WO1995001432A1 - Nouveau polypeptide et adn codant pour celui-ci - Google Patents

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WO1995001432A1
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amino acid
polypeptide
acid sequence
dna
factor
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Sadaaki Iwanaga
Tatsushi Muta
Noriaki Seki
Toshio Oda
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Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/579—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving limulus lysate
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    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
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    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance

Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide represented by the amino acid sequence of (1 ⁇ 3) - ⁇ -1D-glucan-sensitive factor (hereinafter referred to as “Factor G”) derived from a horseshoe crab's hambosite.
  • the present invention relates to a DNA encoding the same, particularly to a polypeptide represented by the amino acid sequence of the a-subunit of factor G and a DNA encoding the same.
  • Fig. 1 shows this coagulation cascade reaction in the Japanese horseshoe crab (Tachypleus tridentatus).
  • the structures of the three serine proteinase precursors (factor C, factor B, and coagulase) and the gelling protein (coagulogen) shown in Fig. 1 are cDNA clones.
  • the licensing is present on the cell walls of fungi and yeasts.
  • Factor (G) exists as a factor that interacts with this (1 ⁇ 3) —) 5—D—glucan to initiate the gelation reaction.
  • Factor G is a serine protein precursor and is a glycoprotein composed of a non-covalently linked 72 kDa subunit (subunit) and a 37 kDa subunit (subunit).
  • the a subunit of factor G has a specific binding site for (1 ⁇ 3) - ⁇ -peglucan, and the b subunit has a serine protease region.
  • (1 ⁇ 3)- ⁇ 1 D-Glucan is thought to bind to the a subunit to activate factor G and to express the function of serine protease.
  • the full structure of factor G has not yet been elucidated.
  • the present invention has been made in view of the above situation, and has a G factor derived from horseshoe crab hambosite, particularly (1 ⁇ 3) — /? — D—glucan binding site. a It is an attempt to isolate and purify a subunit and to clarify its entire structure.
  • An object of the present invention is to provide a polypeptide that blocks the (1 ⁇ 3)-?-D-glucan binding site of factor G, and a cDNA encoding the same.
  • Another object of the present invention is to provide a polypeptide of a subunit of G factor and a DNA encoding the same.
  • an object of the present invention is to provide a G-factor polypeptide that occupies a subunit and a DNA encoding the same. Therefore, the present invention provides a single-stranded DNA encoding a polypeptide containing at least one motif structure represented by the amino acid sequence Gin-Gln-Trp-Ser or a DNA complementary to the DNA.
  • DNA The present invention relates to double-stranded DNA and a polypeptide represented by the amino acid sequence.
  • the present invention also provides a single-stranded DNA encoding a polypeptide represented by the following amino acid sequence or a sequence having homology thereto, or a DNA complementary to the DNA:
  • the present invention relates to a single-stranded DNA and a polypeptide represented by the amino acid sequence.
  • factor G was obtained from a horseshoe crab blood cell extract by various column chromatography procedures, for example, dextran sulfate-sulfate CL-6B (Dextran su 1 barre-Sepharose C-6B). And Concananolin A — Affinity chromatography with Con A-Sepharose 4B, and Sephacryl S-200HR It can be purified by gel filtration chromatography using a method described in T. Morita et al. (198DFEBS Lett., 129 (2), 318-321, Japanese Patent Publication No. 3-399).
  • the a-subunit and b-subunit, which constitute the factor, are obtained by denaturing factor G with a denaturing agent (such as a surfactant) and fractionating it by high-performance liquid chromatography (HPLC) using a molecular sieve.
  • the partial amino acid sequence of each subunit can be obtained by Reduction of each subunit ⁇ After alkylation, the amino acid sequence of a peptide fragment obtained by enzymatic digestion can be determined by using a peptide sequencer or the like.
  • a cDNA library prepared from poly (A) + RNA isolated from horseshoe crab blood cells, an oligonucleotide or oligonucleotide synthesized based on the partial amino acid sequence of each subunit described above.
  • a cDNA encoding each subunit is isolated by using an antibody or the like against each subunit, and their nucleotide sequences are sequenced by the didoxytin termination method (Proc. Natl. Acad. USA, 74, 5463-5467 (1977) Sanger, F. et al.), Etc. Further, based on the base sequence thus determined and the partial amino acid sequence described above. Each Sub Can and child to determine the ⁇ Mi acid sequence of Tsu door.
  • the a-subunit of factor G has a domain structure based on its amino acid sequence.
  • each amino acid is represented by one letter.
  • a recombinant DNA vector containing a DNA encoding these peptides is prepared, integrated into a host, and cultured or bred. It can produce and collect peptides.
  • Figure 1 shows the endotoxin sensitivity of horseshoe crab blood cells and (1 ⁇ 3) 1 / 3— ⁇ —Glucan-sensitive coagulation cascade reaction mechanism.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of glucanase domain (amino acid number 4 to 2336) of the a-subunit of factor G.
  • FGA is the amino acid sequence of amino acids 4 to 236 of the a-subunit of factor G
  • / 5 G1 A1 is /? — 1,3 — amino acid number of glucanase.
  • the amino acid sequence of 42 1 to 68 2 is shown.
  • Figure 3 shows the amino acid numbers of the a-subunit of factor G.
  • FGA is the amino acid sequence of amino acids 391 to 644 of the a-subunit of factor G
  • Xyn Z is the amino acid sequence of amino acids 298 to xylanase Z.
  • the amino acid sequence of 4 3 4 is shown.
  • Fig. 4 shows the domains of amino acids 247 to 387 of the a-subunit of factor G.
  • FGA is the amino acid sequence of amino acids 247-138 of the a-subunit of factor G
  • XlnA is the amino acid sequence of amino acids 351-47 of xylanase A. The amino acid sequence of 7 is shown.
  • Dextran sulfate mono-Sepharose C or 6B column (5 ⁇ 17.8 cm) prepared by equilibrating 1250 ml of the above extract with an extraction buffer in advance (Preparation method described in Preparation Example 2 of JP-B-3-399) After washing thoroughly with the same buffer, the excess solution adsorbed on the column with 0.02M Tris-HCl buffer, pH 8.0 (0.15M sodium chloride) was added. The protein was washed away. Next, the protein adsorbed to the column was eluted with 0.02 M Tris-HCl buffer, PH8.0 (0.25 M sodium chloride) to obtain a G factor fraction.
  • Con A-Sepharose 4B column (Pharmacia Bay) previously equilibrated with the above factor G fraction with 0.02 M Tris-HCl buffer, pH 8.0 (0.25 M sodium chloride solution) (2X16cm), wash well with equilibration buffer, and re-wash with 0.02M Tris-HCl buffer, pH 8.0 (0.5M sodium chloride). The ram was thoroughly washed. After washing, eluting protein adsorbed on the column with Tris-HCl buffer, PH8.0 (0.5M sodium chloride, 0.5M methyl-D-glucoside) Then, a G factor fraction was obtained.
  • the factor G fraction was concentrated by ultrafiltration, and then pre-equilibrated with 0.05M sodium phosphate buffer, PH6.5. It was added to S-200H column (Pharmacia Biotech Co., Ltd.) (2.7 ⁇ 98 cm), and the protein was eluted with the same buffer. The protein fraction eluted last in this chromatographic column and showing little absorption at a wavelength of 280 nm was collected. The protein thus obtained was used as a final purified preparation of factor G. Determination of final 113 than g of blood cells, c 2.
  • G factor a subunit preparative subsequences that give the G factor of approximately 300 g bovine serum Arve Mi down converted
  • a Subunit and b Subunit are separated. Also serves as a concentrated factor G obtained in the above 1 and desalting, After precipitation with main Tano Ichiru and chloroform (Methods in Enzymology vol.182, P 78-79 , (1990)), Dissolved in 2% SDS (sodium sodium dodecyl sulfate) solution and heated at 100 for 5 minutes. The heated sample was subjected to gel filtration using two linked TSKgel G3000SW using 0.1 M sodium phosphate buffer, PH7.0 (containing 0.1% SDS) as the mobile phase. As a result, the a and b subunits of G factor were separated.
  • SDS sodium sodium dodecyl sulfate
  • Trichloroacetic acid was added to the fraction of the a-subunit of G factor obtained in the above 2 (1) to a final concentration of 17.4% (W / V), and the a-subunit of G factor was added.
  • the kit was allowed to settle. According to the method of Paul Matsudaira (A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing, p42-43> 1989, published by Academic Press, Inc.), the precipitated G factor a subunit was replaced with 0.4M ammonium bicarbonate. (Containing 8M urea), perform reductive alkylation using potassium acetate, and then add water to add urea.
  • the amino acid sequence of each of the obtained peptides was determined using a gas-phase sequencer 479A (Affairs, Inc., Rideno Systems Japan, Inc.). Table 1 shows the results.
  • Equation 1 The oligonucleotides A 'and B' shown here cover all the possibilities of the sequences corresponding to A and B or the complementary sequences, respectively, provided that the Phe of A The third nucleotide (T, C) in Don (TT (C / T)) has been removed.
  • a Limulus crab blood cell cDNA library was prepared from the cDNA synthesized in (1) by using the ADNA method of cDNA Cloning System gU0 Adapter.
  • the poly (A) + RNA obtained in 4 (2) above was used as a type, and the oligonucleotide synthesized in 3 above was used for PCR (Saiki, K. et al, Science, 239, 487-491, 1988), and amplified a cDNA fragment encoding a part of the a subunit of factor G.
  • the c DNA Furagume down preparative multi-ply beam - by using the DNA Raberi down Guki Tsu Miyako (Japan G emission Corporation) those labeled with [or- 32 P] dCTP by the probe, and the 5.
  • By screening the cDNA library prepared in (2) two positive clones containing the longest insert cDNA of about 2,400 bp can be obtained.
  • the insert cDNAs of these clones were exactly the same except that the lengths of the 5 'end and the 3' end differed by a few bases.
  • the base sequences of both were determined, and the base sequence obtained by combining them was found to have a start codon and po] y (A) + tail. The size of bp was shown.
  • the insert cDNA obtained in step 6 above was inserted into the PUC118 vector and the pBluescript II SK vector.
  • the restriction enzyme recognition site on the cDNA fragment and the kilosequence deletion kit (Takara Shuzo Co., Ltd. )) was performed by de- laying.
  • the DNA sequencer 370A (Applied Noy Systems) using a nucleotide primer that fluorescently labels the base sequence of cDNA in the clone prepared by the above method Janon Co., Ltd.) (Smith, LM et al (1986) Nature 321, 674-679).
