WO1995019777A2

WO1995019777A2 - Utilisation de diesters de muramyl peptides, dans une forme orale, comme immunostimulants

Info

Publication number: WO1995019777A2
Application number: PCT/FR1995/000077
Authority: WO
Inventors: Louis Chedid; Françoise Audibert; Pierre Lefrancier
Original assignee: Vacsyn, S.A.
Priority date: 1994-01-25
Filing date: 1995-01-24
Publication date: 1995-07-27
Also published as: FR2715305B1; EP0741573A1; CA2181899A1; AU1580995A; WO1995019777A3; JPH09509409A; FR2715305A1

Abstract

L'invention concerne une composition pharmaceutique immunostimulante active par voie externe, caractérisée en ce qu'elle contient un diester de formule générale (I) dans laquelle: R est CH3, X est L-Ala ou L-Thr, R1 est un groupe hydrocarboné possédant de 1 à 4 atomes de carbone, R2 est un groupe hydrocarboné possédant 1 à 2 atomes de carbone, dans une formulation d'administration par voie externe compatible avec une administration de principe actif comprise entre 0,1 mg et 5 mg par kg de poids chez l'homme ou l'animal.

Description

DIESTERS DE MURAMYL PEPTIDES DANS UNE FORME ORALE

La présente invention est relative à une composition pharmaceutique immunostimulante, active par administration externe, notamment par voie orale, nasale, transcutanée, aérosol ; cet effet immunoεtimulant pouvant être mis à profit soit pour une activité d¹immuno-adjuvant en association avec un vaccin, soit en traitement prophylactique ou thérapeutique d'une infection éventuellement en association avec un autre traitement approprié au type d¹infection.

Les mura yl peptides et leurs dérivés esters sont une famille de molécules qui ont été décrites dans de nombreuses publications et de nombreux brevets depuis la première description du N-acetyl-Muramyl-L-Alanyl- Disoglutamine (MDP pour muramyl dipeptide) .

Brièvement, ils sont capables d'exercer une grande variété d'activités biologiques incluant- une activité immuno-adjuvante, une activité anti-infectieuse, une activité antitumorale, une activité anti-allergique et une régulation de la sécrétion des cyto ines. Cependant, un certain nombre de ces muramyl peptides, s'ils peuvent présenter des activités biologiques tout à fait prometteuses, présentent souvent des effets secondaires ou des inconvénients qui en empêchent leur utilisation à titre de médicament, notamment des effets toxiques ou une difficulté de formulation du fait de leur faible solubilité dans des solutions aqueuses.

Ils présentent en outre une grande variabilité dans leur spectre d'action.

Le seul immuno-adjuvant utilisé en clinique humaine est actuellement l'hydroxyde d'aluminium, mais ce composé n'est actif que par voie systémique, c'est- à-dire qu'il doit être injecté par voie parentérale et n'est pas actif après administration par voie orale ou transcutanée. De plus, il produit des effets indésirables comme l'induction d'anticorps de type IgE gui créent un risgue d'allergie. En outre, il produit principalement une réponse humorale et ne favorise pas la production d'immunoglobulines sécrétoires.

La recherche, par conséquent, d'un immunosti ulant qui présente à la fois des avantages d'efficacité, de formulation, et de toxicité reste un problème actuel qui n'avait encore jamais été résolu par l'un ou l'autre des dérivés du MDP ; en particulier, un immunomodulateur actif après administration par voie externe, notamment par voie orale ou percutanée ou aérosol, peut permettre d'envisager une utilisation plus large et plus souple de cet immunostimulant.

La présente invention a justement permis de sélectionner parmi les nombreux dérivés et analogues du MDP des diesters de formule générale I :

dans laquelle :

- R est CH3 ,

- X est L-Ala ou L-Thr ,

- RI est un groupe hydrocarboné possédant de 1 à 4 atomes de carbone,

- R2 est un groupe hydrocarboné possédant 1 à 2 atomes de carbone.

Un composé particulier répondant à cette formule est le muradimétide de formule II :

Nac-Mur-L-Ala-D-Gl [OMe]-OMe lequel muradi étide est soluble dans l'eau, présente une faible toxicité et peut ainsi être intégré à titre de principe actif dans une composition pharmaceutique immunostimulante qui est active par voie externe, notamment par voie orale, percutanée ou aérosol, et ce dans une formulation compatible avec une administration de principe actif comprise entre 0,1 mg et 5 mg par kg de poids.

Le muradimétide est une molécule synthétique dont une synthèse a été décrite dans le brevet français FR760680.

