CA2181899A1 - Utilisation de diesters de muramyl peptides, dans une forme orale, comme immunostimulants - Google Patents

Abstract

L'invention concerne une composition pharmaceutique immunostimulante active par voie externe, caractérisée en ce qu'elle contient un diester de formule générale (I) dans laquelle: R est CH3, X est L-Ala ou LThr, R1 est un groupe hydrocarboné possédant de 1 à 4 atomes de carbone, R2 est un groupe hydrocarboné possédant 1 à 2 atomes de carbone, dans une formulation d'administration par voie externe compatible avec une administration de principe actif comprise entre 0,1 mg et 5 mg par kg de poids chez l'homme ou l'animal.

Description

wo9s/19777 2 1 ~ 1 899 I~l/r~C /I
DIESTERs DE MURaMYL ~~ LIE8 DAN8 UNE FORME ORALE
La présente invention est relative à une composition pharmaceutique immunostimulante, active par administration externe, notamment par voie orale, nasale, transcutanee, aérosol ; cet effet immunostimulant pouvant être mis à profit soit pour une activite d'immuno-adjuvant en association avec un vaccin, soit en traitement prophylactique ou thérapeutique d 'une infection éventuellement en association avec un autre traitement approprié au type d ' infection .
Les muramyl peptides et leurs dérivés esters sont une famille de molecules qui ont été décrites dans de nombreuses publications et de nombreux brevets depuis la première description du N-acetyl-Muramyl-L-Alanyl-Disoglutamine (MDP pour muramyl dipeptide).
Brièvement, ils sont capables d ' exercer une grande variéte d'activites biologiques incluant~ une activité
immuno-adjuvante, une activité anti-infectieuse, une activité antitumorale, une activite anti-allergique et une regulation de la sécretion des cytokines.
rer,,r,lAnt, un certain nombre de ces muramyl peptides, s ' ils peuvent présenter des activités biologiques tout à fait prometteuses, présentent souvent des effets secondaires ou des inconvenients qui en empêchent leur utilisation i titre de médicament, notamment des effets toxiques ou une difficulte de formulation du fait de leur faible solubilité dans des solutions aqueuses.
Ils présentent en outre une grande variabilité
dans leur spectre d ' action.
Le seul immuno-adjuvant utilisé en clinique humaine est actuellement l'hydroxyde d'aluminium, mais ce compose n'est actif que par voie systemique, c'e6t-à-dire qu ' il doit être inj ecte par voie parentérale et W0 95119777 2 1 8 1 8 9 9 r~ llr~a ~
n ' est pas actif après administration par voie orale ou transcutanée. De plus, il produit des effets indésirables comme l ' induction d ' anticorps de type IgE
qui creent un risque d'allergie. En outre, il produit principalement une réponse humorale et ne favorise pas la production d ' immunoglobulines sécretoires .
La recherche, par consequent, d'un; - Limulant qui présente a la fois des avantages d'efficacité, de formulation, et de toxicité reste un probleme actuel qui n ' avait encore j amais éte resolu par l ' un ou l ' autre des dérivés du MDP ; en particulier, un - 1 ~teur actif apres administration par voie externe, notamment par voie orale ou percutanée ou aérosol, peut permettre d'envisager une utilisation plus large et plus souple de cet immunostimulant.
La presente invention a justement permis de sélectionner parmi les nl `, c:ux dérivés et analogues du MDP des diesters de formule générale I:

Wo95/19777 2 1 8 1 8 ~/ 9 ~ ~ l/rlvS ~

o 6 / \
CH20H / ~ \
Hc~//~H a / ~
H
a R cH~> - X - N~ CH~O ~1 I
CE~
r CH2 ~O~R2 dans laquelle:
- R est CH3, - X est L-Ala ou L-Thr, - Rl est un groupe hydrocarboné possedant de l a 4 atomes de carbone, - R2 est un groupe hydrocarboné possedant l à 2 atomes de carbone.
Un composé particulier repondant a cette formule est le muradimetide de formule II:
Nac-~qur-L-Ala -D-Glu [ OMe ] -OMe Wo 9~/19777 r~l/r~ 5 ~
2181~9~