  • nucleotide sequence of c-DNA of the a-subunit of factor G determined in this manner, and the amino acid sequence determined thereby are shown in the sequence listing of SEQ ID NO: 1.
  • This amino acid sequence contains all of the partial amino acid sequence determined in 2 (3) (Table 1), and the insert cDNA whose base sequence was determined this time contains the G factor. a Certainly coded the subunit.
  • the vector is a vector constructed for gene recombination from a phage or plasmid capable of autonomous growth in a host microorganism or cell, that is, an appropriate promoter, sD sequence, Translation start code ATG or Further, those containing an appropriate structural gene are suitable.
  • a transformant can be obtained by transferring the constructed vector into an appropriate host organism or cell. Examples of the host include various colon strains, various yeast strains, animal cells such as oocytes (CHO) of animals such as murine mice, rats, and hamsters.
  • G factor Plant cells, insect cells And animal and plant insect hosts.
  • a large amount of G factor or its subunit (hereinafter referred to as G factor, etc.) can be produced stably.
  • the culture or breeding conditions of the transformant can be appropriately changed within a range that produces factor G or the like, but it is preferable to use conditions generally known in this technical field in which the host used grows.
  • Factor G or the like in a culture or a breeding product can be used by directly collecting a culture solution containing cells or cells or an extract obtained by crushing an individual by an appropriate mechanical method.
  • factor G or the like when factor G or the like is present in a culture solution or an extract, according to a conventional method, the fragmented solution of the factor G or the like and the cells, cells, or individuals are separated by filtration, centrifugation, or the like. It is used after separating When factor G, etc. is present in the cells, cells or the organ membrane of the individual, the cells, cells or cells are collected by filtering or centrifuging the obtained culture or debris. Then, this product is separated and collected by solubilizing factor G or the like by adding a chelating agent and / or a surfactant such as a mechanical method, an ultrasonic treatment or an enzymatic method such as lysozyme, or EDTA. Isolation of factor G or the like from the thus obtained solution of factor G or the like can be performed by following a generally known protein purification method.
  • factor G etc. should be expressed as chimerabolipeptide.
  • it can be easily isolated by utilizing the properties of the other protein.
  • it can be easily isolated by affinity chromatography using the affinity with the other protein.
  • the G factor a submit can be expressed in the following manner.
  • oligonucleotide having a 3' sequence, and further phosphorylate the 5 'end.
  • the oligonucleotide is hybridized with a single-stranded DNA prepared from a plasmid into which a gene encoding the a-subunit of factor G has been incorporated, and DNA such as K1 enow fragment is hybridized.
  • An elongation reaction is carried out using a polymerase, and the resulting single-stranded portion is cut with a DNA nuclease such as Mung bean nuclease to obtain a double-stranded DNA.
  • This double-stranded DNA is digested with SphI restriction enzyme, and the sticky ends generated at this time are blunt-ended with T4 DNA polymerase, Klenofragment or B1 unting kit.
  • This double-stranded DNA is cut with Nc0I restriction enzyme in advance, and the resulting sticky end is treated with T4 DNA polymerase, K1en0 wfragment or B1 unting kit. It was incorporated into blunted PTV118N (containing the ampicillin resistance gene).
  • This plasmid is introduced into E.c01iJM109 or E.c01iMV1184 to obtain a transformant. In this case, the necessary transformant can be selected by a general method utilizing the properties of the plasmid.
  • the LB plate that holds ampicillin (5—Bromo 4—Cro mouth 1—3—3 Indolin 1—D—Galactoside (X—ga 1) / Iso Culture on isopropyl thiogalactoside (IPTG), Pick up and select the white color with the target plus.
  • a plasmid having a further correct sequence can be obtained by screening using a synthetic oligonucleotide of 5'-AAACAGACCATGAGCCACGAACCA-3 'as a probe.
  • DNA sequencing using RV-N Primer (Takara Shuzo Co., Ltd.) as a sequencing primer demonstrated that plasmid was correctly constructed. Can be confirmed. E.
  • the a-subunit of factor G is purified from the culture supernatant or the bacterial cell extract by a generally used method. At this time, purification can be performed more easily by performing affinity chromatography using a ligand or the like having an affinity for the a-subunit of the antibody or the G factor.
  • a peptide fragment was obtained from the b-subunit of factor G obtained in (1) by the same method as in 2. (2) of Example 1.
  • Oligonucleotides C 'and D' shown here cover all possibilities of sequences corresponding to or complementary to C and D (except for the terminal amino acids of C and D). Lys and the third nucleotide of the D codon (AA (A / G) and (AC (A / C / G / T))), respectively (A, G and T, C, A, G) has been excluded).
  • the poly (A) + NA obtained in 4. (2) of Example 1 was used as the ⁇ type, and the oligonucleotide synthesized in Step 2 was used.
  • Analysis of the nucleotide sequence of the insert cDNA of this clone revealed that it corresponded to the amino acid sequence of the peptide derived from the b-subunit of factor G obtained in 1. (2) above. It contains a base sequence, has a polyA addition signal, and its size suggests that this clone is a full-length cDNA.
  • the nucleotide sequence of cDNA of the b-subunit of factor G was determined in the same manner as in 7 of Example 1. As a result of these studies, the nucleotide sequence of the b subunit cDNA of factor G, which was clarified, and the amino acid of the b subunit of factor G, which were clarified accordingly The sequence is shown in the sequence listing of SEQ ID NO: 2.
  • the vector After transferring the recombinant DNA vector containing the cDNA encoding the polypeptide collected in Example 2 into a host microorganism capable of replicating, a suitable animal cell, an insect or an insect cell, the vector is merged with the vector.
  • (1 ⁇ 3)-1-D-Glucan binding ability is used as an indicator to culture or breed microorganisms, animal cells, insects or insect cells carrying the recombinant DNA vector, which are obtained by screening.
  • the polypeptide of the present invention can be collected.
  • the a- subunit of factor G of the horseshoe rabies lysate was isolated and purified, and its amino acid sequence and the cDNA base sequence encoding it were determined.
  • the sequence of (1 ⁇ 3) — /? — D —glucan binding site is contained in this sequence, and the cDNA corresponding to the binding site is identified by genetic engineering using these cDNAs. You can get a peptide.
  • the resulting polypeptide has the following various effects.
  • Diagnosis of the above-described deep mycosis is based on the (1 ⁇ 3) - ⁇ -peg) polypeptide or (1 ⁇ 3) -D-g Lucan is labeled with a labeling substance such as a radioisotope, enzyme, fluorescent substance, luminescent substance, etc., and is used as a ligand-receptor by the Atsushi method (1 ⁇ 3) _ /? — D—Can be done by measuring glucan. Measurement methods such as a method in which the polypeptide is bound to a solid phase such as microplates, test tubes and beads to specifically capture and detect (1 ⁇ 3) -15-D-glucan Can also be used. With such a measurement method, (1 ⁇ 3)- ⁇ -1D-glucan derived from a fungus in a body fluid can be specifically measured, and diagnosis of deep mycosis can be performed simply and quickly.
  • a labeling substance such as a radioisotope, enzyme, fluorescent substance, luminescent
  • a drug in which an antifungal agent is bound to a polypeptide having a (1 ⁇ 3) — / 9—D-glucan binding site has a strong affinity for a lesion, and (1 ⁇ 3) 3) — /? — D-glucan is a new selective antifungal agent that specifically kills fungal fungal lesions on the cell wall.
  • yeast that encodes a target protein when expressing the target protein is used as a host for yeast cells. Is used frequently. This is because glycoproteins can be produced and mass cultivation is possible as with bacteria.
  • the problem is that very small amounts of (1 ⁇ 3) ——D-glucan are present in yeast products, and residues of yeasts are often found in the product. And removal is required.
  • the affinity chromatography is performed using an affinity carrier in which a polypeptide having a (1 ⁇ 3) — / 5—D—glucan binding site is bound to a support. By performing chromatography, yeast residues can be specifically removed or quantified, and it can be confirmed that there is no yeast cell component in the product after removal.

