WO1995011296A1 - Verfahren zur gezielten veränderung von enzymen, veränderte enzyme und deren verwendung - Google Patents
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Abstract
Enzyme können gemeinhin entweder durch chemische Modifizierung der das Enzym bildenden Aminosäuren oder durch Mutation des das Enzym codierenden Gens verändert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man nacheinander die Struktur von mindestens zwei Enzymen aus einer Gruppe von Enzymen klärt; die Bindungstaschen der Enzyme mit geklärter Struktur aus einer Gruppe vergleicht; die Aminosäuren ermittelt, die für die Bindung eines für das unveränderte Enzym bevorzugten Substrates notwendig sind; die Aminosäuren in der Bindungstasche des unveränderten Enzyms mit geklärter Struktur auswählt, welche für die Bindung eines erwünschten, vom unveränderten Enzym nicht bevorzugten Substrats zu verändern sind; die ausgewählten Aminosäuren durch Mutation eines zum Enzym gehörigen Gens verändert; und das mutierte Gen exprimiert und das gezielt veränderte Enzym isoliert. Zur Erfindung gehören auch neue veränderte Enzyme der Gruppe E.C. 1.4.1. Stereospezifische Umsetzung von Oxosäuren zu Aminosäuren und umgekehrt.
Description
Verfahren zur gezielten Veränderung von Enzymen, veränderte Enzyme und deren Verwendung
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur gezielten Veränderung von Enzymen, veränderte Enzyme und deren Verwendung.
Enzyme können gemeinhin entweder durch chemische Modifizierung der das Enzym bildenden Aminosäuren oder durch Mutation des das Enzym codierenden Gens verändert werden. Chemische Modifizierungen sind häufig unspezifisch, so daß die gezielte Veränderung der Enzymstruktur durch gerichtete Mutation des Gens Vorteile gegenüber der chemischen Modifizierung aufweist.
Veränderte Enzyme zeigen häufig verbesserte Eigenschaften bezüglich Aktivität, Spezifität oder Stabilität gegenüber den unveränderten Enzymen. Bisherige Aktivitäten auf diesem Gebiet beschränkten sich häufig auf die Verbesserung globaler Eigenschaften des Enzyms wie z. B. Stabilität gegenüber
Reaktionsmedien. So zum Beispiel wurden alkalische Proteasen gegen die oxidierende Wirkung von Bleichmitteln stabilisiert. Das Problem der Änderung der Spezifität von Enzymen zur Umsetzung vorher definierter Substrate ist allerdings kaum bearbeitet worden. Eine Ausnahme bildet jedoch die Arbeit von H. M. Wilks et al. (H. M. Wilks et al. , Science 1988, 242, 1541 - 1544) , in der die Substratspezifität einer aktat- Dehydrogenase mit Laktat als bevorzugtem Substrat zu einer Malat-Dehydrogenase mit Malat als bevorzugtem Substrat umgewandelt wird.
Besonders erwünscht ist bei Enzymen die Selektivität zur Herstellung enantiomerenreiner Verbindungen. Die Enantioselektivität ist u. a. bei Aminosäure-Dehydrogenasen besonders gut ausgeprägt. So wurden Aminosäure-Dehydrogenasen
aus einer Reihe von Organismen gescreent. Die wichtigsten Enzyme zum Einsatz in der organischen Synthese sind Alanin- Dehydrogenase (AlaDH, E.C. 1.4.1.1.), Phenylalanin- Dehydrogenase (PheDH; noch keine E.C. Nummer)) und insbesondere Leucin-Dehydrogenase (LeuDH, E.C. 1.4.1.9.) . Das bestuntersuchte Enzym der Gruppe ist aber die ubiquitäre Gluta at-Dehydrogenase (GluDH, E.C. 1.4.1.2.-4.), die einen wichtigen Knotenpunkt zwischen Kohlenstoff- und Stickstoffmetabolismus bildet. GluDH katalysiert die NAD(P)+- abhängige oxidative Desaminierung von L-Glutamat zu 2- Oxoglutarat und Ammoniak:
Glutamat + NAD(P)+ + H2O -^^ 2-Oxoglutarat + NH4+ + NAD(P)H + H
Aminosäure-Dehydrogenasen katalysieren allgemein die reversible reduktive Aminierung von prochiralen Ketosäuren zu L-Aminosäuren ( (S) -Konfiguration) bzw. die umgekehrte Reaktion der oxidativen Desaminierung von L-Aminosäuren zu Oxosäuren.