lequel muradimetide est soluble dans l'eau, presente une faible toxicite et peut ainsi être intégré a titre de principe actif dans une composition pharmaceutique immunostimulante qui est active par voie externe, notamment par voie orale, percutanée ou aérosol, et ce dans une formulation compatible avec une administration de principe actif comprise entre 0,l mg et 5 mg par kg de poids.
Le muradimetide est une molecule synthétique dont une synthese a éte décrite dans le brevet francais FR760680 .
L'invention consiste donc parmi l'ensemble des dérives du muramyl dipeptide à sélectionner un compose répondant a la formule ci-dessus parmi des dérivés qui avaient déjà ete prealablement décrits, lesdits dérivés présentant a la fois des qualités; - Limulantes remarquables qui permettent de les utiliser comme adjuvants de vaccins, comme substance antibactérienne ou antivirale, et dont la faible toxicite permette également leur administration par voie externe, notamment orale, nasale ou aerosol ou percutanée et ne présentant pas les effets secondaires observes pour le MDP ou d ' autres dérivés, notamment des mono-esters .
La combinaison de toutes ces caracteristiques permet de selectionner les dérivés de formule génerale I et, plus particulièrement, le muradimétide de formule II comme principe actif d ' une composition pharmaceutique immunostimulante administrable par voie externe, notamment par voie orale, percutanée ou aerosol, active dans une formulation compatible avec une administration comprise entre 0, l mg et 5 mg/kg de poids chez l ' homme ou l ' animal . Les doses préferées etant de o, 5 mg ~ 3 mg/kg.
Une propriéte interessante de la composition selon l ' invention est qu ' il s ' agit d ' un immuno-adj uvant W0 95/19777 ~ P~ r~ / /
utilisable en accompagnement d'un effet induit par une vaccination. Plus particulierement, la composition pharmaceutique utilisee comme adjuvant peut être administrée avant, pendant ou après une vaccination quel que soit le mode d ' administration de cette dernière et par cet effet immuno-adjuvant conduire à
une synthèse accrue d ' anticorps protecteurs et permettre, le cas écheant, l'economie d'un ou deux rappels ~-~c~cs~ i res dans le cadre de la vaccination classique. L'activité adjuvante s'obtient également si la première administration de la molécule est effectuée au moment du rappel. Dans tous les cas de figure, on obtient à la fois une augmentation des anticorps et une modification du profil isotypique en faveur de 1 ' immunité secrétoire.
La composition pharmaceutique; -~Limulante de 1 ' invention peut egalement être utilisée pour prévenir ou traiter les infections virales, _bacteriennes, parasitaires ou autres.
Le muradimetide notamment a la capacité tout à
fait remarquable parmi 1 ' ensemble des dérivés du MDP
d'être actif dans la protection des sujets traités contre une infection lorsqu'il est administre par voie externe après ladite infection, un exemple particulierement interessant de voie externe étant la voie orale (per os).
Les diesters de formule 1 peuvent etre utilisés pour la fabrication d'une composition pharmaceutique immuno-stimulante administrable par voie externe, et si la voie orale est particulièrement intéressante, d'autres voies telles la voie des muqueuses, la voie percutanée, ou la voie aérosol sont également utilisables .
Une autre particularité tout a fait remarguable du muradimétide et des autres composes inclus dans la Wo 95119777 2 1 a 1 8 9 9 ~ r~ "

formule I ci-dessus dans la composition pharmaceutique de l ' invention est leur capacité a présenter une synergie dans l'effet protecteur à l'egard d'une infection lorsqu1elle est administrée con~ointement ou parallèlement à un autre composé antiviral ou anti-infectieux. Par exemple, lorsque la composition de l ' invention est utilisée en association avec l 'AZT dans le traitement des infections par HIV, une protection est observée lorsque l'AZT est administré à une dose suboptimale de O.Ol M d'AZT, dose ne confèrant aucune protection à l ' egard d ' une infection quand elle est administree seule, cette utilisation pouvant être simultanée, séparée ou étalée dans le temps.
Les exemples suivants montreront de façon non limitative et plus démonstrative, comment la combinaison des qualites du muradimétide, choisi à
titre d'exemple, dans les composes de formule I en font un candidat de choix dans la fabrication d'une composition immunostimulante administrable par voie externe, et notamment par voie orale.
Dans ces exemples, les f igures ont les significations suivantes:
- La figure l représente l'activité adjuvante du muradimétide (~DM) administre oralement sur la réponse anticorps de la souris a un vaccin hepatite B. Deux groupes de 8 souris Swiss femelles de 7 a 8 51''n~; nf~c:
reçoivent par voie sous-cutanée au jour l et au jour 30, 1 ~Lg d'antigènes (HBS Ag) absorbé sur alum (135 ~Lg). Un groupe experimental reçoit simultanément l mg de muradimétide par voie orale.
- La f igure 2 represente l ' activité protectrice du muradimetide contre une infection par le v~rus EMC, c'est-à-dire le taux de survie a 60 jours exprime en pourcentage de souris swiSS traitees par le W0 9~119177 ~ 8 q q p~ r~ _ "
muradimétide de façon systémique après une infection par l ' l~ NCV .
- La f igure 3 represente l ' activité dose-reponse du muradimetide administre dans la protection des souris contre une infection EMCV.
- La figure 4 représente l'effet du MDP ou du muradimétide (MDM) en association ou non avec un traitement antirétroviral par l 'AZT sur la production d ' antigenes HIV dans des cultures de cellules U937 infectées par le virus HIV.
- EXEMP1E I: Ph~rmacologie génerale:
l ) Etude de la pyrogénicité
Le tableau l est une comparaison de l ' ef fet pyrogène chez le lapin du muradimétide et du MDP
administres par la voie veineuse (i.v. ) . Les essais de pyrogénicité ont été realises en suivant les règles de la pharmacopée europeenne.
Ces données montrent que le muradimetide n ' est pas pyrogene quand il est administré a des lapins a la dose de 3 mg/kg, alors que la dose minimum pyrogene du MDP
est voisine de 0,33 mg/kg. En effet, lorsque 6 lapins par groupe sont utilises, la pharmacopée dit un produit a) apyrogene a la dose administrée quand la somme des élevations maximum de température observées chez ces lapins pendant la durée de l ' essai est inférieure à 3 ' .
b) pyrogène quand cette somme est supérieure a 4 et douteux donc que l ' essai doit ~tre répéte sur un plus grand nombre d ' animaux lorsque la somme est supérieure

2 3.