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Description

明 細 書 新規ポ リ ぺプチ ド及びそれをコー ドする D N A 技 術 分 野
本発明は、 力ブ トガニ ' ァメ ボサイ ト由来の （ 1 → 3 ) - β 一 D—グルカ ン感受性因子 （以下 「 G因子」 という ） のァ ミ ノ 酸配列で示されるポリ ぺプチ ド及びそれをコ一 ドする D N A、 特に、 G因子の a サブュニ ッ トのア ミ ノ酸配列で示されるポリ ぺプチ ド及びそれをコー ドする D N Aに関する。
背 景 技 術
従来、 力ブ トガニ ' ァメ ボサイ ト · ライ セー トを使用して、 エ ン ド ト キ シ ンを測定する方法が知られている。 こ の方法は、 微量、 たとえば 1 0— 9 gオーダーのエ ン ド ト キ シ ンによ り ラ イ セ一 トが凝固する こ とに基づいており、 その後の生化学的解明 により、 この反応はい く つかの凝固因子の段階的な活性化機構 より成る こ とが明らかにされている （カスケー ド反応ともいう）
(中村隆範他、 日本細菌学雑誌、 、 781-803 (1983)) 。 第 1 図に日本産力ブ トガニ (Tachypleus tridentatus)における こ の凝固カスケー ド反応を示す。 またこの第 1 図に示す三種のセ リ ンプロテア一ゼ前駆体 （ C因子、 B因子、 凝固酵素前駆体） とゲル化タ ンパク質 （コアギュ 口一ゲン） に関しては、 それら の構造が cDNAク ローニ ング等によりすでに明らかにされている (T.Muta et al (1991) J.Biol. Chem. , 266 , 6554- 656K T.Muta et al (1991) J . B i o 1. Chem . ,265,22426-22433 、 T. Miyata et al (1986) J. Biochem. , 100, 213-220) 。
一方、 こ のライ セ一 ト は、 真菌や酵母菌の細胞壁に存在する
( 1 → 3 ) — — D—グルカ ンに も 1 0 -B〜 l 0 -9 g のオーダ 一で反応し、 ゲル化を引き起こすこ とが知られている （第 1.図 参照） 。 こ の （ 1 → 3 ) — )5 — D —グルカ ン と相互作用し、 ゲ ル化反応を開始させる因子と して、 G因子が存在する。 G因子 は他の因子と同様にセ リ ンプロテァーゼ前駆体であり 、 72kDa の a subuni t (サブュニ ッ ト） と 37kDa の b subuni t (サブュ ニッ ト） が非共有結合で結ばれた糖タ ンパク質である こ とが明 らかにされている（1991年第 64回日本生化学会にて発表） 。
また、 G因子の a サブユニ ッ トには （ 1 → 3 ) 一 β — Ό ー グ ルカ ンに特異的な結合部位が、 さ らに b サブュニ ッ トにはセ リ ンプロテアーゼ領域が存在し、 （ 1 → 3 ) — ^ 一 D —グルカ ン が a サブユニ ッ トに結合する と G因子が活性化されセ リ ンプロ テアーゼの機能を発現する ものと考えられている。 しかし、 G 因子の全構造は、 まだ明らかにされていない。
発 明 の 開 示
本発明は、 上記したような状況を考慮してなされたものであ つて、 カブ トガニ · ァメ ボサイ ト由来の G因子、 特に （ 1 → 3 ) — /? — D —グルカ ン結合部位を有する a サブュニ ッ トを単離精 製し、 その全構造を明らかにしよう とする ものである。
本発明の課題は、 G因子の （ 1 → 3 ) — ? 一 D - グルカ ン結 合部位を舍むポリ ペプチ ド及びそれをコー ドする c D N Aを提 供する こ とにある。
また、 本発明の課題は、 G因子の a サブュニ ッ トのポリ ぺプ チ ド及びそれをコー ドする D N Aを提供する こ とにある。
さ らに、 本発明の課題は、 a サブュニ ッ トを舍む G因子のポ リ ペプチ ド及びそれをコー ドする D N Aを提供する こ とである。 従って、 本発明は、 ア ミ ノ酸配列 Gin- Gln-Trp- Serで示され るモチーフ構造を少な く とも一箇所含むポリ ぺプチ ドをコ一ド する一本鎖の D N A又は該 D N Aと相補的な D N Aとからなる 二本鎖の D N Aおよび該ア ミ ノ酸配列で示されるポリ ぺプチ.ド に関する。
また、 本発明は、 次のア ミ ノ酸配列またはそれと相同性を有 する配列で示されるポリ ぺプチ ドをコ一ドする一本鎖の D N A 又は該 D N Aと相補的な D N Aとからなる二本鎖の D N Aおよ び該ア ミ ノ酸配列で示されるポ リ べプチ ドに関する。
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以下本発明について詳し く 説明する。
まず G因子は、 カブ トガニ血球抽出液より種々のカ ラムク ロ マ トグラフィ 一の操作、 例えばデキス ト ラ ン硫酸一セフ ァ 口一 ス CL-6B (Dextran s u 1 f a te- Sepharose Cし- 6B)およびコ ンカナ ノ リ ン A —セ フ ァ ロース 4B(Con A-Sepharose 4B ) によるァフ ィ ニテ ィ 一ク ロマ トグラ フ ィ ー、 さ らにセ フ ァ ク リ ノレ（Sephacr yl) S-200HR によるゲル濾過ク ロマ トグラ フ ィ 一により精製す るこ とができる（T.Morita etal (198DFEBS Lett. , 129(2) ,318- 321、 特公平 3- 399 号公報）。 さ らに、 G因子を構成する a サブ ュニ ッ トおよび b サブュニ ッ トは、 G因子を変性剤 （界面活性 剤等） により変性し、 分子篩を用いた高速液体ク 口マ トグラフ ィ一 （ H P L C ) で分画する こ とにより得る こ とができる。 各 々 のサブュニ ッ トの部分ア ミ ノ酸配列は、 それぞれのサブュニ ッ トを還元 ♦ アルキル化後、 酵素消化する こ とにより得られる ペプチ ド断片のア ミ ノ酸配列をペプチ ドシークェ ンサ一等を用 いて決定する こ とにより得る こ とができる。 また、 カブ トガニ 血球より単離した poly(A) + RNAより作製した cDNAライ ブラ リ 一から前述した各々のサブュニ ッ トの部分ァ ミ ノ酸配列に基づ いて合成したオ リ ゴヌク レオチ ドまたは各々のサブュニ ッ トに 対する抗体等を用いる こ とによりそれぞれのサブユニ ッ トをコ — ドする cDN Aを単離し、 それらの塩基配列をダイ デォキシチヱ ィ ンタ一ミ ネーショ ン法 (Proc. Natl . Acad. Sci . U.S.A. 74, 5463-5467 (1977) Sanger, F. et al .) 等により決定する こ と ができる。 また、 このよう に決定された塩基配列と上記部分ァ ミ ノ酸配列を基に各サブュニ ッ トのァ ミ ノ酸配列を決定する こ とができる。
以上の方法によって、 配列番号 1 で示される G因子の a サブ ユニッ トであるポ リ ペプチ ドをコー ドする c D N A ( AGC · ·, · · GTG；塩基番号 1 1 4 ~ 2 0 7 5 ) およびそれに対応するァ ミ ノ 酸配列 （Ser ' . · ·ν3ΐ ;ア ミ ノ酸番号 1 〜 6 5 4 ) を明らかにし た。
また、 G因子の a サブュニ ッ ト は、 そのア ミ ノ酸配列より ド メ イ ン構造を有している こ とを明らかにした。
すなわち、 a サブュニ ッ トのァ ミ ノ 末端側 （Pro A 1 a；ァ ミ ノ酸番号 4 〜 2 3 6 ) には /? — 1 , 3 —グルカナーゼのカル ボキシル末端側の配列と類似した配列をもつダルカナーゼ ドメ イ ンが存在した （第 2図） 。 一方、 カルボキシル末端側には 1 26個のア ミ ノ酸から構成される繰り返し構造 （Ser ' · · ·Ιΐ6;ァ ミ ノ酸番号 3 9 1 〜 5 1 6及び Ser....Val ； ア ミ ノ酸番号 5
2 9〜 6 5 4 ) が存在し、 またこの配列はキシラナ一ゼ Zのァ ミ ノ末端側の配列と類似していた （第 3図） 。 さ らに、 これら のダルカナーゼ ドメ ィ ンとキシラナーゼ ドメ ィ ンとの間には " Q Q W S (Gln-Gln-Trp-Ser) " モチーフを舍み、 さ らにキ シラ ナーゼ Aの配列と類似した配列が三回繰り返して存在した（Leu Leu;ア ミ ノ酸番号 2 4 7 〜 2 9 3、 Glu Val ;ァ ミ ノ 酸番号 2 9 4 〜 3 4 0及び Gly · ' · ·56Γ;ア ミ ノ酸番号 3 1 〜
3 8 7 ) (第 4図） 。
なお、 第 2図〜第 4図においては各ア ミ ノ酸を 1 文字表記で 表わした。
本発明では、 これらのぺプチ ドをコ一 ドする D Ν Αを舍む組 換え D N Aベクターを調製し、 これを宿主に組み込み、 培養あ るいは飼育する、 いわゆる遺伝子工学的手法によって、 これら のべプチ ドを産生採取する こ とができる。
図面の簡単な説明
第 1 図はカブ トガニ血球のェ ン ド トキ シ ン感受性および （ 1 → 3 ) 一 /3 — Ό —グルカ ン感受性の凝固カ スケ一ド反応の機構 を示す。
第 2図は G因子の a サブュニ ッ ト のグルカナーゼ ドメ イ ン (ア ミ ノ酸番号 4〜 2 3 6 ) のア ミ ノ酸配列を示す。 図中、 FGA は G因子の a サブュニッ トのア ミ ノ酸番号 4〜 2 3 6 のァ ミ ノ 酸配列、 /5 G1 A1 は /? — 1 , 3 —グルカナーゼのア ミ ノ酸番号
4 2 1〜 6 8 2 のア ミ ノ 酸配列を示す。
第 3図は G因子の a サブュニ ッ 卜のア ミ ノ酸番号 3 9 1〜 6
5 4 の ドメ イ ンを示す。 図中、 FGA は G因子の a サブュニ ッ ト のア ミ ノ 酸番号 3 9 1〜 6 5 4 のア ミ ノ酸配列、 Xyn Z はキシ ラナ一ゼ Zのア ミ ノ酸番号 2 9 8〜 4 3 4 のア ミ ノ酸配列を示 す。
第 4図は G因子の a サブュニ ッ ト のア ミ ノ酸番号 2 4 7〜 3 8 7 の ドメ イ ンを示す。 図中、 FGA は G因子の a サブュニ ッ ト のア ミ ノ酸番号 2 4 7〜 3 8 7 のア ミノ酸配列、 Xln A はキシ ラ ナーゼ Aのァ ミ ノ酸番号 3 5 1〜 4 7 7 のァ ミ ノ酸配列を示 す。
発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の具体的実施例を説明するが、 本発明は、 これ に限定される ものではない。
実施例 1
1 . G因子の精製
( 1 ) 血球抽出液の調製
力ブ ト ガニ（Tachypleus tridentatus) の血球 113 g に 0.02M ト リ ス ー塩酸緩衝液， PH8.G (50mM 塩化ナ ト リ ウ ム舍有） 400ml を加え、 高速ホモ ジナ イ ザー （商品名、 ヒ ス コ ト ロ ン、 日本精 密工業 （株））で 3分間ホモ ジナ イ ズした後、 8000rpm 、 30分間 遠心し、 上清を得た。 さ らに、 遠心の際に生じた沈澱物に同一 緩衝液 300 m 1を加え、 前記操作と同様、 ホモ ジナイ ズと遠心を 行い再び上清を得た。 この沈澱物に同一緩衝液を加えて遠心し、 上清を回収する操作を、 さ らに 2回繰り返し、 遠心操作で得ら れた全ての上清を集め、 1250mlの血球抽出液を得た。
( ) 血球抽出液からの G因子の精製方法
a. デキス ト ラ ン硫酸一セ フ ァ ロース CL- 6Bカ ラ ム ク ロマ ト グ ラ フ ィ 一
