CA2181899A1

CA2181899A1 - Use of diesters of muramyl peptides in oral form as immunostimulating agents

Info

Publication number: CA2181899A1
Application number: CA002181899A
Authority: CA
Inventors: Louis Chedid; Francoise Audibert; Pierre Lefrancier
Original assignee: Individual
Current assignee: Vacsyn SA
Priority date: 1994-01-25
Filing date: 1995-01-24
Publication date: 1995-07-27
Also published as: WO1995019777A2; FR2715305B1; EP0741573A1; AU1580995A; WO1995019777A3; JPH09509409A; FR2715305A1

Abstract

The invention relates to an externally active immunostimulating pharmaceutical composition characterized in that it contains a diester having the general formula (I) wherein R is CH3, X is L-Ala or L-Thr, R1 is a hydrocarbonaceous group having from 1 to 4 carbon atoms, R2 is a hydrocarbonaceous group having 1 or 2 carbon atoms, in an externally administered formulation compatible with an administration of active principle comprised between 0.1 mg and 5 mg par kg of weight to human beings or animals.

Description

wo9s/19777 2 1 ~ 1 899 I~l/r~C /I
DIESTERs DE MURaMYL ~~ LIE8 DAN8 UNE FORME ORALE
La présente invention est relative à une composition pharmaceutique immunostimulante, active par administration externe, notamment par voie orale, nasale, transcutanee, aérosol ; cet effet immunostimulant pouvant être mis à profit soit pour une activite d'immuno-adjuvant en association avec un vaccin, soit en traitement prophylactique ou thérapeutique d 'une infection éventuellement en association avec un autre traitement approprié au type d ' infection .
Les muramyl peptides et leurs dérivés esters sont une famille de molecules qui ont été décrites dans de nombreuses publications et de nombreux brevets depuis la première description du N-acetyl-Muramyl-L-Alanyl-Disoglutamine (MDP pour muramyl dipeptide).
Brièvement, ils sont capables d ' exercer une grande variéte d'activites biologiques incluant~ une activité
immuno-adjuvante, une activité anti-infectieuse, une activité antitumorale, une activite anti-allergique et une regulation de la sécretion des cytokines.
rer,,r,lAnt, un certain nombre de ces muramyl peptides, s ' ils peuvent présenter des activités biologiques tout à fait prometteuses, présentent souvent des effets secondaires ou des inconvenients qui en empêchent leur utilisation i titre de médicament, notamment des effets toxiques ou une difficulte de formulation du fait de leur faible solubilité dans des solutions aqueuses.
Ils présentent en outre une grande variabilité
dans leur spectre d ' action.
Le seul immuno-adjuvant utilisé en clinique humaine est actuellement l'hydroxyde d'aluminium, mais ce compose n'est actif que par voie systemique, c'e6t-à-dire qu ' il doit être inj ecte par voie parentérale et W0 95119777 2 1 8 1 8 9 9 r~ llr~a ~
n ' est pas actif après administration par voie orale ou transcutanée. De plus, il produit des effets indésirables comme l ' induction d ' anticorps de type IgE
qui creent un risque d'allergie. En outre, il produit principalement une réponse humorale et ne favorise pas la production d ' immunoglobulines sécretoires .
La recherche, par consequent, d'un; - Limulant qui présente a la fois des avantages d'efficacité, de formulation, et de toxicité reste un probleme actuel qui n ' avait encore j amais éte resolu par l ' un ou l ' autre des dérivés du MDP ; en particulier, un - 1 ~teur actif apres administration par voie externe, notamment par voie orale ou percutanée ou aérosol, peut permettre d'envisager une utilisation plus large et plus souple de cet immunostimulant.
La presente invention a justement permis de sélectionner parmi les nl `, c:ux dérivés et analogues du MDP des diesters de formule générale I:

Wo95/19777 2 1 8 1 8 ~/ 9 ~ ~ l/rlvS ~

o 6 / \
CH20H / ~ \
Hc~//~H a / ~
H
a R cH~> - X - N~ CH~O ~1 I
CE~
r CH2 ~O~R2 dans laquelle:
- R est CH3, - X est L-Ala ou L-Thr, - Rl est un groupe hydrocarboné possedant de l a 4 atomes de carbone, - R2 est un groupe hydrocarboné possedant l à 2 atomes de carbone.
Un composé particulier repondant a cette formule est le muradimetide de formule II:
Nac-~qur-L-Ala -D-Glu [ OMe ] -OMe Wo 9~/19777 r~l/r~ 5 ~
2181~9~

lequel muradimetide est soluble dans l'eau, presente une faible toxicite et peut ainsi être intégré a titre de principe actif dans une composition pharmaceutique immunostimulante qui est active par voie externe, notamment par voie orale, percutanée ou aérosol, et ce dans une formulation compatible avec une administration de principe actif comprise entre 0,l mg et 5 mg par kg de poids.
Le muradimetide est une molecule synthétique dont une synthese a éte décrite dans le brevet francais FR760680 .
L'invention consiste donc parmi l'ensemble des dérives du muramyl dipeptide à sélectionner un compose répondant a la formule ci-dessus parmi des dérivés qui avaient déjà ete prealablement décrits, lesdits dérivés présentant a la fois des qualités; - Limulantes remarquables qui permettent de les utiliser comme adjuvants de vaccins, comme substance antibactérienne ou antivirale, et dont la faible toxicite permette également leur administration par voie externe, notamment orale, nasale ou aerosol ou percutanée et ne présentant pas les effets secondaires observes pour le MDP ou d ' autres dérivés, notamment des mono-esters .
La combinaison de toutes ces caracteristiques permet de selectionner les dérivés de formule génerale I et, plus particulièrement, le muradimétide de formule II comme principe actif d ' une composition pharmaceutique immunostimulante administrable par voie externe, notamment par voie orale, percutanée ou aerosol, active dans une formulation compatible avec une administration comprise entre 0, l mg et 5 mg/kg de poids chez l ' homme ou l ' animal . Les doses préferées etant de o, 5 mg ~ 3 mg/kg.
Une propriéte interessante de la composition selon l ' invention est qu ' il s ' agit d ' un immuno-adj uvant W0 95/19777 ~ P~ r~ / /
utilisable en accompagnement d'un effet induit par une vaccination. Plus particulierement, la composition pharmaceutique utilisee comme adjuvant peut être administrée avant, pendant ou après une vaccination quel que soit le mode d ' administration de cette dernière et par cet effet immuno-adjuvant conduire à
une synthèse accrue d ' anticorps protecteurs et permettre, le cas écheant, l'economie d'un ou deux rappels ~-~c~cs~ i res dans le cadre de la vaccination classique. L'activité adjuvante s'obtient également si la première administration de la molécule est effectuée au moment du rappel. Dans tous les cas de figure, on obtient à la fois une augmentation des anticorps et une modification du profil isotypique en faveur de 1 ' immunité secrétoire.
La composition pharmaceutique; -~Limulante de 1 ' invention peut egalement être utilisée pour prévenir ou traiter les infections virales, _bacteriennes, parasitaires ou autres.
Le muradimetide notamment a la capacité tout à
fait remarquable parmi 1 ' ensemble des dérivés du MDP
d'être actif dans la protection des sujets traités contre une infection lorsqu'il est administre par voie externe après ladite infection, un exemple particulierement interessant de voie externe étant la voie orale (per os).
Les diesters de formule 1 peuvent etre utilisés pour la fabrication d'une composition pharmaceutique immuno-stimulante administrable par voie externe, et si la voie orale est particulièrement intéressante, d'autres voies telles la voie des muqueuses, la voie percutanée, ou la voie aérosol sont également utilisables .
Une autre particularité tout a fait remarguable du muradimétide et des autres composes inclus dans la Wo 95119777 2 1 a 1 8 9 9 ~ r~ "

