ml
  • the renaturation is carried out by dilution to a protein concentration of 30 ⁇ g / ml in a buffer whose final concentration is: Tris HC1 50 mM; pH 8.5; 1 mM EDTA; NaCl, 0.1 M; PMSF 25 ⁇ g / ml; 0.8 M urea; 0.5 mM oxidized glutathione; DTT 0.25 mM.
  • a buffer whose final concentration is: Tris HC1 50 mM; pH 8.5; 1 mM EDTA; NaCl, 0.1 M; PMSF 25 ⁇ g / ml; 0.8 M urea; 0.5 mM oxidized glutathione; DTT 0.25 mM.
  • Example 6 Purification of non-glycosylated recombinant polypeptides derived from IgE.
  • the polypeptides obtained according to Example 5 are subjected to chromatography on an anion exchanger Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia) with an application buffer F (Tris 20 mM; pH 8.5; 30 mM NaCl) which allows the dimers to cling to the column while maintaining correct stability.
  • an application buffer F Tris 20 mM; pH 8.5; 30 mM NaCl
  • the same buffer F with a linear increasing NaCl concentration is used as gradient.
  • the elution of the fraction enriched in dimer is done when the NaCl concentration reaches 70 mM.
  • the column is washed with 20 mM Tris buffer (pH 8.5) 1 M NaCl.
  • Vervet monkeys C1-C2-C5-C7-C10 are immunized with the recombinant polypeptides purified according to Example 6; the protocol followed is as follows as illustrated with Fc ⁇ CH'2-CH4 (226-547):
  • the recombinant polypeptide (internal reference r E 2-4 (7), prepared according to Example 5, myeloma IgE or the sera of monkeys immunized with Fc ⁇ CH2 '-CH4 (226-547) according to Example 7.1 have been tested for their ability inhibit the passive cutaneous anaphylaxis (PCA) reaction in monkeys (Ishizaka K. et al., J. Allergy, 1967, 39, 254).
  • PCA passive cutaneous anaphylaxis
  • the test was carried out in the Vervet monkey, the passive cutaneous anaphylaxis reaction was induced by intradermal injection of serum from atopic patients followed 24 hours later by the specific allergen Dptero, also at the same site of inoculation. intradermally.
  • the visualization of erythema is carried out by intravenous injection of an Evans blue solution. Reading is done by measuring the diameter of the bluish papules at the intradermal injection points, and calculating the corresponding areas. For negative controls, the reagents are replaced with a 9% NaCl solution.
  • the inhibition of ACP is measured by injection at the same site of inoculation, intradermally, of the recombinant polypeptide rE2-4 (7), or of the sera of the monkeys immunized at different dilutions, or of the IgE of a human myeloma (Guill) 1 hour before sensitization by serum of atopic patients and the allergen according to the protocol described for the induction of PCA.
  • the PCR test is significantly inhibited from 140 nM. for myeloma IgE and 14 nM. for the recombinant peptide, indicating that a dose of rE2-4 (7) is required approximately 100,000 times greater than that specific IgE, to inhibit the PCR reaction in the Vervet monkey.
  • the recombinant polypeptide Fc ⁇ CH2'-CH4 (226-547) carries epitopes capable of inducing antibodies neutralizing the hypersensitivity reaction of t ype 1.

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Abstract

La présente invention concerne une composition vaccinale qui se prête utile pour traiter ou prévenir les réactions d'hypersensibilité de type 1 médiées par les immunoglobulines E, les maladies immunitaires inflammatoires, et pour moduler la synthèse des IgE. L'invention concerne également les anticorps spécifiques induits par l'agent immunogène de la composition vaccinale, ainsi que l'agent immonogène utilisé et un procédé de préparation pour l'obtenir. L'agent immunogène est un polypeptide non glycosylé ou partiellement glycosylé dérivé du fragment Fc de l'IgE humaine ou de primate.

Description

Vaccin anti-allergique
La présente invention a pour objet des compositions pharmaceutiques principalement destinées au traitement ou à la prévention des réactions allergiques notamment médiées par les immunoglobulines E (IgE), ainsi que des maladies immunitaires, notamment inflammatoires, qui en découlent. Dans certains cas, ces compositions pourraient être aussi utilisées pour moduler la production d'IgE par l'organisme, en particulier pour lutter contre les pathologies liées à la production anormale des IgE.
D'une manière générale, on sait que les anticorps produits par un organisme sont des immunoglobulines. Une molécule d' immunoglobul ine est formée de deux chaînes polypept idiques légères (chaîne L) et de deux chaînes lourdes (chaîne H) dans une configuration "Y". Il existe différentes classes d' immunoglobul inés, G, M, A, D et E, chacune caractérisée par une chaîne lourde particulière. L'IgE possède une chaîne lourde de type epsilon (e).
Toute immunoglobul i ne clivée à la papaine génère un fragment constant Fc et deux fragments Fab. Dans la suite du texte le terme fragment "Fc" sera utilisé pour désigner un dimère composé pour l'essentiel de tout ou partie de la région d'une IgE allant du domaine CH2 au domai ne CH4 .
Les IgE pos sèden t des récepteurs à la surface des cellules du système immunitaire : un récepteur de haute affinité (FccRI) est présent sur les mastocytes, les basophiles et les cellules de Langherans tandis qu'un récepteur de basse affinité (FceRII) est présent sur les lymphocytes B, les eosinophi les, les plaquettes et les monocytes. Les IgE se fixent sur leur récepteurs par l'intermédiaire de leur région Fcc
Lors d'une deuxième exposition à un antigène certains individus développent une raction allergique qui peut prendre des formes variées ; elle peut être notamment aussi bien aiguë que chronique. Les IgE jouent un rôle central dans le phénomène allergique, en particulier elles sont un des facteurs déclenchants de la réaction allergique aiguë, aussi appelée réaction d'hypersensibilité de type I.
En bref, des cellules présentatrices d'antigène transportent l'allergène et le présentent aux cellules T qui à leur tour, aident les lymphocytes B à produire des IgE spécifiques de l'allergène. Ces IgE se lient par leur région Fc aux récepteurs FcεRl des mastocytes. Quand ces IgE liées aux mastocytes interagi ssent ultérieurement avec le même allergène, un pontage s'établit entre les récepteurs FcεRI. Ce pontage déclenche une réaction de dégranulation qui libère des médiateurs responsables des symptômes cliniques d'une réaction allergigue aiguë ; il y a notamment relargage d'histaminé.
Les symtômes d'allergie locale incluent, par exemple, la rhinite et l'asthme allergiques, l'urticaire, l'eczéma atopique, la stimulation des extrémités des nerfs suivie de prurit et de douleurs.
Lors d'une administration systémique d'antigène, certains individus réagissent par une chute de la tension, un col lapsus, des bronchospasmes, voire un choc anaphylactique mortel.
Dans le cas d'une allergie alimentaire des symptômes apparaissent, tels que le prurit et le gonflement des lèvres, de la bouche et de la langue, des nausées et des vomissements, et des douleurs abdominales.
Les traitements actuels de l'allergie consistent, soit à traiter les symptômes par des inhibiteurs des médiateurs libérés, soit à augmenter la tolérance à un antigène spécifique par désensibilisation. Des développements plus récents permettent d'envisager une intervention plus en amont dans le but de traiter les causes de l'allergie au lieu des symptômes.