L'invention consiste donc parmi l'ensemble des dérivés du muramyl dipeptide à sélectionner un composé répondant à la formule ci-dessus parmi des dérivés qui avaient déjà été préalablement décrits, lesdits dérivés présentant à la fois des qualités immunostimulantes remarquables qui permettent de les utiliser comme adjuvants de vaccins, comme substance antibactérienne ou antivirale, et dont la faible toxicité permette également leur administration par voie externe, notamment orale, nasale ou aérosol ou percutanée et ne présentant pas les effets secondaires observés pour le MDP ou d'autres dérivés, notamment des mono-esters.

La combinaison de toutes ces caractéristiques permet de sélectionner les dérivés de formule générale

I et, plus particulièrement, le muradimétide de formule

II comme principe actif d'une composition pharmaceutique immunostimulante administrable par voie externe, notamment par voie orale, percutanée ou aérosol, active dans une formulation compatible avec une administration comprise entre 0,1 mg et 5 mg/kg de poids chez l'homme ou l'animal. Les doses préférées étant de 0,5 mg à 3 mg/kg.

Une propriété intéressante de la composition selon l'invention est qu'il s'agit d'un immuno-adjuvant utilisable en accompagnement d'un effet induit par une vaccination. Plus particulièrement, la composition pharmaceutique utilisée comme adjuvant peut être administrée avant, pendant ou après une vaccination quel que soit le mode d'administration de cette dernière et par cet effet immuno-adjuvant conduire à une synthèse accrue d'anticorps protecteurs et permettre, le cas échéant, l'économie d'un ou deux rappels nécessaires dans le cadre de la vaccination classique. L'activité adjuvante s'obtient également si la première administration de la molécule est effectuée au moment du rappel. Dans tous les cas de figure, on obtient à la fois une augmentation des anticorps et une modification du profil isotypique en faveur de 1'immunité sécrétoire.

La composition pharmaceutique immunostimulante de l'invention peut également être utilisée pour prévenir ou traiter les infections virales, bactériennes, parasitaires ou autres.

Le muradimétide notamment a la capacité tout à fait remarquable parmi l'ensemble des dérivés du MDP d'être actif dans la protection des sujets traités contre une infection lorsqu'il est administré par voie externe après ladite infection, un exemple particulièrement intéressant de voie externe étant la voie orale (per os) .

Les diesters de formule 1 peuvent être utilisés pour la fabrication d'une composition pharmaceutique immuno-stimulante administrable par voie externe, et si la voie orale est particulièrement intéressante, d'autres voies telles la voie des muqueuses, la voie percutanée, ou la voie aérosol sont également utilisables.

Une autre particularité tout à fait remarquable du muradimétide et des autres composés inclus dans la formule I ci-dessus dans la composition pharmaceutique de 1 'invention est leur capacité à présenter une synergie dans l'effet protecteur à l'égard d'une infection lorsqu'elle est administrée conjointement ou parallèlement à un autre composé antiviral ou anti¬ infectieux. Par exemple, lorsque la composition de l'invention est utilisée en association avec l'AZT dans le traitement des infections par HIV, une protection est observée lorsque l'AZT est administré à une dose suboptimale de 0.01 M d'AZT, dose ne conférant aucune protection à l'égard d'une infection quand elle est administrée seule, cette utilisation pouvant être simultanée, séparée ou étalée dans le temps.

Les exemples suivants montreront de façon non limitative et plus démonstrative, comment la combinaison des qualités du muradimétide, choisi à titre d'exemple, dans les composés de formule I en font un candidat de choix dans la fabrication d'une composition immunostimulante administrable par voie externe, et notamment par voie orale.

Dans ces exemples, les figures ont les significations suivantes :

La figure 1 représente l'activité adjuvante du muradimétide (MDM) administré oralement sur la réponse anticorps de la souris à un vaccin hépatite B. Deux groupes de 8 souris Swiss femelles de 7 à 8 semaines reçoivent par voie sous-cutanée au jour 1 et au jour 30, 1 μg d'antigènes (HBS Ag) absorbé sur alu (135 μg) . Un groupe expérimental reçoit simultanément 1 mg de muradimétide par voie orale.

- La figure 2 représente l'activité protectrice du muradimétide contre une infection par le virus EMC, c'est-à-dire le taux de survie à 60 jours exprimé en pourcentage de souris Swiss traitées par le muradimétide de façon systémique après une infection par l'EMCV.

- La figure 3 représente l'activité dose-réponse du muradimétide administré dans la protection des souris contre une infection EMCV.

- La figure 4 représente l'effet du MDP ou du muradimétide (MDM) en association ou non avec un traitement antirétroviral par l'AZT sur la production d'antigènes HIV dans des cultures de cellules U937 infectées par le virus HIV.

- EXEMPLE I : Pharmacologie générale :

1) Etude de la pyrogénicité :

Le tableau 1 est une comparaison de l'effet pyrogène chez le lapin du muradimétide et du MDP administrés par la voie veineuse (i.v.). Les essais de pyrogénicité ont été réalisés en suivant les règles de la pharmacopée européenne.