formule I ci-dessus dans la composition pharmaceutique de l ' invention est leur capacité a présenter une synergie dans l'effet protecteur à l'egard d'une infection lorsqu1elle est administrée con~ointement ou parallèlement à un autre composé antiviral ou anti-infectieux. Par exemple, lorsque la composition de l ' invention est utilisée en association avec l 'AZT dans le traitement des infections par HIV, une protection est observée lorsque l'AZT est administré à une dose suboptimale de O.Ol M d'AZT, dose ne confèrant aucune protection à l ' egard d ' une infection quand elle est administree seule, cette utilisation pouvant être simultanée, séparée ou étalée dans le temps.
Les exemples suivants montreront de façon non limitative et plus démonstrative, comment la combinaison des qualites du muradimétide, choisi à
titre d'exemple, dans les composes de formule I en font un candidat de choix dans la fabrication d'une composition immunostimulante administrable par voie externe, et notamment par voie orale.
Dans ces exemples, les f igures ont les significations suivantes:
- La figure l représente l'activité adjuvante du muradimétide (~DM) administre oralement sur la réponse anticorps de la souris a un vaccin hepatite B. Deux groupes de 8 souris Swiss femelles de 7 a 8 51''n~; nf~c:
reçoivent par voie sous-cutanée au jour l et au jour 30, 1 ~Lg d'antigènes (HBS Ag) absorbé sur alum (135 ~Lg). Un groupe experimental reçoit simultanément l mg de muradimétide par voie orale.
- La f igure 2 represente l ' activité protectrice du muradimetide contre une infection par le v~rus EMC, c'est-à-dire le taux de survie a 60 jours exprime en pourcentage de souris swiSS traitees par le W0 9~119177 ~ 8 q q p~ r~ _ "
muradimétide de façon systémique après une infection par l ' l~ NCV .
- La f igure 3 represente l ' activité dose-reponse du muradimetide administre dans la protection des souris contre une infection EMCV.
- La figure 4 représente l'effet du MDP ou du muradimétide (MDM) en association ou non avec un traitement antirétroviral par l 'AZT sur la production d ' antigenes HIV dans des cultures de cellules U937 infectées par le virus HIV.
- EXEMP1E I: Ph~rmacologie génerale:
l ) Etude de la pyrogénicité
Le tableau l est une comparaison de l ' ef fet pyrogène chez le lapin du muradimétide et du MDP
administres par la voie veineuse (i.v. ) . Les essais de pyrogénicité ont été realises en suivant les règles de la pharmacopée europeenne.
Ces données montrent que le muradimetide n ' est pas pyrogene quand il est administré a des lapins a la dose de 3 mg/kg, alors que la dose minimum pyrogene du MDP
est voisine de 0,33 mg/kg. En effet, lorsque 6 lapins par groupe sont utilises, la pharmacopée dit un produit a) apyrogene a la dose administrée quand la somme des élevations maximum de température observées chez ces lapins pendant la durée de l ' essai est inférieure à 3 ' .
b) pyrogène quand cette somme est supérieure a 4 et douteux donc que l ' essai doit ~tre répéte sur un plus grand nombre d ' animaux lorsque la somme est supérieure wo9s / 19777 2 1 ~ 1,899 I ~ l / r ~ C / I
DIESTERs OF MURaMYL ~~ LIE8 DAN8 AN ORAL FORM
The present invention relates to a immunostimulating pharmaceutical composition, active by external administration, in particular by oral route, nasal, transcutaneous, aerosol; this effect immunostimulant that can be used either for a immuno-adjuvant activity in combination with vaccine, either as a prophylactic treatment or therapeutic of an infection possibly in combination with other treatment appropriate to the type infection.
Muramyl peptides and their ester derivatives are a family of molecules that have been described in numerous publications and numerous patents since the first description of N-acetyl-Muramyl-L-Alanyl-Disoglutamine (MDP for muramyl dipeptide).
Briefly, they are able to exercise great variety of biological activities including ~ an activity immuno-adjuvant, anti-infectious activity, anti-tumor activity, anti-allergic activity and regulation of cytokine secretion.
rer ,, r, lAnt, a number of these muramyl peptides, if they can exhibit biological activities while quite promising, often have effects side effects or disadvantages that prevent their use as a medicine, including effects toxic or difficulty formulating due to their low solubility in aqueous solutions.
They also exhibit great variability in their spectrum of action.
The only immuno-adjuvant used in the clinic human is currently aluminum hydroxide but this compound is only active systemically, this is that is, it must be injected parenterally and W0 95 119 777 2 1 8 1 8 9 9 r ~ llr ~ a ~
is not active after oral administration or transcutaneous. In addition, it produces effects undesirable as the induction of IgE type antibodies who create a risk of allergy. In addition, it produces mainly a humoral response and does not favor the production of secretory immunoglobulins.
The search, therefore, for a; - Limiting which has both efficiency advantages, formulation, and toxicity remains a current problem which had not yet been resolved by one or more the other is a derivative of MDP; in particular, a - 1 active ingredient after administration by route external, especially orally or percutaneously or aerosol, may allow use to be considered wider and more flexible of this immunostimulant.
The present invention has made it possible to select from nl `, c: ux derivatives and analogues of MDP of the diesters of general formula I:

Wo95 / 19777 2 1 8 1 8 ~ / 9 ~ ~ l / rlvS ~

o 6 / \
CH20H / ~ \
Hc ~ // ~ H a / ~
H
at R cH ~> - X - N ~ CH ~ O ~ 1 I
CE ~
r CH2 ~ O ~ R2 in which:
- R is CH3, - X is L-Ala or L-Thr, - Rl is a hydrocarbon group having 4 carbon atoms, - R2 is a hydrocarbon group having 1 to 2 atoms of carbon.
A particular compound corresponding to this formula is the muradimetide of formula II:
Nac- ~ qur-L-Ala -D-Glu [OMe] -OMe Wo 9 ~ / 19777 r ~ l / r ~ 5 ~
2181 ~ 9 ~

which muradimetide is water soluble, present low toxicity and can thus be integrated as of active ingredient in a pharmaceutical composition immunostimulant which is active externally, especially by oral, percutaneous or aerosol route, and this in a formulation compatible with an administration active ingredient between 0.1 mg and 5 mg per kg weight.
Muradimetide is a synthetic molecule whose a summary was described in the French patent FR760680.
The invention therefore consists among all of the muramyl dipeptide derivatives to select a compound having the above formula among derivatives which had already been previously described, said derivatives having both qualities; - Limulants remarkable that allow to use them as vaccine adjuvants, as an antibacterial substance or antiviral, and whose low toxicity allows also their administration externally, especially oral, nasal or aerosol or percutaneous and does not not having the side effects observed for MDP or other derivatives, in particular mono-esters.
The combination of all these features allows to select the derivatives of general formula I and, more particularly, the muradimetide of formula II as active ingredient of a composition immunostimulating pharmaceutical external, including oral, percutaneous or aerosol, active in a formulation compatible with administration between 0.1 mg and 5 mg / kg of weight in humans or animals. Preferred doses being from o, 5 mg ~ 3 mg / kg.
An interesting property of the composition according to the invention is that it is an adjuvant immuno-adj W0 95/19777 ~ P ~ r ~ / /
usable as an accompaniment to an effect induced by a vaccination. More particularly, the composition pharmaceutical used as an adjuvant can be given before, during or after a vaccination whatever the mode of administration of this last and by this immunoadjuvant effect lead to increased synthesis of protective antibodies and allow, if necessary, the economy of one or two reminders ~ - ~ c ~ cs ~ i res in the context of vaccination classic. The adjuvant activity is also obtained if the first administration of the molecule is carried out at the time of the recall. In all cases, we obtains both an increase in antibodies and a modification of the isotypic profile in favor of Secretory immunity.
Pharmaceutical composition; - ~ Limulant of The invention can also be used to prevent or treat viral, _bacterial, parasitic or otherwise.
Muradimetide in particular has the ability to remarkable fact among the set of CDM derivatives to be active in the protection of the subjects treated against infection when administered by route external after said infection, an example particularly interesting from an external point of view being the oral (orally).
Diesters of formula 1 can be used for the manufacture of a pharmaceutical composition immunostimulatory administered externally, and if the oral route is particularly interesting, other pathways such as mucosal pathway, percutaneous, or aerosol are also usable.
Another very remarkable feature of the muradimetide and other compounds included in the Wo 95119777 2 1 to 1 8 9 9 ~ r ~ "