A cette fin, on a déjà proposé d'intervenir au niveau de l'interaction entre les IgE spécifiques et leurs récepteurs,
(i) en utilisant un fragment Fcε non-immunogène à titre de compétiteur pour la fixation sur les récepteurs des IgE,
(ii) en utilisant des anticorps monoclonaux anti-IgE ou anti-FcεRl ou II, empêchant l'interaction des IgE avec leurs récepteurs, ou
(iii) en utilisant des anticorps monoclonaux réduisant la synthèse des IgE par les lymphocytes B.
La première approche (i) a été étudiée notamment par R. S. Geha et al. (Nature Vol. 315, 1985, n° 6020, 577-578) qui décrivent le blocage de la réaction de Prausni tz-Kustner provoquée par l'injection cutanée chez l'homme d'un sérum contenant les anticorps IgE aux graminés, en présence d'un excès d'un polypeptide non glycosylé résultant d'une expression bactérienne du fragment de gène humain codant pour l'essentiel du fragment Fcε, à savoir pour la séquence d'acides aminés 218-547 selon la définition de Bennich (Progress In Immunol . II Vol. I, 1974, 49-58 et Int. Arch. Allergy App. Immunol. 53, 459), en présence de l'allergène. Les auteurs préconisent cette approche du fait que ces fragments peptidiques ne seraient pas immunogènes chez l'homme. D'autres fragments dérivés du fragment Fcε ont été proposés dans WO 88/00204.
D'autre part, WO 90/15878 (Stanworth) décrit un oligopeptide de 10 acides aminés de formule Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe ; séquence identique à celle du domaine CH4 de la chaîne ε. Cet oligopeptide se comporte comme un haptène et, par conséquent, il doit être nécessairement conjugué à un élément porteur pour être utilisé comme agent vaccinal anti-allergique.
WO 93/5810 (Hellman) décrit un peptide dont la séquence d'acides aminés est identique à celle de la région CH2-CH3 de la chaîne ε. A des fins vaccinales, ce peptide est utilisé sous forme fusionnée avec la glutathiontransférase de Schistosoma japonicum en présence d'adjuvant de Freund complet ou incomplet.
En modifiant le profil de glycosylation d'un fragment Fcε humain, on a maintenant trouvé un moyen pour rendre immunogène ce fragment Fcε chez l'homme, vraisemblablement en démasquant des épitopes néoantigéniques. De plus, il a été trouvé que, ce fragment Fcε rendu immunogène induit des anticorps qui reconnaissent les IgE natives mais qui ne forment pas, avec ces IgE natives, des complexes immuns susceptibles d'induire des réactions indésirables telles que le relargage d'histamine.
Un fragment Fcε rendu immunogène pour l'organisme dont il est issu pourrait donc être utilisé :
(i) soit en tant qu'agent vaccinal,
(ii) soit pour générer in vitro des anticorps qui alors seraient utiles dans des traitements d'immunisation passive.
D'une manière générale, la présente invention concerne des compositions pharmaceutiques destinées à modifier favorablement l'intensité de la réponse immunitaire à l' encontre d'un allergène ou le taux de synthèse des IgE. Elles se prêtent de manière toute particulière au traitement ou à la prévention des réactions allergiques aiguë et des maladie inflammatoires qui peuvent en découler.
En premier lieu l'invention a pour objet une composition pharmaceutique qui comprend, en quantité efficace, et à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique pour induire un effet vaccinal antiallergique, un polypeptide dont une partie au moins de la séquence d'acides aminés est dérivée de celle du monomère du fragment Fcε de l'IgE de primates, notamment humain, et présentant, par rapport à l'IgE native naturellement présente dans l'organisme humain ou de primates, un ou des sites ou épi topes néoantigéniques.
Il est supposé que le ou les épitopes néoant ignéiques que le polypeptide non glycosylé selon l'invention présente, par rapport au fragment Fcε des IgE natives, pourraient être des épitopes immuno logiquement dissimulés dans l'IgE native naturellement présente dans l'organisme du primate et/ou des néoépitopes résultant de modifications conformât ionnel les de la séquence polypeptidique, même dans le cas où la structure primaire impliquée dans cet épi tope se retrouve dans les IgE natives.
En d'autres termes, un épi tope néoantigénique pourrait être mis en évidence en montrant qu'un anticorps monoclonal réagissant avec un polypeptide selon l'invention (ayant une séquence d'acides aminés identique à celle d'une région de la chaîne s) ne réagit pas avec une IgE native.
Par quantité vaccinante efficace on entend, dans le sens de la présente invention, la quantité permettant d'assurer, en une ou plusieurs injections, l'effet protecteur recherché après stimulation du système immunitaire.
Par "séquence dérivée" de la séquence de référence du monomère dudit fragment Fcε de l'IgE on entend :
(i) la séquence de référence dans son intégralité,
(ii) une séquence partielle, incluse dans la séquence de référence ; ou
(iii) une séquence présentant un degré d'homologie d'au moins 98 % avec la séquence de référence ou des séquences partielles de cette dernière. A titre d'exemple des fragments Fcε de primates sont considérés comme homologues des séquences humaines.
On comprend donc que le polypeptide de la composition selon l'invention présente une séquence dont une partie importante, au moins, peut provenir du fragment Fcε d'une IgE naturelle ou monoclonale de primate, ou bien peutêtre obtenue par expression, dans un vecteur recombinant, d'une séquence d'acide nucléique codant pour la séquence dérivée, ou synthétisés de toute autre manière. De préférence sensiblement la totalité de la séquence d'acides aminés du polypeptide est dérivée de la séquence de référence.
Préfèrent iel lement la séquence du polypeptide contient, ou est constituée par, les séquences intégrales ou partielles d'un domaine, ou plusieurs ou tous les domaines CH2, CH3 et CH4 de la chaîne lourde ε de l'IgE (humaine ou de primate). De préférence l'un au moins des domaines CH2 et CH3 est présent.
Des exemp l es de po l ypept ides utilisés dans la préparation de compositions vaccinales selon l'invention contiennent la séquence du fragment Fcε intégral de l'IgE humaine dénommée Fcε CH2-CH4 ( 218-547 ) ; ou la séquence partielle du fragment Fcε CH2-CH4 (Val 224 - Lys 547) ; Fcε CH2-CH4 (Ser 225 - Lys 547) ; Fcε CH2-CH4 (Val 234 - Lys 547) ; Fcε CH2-CH4 (Ser 226 - Lys 547) également désigné par la référence interne rE.2.4(7).
Selon la nomenclature adoptée dans la présente demande de brevet un polypeptide recombinant appelé Fcε CH2-CH4 indique qu'il contient une séquence correspondant au fragment de la chaîne lourde s de l'IgE humaine qui contient les trois domaines CH2 à CH4 complets. Fcε CH2'-CH4 (Ser 226-Lys 547) ou Fcε CH2'-CH4 (226-547) indique que le fragment contient la séquence d'IgE humaine à partir de la serine en position 226 et jusqu ' à l a l ys i ne en pos i t i on 547 . Les ac i des ami nés sont énumérés conformément à l'identificateur de séquence SEQ ID nº 1 que l'on peut rapprocher du repérage de Bennich et al., Prog. Immunol. vol 1, Ed. North Holland, Amsterdam, (1974), p 49. De préférence la séquence d'acides aminés du polypeptide du vaccin selon l'invention est dérivée de la séquence telle que montrée dans 1 ' ID SEQ n° 1, de l'acide aminé en position 215 à l'acide aminé en position 547.