Ces données montrent que le muradimétide n'est pas pyrogène quand il est administré à des lapins à la dose de 3 mg/kg, alors que la dose minimum pyrogène du MDP est voisine de 0,33 mg/kg. En effet, lorsque 6 lapins par groupe sont utilisés, la pharmacopée dit un produit a) apyrogène à la dose administrée quand la somme des élévations maximum de température observées chez ces lapins pendant la durée de l'essai est inférieure à 3 ' . b) pyrogène quand cette somme est supérieure à 4° et douteux donc que l'essai doit être répété sur un plus grand nombre d'animaux lorsque la somme est supérieure à 3^e . Tableau 1

Muradimétide MDP

Dosages Lapin Delta T Lapin Delta T n° n°

0,33mg/kg 1 0,10 1 0,10 2 0,30 2 0,20 3 0,40 3 0,30 4 0,20 4 1,20 5 0,05 5 0,60 6 0,00 6 0,65

1° .05 3° .05

1 mg/kg 1 0,75 1 0,60 2 0,50 2 1,20 3 0,80 3 0,50 4 0,40 4 0,70 5 0,10 5 0,40 6 0,10 6 0,80

2° .65 4° .20

3 mg/kg 1 1,10 1 1,50 2 0,55 2 0,30 3 0,20 3 0,45 4 0,15 4 0,50 5 0,70 5 0,80 6 0,20 6 0,50

2° .90 4° .05

2) Mesure de la leucopenie chez les lapins : La plupart des dérivés et analogues de MDP induisent une leucopenie lorsqu'ils sont administrés à des lapins. Au contraire, le muradimétide ne modifie pas la numération sanguine comme cela est indiqué dans le tableau 2 suivant : Tableau 2

Traitement Leucocytes/mm3

100 μg/kg/i.v. T.O T + 3 heures

Muradimétide 7850 7700 MDP 7600 2000

3) Absence d'induction du sommeil lent : Le muradimétide et le MDP ont été administrés à des lapins soit I.V. soit par la voie intracérébroventriculaire (I.C.V.) soit oralement (P.O.). Les doses minimum somnogènes capables d'induire du sommeil paradoxal sont reportées sur le tableau suivant. Ces résultats montrent que la dose somnogene minimum du muradimétide est 10 fois plus élevée que celle du MDP par voie parentérale et qu'il n'est pas actif par la voie orale.

Tableau 3

Absence d'activité somnogene du muradimétide administré oralement

Administration Doses somnogènes minimales/kg

Muradimétide MDP

I.V. 1 mg 100 μg

I.C.V. 1 μg 0.025 μg

P.O. négatif à 10 mg 1 mg - EXEMPLE II : Activité adjuvante du muradimétide en administration orale :

Le muradimétide est administré oralement simultanément avec une vaccination parentérale par un antigène.

1) Réponse à la sérum albumine humaine (BSA) :

L'activité adjuvante du muradimétide, c'est-à-dire sa capacité à augmenter la réponse anticorps à l'antigène (BSA) a été comparée avec l'activité de plusieurs autres muramyl peptides après administration à des souris soit par voie orale, soit par voie sous- cutanée.

La BSA est administrée en tant qu'antigène, toujours par voie sous-cutanée. Les résultats sont indiqués dans le tableau 4 suivant :

Tableau 4

--

Administration

Muramyl peptides Nom abrégé de l'adjuvant

Per os S.C.

Témoins (sans adjuvant) 30 30

Nac-Mur-L-Ala-D-iGln MDP 1100 700

Nac-Mur-L-Ser-D-iGln MDP serine 450 1300

Nac-Mur-N-Methyl-L-Ala-D-iGln 100 450

Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OMe Mura etide 100 500

Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OnBu Murabutide 100 700

Nac-Mur-L-Ala-D-Glu MDPA 200 1000

Nac-Mur-L-Ala-D-Glu* (OMe)OMe Muradimétide 1100 1350

Nac-Mur-L-Ala-D-Glu(OMe)OnBu 200 500

Nac-Mur-L-Ala-D-Glu-OMe 200 450

Nac-Mur-L-Ala-D-Glu-OnBu 80 550

* D-Glu peut être substitué sur les fonctions carboxyles en ou 7. Les substitutions faites en ₇ sont indiquées entr parenthèses. La BSA est donnée en sous-cutanée à raison de 0,5 mg le jour 0 et le jour 30. Le MDP et ses dérivés ou analogues sont donnés uniquement le jour 0, soit à raison de 1 mg per os, soit de 0,1 mg mélangé avec l'antigène en sous-cutanée.