In den meisten Fällen, darunter allen NAD+-abhängigen GluDHs, weist das Enzym sechs identische Untereinheiten von je etwa 48 kD auf. Es wird eine erhebliche Homologie in der Polypeptidkette der hexameren GluDHs gefunden, insbesondere weisen die Glutamat-Bindungstasche und das aktive Zentrum eine bemerkenswerte Ähnlichkeit auf (Britton, K.L., Baker, P.J., Rice, D.W. und Stillman, T.J., Eur. J. Bioche . 1992, 209, 851-859) .
Der Grad der Ähnlichkeit zwischen den Strukturen der Mitglieder der Familie der Aminosäure-Dehydrogenasen aus verschiedenen Organismen ist so hoch, daß man bei den
Aminosäure-Dehydrogenasen von einer einzigen Superfamilie von Enzymen ausgeht, die durch divergente Evolution entstanden ist (S. Nagata, K. Tanisawa, N. Esaki, Y. Saka oto, T. Ohshima, H. Tanaka und K. Soda, Biochemistry 1988, 27, 9056-
62; H. Takada, T. Yoshimura, T. Ohshima, N. Esaki und K. Soda, J. Bioche . 1991, 109, 371-6) .
Die dreidimensionale Struktur der Glutamat-Dehydrogenase aus Clostridium symbiosum ist bekannt (Baker, P.J. et al. , Proteins 1992, 12, 75-86) . Das Gen dieses Enzyms wurde kloniert und überexprimiert in Escherichia coli (Teller, J.K., et al., Eur. J. Biochem. 1992, 286, 151-159) . Bisher gelang es jedoch nicht, durch gerichtete Mutation des Gens die Enzymstruktur dergestalt zu verändern, daß auch bestimmte, vor der Mutation ausgewählte Substrate umgesetzt werden.
Aufgabe der Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren zur gezielten Veränderung von Enzymen bereitzustellen, bei dem gewünschte Substrate unabhängig von der natürlichen
Substratspezifität des Enzyms umgesetzt werden können. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein verändertes Enzym anzugeben, das an seinem Bindungsort für ein Substrat so abgeändert ist, daß ein gewünschtes, gemeinhin nicht bevorzugtes, Substrat vom veränderten Enzym mit hinreichender Aktivität, Selektivität und Stabilität umgesetzt wird.
Verfahrensmäßig gelöst wird das erfindungsgemäße Problem dadurch, daß man nacheinander die in Anspruch 1 angegebenen Schritte ausführt. Dadurch, daß man
- die Struktur von mindestens zwei Enzymen aus einer Gruppe von Enzymen klärt,
die Bindungstaschen der Enzyme mit geklärter Struktur aus einer Gruppe vergleicht;
die Aminosäuren ermittelt, die für die Bindung eines für das unveränderte Enzym bevorzugten Substrates notwendig sind;
die Aminosäuren in der Bindungstasche des unveränderten Enzyms mit geklärter Struktur auswählt, welche für die Bindung eines erwünschten, vom unveränderten Enzym nicht bevorzugten Substrats zu verändern sind;
- die ausgewählten Aminosäuren durch Mutation eines zum Enzym gehörigen Gens verändert; und
das mutierte Gen exprimiert und das gezielt veränderte Enzym isoliert,
gelingt es, das Substratspektrum gegenüber dem unveränderten Enzym auf neue Zielstrukturen zu erweitern. Dadurch läßt sich eine vorteilhafte Aktivität, Selektivität oder Stabilität auf eine größere Anzahl Substrate ausdehnen.