A titre d'exemple la séquence d'acides aminés de ce polypeptide peut être constituée par ou comporter l'une des séquences suivantes, ou en être dérivée :
- de l'acide aminé en position 218 à l'acide aminé en position 547,
- de l'acide aminé en position 224 à l'acide aminé en position 547,
- de l'acide aminé en position 226 à l'acide aminé en position 547,
- de l'acide aminé en position 234 à l'acide aminé en position 547,
- de l'acide aminé en position 330 à l'acide aminé en position 547,
- de l'acide aminé en position 358 à l'acide aminé en position 547,
- de l'acide aminé en position 418 à l'acide aminé en position 547,
- de l'acide aminé en position 438 à l'acide aminé en position 547,
- de l'acide aminé en position 215 à l'acide aminé en position 330,
- de l'acide aminé en position 218 à l'acide aminé en position 330,
- de l'acide aminé en position 226 à l'acide aminé en position 330, ou
- de l'acide aminé en position 234 à l'acide aminé en position 330, - de l'acide aminé en position 300 à l'acide aminé en position 500.
De préférence ie polypeptide a une séquence comprenant au moins 15, de préférence 60 acides aminés.
On préfère que la séquence des polypeptides soit relativement longue. Par exemple le polypeptide peut avoir une séquence comprenant au moins 100 acides aminés, et notamment au moins 220 acides aminés.
Dans la composition selon l'invention ledit polypeptide est préférentiel lement sous forme dimérique.
L'identité d'acides aminés des différents polypeptides selon l'invention peut varier notamment à cause de substitutions conservatrices qui permettent de conserver la conformation squelettique du polypeptide. Ainsi, de fagon préférée, dans les agents immunogènes selon l'invention une substitution en position homologue, comparée à la séquence de Bennich (1974, voir supra) se fait avec un acide aminé ayant une fonctionnalité équivalente en ce qui concerne ses propriétés hydrophobiques, de charge ou d'espacement. On choisit par exemple parmi le groupe des acides aminés hydrophobes entre alanine, isoleucine, leucine, méthionine, phénylalanine, proline, tryptophane et valine ; parmi le groupe des acides aminés polaires non chargés entre asparagine, cystéine, glutamine, glycine, serine, thréonine et tyrosine ; parmi les acides aminés chargés positivement entre arginine, histidine et lysine ; parmi les acides aminés chargés négativement entre acide aspartique et acide glutamique et parmi le groupe des acides aminés d'espacement éguivalent entre alanine, glycine et serine.
Des modifications telles que des délétions ou des insertions peuvent également intervenir. Afin que le polypeptide utile aux fins de la présente invention puisse présenter par rapport à une IgE humaine native, au moins un épi tope néoant igénique, il convient notamment que ce polypeptide soit non-glycosylé ou qu'il possède un profil de glycosy lat ion différent d'une IgE humaine native. De préférence, le polypeptide sera non glycosylé.
Un polypeptide non glycosylé signifie qu'il est dépourvu des chaînes polysacchar idiques attachées aux asparagines (Asn) présentes dans la séquence d'acides aminés de l'IgE humaine naturelle.
Contrairement à ce que l'on pouvait supposer, le polypeptide dérivé de l'IgE utilisé dans la préparation des compositions vaccinales de la présente invention est capable d'être immunogène par. lui-même, et ne nécessite pas. l'utilisation de protéine porteuse. Il peut donc être sous forme libre (non couplé, non-fusionné ou non-conjugué). De même la présence d'adjuvant n'est pas indispensable et notamment pas celle des adjuvants, puissants tels que l'adjuvant de Freund, complet ou incomplet. La présence d'un adjuvant léger tel gue l'alun est cependant compatible avec l'invention.
Les anticorps induits par l'agent immunogène selon l'invention sont capables de modifier favorablement l'intensité de la réponse immunitaire médiée par les IgE lors de l'introduction d'un allergène dans l'organisme humain.
Les anticorps induits par les compositions vaccinales selon l'invention sont vraisemblablement spécifiques d'épitopes immunologiquement dissimulés dans l'IgE naturelle présente dans l'organisme concerné, et/ou spécifiques de la conformation du polypeptide utilisé. De ce fait, les anticorps induits ne reconnaissent pas l'IgE naturelle de la même façon que les anti-IgE naturellement présents et ont l'avantage de ne pas former des complexes immuns IgE/anti-IgE avec les IgE naturelles.
Ces anticorps ne risquent pas d' induire les effets secondaires présumés des auto-anticorps anti-IgE induits par les vaccins de l'art antérieur.
Ces anticorps ne provoquent pas de libération de médiateurs et peuvent être utilisés dans des compositions pharmaceutiques destinées à une immunisation protectrice passive d'un organisme. Une autre application serait de les utiliser dans des immunopurifications par chromatographie d'agents immunogènes conformes à la présente invention.
Les anticorps utilisables, dans une composition pharmaceutique selon l'invention peuvent être des anticorps humains obtenus par immunisation de donneurs dont les anticorps peuvent être utilisés ensuite pour une sérothérapie ou, de préférence, pour la préparation d'une composition d' immunoglobulinés obtenue par purification du sérum des donneurs, par exemple par chromatographie d' immuno-affinité utilisant des IgE immobilisées sur colonnes.
Les anticorps peuvent cependant également être des anticorps hétérologues, par exemple des anticorps murins ou autres, obtenus par immunisation à partir des polypeptides selon l'invention. Ces anticorps hétérologues peuvent être monoclonaux ou polyclonaux. Ils peuvent être humanisés selon les procédures classiques.
Enfin des sélections d'anticorps humains peuvent être effectuées par prélèvement de lymphocytes circulants d'un donneur humain immunisé par les polypeptides selon l'invention, obtention des séquences codant pour les chaînes VL et HL et sélection multicombinatoire selon les techniques décrites, par exemple, par P. Waterhouse et al., Nucleic Acids Research, 1993, Vol. 21 N° 9, 2265-2266.
L'obtention des dérivés polypept idiques de l'IgE, selon l'invention, s'effectue, de préférence, par la voie de synthèse de polypeptides recombinants.
A partir d'un gène clone codant pour la chaîne lourde s d'IgE humaine ou de primate, un fragment de ce gène ou le gène entier sont transférés dans une cellule hôte choisie. De préférence on choisit une cellule hôte qui permet d'obtenir des polypeptides non glycosylés.
Préfèrent iel lement l'hôte transformé est un procaryote tel que E. coli et plus particulièrement lessouches E. coli CAG 1139 et BL 21 qui permettent d'obtenir des taux de production intéressants.
Des cellules hôtes sont transformées par un vecteur d'expression assurant l'expression d'un fragment d'ADN isolé codant pour l'agent immunogène.
Par fragment d'ADN isolé on entend un fragment d'ADN qui n'est plus associé à l'ensemble des régions naturelles qui contrôlent son expression dans l'organisme dont il est issu, c'est-à-dire dans le cas des exemples repris ci-dessous, l'être humain.
Parmi les fragments d'ADN isolés qui comprennent une séquence codant pour un agent immunogène il faut citer en particulier l'ADN qui est repris dans la liste d'identification des séquences sous le numéro SEQ ID nº 1.
Comme vecteur d'expression il convient d'utiliser des vecteurs déjà bien connus de l'homme de métier qui sont adaptés pour être utilisés dans l'hôte choisi et qui conviennent pour exprimer des gènes eucaryotes.
