FR2715305A1

FR2715305A1 - Diesters of muramyl peptides in an oral form.

Info

Publication number: FR2715305A1
Application number: FR9400786A
Authority: FR
Inventors: Chedid Louis; Audibert Francoise; Lefrancier Pierre
Original assignee: Vacsyn SA
Current assignee: Vacsyn SA
Priority date: 1994-01-25
Filing date: 1994-01-25
Publication date: 1995-07-28
Anticipated expiration: 2014-01-25
Also published as: WO1995019777A2; FR2715305B1; EP0741573A1; CA2181899A1; AU1580995A; WO1995019777A3; JPH09509409A

Abstract

The invention relates to an externally active immunostimulating pharmaceutical composition characterized in that it contains a diester having the general formula (I) wherein R is CH3, X is L-Ala or L-Thr, R1 is a hydrocarbonaceous group having from 1 to 4 carbon atoms, R2 is a hydrocarbonaceous group having 1 or 2 carbon atoms, in an externally administered formulation compatible with an administration of active principle comprised between 0.1 mg and 5 mg par kg of weight to human beings or animals.

Description

DIESTERS DE MURAMYL PEPTIDES DANS UNE FORME ORALE
La présente invention est relative à une composition pharmaceutique immunostimulante, active par administration externe, notamment par voie orale, nasale, transcutanée, aérosol ; cet effet immunostimulant pouvant être mis à profit soit pour une activité d'immuno-adjuvant en association avec un vaccin, soit en traitement prophylactique ou thérapeutique d'une infection éventuellement en association avec un autre traitement approprié au type d'infection.MURAMYL PEPTIDE DIESTERS IN ORAL FORM
The present invention relates to an immunostimulatory pharmaceutical composition, active by external administration, especially orally, nasally, transdermally, aerosol; this immunostimulatory effect can be exploited either for an immuno-adjuvant activity in combination with a vaccine, or as a prophylactic or therapeutic treatment of an infection possibly in combination with another treatment appropriate to the type of infection.

Les muramyl peptides et leurs dérivés esters sont une famille de molécules qui ont été décrites dans de nombreuses publications et de nombreux brevets depuis la première description du N-acetyl-Muramyl-L-Alanyl
Disoglutamine (MDP pour muramyl dipeptide).Muramyl peptides and their ester derivatives are a family of molecules that have been described in numerous publications and numerous patents since the first description of N-acetyl-Muramyl-L-Alanyl.
Disoglutamine (MDP for muramyl dipeptide).

Brièvement, il sont capables d'exercer une grande variété d'activités biologiques incluant une activité immuno-adjuvante, une activité anti-infectieuse, une activité antitumorale, une activité anti-allergique et une régulation de la sécrétion des cytokines. Briefly, they are capable of performing a wide variety of biological activities including immunoadjuvant activity, antiinfective activity, antitumor activity, antiallergic activity, and regulation of cytokine secretion.

Cependant, un certain nombre de ces muramyl peptides, s'ils peuvent présenter des activités biologiques tout à fait prometteuses, présentent souvent des effets secondaires ou des inconvénients qui en empêchent leur utilisation à titre de médicament, notamment des effets toxiques ou une difficulté de formulation du fait de leur faible solubilité dans des solutions aqueuses.However, a number of these muramyl peptides, if they can present promising biological activities, often have side effects or disadvantages that prevent their use as a drug, including toxic effects or difficulty in formulation because of their low solubility in aqueous solutions.

Ils présentent en outre une grande variabilité dans leur spectre d'action. They also have a great variability in their spectrum of action.

Le seul immuno-adjuvant utilisé en clinique humaine est actuellement l'hydroxyde d'aluminium, mais ce composé n'est actif que par voie systémique, c'està-dire qu'il doit être injecté par voie parentérale et n'est pas actif après administration par voie orale ou transcutanée. De plus, il produit des effets indésirables comme l'induction d'anticorps de type IgE qui créent un risque d'allergie. En outre, il produit principalement une réponse humorale et ne favorise pas la production d'immunoglobulines sécrétoires. The only immuno-adjuvant used in the human clinical trial is currently aluminum hydroxide, but this compound is active only systemically, ie it must be injected parenterally and is not active. after oral or transcutaneous administration. In addition, it produces side effects such as the induction of IgE antibodies that create a risk of allergy. In addition, it mainly produces a humoral response and does not promote the production of secretory immunoglobulins.

La recherche, par conséquent, d'un immunostimulant qui présente à la fois des avantages d'efficacité, de formulation, et de toxicité reste un problème actuel qui n'avait encore jamais été résolu par l'un ou l'autre des dérivés du MDP ; en particulier, un immunomodulateur actif après administration par voie externe, notamment par voie orale ou percutanée ou aérosol, peut permettre d'envisager une utilisation plus large et plus souple de cet immunostimulant. The search, therefore, for an immunostimulant that has both efficacy, formulation, and toxicity advantages remains a current problem that has never been solved by any of the drug derivatives. CDM; in particular, an active immunomodulator after administration externally, especially orally or percutaneously or aerosol, may allow to consider a wider and more flexible use of this immunostimulant.

La présente invention a justement permis de sélectionner parmi les nombreux dérivés et analogues du
MDP des diesters de formule générale I

dans laquelle - R est CH3, - X est L-Ala ou L-Thr, - R1 est un groupe hydrocarboné possédant de 1 à 4 atomes de carbone, - R2 est un groupe hydrocarboné possédant 1 à 2 atomes de carbone.The present invention has made it possible to select among the numerous derivatives and analogues of
MDP of diesters of general formula I

in which - R is CH 3, - X is L-Ala or L-Thr, - R 1 is a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms, - R 2 is a hydrocarbon group having 1 to 2 carbon atoms.

Un composé particulier répondant à cette formule est le muradimétide de formule II Nac-Mur-L-Ala-D-Glu[OMe]-OMe lequel muradimétide est soluble dans l'eau, présente une faible toxicité et peut ainsi être intégré à titre de principe actif dans une composition pharmaceutique immunostimulante qui est active par voie externe, notamment par voie orale, percutanée ou aérosol, et ce dans une formulation compatible avec une administration de principe actif comprise entre 0,1 mg et 5 mg par kg de poids. A particular compound according to this formula is the muradimetide of formula II Nac-Mur-L-Ala-D-Glu [OMe] -OMe which muradimetide is soluble in water, has a low toxicity and can thus be integrated as a active principle in an immunostimulatory pharmaceutical composition which is active externally, in particular orally, percutaneously or aerosolically, and in a formulation compatible with an administration of active principle of between 0.1 mg and 5 mg per kg of weight.

Le muradimétide est une molécule synthétique dont une synthèse a été décrite dans le brevet français
FR760680.Muradimetide is a synthetic molecule whose synthesis has been described in the French patent
FR760680.

L'invention consiste donc parmi l'ensemble des dérivés du muramyl dipeptide à sélectionner un composé répondant à la formule ci-dessus parmi des dérivés qui avaient déjà été préalablement décrits, lesdits dérivés présentant à la fois des qualités immunostimulantes remarquables qui permettent de les utiliser comme adjuvants de vaccins, comme substance antibactérienne ou antivirale, et dont la faible toxicité permette également leur administration par voie externe, notamment orale, nasale ou aérosol ou percutanée et ne présentant pas les effets secondaires observés pour le
MDP ou d'autres dérivés, notamment des mono-esters.The invention therefore consists of all the derivatives of the muramyl dipeptide to select a compound corresponding to the above formula from derivatives which had already been previously described, said derivatives having both remarkable immunostimulatory qualities which make it possible to use them as vaccine adjuvants, as an antibacterial or antiviral substance, and whose low toxicity also allows their administration externally, especially orally, nasally or aerosol or percutaneously and not having the side effects observed for the
MDP or other derivatives, especially mono-esters.

La combinaison de toutes ces caractéristiques permet de sélectionner les dérivés de formule générale
I et, plus particulièrement, le muradimétide de formule II comme principe actif d'une composition pharmaceutique immunostimulante administrable par voie externe, notamment par voie orale, percutanée ou aérosol, active dans une formulation compatible avec une administration comprise entre 0,1 mg et 5 mg/kg de poids chez l'homme ou l'animal. Les doses préférées étant de 0,5 mg à 3 mg/kg.The combination of all these characteristics makes it possible to select the derivatives of general formula
And, more particularly, the muradimetide of formula II as active principle of an immunostimulatory pharmaceutical composition which can be administered externally, in particular orally, percutaneously or aerosolically, and which is active in a formulation compatible with an administration of between 0.1 mg and 5 mg. mg / kg body weight in humans or animals. Preferred doses are from 0.5 mg to 3 mg / kg.