Les anticorps sont mesurés par hémaglutination passive au jour 36.

Nous voyons dans ce tableau que trois composés parmi les plus efficaces sont le MDP, le MDPA et le muradimétide. Le MDP serine étant hautement pyrogène, il est inutilisable en thérapeutique.

Les résultats plus détaillés comparant ces trois composés sont donnés dans le tableau 5 suivant :

Tableau 5

Comparaison entre l'activité adjuvante du MDP et du muradimétide donnés en sous-cutanée ou par voie orale

Adjuvant Nombre Réponse anticorps de souris (gamme de titres)

Témoins (sans 150 30 (<3-400) adjuvant)

MDP S.C. 150 700 (50-3200) MDP P.O. 50 1100 (50-3200)

Muradimétide S.C. 32 1350 (100-3200) Muradimétide P.O. 16 1100 (50-3200)

MDPA S.C. 32 1000 (200-3200) MDPA P.O. 16 200 (12-800)

Les conditions expérimentales sont les mêmes que celles décrites dans le tableau 4 ci-dessus.

Ces données montrent que seulement deux molécules, le MDP et le muradimétide, sont actives de façon significative quand elles sont données par voie orale simultanément avec l'antigène administré par voie parentérale.

De façon intéressante, le MDPA dont le muradimétide est le dérivé diester méthylique, est actif lorsqu'il est administré par voie systémique, mais peu actif quand il est administré par voie orale indiquant que l'activité biologique du muradimétide administré oralement ne peut être attribuée à la formation de MDPA résultant d'une hydrolyse de ses groupes esters méthyliques.

Compte tenu de la toxicité du MDP telle qu'elle est connue et rappelée plus haut, il est clair que, parmi l'ensemble des dérivés et analogues du MDP, seul le muradimétide présente la combinaison des qualités de non-toxicité et d'activité adjuvante lorsqu'il est administré par voie orale.

2) Réponse à un vaccin hépatite B : _

L'antigène utilisé est un antigène de surface recombinant du virus hépatite B (HBS) obtenu par recombinaison génétique et administré, absorbé sur de l'hydroxyde d'aluminium.

Il a été injecté par voie sous-cutanée à des souris Swiss au jour 1 et au jour 21. Le muradimétide a été donné oralement en même temps que le vaccin.

Les résultats obtenus sont représentés dans la figure 1 ; dans cette figure, des souris Swiss (8 par groupe) reçoivent par voie sous-cutanée 1 μg de HBS Ag (Pasteur Mérieux Sérums et Vaccins) et du muradimétide par voie orale (1 mg) . Un rappel est donné au trentième jour.

La figure 1 indique clairement que cette administration orale a de façon considérable augmenté la réponse au vaccin et permet une production beaucoup plus précoce d'anticorps contre l'antigène vaccinant. 3) Réponse à un peptide synthétique d'Escherichia coli administré par voie orale :

Le peptide représente la copie d'une structure vaccinante d'un antigène de surface d'Escherichia coli.

Cet antigène est connu pour être un antigène potentiellement protecteur chez les humains.

Le peptide a été encapsulé dans des microsphères poly(DL-lactide coglycolide) et donné par voie orale à des souris Swiss femelles soit seul, soit avec le muradimétide administré soit par voie sous-cutanée, soit par voie orale. La réponse anticorps dans le sérum a été évaluée par test ELISA soit contre le peptide, soit contre la structure naturelle de la protéine.

Le tableau 6 ci-dessous représente la reconnaissance de la protéine naturelle par les anticorps obtenus après administration orale du peptide synthétique encapsulé dans les microsphères.

Tableau 6

Groupes Réponse anticorps contre

Peptide Protéine synthé¬ naturelle tique

E. coli peptide P.O. 300 200

E. coli peptide P.O. 1100 1200

+ muradimétide S.C.

E. coli peptide+ muradimétide P.O. 4000 2000

Les souris Swiss ont reçu les jours 1 et 30 par voie orale 10 μg du peptide synthétique. Le peptide a été incorporé dans les microsphères et le muradimétide dans une solution saline a été administré soit en sous-cutanée (100 μg) , soit par voie orale à raison d'1 mg par souris.

Ces données montrent que le muradimétide, particulièrement lorsqu'il est donné par voie orale a permis d'obtenir dans le sérum des anticorps reconnaissant l'antigène synthétique et sa structure naturelle.

4) Le muradimétide est administré oralement avec une immunisation secondaire par un antigène administré par voie parentérale :

L'influence de l'administration orale du muramyl peptide au moment d'une injection secondaire d'antigène immunisant a été évaluée par la production d'isotype d'anticorps produits dans le sérum et par la présence d'IgA sécrétoires (recherchées dans le fluide intestinal) .