Pour un hôte de type procaryote il convient particulièrement bien de choisir un vecteur d'expression bicistronique qui permet de garantir un taux d'expression élevé et la production de polypeptides eucaryotes dépourvus d'acides aminés d'origine hétérologue.
Les composants de base d'un tel système de vecteur d'expression bicistronique sont un plasmide multicopie contenant un promoteur fort et un site de liaison des ribosomes, une séquence synthétique (premier cistron) et la séquence codante du polypeptide à exprimer (second cistron).
Le rôle du premier cistron est de produire une séquence optimisée pour l'initiation de la traduction. L'accessibilité du ribosome à l'ARNm peut être augmentée si la séquence Shine-Dalgarno et le codon AUG sont localisés dans le contexte d'une région riche en AU libre de structure secondaire locale. Le premier cistron sert à séparer la région 5' non traduite, de la séquence codante du gène d'intérêt. Ainsi, la possibilité de formation d'une structure secondaire entre ces régions est réduite.
Les ribosomes se fixent au site de liaison des ribosomes du premier cistron, initient la traduction du codon AUG et traduisent le premier cistron. A l'extrémité de celui-ci, les ribosomes ne sont pas dissociés et réinitient aussitôt la traduction du second cistron.
Le niveau d'expression du second cistron serait très sensible à des changements altérants tels que :
- la longueur de la phase de lecture ouverte dans le premier cistron (il faut 8 à 18 codons) ;
- la position du codon stop qui termine la traduction du premier cistron ;
- la longueur de la région interci stronique (elle doit être courte) ;
- la phase du codon stop du premier cistron par rapport au codon d'initiation du second cistron (elle doit être la même) ;
- la séquence SD nécessaire pour l'expression du second cistron et l'espace entre cette séquence et le codon de réinitiation.
Un vecteur d'expression bicistronique particulièrement préféré pour être utilisé dans E. coli est le pWT211 Ncol Bis.
Les cellules hôtes transformées sont cultivées sur un milieu approprié et on récupère le polypeptide recombinant.
La renaturation des polypeptides recombinants dérivés d'IgE après synthèse par des cellules hôtes transformées ne concerne que les formations des ponts disulfure pour obtenir des dimères et exclut la N-glycosylat ion des asparagines dans la séquence d'acides aminés.
Pour la formation des ponts disulfure la concentration relative au couple όxydo-réducteur utilisé est de 2/1 de préférence. Comme couple oxydo-réducteur qui convient particulièrement bien pour les polypeptides recombinants d'IgE synthétisée en E. coli, on citera le couple glutathion oxydé/DDT.
On peut également envisager de synthétiser chimiquement les polypeptides utilisés comme agents immunogènes selon l'invention, par des méthodes de synthèse connues de l'homme de métier. A titre de référence on citera les polypeptides synthétiques de Stanworth (Eur. Immunol. 1987, 17-437).
Les polypeptides dérivés de l'IgE sous forme non-glycosylés utilisés selon l'invention peuvent également être obtenus par déglycosyt ion enzymatique de la séquence d'acides aminés de l'IgE native. Ce procédé de préparation convient particulièrement bien si on envisage d'utiliser comme agent immunogène non-gl ycosylé la chaîne lourde s de l'IgE ou son fragment Fcε CH2-CH4 qui est obtenu après clivage enzymatigue de l'IgE par la papaïne.
L'invention concerne également une méthode pour traiter ou prévenir les réactions d'hypersensibilité de type 1, une maladie immunitaire inflammatoire ou une affection liée à une production anormale des IgE, qui comprend l'acte d'administrer, en quantité efficace, une composition vaccinale ou une composition d'anticorps selon l'invention à un sujet ayant besoin d'un tel traitement.
La méthode de traitement ou de prévention des réactions d'hypersensibilité de type 1, selon l'invention, est tout à fait différente d'un traitement d'inhibition par compétition avec l'IgE par action sur le récepteur FcεRl, qui nécessite l'administration de doses élevées, le cas échéant dans des zones localisées de l'organisme, d'un polypeptide dérivé du fragment Fcε de l'IgE.
Comme exemple d'affection liée à une production anormale des IgE on peut citer le cas des patients infectés par le virus HIV, qui présentent très fréquemment des taux anormalement élevés d'IgE. Ces affections comprennent, de façon non-limitative, des sinusites sévères, des bronchopneunomies, ainsi que toutes les manifestations allergiques et des maladies immunitaires inflammatoires fréquemment rencontrées chez ces patients. La présente invention recommande également de traiter les sujets infectés par HIV et présentant un taux anormalement élevé d'IgE, y compris en l'absence apparente d'affection liée à ces immunoglobulines, du fait que des auteurs ont constaté une diminution de la survie à 24 mois chez les sujets ayant un taux d'IgE supérieur à 150 KIU/1 comparés aux sujets ayant un taux inférieur à cette valeur.
La composition vaccinale selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier on peut associer l'agent immunogène utilisé avec un diluant ou un support pharmaceutiguement acceptable tel que par exemple une solution saline physiologigue apyrogene. En outre, une composition vaccinale selon l'invention peut contenir des composants usuels tels qu'un tampon, un agent conservateur ou stabilisant , le cas échéant, un excipient de lyophilisation. L'agent immunogène peut être conservé en présence d'un diluant, d'un support ou d'un composant tel que précédemment évoqué. De manière alternative, un diluant, un support ou un composant peut être ajouté juste avant l'emploi.
C'est pourquoi l'invention concerne de manière alternative un kit contenant :
a) une composition essentiellement constituée d'un agent immunogène sous forme dudit polypeptide non-glycosylé ;
b) une composition comprenant au moins un composant sélectionné parmi un diluant ou un support pharmaceut iquement acceptable, un composant ayant un pouvoir tampon, un agent conservateur ou stabilisant ;
c) des instructions pour l'administration concomitante par exemple sous forme de mélange des compositions décrites sous a) et b) .
Enfin, une composition vaccinale selon l'invention peut contenir un agent immunogène autre que l'agent immunogène sous forme d'un polypeptide non-glycosy lé dérivé d'IgE, comme par exemple dans le cas d'un vaccin polyvalent. Une composition vaccinale selon l'invention peut également contenir plusieurs agents immunogènes différents tous étant des polypeptides non-glycosylés dérivés de l'IgE.
Une composition vaccinale selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins. De façon préférée, une composition vaccinale selon l'invention est administrée par voie générale ou éventuellement locale, sous-cutanée, intramusculaire ou intra-veineuse sous forme de suspension injectable par exemple. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. Le dosage approprié varie en fonction de divers paramètres, comme par exemple l'individu à traiter ou le mode d'administration. On peut toutefois indiquer que de bons résultats peuvent être obtenus avec une dose unitaire de 0,5 à 5 ou 10 μg/kg d'agent immunogène sous un volume compatible avec l'injection.
La dose unitaire peut, par exemple comporter, sous un volume d'un véhicule liquide injectable, une quantité comprise entre 10 et 500 μg άu polypeptide, de préférence de 25 à 250 μg, et notamment de 50 à 125 μg.