Une propriété intéressante de la composition selon l'invention est qu'il s'agit d'un immuno-adjuvant utilisable en accompagnement d'un effet induit par une vaccination. Plus particulièrement, la composition pharmaceutique utilisée comme adjuvant peut être administrée avant, pendant ou après une vaccination quel que soit le mode d'administration de cette dernière et par cet effet immuno-adjuvant conduire à une synthèse accrue d'anticorps protecteurs et permettre, le cas échéant, l'économie d'un ou deux rappels nécessaires dans le cadre de la vaccination classique. L'activité adjuvante s'obtient également si la première administration de la molécule est effectuée au moment du rappel. Dans tous les cas de figure, on obtient à la fois une augmentation des anticorps et une modification du profil isotypique en faveur de l'immunité sécrétoire. An interesting property of the composition according to the invention is that it is an immuno-adjuvant that can be used to accompany an effect induced by vaccination. More particularly, the pharmaceutical composition used as an adjuvant can be administered before, during or after vaccination, whatever the mode of administration of the latter, and by this immunoadjuvant effect lead to an increased synthesis of protective antibodies and allow the where appropriate, the saving of one or two reminders necessary in the context of traditional vaccination. Adjuvant activity is also achieved if the first administration of the molecule is performed at the time of the booster. In all cases, we obtain both an increase in antibodies and a change in the isotype profile in favor of secretory immunity.

La composition pharmaceutique immunostimulante de l'invention peut également être utilisée pour prévenir ou traiter les infections virales, bactériennes, parasitaires ou autres. The immunostimulatory pharmaceutical composition of the invention may also be used to prevent or treat viral, bacterial, parasitic or other infections.

Le muradimétide notamment a la capacité tout à fait remarquable parmi l'ensemble des dérivés du MDP d'être actif dans la protection des sujets traités contre une infection lorsqu'il est administré par voie externe après ladite infection, un exemple particulièrement intéressant de voie externe étant la voie orale (per os). Muradimetide in particular has the quite remarkable ability among all CDM derivatives to be active in protecting subjects treated against infection when it is administered externally after said infection, a particularly interesting example of an external route. being the oral route (per os).

Les diesters de formule 1 peuvent être utilisés pour la fabrication d'une composition pharmaceutique immuno-stimulante administrable par voie externe, et si la voie orale est particulièrement intéressante, d'autres voies telles la voie des muqueuses, la voie percutanée, ou la voie aérosol sont également utilisables. The diesters of formula 1 may be used for the manufacture of an externally administrable immunostimulatory pharmaceutical composition, and if the oral route is of particular interest, other routes such as the mucosal route, the percutaneous route, or the route aerosol can also be used.

Une autre particularité tout à fait remarquable du muradimétide et des autres composés inclus dans la formule I ci-dessus dans la composition pharmaceutique de l'invention est leur capacité à présenter une synergie dans l'effet protecteur à l'égard d'une infection lorsqu'elle est administrée conjointement ou parallèlement à un autre composé antiviral ou antiinfectieux. Par exemple, lorsque la composition de l'invention est utilisée en association avec 1'AZT dans le traitement des infections par HIV, une protection est observée lorsque 1'AZT est administré à une dose suboptimale de 0.01 M d'AZT, dose ne confèrant aucune protection à l'égard d'une infection quand elle est administrée seule, cette utilisation pouvant être simultanée, séparée ou étalée dans le temps. Another quite remarkable feature of muradimetide and the other compounds included in formula I above in the pharmaceutical composition of the invention is their ability to synergize in the protective effect against infection when it is administered together or in parallel with another antiviral or antiinfective compound. For example, when the composition of the invention is used in combination with AZT in the treatment of HIV infections, protection is observed when AZT is administered at a suboptimal dose of 0.01 M AZT, a dose which confers no protection against infection when administered alone, this use may be simultaneous, separate or spread over time.

Les exemples suivants montreront de façon non limitative et plus démonstrative, comment la combinaison des qualités du muradimétide, choisi à titre d'exemple, dans les composés de formule I en font un candidat de choix dans la fabrication d'une composition immunostimulante administrable par voie externe, et notamment par voie orale. The following examples will show in a nonlimiting and more demonstrative way, how the combination of the qualities of the muradimetide, chosen as an example, in the compounds of formula I make it a candidate of choice in the manufacture of an immunostimulatory composition administrable by externally, and particularly orally.

Dans ces exemples, les figures ont les significations suivantes - La figure 1 représente l'activité adjuvante du muradimétide administré oralement sur la réponse anticorps de la souris à un vaccin hépatite B. In these examples, the figures have the following meanings: FIG. 1 represents the adjuvant activity of muradimetide administered orally on the antibody response of the mouse to a hepatitis B vaccine.

- La figure 2 représente l'activité protectrice du muradimétide contre une infection par le virus EMC, c'est-à-dire le taux de survie à 60 jours exprimé en pourcentage de souris Swiss traitées par le muradimétide de façon systémique après une infection par 1'EMCV.FIG. 2 represents the protective activity of muradimetide against EMC virus infection, that is, the 60-day survival rate expressed as a percentage of Swiss mice treated with muradimetide systemically after infection with 1'EMCV.

- La figure 3 représente l'activité dose-réponse du muradimétide administré dans la protection des souris contre une infection EMCV.FIG. 3 represents the dose-response activity of muradimetide administered in the protection of mice against an EMCV infection.

- La figure 4 représente l'effet du MDP ou du muradimétide (MDM) en association ou non avec un traitement antirétroviral par 1'AZT sur la production d'antigènes HIV dans des cultures de cellules U937 infectées par le virus HIV. FIG. 4 represents the effect of MDP or muradimetide (MDM) in combination or not with antiretroviral treatment by AZT on the production of HIV antigens in cultures of U937 cells infected with the HIV virus.

- EXEMPLE I : Pharmacologie générale
1) Etude de la pyrogénicité
Le tableau 1 est une comparaison de l'effet pyrogène chez le lapin du muradimétide et du MDP administrés par la voie veineuse (i.v.). Les essais de pyrogénicité ont été réalisés en suivant les règles de la pharmacopée européenne.EXAMPLE I: General Pharmacology
1) Study of pyrogenicity
Table 1 is a comparison of the pyrogenic effect in rabbits of muradimetide and MDP administered by the venous route (iv). The pyrogenicity tests were carried out following the rules of the European Pharmacopoeia.

Ces données montrent que le muradimétide n'est pas pyrogène quand il est administré à des lapins à la dose de 3 mg/kg, alors que la dose minimum pyrogène du MDP est voisine de 0,33 mg/kg. En effet, lorsque 6 lapins par groupe sont utilisés, la pharmacopée dit un produit a) apyrogène à la dose administrée quand la somme des élévations maximum de température observées chez ces lapins pendant la durée de l'essai est inférieure à 3". These data show that muradimetide is not pyrogenic when administered to rabbits at a dose of 3 mg / kg, whereas the minimum pyrogen dose of MDP is close to 0.33 mg / kg. Indeed, when 6 rabbits per group are used, the pharmacopoeia says a product a) pyrogen-free at the dose administered when the sum of the maximum temperature rises observed in these rabbits during the duration of the test is less than 3 ".

b) pyrogène quand cette somme est supérieure à 4 et douteux donc que l'essai doit être répété sur un plus grand nombre d'animaux lorsque la somme est supérieure à 3". (b) pyrogenic when that sum is greater than 4 and doubtful so that the test must be repeated on a larger number of animals when the sum is greater than 3 ".