Erfindungsgemäß werden dabei unter einer Gruppe von Enzymen alle Mitglieder einer Unter-Unterklasse (Sub-subclass) nach E.C. -Nomenklatur verstanden (E.C. = enzyme commission) . Die Art der Unter-unterklasse unterliegt keiner besonderen Beschränkung. Zu den bevorzugte Unter-unterklassen gehören NAD(P)+-abhängige Redoxreaktionen mit Aminen (Gruppe 1.4.1. nach E.C. -Nomenklatur) , Serin-Proteasen (Gruppe 3.4.21. nach E.C. -Nomenklatur) und Carboxylesterhydrolasen (Gruppe 3.1.1. nach E.C.-Nomenklatur) .
Im Rahmen der Erfindung wird unter Strukturaufklärung die Bestimmung der räumlichen Struktur eines Enzyms verstanden. Grundsätzlich ist es notwendig, Informationen über die Struktur zweier Enzyme aus einer Gruppe zu erhalten. Dabei können alle dem Fachmann bekannten Methoden zur Strukturaufklärung von Enzymen für das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft eingesetzt werden. Besonders bevorzugt ist es, daß man bei wenigstens einem Enzym einer Gruppe die Analyse der Aminosäure-Sequenz durchführt, einen zugehörigen
Enzym-Substrat-Komplex kristallisiert und die Raumstruktur des Enzym-Substrat-Komplexes aufklärt. Ist die Sequenz eines zweiten Enzyms der Gruppe hochhomolog zur Struktur des ersten, genügt dies hinsichtlich der Struktur des zweiten
Enzyms der Gruppe als Information für die Durchführung der Veränderungen am Enzym. Hierbei wird unter hochhomolog die mindestens 50%ige Übereinstimmung der Sequenz zweier Enzyme verstanden.
Im zweiten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Bindungstaschen der Enzyme aus einer Gruppe, deren Struktur im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens geklärt wurde, miteinander verglichen. Unter Bindungstasche wird dabei die dreidimensionale Umgebung des Bindungsortes eines Substrates am Enzym zum letztlichen Zweck der Umsetzung durch das Enzym verstanden, wobei die Bindungstasche aus Aminosäuren gebildet wird, die in der Sequenz des Enzyms nicht notwendigerweise nebeneinander liegen. Beim Vergleichen der Bindungstaschen der Enzyme wird der Einfluß der einzelnen Aminosäuren der Bindungstaschen hinsichtlich Analogie in bezug auf Polarität, Ladung und sterischem Anspruch an das Substrat geprüft.
Unter Berücksichtigung der bei der Analogie-Prüfung erhältlichen Ergebnisse werden dann die Aminosäuren ermittelt, die für die Bindung eines für das Enzym bevorzugten Substrates notwendig sind. Ebenso wird die Stellung dieser Aminosäuren in der Sequenz ermittelt. Hieran schließt sich dann die Auswahl derjenigen Aminosäuren in der Bindungstasche von Enzymen mit geklärter Struktur an, welche für die Bindung eines gewünschten, vom unveränderten Enzym nicht bevorzugten Substrat zu verändern sind. Die ausgewählten Aminosäuren werden bevorzugt durch Mutation des entsprechenden Tripletts des zugehörigen Gens derart verändert, daß das veränderte Triplett die für die Bindung des gewünschten Substrates erforderliche Aminosäure codiert. Das mutierte Gen wird in einem geeigneten Organismus exprimiert, das veränderte Enzym aus dem Organismus isoliert und auf Bindung des gewünschten Substrates sowie auf Aktivität, Selektivität und Stabilität geprüft.