L'invention a également pour objet l'utilisation, comme décrite ci-dessus, du polypeptide défini ci-dessus, pour la préparation d'une composition vaccinale selon l'invention. L'objet de la présente invention est illustré par les exemples qui suivent, qui sont donnés à titre d'illustration uniquement. Ils font référence aux figures 1 à 5 où la figure 1 représente la carte de restriction du vecteur d'expression pWT211 Ncol ; la figure 2 comprend la carte de restriction du vecteur d'expression bicistronique PWT211 Ncol Bis et la séquence du promoteur ; la figure 3 résume les différents polypeptides non-glycosylés dérivés de l'IgE humaine exprimés dans les exemples ; la figure 4 représente le chromatogramme obtenu par chromatographie en phase inverse de l'extrait renaturé de Fcε CH2'-CH4 (226-547) élue à 70 mM de NaCl sur colonne de Q-Sépharose contenant 220 μg de protéines totales ; la figure 5 reprend le chromatogramme obtenu par chromatographie en phase inverse du Fcε CH2'-CH4(226-547) purifié après élimination du contaminant de 14 000 daltons par chromatographie sur Superdex 75.
Toutes les techniques employées dans les exemples ci-dessous pour le clonage, la digestion de l'ADN, l'analyse de fragments de restriction en gel d'agarose sont celles décrites dans le manuel de laboratoire Maniatis, Molecular Cloning, Sec. Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) bien connu de l'homme de métier. Exemple 1 : Expression du fragment FcεCH2-CH4
L'ARN total a été isolé à partir d'un myélome humain 266BL qui synthétise une IgE de type ND tel que décrit dans J.H. Kenten, Proc. Natl. Acad. Sci. US 79, (1982), p 6661. L'ARN messager (ARNm) est purifié par chromatographie sur colonne d'oligo dT. Après séparation des ARNm sur gradient de saccharose, une fraction enrichie en ARNm codant pour la chaîne lourde s est copiée en ADN complémentaire (ADNc). Cet ADNc est clone dans un plasmide et transformé dans E. coli.
Une sonde synthétique (ol igonucl éot ide) déduite de la séquence protéique N-terminale de l'IgE qui est décrite dans Bennich, Progress in Immunology II, Vol I, (1974), p 49, est utilisée pour cribler la banque d'ADNc. Parmi les cinq clones positifs détectés, un seul possède un ADNc de 2 Kb codant pour la chaîne lourde s complète. En d'autres termes, codant pour les régions 5' et 3' non traduites du ARNm, pour la chaîne s mature et pour le peptide de sécrétion N-terminal de vingt acides aminés.
Seule la portion du gène codant pour le fragment Fcε CH2-CH4 (Asp 218-Lys 547) est sous-clonée dans le plasmide d'expression pWT211 sous le contrôle du promoteur-opérateur tryptophane selon la méthode décrite dans J. Kenten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, (1984), p 2955. Ce vecteur d'expression est analogue au pWT111 décrit dans W. Tacon, Molec. Gen. Genêt. 177, (1980). Ce plasmide est obtenu à partir du plasmide PWT111 de 4 823 pb par délétion du gène rop (767 pb) situé entre l'origine de réplication et le gène de la tétracycline. Ce vecteur permet de réprimer la synthèse du polypeptide recombinant en présence de tryptophane et d'induire un haut niveau de synthèse grâce à l'acide 3-β- indoleacryl ique (IAA).
Le plasmide exprimant le fragment fcs CH2-CH4 (218-547) est sélectionné et appelé pSC213. Le fragment Fcε analysé par électrophorèse après coloration au bleu de Coomassie a un poids moléculaire de 40 KD (Keuton J. PNAS 1984 - 81 p 2955). En position 225 le fragment Fcε CH2-CH4 (218-547) a maintenu une cystéine qui dans l'IgE naturelle forme un pont disulfure avec une cystéine du domaine CH1, absent dans Fcε CH2-CH4. Cette cystéine 225 est remplacée par une serine 225. Le site de restriction HindIII et le site de restriction BglII qui possède le gène du FcεCH2-CH4 (218-547) clone sont utilisés pour remplacer la cystéine par la serine. A cet effet on effectue une délétion du fragment HindIII-BglII de 59 pb qui contient le triplet codant pour la cystéine 225. On remplace le fragment délété par un "linker" synthétique de 35 pb possédant une mutation d'une base G en C au niveau du codon d'intérêt. On obtient ainsi le fragment Fcε CH2'-CH4 (Ser 225-Lys 547) représenté dans la figure 5.
L'expression dans pSC213 aboutit à un polypeptide de fusion qui contient sept acides aminés du gène trpE plus deux acides aminés qui résultent de la création du site de restriction Hind III.
Pour éliminer les acides aminés d'E. coli afin d'avoir un polypeptide recombinant qui ne contient que des parties du Fcε d'IgE humaine, on crée un site de clonage Ncol par mutagénèse dirigée au niveau du codon ATG. Ce site peut être utilisé pour le clonage des polypeptides dérivés de l'IgE selon l'invention à la place du site HindIII.
La création du site Ncol est réalisée à partir du vecteur de départ pWT211. Le plasmide pWT211 possède deux sites de restriction uniques (PstI et BamHI) situés de part et d'autre du codon d'initiation, sites qui sont présents également dans le polylinker du phage M13. Un fragment de 1 500 pb Pstl-BamHI est donc clone dans M13mp18 (J. Messing, Methods Enzymol. 101, (1983), p 20). La figure 1 montre les bons clones obtenus (9 sur 18) après préparation d'ADN simple-brin. L'insertion du fragment à muter est aussi contrôlée par séquence avec l'amorce universelle M13.
L'ol igonucléot ide muteur tel qu'identifié sous le SEQ ID nº 2 permettant la création du site Ncol diffère de deux bases autour du codon d'initiation par rapport à la séquence d'origine. La mutagénèse est réalisée suivant le protocole T.A. Kunkel, Methods Enzymol. 154, (1987), p 367. Vecteur pWT211
01 igonucléotide
SEQ ID nº 2
Figure imgf000023_0001
Cette méthode utilise un ADN matrice simple-brin (phage M13) où une partie des résidus thymines sont remplacés par des uraciles. Ce bactériophage recombinant est produit dans la souche d'E. coli CJ 236 (T.A. Kunkel et al., Methods Enzymol. 15'4, (1987), p 367) portant les mutations dut- et ungA Cette souche est déficiente en uracyl-N-glycosylase, enzyme remplaçant les uraciles par des thymines en temps normal. L'ADN simple-brin uracilé contenant le fragment à muter est utilisé comme matrice dans un procédé de mutagénèse standard pour générer un hétéroduplex formé d'un brin uracyle et d'un brin synthétisé in vitro contenant des thymines. La transformation de cet ADN dans une souche JM101 dans Maniatis ung provoque la destruction du brin matrice ce qui entraîne une diminution conséquente de la production de phages sauvages ; la plupart des phages formés dérivent du brin non uracyle. Comme la synthèse de ce brin a été amorcée avec l'oligonucléotide muteur phosphorylé, ces phages recombinants portent les mutations désirées.
Après la réaction de mutagénèse, le séquençage est une des méthodes permettant de vérifier la présence de mutations. A titre d'exemple, sur 13 simples-brins isolés après mutagénèse, 7 clones sur 13 possèdent les mutations, vues sur deux pistes C et G.
Le fragment muté de 1 500 pb est réinséré dans le vecteur pWT211 entre les sites PstI et BamHI après PCR (polymer chain reaction) sur l'ADN simple-brin M13. Les 1 500 pb sont amplifiées grâce aux amorces M13 universelles et inverses et digérées par les deux enzymes ayant servi au clonage. Les bons clones sont contrôlés sur gel d'agarose après digestion par PstI et Ncol (bandes de 1 200 et 2 800 pb) et séquences au niveau du site Ncol. Le plasmide correctement muté est sélectionné et nommé pWT211 Ncol et sa carte de restriction est reprise figure 1.