Tableau 1

Table 1

<tb> <SEP> Muradimétide <SEP> MDP
<tb> Dosages <SEP> Lapin <SEP> Delta <SEP> T <SEP> Lapin <SEP> Delta <SEP> T
<tb> <SEP> n <SEP> n0 <SEP>
<tb> 0,33mg/kg <SEP> 1 <SEP> 0,10 <SEP> 1 <SEP> 0,10
<tb> <SEP> 2 <SEP> 0,30 <SEP> 2 <SEP> 0,20
<tb> <SEP> 3 <SEP> 0,40 <SEP> 3 <SEP> 0,30
<tb> <SEP> 4 <SEP> 0,20 <SEP> 4 <SEP> 1,20
<tb> <SEP> 5 <SEP> 0,05 <SEP> 5 <SEP> 0,60
<tb> <SEP> 6 <SEP> 0,00 <SEP> 6 <SEP> 0,65
<tb> <SEP> 10.05 <SEP> 30.05 <SEP>
<tb> 1 <SEP> mg/kg <SEP> 1 <SEP> 0,75 <SEP> 1 <SEP> 0,60
<tb> <SEP> 2 <SEP> 0,50 <SEP> 2 <SEP> 1,20
<tb> <SEP> 3 <SEP> 0,80 <SEP> 3 <SEP> 0,50
<tb> <SEP> 4 <SEP> 0,40 <SEP> 4 <SEP> 0,70
<tb> <SEP> 5 <SEP> 0,10 <SEP> 5 <SEP> 0,40
<tb> <SEP> 6 <SEP> 0,10 <SEP> 6 <SEP> 0,80
<tb> <SEP> 2 .65 <SEP> 4 .20 <SEP>
<tb> 3 <SEP> mg/kg <SEP> 1 <SEP> 1,10 <SEP> 1 <SEP> 1,50
<tb> <SEP> 2 <SEP> 0,55 <SEP> 2 <SEP> 0,30
<tb> <SEP> 3 <SEP> 0,20 <SEP> 3 <SEP> 0,45
<tb> <SEP> 4 <SEP> 0,15 <SEP> 4 <SEP> 0,50
<tb> <SEP> 5 <SEP> 0,70 <SEP> 5 <SEP> 0,80
<tb> <SEP> 6 <SEP> 0,20 <SEP> 6 <SEP> 0,50
<tb> <SEP> 2 .90 <SEP> 4ç.05 <SEP>
<tb>
2) Mesure de la leucopénie chez les lapins
La plupart des dérivés et analogues de MDP induisent une leucopénie lorsqu'ils sont administrés à des lapins. Au contraire, le muradimétide ne modifie pas la numération sanguine comme cela est indiqué dans le tableau 2 suivant
Tableau 2

<tb><SEP> Muradimetide <SEP> MDP
<tb> Assays <SEP> Rabbit <SEP> Delta <SEP> T <SEP> Rabbit <SEP> Delta <SEP> T
<tb><SEP> n <SEP> n0 <SEP>
<tb> 0.33mg / kg <SEP> 1 <SEP> 0.10 <SEP> 1 <SEP> 0.10
<tb><SEP> 2 <SEP> 0.30 <SEP> 2 <SEP> 0.20
<tb><SEP> 3 <SEP> 0.40 <SEP> 3 <SEP> 0.30
<tb><SEP> 4 <SEP> 0.20 <SEP> 4 <SEP> 1.20
<tb><SEP> 5 <SEP> 0.05 <SEP> 5 <SEP> 0.60
<tb><SEP> 6 <SEP> 0.00 <SEP> 6 <SEP> 0.65
<tb><SEP> 10.05 <SEP> 30.05 <SEP>
<tb> 1 <SEP> mg / kg <SEP> 1 <SEP> 0.75 <SEP> 1 <SEP> 0.60
<tb><SEP> 2 <SEP> 0.50 <SEP> 2 <SEP> 1.20
<tb><SEP> 3 <SEP> 0.80 <SEP> 3 <SEP> 0.50
<tb><SEP> 4 <SEP> 0.40 <SEP> 4 <SEP> 0.70
<tb><SEP> 5 <SEP> 0.10 <SEP> 5 <SEP> 0.40
<tb><SEP> 6 <SEP> 0.10 <SEP> 6 <SEP> 0.80
<tb><SEP> 2 .65 <SEP> 4 .20 <SEP>
<tb> 3 <SEP> mg / kg <SEP> 1 <SEP> 1.10 <SEP> 1 <SEP> 1.50
<tb><SEP> 2 <SEP> 0.55 <SEP> 2 <SEP> 0.30
<tb><SEP> 3 <SEP> 0.20 <SEP> 3 <SEP> 0.45
<tb><SEP> 4 <SEP> 0.15 <SEP> 4 <SEP> 0.50
<tb><SEP> 5 <SEP> 0.70 <SEP> 5 <SEP> 0.80
<tb><SEP> 6 <SEP> 0.20 <SEP> 6 <SEP> 0.50
<tb><SEP> 2 .90 <SEP> 4c.05 <SEP>
<Tb>
2) Measurement of Leukopenia in Rabbits
Most derivatives and analogues of MDP induce leucopenia when administered to rabbits. In contrast, muradimetide does not affect blood counts as shown in Table 2 below
Table 2

<tb> Traitement <SEP> Leucocytes/mm3
<tb> 100 <SEP> g/kg/i.v. <SEP> T.0 <SEP> T <SEP> + <SEP> 3 <SEP> heures
<tb> Muradimétide <SEP> 7850 <SEP> 7700
<tb> MDP <SEP> 7600 <SEP> 2000
<tb>
3) Absence d'induction du sommeil lent
Le muradimétide et le MDP ont été administrés à des lapins soit I.V. soit par la voie intracérébroventriculaire (I.C.V.) soit oralement (P.O.). Les doses minimum somnogènes capables d'induire du sommeil paradoxal sont reportées sur le tableau suivant. Ces résultats montrent que la dose somnogène minimum du muradimétide est 10 fois plus élevée que celle du MDP par voie parentérale et qu'il n'est pas actif par la voie orale.<tb> Treatment <SEP> Leukocytes / mm3
<tb> 100 <SEP> g / kg / iv <SEP> T.0 <SEP> T <SEP> + <SEP> 3 <SEP> hours
<tb> Muradimetide <SEP> 7850 <SEP> 7700
<tb> CDM <SEP> 7600 <SEP> 2000
<Tb>
3) Absence of slow sleep induction
Muradimetide and MDP were administered to rabbits either IV or intracerebroventricularly (ICV) or orally (PO). The minimum somnogenic doses capable of inducing paradoxical sleep are reported in the following table. These results show that the minimum somnogenic dose of muradimetide is 10-fold higher than that of parenteral MDP and that it is not active by the oral route.

Tableau 3
Absence d'activité somnogène du muradimétide
administré oralement

Table 3
Absence of somnogenic activity of muradimetide
administered orally

<tb> <SEP> Administration <SEP> Doses <SEP> somnogènes <SEP> minimales/kg
<tb> <SEP> Muradimétide <SEP> MDP
<tb> I.V. <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 100 <SEP> <SEP> Ag <SEP>
<tb> I.C.V. <SEP> 1 <SEP> g <SEP> 0.025 <SEP> g <SEP>
<tb> P.O. <SEP> négatif <SEP> à <SEP> 10 <SEP> mg <SEP> 1 <SEP> mg
<tb> - EXEMPLE Il : Activité adjuvante du muradimétide en administration orale
Le muradimétide est administré oralement simultanément avec une vaccination parentérale par un antigène.<tb><SEP> Administration <SEP> Doses <SEP> somnogens <SEP> minimum / kg
<tb><SEP> Muradimetide <SEP> MDP
<tb> IV <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 100 <SEP><SEP> Ag <SEP>
<tb> ICV <SEP> 1 <SEP> g <SEP> 0.025 <SEP> g <SEP>
<tb> PO <SEP> negative <SEP> to <SEP> 10 <SEP> mg <SEP> 1 <SEP> mg
EXAMPLE II Adjuvant Activity of Muradimetide in Oral Administration
Muradimetide is administered orally simultaneously with parenteral vaccination with an antigen.

1) Réponse à la sérum albumine humaine (BSA)
L'activité adjuvante du muradimétide, c'est-à-dire sa capacité à augmenter la réponse anticorps à l'antigène (BSA) a été comparée avec l'activité de plusieurs autres muramyl peptides après administration à des souris soit par voie orale, soit par voie souscutanée.1) Response to human serum albumin (BSA)
The adjuvant activity of muradimetide, i.e., its ability to increase the antibody response to the antigen (BSA), was compared with the activity of several other muramyl peptides after administration to mice either orally, either subcutaneously.