Hierbei wird vorteilhaft eine neuentwickelte Technik zur
Prüfung der veränderten Enzyme eingesetzt. Zum Screening und
zur Optimierung der Mutanten wird auf Mikrotiterplatten getestet, die es gestatten, viele Mutanten (in Reihen) auf viele Substrate (Zeilen) testen. Im Falle der Gruppe 1.4.1. der Aminosäure-Dehydrogenasen wird als Screening-Reaktion die oxidative Desamidierung verwendet; dazu werden die Reaktanten (Aminosäure und Cofaktor) mit einem künstlichen Elektronenakzeptor als Mediator (Phenazinmethosulfat) sowie einem gefärbten terminalen Elektronenakzeptor (Tetrazoliumfarbstoff) zusammengebracht. Aktivität eines mutierten Enzyms wird durch eine Färbung angezeigt.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat sich besonders dann bewährt, wenn als Enzyme Aminosäure-Dehydrogenasen der Gruppe 1.4.1. und als sowohl vom unveränderten Enzym als auch vom veränderten Enzym bevorzugte Substrate 2-Oxosäuren eingesetzt werden, die sich nur in ihrem Rest unterscheiden. So wurde gefunden, daß bei der Glutamat-Dehydrogenase aus Clostridium symbiosum die folgenden Aminosäuren der Sequenz des Enzyms besonderen Einfluß bei der Bindung des Substrates ausüben: Valin 377, Serin 380, Threonin 193, Lysin 89 und Alanin 163; ferner wurde gefunden, daß die folgenden Aminosäuren zusätzlichen Einfluß ausüben: Glutamin 110, Aspartat 114, Methionin 121, Arginin 205.
Verfahrensgemäß wird dann zur Herstellung von Enzymen für die stereospezifische reversible Reaktion der oxidativen Desaminierung einer L-Aminosäure oder reduktiven Aminierung einer Oxosäure, bei einem Enzym aus der Gruppe mit der E.C.¬ Nummer 1.4.1. eine Bindungstasche mit den Resten Valin 377, Serin 380, Threonin 193, Lysin 89 und Alanin 163 durch Mutation eines zum Enzym gehörigen Gens verändert.
Die Erfindung stellt auch neuartige Enzyme zur Verfügung.
Diese verfügen bevorzugt über mindestens eine Bindungstasche, die wenigstens hinsichtlich eines Restes verändert ist, so daß ein gewünschtes, vom unveränderten Enzym nicht bevorzugtes Substrat mit hinreichender Aktivität, Selektivität und Stabilität umgesetzt wird. Insbesondere zur Bindung eines vom unveränderten Enzym nicht bevorzugten
Substrates für die stereospezifische Reaktion der oxidativen Desaminierung einer L-Aminosäure oder reduktiven Aminierung einer Oxosäure ist es von Vorteil, daß die Bindungstasche wenigstens eine Veränderung an den Resten Valin 377, Serin 380, Threonin 193, Lysin 89 und Alanin 163 aufweist, mit der Konsequenz, daß das gewünschte Substrat vom veränderten Enzym verbessert gebunden und umgesetzt wird.
Mit dem Verfahren gemäß der Erfindung und mit den neuartigen erfindungsgemäß veränderten Enzymen lassen sich unter anderem 2-Oxosäuren zur Herstellung von L-Alpha-Aminosäuren in hoher Enantiomerenausbeute umsetzen. Des weiteren ist es vorteilhaft, die wenigstens hinsichtlich eines Restes in der Bindungstasche veränderten Enzyme zur Umsetzung von L-Alpha- Aminosäuren zur Herstellung von 2-Oxosäuren zu verwenden. Außerdem ist es von großem Vorteil, die veränderten Enzyme zur Umsetzung von DL-Alpha-Aminosäuren zur Herstellung von 2- Oxosäuren und D-Alpha-Aminosäuren zu verwenden.
Durch den Einsatz von DL-Alpha-Aminosäuren als Substrate sind nach Umsetzung mit Enzymen der Gruppe 1.4.1. enantiomerenreine D-Aminosäuren zugänglich. Preiswerte L- Alpha-Aminosäuren lassen sich somit unter äußerst vorteilhaften Bedingungen zu Oxosäuren umsetzen.
Beispiel 1:
Die dreidimensionale Kristallstruktur der Glutamat- Dehydrogenase aus Clostridium symbiosum ist aus der Literatur bekannt und zwar sowohl als Komplex mit Glutamat (T. J. Stillman et al. , J. Mol. Biol., 1993, 234, Seiten 1131 - 1139) als auch in freier Form sowie als Komplex mit dem Cofaktor NAD+ (P. J. Baker et al. , Proteins, 1992, 12, Seiten 75 - 86) .