前記抽出液 1250mlを、 あらかじめ抽出用緩衝液で平衡化した デキス ト ラ ン硫酸一セ フ ァ ロース Cい 6Bカ ラム （5X17.8cm) (調 製法は特公平 3-399 号公報の調製例 2参照） に添加し、 充分に 同緩衝液で洗浄した後、 0.02M ト リ ス ー塩酸緩衝液， pH8.0 (0.15M塩化ナ ト リ ウ ム舍有） でカ ラムに吸着した余分なタ ンパ ク質を洗い流した。 次いで、 0.02M ト リ スー塩酸緩衝液， PH8.0 (0.25M塩化ナ ト リ ゥム舍有） で力 ラムに吸着したタ ンパク質を 溶出し、 G因子画分を得た。
b. コ ンカ ナノべ'リ ン A—セフ ァ ロ一ス 4Bカ ラム ク ロマ ト グラ フ ィ ー
前記の G因子画分を、 あらかじめ 0.02M ト リ ス —塩酸緩衝液， pH8.0(0.25M塩化ナ ト リ ゥム舍有）で平衡化した Con A-Sepharose 4Bカ ラム （フ ア ルマ シアバイ オテク （株） ）（2X16cm) に添加し、 平衡化緩衝液で充分に洗浄した後、 0.02M ト リ スー塩酸緩衝液， pH8.0(0.5M塩化ナ ト リ ウ ム舍有） で再度カ ラ ムを充分に洗浄し た。 洗浄後、 ト リ ス ー塩酸緩衝液， PH8.0 (0.5M塩化ナ ト リ ゥ ム、 0.5Mメ チルー 一 D —グルコ シ ド舍有）で力 ラ ムに吸 着したタ ンパク質を溶出し、 G因子画分を得た。
セ フ ァ ク リ ノレ S - 200 HRカ ラ ム ク ロ マ ト グラ フ ィ ー
前記の G因子画分を限外濾過により濃縮した後、 あらかじめ 0.05M リ ン酸ナ ト リ ウム緩衝液， PH6.5 で平衡化した Sephacryl S-200H カ ラ ム （ フ ア ルマ シアバイ オテク （株）） (2.7X98cm) に添加し、 同緩衝液でタ ンパク質を溶出した。 このク ロマ トグ ラフ ィ 一で最後に溶出され、 280 nmの波長でわずかな吸収しか 示さないタ ンパク質の画分を集めた。 このよう にして得られた タ ンパク質を G因子の最終精製標品と した。 最終的に 113 g の 血球より、 牛血清アルブ ミ ン換算で約 300 g の G因子を得た c 2. G因子の a サブユニ ッ トの部分配列の決定
( 1 ) G因子の a サブユニ ッ ト と b サブユニ ッ トの分離
G因子の a サブュニッ ト と b サブュニ ッ トの c D N Aク ロー ニ ングを行う ために必要な G因子の a 、 bサブュニ ッ 卜の部分 ア ミ ノ酸配列を明らかにするため、 まず G因子の a サブュニッ ト と b サブュニ ッ トを分離した。 前記 1 で得られた G因子を脱 塩と濃縮とを兼ねて、 メ タノ 一ルとク ロロホルムを用いて沈澱 させた後（Methods in Enzymology vol.182, P78-79, (1990)) 、 2 % S D S ( ドデシル硫酸ナ ト リ ウム） 溶液に溶解し、 100 で 5分間加熱した。 この加熱した試料を、 0.1Mリ ン酸ナ ト リ ゥ ム緩衝液， PH7.0 (0.1% S D Sを含む） を移動相と して用いた、 二本を連結した TSKgel G3000SWによるゲル濾過に付すこ とによ り、 G因子の a 、 b サブュニ ッ トを分離した。
( 2 ) G因子の a サブュニ ッ トの酵素消化
前記 2 ( 1 ) で得られた G因子の a サブュニッ トの画分に終 濃度で 17.4% (W/V) になるよう に ト リ ク ロ 口酢酸 （TCA)を加え て G因子の a サブュニ ッ トを沈澱させた。 Paul Matsudaira の 方法 ( A Practical Guide to Protein and Pe tide Purification for Microsequencing, p42-43> 1989, Academic Press, Inc.発行） に従い、 沈澱させた G因子の a サブュニ 'ン トを 0.4M 重炭酸ァ ンモニゥ ム （8M尿素を舍む） に溶解し、 ョ一 ドアセ ト ア ミ ドを用いて還元アルキル化を行い、 次いで水を加えて尿素 濃度を 4Mに希釈した後、 酵素一基質重量比 1 :60の リ シルェ ン. ド ぺプチダ一ゼ（lysyl endopeptidase, 和光純薬工業 （株） ） を 加え 37'Cで 20時間酵素消化した。 こ の消化物をあらかじめ 0.06 % (V/V) ト リ フルォ ロ酢酸で平衡化した Bondasphere 5 〃 C8 -300A (2.1X150mm) (ウォーターズ社） に添加し、 充分にカ ラ ムを洗浄した後、 5分後に 0 % (V/V)、 65分後に 24% (V/V) 、 125分後に 56% (V/V) 、 135分後に 80% (V/V) までァセ トニ ト リ ル濃度を連続的に上昇させた直線的濃度勾配法を用いて、 0.2 ml/min の流速で吸着したタ ンパク質を溶出した。 こ の際溶出 される各ペプチ ドは 210nm の紫外部吸収でモニターし、 全て分 取した。
( 3 ) 部分ア ミ ノ酸配列の決定
得られた各ペプチ ドのア ミ ノ酸配列を気相シークェンサ一 47 7A (ァフ。ラ イ ド ノ ィ ォ システムズ ジャパン （株））を用いて 決定した。 この結果を第 1 表に示す。
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ただし、 Xaa は自然界に存在するア ミ ノ酸のいずれかを示す, 3. オ リ ゴヌ ク レオチ ドの合成
第 1 表の決定したァ ミ ノ酸配列の中から、 2種のア ミ ノ 酸配 列 A:-Glu-Asp- Tyr-Asp- Gly- Phe- 、 B： - Trp- Va 1 - Me t- Phe- Trp- « et- を利用して、 A をセ ンスに、 B をア ンチセ ンスに逆翻訳し- さ らに 5' 末端側に制限酵素認識配列と DNA の保護のための 2 塩基を付けた以下に示す様なそれぞれ 25個と 26個のォ リ ゴヌク レオチ ドの混合物を D N Aシ ンセサイ ザー 3 8 O A (アプライ ド バイ オシステムズ ジャパン （株） ） を用いて合成した。
A' ： 5' -CGGAGCTCGAAGATTATGATGGTTT-3 25raer
G C C C C A G
ACCCATTACAAAACCTACCTTAAGGC-5 26mer
C G A
G
〔式 1 〕 こ こに示すオ リ ゴヌク レオチ ド A ' 及び B ' はそれぞれ、 A および Bに相当する配列あるいは相補的配列の全ての可能性を 包括している （但し、 Aの Phe のコ ド ン （TT(C/T))中の 3番目 のヌ ク レオチ ド（T, C)は除かれている） 。
4. G因子をコー ドする mRNAを舍む Poly(A)+ RNA の調製
G因子はカブ トガニ血球より精製されるこ とから、 po 1 y (A) + RNA はカブ トガニ血球より単離した。
( 1 ) 全 R N Aの調製
カブ トガニ血球 11.8 g より AGPC法 （実験医学 Vol.9, P1937〜 1940を参照） を用いて、 全 RNA 約 llmgを分離した。
( 2 ) poly (A) + RNA の調製
分離した全 βΝΑ のう ち約 2mg の全 RNA より 01 i go tex- dT 30 Superキ ッ ト （日本ロ シュ （株））を用いて poly(A)+ RNA を単 離した。 さ らに、 一度単離した poly(A)+ RNA は、 より純度を 高めるために、 同様の操作をもう一度繰り返した。 こ のよ う に 2度の Oligotex-dT 30 Superキ ッ トの操作により、 mgの全 RN A から 34.5 / gの高純度の poly(A)+ RNA を得た。
5. カブ トガニ血球 c D N Aのライ ブラ リ ーの作製
( 1 ) c D N Aの合成
前記 4で得た poly (A) + RNA 34.5 gのう ち 5 gの poly (A) + RNA からアマシャ ム社の c D N A synthesisキ ッ トを利 用し、 c D N Aを合成した。
( 2 ) c D N Aラ イ ブラ リ 一の作製
( 1 ) で合成した c D N Aからアマシ ャ ム社の c D N Aク ロ 一二ングシステム ス g U0アダプタ一法を利用し、 カブ ト ガニ血 球 c D N Aライ ブラ リ 一を作製した。
6. G因子の aサブユニ ッ ト の c D N Aク ローニ ング
前記 4 ( 2 ) で得られた poly(A) + RNA を踌型と し、 さ らに 前記 3で合成したオ リ ゴヌク レオチ ドを用いて、 PCR 法（Sa i k i , .K. et al, Science, 239, 487-491 , 1988)を行い G因子の a サ ブュニ ッ 卜 の一部をコー ドする c D N Aフラグメ ン トを増幅し た。 この c D N Aフラグメ ン トをマルチプライ ム- DNAラベリ ン グキ ッ ト （日本ジー ン （株） ） を利用して [ or— 32 P ] dCTP で ラベルしたものをプローブ,と して、 前記 5. ( 2 ) で作製した c D N Aラ イ ブラ リ ーをスク リ ーニ ングする こ とにより、 長さ力 最も長い約 2,400bp のィ ンサー ト c D N Aを舍む二つのポジテ イ ブク ロ一ンを得た。 これらのク ローンのィ ンサ一 ト c D N A は、 5'末端側と 3'末端側の長さが数塩基異なる こ とを除けば、 全く 同一であった。 また両者の塩基配列を決定し、 それらを複 合した塩基配列は、 開始コ ド ン と po]y(A)+ tailを舍み、 2,408 bpの大きさを示した。
7. G因子の a サブュニ ッ トをコー ドする c D N A塩基配列の 決定
上記 6. で得られたイ ンサー ト c D N Aを PUC118べクター及 び pBluescript II SK ベクターに組み込んだ。 pUC118ベクター 及び pBluescript II SK ベクタ一にク ローニ ングした c D N A の全塩基配列を決定するために、 c D N A断片上の制限酵素認 識部位ならびにキロ一 シークェ ンスデレーシ ョ ンキ ッ ト （宝酒 造 （株） ） を用いたデレーショ ンによるサブク ローニ ングを行 つた。 上記方法により作製したク ロー ン中の c D N Aの塩基配 列を螢光ラ ベルしたヌ ク レオチ ドプラ イ マーを使用 した DN A シ ーク ェ ンサ一 370A (アプラ イ ド ノぺ'ィ ォシステムズ ジャノ ン (株） ） （Smith, L. M. et al (1986) Nature 321， 674-679)を 用いて決定した。
このよう に決定した G因子の a サブュニ ッ トの c D N Aの塩 基配列、 ならびにそれより明らかにされたァ ミ ノ酸配列を配列 番号 1 の配列表に示した。 このア ミ ノ酸配列中に、 2 ( 3 ) で 決定した部分ア ミ ノ酸配列 （第 1表） が全て含まれており、 今 回塩基配列を決定したィ ンサー ト c D N Aは G因子の a サブュ ニッ トを確かにコー ドしていた。
8. G Ξ子またはそのサブュニッ トの発現および精製