Pour cloner.Fcε CH2 ' -CH4 (Val 224 - Lys 547) dans le plasmide pWT211 Ncol, le vecteur est coupé par Ncol et Bam Hl, sites choisis pour leur facilité de digestion après amplification par PCR. Une portion de plasmide de 371 pb situé dans le gène de résistance à la tétracycline est ainsi éliminée. Fcε CH2 ' -CH4 (Val 224 - Lys 547) est amplifié par PCR pour créer les sites Ncol et BamHI. La séguence de 1 ' ol igonucléot ide sis au niveau de NcoI est choisie de telle façon que la phase de lecture ouverte et l'intégrité du site de clonage soient conservées. Fcε CH2 ' -CH4 (Val 224 - Lys 547) est exprimé dans les couches d'E. coli CAG 1139 (A.D. Grossman et al., Cell 32, (1983), p 151) ou BL 21 (F.W. Studier, J. Mol. Biol. 189, (1986), p 113); la protéine est exempte d'acides aminés d'origine d'E. coli. Exemple 2 : Construction d'un vecteur d'expression
bici stronique
Un vecteur bicistronique qui permet d'exprimer le polypeptide non-glyσosylé dérivé d'IgE dans E. coli est le
PWT211 Ncol Bis. Pour le préparer on effectue la digestion du plasmide pWT211NcoI par l'enzyme de restriction NcoI au site créé par mutagénèse dirigé selon l'exemple 1. On fait suivre par une insertion d'un "linker" synthétique double-brin de 42 pb contenant les sept acides aminés de trpE, une seconde séquence de Shine-Dalgarno et des codons de terminaison TAA dans les trois phases. L'insertion est facilement contrôlée sur gel d'agarose après digestion par
Dral (site présent dans l'adaptateur synthétique).
Les diverses contraintes permettant une bonne efficacité de traduction et par conséquent une expression du gène d'intérêt à un niveau élevé ont été respectées.
La figure 2 donne la carte de restriction du plasmide pWT2 llNcoIBi s et la séquence SEQ ID No. 3 au niveau du promoteur bicistronique.
Exemple 3 : Préparation d'un vecteur bicistronique codant pour les polypeptides dérivés d'Ige. Comme vecteur bicistronique on utilise pWT211 Ncol
Bis dans lequel les codons des polypeptides respectifs sont insérés entre les sites Ncol et BamHI. Fcε CH2'-CH4 (Ser 226 - Lys 547) est également exprimé. Le plasmide ainsi exprimé s'appelle pE2-4(7). Dans ce cas, il y a suppression du site Ncol car la séquence nucléot idique à l'extrémité 5' commence par le codon TCC de la serine 226. Fcε CH2'-CH4 (226-547) correspond à la séquence de l'IgE native humaine respective et est exprimé à 20 % sous forme de corps d'inclusion. Le microséquençage de l'extrémité 5' des polypeptides recombinants montre que la méthionine N-terminale est clivée de façon quantitative in vivo dans la bactérie.
La séquence complète du Fcε CH2'-CH4 (226-547) est donnée dans la SEQ ID nº 1.
La figure 3 résume les constructions réalisées comme illustration de la présente invention.
Exemple 4 : Déglycosylat ion d'IgE native
Des polypeptides dérivés d'IgE sous forme nonglycosylee sont obtenus par déglycosylat ion enzymatique. A cet effet, 200 μg/ml d'IgE dans 0,55 M phosphate de sodium pH 8,6 sont incubés avec 15 U/ml N-glycosydase F (N-Glycanase, Genzyme Corp.) pendant une nuit à 37ºC. L'IgE déglycosylée est alors absorbée avec un excès de Lentil Lectin Sepharose 4B (Sigma Chemical Comp.) à 4°C sur rotateur. L'analyse de la préparation ainsi obtenue par SDS-PAGE et marquaqe du gel au PAS (acide périodique-Schiff) démontre clairement que l'IgE est complètement déglycosylée. La concentration d'IgE déglycosyle est déterminée par radio-immunoessai en utilisant les anticorps spécifiques obtenus selon l'invention.
L'IgE peut être fragmentée à la papaïne en fragments Fab et Fc (Ishizaka et al. 1970, Immunochem., Vol. 7: p 687).
Exemple 5 : préparation de polypeptides recombinants non- glycosylés dérivés d'IgE humaine.
La souche E. coli BL21 ou CAG 1139 est transformée avec le vecteur d'expression bicistronique WT211NcoIBis préparé dans l'exemple 2 selon les méthodes de transformation bien connues de l'homme de métier. 100 μl d'une préculture cultivée à 37°C dans du milieu LB plus ampicilline pendant 18 à 24 heures sont ensemencés dans 10 ml de milieu M9 (Miller J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics (Cold Springer NY) contenant 50 μl/ml d' ampici 11 ine ou de carbenici 11 ine 50 μg/ml. Deux tubes de 10 ml de préculture servent à ensemencer 1 litre de culture qui est incubé à 37ºC sous agitation jusqu'à ce que la D.O. (600 nM) atteigne 0,2 - 0,3.
L'expression est alors induite par addition d'acide 3-β-indolacrylique à 15 μg/ml en concentration finale.
Les cultures sont à nouveau incubées à 37ºC sous agitation dans un incubateur pendant 5 à 6 heures jusqu'à une densité optique mesurée à 600 nm égale à 2,0.
Les dérivés d'IgE recombinants exprimés sont agrégés sous forme de corps d'inclusion dans la bactérie et présentent 20 % des protéines totales.
Les dérivés recombinants d'IgE ainsi synthétisés sont récupérés par extraction selon D. Bohmann et al (1988), Transcriptional régulation by the AP-1 family of enhancer bindings proteins: a nuclear targer for signal transduction. Cold Spring Harbor Symp Quant. Bio 53, 695-700.
Les bactéries sont recueillies par centrifugation à 4 200 t/min pendant 15 min. Les culots sont resuspendus dans 7,2 % du volume initial de culture à l'aide du tampon A (Tris HCl 10 mM ; pH 7,9 ; 25 % saccharose, KC1 100 mM, PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluorure) 2 mM) puis, après dissolution complète, on rajoute la solution B (Tris HCl 300 mM ; pH 7,9 ; EDTA 100 mM, lysozyme 4 mg/ml). On laisse en contact pendant 10 min à 0°C avant d'ajouter la solution C (LiCl 1M ; EDTA 20mM, 0,5 % NP40 (Nonidet nonylphenyl polyethylene glycol).
La suspension bactérienne est soniquée pendant 3 mn dans la glace.
Les corps d'inclusion contenant les protéines recombinantes rE2-4(7) sont recueillis par centrifugation à 10 000 t/min pendant 10 min à 4ºC.
Les culots sont lavés deux fois dans un tampon D (Tris HC1 10 mM ; pH 7,9 ; EDTA 0,1 mM ; LiCl 0,5 M ; 0,5 % NP40, DTT 1 mM, PMSF 1 mM). Après resuspension, la solution est soniquée comme précédemment, puis lavée deux fois dans un tampon E ( 10 mM Tris HCl , (pH 7,9) 0,1 M EDTA, 0,5 % NP40,1 mM DTT, 1 mM PMSF. Après resuspension le culot obtenu est congelé et stocké à -80ºC.