Aus der Literatur ist ebenfalls bekannt, daß die Substratspezifität der Glutamat-Dehydrogenase aus Clostridium symbiosum durch Wechselwirkungen mit den Seitenketten der
Aminosäuren Lys 89, Ser 380, Gly 90, Ala 163 und Val 377 herrührt (T. J. Still an et al. , J. Mol. Biol., 1993, 234, Seiten 1131 - 1139; die zahlenmäßige Bezeichnung der Aminosäuren bezieht sich auf die Stellung der jeweiligen Aminosäure in der Sequenz der Glutamat-Dehydrogenase aus Clostridium symbiosum, gerechnet vom N-Terminus her) .
Die spezifische Wechselwirkung mit der 7-Carboxylgruppe des Substrates Glutamat wird durch die Lysin-Seitengruppe in Position 89 der Glutamat-Dehydrogenase aus Clostridium symbiosum ausgeübt (K. L. Britton et al., J. Mol. Biol., 1993, 234, Seiten 938 - 945) .
Ein Austausch dieser Seitenkette in Position 89 durch eine ungeladene und unpolare Gruppe setzt daher die Aktivität der Glutamat-Dehydrogenase aus Clostridium symbiosum gegenüber Glutamat drastisch herab und die Aktivität gegenüber unpolaren Aminosäuren steigt an.
Der Wildtyp der Glutamat-Dehydrogenase aus Clostridium symbiosum ist spezifisch in bezug auf Glutamat als Substrat: bei pH 7.0 und 25 °C in 0.1 molarem Phosphatpuf er, mit 1 mmol/1 NAD+ und 40 mmol/1 Aminosäure konnte die
Spezifitätskonstante kcat/κM ^ei L-Glutamat als Substrat zu 5,l-10- l-mol~----s_--- bzw. eine Aktivität von 11,2 U/mg bestimmt werden, während L-Norleucin und L-Methionin unter den gleichen Bedingungen keine meßbare Aktivität zeigen (Aktivität < 10-4 U/mg) .
Das Gen, das die Phenylalanin-Dehydrogenase aus Bacillus sphaericus kodiert, wurde durch Verwendung von Mismatch- Oligonukleotid-Primern punktspezifisch mutiert und anschließend nach der Uracil-DNA-Methode für mutierte DNA selektiert, beides wie beschrieben bei Kunkel T. A. et al. , Proc. Nat. Acad. Sei., 1985, 82, Seiten 488 - 492 und bei Kunkel T. A. et al. , Methods in Enzymology, 1987, 154, Seiten 367 - 382, mit der Polymerase-Chain-Reaktion kloniert, die DNA-Sequenzanalyse durchgeführt und Expression in
Escherichia coli vorgenommen (J. K. Teller et al. , Eur. J. Biochem., 1992, 206, Seiten 151 bis 159) .
Das in Escherichia coli exprimierte Enzym wurde durch Chromatographie an Remazol Brilliant Red GG, immobilisiert auf Sepharose 6B, wie bei Syed S. E. H. et al. , Biochim. Biophys. Acta, 1990, 1115, Seiten 123 - 130 beschrieben, isoliert und wie in T. J. Stillman et al. (J. Mol. Biol., 1993, 234, Seiten 1131 - 1139) beschrieben, kristallisiert und der Röntgenstrukturanalyse unterworfen.
Ergebnis:
Durch die oben beschriebene Prozedur wurde die Glutamat- Dehydrogenase aus Clostridium symbiosum in der Position 89 durch gezielte Mutagenese von Lysin zu Leucin verändert (Lys89Leu, K89L) . Bei dem in Position 89 in der Sequenz geänderten Enzym wurden die Aktivitäten mit den gleichen Substraten wie beim Wildtyp ermittelt.