WOg5/19777 P~llr~_.'~. Il Tableau 1 Muradimétide MDP
Dosages Lapin Delta T Lapin Delta T
n n 0,33mg/kg 1 0,10 1 0,10 2 0,30 2 0,20

3 0,40 3 0,30

4 0,20 4 1,20 0,05 5 0,60 6 0,00 6 0,65 -1-.05 3.05 1mg/kg 1 0,75 1 0,60 2 0,50 2 1,20 3 0,80 3 0,50 4 0,40 4 0,70 0,10 5 0,40 6 0,10 6 0,80 2.65 4.20 3mg/kg 1 1,10 1 1,50 2 0,55 2 0,30 3 0,20 3 0,45 4 0,15 4 0,50 0,70 5 0,80 6 0,20 6 0,50 2.90 4 .05 2 ~ Mesure de la leucopenie chez les lapins La plupart des derives et analogues de MDP
induisent une leucopenie lorsqu ' ils sont administrés a des lapins. Au contraire, le muradimetide ne modifie pas la numération sanguine comme cela est indique dans le tableau 2 suivant:

~Vo 9~/19777 2 8 ~ 8 9 9 1 ~I/r~ ~ "
Tableau 2 Traitement Leucocytes/mm3 100 ,ug/kg/i.v. T. 0 T + 3 heures Muradimétide 7850 7700 3 ) Absence d ' induction du sommeil lent Le muradimétide et le MDP ont été administrés à
des lapins soit I . V. soit par la voie intracerébroventriculaire (I-C.V.) soit oralement (PØ). Les doses minimum somnogènes capables d'induire du sommeil paradoxal sont reportees sur le tableau suivant. Ces resultats montrent que la dose somnogene minimum du muradimétide est lO fois plus élevée que celle du MDP par voie parentérale et qu ' il n ' est pas actif par la voie orale.
Tableau 3 Absence d ' activité somnogene du muradimetide administré oralement Administration Doses somnogènes minimales/kg Muradimetide MDP
I.V. 1 mg lO0 ~Lg I.C.V. 1 ,~cg 0.025 ~g P.~. n~q:ti~ `: 10 mg 1 mg WO 9~/19777 . ~ rl~S_,. I l - EXEMPLE II: Activité adjuvante du muradimétide en ~dministr~tion orale:
Le muradimétide est administré oralement simultanément avec une vaccination parentérale par un antigene .
1) Reponse à la sérum albumine humaine (BSA~:
L ' activite: ad j uvante du muradimetide, c ' est-à-dire sa capacité à augmenter la réponse anticorps à
1 ' antigene (BSA) a éte comparée avec 1 ' activité de plusieurs autres muramyl peptides après administration a des souris soit par voie orale, soit par voie sous-cutanée .
La BSA est administree en tant qu ' antigene, touj ours par voie sous-cutanée . Les résultats sont indiqués dans le tableau 4 suivant:
Tableau 4 Administration Muramyl peptides ¦ Nom abrége de 1 ' adjuvant Per os S. C.
Témoins (sans adjuvant) 30 30 Nac-Mur-L-Ala-D-iGln MDP 1100 700 Nac-Mur-L-Ser-D-iGln MDP sérine 450 1300 Nac-Mur-N-Methyl-L-Ala-D-iGln 100 450 Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OMe Murametide 100 500 Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OnBu Murabutide 100 700 Nac-Mur-L-Ala-D-Glu MDPA 200 1000 Nac-Mur-L-Ala-D-Glu* (OMe) OMe Muradimetide 1100 1350 Nac-Mur-L-Ala-D-Glu (OMe) OnBu 200 500 Nac-Mur-L-Ala-D-Glu-OMe 200 450 Nac-Mur-L-Ala-D-Glu-OnBu 80 550 ~ D-Glu peut être substitue sur les fonctions carboxyles en c~ -ou ~. Les substitutions faites en ~ sont indiquées entre parentheses .