La BSA est administrée en tant qu'antigène, toujours par voie sous-cutanée. Les résultats sont indiqués dans le tableau 4 suivant
Tableau 4

BSA is administered as an antigen, always subcutaneously. The results are shown in Table 4 below
Table 4

<tb> <SEP> Administration
<tb> Muramyl <SEP> peptides <SEP> Nom <SEP> abrégé <SEP> de <SEP> l'adjuvant
<tb> <SEP> Per <SEP> os <SEP> S.C.
<tb><tb><SEP> Administration
<tb> Muramyl <SEP> Peptides <SEP> Name <SEP> Abbreviated <SEP> of <SEP> Adjuvant
<tb><SEP> Per <SEP> os <SEP> SC
<Tb>

Témoins <SEP> (sans <SEP> adjuvant) <SEP> 30 <SEP> 30
<tb> Nac-Mur-L-Ala-D-iGln <SEP> MDP <SEP> 1100 <SEP> 700
<tb> Nac-Mur-L-Ser-D-iGln <SEP> MDP <SEP> sérine <SEP> 450 <SEP> 1300
<tb> Nac-Mur-N-Methyl-L-Ala-D-iGln <SEP> 100 <SEP> 450
<tb> Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OMe <SEP> Murametide <SEP> 100 <SEP> 500
<tb> Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OnBu <SEP> Murabutide <SEP> 100 <SEP> 700
<tb> Nac-Mur-L-Ala-D-Glu <SEP> MDPA <SEP> 200 <SEP> 1000
<tb> Nac-Mur-L-Ala-D-Glu*(OMe)OMe <SEP> Muradimetide <SEP> 1100 <SEP> 1350
<tb> Nac-Mur-L-Ala-D-Glu(OMe)OnBu <SEP> 200 <SEP> 500
<tb> Nac-Mur-L-Ala-D-Glu-OMe <SEP> 200 <SEP> 450
<tb> Nac-Mur-L-Ala-D-Glu-OnBu <SEP> 80 <SEP> 550
<tb> * D-Glu peut être substitué sur les fonctions carboxyles en a ou a. Les substitutions faites en z sont indiquées entre parenthèses.Controls <SEP> (without <SEP> Adjuvant) <SEP> 30 <SEP> 30
<tb> Nac-Mur-L-Ala-D-iGln <SEP> MDP <SEP> 1100 <SEP> 700
<tb> Nac-Mur-L-Ser-D-iGln <SEP> MDP <SEP> serine <SEP> 450 <SEQ> 1300
<tb> Nac-Mur-N-Methyl-L-Ala-D-iGln <SEP> 100 <SEP> 450
<tb> Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OMe <SEP> Murametide <SEP> 100 <SEP> 500
<tb> Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OnBu <SEP> Murabutide <SEP> 100 <SEP> 700
<tb> Nac-Mur-L-Ala-D-Glu <SEP> MDPA <SEP> 200 <SEP> 1000
<tb> Nac-Mur-L-Ala-D-Glu * (OMe) OMe <SEP> Muradimetide <SEP> 1100 <SEQ> 1350
<tb> Nac-Mur-L-Ala-D-Glu (OMe) OnBu <SEP> 200 <SEP> 500
<tb> Nac-Mur-L-Ala-D-Glu-OMe <SEP> 200 <SEP> 450
<tb> Nac-Mur-L-Ala-D-Glu-OnBu <SEP> 80 <SEP> 550
<tb> * D-Glu can be substituted on the carboxyl functions in a or a. Substitutions made in z are indicated in parentheses.

La BSA est donnée en sous-cutanée à raison de 0,5 mg le jour 0 et le jour 30. Le MDP et ses dérivés ou analogues sont donnés uniquement le jour 0, soit à raison de 1 mg per os, soit de 0,1 mg mélangé avec l'antigène en sous-cutanée. The BSA is given subcutaneously at 0.5 mg on day 0 and day 30. The CDM and its derivatives or analogues are given only on day 0, either at 1 mg per os, or 0, 1 mg mixed with the antigen subcutaneously.

Les anticorps sont mesurés par hémaglutination passive au jour 36. The antibodies are measured by passive hemagglutination on day 36.

Nous voyons dans ce tableau que trois composés parmi les plus efficaces sont le MDP, le MDPA et le muradimétide. Le MDP sérine étant hautement pyrogène, il est inutilisable en thérapeutique. We see in this table that three of the most effective compounds are CDM, MDPA and muradimetide. Since CDM serine is highly pyrogenic, it is unusable in therapeutics.

Les résultats plus détaillés comparant ces trois composés sont donnés dans le tableau 5 suivant
Tableau 5
Comparaison entre l'activité adjuvante du MDP
et du muradimétide donnés en sous-cutanée
ou par voie orale

The more detailed results comparing these three compounds are given in Table 5 below
Table 5
Comparison between the adjuvant activity of the CDM
and muradimetide given subcutaneously
or orally

<tb> <SEP> Adjuvant <SEP> Nombre <SEP> Réponse <SEP> anticorps
<tb> <SEP> de <SEP> souris <SEP> (gamme <SEP> de <SEP> titres)
<tb> Témoins <SEP> (sans <SEP> 150 <SEP> 30 <SEP> ( < 3-400)
<tb> adjuvant)
<tb> MDP <SEP> S.C. <SEP> 150 <SEP> 700 <SEP> (50-3200)
<tb> MDP <SEP> P.O. <SEP> 50 <SEP> 1100 <SEP> (50-3200)
<tb> Muradimetide <SEP> S.C. <SEP> 32 <SEP> 1350 <SEP> (100-3200)
<tb> Muradimetide <SEP> P.O. <SEP> 16 <SEP> 1100 <SEP> (50-3200)
<tb> MDPA <SEP> S.C. <SEP> 32 <SEP> 1000 <SEP> (200-3200)
<tb> MDPA <SEP> P.O. <SEP> 16 <SEP> 200 <SEP> (12-800)
<tb>
Les conditions expérimentales sont les mêmes que celles décrites dans le tableau 4 ci-dessus.<tb><SEP> Adjuvant <SEP> Number <SEP> Response <SEP> Antibody
<tb><SEP> of <SEP> mice <SEP> (range <SEP> of <SEP> titles)
<tb> Witnesses <SEP> (without <SEP> 150 <SEP> 30 <SEP>(<3-400)
<tb> adjuvant)
<tb> MDP <SEP> SC <SEP> 150 <SEP> 700 <SEP> (50-3200)
<tb> MDP <SEP> PO <SEP> 50 <SEP> 1100 <SEP> (50-3200)
<tb> Muradimetide <SEP> SC <SEP> 32 <SEP> 1350 <SEP> (100-3200)
<tb> Muradimetide <SEP> PO <SEP> 16 <SEP> 1100 <SEP> (50-3200)
<tb> MDPA <SEP> SC <SEP> 32 <SEP> 1000 <SEP> (200-3200)
<tb> MDPA <SEP> PO <SEP> 16 <SEP> 200 <SEP> (12-800)
<Tb>
The experimental conditions are the same as those described in Table 4 above.

Ces données montrent que seulement deux molécules, le MDP et le muradimétide, sont actives de façon significative quand elles sont données par voie orale simultanément avec l'antigène administré par voie parentérale. These data show that only two molecules, MDP and muradimetide, are significantly active when given orally simultaneously with the parenterally administered antigen.

De façon intéressante, le MDPA dont le muradimétide est le dérivé diester méthylique, est actif lorsqu'il est administré par voie systémique, mais peu actif quand il est administré par voie orale indiquant que l'activité biologique du muradimétide administré oralement ne peut être attribuée à la formation de MDPA résultant d'une hydrolyse de ses groupes esters méthyliques. Interestingly, MDPA, of which muradimetide is the methyl diester derivative, is active when administered systemically, but poorly active when orally administered, indicating that the biological activity of orally administered muradimetide can not be attributed. the formation of MDPA resulting from hydrolysis of its methyl ester groups.

Compte tenu de la toxicité du MDP telle qu'elle est connue et rappelée plus haut, il est clair que, parmi l'ensemble des dérivés et analogues du MDP, seul le muradimétide présente la combinaison des qualités de non-toxicité et d'activité adjuvante lorsqu'il est administré par voie orale. Given the toxicity of CDM as it is known and recalled above, it is clear that, among all CDM derivatives and analogues, only muradimetide has the combination of the qualities of non-toxicity and activity. adjuvant when given orally.

2) Réponse à un vaccin hépatite B
L'antigène utilisé est un antigène de surface recombinant du virus hépatite B (HBS) obtenu par recombinaison génétique et administré, absorbé sur de l'hydroxyde d'aluminium.2) Response to a hepatitis B vaccine
The antigen used is recombinant hepatitis B virus recombinant surface antigen (HBS) obtained by genetic recombination and administered, absorbed on aluminum hydroxide.