上記で得られたク ロー ンから G因子の a サブュニ ッ トをコ一 ドする遺伝子の全部あるいは一部を超音波処理、 制限酵素処理 またはこ の技術分野において知られた他の方法により切り出し、 適当なベクターに組み込む。 ベクターと しては宿主微生物体内 あるいは細胞内で自律的に増殖しう るフ ァ ージまたはプラス ミ ドから遺伝子組み替え用と して構築されたもの、 つま り適当な プロモータ—、 s D配列、 翻訳開始コ ド ン A T G、 あるいはさ らに適当な構造遺伝子を含むよ うなものが適している。 こ の構 築したベクターを適当な宿主生物または細胞に移入する こ とに. より形質転換体を得る こ とができる。 宿主と しては、 種々の大 腸菌株、 種々 の酵母菌株、 ハツカ ネズミ 、 ラ ッ ト、 チヤィ ニ ー ズハムスター等の動物の卵母細胞 （ C H O ) のよう な動物細胞. 植物細胞、 昆虫細胞、 動植物昆虫宿主等である。 このようにし て得られた形質転換体を栄養培地で培養するこ とにより、 ある いは栄養食で飼育する こ とにより多量の G因子またはそのサブ ュニ ッ ト （以下、 G因子等という ） を安定して生産する ことが できる。 形質転換体の培養あるいは飼育条件は、 G因子等を生 産する範囲で適宜変更可能であるが、 用いた宿主が生育し、 こ の技術分野において一般に知られている条件を用いる とよい。 培養物中のあるいは飼育物中の G因子等は、 菌体あるいは細胞 を舍む培養液あるいは個体を適当な機械的な方法で破砕した抽 出液をそのまま採取し、 利用するこ ともできる。 しかし、 一般 には常法に従って、 G因子等が培養液中あるいは抽出液中に存 在する場合には、 濾過、 遠心分離などにより G因子等舍有溶液 と菌体、 細胞あるいは個体の破砕破片とを分離した後に利用さ れる。 G因子等が菌体内、 細胞内あるいは個体の臓器膜内に存 在する場合には、 得られた培養物あるいは破片を濾過または遠 心分離などの手段により、 菌体、 細胞あるいは破片を採取し、 次いでこの物を機械的方法または超音波処理またはリ ゾチーム 等の酵素的方法または E D T A等のキ レー ト剤および/または 界面活性剤を添加して G因子等を可溶化して分離採取する。 こ のよ うにして得られた G因子等舍有溶液からの G因子等の単離 は、 通常知られているタ ンパク質の精製方法に従う こ とにより 可能である。
こ の際、 G因子等をキメ ラボリ べプチ ドと して発現していれ ば、 他方のタ ンパク質の性質を利用 して容易に単離する こ とが 可能である。 例えば他方のタ ンパク質のある物との親和性を利 用して、 ァフ ィ 二ティ ーク ロマ トグラフ ィ 一によ り容易に単離 する こ とが可能である。
実際に G因子 a サブュニ ッ ト は、 次のよう な方法で発現でき る。
5 ' - A G C C A C G AA C C AA A G T G G C A - 3 ' の配 列をもつオ リ ゴヌ ク レオチ ドを合成し、 さ らに 5 ' 末端をリ ン 酸化する。 次いでこのオ リ ゴヌク レオチ ドを G因子の a サブュ ニ ッ トをコー ドする遺伝子が組み込まれたプラス ミ ドより調製 した一本鎖 D N Aとハイ ブリ ダィ ズし、 K 1 enow fragment など の D N Aポリ メ ラ一ゼによる伸長反応を行い、 この際生じる一 本鎖部分を Mung bean nucleaseなどの D N Aヌ ク レア一ゼで 切断し、 二本鎖 D N Aとする。 こ の二本鎖 D N Aを S p h I 制限酵素で切断し、 この際生じる接着末端は T 4 D N Aポリ メ ラ一セ あるいは K l e n o f r a g m e n t ある いは B 1 u n t i n gキ ッ トにより平滑化する。 この二本鎖 D N Aを あらかじめ N c 0 I 制限酵素で切断し、 こ の際生じる接着末 端は T 4 D N Aポ リ メ ラ一ゼある いは K 1 e n 0 w f r a g m e n t あるいは B 1 u n t i n gキ ッ トにより平滑化した P T V 1 1 8 N (ア ンピシ リ ン耐性遺伝子を舍む） に組み込ん だ。 このプラス ミ ドを E . c 0 1 i J M 1 0 9 あるいは E . c 0 1 i M V 1 1 8 4 に導入し、 形質転換体を得る。 こ の際- 必要な形質転換体はプラ ス ミ ドの性質を利用した一般的な方法 で選択する こ とができ る。 すなわち、 ア ンピシ リ ンを舍む L B プレー ト （ 5 —ブロモ一 4 — ク ロ 口 一 3 — 3 ィ ン ド リ ノレ 一 ^ 一 D—ガラ ク ト シ ド （ X— g a 1 ) /イ ソ プロ ピルチオガラ ク ト シ ド （ I P T G ) をあらかじめ塗布したもの） 上で培養し、 目 的のプラス ミ ドの導入された白色コ ロニーを拾い上げて選択.す る。 さ らに正しい配列をもつプラス ミ ドは、 5 ' - A A A C A G A C C A T G A G C C A C G AA C C A - 3 ' の合成オ リ ゴ ヌク レオチ ドをプローブとしてスク リ ーユングして得る こ とが できる。 さ らに R V— Nプライ マ一 （宝酒造 （株） ） をシーク ェ ンシ ンダプラ イ マ一と して用いた D N Aシーク ェ ン シ ングに より正し く プラス ミ ドが構築されたこ とをさ らに確認するこ と ができる。 正しい配列をもつプラス ミ ドが導入された E . c 0 1 i J M 1 0 9 あるいは M V 1 1 8 4を 1 0 0 〃 g /m l ァ ンピシ リ ンと I mM I P T Gを舍む 3 %Nutrient broth (日水 製薬 （株） ） にて 3 0て、 2 4時間培養する。 こ の培養上清あ るいは菌体抽出液より、 一般的に用いられている方法により G 因子の a サブュニ ッ トを精製する。 このとき抗体あるいは G因 子の aサブュニ ッ トに親和性をもつリ ガン ドなどを用いたァフ ィ ニティーク ロマ トグラフ ィ ーを行う こ とにより、 より簡単に 精製することが可能である。
実施例 2
1. G因子の bサブュニ ッ トの部分ァ ミ ノ酸配列の決定
( 1 ) G因子 bサブュニ ッ トの単離
実施例 1 の 2. ( 1 ) で G因子を a サブュニッ ト と bサブュ 二 ッ トに分離することにより、 bサブユニ ッ ト も同様に得た。 ( 2 ) G因子の bサブユニ ッ トの酵素消化
前記 （ 1 ) で得られた G因子の bサブュニ ッ トから実施例 1 の 2. ( 2 ) と同じ方法でペプチ ド断片を得た。
( 3 ) 部分ア ミ ノ酸配列の決定
得られた各べプチ ドのァ ミ ノ酸配列を実施例 1 の 2. ( 3 ) と同様に決定した。 この結果を第 2表に示す。
1 7 丁正された用紙 (規則 91) 第 2表
Peptide
Gly- 1 le-Asn-Glu- Ly s
Pe tide 2
Xaa-Xaa-Gly-Phe-Xaa-Pro-Val-lle-Thr- Pe tide 3
I le- I le- Gly-Gly Gly- I le-Ala-Thr-Pro-His-Ser-Xaa- Pro- aa Met - Val Gly- I le-Phe-
Pe tide 4
Va 1 - Asn- Pro- Peptide 5
Val-Xaa- Val-Val Thr- Ala-Ala- His-Cys- Leu-Va卜 Thr Gln-Phe Gly-Asn- Arg-Gln-Xaa-Tyr-Ser-Ile-Phe-Val Arg- Val■ Gly - Ala. His-Xaa-Ile-Xaa-Asn-Ser-Gly-Thr Asn -
Pe tide 6
Val-Val- Ile-Thr-Gly-Trp-Gly-Val-Thr-Gly-Lys Peptide 7
Asn- Va 1 し eu-Arg - Glu - Leu - Glu - Leu - Pro - Va卜 Va卜 Thr Asn-Glu Gln-Cys-Xaa-Lys
Peptide 8
Ser-Tyr-Gln - Thr -し eu-Pro-Phe - Ser-Lys
Peptide 9
Leu- Asn- Arg-Gl - I le-Thr-Asn- Asp-Met- I le-Cys- Ala Gly-Phe- Pro - Glu-Gly - Gly_し ys
Pe tide 10
Asp- Al a- Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-Met Ty r - G 1 n■ Asn-Pro-Thr-Thr-Gly-Arg-Val-Lys
2. オ リ ゴヌ ク レオチ ドの合成
決定したァ ミ ノ酸配列の中から、 2種のア ミ ノ酸配列 C ： -A sn-Glu-Gln-Cys- (Asn) -Lys. D ： -Met-Tyr-Gln- Asn-Pro-Thr- の配列を利用して、 Cをセ ンスに Dをア ンチセ ンスに逆詡訳し. 実施例 1 の 3. と同様の方法で以下に示す様なそれぞれ 25個の オ リ ゴヌ ク レオチ ド C ' および D ' の混合物を合成した。 前記 C中- (Asn)- は、 Asnと推定したこ とを示す。 C ' ： 5 ' -CGGAGCTCAATGAACAATGTAATAA-3 ' 25mer
C G G C C
D ' ： 3 ' -TACATAGTTTTAGGTTGCTTAAGGC-5' 25mer
G C G C A
G
〔式 2 〕
ここに示すオ リ ゴヌク レオチ ド C 'および D 'は C および!） に相 当する配列あるいは相補的配列の全ての可能性を包括している (但し、 C および D の 末端ァ ミ ノ酸の Lys ならびに D の Thr のそれぞれコ ド ン（AA(A/G)および（AC(A/C/G/T)) の 3番目のヌ ク レオチ ド （それぞれ A , G および T , C , A , G)は除かれている） 。
4 , GB子の b サブユニ ッ トの c D N Aク ローニング
実施例 1 の 4. ( 2 ) で得られた poly(A)+ NA を铸型と し さ らに前記 2 で合成したオ リ ゴヌク レオチ ドを用いて、 以下実 施例 1 の 6. と同様の方法で実験を行い、 l,979bpの c D N A を舍むポジティ ブク ロー ンを得た。 このク ローンのィ ンサ一 ト c D N Aの塩基配列を解析したところ、 前記 1 . ( 2 ) で得られ た G因子の bサブュニ ッ ト由来のぺプチ ドのア ミ ノ酸配列に相 当する塩基配列を含んでおり、 さ らに poly A付加シグナルが 存在し、 またその大きさからこのク ローンは全長の c D N Aで ある と思われる。
5. G因子の b サブュニッ トをコー ドする c D N A塩基配列の
G因子の b サブュニッ トの c D N Aの塩基配列は、 実施例 1 の 7. と同様の方法で決定した。 こ のよ う に検討した結果、 明 らかになつた G因子の b サブュニ ッ トの c D N Aの塩基配列な らびにそれより明らかにされた G因子の b サブュニ 'ン トのァ ミ ノ酸配列を配列番号 2 の配列表に示した。
こ のア ミ ノ酸配列中に実施例 2 の 1 ( 3 ) で決定した部分ァ ミ ノ酸配列 （表 2 ) が全て舍まれている こ とから、 今回塩基配 列を決定したィ ンサ一 ト c D N Aは G因子の b サブュニ ッ トを 確かにコー ドしていた。
実施例 2で採取したポリ べプチ ドをコー ドする c D N Aを舍 む組み換え D N Aベクターを複製可能な宿主微生物、 適当な動 物細胞、 昆虫あるいは昆虫細胞に移入した後、 ベクターのマー 力一と （ 1 → 3 ) — 一 D —グルカ ン結合能とを指標と してス ク リ ーニングして取得した、 該組み換え D N Aベクタ一を保持 する微生物、 動物細胞、 昆虫あるいは昆虫細胞を培養あるいは 飼育し、 本発明のポリ ペプチ ドを採取する こ とができる。
産業上の利用可能性