W095/19777 2 ~ 8 1 89q P~l/rl~ r //
La BSA est donnee en sous-cutanée a raison de 0, 5 mg le j our 0 et le j our 3 0 . Le MDP et ses dérivés ou analogues sont donnés uniquement le j our 0, soit à
raison de 1 mg per os, soit de 0, l mg melange avec 1 ' antigène en sous-cutanée.
Les anticorps sont mesures par hémaglutination passive au jour 36.
Nous voyons dans ce tableau que trois ~~ -~^~
parmi les plus efficaces sont le MDP, le MDPA et le muradimétide. Le MDP sérine etant hautement pyrogène, il est inutilisable en therapeutique.
Les resultats plus detailles comparant ces trois composes sont donnés dans le tableau 5 suivant:
Tableau 5 Comparaison entre l ' activité adjuvante du MDP
et du muradimetide donnés en sous-cutanee ou par voie orale Ad uvant Nombre Réponse anticorps ] de souriS (gamme de titres) Témoins (sans 150 30 (<3-400) ad j uvant ) MDP S.C. 150 700 (50-3200) MDP PØ 50 1100 (50--3200) Muradimetide S.C. 32 1350 (100-3200) Muradimetide PØ 16 1100 (50-3200) MDPA S.C. 32 lO00 (200-3200) MDPA PØ 16 200 (12--800) Les conditions experimentales sont les mêmes que celles decrites dans le tableau 4 ci-dessus.
Ces donnees r ILLt:llL que seulement deux molécules, le MDP et le muradimetide, sont actives de façon W095/19777 P~l/r~_ ll significative quand elles sont donnees par voie orale 6imultAr~ ~ avec l ' antigene administré par voie parentérale .
De façon intéressante, le MDPA dont le muradimétide est le derive diester methylique, est actif lorsqu ' il est administre par voie systémique, mais peu actif quand il est administré par voie orale indiquant que l ' activité biologique du muradimétide administré oralement ne peut être attribuée a la formation de MDPA resultant d'une hydrolyse de ses groupes esters méthyliques.
Compte tenu de la toxicité du MDP telle qu ' elle est connue et rappelée plus haut, il est clair que, parmi l 'ensemble des dérives et analogues du MDP, seul le muradimétide presente la combinaison des qualites de non-toxicite et d'activite adjuvante lorsqu'il est administre par voie orale.
2 ) Réponse à un vaccin hépatite B : _ L'antigene utilise est un antigene de surface recombinant du virus hepatite B (HBS) obtenu par recombinaison genetique et administre, absorbe sur de 1 ' hydroxyde d ' aluminium .
Il a été inj ecte par voie sous-cutanée a des souris Swiss au j our l et au j our 21. Le muradimétide a été donne oralement en meme temps que le vaccin.
Les résultats obtenus sont representés dans la figure l; dans cette figure, des souris Swiss (8 par groupe) recoivent par voie sous-cutanee l ~g de HBS Ag (Pasteur Mérieux Serums et Vaccins) et du muradimetide par voie orale (l mg). Un rappel est donné au trentième j our .
La figure l indique clairement que cette administration orale a de façon considérable augmente la réponse au vaccin et permet une production b~Allco~
plus precoce d ' anticorps contre l ' antigene vaccinant.

Wo 95/19777 P~
~181189q 3 ) Réponse à un peptide synthétiaue d ' Escherichia coli administré par voie orale:
Le peptide represente la copie d ' une structure vaccinante d'un antigene de surface d'Escherichia coli.
Cet antigène est connu pour être un antigène potentiellement protecteur chez les humains.
Le peptide a ete encapsule dans des microsphères poly(DL-lactide coglycolide) et donné par voie orale a des souris Swiss femelles soit seul, soit avec le muradimetide administré soit par voie sous-cutanée, soit par voie orale. La réponse anticorps dans le serum a eté évaluée par test ELISA soit contre le peptide, soit contre la structure naturelle de la protéine.
Le tableau 6 ci-dessous représente la recnnn~; Cc~nce de la protéine naturelle par les anticorps obtenus apres administration orale du peptide synthetique encapsulé dans les microsphères.
Tableau 6 Groupes Réponse anticorps contre Peptide Protéine synthe- naturelle tique E. coli peptide PØ 300 200 E. coli peptide PØ 1100 1200 + muradimetide S . C.
E. coli peptide+ muradimétide PØ 4000 2000 Les souris Swiss ont re$u les j ours 1 et 3 0 par voie orale 10 ~Lg du peptide synthétique. Le peptide a éte incorpore dans les microsphères et le muradimetide dans une solution saline a été administré soit en W0 95/19777 ~ r~' l /
2~81899 sous-cutanee (lQ0 ILg), soit par voie orale à raison d'l mg par souris.
Ces données montrent que le muradimétide, particul ierement lorsqu ' il est donné par voie orale a permis d ' obtenir dans le sérum des anticorps recr,nn~; cc~nt 1 ' antigène synthétique et sa structure naturelle .
4 ) Le muradimetide est administre oralement avec une i ; ~ation secondaire par un antigene administré
par voie parenterale:
L'influence de l'administration orale du muramyl peptide au moment d ' une inj ection si ron~ i re d ' antigène ; c~nt a été evaluee par la production d ' isotype d ' anticorps produits dans le serum et par la présence d'IgA sécretoires (recherchées dans le fluide intestinal ) .
Un antigene protecteur de Shistosoma mansoni (SMAg) a été administre par voie sous-cutanée a des souris Swiss (un groupe de 8) au jour 1 et au jour 21;
cet antigène est absorbé sur 1 ' hydroxyde d ' aluminium.
Pour l'i isation sF~-nna~ire~ les souris recoivent par voie orale 1 mg de muradimétide. Les résultats 60nt donnés dans le tableau suivant:

WO95/19777 2 1 8 1 8 9 9 ~ r~ . //

Tableau 7 Influence du muradimetide administre oralement au temps du rappel sur la réponse humorale au SMAg T In i cAtion Titres anticorps dans Primaire Secondaire Liquide Sérum intestinal IgA IgG IgA IgE
SMAg + alum SMAg + alum 7&00 2250 <100 1210 SMAg + alum SMAg + alum + 15000 3250 <100 <100 muradimetide p . o .
Ces résultats démontrent que le muramyl dipeptide administré lors de 1 ' i , i cAtion spcr)nrlA i re peut augmenter et moduler la reponse a un antigène administre par voie parenterale.
L'administration du muradimetide a augmenté la synthèse spécifique d'IgA sécretoire. De facon surprenante, il a diminué considérablement la production d'IgE dans le sérum, confirmant en cela que 1 ' administration orale de muradimétide peut moduler le profil isotypique de la reponse anticorps.
4 ) Le muradimétide et 1 ' antigène sont administrés par voie orale ; le muradimetide n ' étant administré que lors de l~i ication C~cr~n(lAire.
REPONSE A IA CHAINE ~ DE LA TOXINE CHOLERIQUE
L ' influence du muradimétide administre par voie orale en meme temps que 1~ i i cation sec~nrlA i re a egalement été étudiée dans la réponse anticorps a un immunogène actif par voie orale: la chaine ~ de la toxine cho l ér i que ( B CT ) .

Wo 95/19777 . ~ I/r~'.'~
2 ~ ~ ] ~9~

Des experiences ont été realisees dans un groupe de 8 souris Swiss femelles recevant chacune d ' elle par voie orale lO ,ug de ~CT, deux fois à trois ~s~~~in-~c d ' intervalle.
Les anticorps sont mesures par la technique ELISA
dans le sérum e~ dans les lavages vaginaux au jour 28.
Les résultats sont exprimés dans le tableau 8 suivant .
Tab l eau 8 Activite adj uvante du MDP associée avec vaccin oral ADJUVANT ANTI-,~CT
Dans le Dans le sérum l iquide vaginal IgG IgA IgG IgA
Contrôle (sans adjuvant) 1800 900 20 5 Murad imet i de p . o . l mg ~ 6 0 0 2 7 0 0 3 5 8 5 au j our 25 Cette experience demontre que le muradimetide administré par voie orale en même temps qu ' un rappel d '; i qation par un vaccin oral peut exercer son pouvoir adjuvant aussi bien au niveau de l ' immunite systémique qu ' au niveau de l ' immunite mucosale mesure par la quantite~d'IgA sécrétoire.

Wo95/19777 2 1 8 1 8 9 9 i~ "
- EXEMPLE III : Activité anti-infectieuse du muradimétide admini~tré par voie orale:
l~ Protection contre les bacteries:
la: Infection par une mycobactérie De nombreuses souches de mycobactéries en particulier parmi les mycobacteria tuberculosis sont résistantes aux antibiotiques. La tuberculose est redevenue un problème majeur de santé et bien sûr particulierement chez les individus immuno déprimés. Un médicament administre oralement et augmentant les défenses contre ce type d'affection revet donc une importance considérable non seulement dans le domaine de la tuberculose mais également dans celui des infections opportunistes liées a de nombreuses souches de mycobactéries.
Le Muradimétide a éte montré capable de proteger la souris contre une infection par Mycobacterium Fortuitum. Cet effet est obtenu en particulier par des animaux traites par l 'AZT qui a comme effets secondaires connus de provoquer une immuno dépression et par voie de conséquence d ' accroitre la sensibilité
aux agressions bacteriennes ou virales.
I~n modèle utilise est une infection par Mycobacterium Fortuitum chez la souris. Les animaux sont des souris femelles C57Bl/6 de 8 semaines. Ils sont divises en 3 groupes de 8 animaux: -a) un groupe de témoins reçoit de l 'AZT per ospendant 3 semaines a raison de 3 mg par souris, trois fois par semaine, b) un second groupe de témoins n ' est pas traité, c) le groupe expérimental reçoit du Muradimetide a la dose de l mg en même temps que l 'AZT.
Les animaux des trois groupes sont éprouvés le l.^n~^~9; n de la dernière administration d ' AZT seul ou associe. Ils reçoivent une injection par voie veineuse Wo 95/19777 P~ ~a'~
218189q de 2 x 107 unités infectantes de M. Fortuitum. Les animaux sont suivis pendant 20 jours.
Les resultats cumules de deux experiences réalisees dans res memes conditions experimentales sont donnés dans le tableau 9 suivant:
Tableau 9 Survie au j our Témoin non traites 16 4 1 0 0 Temoin - AZT 16 6 2 2 2 Groupe AZT + Muradimetide 16 16 14 14 14 Il est clair que le Muradimétide a fl~ ..I r~ une très forte activite anti-mycobacterienne.
lb: Infection par Klebsiella pneumoniae Le muradim~tide est administré soit par voie parenterale, soit par voie orale avant ou apres un challenge letal par Klebsiella pneumoniae. Cette administration peut, comme le montre le tableau lO ci-dessous, protéger de la mort les souris traitées cette protection peut être obtenue aussi bien chez les adultes que chez les nouveaux-nes.