Hierbei wurden unter den gleichen Assay-Bedingungen wie oben die folgenden relativen Aktivitäten (U/mg) gemessen:
rel. Aktivität (U/mg)
L-Glutamat 0,011
L-Norleucin 0,012
L-Methionin 0,005
Während also der Wildtyp der Glutamat-Dehydrogenase aus Clostridium symbiosum nur Glutamat umsetzt, nicht aber Norleucin oder Methionin, setzt das in Position 89 mutierte Enzym Lys 89 Leu (K89L) die drei Aminosäuren Norleucin,
Glutamat und Methionin im Verhältnis der kcat/Kjγ[-Werte von 1,2 : 1,1 : 0,5 um.
Beispiel 2 :
Die dreidimensionale Kristallstruktur der Glutamat- Dehydrogenase aus Clostridium symbiosum ist aus der Literatur bekannt und zwar sowohl als Komplex mit Glutamat (T. J. Stillman et al., J. Mol. Biol., 1993, 234,
Seiten 1131 - 1139) als auch in freier Form sowie als Komplex mit dem Cofaktor NAD+. (P. J. Baker et al. , Proteins, 1992, 12, Seiten 75 - 86) .
Aus der Literatur ist ebenfalls bekannt, daß die Substratspezifität der Glutamat-Dehydrogenase aus Clostridium symbiosum durch Wechselwirkungen mit den Seitenketten der Aminosäuren Lys 89, Ser 380, Gly 90, Ala 163 und Val 377 herrührt (T. J. Stillman et al., J. Mol. Biol., 1993, 234, Seiten 1131 - 1139; die zahlenmäßige Bezeichnung der Aminosäuren bezieht sich auf die Stellung der jeweiligen Aminosäure in der Sequenz der Glutamat-Dehydrogenase aus Clostridium symbiosum, gerechnet vom N-Terminus her) .
Durch zusätzlichen Vergleich der literaturbekannten Aminosäuresequenzen (K. L. Britton et al. , J. Mol. Biol., 1993, 234, Seiten 938 - 945) der vier Aminosäure- Dehydrogenasen
Glutamat-Dehydrogenase aus Clostridium symbiosum, Leucin-Dehydrogenase aus Bacillus stearothermophilus, Phenylalanin-Dehydrogenase aus Thermoactinomyces intermedius und Phenylalanin-Dehydrogenase aus Bacillus sphaericus,
wurden die Reste Leu 89, Gly 90, Ala 163, Val 377 und Val 380 in der Aminosäuresequenz der Leucin-Dehydrogenase für die Substratspezifität als ausschlaggebend erkannt (K. L. Britton et al., J. Mol. Biol., 1993, 234, Seiten 943 und 944). Desgleichen wurden die Reste Leu 89, Gly 90, Gly 163, Leu 377 und Val 380 in der Aminosäuresequenz der Phenylalanin- Dehydrogenase für die Substratspezifität als ausschlaggebend
erkannt (K. L. Britton et al., J. Mol. Biol., 1993, 234, Seiten 943 und 944) . Die Zählung der Stellung der Aminosäuren bezieht sich hier immer auf die zahlenmäßige Stellung der jeweiligen Aminosäure in der Sequenz der Glutamat- Dehydrogenase aus Clostridium symbiosum.
Da die Substratspezifität von Leucin-Dehydrogenase und Phenylalanin-Dehydrogenase aber völlig verschieden ist (K. L. Britton et al. , J. Mol. Biol., 1993, 234, Seiten 943 und 944) , wird die Substratspezifität der Phenylalanin- Dehydrogenase aus Bacillus sphaericus durch Mutation der
Reste Gly 163 und Leu 377 abgeändert und in Richtung auf die Substratspezifität einer Leucin-Dehydrogenase modifiziert.