本発明ではカブ トガ二のァメ ボサイ ト · ライ セー トの G因子 の a サブュニ ッ トを単離精製し、 そのア ミ ノ酸配列およびそれ をコー ドする c D N A塩基配列を決定した。
その結果、 この配列中に （ 1 → 3 ) — /? — D —グルカ ン結合 部位の配列が舍まれており、 これらの c D N Aを用いて遺伝子 工学的手法により その結合部位に相当するポリ ぺプチ ドを得る こ とができる。 得られるポリ ペプチ ドは、 次の種々の効果を示 す。
( 1 ) 近年、 免疫不全患者の増加、 高齢化に伴って、 カ ンジダ- ァスペルギルス等のよう に通常病原性の弱い二次病原体による 日和見真菌感染が目立って増加している。 しかし特に真菌によ る内臓等の深在性真菌症は一部の特殊な病型を除いては侵襲的 な手段によ らない限り臨床診断が困難であり、 そのため剖検後 初めて診断される こ とが多い （微生物学辞典、 1 9 8 9年、 技 報堂） 。
上記深在性真菌症の診断は、 該 （ 1 → 3 ) 一 β — Ό ー グ）レカ ン結合部位を舍むポリ ペプチ ドまたは （ 1 → 3 ) — 一 D —グ ルカ ンを放射性同位元素、 酵素、 螢光物質、 発光物質などの標 識物質を用いてラ ベル化したものを用いてリ ガン ド一レセプタ 一 ' ア ツセィ法によって （ 1 → 3 ) _ /? — D—グルカ ンを測定 するこ とによって行う こ とができる。 また、 該ポリ ペプチ ドを マイ ク ロプレー ト、 試験管、 ビーズなどの固相に結合して （ 1 → 3 ) 一 5— D—グルカ ンを特異的に捕捉して検出する方法等 の測定法によるこ ともできる。 このよう な測定法より体液中の 真菌由来の （ 1 → 3 ) — ^ 一 D—グルカ ンを特異的に測定し、 深在性真菌症の診断を簡便かつ迅速に行う こ とができる。
( 2 ) また、 （ 1 → 3 ) — /9 — D—グルカ ン結合部位を舍むポ リ ぺプチ ドに抗真菌剤を結合させた医薬は病巣に強い親和性を 有し、 （ 1 → 3 ) — /? 一 D—グルカ ンが細胞壁に存在する病巣 の真菌を特異的に殺菌する新たな選択的抗真菌剤となり う る。
( 3 ) さ らに、 近年の遺伝子操作技術の発達に伴い、 目的タ ン パク質を発現する際に目的とするタ ンパク質をコー ドする遺伝 子を舍むべクタ一の宿主として、 酵母菌が繁用されている。 こ れは、 糖タ ンパク質の生産が可能で、 細菌と同じ く 大量培養が 可能であるためである。 しかし、 問題点と して、 生産物中に極 微量の （ 1 → 3 ) — — D—グルカ ンを構成成分と して持つ酵 母菌の残渣が舍まれる こ とが多 く 、 その定量及び除去が必要と なる。 この場合に、 （ 1 → 3 ) — /5— D—グルカ ン結合部位を 舍むポリ ペプチ ドを支持体に結合したァフ ィ 二テ ィ ー担体を用 いてァフ ィ 二ティ ーク ロマ トグラフ ィ 一を行う こ とにより、 特 異的に酵母菌の残渣の除ま、 あるいは定量を行う こ とができ、 また除去後の生産物に酵母菌菌体成分が存在しないこ との確認 も、 （ 1 ) に述べたよう な （ 1 → 3 ) — /? — D—グルカ ン結合 部位を舍むポリ ペプチ ドを用いた定量法を行う こ とによって、 カブ トガニ · ァメ ボサイ ト · ライ セ一 トを用いた場合に比べて より簡便で特異性の高い確認が可能となる
配 列 表
配列番号
配列の長さ 2 4 0 8
配列の型 二本鎖
トポ口ジ一 直鎖状
力ブ トガニ血球
配列
10 20 30 40
GTGGGGGGTTTAGTTGAAACAGTAAATACGTTAACTGTTTAATCT
50 60 70 80 90
TGTTAATTGCAATGTTGGTGTTGCTGTGTTGTGTTGTTTTGCATG
MetLeuVaUeuLeuCysCysValValLeuHisVal
-15 -10
100 110 120 130
TTGGTGTTGCAAGAATTTGCTGTAGCCACGAACCAAAGTGGCAGC
GlyValAlaArglleCysCysSerHisGluProし ysTrpGlnし eu
-5 - 1 1 5
140 150 160 170 180
TCGTCTGGTCGGATGAATTTACCAATGGAATAAGTTCTGATTGGG
ValTrpSerAspGluPheThrAsnGlylleSerSerAspTrpGlu
10 15 20
190 200 210 220
AATTTGAAATGGGCAATGGCCTCAATGGTTGGGGTA TAACGAAC
PheGluMetGlyAsnGlyLeuAsnGl TrpGl AsnAsnGluLeu 230 240 250 260 270
TGCAATATTATCGTCGTGAA ATGCCCAAGTTGAGGGAGGGAAAC
GlnTyrTyrArgArgGluAsnAlaGlnValGluGlyGlyLysLeu
40 45 50
280 290 300 310
TGGTAATTACTGCTAA AGAGAAGACTATGATGGCTTCAAATACA
Val I leThrAlsし ysArgGluAspTyrAspGlyPheLysTyrThr
55 60 65
320 330 340 350 360
CTTCTGCTAGGCTGAAAACCCAGTTTGATAAATCTTGGAAGTATG
SerAlaArgし euし ysThrGlnPheAspし ysSerTrpLysTyrGly
70 75 80
370 380 390 400
GTAAAATTGAAGCCAAAATGGCGATTCCATCATTTCGGGGAGTCT
Lysl leGluAlaし ysMetAlal leProSerPheArgGlyValTrp
85 90 95
410 420 430 440 450
GGGTGATGTTCTGGATGTCAGGAGACAACACTAATTATGTTAGAT
ValMetPheTrpMetSerGl AspAsnThrAsnTyrValArgTrp
100 105 110
460 470 480 490 GGCCATCTTCTGGTGAAATTGACTTTATTGAACATAGAAACACTA ProSerSerGlyGluIleAspPhelleGluHisArgAsnThrAsn
115 120 125
500 510 520 530 540
ACAATGAAAAAGTCAGAGGAACTATTCACTGGTCCACTCCTGACG
AsnGluLysValArgGl Thrl leHisTrpSerThrProAspGly
130 135 140
550 560 570 580
GTGCTCATGCGCATCATAACAGAGAAAGTAATACAAATGGGATTG
AlaHisAlaHisHisAsnArgGluSerAsnThrAsnGlylleAsp
145 150 155
590 600 610 620 630
ATTATCACATTTATTCTGTAGAGTGGAATTCTTCCATTGTTAAAT
TyrHisIleTyrSerValGluTrpAsnSerSerl leValし ysTrp
160 165 170
640 650 660 670
GGTTTGTTAATGGAAATCAATACTTTGAAGTGAAAATTCAGGGAG
PheValAsnGlyAsnGlnTyrPheGluValLysIleGliiGlyGly
175 180 185
680 690 700 710 720
GAGTAAATGGGAAAAGTGCATTTCGTAACAAAGTTTTCGTTATTT
ValAsnGlyLysSerAlaPheArgAsnLysValPheVallleし eu
190 195 200 730 740 750 760
TAAACATGGCGATTGGTGGAAACTGGCCAGGATTCGATGTTGCTG
AsnMetAlal leGlyGlyAsnTrpProGlyPheAspValAlaAsp 205 210 215
770 780 790 800 810
ACGAGGCTTTCCCTGCTAAAATGTACATTGATTATGTCCGTGTAT
GluAlaPheProAlaLysMetTyrlleAspTyrValArgValTyr 220 225 230
820 830 840 850
ACCAGGATGCCAGTACATCTTCTCCTGTTGGGGATACCTCTTTAG
GlnAspAlaSerThrSerSerProValGl AspThrSerLeuAsp 235 240 245
860 870 880 890 900
ATGGTTACTATTTTGTCCAAAACAGGCACAGTGAATTGTATCTTG
GlyTyrTyrPheValGlnAsnArgHisSerGluLeuTyrLeuAsp 250 255 260
910 920 930 940
ATGTCACTGATGCCAGTAACGAAGATGGAGCATTTCTGCAACAAT
ValThrAspAlaSerAsnGluAspGlyMaPheLeuGlnGlnTrp 265 270 275
950 960 970 980 990 GGTCTTATAGTGGTAATGAGAACCAACAGTTTGATTTTGAGCATC SerTyrSerGlyAsnGluAsnGlnGlnPheAspPheGluHisLeu 280 285 290
1000 1010 1020 1030
TCGAAAATAATGTTTATAAAATTACTAATAAAAAAAGTGGAAAAT
GluAsnAsnValTyrし ysIleThrAsnLysし ysSerGlyし ysSer 295 300 305
1040 1050 1060 1070 1080
CTTTGGATGTTTATAATTTTGGGACTGAGAATGGTGTTAGAATCC
LeuAspValTyrAsnPheGlyThrGluAsnGlyValArglleGln 310 315 320
1090 1100 1110 1120
AACAGTGGTCATATGGAGGGGCTCGCAATCAGCAGTTTACTGTAC
GlnTrpSerTyrGlyGl AlaArgAsnGlnGlnPheThrValGln 325 330 335
1130 1140 1150 1160 1170
AAAGTGTTGGTGATGGTTATTATAAGATTATTCCACGCGGCAGTG
SerValGlyAspGlyTyrTyrLysI lei leProArgGl SerGly 340 345 350
1180 1190 1200 1210
GAAAGATAGTGGAAGTAGCAG TTTTAGTAAAGATGCAGGAGGG
し ysl leValGluVal AlaAspPheSerLysAspAlaGlyGlyLys 355 360 365 1220 1230 1240 1250 1260
AGATACAACAATGGTCTGATAACAACCAATTATCTGGACAGTGGA
IleGltiGlnTrpSerAspAsnAsnGlnLeuSerGlyGlnTrpLys
370 375 380
1270 1280 1290 1300
AACTTATTAAAAGTAAAAGTTATTCTAAATTAATTCAGGCAGAAA
Leulleし ysSerし ysSerTyrSerし ysし euIleGlnAlsGluSer
385 390 395
1310 1320 1330 1340 1350
GTTATTTTGATTCCTCAA AGTACAATTGGAAGATACCTCAGATG
TyrPheAspSerSerLysValGlnLeuGluAspThrSerAspVal
400 405 410
1360 1370 1380 1390
TAGGAGGTGGGAAGAATGTTAAATGTGATAATGAAGGAGCCTGGA
GlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspAsnGluGlyAlaTrpMet
415 420 425
1400 1410 1420 1430 1440
TGGCTTATAAGGATATTGATTTCCCCAGTTCAGGTAATTATCGAA
AlaTyrし ysAspIleAspPheProSerSerGlyAsnTyrArglle
430 435 440
1450 1460 1470 1480
TAGAATACAGAGTAGCAAGTGAACGTGCAGGAGGAAAGCTGTCTC GluTyrArgVal AlaSerGluArgAlaGlyGlylysLeuSerLeu 445 450 455
1490 1500 1510 1520 1530
TGGATTTGAATGCAGGCTCTATAGTTCTTGGCATGCTGGATGTTC
AspLeuAstiAlaGlySerlleValLeuGlyMetLeuAspValPro
460 465 470
1540 1550 1560 1570
CTTCAACAGGAGGATGGCAGAAGTGGACCACCATTTCCCATACAG
SerThrGlyGlyTrpGlnLysTrpThrThrlleSerHisThrVal
475 480 485
1580 1590 1600 1610 1620
TGAATGTGGATTCAGGTACATATAACTTGGGGATCTATGTTCAAC
AsnVal AspSerGlyThrTyrAsnLeuGl l leTyrValGlnArg
490 495 500
1630 1640 1650 1660
GAGCCAGCTGGAATATCAACTGGATAAAGATTACAAAAATACCTG
AlaSerTrpAsnl leAsnTrpI leLysI leThrLysI leProGlu
505 510 515
1670 1680 1690 1700 1710
AACAGTCAAATTTGAATCAAGGGCGTCGTAATTCTAAATTAATTC
GlnSerAsnLeuAsnGlnGlyArgArgAsnSerLysLeuIleGln
520 525 530 1720 1730 1740 1750
AGGCAGAAAGTTATTTTAGTTACTCAGAAGTACAACTGGAAGATA
AlaGluSerTyrPheSerTyrSerGluValGlnLeuGl uAs Thr 535 540 545
1760 1770 1780 1790 1800
CCTTAGATGTAGGAGGTGGAAAGAATGTTAAATGTGATAAAGAAG
LeuAspValGlyGlyGlyし ysAsnValし ysCysAspLysGluGly 550 555 560
1810 1820 1830 1840
GGGCCTGGATGGCTTACAAGGATATTGATTTCCCCAGTTCAGGAA
AlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlySer 565 570 575
1850 1860 1870 1880 1890
GTTATCGAGTAGAATACAGAGTGGCAAGTGAACGTGCAGGAGGAA
TyrArgValGIuTyrArgVal AlaSerGIuArgAlaGlyGlyLys 580 585 590
1900 1910 1920 1930
AGCTGTCCCTAGATTTGAATGCAGGCTCTATAGTGCTTGGCATGC
し euSerし euAspし euAsnAlsGlySerlleValし euGlyMetし eu 595 600 605
1940 1950 1960 1970 1980
TGGATATTCCTTCAACAGGAGGATTGCAGAAGTGGACCACCATTT
AspIleProSerThrGlyGlyし euGlnし ysTrpThrThrlleSer 610 615 620
1990 2000 2010 2020
CTCATATAGTGAATGTGGATTTAGGTACATATAACTTGGGAATTT
Hisl leValAsnValAspLeuGlyThrTyrAsnLeuGlyl leTyr 625 630 635
2030 2040 2050 2060 2070
ATGTTCAAAAAGCCAGTTGGAATATCAATTGGATTAGAATTACAA
ValGlriLysAlaSerTrpAsnlleAsnTrpIleArglleThrLys 640 645 650
2080 2090 2100 2110
AAGTGTAGGATACAAGAGCAAACCAATTGTATTATTTTGAAGAAA
Val
654
2120 2130 2140 2150 2160
CAACAGCTGTTGACCATAATCTTTGTTCATTGAGAATTTATCCAA
2170 2180 2190 2200
CTGTTATAGAATCTATCACCTTTCCAGATGTACGCATTGCTGATG
2210 2220 2230 2240 2250
GTTTTGAACTAATAAATGAGGAGATTATAAGTGCTAATGTGTTTG
2260 2270 2280 2290
TTATATCTTTAATTTTTAAAAACAAATTATCAACTAACTTTTCAA 2300 2310 2320 2330 2340
TTCAGGCATGGTGTTTCTCTTTTTAATCTGTATTTCTAATAAATT
2350 2360 2370 2380
AATGTCTTTAAGAGTTGTTTTGTTTACAATAAATAAAGTTTGATT
2390 2400
GTGTGGGATAAAAAAAAAAAAAA
配列番号 2
配列の長さ 1 9 7 9
配列の型 ニ本鎮
ト ポ口 ジ一 直鎖状
起 源 力ブ ト ガニ血球
配列
10 20 30 40
GAAGACAAGAGAGTTGAAACAACCATAGCCTGTTTGCTTATGACT
50 60 70 80 90
TTCAATAAGAGATACTCGGCTTAAAGGGAACTGACTTATTCGTAG
100 110 120 130
AGGCTATACCATGGATATCAGTTTCCTGGTTTTTATCACACTGTC
MetAspI leSerPheし euValPhel leThrLeuSer -30 -25 -20
140 150 160 170 180
TATGGCTCTCTTCTCGAGCAACGTGACAGGAACGTCAGTAACATC 2
1 -" ' to
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■~o 1 ~~ 1 <； cn
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CD CD -J 6-* «=C «=c * 6 ω E→
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150 155 160
680 690 700 710 720
TCGTGAATTGGAGTTGCCCGTGGTTACAAACGAACAGTGCAAC A
ArgGluLeuGluLeuProValValThrAsnGluGlnCysAsnLys
165 170 175
730 740 750 760
ATCTTATCAGACACTCCCATTCTCAAAATTGAACCGAGGAATCAC
SerTyrGlnThrし euProPheSerLysし euAsnArgGlyl leThr
180 185 190
770 780 790 800 810
TAACGACATGATTTGTGCGGGGTTTCCGGAAGGAGGGAAAGATGC
AsnAspMetlleCysAlaGlyPheProGluGlyGlyLysAspAIa
195 200 205
820 830 840 850
TTGTCAGGGCGACTCTGGTGGTCCCCTGATGTATCAGAATCCAAC
CysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuMetTyrGlnAsnProThr
210 215 220
860 870 880 890 900
AACAGGAAGAGTGAAAATAGTTGGAGTTGTATCATTTGGGTTCGA
ThrGl ArgValLysIleValGlyValValSerPheGlyPheGlu
225 230 235
910 920 930 940 ATGTGCTCGTCCCAACTTCCCCGGTGTTTACACGCGCCTCTCGAG CysAlsArgProAsnPheProGlyVslTyrThrArgし euSerSer
240 245 250
950 960 970 980 990
CTACGTTAACTGGCTCCAGGAAATCACCTTCGGACAGTCACTCGC
TyrVaUsnTrpLeuGlnGluI leThrPheGlyGlnSerし euAla
255 260 265
T
A
A
T
T
T
Figure imgf000038_0001
L ε
19i9/V3X3VVVVV9VV3VX3VVI3I3IV90IVV3VIVXVIDV3D
099T 029ΐ 0^91 0S9I t/I\/V\/VXXXX9IVXXXVVVVVDVlVlIXXIV3VV9XXX0V3VV9V 029ΐ 0ΐ9ΐ 009ΐ 06ST 08SI
VV933VVX9VVV33XX99J;V9IV99ID9XVVI9VV3VVVV3VVV3
0Α2ΐ 09ST 0991 0^91
VVVVVVV3911X9I3IVVVIII193UI33999VXVV93I99IVVI
02SI OTST 009ϊ 06H
X9I19J,XV3VI9VI1I39II3DVIIVVIIV1VXVI1XVIVI9IX9
08 QLVl 09^1 09H
1XVXVI1I3I33/D33II9I3VVI3VIIV3IX3VVXIIIV0V I1
O i OSH 02H 0 I 00 /IXXXIX0V93X9V31 VXD V0II3VVVX VIVO VVI9V9X3V9V0I
06ST 08δΐ OIST 0981
IV33VIVV39VVVVXIV1XV3V3V0IVVVVXVXXVVXVVIVVIVV
09δΐ o I οεει 02ει οιετ
VX9 3V0X V9I33X333V93XV390V333IVXX3X1XVIVVIV/
ΟΟδΐ 062ΐ 0821 OLZI
LSOlO/P6di/13d な刚 /S6 OM 1670 1680 1690 1700 1710
TCATTCAGGTTTAACAGTGCAACTTAAATCAACAGTTAGTTGTTC
1720 1730 1740 1750
ACTAAACATTACAATTTGATCCTTTATAAACGCTA TACTGTTTA
1760 1770 1780 1790 1800
AACAGTCAGTAATAATACAGTATCATAGCATATCATATATGAAGG
1810 1820 1830 1840
TATTTTAACATTCTATATACAAAGCCAGAATTGAAAACGGTAATA
1850 1860 1870 1880 1890
TTTTGTACGATTAGTGAATTATTGTTTTTAAGAACAAACTGGTAT
1900 1910 1920 1930
CAAATTTAAAATATGAATCTGTGATTTAATATTTTTTACAACGTT
1940 1950 1960 1970
CTAACTTACCACTTTTGTTGTGAATAAAGGTGTTTACAAATGGA

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 次のア ミ ノ酸配列で示されるモ チーフ構造を少な く とも一 箇所含むポリ ペプチ ドをコー ドする一本鎮の D N A又は該 D N Aと相補的な D N Aとからなる二本鎖の D N A。