I1 a été injecté par voie sous-cutanée à des souris Swiss au jour 1 et au jour 21. Le muradimétide a été donné oralement en même temps que le vaccin. It was injected subcutaneously into Swiss mice on day 1 and day 21. Muradimetide was given orally at the same time as the vaccine.

Les résultats obtenus sont représentés dans la figure 1 ; dans cette figure, des souris Swiss (8 par groupe) reçoivent par voie sous-cutanée 1 ssg de HBS Ag (Pasteur Mérieux Sérums et Vaccins) et du muradimétide soit par voie sous-cutanée (100 Zig), soit par voie orale (1 mg). Un rappel est donné au trentième jour. The results obtained are shown in Figure 1; in this figure, Swiss mice (8 per group) receive subcutaneously 1 ssg of HBS Ag (Pasteur Serious Serums and Vaccines) and muradimetide either subcutaneously (100 Zig) or orally (1 mg). A reminder is given on the thirtieth day.

La figure 1 indique clairement que cette administration orale a de façon considérable augmenté la réponse au vaccin et permet une production beaucoup plus précoce d'anticorps contre l'antigène vaccinant. Figure 1 clearly indicates that this oral administration has significantly increased the response to the vaccine and allows a much earlier production of antibodies against the vaccinating antigen.

3) Réponse à un peptide synthétique d'Escherichia coli administré par voie orale
Le peptide représente la copie d'une structure vaccinante d'un antigène de surface d'Escherichia coli. 3) Response to Escherichia coli synthetic peptide administered orally
The peptide represents the copy of a vaccinating structure of an Escherichia coli surface antigen.

Cet antigène est connu pour être un antigène potentiellement protecteur chez les humains. This antigen is known to be a potentially protective antigen in humans.

Le peptide a été encapsulé dans des microsphères poly(DL-lactide coglycolide) et donné par voie orale à des souris Swiss femelles soit seul, soit avec le muradimétide administré soit par voie sous-cutanée, soit par voie orale. La réponse anticorps dans le sérum a été évaluée par test ELISA soit contre le peptide, soit contre la structure naturelle de la protéine. The peptide was encapsulated in poly (DL-lactide coglycolide) microspheres and given orally to female Swiss mice either alone or with the muradimetide administered either subcutaneously or orally. The antibody response in the serum was evaluated by ELISA test against the peptide or against the natural structure of the protein.

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 6 suivant. Le tableau 5 représente la reconnaissance de la protéine naturelle par les anticorps obtenus après administration orale du peptide synthétique encapsulé dans les microsphères. The results obtained are presented in the following Table 6. Table 5 shows the recognition of the natural protein by the antibodies obtained after oral administration of the synthetic peptide encapsulated in the microspheres.

Tableau 6

Table 6

<tb> Groupes <SEP> Réponse <SEP> anticorps
<tb> <SEP> contre
<tb> <SEP> Peptide <SEP> Protéine
<tb> <SEP> synthé- <SEP> naturelle
<tb> <SEP> tique
<tb> E. <SEP> coli <SEP> peptide <SEP> P.O. <SEP> 300 <SEP> 200
<tb> E. <SEP> coli <SEP> peptide <SEP> P.O. <SEP> 1100 <SEP> 1200
<tb> + <SEP> muradimétide <SEP> S.C.
<tb><tb> Groups <SEP> Response <SEP> Antibody
<tb><SEP> against
<tb><SEP> Peptide <SEP> Protein
<tb><SEP> synthetic <SEP> natural
<tb><SEP> tick
<tb> E. <SEP> coli <SEP> peptide <SEP> PO <SEP> 300 <SEP> 200
<tb> E. <SEP> coli <SEP> peptide <SEP> PO <SEP> 1100 <SEP> 1200
<tb> + <SEP> muradimetide <SEP> SC
<Tb>

E. <SEP> coli <SEP> peptide+ <SEP> muradimétide <SEP> P.O. <SEP> 4000 <SEP> 2000
<tb>
Les souris Swiss ont reçu les jours 1 et 30 par voie orale 10 pg du peptide synthétique. Le peptide a été incorporé dans les microsphères et le muradimétide dans une solution saline a été administré soit en sous-cutanée (100 g), soit par voie orale à raison d'l mg par souris.E. <SEP> coli <SEP> peptide + <SEP> muradimetide <SEP> PO <SEP> 4000 <SEP> 2000
<Tb>
Swiss mice received on days 1 and 30 orally 10 μg of the synthetic peptide. The peptide was incorporated into the microspheres and muradimetide in saline was administered either subcutaneously (100 g) or orally at 1 mg per mouse.

Ces données montrent que le muradimétide, particulièrement lorsqu'il est donné par voie orale a permis d'obtenir dans le sérum des anticorps reconnaissant l'antigène synthétique et sa structure naturelle. These data show that muradimetide, particularly when given orally, has made it possible to obtain antibodies in the serum that recognize the synthetic antigen and its natural structure.

4) Le muradimétide est administré oralement avec une immunisation secondaire par un antigène administré par voie parentérale
L'influence de l'administration orale du muramyl peptide au moment d'une injection secondaire d'antigène immunisant a été évaluée par la production d'isotype d'anticorps produits dans le serum et par la présence d'IgA sécrétoires (recherchées dans le fluide intestinal).4) Muradimetide is administered orally with secondary immunization with a parenteral antigen
The influence of oral administration of muramyl peptide at the time of a secondary injection of immunizing antigen was evaluated by the production of isotype antibodies produced in the serum and by the presence of secretory IgA (sought in the literature). intestinal fluid).

Un antigène protecteur de Shistosoma mansoni (SMAg) a été administré par voie sous-cutanée à des souris Swiss (un groupe de 8) au jour 1 et au jour 21 cet antigène est absorbé sur l'hydroxyde d'aluminium. A Shistosoma mansoni protective antigen (SMAg) was administered subcutaneously to Swiss mice (a group of 8) on day 1 and on day 21 this antigen is absorbed on aluminum hydroxide.

Pour l'immunisation secondaire, les souris reçoivent par voie orale 1 mg de muradimétide. Les résultats sont donnés dans le tableau suivant
Tableau 7
Influence du muradimétide administré oralement
au temps du rappel sur la réponse humorale au SMAa

For secondary immunization, the mice receive orally 1 mg of muradimetide. The results are given in the following table
Table 7
Influence of muradimetide administered orally
at the time of the recall on the humoral response to the SMAa

<tb> <SEP> Immunisation <SEP> Titres <SEP> anticorps <SEP> dans
<tb> Primaire <SEP> Secondaire <SEP> Liquide <SEP> <SEP> Sérum
<tb> <SEP> intestinal <SEP>
<tb> <SEP> [ <SEP> IgA <SEP> | <SEP> IclE <SEP>
<tb> SMAg <SEP> + <SEP> alum <SEP> SMAg <SEP> + <SEP> alum <SEP> 7800 <SEP> 2250 <SEP> < 100111210
<tb> SMAg <SEP> + <SEP> alum <SEP> SMAg <SEP> + <SEP> alum <SEP> + <SEP> 15000 <SEP> 3250 <SEP> < 100 <SEP> < 100
<tb> <SEP> muradimétide <SEP> p.o.
<tb> <tb><SEP> Immunization <SEP> Titres <SEP> antibodies <SEP> in
<tb> Primary <SEP> Secondary <SEP> Liquid <SEP><SEP> Serum
<tb><SEP> intestinal <SEP>
<tb><SEP>[<SEP> IgA <SEP> | <SEP> IclE <SEP>
<tb> SMAg <SEP> + <SEP> alum <SEP> SMAg <SEP> + <SEP> alum <SEP> 7800 <SEP> 2250 <SEP><100111210
<tb> SMAg <SEP> + <SEP> alum <SEP> SMAg <SEP> + <SEP> alum <SEP> + <SEP> 15000 <SEP> 3250 <SEP><100<SEP><100
<tb><SEP> muradimetide <SEP> in
<Tb>

Ces résultats démontrent que le muramyl dipeptide administré lors de l'immunisation secondaire peut augmenter et moduler la réponse à un antigène administré par voie parentérale. These results demonstrate that the muramyl dipeptide administered during the secondary immunization can increase and modulate the response to a parenterally administered antigen.