Pour renaturer les dérivés d'IgE recombinants, le culot congelé est décongelé dans la glace pilée puis solubilisé à 30°C avec le tampon PEB (Pellet Extraction Buffer, Tris HC1 50 mM ; pH 7,9 ; urée 8M ; EDTA 1 mM ; NaCl 0,5 M (fig 3) PMSF 25 μg/ml) à raison de 20 ml de tampon par litre de culture. Après dissolution, on ajoute du DTT à la concentration finale de 10 mM et on laisse en contact pendant 1 heure à température ambiante. La renaturation est effectuée par dilution jusqu'à une concentration protéique de 30 μg/ml dans un tampon dont la concentration finale est : Tris HC1 50 mM ; pH 8,5 ; EDTA 1 mM ; NaCl, 0,1 M ; PMSF 25 μg/ml ; urée 0,8 M ; glutathion oxydé 0,5 mM ; DTT 0,25 mM. Après agitation, la solution est laissée au repos pendant 24 heures à 4°C. La solution obtenue est alors concentrée sur membrane d'ultrafiltration, dialysée contre un tampon PBS.
Exemple 6 : Purification des polypeptides recombinants non-glycosylés dérivés d'IgE.
Pour séparer les monomères des dimères renaturés, on soumet les polypeptides obtenus selon l'exemple 5 à une chromatographie sur échangeur d'anions Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia) avec un tampon d'application F (Tris 20 mM ; pH 8,5 ; NaCl 30 mM) ce qui permet aux dimères de s'accrocher sur la colonne tout en lui conservant une stabilité correcte. Pour l'élution on utilise comme gradient le même tampon F avec une concentration en NaCl croissante linéaire. L'élution de la fraction enrichie en dimère se fait quand la concentration en NaCl atteint 70 mM. La colonne est lavée avec du tampon Tris 20 mM (pH 8,5) NaCl 1 M.
D'autres produits coéluent avec les dimères dont un de 14 000 daltons de masse molaire en quantité importante. L'éluat obtenu est concentré à 0,5 mg/ml en dimère mesurée par ELISA.
Les coéluents et les dérivés recombinants d'IgE sont séparés par chromatographie en gel filtration sur Superdex 75. (fig 5)
Dans le cas du polypeptide recombinant Fcε CH2-CH4 (226-547) on obtient environ 2 à 3 mg de dimère/litre de culture. Exemple 7 : Immunogénicité du polypeptide recombinant Fcε
CH2'CH4 (226-547) chez le singe Vervet.
1. Protocole d'immunisation.
5 singes Vervet C1-C2-C5-C7-C10 sont immunisés avec les polypeptides recombinants purifiés selon l'exemple 6 ; le protocole suivi est le suivant tel que illustré avec FcεCH'2-CH4 (226-547) :
Jour 0 : injection en s.c. en 2 points de 2 × 25 μg de Fcε
CH2'-CH4 (226-547) sous 100 μl
Jour 15 : injection en s.c en 2 points de 2 × 50 μg de Fcε
CH2'-CH4 (226-547) sous 200 μl
Jour 30 : injection en s.c. en 2 points de 2 × 50 μg de
Fcε CH2'-CH4 (226-547) sous 200 μl
45 jours après la première injection, on prélève un échantillon de sérums sur chacun des singes. Les échantillons de sérums sont testés en ELISA pour leur réaσtivité vis à vis de l'IgE humaine et du Fcε CH2'-CH4 (226-547). Les résultats obtenus indiquent une faible réactivité croisée et d'autre part un taux d'anticorps anti Fcε CH2'-CH4 (226-547) supérieur à celui des anticorps anti-IgE.
2. Effet neutralisant sur les réactions d'hypersensibilité de type I
Le polypeptide recombinant (référence interne r E 2-4(7), préparé selon l'exemple 5, l'IgE de myélome ou les sérums des singes immunisés avec le Fcε CH2 '-CH4 (226-547) selon l'exemple 7.1 ont été testés pour leur capacité d'inhiber la réaction d'anaphylaxie cutanée passive (ACP) chez le singe (Ishizaka K. et al., J. Allergy, 1967, 39, 254).
Le test a été réalisé chez le singe Vervet, la réaction d' anaphylaxie cutanée passive a été induite par injection par voie intradermique de sérum de patients atopiques suivi 24 h plus tard de l'allergène spécifique Dptero, au même point d'inoculation, également par voie intradermique. La visualisation de l'érythème est réalisée par injection par voie intraveineuse d'une solution de bleu d'Evans. La lecture se fait par mesure des diamètre des papules bleutées aux points d'injection intradermique, et calcul des surfaces correspondantes. Pour les contrôles négatifs, les réactifs sont remplacés par une solution de NaCl à 9 % .
L'inhibition de l 'ACP est mesurée par injection au même point d'inoculation, par voie intradermique, du polypeptide recombinant rE2-4 (7), ou des sérums des singes immunisés à différentes dilutions, ou de l'IgE d'un myélome humain (Guill) 1 heure avant sensibilisation par le sérum de patients atopiques et de l'allergène selon le protocole décrit pour l'induction de l'ACP.
Les résultats montrent que le polypeptide recombinant Fcε CH2'-CH4 (226-547) est capable d'inhiber la réaction d'ACP, et qu'il n'a pas perdu ses qualités fonctionnel les puisqu'il est capable de se fixer sur le récepteur FcεRl de l'IgE.
Chez le singe Vervet, le test d'ACP est inhibé significativement à partir de 140 nM. pour l'IgE de myélome et 14 nM. pour le peptide recombinant, indiquant qu'il faut une dose de rE2-4(7) environ 100 000 fois supérieure à celle de l'IgE spécifique, pour inhiber la réaction d'ACP chez le singe Vervet.
Chez ces mêmes singes, l'inhibition totale de l'ACP est obtenue pour une concentration de 540 nM pour l'IgE de myélome, alors qu'avec le polypeptide recombinant, l'inhibition est proqressive (50 % à 540 nM et 100 % à 2700 nM).
Le transfert d'immunsérum de singes immunisés avec le polypeptide recombinant Fcε CH2'-CH4 (226-547) à des singes non immunisés, entraine une négativation de la réaction d'ACP. La réaction est totalement inhibée lorsque l'on utilise le sérum pur de singe immun (par exemple singe nº Cl 117 jours après son immunisation avec le polypeptide Fcε CH2'-CH4 (226-547). Il existe un effet dose, illustré par une diminution de l'inhibition lors d'une injection de l'immunsérum dilué au 1/50ème (73 % d'inhibition).
Si les mêmes tests d'ACP sont réalisés sur des singes immunisés avec le peptide recombinant, on n'observe aucune réaction positive, même pas avec le témoin positif : sérum d'atopique et allergène correspondant, même à forte concentrât ion.
En Conclusion. 1) L'efficacité vaccinale des polypeptides recombinants a été testée sur le modèle animal le plus proche de l'être humain puisque les IqE de singe ont, avec celles de l'homme une homologie supérieure à 95 %.
2) Le polypeptide recombinant Fcε CH2'-CH4 (226-547) porte des épitopes capables d'induire des anticorps neutralisant la réaction d'hypersensibilité de t ype 1 .
3) Les anticorps induits chez le singe sont bien dus à l'existence d'épitopes portés par cette molécule et non pas simplement dus à des différences structurales entre les IgE du singe et l'être humain, si cela avait été le cas, les anticorps provenant des singes immunisés reconnaîtraient les IgE humaines, ce qui n'est pas le cas (Mesure en Western Blot).