Gln-Gln-Trp-Ser
2. 請求の範囲 1 に記載のァ ミ ノ酸配列で示されるポリ ぺプチ ド'。
3. 次のア ミ ノ酸配列で示される Gln-Gln-Trp-Ser のモチーフ 構造を三箇所舍むポリ ぺプチ ド （配列表 1 のァ ミ ノ酸番号 2 4 7〜 3 8 7 ) またはそれと相同性を有するア ミ ノ酸配列のボリ ペプチ ドをコー ドする一本鎮の D N A又は該 D N Aと相補的な D N Aとからなる二本鎖の D N A。
LeuAspGlyTyrTyrPheValGlnAsnArgHisSerGluLeuTyrLeuAsp . ValThrAspAlaSerAsnGluAspGlyAlaPheLeuGlnGlnTrpSerTyr SerGlyAsnGluAsnGlnGlnPheAspPheGluHisLeuGluAsnAsnVal TyrLysIleThrAsnLysLysSerGlyLysSerLeuAspValTyrAsnPhe GlyThrGluAsnGlyValArglleGlnGlnTrpSerTyrGlyGlyAlaArg AsnGlnGlnPheThrValGlnSerValGlyAspGlyTyrTyrLysIlelle ProArgGlySerGlyLysIleValGluValAlaAspPheSerLysAspAla GlyGl LysIleGlnGlnTrpSerAspAsnAsnGlnLeuSerGlyGlnTrp し ysLeuI leLysSer
4. 請求の範囲 3 に記載のア ミ ノ酸配列で示されるボリ べプチ
5. 次のア ミ ノ酸配列で示されるダルカナーゼ ドメ イ ンである ポリ ペプチ ド （配列表 1 のア ミ ノ酸番号 4 〜 2 3 6 ) またはそ れと相同性を有するア ミ ノ酸配列のポリ ペプチ ドをコー ドする 一本鎖の D N A又は該 D N Aと相補的な D N Aとからなる二本 鎖の D N A。
ProLysTrpGlnし euValTrpSerAspGluPheThrAsnGlylleSerSer AspTrpGluPheGluMetGlyAsnGl LeuAsnGlyTrpGl AsnAsnGlu LeuGlnTyrTyrArgArgGluAsnAlaGlnValGluGlyGlylysLeuVal IleThrAlaLysArgGluAspTyrAspGlyPheLysTyrThrSerAlaArg LeuLysThrGlnPheAspLysSerTrpし ysTyrGlyし ysIleGluAlaLys MetAlalleProSerPheArgGlyValTrpValMetPheTrpMetSerGly AspAsnThrAsnTyrValArgTrpProSerSerGlyGluI leAspPhel le GluHisArgAsnThrAsnAsnGluLysValArgGlyThrlleHisTrpSer ThrProAspGlyAlaHisAlaHisHisAsnArgGluSerAsnThrAsnGly I leAspTyrHisI leTyrSerValGluTrpAsnSerSerl leValLysTrp PheValAsnGl AsnGlnTyrPheGluValLysI leGlnGlyGlyValAsn GlyLysSerAlaPheArgAsnLysValPheVallleLeuAsnMetAlalle GlyGlyAsnTrpProGlyPheAspVslAlsAspGluAlsPheProAlslys MetTyrl leAspTyrValArgValTyrGlnAspAla
6. 請求の範囲 5に記載のア ミ ノ酸配列で示されるポリ べプチ
7. 次のア ミ ノ酸配列で示されるキシラナ一ゼ ドメ イ ンである ポリ ペプチ ド （配列表 1 のア ミ ノ酸番号 3 9 1 - 6 5 4 ) また はそれと相同性を有するア ミ ノ酸配列のポリ ペプチ ドをコー ド する一本鎖の D N A又は該 D N Aと相補的な D N Aとからなる 二本鎖の D Ν Α β
erLysし euileGln/UaGluSeriyrPheAspSerSerLysValGlnし eu GluAspThrSerAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspAsnGlu GlyAlaTrpMetAlaTyrし ysAspI leAspPheProSerSerGlyAsnTyr ArglleGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysleuSerLeu Aspし euAsnAlaGly¾erIleValLeuGlyMetし euAspValProSerThr Gl Gl TrpGlnLysTrpThrThrl leSerHisThrValAsnValAspSer GlyThrTyrAsnし euGlyl leTyrVslGlnArgAlsSerTrpAsnl leAsn . TrpIleLysIleThrし ysIleProGluGlnSerAsnLeuAsnGlnGlyArg ArgAsnSerLysLeuI leGlnAlaGluSerTyrPheSerTyrSerGluVal GlnLeuGluAspThrし euAspValGlyGlyGlyLysAsnValし ysCysAsp LysGluGlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGly SerTyrArgValGluTyrArgVal AlaSerGluArgAlaGlyGlyし ysし eu SerLeuAspLeuAsnAlaGlySerlleValLeuGlyMetLeuAspIlePro SerThrGlyGlyLeuGlnLysTrpThrThrlleSerHisIleValAsnVal Aspし euGlyThrTyrAsnLeuGlylleTyrValGlnLysAlaSerTrpAsn IleAsnTrpI leArgl leThrし ysVal
8. 請求の範囲 7 に記載のア ミ ノ酸配列で示されるポリ ぺプチ
9. 次のア ミ ノ酸配列で示される （ 1 → 3 ) 一 β — Ό _ ダル力 ン感受性因子の αサブュニ ッ トのポリ ぺプチ ドをコ一ドする一 本鎖の D Ν Α又は該 D Ν Αと相補的な D Ν Αとからなる二本鎖 の D N A。
SerHisGluProLysTrpbinし euValTrpSerAspGluPheThrAsnbly I leSerSerAspTrpGluPheGluMetGl AsnGl LeuAsnGl TrpGl AsnAsnGluし euGlnTyrjiyrArgArgGluAsnAlaGlnValGluGlyGly tysLeuVal I leThrAlatysArgGluAspTyrAspGlyPheLysTyrThr SerAlaArgし euLysThrGlnPheAspし ysSerirpLysTyrGlyLysIle GluAlaLysMetAlal leProSerPheArgGl ValTrpValMetPheTrp MetSerGlyAspAsnThrAsnTyrValArgTrpProSerSerGlyGluIle AspPhel leGluHisArgAsnThrAsnAsnGluLysVal ArgGlyThrl le HisTrpSerThrProAspGl AlaHisAlaHisHisAsnArgGluSerAsn ThrAsnGlylleAspTyrHisIleTyrSerValGluTrpAsnSerSerlle VsllysTrpPheVslAsnGlyAsnGlnTyrPheGluViilLysIleGlnGly GlyValAsnGlyLysSerAlaPheArgAsiiLysValPheVal I leLeuAsn MetAlalleGlyGlyAsnTrpProGlyPheAspVal laAspGluAlaPhe . ProAlaLysMetTyrlleAspTyrValArgValTyrGlnAspAlaSerThr SerSerProValGlyAspThrSerLeuAspGlyTyrTyrPheValGlnAsn ArgHisSerGluLeuTyrし euAspValThrAspAlaSerAsnGluAspGly AlaPheLeuGlnGlnTrpSerTyrSerGlyAsnGluAsnGlnGlnPheAsp PheGluHisし euGIuAsnAsnValTyrし ysIleThrAsntysし ysSerGly LysSerLeuAspValTyrAsnPheGl ThrGluAsnGl Val Argl leGln GlnTrpSerTyrGlyGlyAlaArgAsnGlnGlnPheThrValGlnSerVal GlyAspGlyTyrTyrし ysl lei leProArgGlySerGlyし ysl leValGlu ValAlaAspPheSerLysAspAlaGlyGlyLysI leGlnGlnTrpSerAsp AsnAsnGlnLeuSerGlyGliiTrpし ysteuIleLysSerLysSerTyrSer し ysし eulleGlnAlaGluSerTyrPheAspSerSerLysValGlnLeuGlu AspThrSerAspValGlyGlyGlyLysAsnVa ysCysAspAsnGluGly AlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlyAsnTyrArg IleGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSerLeuAsp LeuAsnAlaGlySerlleValLeuGlyMetLeuAspValProSerThrGly G lyTrpGlnLysTrpThrThr I leSerHi sThrValAsnVal AspSerGl ThrTyrAsnし euGlyl leTyrValGlnArgAlaSerTrpAsnl leAsnTrp lieし ysIleThrLysIleProGluGlnSerAsnteuAsnGlnGlyArgArg AsnSerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheSerTyrSerGluValGln し euGluAspThrし euAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspLys GluGlyAlsTrpMetAlsTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlySer TyrArgValGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSer し euAspLeuAsnAlaGlySerlleValLeuGlyMetし euAspIleProSer ThrGlyGlyLeuGlnし ysTrpThrThrlleSerHisIleValAsnValAsp し euGlyThrTyrAsnLeuGlylleTyrVslGlnし ysAlaSerTrpAsnlle AsnTrpIleArglleThrし ysVsl
0. 請求の範囲 9 のア ミ ノ 酸配列で示される ポ リ ペプチ ド。
1 1 . 請求の範囲 1 0 のポリ ペプチ ドと配列番号 2 の配列表で 表される G因子 b サブュニ ッ トのア ミ ノ 酸配列 （ア ミ ノ酸番号 1 〜 278)で示されるポリ ぺプチ ドとからなるポリ ぺプチ ド。
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