V~O 95119777 2 1 8 1 8 9 9 Tableau 10 Activite antibacterienne du muradimétide administré par voie orale et par voie systémique en comparaison avec la molecule parente MDPA
Traitement % de protection (nombre d ' animaux) Jour 1 (avant challenge) Muradimétide.. 100 ~Lg i.v. 53 (16) 2 mg p.o. 50 (24) 100 llg s . c. * 75 (37) MDPA.......... 100 ,ug i.v. 56 (24) 2 mg p.o- 25 (16) Heure + 1 (après challenge) Muradimétide.. 100 ~g i.v. 69 (16) MDPA.......... 100 ,ug i.v. 69 (16) Les animaux sont des souris femelles Swiss de 6/7 semaines, sauf pour le groupe note d ' un astérisque qui est constitue de souris nouveaux-nés.
Ces résultats démontrent que le muradimétide est doue d'une activité immuno-stimulante non spécifique.
De façon surprenante, il se montre comme l 'un des derivés ou analogues du MDP particulièrement efficaces, lorsqu ' il est administré par voie orale et egalement aussi bien avant qu ' après le challenge par une dose mortelle de bacteries.
Au contraire, sa molécule parente, le MDPA, est aussi active que le muradimétide lorsqu'il est administré par voie systémique, mais, par contre, ne montre pas d'activité significative lorsqu'il est WO 95~19777 P~ r~
218189~ --administré oralement (seulement 25% de protection, contre 50% pour le muradimétide).
2 ) Protection contre les virus :
Le muradimetide peut proteger des hôtes contre des infections virales d ' ethiologies diverses comme cela va être montré ci-dessous dans lequel 1 ' immunostimulant a éte demontré actif de la même façon après administration par voie systémique ou administration par voie orale.
a) Virus ~e 1 ' influenz~ :
Le virus de 1 ' influenza de 1 ' espèce APR/8 est capable d ' induire une pneumonie létale chez les souris adultes .
Le muradimetide administre par voie orale 24 h après le challenge infectieux donne par voie orale a eté capable de protéger 30% des animaux observés durant deux s~ in~c, b) Virus ~e l'~ ph~lomyoc2rdite ~E~CV):
L ' EMCV induit dans les souris une encéphalomyocardite sévere c~r~ nt ~ la mort apres

5/6 jours dans nos conditions expérimentales (100 DL50 donnees en intraperitoneal). L'effet protecteur du muradimetide a eté évalue dans ce modele apres administration intraperitoneale.
b.1. Effet prophylactique:
Le muradimetide est administre a la dose de 2 ou 20 mg~kg selon ïes expériences dans des souris 24 h avant une infectlon par 1 'EMCV a la dose de lOo DL50.
Les animaux sont-observés pendant 60 jours.
Les résultats comparatifs obtenus avec différents dérivés du MDP dans le tableau 11 suivant:

Tableau 11 Effet prophylactique Activité anti-virale de dérivés hydrophyles de la famille des muramyl peptides administrés à la souris avant l'injection de 100 DL50 du virus EMCV
Muramyl peptides % de survie (30 µg administrés 24h avant le virus) Muradimétide 30 Muramétide 10 Il est évident à la lecture de ce tableau que le muradimétide seul, sans injection ultérieure d'interféron, permet d'obtenir un pourcentage de survie de 30 % des souris.

Pour mieux mettre en évidence l'activité
remarquable du muradimétide dans le modèle EMCV, des expériences dose-réponse ont été entreprises en utilisant le muradimétide ou d'autres dérivés de muramyl peptides administré 24 h avant l'infection virale, les résultats sont présentés dans le tableau 12 suivant:

WO9S/19777 P~llr~
21~18q9 Tableau 12 Dose e~ficace 50 des deriYes hydrophiles de la famille des muramyl peptides administres à la souris avant 1 ' injection de 100 DL50 du virus EMCV
Muramyl peptides DE50 MDP = > 600 ~Lg MDPA (OCH3) OC4E~9 600 ~g Muradimetide 150 ,ug Murametide 300 I~g .. .. ~ .
DE50 : dose du compose testé permettant d ' assurer la survie de la moitié des animaux.
On voit dans le tableau 12 qu ' une dose de 150 ~g de muradimetide est suffisante pour obtenir 50% de survie .
L'activité anti-virale du muradimétide est illustree par la f igure 2 qui montre qu ' a la dose de 300 ~Lg le muradimetide protege plus de 60% des souris contre la mort par infection virale, le MDP lui ne protège que 20% des animaux.
La figufe 3 représente l'activité dose reponses du muradimetide dans la protection des souris contre 1 ' inf ection par 1 ' EMCV .
Les souris Swiss (groupe de 10) ont été
pretraitees par-le muradimetide avant une infection par 100 DL50 d ' unités infectieuses d ' EMCV et les souris ont eté observees pendant 60 jours.
On voit, dans cette figure, que le muradimétide seul protege 80% des animaux à la dose la plus forte de 600 ~g/souris equivalente a 30 mg/kg.
Le muradimetide a également ete montre comme actif par administration orale contrairement aux autres dérives muramyl peptides.

