WO1994024168A1 - Immunoparticules porteuses d'anticorps monoclonaux anti-cd4 et leur utilisation - Google Patents

Immunoparticules porteuses d'anticorps monoclonaux anti-cd4 et leur utilisation Download PDF

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WO1994024168A1
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anticoφs
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monoclonal
antibodies
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Nicole Bru-Magnierz
Jean-Claude Chermann
François LESCURE
Jean-Marie Teulon
Pascal Breton
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Laboratoires Upsa
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
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Definitions

  • the invention relates to immunoparticles consisting of polymerized methylidene malonate nanoparticles coated with anti-CD4 antibodies and their use for the prophylaxis and / or treatment of pathologies due to infection by the HIV virus, or as biological reagents.
  • HIV virus human immunodeficiency virus
  • anti-CD4 monoclonal antibodies to inhibit the formation of syncytia (giant cells formed by the joining of healthy T lymphocytes and infected T lymphocytes) has been reported in F. Rey et al, Virology, 1991, 181. 165 -171.
  • Nanoparticle-monoclonal antibody conjugates in which the nanoparticle consists of a hexylcyano-acrylate polymer and the monoclonal antibody is an anti-alpha fetoprotein antibody (for application to the determination of alpha fetoprotein) of on the one hand, or an anti-sarcoma antibody (for anti-tumor application) have been described respectively in C. Kubiak et al, Int. J. Pharmaceutics, 1988, 41, 181-187 and L. Illum et al, J. Pharmacol. Exp. Therapeutics, 1984, 230. 733-736. However, these conjugates based on cyano-acrylic polymer exhibit toxicity with respect to T4 lymphocytes.
  • Liposomes coated with anti CD4 LEU3-A antibodies have been described in N. Phillips et al, Cancer Detect Prev., 1990, .14, 383-390. However, these liposomes have had the disadvantage of causing the appearance of anti-liposome antibodies in mice (N. Philipps, Second European Symposium on Controlled Drug Delivery, 1992, Noorduijk aan Zee, Netherlands, Abstract book, p. 172- 175).
  • immunonanoparticles carrying anti-CD4 monoclonal antibodies in the prophylaxis and / or treatment of pathologies due to infection with the HIV virus, in particular AIDS.
  • These immunonanoparticles have the advantages of giving said antibodies better stability, greater activity and better immunoreactivity. They are also completely biodegradable and have very low toxicity, their degradation products being themselves non-toxic. In addition, they can advantageously be sterilized and lyophilized.
  • the invention therefore relates to immunonanoparticles consisting of nanoparticles of polymer of a methylidene malonate compound of formula (I):
  • R ⁇ and R 2 identical or different, represent a linear or branched C -C5 alkyl group and n is an integer from 1 to 5, said nanoparticles being coated with anti-CD4 antibodies.
  • the compounds of formula (I) polymerize in the form of a polymer network to form the nanoparticles having a diameter between 100 and 400 nm, preferably of the order of 300 nm.
  • the average molecular weight (Mp) of the methylidene malonate polymers of formula (I) is of the order of 600 expressed in polystyrene equivalents.
  • the immunonanoparticles according to the invention can advantageously contain within their polymer network a biologically active substance, preferably an antiviral agent.
  • an antiviral agent preferably an antiviral agent.
  • antiviral agents non-limiting mention may be made of didanosine, ribavirin, zidovudine, aciclovir, vidarabine and zalcitabine.
  • the anti-CD4 monoclonal antibody with which the nanoparticle is coated to constitute the immunonanoparticle is chosen from the antibodies OKT4, OKT4-A, and the antibody IOT4a derived from hybridoma 13 B8-2, the antibody IOT4a being preferred.
  • monoclonal antibodies will be used in the form of a solution containing bovine serum albumin as supplied commercially.
  • anti-CD4 monoclonal antico ⁇ s marked with a fluorescent substance such as fluorescein isothiocyanate, or, preferably, unlabeled anti-CD4 antico ⁇ s.
  • the anti-CD4 monoclonal antico ⁇ s are fixed on the nanoparticles to constitute the immunonanoparticles by techniques known per se, preferably by passive adsorption, in particular in a phosphate buffer.
  • Said antico ⁇ s can also be attached to the nanoparticles by specific adsorption in particular via protein A of Staphylococcus aureus or a biotin-avidin bond.