Das Gen, das die Phenylalanin-Dehydrogenase aus Bacillus sphaericus kodiert, wurde durch Verwendung von Mismatch- Oligonukleotid-Primern punktspezifisch mutiert und anschließend nach der Uracil-DNA-Methode für mutierte DNA selektiert, beides wie beschrieben bei Kunkel T. A. et al., Proc. Nat. Acad. Sei., 1985, 82, Seiten 488 - 492 und bei Kunkel T. A. et al., Methods in Enzymology, 1987, 154, Seiten 367 - 382, mit der Polymerase-Chain-Reaktion kloniert, die DNA-Sequenzanalyse durchgeführt und Expression in Escherichia coli vorgenommen (J. K. Teller et al. , Eur. J. Biochem., 1992, 206, Seiten 151 bis 159) .
Das in Escherichia coli exprimierte Enzym wurde durch Chromatographie an Remazol Brilliant Red GG, immobilisiert auf Sepharose 6B, wie bei Syed S. E. H. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1990, 1115, Seiten 123 - 130 beschrieben, isoliert und wie in T. J. Stillman et al. (J. Mol. Biol., 1993, 234, Seiten 1131 - 1139) beschrieben, kristallisiert und der Röntgenstrukturanalyse unterworfen.
Ergebnis :
Durch die oben beschriebene Prozedur wurde die Phenylalanin- Dehydrogenase aus Bacillus sphaericus in zwei Stellen in der Aminosäuresequenz verändert: Statt der Aminosäuren Gly 163 und Leu 377 wies das mutierte Enzym die Aminosäuren Ala 163 und Val 377 am entsprechenden Ort in der Sequenz auf. Bei dem in zwei Positionen in der Sequenz geänderten Enzym wurden die Aktivitäten mit verschiedenen potentiellen Substraten ermittelt unter den Assay-Bediungungen wie bei Y. Asano et al. (J. Biol. Chem. 1987, 262, Seiten 10346 - 10354) bei pH 10.4 und 25 °C in 0.1 molarem Glycin-NaOH-Puffer, mit 2.5 mmol/1 NAD+ und 10 mmol/1 L-Aminosäure. Die Ergebnisse sind wie folgt:
Aminosäure Wildtvp Doppelmutante
L-Leu 1 . 5 % 3 . 0 % L-Val 1 . 7 % 6 . 4 % L-Met 2 . 6 % 3 . 8 % L-Nva 2 . 9 % 3 . 2 % L-Ile 1 . 0 % 5 . 5 %
L-Phe (zum Vergleich) 100 . 0 % 7 . 7 %
Die Phe-Aktivität des Wildtyps entspricht 87.6 U/mg Protein, gemessen unter den gleichen Assay-Bedingungen wie bei Y. Asano et al. (J. Biol. Chem., 1987, 262, Seiten 10346 - 10354) bei pH 10.4 und 25 °C in 0.1 molarem Glycin-NaOH-Puffer, mit 2.5 mmol/1 NAD+ und 10 mmol/1 L-Aminosäure.
Es ist daher festzustellen, daß nicht nur die relative Aktivität der Mutante bei den aliphatischen L-Aminosäuren nahe an die Aktivität gegenüber L-Phenylalanin heranreicht, sondern daß die absolute Aktivität der Mutante gegenüber aliphatischen L-Aminosäuren höher ist als die Aktivität des Wildtyps gegenüber diesen Substraten. Dies bedeutet, daß die
Spezifität signifikant hin zu derjenigen einer Leucin- Dehydrogenase verändert ist.
Beispiel 3 :
0.4 mmol (0.52 g) 2-Ketocaproat (= 2-Oxonorleucin) wurden in 100 ml 0.1 molarem Phosphatpuffer mit pH 7 gelöst und 0.05 mol (2.68 g) Ammoniumchlorid sowie 0.1 mmol (66.3 mg) NAD+ zugegeben. Anschließend wurden 4.5 mg einer in Position 89 von Lysin zu Leucin veränderten Glutamat- Dehydrogenase zugegeben und unter Magnetrührung reagieren gelassen. Die gemessene Aktivität des in Position 89 veränderten Enzyms betrug 1.3 U/mg. Nach 96 Stunden wurden zu dem Ansatz 100 ml Ethanol gegeben und am Rotationsverdampfer eingeengt. Das ausgefallene Produkt wurde je einmal mit 10 ml kaltem Wasser und Ethanol gewaschen und bei 50 °C im Vakuum getrocknet. Die Enantiomerenreinheit wurde durch GC über Chirasil-Val bestimmt.