L'administration du muradimétide a augmenté la synthèse spécifique d'IgA sécrétoire. De façon surprenante, il a diminué considérablement la production d'IgE dans le sérum, confirmant en cela que l'administration orale de muradimétide peut moduler le profil isotypique de la réponse anticorps. Administration of muradimetide increased the secretory synthesis of secretory IgA. Surprisingly, it has significantly decreased IgE production in serum, confirming that oral administration of muradimetide can modulate the isotype profile of the antibody response.

4) Le muradimétide et l'antigène sont administrés par voie orale ; le muradimétide n'étant administré que lors de l'immunisation secondaire. 4) Muradimetide and antigen are administered orally; Muradimetide is administered only during secondary immunization.

REPONSE A LA CHAINE P DE LA TOXINE CHOLERIQUE
L'influence du muradimétide administré par voie orale en même temps que l'immunisation secondaire a également été étudiée dans la réponse anticorps à un immunogène actif par voie orale : la chaîne ss de la toxine cholérique (pCT). RESPONSE TO THE CHAIN OF CHOLERIC TOXIN
The influence of oral muradimetide at the same time as secondary immunization has also been studied in the antibody response to an orally active immunogen: the ss chain of cholera toxin (pCT).

Des expériences ont été réalisées dans un groupe de 8 souris Swiss femelles recevant chacune d'elle par voie orale 10 ssg de pCT, deux fois à trois semaines d'intervalle. Experiments were performed in a group of 8 female Swiss mice each receiving 10 μg of pCT orally twice to three weeks apart.

Les anticorps sont mesurés par la technique ELISA dans le sérum et dans les lavages vaginaux au jour 28. Antibodies are measured by the ELISA technique in serum and in vaginal washings at day 28.

Les résultats sont exprimés dans le tableau 8 suivant. The results are expressed in the following Table 8.

Tableau 8
Activité adjuvante du MDP associée avec
vaccin oral

Table 8
Adjunctive activity of the CDM associated with
oral vaccine

<tb> ADJUVANT <SEP> ANTI-ssCT <SEP>
<tb> <SEP> Dans <SEP> le <SEP> Dans <SEP> le
<tb> <SEP> sérum <SEP> liquide <SEP> vaginal
<tb> <SEP> IgG <SEP> IgA <SEP> IgG <SEP> IgA <SEP>
<tb> Contrôle <SEP> (sans <SEP> adjuvant) <SEP> 1800 <SEP> 900 <SEP> 20 <SEP> 5
<tb> Muradimétide <SEP> p.o. <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 4600 <SEP> 2700 <SEP> 35 <SEP> 85
<tb> au <SEP> jour <SEP> 25
<tb>
Cette expérience démontre que le muradimétide administré par voie orale en même temps qu'un rappel d'immunisation par un vaccin oral peut exercer son pouvoir adjuvant aussi bien au niveau de l'immunité systémique qu'au niveau de l'immunité mucosale mesuré par la quantité d'IgA sécrétoire.<tb> ADJUVANT <SEP> ANTI-ssCT <SEP>
<tb><SEP> In <SEP> the <SEP> In <SEP> the
<tb><SEP> serum <SEP> vaginal fluid <SEP>
<tb><SEP> IgG <SEP> IgA <SEP> IgG <SEP> IgA <SEP>
<tb> Control <SEP> (without <SEP> adjuvant) <SEP> 1800 <SEP> 900 <SEP> 20 <SEP> 5
<tb> Muradimetide <SEP> in <SEP> 1 <SEP> mg <SEQ> 4600 <SEQ> 2700 <SEP> 35 <SEP> 85
<tb> at <SEP> day <SEP> 25
<Tb>
This experiment demonstrates that muradimetide administered orally at the same time as an immunization booster by an oral vaccine can exercise its adjuvant power both at the level of the systemic immunity and at the level of the mucosal immunity measured by the amount of secretory IgA.

- EXEMPLE III : Activité anti-infectieuse du muradimétide administré par voie orale
1) Protection contre les bactéries
Le modèle utilisé est l'infection par Klebsiella pneumoniae. Le muradimétide est administré soit par voie parentérale, soit par voie orale avant ou après un challenge létal par des bactéries. Cette administration peut, comme le montre le tableau 9 ci-dessous, protéger de la mort les souris traitées ; cette protection peut être obtenue aussi bien chez les adultes que chez les nouveaux-nés. EXAMPLE III Anti-infectious activity of muradimetide administered orally
1) Protection against bacteria
The model used is Klebsiella pneumoniae infection. Muradimetide is administered either parenterally or orally before or after a lethal challenge by bacteria. This administration can, as shown in Table 9 below, protect the treated mice from death; this protection can be obtained in adults as well as in newborns.

Tableau 9
Activité antibactérienne du muradimétide administré par voie orale et par voie systémique
en comparaison avec la molécule parente MDPA

Table 9
Antibacterial activity of muradimetide administered orally and systemically
in comparison with the parent molecule MDPA

<tb> <SEP> Traitement <SEP> % <SEP> de <SEP> protection
<tb> <SEP> (nombre <SEP> d'animaux)
<tb> Jour <SEP> 1 <SEP> (avant <SEP> challenge)
<tb> <SEP> Muradimétide <SEP> 100 <SEP> g <SEP> i.v. <SEP> 53 <SEP> (16)
<tb> <SEP> 2 <SEP> mg <SEP> p.o. <SEP> 50 <SEP> (24)
<tb> <SEP> 100 <SEP> Ag <SEP> s.c.* <SEP> 75 <SEP> (37)
<tb> <SEP> MDPA <SEP> 100 <SEP> Ag <SEP> i.v. <SEP> 56 <SEP> (24)
<tb> <SEP> 2 <SEP> mg <SEP> p.o. <SEP> 25 <SEP> (16)
<tb> Heure <SEP> + <SEP> 1 <SEP> (après <SEP> challenge)
<tb> <SEP> Muradimétide <SEP> 100 <SEP> Ag <SEP> i.v. <SEP> 69 <SEP> (16)
<tb> <SEP> MDPA <SEP> 100 <SEP> ag <SEP> i.v. <SEP> 69 <SEP> (16)
<tb>
Les animaux sont des souris femelles Swiss de 6/7 semaines, sauf pour le groupe noté d'un astérisque qui est constitué de souris nouveaux-nés.<tb><SEP> Processing <SEP>% <SEP> of <SEP> Protection
<tb><SEP> (number <SEP> of animals)
<tb> Day <SEP> 1 <SEP> (before <SEP> challenge)
<tb><SEP> Muradimetide <SEP> 100 <SEP> g <SEP> iv <SEP> 53 <SEP> (16)
<tb><SEP> 2 <SEP> mg <SEP> in <SEP> 50 <SEP> (24)
<tb><SEP> 100 <SEP> Ag <SEP> sc * <SEP> 75 <SEP> (37)
<tb><SEP> MDPA <SEP> 100 <SEP> Ag <SEP> iv <SEP> 56 <SEP> (24)
<tb><SEP> 2 <SEP> mg <SEP> in <SEP> 25 <SEP> (16)
<tb> Time <SEP> + <SEP> 1 <SEP> (after <SEP> challenge)
<tb><SEP> Muradimetide <SEP> 100 <SEP> Ag <SEP> iv <SEP> 69 <SEP> (16)
<tb><SEP> MDPA <SEP> 100 <SEP> ag <SEP> iv <SEP> 69 <SEP> (16)
<Tb>
The animals are Swiss female mice of 6/7 weeks, except for the group marked with an asterisk which is constituted of newborn mice.

Ces résultats démontrent que le muradimétide est doué d'une activité immuno-stimulante non spécifique. These results demonstrate that muradimetide is endowed with non-specific immunostimulatory activity.

De façon surprenante, il se montre comme l'un des dérivés ou analogues du MDP particulièrement efficaces, lorsqu'il est administré par voie orale et également aussi bien avant qu'après le challenge par une dose mortelle de bactéries. Surprisingly, it is one of the particularly effective derivatives or analogs of MDP, when administered orally and also before and after the challenge by a lethal dose of bacteria.

Au contraire, sa molécule parente, le MDPA, est aussi active que le muradimétide lorsqu'il est administré par voie systémique, mais, par contre, ne montre pas d'activité significative lorsqu'il est administré oralement (seulement 25% de protection, contre 50% pour le muradimétide). On the contrary, its parent molecule, MDPA, is as active as muradimetide when administered systemically, but, on the other hand, does not show significant activity when administered orally (only 25% protection, against 50% for muradimetide).