formula I above in the pharmaceutical composition of the invention is their ability to present a synergy in the protective effect towards a infection when administered together or alongside another antiviral or anti infectious. For example, when the composition of the invention is used in combination with AZT in treatment of HIV infections, protection is observed when AZT is administered at a dose suboptimal of O.Ol M AZT, dose conferring no protection against infection when it is administered alone, this use can be simultaneous, separate or spread over time.
The following examples will not show limiting and more demonstrative, how the combination of the qualities of muradimetide, chosen at as an example, in the compounds of formula I make it a prime candidate in making a immunostimulatory composition which can be administered by the external, and especially orally.
In these examples, the figures have the following meanings:
- Figure l represents the adjuvant activity of muradimetide (~ DM) administered orally on the response mouse antibody to hepatitis B vaccine. Two groups of 8 female Swiss mice from 7 to 8 51''n ~; nf ~ c:
receive subcutaneously on day l and day 30, 1 ~ Lg of antigens (HBS Ag) absorbed on alum (135 ~ Lg). An experimental group receives simultaneously l mg muradimetide by mouth.
- Figure 2 shows the protective activity of muradimetide for infection with the EMC virus, that is to say the survival rate at 60 days expressed in percentage of swiSS mice treated with W0 9 ~ 119 177 ~ 8 qqp ~ r ~ _ "
muradimetide systemically after infection by l ~ NCV.
- Figure 3 shows the dose-response activity of muradimetide administers in the protection of mice against an EMCV infection.
- Figure 4 shows the effect of CDM or muradimetide (MDM) in combination or not with a AZT antiretroviral therapy on production of HIV antigens in U937 cell cultures infected with the HIV virus.
- EXEMP1E I: General pharmacology:
l) Study of pyrogenicity Table l is a comparison of the effect pyrogen in rabbits of muradimetide and MDP
administered by the venous route (iv). The trials of pyrogenicity were carried out following the rules of the European Pharmacopoeia.
These data show that muradimetide is not pyrogen when administered to rabbits at the dose 3 mg / kg, while the minimum pyrogenic dose of MDP
is close to 0.33 mg / kg. Indeed, when 6 rabbits by group are used, the pharmacopoeia says a product a) apyrogenic at the dose administered when the sum of maximum temperature rises observed in these rabbits during the duration of the test is less than 3 '.
b) pyrogen when this sum is greater than 4 and doubtful therefore that the test should be repeated on a more large number of animals when the sum is greater

2 3.

WOg5/19777 P~llr~_.'~. Il Tableau 1 Muradimétide MDP
Dosages Lapin Delta T Lapin Delta T
n n 0,33mg/kg 1 0,10 1 0,10 2 0,30 2 0,20 2 3.

WOg5 / 19777 P ~ llr ~ _. '~. he Table 1 Muradimetide MDP
Dosages Delta T Rabbit Delta T Rabbit nn 0.33mg / kg 1 0.10 1 0.10 2 0.30 2 0.20

3 0,40 3 0,30 3 0.40 3 0.30

4 0,20 4 1,20 0,05 5 0,60 6 0,00 6 0,65 -1-.05 3.05 1mg/kg 1 0,75 1 0,60 2 0,50 2 1,20 3 0,80 3 0,50 4 0,40 4 0,70 0,10 5 0,40 6 0,10 6 0,80 2.65 4.20 3mg/kg 1 1,10 1 1,50 2 0,55 2 0,30 3 0,20 3 0,45 4 0,15 4 0,50 0,70 5 0,80 6 0,20 6 0,50 2.90 4 .05 2 ~ Mesure de la leucopenie chez les lapins La plupart des derives et analogues de MDP
induisent une leucopenie lorsqu ' ils sont administrés a des lapins. Au contraire, le muradimetide ne modifie pas la numération sanguine comme cela est indique dans le tableau 2 suivant:

~Vo 9~/19777 2 8 ~ 8 9 9 1 ~I/r~ ~ "
Tableau 2 Traitement Leucocytes/mm3 100 ,ug/kg/i.v. T. 0 T + 3 heures Muradimétide 7850 7700 3 ) Absence d ' induction du sommeil lent Le muradimétide et le MDP ont été administrés à
des lapins soit I . V. soit par la voie intracerébroventriculaire (I-C.V.) soit oralement (PØ). Les doses minimum somnogènes capables d'induire du sommeil paradoxal sont reportees sur le tableau suivant. Ces resultats montrent que la dose somnogene minimum du muradimétide est lO fois plus élevée que celle du MDP par voie parentérale et qu ' il n ' est pas actif par la voie orale.
Tableau 3 Absence d ' activité somnogene du muradimetide administré oralement Administration Doses somnogènes minimales/kg Muradimetide MDP
I.V. 1 mg lO0 ~Lg I.C.V. 1 ,~cg 0.025 ~g P.~. n~q:ti~ `: 10 mg 1 mg WO 9~/19777 . ~ rl~S_,. I l - EXEMPLE II: Activité adjuvante du muradimétide en ~dministr~tion orale:
Le muradimétide est administré oralement simultanément avec une vaccination parentérale par un antigene .
1) Reponse à la sérum albumine humaine (BSA~:
L ' activite: ad j uvante du muradimetide, c ' est-à-dire sa capacité à augmenter la réponse anticorps à
1 ' antigene (BSA) a éte comparée avec 1 ' activité de plusieurs autres muramyl peptides après administration a des souris soit par voie orale, soit par voie sous-cutanée .
La BSA est administree en tant qu ' antigene, touj ours par voie sous-cutanée . Les résultats sont indiqués dans le tableau 4 suivant:
Tableau 4 Administration Muramyl peptides ¦ Nom abrége de 1 ' adjuvant Per os S. C.
Témoins (sans adjuvant) 30 30 Nac-Mur-L-Ala-D-iGln MDP 1100 700 Nac-Mur-L-Ser-D-iGln MDP sérine 450 1300 Nac-Mur-N-Methyl-L-Ala-D-iGln 100 450 Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OMe Murametide 100 500 Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OnBu Murabutide 100 700 Nac-Mur-L-Ala-D-Glu MDPA 200 1000 Nac-Mur-L-Ala-D-Glu* (OMe) OMe Muradimetide 1100 1350 Nac-Mur-L-Ala-D-Glu (OMe) OnBu 200 500 Nac-Mur-L-Ala-D-Glu-OMe 200 450 Nac-Mur-L-Ala-D-Glu-OnBu 80 550 ~ D-Glu peut être substitue sur les fonctions carboxyles en c~ -ou ~. Les substitutions faites en ~ sont indiquées entre parentheses .

W095/19777 2 ~ 8 1 89q P~l/rl~ r //
La BSA est donnee en sous-cutanée a raison de 0, 5 mg le j our 0 et le j our 3 0 . Le MDP et ses dérivés ou analogues sont donnés uniquement le j our 0, soit à
raison de 1 mg per os, soit de 0, l mg melange avec 1 ' antigène en sous-cutanée.
Les anticorps sont mesures par hémaglutination passive au jour 36.
Nous voyons dans ce tableau que trois ~~ -~^~
parmi les plus efficaces sont le MDP, le MDPA et le muradimétide. Le MDP sérine etant hautement pyrogène, il est inutilisable en therapeutique.
Les resultats plus detailles comparant ces trois composes sont donnés dans le tableau 5 suivant:
Tableau 5 Comparaison entre l ' activité adjuvante du MDP
et du muradimetide donnés en sous-cutanee ou par voie orale Ad uvant Nombre Réponse anticorps ] de souriS (gamme de titres) Témoins (sans 150 30 (<3-400) ad j uvant ) MDP S.C. 150 700 (50-3200) MDP PØ 50 1100 (50--3200) Muradimetide S.C. 32 1350 (100-3200) Muradimetide PØ 16 1100 (50-3200) MDPA S.C. 32 lO00 (200-3200) MDPA PØ 16 200 (12--800) Les conditions experimentales sont les mêmes que celles decrites dans le tableau 4 ci-dessus.
Ces donnees r ILLt:llL que seulement deux molécules, le MDP et le muradimetide, sont actives de façon W095/19777 P~l/r~_ ll significative quand elles sont donnees par voie orale 6imultAr~ ~ avec l ' antigene administré par voie parentérale .
De façon intéressante, le MDPA dont le muradimétide est le derive diester methylique, est actif lorsqu ' il est administre par voie systémique, mais peu actif quand il est administré par voie orale indiquant que l ' activité biologique du muradimétide administré oralement ne peut être attribuée a la formation de MDPA resultant d'une hydrolyse de ses groupes esters méthyliques.
Compte tenu de la toxicité du MDP telle qu ' elle est connue et rappelée plus haut, il est clair que, parmi l 'ensemble des dérives et analogues du MDP, seul le muradimétide presente la combinaison des qualites de non-toxicite et d'activite adjuvante lorsqu'il est administre par voie orale.
2 ) Réponse à un vaccin hépatite B : _ L'antigene utilise est un antigene de surface recombinant du virus hepatite B (HBS) obtenu par recombinaison genetique et administre, absorbe sur de 1 ' hydroxyde d ' aluminium .
Il a été inj ecte par voie sous-cutanée a des souris Swiss au j our l et au j our 21. Le muradimétide a été donne oralement en meme temps que le vaccin.
Les résultats obtenus sont representés dans la figure l; dans cette figure, des souris Swiss (8 par groupe) recoivent par voie sous-cutanee l ~g de HBS Ag (Pasteur Mérieux Serums et Vaccins) et du muradimetide par voie orale (l mg). Un rappel est donné au trentième j our .
La figure l indique clairement que cette administration orale a de façon considérable augmente la réponse au vaccin et permet une production b~Allco~
plus precoce d ' anticorps contre l ' antigene vaccinant.