WO 95/19777 2 1 8 1 8 9 9 ~ /rn7~,1~ //
L ' administration de muradimetide par voie orale h après le challenge infectieux est capable d ' augmenter 1 ' activité d ' IFN ~/~ administré au même moment par voie intrapéritonéale, comme ceci est montre dans le tableau 13 suivant:
Tableau 13 Traitement Taux de survie 1 h après le challenge final a 60 jours PBS (contrôle~ 0/20 Nuradimétide (150 mg/kg) p.o. 1/20 IFN~ 25,000 U.I. i.p. 6/20 Traitement combine 10/20 MDM p . o . + IFN i . p .
c) Virus Herpès Simplex type II (HSV II):
HSV II induit chez la souris _des nécroses sevères dans le foie; le muradimétide à la dose de 300 I~g administre après un challenge infectieux par 2.104 U.I. de HSV II est capable d'inhiber le développement de la nécrose le cinquieme jour, epoque qui represente le pic de la deterioration dans le foie.
Les donnees representées dans le tableau 14 suivant ont eté obtenues en utilisant des groupes de 10 souris Swiss femelles:
, WO gS119777 P.~

Tableau 14 Activité du muradimétide dans le traitement de 1 ' infection par HSV II
Traitement Nombre de nécroses 96 a + 1 heure par foie d ' inhibition moyenne + SD
Aucun 94 $ 4 0 MDP 63 $ 7 33 Muradimétide 35 $ 4 63 Dans ces expériences, le muradimétide est capable d ' interférer avec 1 ' activité necrotique du virus diffusé dans le foie.
d) Virus de 1 '; nd~ficience humaine:
L ' ef fet de la combinaison des muramyl peptides avec des doses suboptimales de drogues anti-retrovirales comme le 2 ', 3 ' -dioxycytidine tddC), l'azidothymidine (AZT) et d'autres agents inhibiteurs, a été investigué dans un modele d ' infection HIV de cellules d ' origine humaine U937 monoplastoldes Con positives .
Le protocole expérimental utilisé pour etudier l'effet des differents traitements sur l'infection virale dans ces cellules est le suivant:
Des lignées cellulaires U937 non infectées sont incubees pendant 2 h avec un pool de virus en présence de 2 g de polybrène. Après 1 ' infection, les cellules sont centrifugees et les cultures sont ensuite ensemencees dans un milieu RPMI supplementé avec du sérum de veau foetal. Différentes quantités de derives de muramyl peptides et d ' agents anti-retroviraux, sont dissoutes dans Ia culture comme montré plus l:~as. Les cellules sont ensuite comptées par observation microscopi~ue après coloration au bleu trypan.

Wo 9Sl19777 2 1 8 1 8 9 9 r~ r~r~
Association des derives muramyl peptides avec l'AZT: -La mesure de 1 ' antigene HIV présent dans des cultures cellulaires infectées et traitées par du MDP
ou du muradimétide seuls ou en combinaison avec 1 'AZT
permet de montrer 1 ' activite inhibitrice de ces molécules .
La figure 4 représentant l'effet des traitements de 1 'AZT, du MDP ou du muradimétide (MDM) administrés seuls ou en combinaison.
L ' activite inhibitrice de doses sub-optimales de 0,01 M d'AZT est manifeste au jour 10, mais non au jour 3 suivant 1 ' inf ection par le HIV .
Un effet synergique significatif est obtenu en utilisant 10 ~Lg de MDP ou du muradimétide en combinaison avec la dose sub-optimale 0, 01 M d ' AZT
comme il est montré sur le test antigène/HIV.
La combinaison des muramyl peptides_ et de l'AZT
montre une activite synergique également au j our 10, une période de temps pour la~uelle les muramyl peptides seuls sont inefficaces.
Effet du Muradimetide sur des souris "MAIDS"
Il existe chez la souris un modèle viral experimental qui permet de reproduire certains signes du sida. Ce modele est appele MAIDS pour "Nurine Acquired Immuno Deficiency Syndrome". Ce modèle est considéré comme représentant une valeur certaine dans la recherche de medicaments pour prévenir ou traiter des symptomes liés a 1 ' infection par le HIV.
Le virus LP-BM5 de la leucémie murine est un retrovirus défectif qui est capable d ' infecter en particulier les souris C57Bl/6. Il a éte décrit par Mosier D.E. et al dans J. Exp Med. (1985~ 161 766:784 et dans J. Exp. Med (1987) 165: 1737-1742.