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Claims

REVENDICATIONS
1. Composition pharmaceutique comprenant, en quantité efficace, et à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique pour induire un effet vaccinal antiallergique, un polypeptide dont une partie, au moins, de la séquence d'acides aminés est dérivée de celle du monomère du fragment Fcc de l'IgE de primate, notamment humain, et présentant par rapport à l'IgE native naturellement présente dans l'organisme humain, ou des primates, un ou des sites ou épi topes néoantigéniques.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comporte, dans un véhicule approprié à l'administration parentérale, une dose unitaire de 0,5 à 5 μg/kg. dudit polypeptide.
3. Composition pharmaceutique, selon l'une des revendications 1 et 2, comprenant un polypeptide dont la séquence d'acides aminés est dérivée de la séquence telle que montrée dans I'ID SEQ Nº 1, de l'acide aminé en position 215 à l'acide aminé en position 547 ; ledit polypeptide présentant par rapport à une IgE humaine native, au moins un épitope néoant igénique.
4. Composition selon la revendication 3, dans laquelle ledit polypeptide a une séquence d'acides aminés dérivée de la séquence telle que montrée dans l'ID SEQ Nº 1,
- de l'acide aminé en position 218 à l'acide aminé en position 547,
- de l'acide aminé en position 224 à l'acide aminé en position 547,
- de l'acide aminé en position 226 à l'acide aminé en position 547,
- de l'acide aminé en position 234 à l'acide aminé en position 547,
- lie l'acide aminé en position 330 à l'acide aminé en position 547,
- de l'acide aminé en position 358 à l'acide aminé en position 547,
- de l'acide aminé en position 418 à l'acide aminé en position 547, ou
- de l'acide aminé en position 438 à l'acide aminé en position 547.
5. Composition selon la revendication 3, dans laquelle ledit polypeptide a une séquence en acides aminés qui inclut la séquence substantiellement telle que montrée dans l'ID SEQ N° 1, de l'acide aminé en position 438 à l'acide aminé en position 547.
6. Composition selon la revendication 3, dans laquelle ledit polypeptide a une séquence en acide aminés dérivée de la séquence telle que montré dans le ID SEQ Nº 1, de l'acide aminé en position 226 à l'acide aminé en position 547.
7. Composition selon la revendication 3, dans lequel le ledit polypeptide a une séquence en acides aminés dérivée de la séquence telle que montrée dans l'ID SEQ N° 1,
- de l'acide aminé en position 215 à l'acide aminé en position 330,
- de l'acide aminé en position 218 à l'acide aminé en position 330,
- de l'acide aminé en position 226 à l'acide aminé en position 330, ou
- de l'acide aminé en position 234 à l'acide aminé en position 330.
8. Composition selon la revendication 3, dans laquelle ledit polypeptide a une séquence en acides aminés dérivée de la séquence telle que montrée dans l'ID SEQ Nº 1 de l'acide aminé en position 300 à l'acide aminé en position 500.
9. Composition selon la revendication 4, dans laquelle ledit polypeptide a une séquence d'acides aminés telle que montrée dans l'ID SEQ Nº 1 ,
- de l'acide aminé en position 218 à l'acide aminé en position 547,
- de l'acide aminé en position 224 à l'acide aminé en position 547,
- de l'acide aminé en position 226 à l'acide aminé en position 547,
- de l'acide aminé en position 234 à l'acide aminé en position 547,
- de l'acide aminé en position 330 à l'acide aminé en position 547,
- de l'acide aminé en position 358 à l'acide aminé en position 547,
- de l'acide aminé en position 418 à l'acide aminé en position 547, ou
- de l'acide aminé en position 438 à l'acide aminé en position 547.
10. Composition selon la revendication 8, dans laquelle ledit polypeptide a une séquence en acides aminés qui inclut la séquence telle que montrée dans le ID SEQ N° 1, de l'acide aminé en position 438 à l'acide aminé en position 547.
11. Composition selon la revendication 6, dans laquelle ledit polypeptide a une séquence en acides aminés telle que montrée dans l'IDE SEQ N° 1, de l'acide aminé en position 226 à l'acide aminé en position 547.
12. Composition selon la revendication 7, dans laquelle ledit polypeptide a une séquence en acides aminés telle que montrée dans 1'ID SEQ N° 1.
- de l'acide aminé en position 215 à l'acide aminé en position 330,
- de l'acide aminé en position 218 à l'acide aminé en position 330,
- de l'acide aminé en position 226 à l'acide aminé en position 330, ou
- de l'acide aminé en position 234 à l'acide aminé en position 330.
13. Composition selon l'une des revendications 1 à 8, dans laquelle le polypeptide a une séquence comprenant au moins 15, de préférence 60 acides aminés.
14. Composition selon la. revendication 13, dans laquelle le polypeptide a une séquence comprenant au moins 100 acides aminés.
15. Composition selon la revendication 14, dans laquelle le polypeptide a une séquence comprenant au moins 220 acides aminés.
16. Composition selon l'une des revendications 1 à
15, dans laquelle le polypeptide est non-gl ycosylé.
17. Composition selon l'une des revendications 1 à
16, dans laquelle ledit polypeptide est sous forme dimérique.
18 Composition selon l'une des revendications 1 à
17, dans laquelle ledit polypeptide est sous forme libre (non-σouplé, non-fusionné et non-conjugué).
19. Composition selon l'une des revendications 1 à
18, qui ne contient pas d'adjuvant.
20. Composition selon l'une des revendications 1 à 18, qui contient en outre un adjuvant faible, à l'exclusion de l'adjuvant de Freund complet ou incomplet.
21. Composition selon la revendication 20, qui contient de l'alun, à titre d'adjuvant.
22. Une composition selon l'une des revendications l à 21, qui comprend de 10 à 500 μg, de préférence de 25 à 250 μg dudit polypeptide par dose unitaire de vaccin.
23. Composition selon la revendication 22, qui comprend de 50 à 125 μg dudit polypeptide par dose unitaire de vaccin.
24. Utilisation d'un polypeptide dont une partie au moins de la séquence d'acides aminés est dérivée du fragment Fcε de l'IgE de primates, notamment humain, et présentant par rapport à l'IgE naturellement présente dans l'organisme humain, ou de primate, un ou des sites ou épi topes néoant igénique, tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1, et 3 à 18 pour la préparation d'une composition vaccinale destinée à modifier favorablement l'intensité de la réponse immunitaire médiée par les IgE.
25. Utilisation selon la revendication 24 caractérisée en ce que, pour la préparation d'un vaccin à administration parentérale, on introduit dans un véhicule ayant un volume et une composition adaptée à l'administration parentérale, une quantité de 0,5 à 5 μg/kg dudit polypeptide.
26. Composition contenant des anticorps induits par une composition vaccinale selon l'une des revendications
27. Composition destinée à l'immunisation passive. contenant une quantité efficace d'anticorps selon la revendication 26.
28. Procédé d'immunopurification par chromatographie d'agents immunogènes dans lequel on utilise des anticorps selon la revendication 26.
29. Procédé de préparation d'un polypeptide immunogène selon l'une des revendications 1 et 3 à 18, caractérisé en ce que l'on cultive, sur un milieu approprié, une cellule hôte transformée avec un vecteur d'expression assurant l'expression d'un fragment d'ADN isolé codant pour ledit polypeptide, et que l'on récupère le polypeptide reσombinant.
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