Wo 95/19777 P~
~181189q 3 ) Réponse à un peptide synthétiaue d ' Escherichia coli administré par voie orale:
Le peptide represente la copie d ' une structure vaccinante d'un antigene de surface d'Escherichia coli.
Cet antigène est connu pour être un antigène potentiellement protecteur chez les humains.
Le peptide a ete encapsule dans des microsphères poly(DL-lactide coglycolide) et donné par voie orale a des souris Swiss femelles soit seul, soit avec le muradimetide administré soit par voie sous-cutanée, soit par voie orale. La réponse anticorps dans le serum a eté évaluée par test ELISA soit contre le peptide, soit contre la structure naturelle de la protéine.
Le tableau 6 ci-dessous représente la recnnn~; Cc~nce de la protéine naturelle par les anticorps obtenus apres administration orale du peptide synthetique encapsulé dans les microsphères.
Tableau 6 Groupes Réponse anticorps contre Peptide Protéine synthe- naturelle tique E. coli peptide PØ 300 200 E. coli peptide PØ 1100 1200 + muradimetide S . C.
E. coli peptide+ muradimétide PØ 4000 2000 Les souris Swiss ont re$u les j ours 1 et 3 0 par voie orale 10 ~Lg du peptide synthétique. Le peptide a éte incorpore dans les microsphères et le muradimetide dans une solution saline a été administré soit en W0 95/19777 ~ r~' l /
2~81899 sous-cutanee (lQ0 ILg), soit par voie orale à raison d'l mg par souris.
Ces données montrent que le muradimétide, particul ierement lorsqu ' il est donné par voie orale a permis d ' obtenir dans le sérum des anticorps recr,nn~; cc~nt 1 ' antigène synthétique et sa structure naturelle .
4 ) Le muradimetide est administre oralement avec une i ; ~ation secondaire par un antigene administré
par voie parenterale:
L'influence de l'administration orale du muramyl peptide au moment d ' une inj ection si ron~ i re d ' antigène ; c~nt a été evaluee par la production d ' isotype d ' anticorps produits dans le serum et par la présence d'IgA sécretoires (recherchées dans le fluide intestinal ) .
Un antigene protecteur de Shistosoma mansoni (SMAg) a été administre par voie sous-cutanée a des souris Swiss (un groupe de 8) au jour 1 et au jour 21;
cet antigène est absorbé sur 1 ' hydroxyde d ' aluminium.
Pour l'i isation sF~-nna~ire~ les souris recoivent par voie orale 1 mg de muradimétide. Les résultats 60nt donnés dans le tableau suivant:

WO95/19777 2 1 8 1 8 9 9 ~ r~ . //

Tableau 7 Influence du muradimetide administre oralement au temps du rappel sur la réponse humorale au SMAg T In i cAtion Titres anticorps dans Primaire Secondaire Liquide Sérum intestinal IgA IgG IgA IgE
SMAg + alum SMAg + alum 7&00 2250 <100 1210 SMAg + alum SMAg + alum + 15000 3250 <100 <100 muradimetide p . o .
Ces résultats démontrent que le muramyl dipeptide administré lors de 1 ' i , i cAtion spcr)nrlA i re peut augmenter et moduler la reponse a un antigène administre par voie parenterale.
L'administration du muradimetide a augmenté la synthèse spécifique d'IgA sécretoire. De facon surprenante, il a diminué considérablement la production d'IgE dans le sérum, confirmant en cela que 1 ' administration orale de muradimétide peut moduler le profil isotypique de la reponse anticorps.
4 ) Le muradimétide et 1 ' antigène sont administrés par voie orale ; le muradimetide n ' étant administré que lors de l~i ication C~cr~n(lAire.
REPONSE A IA CHAINE ~ DE LA TOXINE CHOLERIQUE
L ' influence du muradimétide administre par voie orale en meme temps que 1~ i i cation sec~nrlA i re a egalement été étudiée dans la réponse anticorps a un immunogène actif par voie orale: la chaine ~ de la toxine cho l ér i que ( B CT ) .

Wo 95/19777 . ~ I/r~'.'~
2 ~ ~ ] ~9~

Des experiences ont été realisees dans un groupe de 8 souris Swiss femelles recevant chacune d ' elle par voie orale lO ,ug de ~CT, deux fois à trois ~s~~~in-~c d ' intervalle.
Les anticorps sont mesures par la technique ELISA
dans le sérum e~ dans les lavages vaginaux au jour 28.
Les résultats sont exprimés dans le tableau 8 suivant .
Tab l eau 8 Activite adj uvante du MDP associée avec vaccin oral ADJUVANT ANTI-,~CT
Dans le Dans le sérum l iquide vaginal IgG IgA IgG IgA
Contrôle (sans adjuvant) 1800 900 20 5 Murad imet i de p . o . l mg ~ 6 0 0 2 7 0 0 3 5 8 5 au j our 25 Cette experience demontre que le muradimetide administré par voie orale en même temps qu ' un rappel d '; i qation par un vaccin oral peut exercer son pouvoir adjuvant aussi bien au niveau de l ' immunite systémique qu ' au niveau de l ' immunite mucosale mesure par la quantite~d'IgA sécrétoire.

Wo95/19777 2 1 8 1 8 9 9 i~ "
- EXEMPLE III : Activité anti-infectieuse du muradimétide admini~tré par voie orale:
l~ Protection contre les bacteries:
la: Infection par une mycobactérie De nombreuses souches de mycobactéries en particulier parmi les mycobacteria tuberculosis sont résistantes aux antibiotiques. La tuberculose est redevenue un problème majeur de santé et bien sûr particulierement chez les individus immuno déprimés. Un médicament administre oralement et augmentant les défenses contre ce type d'affection revet donc une importance considérable non seulement dans le domaine de la tuberculose mais également dans celui des infections opportunistes liées a de nombreuses souches de mycobactéries.
Le Muradimétide a éte montré capable de proteger la souris contre une infection par Mycobacterium Fortuitum. Cet effet est obtenu en particulier par des animaux traites par l 'AZT qui a comme effets secondaires connus de provoquer une immuno dépression et par voie de conséquence d ' accroitre la sensibilité
aux agressions bacteriennes ou virales.
I~n modèle utilise est une infection par Mycobacterium Fortuitum chez la souris. Les animaux sont des souris femelles C57Bl/6 de 8 semaines. Ils sont divises en 3 groupes de 8 animaux: -a) un groupe de témoins reçoit de l 'AZT per ospendant 3 semaines a raison de 3 mg par souris, trois fois par semaine, b) un second groupe de témoins n ' est pas traité, c) le groupe expérimental reçoit du Muradimetide a la dose de l mg en même temps que l 'AZT.
Les animaux des trois groupes sont éprouvés le l.^n~^~9; n de la dernière administration d ' AZT seul ou associe. Ils reçoivent une injection par voie veineuse Wo 95/19777 P~ ~a'~
218189q de 2 x 107 unités infectantes de M. Fortuitum. Les animaux sont suivis pendant 20 jours.
Les resultats cumules de deux experiences réalisees dans res memes conditions experimentales sont donnés dans le tableau 9 suivant:
Tableau 9 Survie au j our Témoin non traites 16 4 1 0 0 Temoin - AZT 16 6 2 2 2 Groupe AZT + Muradimetide 16 16 14 14 14 Il est clair que le Muradimétide a fl~ ..I r~ une très forte activite anti-mycobacterienne.
lb: Infection par Klebsiella pneumoniae Le muradim~tide est administré soit par voie parenterale, soit par voie orale avant ou apres un challenge letal par Klebsiella pneumoniae. Cette administration peut, comme le montre le tableau lO ci-dessous, protéger de la mort les souris traitées cette protection peut être obtenue aussi bien chez les adultes que chez les nouveaux-nes.