2) Protection contre les virus
Le muradimétide peut protéger des hôtes contre des infections virales d'éthiologies diverses comme cela va être montré ci-dessous dans lequel l'immunostimulant a été démontré actif de la même façon après administration par voie systémique ou administration par voie orale.2) Protection against viruses
Muradimetide can protect hosts against viral infections of various ethiologies as will be shown below wherein the immunostimulant has been shown to be active in the same way after systemic administration or oral administration.

a) Virus de l'influenza
Le virus de l'influenza de l'espèce APR/8 est capable d'induire une pneumonie létale chez les souris adultes.a) Influenza virus
The influenza virus of the species APR / 8 is capable of inducing lethal pneumonia in adult mice.

Le muradimétide administré par voie orale 24 h après le challenge infectieux donné par voie orale a été capable de protéger 30% des animaux observés durant deux semaines. Muradimetide administered orally 24 hours after the oral challenge challenge was able to protect 30% of the animals observed for two weeks.

b) Virus de 1'encéphalomyocardite (ENCV) :
L'EMCV induit dans les souris une encéphalomyocardite sévère conduisant à la mort après 5/6 jours dans nos conditions expérimentales (100 DL50 données en intrapéritonéal). L'effet protecteur du muradimétide a été évalué dans ce modèle après administration intrapéritonéale.(b) Encephalomyocarditis Virus (ENCV):
EMCV induced in mice a severe encephalomyocarditis leading to death after 5/6 days in our experimental conditions (100 LD50 given in intraperitoneal). The protective effect of muradimetide was evaluated in this model after intraperitoneal administration.

b.l. Effet prophylactique
Le muradimétide est administré à la dose de 1 mg/kg dans des souris 24 h avant une infection par 1'EMCV à la dose de 100 DL50. Les animaux sont observés pendant 60 jours.bl Prophylactic effect
Muradimetide is administered at a dose of 1 mg / kg in mice 24 h before an infection with the EMCV at the dose of 100 LD50. The animals are observed for 60 days.

Les résultats comparatifs obtenus avec différents dérivés du MDP dans le tableau 10 suivant
Tableau 10
Effet prophylactique
Activité anti-virale de dérivés hydrophiles de la famille
des muramyl peptides administrés à la souris avant
l'injection de 100 DL50 du virus EMCV

Comparative results obtained with different CDM derivatives in Table 10
Table 10
Prophylactic effect
Anti-viral activity of hydrophilic derivatives of the family
muramyl peptides administered to the mouse before
the injection of 100 LD50 of the EMCV virus

<tb> <SEP> Muramyl <SEP> peptides <SEP> % <SEP> de <SEP> survie
<tb> (300 <SEP> ssg <SEP> administrés <SEP> 24h
<tb> <SEP> avant <SEP> le <SEP> virus)
<tb> O <SEP> O
<tb> MDP <SEP> O
<tb> MDP <SEP> OC4H9 <SEP> 10
<tb> Muradimétide <SEP> 30
<tb> Muramét <SEP> ide <SEP> 10
<tb>
I1 est évident à la lecture de ce tableau que le muradimétide seul, sans injection ultérieure d'interféron, permet d'obtenir un pourcentage de survie de 30% des souris.<tb><SEP> Muramyl <SEP> peptides <SEP>% <SEP> of <SEP> survival
<tb> (300 <SEP> ssg <SEP> administered <SEP> 24h
<tb><SEP> before <SEP> the <SEP> virus)
<tb> O <SEP> O
<tb> CDM <SEP> O
<tb> CDM <SEP> OC4H9 <SEP> 10
<tb> Muradimetide <SEP> 30
<tb> Muramet <SEP> IDE <SEP> 10
<Tb>
It is obvious from reading this table that muradimetide alone, without subsequent injection of interferon, makes it possible to obtain a survival percentage of 30% of the mice.

Pour mieux mettre en évidence l'activité remarquable du muradimétide dans le modèle EMCV, des expériences dose-réponse ont été entreprises en utilisant le muradimétide ou d'autres dérivés de muramyl peptides administré 24 h avant l'infection virale, Les résultats sont présentés dans le tableau 11 suivant
Tableau 11
Dose efficace 50 des dérivés hydrophiles de la famille
des muramyl peptides administrés à la souris
avant l'injection de 100 DL50 du virus EMCV

To better demonstrate the remarkable activity of muradimetide in the EMCV model, dose-response experiments were conducted using muradimetide or other muramyl peptide derivatives administered 24 h prior to viral infection. The results are presented in the following table 11
Table 11
Effective dose 50 of the hydrophilic derivatives of the family
muramyl peptides administered to the mouse
before injection of 100 LD50 of EMCV virus

<tb> <SEP> Muramyl <SEP> peptides <SEP> DE50
<tb> MDP <SEP> > <SEP> 600 <SEP> g <SEP>
<tb> MDPA <SEP> (OCH3)OC4H9 <SEP> 600 <SEP> g
<tb> Muradimétide <SEP> 150 <SEP> Ag <SEP>
<tb> Muramétide <SEP> 300 <SEP> Zg <SEP>
<tb>
DE50 : dose du composé testé permettant d'assurer la survie de la moitié des animaux.<tb><SEP> Muramyl <SEP> peptides <SEP> DE50
<tb> MDP <SEP>><SEP> 600 <SEP> g <SEP>
<tb> MDPA <SEP> (OCH3) OC4H9 <SEP> 600 <SEP> g
<tb> Muradimetide <SEP> 150 <SEP> Ag <SEP>
<tb> Murametic <SEP> 300 <SEP> Zg <SEP>
<Tb>
DE50: dose of test compound to ensure the survival of half of the animals.

On voit dans le tableau 11 qu'une dose de 150 Ag de muradimétide est suffisante pour obtenir 50% de survie. Table 11 shows that a dose of 150 Ag muradimetide is sufficient to obtain 50% survival.

L'activité anti-virale du muradimétide est illustrée par la figure 2 qui montre qu'à la dose de 300 mg le muradimétide protège plus de 60% des souris contre la mort par infection virale, le MDP lui ne protège que 20% des animaux. The anti-viral activity of muradimetide is illustrated in FIG. 2 which shows that at a dose of 300 mg muradimetide protects more than 60% of the mice against death by viral infection, the MDP protects only 20% of the animals. .

La figure 3 représente l'activité dose réponses du muradimétide dans la protection des souris contre l'infection par 1'EMCV. Figure 3 shows the dose response activity of muradimetide in the protection of mice against infection by the MVEC.

Les souris Swiss (groupe de 10) ont été prétraitées par le muradimétide avant une infection par 100 DL50 d'unités infectieuses d'EMCV et les souris ont été observées pendant 60 jours. Swiss mice (group of 10) were pretreated with muradimetide prior to infection with 100 LD50 infectious EMCV units and mice were observed for 60 days.

On voit, dans cette figure, que le muradimétide seul protège 80% des animaux à la dose la plus forte de 600 ssg/souris équivalente à 30 mg/kg. In this figure, it is seen that muradimetide alone protects 80% of the animals at the highest dose of 600 ssg / mouse equivalent to 30 mg / kg.

Le muradimétide a également été montré comme actif par administration orale contrairement aux autres dérivés muramyl peptides. Muradimetide has also been shown to be active by oral administration in contrast to other muramyl peptide derivatives.