W0 95/19777 P~
21~1~99 Les animaux a~fectes par le retrovirus presentent de la ly h~riPn~pathie, une augmentation du volume de la rate (splenomegalie), des élévations en IgG sériques et une diminution des lymphocytes T "T helper" matures ~CCt ~nr~née d'une suppression des réponses des cellules T aux mitogènes et d'une ;nc~r~;té à lepu1~dL~ aux stimulis antigeniques.
La présente experience montre que le traitement par le Muradimetide chez de telles sourls infectées par le retrovirus depuis 7 j ours a permis de corriger les symptômes de la maladi~
Les animaux sont des souris C57Bl/6 femelles de 7 à 8 ~ ; nP~, exemptes de pathogènes spécif iques de la souris. Des groupes de l0 animaux sont infectés par voie péritonéale par des surnageants infectieux contenant le rétrovirus LP-BM5.
7 ~ours après l'infection, le groupe expérimental recoit du Muradimétlde soit administré p~r voie orale soit par voie sous cutanee et ce, a une dose de l00 ~Lg par j our pendant 2 l j ours .
On oberve a la fin du traitement que le Muradimétide a permis d ' inhiber le développement anormal de la rate et que les cellules spleniques des animaux traités repondent aux mitogènes contrairement aux cellules prelevees chez des animaux non traites.
Ceci a ete observé pour la reponse au LPS et à la Con-A
~spécifique des cellules T). Pendant la durée du traitement, il n'y a plus de différence entre les 2 groupes. Enfin, le traitement par le Muradimétide permet de maintenir un taux normal de cellules T
helper .

Claims (19)

REVENDICATIONS

1. Composition pharmaceutique immunostimulante active par voie externe, caractérisée en ce qu'elle contient un diester de formule générale I:

dans laquelle:
- R est CH3, - X est L-Ala ou L-Thr, - R1 est un groupe hydrocarbone possédant de 1 à 4 atomes de carbone, - R2 est un groupe hydrocarboné possédant 1 à 2 atomes de carbone, dans une formulation d'administration par voie externe compatible avec une administration de principe actif comprise entre 0,1 mg et 5 mg par kg de poids chez l'homme ou l'animal.

2. Composition pharmaceutique immunostimulante selon la revendication 1 caractérisée en ce que le composé est le muradimétide de formule II:
Nac-Mur-L-Ala-D-Glu[OMe]-OMe

3. Composition pharmaceutique selon les revendications 1 et 2, caractérisée en ce que la voie externe est la voie orale.

4. Composition pharmaceutique selon les revendications 1 et 2, caractérisée en ce que la voie externe est la voie aérosol.

5. Composition pharmaceutique selon les revendications 1 et 2, caractérisée en ce que la voie externe est la voie percutanée.

6. Composition selon l'une des revendications 1 à
5, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un immuno-adjuvant utilisé en accompagnement d'un effet induit par une vaccination.

7. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle peut être administrée par voie externe avant, pendant ou après une vaccination quel que soit le mode d'administration de ladite vaccination.

8. Composition selon l'une des revendications 1 à
5, caractérisée en ce qu'elle est utilisée pour traiter ou prévenir les effets des infections pathogènes, notamment les infections bactériennes, virales ou parasitaires.

9. Composition selon la revendication 8 caractérisée en ce que l'infection bactérienne susceptible d'être traitée est une infection à
mycobactéries

10. Composition selon l'une des revendications 1 à
5, caractérisée en ce qu'elle est utilisée en association avec un agent antiviral, ou un agent anti-rétroviral, la composition et l'agent antiviral étant utilisés de façon simultanée, séparée ou étalée dans le temps.

11. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle est utilisée en association avec un analogue de nucléoside, notamment l'AZT
(azidothymidine) ou, le 2',3-didéoxycytidine, pour une utilisation simultanée séparée ou étalée dans le temps.

12. Utilisation d'un diester de formule:
pour la fabrication d'une composition pharmaceutique immunostimulante administrable par voie externe dans une formulation compatible avec une administration de principe actif comprise entre 0,1 et 5 mg par kg de poids chez l'homme ou l'animal.

13. Utilisation selon la revendication 12 caractérisée en ce que le diester est le muradimétide de formule II :
Nac-Mur-L-Ala-D-Glu[OMe]-OMe.

14. Utilisation selon l'une des revendications 12 ou 13 caractérisée en ce que la formulation du diester est compatible avec une administration de principe actif comprises entre 0.5 et 3 mg/kg de poids chez l'homme ou l'animal.

15. Utilisation selon l'une des revendications 12, 13 ou 14 caractérisée en ce que la voie externe est la voie orale, la voie des muqueuses, la voie percutanée ou la voie aérosol.

16. Utilisation de muradimétide selon les revendications 12 à 15, pour la préparation d'un immuno-adjuvant de vaccin.

17. Utilisation selon les revendications 12 à 15 pour la préparation d'un médicament destiné à être utilisé de façon simultanée séparée ou étalée dans le temps avec un agent anti-infectieux.

18. Utilisation selon la revendication 17, caractérisée en ce que l'agent anti-infectieux est un agent antiviral notamment un analogue de nucléotide.

19. Utilisation selon les revendications 12 à 15, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique permet de traiter les infections bactériennes, notamment les infections à mycobactéries.