Un antigène protecteur de Shistosoma mansoni (SMAg) a été administré par voie sous-çutanée à des souris Swiss (un groupe de 8) au jour 1 et au jour 21 ; cet antigène est absorbé sur l'hydroxyde d'aluminium.

Pour l'immunisation secondaire, les souris reçoivent par voie orale 1 mg de muradimétide. Les résultats sont donnés dans le tableau suivant :

Tableau 7

Influence du muradimétide administré oralement au temps du rappel sur la réponse humorale au SMAg

Ces résultats démontrent que le muramyl dipeptide administré lors de 1'immunisation secondaire peut augmenter et moduler la réponse à un antigène administré par voie parentérale.

L'administration du muradimétide a augmenté la synthèse spécifique d'IgA sécrétoire. De façon surprenante, il a diminué considérablement la production d'IgE dans le sérum, confirmant en cela que l'administration orale de muradimétide peut moduler le profil isotypique de la réponse anticorps.

4) Le muradimétide et l'antigène sont administrés par voie orale ; le muradimétide n'étant administré que lors de l'immunisation secondaire.

REPONSE A LA CHAINE β DE LA TOXINE CHOLERIQUE

L'influence du muradimétide administré par voie orale en même temps que 1'immunisation secondaire a également été étudiée dans la réponse anticorps à un immunogène actif par voie orale : la chaîne β de la toxine cholérique (βCT) . Des expériences ont été réalisées dans un groupe de 8 souris Swiss femelles recevant chacune d'elle par voie orale 10 μg de βC , deux fois à trois semaines d'intervalle.

Les anticorps sont mesurés par la technique ELISA dans le sérum et dans les lavages vaginaux au jour 28.

Les résultats sont exprimés dans le tableau 8 suivant.

Tableau 8

Activité adjuvante du MDP associée avec vaccin oral

ADJUVANT ANTI-3CT

Dans le Dans le sérum liquide vaginal

IgG IgA IgG IgA

Contrôle (sans adjuvant) 1800 900 20 5

Muradimétide p.o. 1 mg 4600 2700 35 85 au jour 25

Cette expérience démontre que le muradimétide administré par voie orale en même temps qu'un rappel d'immunisation par un vaccin oral peut exercer son pouvoir adjuvant aussi bien au niveau de l'immunité systémique qu'au niveau de 1'immunité mucosale mesuré par la quantité d'IgA sécrétoire. EXEMPLE III : Activité anti-infectieuse du muradimétide administré par voie orale :

1) Protection contre les bactéries : la : Infection par une mycobactérie

De nombreuses souches de mycobactérieε en particulier parmi les mycobactéria tuberculosis sont résistantes aux antibiotiques. La tuberculose est redevenue un problème majeur de santé et bien sûr particulièrement chez les individus immuno déprimés. Un médicament administré oralement et augmentant les défenses contre ce type d'affection revêt donc une importance considérable non seulement dans le domaine de la tuberculose mais également dans celui des infections opportunistes liées à de nombreuses souches de mycobactéries.

Le Muradimétide a été montré capable de protéger la souris contre une infection par Mycobacterium Fortuitum. Cet effet est obtenu en particulier par des animaux traités par l'AZT qui a comme effets secondaires connus de provoquer une immuno dépression et par voie de conséquence d'accroître la sensibilité aux agressions bactériennes ou virales.

Un modèle utilisé est une infection par Mycobacterium Fortuitum chez la souris. Les animaux sont des souris femelles C57B1/6 de 8 semaines. Ils sont divisés en 3 groupes de 8 animaux : a) un groupe de témoins reçoit de l'AZT per os pendant 3 semaines à raison de 3 mg par souris, trois fois par semaine, b) un second groupe de témoins n'est pas traité, c) le groupe expérimental reçoit du Muradimétide à la dose de 1 mg en même temps que l'AZT.

Les animaux des trois groupes sont éprouvés le lendemain de la dernière administration d'AZT seul ou associé. Ils reçoivent une injection par voie veineuse de 2 x 10⁷ unités infectantes de M.Fortuitum. Les animaux sont suivis pendant 20 jours.

Les résultats cumulés de deux expériences réalisées dans les mêmes conditions expérimentales sont donnés dans le tableau 9 suivant :

Tableau 9

Survie au jour

1 5 10 15 20

Témoin non traités 16 4 1 0 0

Témoin - AZT 16 6 2 2 2

Groupe AZT + Muradimétide 16 16 14 14 14

Il est clair que le Muradimétide a démontré une très forte activité anti-mycobactérienne.

lb : Infection par Klebsiella pneumoniae Le muradimétide est administré soit par voie parentérale, soit par voie orale avant ou après un challenge létal par Klebsiella pneumoniae. Cette administration peut, comme le montre le tableau 10 ci- dessous, protéger de la mort les souris traitées ; cette protection peut être obtenue aussi bien chez les adultes que chez les nouveaux-nés.