Ausbeute an L-Norleucin: 0.41 g (78 % der Theorie)
Enantiomerenreinheit: > 99.8 % L-Anteil
Weitere Ausführungsformen der Erfindung werden an Hand der nachfolgenden Patentansprüche ersichtlich.
Claims
1. Verfahren zur gezielten Veränderung von Enzymen, dadurch gekennzeichnet, daß man nacheinander folgende Schritte ausführt:
- Strukturaufklärung von mindestens zwei Enzymen aus einer Gruppe von Enzymen;
Vergleich von Bindungstaschen der Enzyme mit geklärter Struktur aus einer Gruppe;
Ermittlung der Aminosäuren, die für die Bindung eines für das unveränderte Enzym nicht bevorzugten
Substrates notwendig sind;
Auswahl der Aminosäuren in der Bindungstasche des Enzyms mit geklärter Struktur, welche für die Bindung eines erwünschten, vom unveränderten Enzym nicht bevorzugten Substrates zu verändern sind;
Veränderung der ausgewählten Aminosäuren durch Mutation eines zum Enzyms gehörigen Gens;
Exprimierung des mutierten Gens und Isolierung des gezielt veränderten Enzyms.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zum Schritt der Strukturaufklärung folgende Einzelschritte gehören:
- bei wenigstens einem Enzym einer Gruppe Analyse der
Aminosäure-Sequenz, Kristallisation eines zugehörigen Enzym-Substrat-Komplexes und Aufklärung der Raumstruktur des Enzym-Substrat-Komplexes;
Analyse einer hochhomologen Aminosäure-Sequenz wenigstens eines weiteren Enzyms derselben Gruppe und gegebenenfalls Kristallisation des Enzyms.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als gewünschte, vom unveränderten Enzym nicht bevorzugte Substrate 2-0xosäuren eingesetzt werden.
4. Verfahren zur Herstellung von Enzymen für die stereospezifische reversible Reaktion der oxidativen Desaminierung einer L-Aminosäure oder reduktiven Aminierung einer Oxosäure, bei dem bei einem Enzym aus der Gruppe mit der E.C.¬ Nummer 1.4.1. eine Bindungstasche mit den Resten Valin 377, Serin 380, Threonin 193, Lysin 89 und Alanin 163 durch Mutation eines zum Enzym gehörigen Gens verändert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Bindungstasche verändert wird, die zusätzlich die Reste Glutamin 110, Aspartat 114, Methionin 121, Arginin 205 und gegebenenfalls weitere Reste aufweist.
6. Enzym der Gruppe mit der E.C.-Nummer 1.4.1. mit wenigstens einer Bindungstasche zur Bindung eines Substrats für die stereospezifische reversible Reaktion der oxidativen Desaminierung einer L-Aminosäure oder reduktiven Aminierung einer Oxosäure, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens einen geänderten Rest unter den zur Bindungstasche des unveränderten Enzyms gehörenden Resten Valin 377, Serin 380, Threonin 193, Lysin 89 und Alanin 163 aufweist. Enzym nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungstasche zusätzlich die Reste Glutamin 110,
Aspartat 114, Methionin 121, Arginin 205 und gegebenenfalls weitere Reste aufweist, die ggf. verändert sind.
8. Verwendung eines Enzyms nach einem der Ansprüche 6 oder 7 zur Umsetzung von 2-Oxosäuren zur Herstellung von L- Alpha-Aminosäuren.
Verwendung eines Enzyms nach einem der Ansprüche 6 oder 7 zur Umsetzung von L-Alpha-Aminosäuren zur Herstellung von 2-Oxosäuren.
10. Verwendung eines Enzyms nach einem der Ansprüche 6 oder 7 zur Umsetzung von DL-Alpha-Aminosäuren zur Herstellung von 2-Oxosäuren und D-Alpha-Aminosäuren.
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