V~O 95119777 2 1 8 1 8 9 9 Tableau 10 Activite antibacterienne du muradimétide administré par voie orale et par voie systémique en comparaison avec la molecule parente MDPA
Traitement % de protection (nombre d ' animaux) Jour 1 (avant challenge) Muradimétide.. 100 ~Lg i.v. 53 (16) 2 mg p.o. 50 (24) 100 llg s . c. * 75 (37) MDPA.......... 100 ,ug i.v. 56 (24) 2 mg p.o- 25 (16) Heure + 1 (après challenge) Muradimétide.. 100 ~g i.v. 69 (16) MDPA.......... 100 ,ug i.v. 69 (16) Les animaux sont des souris femelles Swiss de 6/7 semaines, sauf pour le groupe note d ' un astérisque qui est constitue de souris nouveaux-nés.
Ces résultats démontrent que le muradimétide est doue d'une activité immuno-stimulante non spécifique.
De façon surprenante, il se montre comme l 'un des derivés ou analogues du MDP particulièrement efficaces, lorsqu ' il est administré par voie orale et egalement aussi bien avant qu ' après le challenge par une dose mortelle de bacteries.
Au contraire, sa molécule parente, le MDPA, est aussi active que le muradimétide lorsqu'il est administré par voie systémique, mais, par contre, ne montre pas d'activité significative lorsqu'il est WO 95~19777 P~ r~
218189~ --administré oralement (seulement 25% de protection, contre 50% pour le muradimétide).
2 ) Protection contre les virus :
Le muradimetide peut proteger des hôtes contre des infections virales d ' ethiologies diverses comme cela va être montré ci-dessous dans lequel 1 ' immunostimulant a éte demontré actif de la même façon après administration par voie systémique ou administration par voie orale.
a) Virus ~e 1 ' influenz~ :
Le virus de 1 ' influenza de 1 ' espèce APR/8 est capable d ' induire une pneumonie létale chez les souris adultes .
Le muradimetide administre par voie orale 24 h après le challenge infectieux donne par voie orale a eté capable de protéger 30% des animaux observés durant deux s~ in~c, b) Virus ~e l'~ ph~lomyoc2rdite ~E~CV):
L ' EMCV induit dans les souris une encéphalomyocardite sévere c~r~ nt ~ la mort apres 4 0.20 4 1.20 0.05 5 0.60 6 0.00 6 0.65 -1-.05 3.05 1mg / kg 1 0.75 1 0.60 2 0.50 2 1.20 3 0.80 3 0.50 4 0.40 4 0.70 0.10 5 0.40 6 0.10 6 0.80 2.65 4.20 3mg / kg 1 1.10 1 1.50 2 0.55 2 0.30 3 0.20 3 0.45 4 0.15 4 0.50 0.70 5 0.80 6 0.20 6 0.50 2.90 4 .05 2 ~ Measurement of leukopenia in rabbits Most CDM derivatives and analogs induce leukopenia when administered to rabbits. On the contrary, muradimetide does not modify not the blood count as indicated in the following table 2:

~ Vo 9 ~ / 19777 2 8 ~ 8 9 9 1 ~ I / r ~ ~ "
Table 2 Leukocyte treatment / mm3 100, ug / kg / iv T. 0 T + 3 hours Muradimetide 7850 7700 3) Lack of slow sleep induction Muradimetide and MDP were administered to rabbits be I. V. either by the way intracerebroventricular (IC.V.) or orally (PØ). Minimum somnogenic doses capable of inducing REM sleep are reported on the board next. These results show that the somnogenic dose minimum of muradimetide is 10 times higher than that of the parenteral MDP and that it is not active by the oral route.
Table 3 Absence of somnogenic activity of muradimetide administered orally Administration Minimum somnogenic doses / kg Muradimetide MDP
IV 1 mg l00 ~ Lg ICV 1, ~ cg 0.025 ~ g P. ~. n ~ q: ti ~ `: 10 mg 1 mg WO 9 ~ / 19777. ~ rl ~ S_ ,. He - EXAMPLE II: Adjuvant activity of muradimetide in ~ oral administration:
Muradimetide is administered orally simultaneously with parenteral vaccination by a antigen.
1) Response to human albumin serum (BSA ~:
Activity: adjuvant of muradimetide, that is to say its ability to increase the antibody response to The antigen (BSA) was compared with the activity of several other muramyl peptides after administration has mice either orally or sub-cutaneous.
BSA is administered as an antigen, always bear subcutaneously. The results are indicated in the following table 4:
Table 4 Administration Muramyl peptides ¦ Short name of the adjuvant Per os SC
Witnesses (without adjuvant) 30 30 Nac-Mur-L-Ala-D-iGln MDP 1100 700 Nac-Mur-L-Ser-D-iGln MDP serine 450 1300 Nac-Mur-N-Methyl-L-Ala-D-iGln 100 450 Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OMe Murametide 100 500 Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OnBu Murabutide 100 700 Nac-Mur-L-Ala-D-Glu MDPA 200 1000 Nac-Mur-L-Ala-D-Glu * (OMe) OMe Muradimetide 1100 1350 Nac-Mur-L-Ala-D-Glu (OMe) OnBu 200 500 Nac-Mur-L-Ala-D-Glu-OMe 200 450 Nac-Mur-L-Ala-D-Glu-OnBu 80 550 ~ D-Glu can be substituted on the carboxyl functions in c ~ -or ~. The substitutions made in ~ are indicated between parentheses .

W095 / 19777 2 ~ 8 1 89q P ~ l / rl ~ r //
BSA is given subcutaneously at a rate of 0.5 mg on day 0 and on day 3 0. CDM and its derivatives or analogues are given only on day 0, i.e.
1 mg per os, or 0.1 mg mixed with 1 antigen subcutaneously.
Antibodies are measured by hemaglutination passive on day 36.
We see in this table that three ~~ - ~ ^ ~
among the most effective are CDM, MDPA and muradimetide. The serine MDP being highly pyrogenic, it is unusable in therapy.
The more detailed results comparing these three compounds are given in the following table 5:
Table 5 Comparison between adjuvant activity of CDM
and muradimetide given subcutaneously or orally Next Antibody Response Number ] of mice (range of titles) Witnesses (without 150 30 (<3-400) before) MDP SC 150 700 (50-3200) MDP PØ 50 1100 (50--3200) Muradimetide SC 32 1350 (100-3200) Muradimetide PØ 16 1100 (50-3200) MDPA SC 32 lO00 (200-3200) MDPA PØ 16 200 (12--800) The experimental conditions are the same as those described in table 4 above.
These data r ILLt: llL that only two molecules, MDP and muradimetide are active W095 / 19777 P ~ l / r ~ _ ll significant when given orally 6imultAr ~ ~ with antigen administered via parenteral.
Interestingly, the MDPA whose muradimetide is the methyl diester derivative, is active when administered systemically, but not very active when administered orally indicating that the biological activity of muradimetide administered orally cannot be attributed to the formation of MDPA resulting from hydrolysis of its methyl ester groups.
Taking into account the toxicity of MDP as it is known and recalled above, it is clear that, among all of the CDM derivatives and analogs, only muradimetide presents the combination of the qualities of non-toxicity and adjuvant activity when it is administered orally.
2) Response to a hepatitis B vaccine: _ The antigen used is a surface antigen hepatitis B virus (HBS) recombinant obtained by genetic recombination and administers, absorbs on 1 aluminum hydroxide.
He was injected subcutaneously with Swiss mouse on day 1 and day 21. Muradimetide has was given orally at the same time as the vaccine.
The results obtained are shown in the figure l; in this figure, Swiss mice (8 per group) receive subcutaneously l ~ g of HBS Ag (Pasteur Mérieux Serums and Vaccines) and muradimetide orally (1 mg). A reminder is given to the thirtieth d our.
Figure l clearly indicates that this oral administration has dramatically increased the response to the vaccine and allows production b ~ Allco ~
earlier antibody against the vaccinating antigen.