Tableau 10

Activité antibactérienne du muradimétide administré par voie orale et par voie systémique en comparaison avec la molécule parente MDPA

Traitement % de protection (nombre d'animaux)

Jour 1 (avant challenge)

53 (16)

2 mg p.o. 50 (24) 100 μg ε.c* 75 (37)

56 (24)

2 mg p.o. 25 (16)

Heure + 1 (après challenge)

69 (16) 6.9 (16)

Les animaux sont des souris femelles Swiss de 6/7 semaines, sauf pour le groupe noté d'un astérisque qui est constitué de souris nouveaux-nés.

Ces résultats démontrent que le muradimétide est doué d'une activité immuno-stimulante non spécifique.

De façon surprenante, il se montre comme l'un des dérivés ou analogues du MDP particulièrement efficaces, lorsqu'il est administré par voie orale et également aussi bien avant qu'après le challenge par une dose mortelle de bactéries.

Au contraire, sa molécule parente, le MDPA, est aussi active gue le muradimétide lorsqu'il est administré par voie systémique, mais, par contre, ne montre pas d'activité significative lorsqu'il est administré oralement (seulement 25% de protection, contre 50% pour le muradimétide) .

2) Protection contre les virus :

Le muradimétide peut protéger des hôtes contre des infections virales d'éthiologies diverses comme cela va être montré ci-dessous dans lequel 1 • immunostimulant a été démontré actif de la même façon après administration par voie systémique ou administration par voie orale. a) Virus de l'influenza :

Le virus de 1 'influenza de l'espèce APR/8 est capable d'induire une pneumonie létale chez les souris adultes.

Le muradimétide administré par voie orale 24 h après le challenge infectieux donné par voie orale a été capable de protéger 30% des animaux observés durant deux semaines. b) Virus de 1•encéphalomyocardite iEMCV) : L'EMCV induit dans les souris une encéphalomyocardite sévère conduisant à la mort après 5/6 jours dans nos conditions expérimentales (100 DL50 données en intrapéritonéal) . L'effet protecteur du muradimétide a été évalué dans ce modèle après administration intrapéritonéale. b.l. Effet prophylactique :

Le muradimétide est administré à la dose de 2 ou 20 mg/kg selon les expériences dans des souris 24 h avant une infection par l'EMCV à la dose de 100 DL50. Les animaux sont observés pendant 60 jours.

Les résultats comparatifs obtenus avec différents dérivés du MDP dans le tableau 11 suivant : Tableau 11 Effet prophylactique Activité anti-virale de dérivés hydrophiles de la famille des muramyl peptides administrés à la souris avant l'injection de 100 DL50 du virus EMCV

Muramyl peptides % de survie (30 μg administrés 24h avant le virus)

0 0

MDP 0

MDP OC₆H₉ 10

Muradimétide 30

Muramétide 10

Il est évident à la lecture de ce tableau que le muradimétide seul, sans injection ultérieure 'interféron, permet d'obtenir un pourcentage de survie de 30% des souris.

Pour mieux mettre en évidence.. l'activité remarquable du muradimétide dans le modèle EMCV, des expériences dose-réponse ont été entreprises en utilisant le muradimétide ou d'autres dérivés de muramyl peptides administré 24 h avant l'infection virale, les résultats sont présentés dans le tableau 12 suivant :

Tableau 12 Dose efficace 50 des dérivés hydrophiles de la famille des muramyl peptides administrés à la souris avant l'injection de 100 DL50 du virus EMCV

Muramyl peptides DE50

MDP > 600 μg

MDPA (OCH₃)OC₄H₉ 600 μg

Muradimétide 150 μg

Muramétide 300 μg

DE50 : dose du composé testé permettant d'assurer la survie de la moitié des animaux.

On voit dans le tableau 12 qu'une dose de 150 μg de muradimétide est suffisante pour obtenir 50% de survie.

L'activité anti-virale du muradimétide est illustrée par la figure 2 qui montre qu'à la dose de 300 μg le muradimétide protège plus de 60% des souris contre la mort par infection virale, le MDP lui ne protège que 20% des animaux.

La figure 3 représente l'activité dose réponses du muradimétide dans la protection des souris contre l'infection par l'EMCV.

Les souris Swiss (groupe de 10) ont été prétraitées par le muradimétide avant une infection par 100 DL50 d'unités infectieuses d'EMCV et les souris ont été observées pendant 60 jours.

On voit, dans cette figure, que le muradimétide seul protège 80% des animaux à la dose la plus forte de 600 μg/souris équivalente à 30 mg/kg.