L'administration de muradimétide par voie orale 1 h après le challenge infectieux est capable d'augmenter l'activité d'IFN a/ss administré au même moment par voie intrapéritonéale, comme ceci est montré dans le tableau 12 suivant
Tableau 12

Oral muradimetide administration 1 h after the infectious challenge is able to increase IFN activity at the same time intraperitoneally, as shown in Table 12 below.
Table 12

<tb> Traitement <SEP> Taux <SEP> de <SEP> survie
<tb> 1 <SEP> h <SEP> après <SEP> le <SEP> challenge <SEP> final <SEP> à <SEP> 60 <SEP> jours
<tb> PBS <SEP> (contrôle) <SEP> 0/20
<tb> Muradimétide <SEP> (150 <SEP> mg/kg) <SEP> p.o. <SEP> 1/20
<tb> IFN-a/P <SEP> 25,000 <SEP> U.I. <SEP> i.p. <SEP> 6/20
<tb> Traitement <SEP> combiné <SEP> 10/20
<tb> MDM <SEP> p.o. <SEP> + <SEP> IFN <SEP> i.p.
<tb> <tb> Treatment <SEP> Rate <SEP> of <SEP> Survival
<tb> 1 <SEP> h <SEP> after <SEP> the <SEP> challenge <SEP> final <SEP> to <SEP> 60 <SEP> days
<tb> PBS <SEP> (control) <SEP> 0/20
<tb> Muradimetide <SEP> (150 <SEP> mg / kg) <SEP> po <SEP> 1/20
<tb> IFN-a / P <SEP> 25,000 <SEP> UI <SEP> ip <SEP> 6/20
<tb> Processing <SEP> combined <SEP> 10/20
<tb> MDM <SEP> po <SEP> + <SEP> IFN <SEP> ip
<Tb>

c) Virus Herpès Simplex type II (HSV II) :
HSV
Tableau 13
Activité du muradimétide dans le traitement
de l'infection par HSV II

c) Herpes Simplex Virus Type II (HSV II):
HSV
Table 13
Muradimetide activity in treatment
of HSV II infection

<tb> <SEP> Traitement <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> nécroses
<tb> <SEP> à <SEP> + <SEP> 1 <SEP> heure <SEP> par <SEP> foie <SEP> d'inhibition
<tb> <SEP> moyenne <SEP> + <SEP> SD
<tb> Aucun <SEP> 94 <SEP> + <SEP> 4 <SEP> 0
<tb> MDP <SEP> 63 <SEP> + <SEP> 7 <SEP> 33
<tb> Muradimétide <SEP> 35 <SEP> + <SEP> 4 <SEP> 63
<tb>
Dans ces expériences, le muradimétide est capable d'interférer avec l'activité nécrotique du virus diffusé dans le foie.<tb><SEP> Treatment <SEP> Number <SEP> of <SEP> Necrosis
<tb><SEP> to <SEP> + <SEP> 1 <SEP> hour <SEP> with <SEP> inhibition <SEP>
<tb><SEP> average <SEP> + <SEP> SD
<tb> None <SEP> 94 <SEP> + <SEP> 4 <SEP> 0
<tb> MDP <SEP> 63 <SEP> + <SEP> 7 <SEP> 33
<tb> Muradimetide <SEP> 35 <SEP> + <SEP> 4 <SEP> 63
<Tb>
In these experiments, muradimetide is able to interfere with the necrotic activity of the virus diffused into the liver.

d) Virus de l'immunodéficience humaine
L'effet de la combinaison des muramyl peptides avec des doses suboptimales de drogues antirétrovirales comme le 2',3'-dioxycytidine (ddC), l'azidothymidine (AZT) et d'autres agents inhibiteurs, a été investigué dans un modèle d'infection HIV de cellules d'origine humaine U937 monoplastoïdes Con positives.d) Human immunodeficiency virus
The effect of the combination of muramyl peptides with suboptimal doses of antiretroviral drugs such as 2 ', 3'-dioxycytidine (ddC), azidothymidine (AZT) and other inhibitory agents, was investigated in a model of HIV infection of cells of human origin U937 monoplastoid Con positive.

Le protocole expérimental utilisé pour étudier l'effet des différents traitements sur l'infection virale dans ces cellules est le suivant
Dés lignées cellulaires U937 non infectées sont incubées pendant 2 h avec un pool de virus en présence de 2 g de polybrène. Après l'infection, les cellules sont centrifugées et les cultures sont ensuite ensemencées dans un milieu RPMI supplémenté avec du sérum de veau foetal. Différentes quantités de dérivés de muramyl peptides et d'agents anti-rétroviraux, sont dissoutes dans la culture comme montré plus bas. Les cellules sont ensuite comptées par observation microscopique après coloration au bleu trypan. The experimental protocol used to study the effect of different treatments on viral infection in these cells is as follows
Uninfected U937 cell lines are incubated for 2 h with a pool of virus in the presence of 2 g of polybrene. After infection, the cells are centrifuged and the cultures are then seeded in RPMI medium supplemented with fetal calf serum. Different amounts of muramyl peptide derivatives and anti-retroviral agents are dissolved in the culture as shown below. The cells are then counted by microscopic observation after staining with trypan blue.

Association avec 1'AZT
La mesure de l'antigène HIV présent dans des cultures cellulaires infectées et traitées par du MDP ou du muradimétide seuls ou en combinaison avec 1'AZT permet de montrer l'activité inhibitrice de ces molécules.Association with AZT
The measurement of the HIV antigen present in infected cell cultures and treated with MDP or muradimetide alone or in combination with AZT makes it possible to show the inhibitory activity of these molecules.

La figure 4 représentant l'effet des traitements de 1'AZT, du MDP ou du muradimétide (MDM) administrés seuls ou en combinaison. Figure 4 shows the effect of treatments of AZT, MDP or muradimetide (MDM) administered alone or in combination.

L'activité inhibitrice de doses sub-optimales de 0,01 M d'AZT est manifeste au jour 10, mais non au jour 3 suivant l'infection par le HIV. Inhibitory activity at suboptimal doses of 0.01 M AZT is evident at day 10, but not at day 3 following HIV infection.

Un effet synergique significatif est obtenu en utilisant 10 g de MDP ou du muradimétide en combinaison avec la dose sub-optimale 0,01 M d'AZT comme il est montré sur le test antigène/HIV. A significant synergistic effect is obtained using 10 g of MDP or muradimetide in combination with the suboptimal 0.01 M dose of AZT as shown on the antigen / HIV test.

La combinaison des muramyl peptides et de 1'AZT montre une activité synergique également au jour 10, une période de temps pour laquelle les muramyl peptides seuls sont inefficaces. The combination of muramyl peptides and AZT shows synergistic activity also at day 10, a period of time for which muramyl peptides alone are ineffective.

Claims

1. An externally active immunostimulatory pharmaceutical composition, characterized in that it contains a diester of general formula I

in which - R is CH 3, - X is L-Ala or L-Thr, - R 1 is a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms, - R 2 is a hydrocarbon group having 1 to 2 carbon atoms, in a formulation external administration compatible with an administration of active principle of between 0.1 mg and 5 mg per kg of weight in humans or animals.

2. The immunostimulatory pharmaceutical composition according to claim 1, characterized in that the compound is muradimetide of formula II Nac-Mur-L-Ala-D-GluCOMe] -OMe

3. Pharmaceutical composition according to claims 1 and 2, characterized in that the external route is the oral route.

4. Pharmaceutical composition according to claims 1 and 2, characterized in that the external route is the aerosol route.

5. Pharmaceutical composition according to claims 1 and 2, characterized in that the external route is the percutaneous route.

6. Composition according to one of claims 1 to 5, characterized in that it is an immunoadjuvant used to accompany an effect induced by vaccination.

7. Composition according to claim 6, characterized in that it can be administered externally before, during or after vaccination regardless of the mode of administration of said vaccination.

8. Composition according to one of claims 1 to 5, characterized in that it is used to treat or prevent the effects of pathogenic infections, including bacterial, viral or parasitic infections.

9. Composition according to one of claims 1 to 5, characterized in that it is used in combination with an antiviral agent, or an antiretroviral agent, the composition and the antiviral agent being used simultaneously, separated or spread in the weather.

10. Composition according to claim 9, characterized in that it is used in combination with a nucleoside analogue, in particular AZT (azidothymidine), or 2 ', 3'-dideoxycytidine, for simultaneous use separated or spread in the weather.

11. Use of a diester of formula:

for the manufacture of an immunostimulatory pharmaceutical composition administrable externally in a formulation compatible with an administration of active principle of between 0.1 and 5 mg per kg of weight in humans or animals.

12. Use according to claim 11 characterized in that the diester is the muradimetide of formula II Nac-Mur-L-Ala-D-Glu [OMe] -OMe.

13. Use according to one of claims 11 or 12 characterized in that the formulation of the diester is compatible with an administration of active principle of between 0.5 and 3 mg / kg of weight in humans or animals.

14. Use according to one of claims 11, 12 or 13 characterized in that the external route is the oral route, the mucosal route, the percutaneous route or the aerosol route.

15. Use of muradimetide according to claims 11 to 14 for the preparation of a vaccine immunoadjuvant.

16. Use according to claims 11 to 14 for the preparation of a medicament for simultaneous use separately or spread over time with an anti-infective agent.

17. Use according to claim 16, characterized in that the infectious agent is an antiviral agent including a nucleotide analogue.