Wo 95/19777 P ~
~ 181189q 3) Response to a synthetic peptide from Escherichia coli administered orally:
The peptide represents the copy of a structure immunization of a surface antigen of Escherichia coli.
This antigen is known to be an antigen potentially protective in humans.
The peptide was encapsulated in microspheres poly (DL-lactide coglycolide) and given orally a female Swiss mice either alone or with the muradimetide administered either subcutaneously, either orally. Antibody response in serum was evaluated by ELISA test either against the peptide, either against the natural structure of the protein.
Table 6 below shows the recnnn ~; Cc ~ nce of natural protein by antibodies obtained after oral administration of the peptide synthetic encapsulated in microspheres.
Table 6 Antibody Response Groups against Protein Peptide natural tick E. coli peptide PØ 300 200 E. coli peptide PØ 1100 1200 + muradimetide S. vs.
E. coli peptide + muradimetide PØ 4000 2000 Swiss mice received days 1 and 3 0 by oral route 10 ~ Lg of the synthetic peptide. The peptide has incorporated into microspheres and muradimetide in saline was administered either in W0 95/19777 ~ r ~ 'l /
2 ~ 81899 subcutaneous (lQ0 ILg), or orally at a rate of l mg per mouse.
These data show that muradimetide, especially when given orally to allowed to obtain antibodies in serum recr, nn ~; cc ~ nt 1 synthetic antigen and its structure natural.
4) Muradimetide is administered orally with an i; ~ secondary ation by an antigen administered parenterally:
The influence of oral administration of muramyl peptide at the time of an injection if antigen ron ~ i re ; c ~ nt was evaluated by isotype production antibodies produced in the serum and by the presence of secretory IgA (sought in the fluid intestinal).
A protective antigen of Shistosoma mansoni (SMAg) has been administered subcutaneously to Swiss mice (a group of 8) on day 1 and day 21;
this antigen is absorbed on aluminum hydroxide.
For sF ~ -nna ~ ire ~ ire ~ mice receive 1 mg muradimetide orally. The 60n results given in the following table:

WO95 / 19777 2 1 8 1 8 9 9 ~ r ~. //

Table 7 Influence of orally administered muradimetide at the time of the reminder on the humoral response to the SMAg T In i cAtion Antibody Titles in Primary Secondary Liquid Serum intestinal IgA IgG IgA IgE
SMAg + alum SMAg + alum 7 & 00 2250 <100 1210 SMAg + alum SMAg + alum + 15000 3250 <100 <100 muradimetide p. o.
These results demonstrate that muramyl dipeptide administered during 1 i, i cAtion spcr) nrlA i re can increase and modulate the response to an antigen administered parenterally.
The administration of muradimetide increased the specific synthesis of secretory IgA. In a way surprisingly it dramatically decreased the production of IgE in serum, confirming that Oral administration of muradimetide can modulate the isotypic profile of the antibody response.
4) Muradimetide and the antigen are administered orally; muradimetide being administered only when i ication C ~ cr ~ n (lAire.
RESPONSE TO IA CHAIN ~ CHOLERIC TOXIN
The influence of muradimetide administered by oral at the same time as 1 ~ ii dry cation ~ nrlA re also studied in the antibody response to a immunogen active by the oral route: the ~ chain of choleric toxin (B CT).

Wo 95/19777. ~ I / r ~ '.' ~
2 ~ ~] ~ 9 ~

Experiments were carried out in a group of 8 female Swiss mice receiving each of them by oral lO, ug of ~ CT, two to three ~ s ~~~ in- ~ c interval.
Antibodies are measured by the ELISA technique in serum e ~ in vaginal washes on day 28.
The results are expressed in Table 8 next .
Water tab 8 Adjuvant activity of the CDM associated with oral vaccine ANTI-, ~ CT ADJUVANT
In the In the vaginal fluid serum IgG IgA IgG IgA
Control (without adjuvant) 1800 900 20 5 Murad imet i de p. o. l mg ~ 6 0 0 2 7 0 0 3 5 8 5 by day 25 This experience demonstrates that muradimetide taken by mouth with a booster of; i qation by an oral vaccine can exercise its adjuvant power both at the level of immunity systemic that at the level of mucosal immunity measures by the amount ~ of secretory IgA.

Wo95 / 19777 2 1 8 1 8 9 9 i ~ "
- EXAMPLE III: Anti-infectious activity of muradimetide administered orally:
Protection against bacteria:
la: Infection with a mycobacterium Many strains of mycobacteria in particularly among mycobacteria tuberculosis are resistant to antibiotics. Tuberculosis is again become a major health problem and of course especially in immunosuppressed individuals. A
drug administered orally and increasing defenses against this type of affection is therefore considerable importance not only in the field tuberculosis but also in that of opportunistic infections linked to many strains of mycobacteria.
Muradimetide has been shown to protect the mouse against a Mycobacterium infection Fortuitum. This effect is obtained in particular by animals treated with AZT which has the effect side effects known to cause immune depression and consequently increase the sensitivity to bacterial or viral attacks.
I ~ n model used is infection by Mycobacterium Fortuitum in mice. Animals are 8 week old female C57Bl / 6 mice. They are divided into 3 groups of 8 animals: -a) a group of controls receives AZT for 3 weeks at a rate of 3 mg per mouse, three times per week, b) a second group of witnesses is not treated, c) the experimental group receives Muradimetide a the dose of 1 mg at the same time as AZT.
The animals of the three groups are tested on l. ^ n ~ ^ ~ 9; n of the last administration of AZT alone or associate. They receive an injection by vein Wo 95/19777 P ~ ~ a '~
218189q of 2 x 107 infecting units of M. Fortuitum. The animals are followed for 20 days.
The cumulative results of two experiments performed under the same experimental conditions are given in the following table 9:
Table 9 Survival today Untreated witness 16 4 1 0 0 Witness - AZT 16 6 2 2 2 AZT + Muradimetide group 16 16 14 14 14 It is clear that Muradimetide has fl ~ ..I r ~ a very strong anti-mycobacterial activity.
lb: Infection with Klebsiella pneumoniae Muradim ~ tide is administered either by parenterally, either orally before or after a challenge letal by Klebsiella pneumoniae. This administration can, as shown in table lO below protect the treated mice from death this protection can be obtained both in adults than in newborns.

V ~ O 95 119 777 2 1 8 1 8 9 9 Table 10 Antibacterial activity of muradimetide administered orally and systemically in comparison with the parent molecule MDPA
Treatment% protection (number of animals) Day 1 (before challenge) Muradimetide .. 100 ~ Lg iv 53 (16) 2 mg po 50 (24) 100 llg s. vs. * 75 (37) MDPA .......... 100, ug iv 56 (24) 2 mg po- 25 (16) Hour + 1 (after challenge) Muradimetide .. 100 ~ g iv 69 (16) MDPA .......... 100, ug iv 69 (16) Animals are 6/7 Swiss female mice weeks, except for the group notes with an asterisk which consists of newborn mice.
These results demonstrate that muradimetide is endowed with non-specific immunostimulatory activity.
Surprisingly, he shows himself as one of the particularly effective derivatives or analogues of MDP, when administered orally and also both before and after the challenge with a dose deadly bacteria.
On the contrary, its parent molecule, MDPA, is as active as muradimetide when it is administered systemically, but does not shows no significant activity when WO 95 ~ 19777 P ~ r ~
218189 ~ -administered orally (only 25% protection, against 50% for muradimetide).
2) Protection against viruses:
Muradimetide can protect hosts from viral infections of various ethiologies as it goes be shown below in which the immunostimulant has was shown active in the same way after systemic administration or administration orally.
a) Virus ~ e 1 'influenz ~:
The influenza virus of the APR / 8 species is capable of inducing lethal pneumonia in mice adults.
Muradimetide administered orally 24 h after the infectious challenge given orally to was able to protect 30% of the animals observed during two s ~ in ~ c, b) Virus ~ e ~ lomyoc2rdite ~ E ~ CV):
EMCV induces in mice a severe encephalomyocarditis c ~ r ~ nt ~ death after

5/6 jours dans nos conditions expérimentales (100 DL50 donnees en intraperitoneal). L'effet protecteur du muradimetide a eté évalue dans ce modele apres administration intraperitoneale.
b.1. Effet prophylactique:
Le muradimetide est administre a la dose de 2 ou 20 mg~kg selon ïes expériences dans des souris 24 h avant une infectlon par 1 'EMCV a la dose de lOo DL50.
Les animaux sont-observés pendant 60 jours.
Les résultats comparatifs obtenus avec différents dérivés du MDP dans le tableau 11 suivant:

Tableau 11 Effet prophylactique Activité anti-virale de dérivés hydrophyles de la famille des muramyl peptides administrés à la souris avant l'injection de 100 DL50 du virus EMCV
Muramyl peptides % de survie (30 µg administrés 24h avant le virus) Muradimétide 30 Muramétide 10 Il est évident à la lecture de ce tableau que le muradimétide seul, sans injection ultérieure d'interféron, permet d'obtenir un pourcentage de survie de 30 % des souris.