Le muradimétide a également été montré comme actif par administration orale contrairement aux autres dérivés muramyl peptides. L'administration de muradimétide par voie orale 1 h après le challenge infectieux est capable d'augmenter l'activité d'IFN / β administré au même moment par voie intrapéritonéale, comme ceci est montré dans le tableau 13 suivant :

Tableau 13

Traitement Taux de survie

1 h après le challenge final à 60 jours

PBS (contrôle) 0/20

Muradimétide (150 mg/kg) p.o. 1/20 IFN-Q-//3 25,000 U.I. i.p. 6/20 Traitement combiné 10/20 MDM p.o. + IFN i.p.

c) Virus Herpès Si plex type II (HSV II) : HSV II induit chez la souris -des nécroses sévères dans le foie ; le muradimétide à la dose de 300 μg administré après un challenge infectieux par 2.10⁴ U.I. de HSV II est capable d'inhiber le développement de la nécrose le cinquième jour, époque qui représente le pic de la détérioration dans le foie.

Les données représentées dans le tableau 14 suivant ont été obtenues en utilisant des groupes de 10 souris Swiss femelles :

Tableau 14 Activité du muradimétide dans le traitement de 1 ' infection par HSV II

Traitement Nombre de nécroses % à + 1 heure par foie d'inhibition moyenne ± SD

Aucun 94 ± 4 0

MDP 63 ± 7 33

Muradimétide 35 ± 4 63

Dans ces expériences, le muradimétide est capable d'interférer avec l'activité nécrotique du virus diffusé dans le foie. d) Virus de 1'immunodéficience humaine : L'effet de la combinaison deε muramyl peptides avec des doseε suboptimales de drogues anti- rétroviraleε comme le 2 ' ,3 '-dioxycytidine (ddC) , 1'azidothymidine (AZT) et d'autres agents inhibiteurs, a été investigué dans un modèle d'infection HIV de cellules d'origine humaine U937 monoplastoïdeε Con positives.

Le protocole expérimental utilisé pour étudier l'effet deε différentε traitementε εur l'infection virale danε ceε cellules est le suivant :

Des lignées cellulaires U937 non infectées sont incubées pendant 2 h avec un pool de virus en présence de 2 g de polybrène. Aprèε l'infection, les cellules sont centrifugées et les cultures sont. ensuite enεemencéeε dans un milieu RPMI supplémenté avec du sérum de veau foetal. Différentes quantités de dérivéε de muramyl peptideε et d'agents anti-rétroviraux, sont dissoutes dans la culture comme montré plus bas. Les cellules sont ensuite comptées par observation microscopique après coloration au bleu trypan. Association des dérivés muramyl peptides avec l'AZT :

La mesure de l'antigène HIV présent dans des cultures cellulaires infectées et traitées par du MDP ou du muradimétide seuls ou en combinaison avec l'AZT permet de montrer l'activité inhibitrice de ces moléculeε.

La figure 4 repréεentant l'effet des traitements de l'AZT, du MDP ou du muradimétide (MDM) administréε seuls ou en combinaison.

L'activité inhibitrice de doses sub-optimales de 0,01 M d'AZT est manifeste au jour 10, mais non au jour 3 suivant l'infection par le HIV.

Un effet synergique significatif est obtenu en utilisant 10 μg de MDP ou du muradimétide en combinaison avec la dose sub-optimale 0,01 M d'AZT comme il est montré sur le test antigène/HIV.

La combinaison des muramyl peptides._. et de l'AZT montre une activité synergique également au jour 10, une période de temps pour laquelle les muramyl peptides seuls sont inefficaceε.

Effet du Muradimétide sur des souris "MAIDS"

Il existe chez la souris un modèle viral expérimental qui permet de reproduire certains signes du sida. Ce modèle est appelé MAIDS pour "Murine Acquired Immuno Deficiency Syndrome". Ce modèle est conεidéré comme représentant une valeur certaine dans la recherche de médicaments pour prévenir ou traiter des symptômes liés à l'infection par le HIV.

Le virus LP-BM5 de la leucémie murine est un rétrovirus défectif qui est capable d'infecter en particulier les souris C57B1/6. Il a été décrit par Mosier D.E. et al dans J. Exp Med. (1985) 161 766:784 et dans J. Exp. Med (1987) 165 : 1737-1742. Les animaux affectés par le rétrovirus présentent de la lymphadenopathie, une augmentation du volume de la rate (spleno egalie) , des élévations en IgG sériques et une diminution des lymphocytes T "T helper" matures accompagnée d'une suppression deε réponεeε des cellules T aux mitogènes et d'une incapacité à répondre aux εtimuliε antigéniqueε.

La présente expérience montre que le traitement par le Muradimétide chez de telles souris infectées par le rétrovirus depuis 7 jours a permis de corriger les εy ptômes de la maladie.