Pour mieux mettre en évidence l'activité
remarquable du muradimétide dans le modèle EMCV, des expériences dose-réponse ont été entreprises en utilisant le muradimétide ou d'autres dérivés de muramyl peptides administré 24 h avant l'infection virale, les résultats sont présentés dans le tableau 12 suivant:

WO9S/19777 P~llr~
21~18q9 Tableau 12 Dose e~ficace 50 des deriYes hydrophiles de la famille des muramyl peptides administres à la souris avant 1 ' injection de 100 DL50 du virus EMCV
Muramyl peptides DE50 MDP = > 600 ~Lg MDPA (OCH3) OC4E~9 600 ~g Muradimetide 150 ,ug Murametide 300 I~g .. .. ~ .
DE50 : dose du compose testé permettant d ' assurer la survie de la moitié des animaux.
On voit dans le tableau 12 qu ' une dose de 150 ~g de muradimetide est suffisante pour obtenir 50% de survie .
L'activité anti-virale du muradimétide est illustree par la f igure 2 qui montre qu ' a la dose de 300 ~Lg le muradimetide protege plus de 60% des souris contre la mort par infection virale, le MDP lui ne protège que 20% des animaux.
La figufe 3 représente l'activité dose reponses du muradimetide dans la protection des souris contre 1 ' inf ection par 1 ' EMCV .
Les souris Swiss (groupe de 10) ont été
pretraitees par-le muradimetide avant une infection par 100 DL50 d ' unités infectieuses d ' EMCV et les souris ont eté observees pendant 60 jours.
On voit, dans cette figure, que le muradimétide seul protege 80% des animaux à la dose la plus forte de 600 ~g/souris equivalente a 30 mg/kg.
Le muradimetide a également ete montre comme actif par administration orale contrairement aux autres dérives muramyl peptides.

WO 95/19777 2 1 8 1 8 9 9 ~ /rn7~,1~ //
L ' administration de muradimetide par voie orale h après le challenge infectieux est capable d ' augmenter 1 ' activité d ' IFN ~/~ administré au même moment par voie intrapéritonéale, comme ceci est montre dans le tableau 13 suivant:
Tableau 13 Traitement Taux de survie 1 h après le challenge final a 60 jours PBS (contrôle~ 0/20 Nuradimétide (150 mg/kg) p.o. 1/20 IFN~ 25,000 U.I. i.p. 6/20 Traitement combine 10/20 MDM p . o . + IFN i . p .
c) Virus Herpès Simplex type II (HSV II):
HSV II induit chez la souris _des nécroses sevères dans le foie; le muradimétide à la dose de 300 I~g administre après un challenge infectieux par 2.104 U.I. de HSV II est capable d'inhiber le développement de la nécrose le cinquieme jour, epoque qui represente le pic de la deterioration dans le foie.
Les donnees representées dans le tableau 14 suivant ont eté obtenues en utilisant des groupes de 10 souris Swiss femelles:
, WO gS119777 P.~

Tableau 14 Activité du muradimétide dans le traitement de 1 ' infection par HSV II
Traitement Nombre de nécroses 96 a + 1 heure par foie d ' inhibition moyenne + SD
Aucun 94 $ 4 0 MDP 63 $ 7 33 Muradimétide 35 $ 4 63 Dans ces expériences, le muradimétide est capable d ' interférer avec 1 ' activité necrotique du virus diffusé dans le foie.
d) Virus de 1 '; nd~ficience humaine:
L ' ef fet de la combinaison des muramyl peptides avec des doses suboptimales de drogues anti-retrovirales comme le 2 ', 3 ' -dioxycytidine tddC), l'azidothymidine (AZT) et d'autres agents inhibiteurs, a été investigué dans un modele d ' infection HIV de cellules d ' origine humaine U937 monoplastoldes Con positives .
Le protocole expérimental utilisé pour etudier l'effet des differents traitements sur l'infection virale dans ces cellules est le suivant:
Des lignées cellulaires U937 non infectées sont incubees pendant 2 h avec un pool de virus en présence de 2 g de polybrène. Après 1 ' infection, les cellules sont centrifugees et les cultures sont ensuite ensemencees dans un milieu RPMI supplementé avec du sérum de veau foetal. Différentes quantités de derives de muramyl peptides et d ' agents anti-retroviraux, sont dissoutes dans Ia culture comme montré plus l:~as. Les cellules sont ensuite comptées par observation microscopi~ue après coloration au bleu trypan.

Wo 9Sl19777 2 1 8 1 8 9 9 r~ r~r~
Association des derives muramyl peptides avec l'AZT: -La mesure de 1 ' antigene HIV présent dans des cultures cellulaires infectées et traitées par du MDP
ou du muradimétide seuls ou en combinaison avec 1 'AZT
permet de montrer 1 ' activite inhibitrice de ces molécules .
La figure 4 représentant l'effet des traitements de 1 'AZT, du MDP ou du muradimétide (MDM) administrés seuls ou en combinaison.
L ' activite inhibitrice de doses sub-optimales de 0,01 M d'AZT est manifeste au jour 10, mais non au jour 3 suivant 1 ' inf ection par le HIV .
Un effet synergique significatif est obtenu en utilisant 10 ~Lg de MDP ou du muradimétide en combinaison avec la dose sub-optimale 0, 01 M d ' AZT
comme il est montré sur le test antigène/HIV.
La combinaison des muramyl peptides_ et de l'AZT
montre une activite synergique également au j our 10, une période de temps pour la~uelle les muramyl peptides seuls sont inefficaces.
Effet du Muradimetide sur des souris "MAIDS"
Il existe chez la souris un modèle viral experimental qui permet de reproduire certains signes du sida. Ce modele est appele MAIDS pour "Nurine Acquired Immuno Deficiency Syndrome". Ce modèle est considéré comme représentant une valeur certaine dans la recherche de medicaments pour prévenir ou traiter des symptomes liés a 1 ' infection par le HIV.
Le virus LP-BM5 de la leucémie murine est un retrovirus défectif qui est capable d ' infecter en particulier les souris C57Bl/6. Il a éte décrit par Mosier D.E. et al dans J. Exp Med. (1985~ 161 766:784 et dans J. Exp. Med (1987) 165: 1737-1742.

W0 95/19777 P~
21~1~99 Les animaux a~fectes par le retrovirus presentent de la ly h~riPn~pathie, une augmentation du volume de la rate (splenomegalie), des élévations en IgG sériques et une diminution des lymphocytes T "T helper" matures ~CCt ~nr~née d'une suppression des réponses des cellules T aux mitogènes et d'une ;nc~r~;té à lepu1~dL~ aux stimulis antigeniques.
La présente experience montre que le traitement par le Muradimetide chez de telles sourls infectées par le retrovirus depuis 7 j ours a permis de corriger les symptômes de la maladi~
Les animaux sont des souris C57Bl/6 femelles de 7 à 8 ~ ; nP~, exemptes de pathogènes spécif iques de la souris. Des groupes de l0 animaux sont infectés par voie péritonéale par des surnageants infectieux contenant le rétrovirus LP-BM5.
7 ~ours après l'infection, le groupe expérimental recoit du Muradimétlde soit administré p~r voie orale soit par voie sous cutanee et ce, a une dose de l00 ~Lg par j our pendant 2 l j ours .
On oberve a la fin du traitement que le Muradimétide a permis d ' inhiber le développement anormal de la rate et que les cellules spleniques des animaux traités repondent aux mitogènes contrairement aux cellules prelevees chez des animaux non traites.
Ceci a ete observé pour la reponse au LPS et à la Con-A
~spécifique des cellules T). Pendant la durée du traitement, il n'y a plus de différence entre les 2 groupes. Enfin, le traitement par le Muradimétide permet de maintenir un taux normal de cellules T
helper . 5/6 days under our experimental conditions (100 LD50 intraperitoneal). The protective effect of muradimetide was evaluated in this model after intraperitoneal administration.
b.1. Prophylactic effect:
Muradimetide is given at a dose of 2 or 20 mg ~ kg based on experiments in 24 h mice before infection with EMCV at a dose of 10o LD50.
The animals are observed for 60 days.
Comparative results obtained with different MDP derivatives in the following table 11:

Table 11 Prophylactic effect Anti-viral activity of hydrophylic derivatives of the family muramyl peptides administered to the mouse before injection of 100 LD50 of EMCV virus Muramyl peptides% survival (30 µg administered 24h before the virus) Muradimetide 30 Murametide 10 It is obvious from reading this table that the muradimetide alone, without further injection interferon, provides a percentage of survival than 30% of the mice.