Leε animaux εont des souriε C57B1/6 femelleε de 7 à 8 εe aineε, exemptes de pathogènes spécifiques de la souris. Des groupes de 10 animaux sont infectés par voie péritonéale par des surnageants infectieux contenant le rétrovirus LP-BM5.

7 jours après l'infection, le groupe expérimental reçoit du Muradimétide soit adminiεtré par voie orale εoit par voie sous cutanée et ce, à une dose de 100 μg par jour pendant 21 jours.

On oberve à la fin du traitement que le Muradimétide a permis d'inhiber le développement anormal de la rate et que les cellules spléniques des animaux traités répondent aux mitogèneε contrairement aux cellules prélevées chez des animaux non traitéε. Ceci a été observé pour la réponse au LPS et à la Con-A (spécifique des cellules T) . Pendant la durée du traitement, il n'y a plus de différence entre les 2 groupes. Enfin, le traitement par le Muradimétide permet de maintenir un taux normal de cellules T helper.

Claims

REVENDICATIONS

1. Composition pharmaceutique immunostimulante active par voie externe, caractérisée en ce qu'elle contient un diester de formule générale I :

dans laquelle :

- R est CH3,

- X est L-Ala ou L-Thr,

- RI est un groupe hydrocarboné possédant de 1 à 4 atomes de carbone,

- R2 est un groupe hydrocarboné possédant l à 2 atomes de carbone, dans une formulation d'administration par voie externe compatible avec une administration de principe actif comprise entre 0,1 mg et 5 mg par kg de poids chez l'homme ou l'animal.

2. Composition pharmaceutique immunostimulante selon la revendication 1 caractérisée en ce que le composé est le muradimétide de formule II :

Nac-Mur-L-Ala-D-Glu[OMe]-OMe

3. Composition pharmaceutique selon les revendications 1 et 2, caractérisée en ce que la voie externe est la voie orale.

4. Composition pharmaceutique selon les revendications 1 et 2, caractérisée en ce que la voie externe est la voie aérosol.

5. Composition pharmaceutique selon les revendications 1 et 2, caractérisée en ce que la voie externe est la voie percutanée.

6. Composition selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un immuno-adjuvant utilisé en accompagnement d'un effet induit par une vaccination.

7. Composition εelon la revendication 6, caractériεée en ce qu'elle peut être adminiεtrée par voie externe avant, pendant ou aprèε une vaccination quel que εoit le mode d'administration de ladite vaccination.

8. Composition selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle est utilisée pour traiter ou prévenir les effets deε infectionε pathogèneε, notamment leε infectionε bactérienneε, viraleε ou parasitaires.

9. Composition εelon la revendication 8 caractérisée en ce que 1'infection bactérienne susceptible d'être traitée est une infection à mycobactéries

10. Composition selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle est utilisée en association avec un agent antiviral, ou un agent anti- rétroviral, la composition et l'agent antiviral étant utiliséε de façon simultanée, séparée ou étalée dans le temps.

11. Compoεition εelon la revendication 9, caractériεée en ce qu'elle est utilisée en association avec un analogue de nucléoside, notamment l'AZT (azidothymidine) ou, le 2 ' ,3-didéoxycytidine, pour une utilisation simultanée εéparée ou étalée danε le tempε.

12. Utiliεation d'un dieεter de formule:

pour la fabrication d'une composition pharmaceutique immunostimulante administrable par voie externe dans une formulation compatible avec une administration de principe actif comprise entre 0,1 et 5 mg par kg de poids chez l'homme ou l'animal.

13. Utilisation selon la revendication 12 caractérisée en ce que le diester est le muradimétide de formule II :

Nac-Mur-L-Ala-D-Glu[OMe]-OMe.

14. Utilisation selon l'une des revendications 12 ou 13 caractériεée en ce que la formulation du diester est compatible avec une administration de principe actif comprises entre 0.5 et 3 mg/kg de poids chez l'homme ou l'animal.

15. Utiliεation εelon l'une des revendications 12, 13 ou 14 caractérisée en ce gue la voie externe est la voie orale, la voie des muqueuseε, la voie percutanée ou la voie aéroεol.

16. Utiliεation de muradimétide selon les revendications 12 à 15, pour la préparation d'un immuno-adjuvant de vaccin.

17. Utilisation selon les revendications 12 à 15 pour la préparation d'un médicament destiné à être utilisé de façon simultanée εéparée ou étalée danε le tempε avec un agent anti-infectieux.

18. Utilisation selon la revendication 17, caractérisée en ce que l'agent anti-infectieux est un agent antiviral notamment un analogue de nucléotide.

19. Utilisation selon les revendications 12 à 15, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique permet de traiter les infections bactériennes, notamment les infections à mycobactéries.