To better highlight the activity remarkable of muradimetide in the EMCV model, dose-response experiments were undertaken in using muradimetide or other derivatives of muramyl peptides given 24 hours before infection viral, results are shown in Table 12 next:

WO9S / 19777 P ~ llr ~
21 ~ 18q9 Table 12 Effective dose 50 of the family's hydrophilic derivatives muramyl peptides administered to mice before injection of 100 LD50 of EMCV virus Muramyl peptides DE50 MDP => 600 ~ Lg MDPA (OCH3) OC4E ~ 9,600 ~ g Muradimetide 150, ug Murametide 300 I ~ g .. .. ~.
ED50: dose of the compound tested making it possible to ensure the survival of half of the animals.
We see in table 12 that a dose of 150 ~ g of muradimetide is sufficient to obtain 50% of survival.
The anti-viral activity of muradimetide is illustrated by f igure 2 which shows that at the dose of 300 ~ Lg muradimetide protects more than 60% of mice against death from viral infection, CDM does not protects only 20% of animals.
Fig. 3 shows the dose response activity of the muradimetide in the protection of mice against 1 infection with EMCV.
Swiss mice (group of 10) were pretreated with muradimetide before infection with 100 LD50 of infectious units of EMCV and mice have been observed for 60 days.
We see in this figure that the muradimetide alone protects 80% of animals at the highest dose of 600 ~ g / mouse equivalent to 30 mg / kg.
Muradimetide has also been shown to be active by oral administration unlike the others muramyl peptide derivatives.

WO 95/19777 2 1 8 1 8 9 9 ~ / rn7 ~, 1 ~ //
Oral administration of muradimetide h after the infectious challenge is able to increase 1 activity of IFN ~ / ~ administered at the same time by intraperitoneal, as shown in the table Next 13:
Table 13 Treatment Survival rate 1 hour after the final challenge at 60 days PBS (control ~ 0/20 Nuradimetide (150 mg / kg) po 1/20 IFN ~ 25,000 UI ip 6/20 Combined treatment 10/20 MDM p. o. + IFN i. p.
c) Herpes Simplex virus type II (HSV II):
HSV II induces necrosis in mice severe in the liver; muradimetide at a dose of 300 I ~ g administer after an infectious challenge by 2.104 HSV II UI is able to inhibit development necrosis on the fifth day, the epoch that represents the peak of deterioration in the liver.
The data represented in table 14 following were obtained using groups of 10 female Swiss mice:
, WO gS119777 P. ~

Table 14 Muradimetide activity in treatment HSV II infection Treatment Number of necroses 96 a + 1 hour per inhibition liver medium + SD
None $ 94 4 0 CDM $ 63 7 33 Muradimetide $ 35 4 63 In these experiments, muradimetide is capable to interfere with the necrotic activity of the virus diffused in the liver.
d) 1 'virus; nd ~ human disability:
The effect of the combination of muramyl peptides with suboptimal doses of anti retrovirals such as 2 ', 3' -dioxycytidine tddC), azidothymidine (AZT) and other inhibitory agents, was investigated in a model of HIV infection of cells of human origin U937 monoplastold Con positive.
The experimental protocol used to study the effect of different treatments on infection viral in these cells is as follows:
Uninfected U937 cell lines are incubated for 2 h with a pool of viruses present 2 g of polybrene. After infection, the cells are centrifuged and the cultures are then seeded in RPMI medium supplemented with fetal calf serum. Different amounts of derivatives muramyl peptides and anti-retroviral agents, are dissolved in the culture as shown above: as. The cells are then counted by observation microscopi ~ eu after staining with trypan blue.

Wo 9Sl19777 2 1 8 1 8 9 9 r ~ r ~ r ~
Association of muramyl peptide derivatives with AZT: -Measuring the HIV antigen present in cell cultures infected and treated with CDM
or muradimetide alone or in combination with AZT
shows the inhibitory activity of these molecules.
Figure 4 representing the effect of treatments AZT, MDP or muradimetide (MDM) administered alone or in combination.
The inhibitory activity of suboptimal doses of 0.01 M AZT is manifest on day 10, but not on day 3 according to HIV infection.
A significant synergistic effect is obtained in using 10 ~ Lg of MDP or muradimetide in combination with the sub-optimal 0.01 M dose of AZT
as shown on the antigen / HIV test.
The combination of muramyl peptides_ and AZT
shows synergistic activity also on day 10, a period of time for the muramyl peptides only are ineffective.
Effect of Muradimetide on "MAIDS" Mice There is a viral model in mice experimental which allows certain signs to be reproduced AIDS. This model is called MAIDS for "Nurine Acquired Immuno Deficiency Syndrome ". This model is considered to represent a certain value in looking for drugs to prevent or treat symptoms associated with HIV infection.
The murine leukemia LP-BM5 virus is a defective retrovirus which is capable of infecting in especially C57Bl / 6 mice. It was described by Mosier DE et al in J. Exp Med. (1985 ~ 161,766: 784 and in J. Exp. Med (1987) 165: 1737-1742.

W0 95/19777 P ~
21 ~ 1 ~ 99 Animals affected by retrovirus show ly h ~ riPn ~ pathie, an increase in the volume of spleen (splenomegaly), elevations in serum IgG
and a decrease in mature T helper T cells ~ CCt ~ nr ~ born from a suppression of cell responses T to mitogens and a; nc ~ r ~; té to lepu1 ~ dL ~ aux antigenic stimuli.
The present experience shows that the treatment by Muradimetide in such deaf people infected with the retrovirus since 7 days has made it possible to correct the symptoms of sickness ~
The animals are female C57Bl / 6 mice of 7 at 8 ~; nP ~, free from specific pathogens of mouse. Groups of 10 animals are infected with peritoneal route through infectious supernatants containing the retrovirus LP-BM5.
7 ~ bear after infection, the experimental group receives Muradimétlde to be administered orally either subcutaneously and at a dose of l00 ~ Lg per day for 2 days.
We observe at the end of the treatment that the Muradimetide helped inhibit development abnormal spleen and that the spleen cells of treated animals respond to mitogens unlike cells taken from untreated animals.
This has been observed for the response to LPS and Con-A
~ specific for T cells). During the duration of treatment, there is no longer any difference between the 2 groups. Finally, treatment with Muradimetide helps maintain normal T cell count helper.

Claims

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1. Immunostimulating Pharmaceutical Composition externally active, characterized in that it contains a diester of general formula I:

in which:
- R is CH3, - X is L-Ala or L-Thr, - R1 is a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms, - R2 is a hydrocarbon group having 1 to 2 atoms of carbon, in a formulation for external administration compatible with an administration of active principle between 0.1 mg and 5 mg per kg of body weight in man or animal.

2. Immunostimulating pharmaceutical composition according to claim 1 characterized in that the compound is muradimetide of formula II:
Nac-Mur-L-Ala-D-Glu[OMe]-OMe

3. Pharmaceutical composition according to claims 1 and 2, characterized in that the way external is the oral route.

4. Pharmaceutical composition according to claims 1 and 2, characterized in that the way external is the aerosol route.

5. Pharmaceutical composition according to claims 1 and 2, characterized in that the way external is the percutaneous route.

6. Composition according to one of claims 1 to 5, characterized in that it is an immuno-adjuvant used in accompaniment of an effect induced by a vaccination.

7. Composition according to claim 6, characterized in that it can be administered by external route before, during or after a vaccination regardless of the mode of administration of said vaccination.

8. Composition according to one of claims 1 to 5, characterized in that it is used to treat or prevent the effects of pathogenic infections, including bacterial, viral or parasitic.

9. Composition according to claim 8 characterized in that the bacterial infection likely to be treated is an infection with mycobacteria

10. Composition according to one of claims 1 to 5, characterized in that it is used in association with an antiviral agent, or an antiviral agent retroviral, the composition and the antiviral agent being used simultaneously, separately or spread out in the weather.

11. Composition according to claim 9, characterized in that it is used in combination with a nucleoside analog, especially AZT
(azidothymidine) or, 2',3-dideoxycytidine, for a simultaneous use separated or spread over time.

12. Using a diester of formula:
for the manufacture of a pharmaceutical composition immunostimulant that can be administered externally in a formulation compatible with an administration of active ingredient between 0.1 and 5 mg per kg of weight in humans or animals.

13. Use according to claim 12 characterized in that the diester is muradimetide of formula II:
Nac-Mur-L-Ala-D-Glu[OMe]-OMe.

14. Use according to one of claims 12 or 13 characterized in that the formulation of the diester is compatible with principled administration active ingredient between 0.5 and 3 mg/kg of weight in man or animal.

15. Use according to one of claims 12, 13 or 14 characterized in that the external channel is the oral route, mucosal route, percutaneous route or the aerosol route.

16. Use of muradimetide according to claims 12 to 15, for the preparation of a vaccine immunoadjuvant.

17. Use according to claims 12 to 15 for the preparation of a medicinal product intended to be used simultaneously separated or spread in the time with an anti-infective agent.

18. Use according to claim 17, characterized in that the anti-infective agent is a antiviral agent in particular a nucleotide analogue.

19. Use according to claims 12 to 15, characterized in that the pharmaceutical composition helps treat bacterial infections, including mycobacterial infections.