  • the invention relates to the use of the immunonanoparticles according to the invention for the prophylaxis and / or the treatment of pathologies due to infection with the HIV virus and in particular for the manufacture of a medicament for the prophylaxis and / or the treatment of pathologies due to infection with the HIV virus.
  • the immunonanoparticles described above have properties of inhibiting the formation of syncytia in the experimental model of F. Rey et al, Virology, 1991, 181, 165-171.
  • the invention also relates to a method for detecting the presence of CD4 antigens in a sample of biological fluid originating from a mammal, human or animal, consisting in bringing a sample of this biological fluid into contact with immunonanoparticles described above, consisting of nanoparticles of polymer of a methylidene malonate compound of formula (I):
  • H 2 C C (I) X COO- (CH 2 ) n -COOR 2 in which Ri and R 2 , identical or different, represent a linear or branched C1-C5 alkyl group and n is an integer from 1 to 5 , said nanoparticles being coated with anti-CD4 antico ⁇ s, in sufficient quantity to form an antigen-antico ⁇ s complex capable of being detected.
  • the invention also relates to the use of the immunanoparticles coated with anti-CD4 antibodies described above as biological reagents, in particular as controls for the evaluation of the activity of compounds in a model inhibition of syncytia formation, or in immunoseparation, immunoprecipitation, immunostaining or immunopurification techniques.
  • EXAMPLE 1 Preparation of 1-ethoxycarbonyl-1-ethoxycarbonylmethyleneoxycarbonylethene immunonanoparticles coated with anti-CD4 IOT4a antibodies. 1) Preparation of nanoparticles:
  • the nanoparticles are prepared under sterile conditions at 25 ° C by emulsion-polymerization of monomer as described in F. Lescure et al,
  • nanoparticles are recovered by filtration on 8 ⁇ m filter paper (Whatman, Great Britain), then divided into aliquots, lyophilized and stored at room temperature.
  • the nanoparticles are resuspended in water for injection.
  • the average size of the nanoparticles is measured before and after lyophilization using a device for analyzing submicrometric particles (Coulter
  • the average particle diameter is around 320 nm.
  • the molecular masses of the constituent polymers of nanoparticles are determined by steric exclusion chromatography (SEC) (Polymer laboratories, Great Britain). For the analysis, the nanoparticulate suspension is ultracentrifuged at 200,000 g for 5 minutes, then the pellet taken up in THF to which 0.5% toluene is added, is injected. Detection is done by refractometry. 2) Attachment of the antico ⁇ s to the nanoparticles:
  • the nanoparticles are diluted in a phosphate buffer pH 7.4 to 2.7 mg / ml.
  • 100 ⁇ ⁇ of monoclonal antico4s IOT4a labeled or not with fluorescein isothiocyanate (clone 13B8-2, solution at 100 ⁇ g / ml containing 0.2% bovine serum albumin, IMMUNOTECH, France) is added to a suspension of 450 ⁇ l of nanoparticles.
  • the mixture is incubated at 20 ° C for 2 hours with shaking.
  • the immunonanoparticles are added at a polymer concentration of 50 ⁇ g ml to an RPMI 1640 medium free of phenol red (GIBCO, USA) containing 1% glutamine, 1% penicillin, 1% streptomycin, 1% neomycin, and 10% fetal calf serum.
  • the nanoparticles coated with antico ⁇ s are separated from the free antico ⁇ s by ultracentrifugation at 40,000 g for 5 min, immediately and 2 h after the start of incubation at 37 C.
  • nanoparticles of isohexylcyano acrylate were also prepared as described in the patents.
  • the nanoparticles coated with antico ⁇ s are separated from the free antico ⁇ s by centrifugation at 80,000 g for 5 min.
  • the concentration of free antico ⁇ s is calculated by reference to a calibration curve, and the percentage of fixed antico ⁇ s is deducted by difference.
  • Table 1 reports the results obtained with the immunonanoparticles of Example 1;
  • Table 2 reports, by way of comparative example, the results obtained with PIHCA nanoparticles coated with the same antico ⁇ s as the immunonanoparticles of Example 1.
  • the nanoparticles prepared according to step 1) of Example 1 are diluted in a phosphate buffer pH 7.4 at 2.7 mg / ml.
  • 100 ⁇ l of OKT4-A monoclonal antico ⁇ s 50 ⁇ g / ml solution containing 0.1% bovine serum albumin, ORTHO DIAGNOSTIC SYSTEMS, USA
  • fluorescein isothiocyanate labeled with fluorescein isothiocyanate are added to a suspension of 450 ⁇ l of nanoparticles.
  • the mixture is incubated at 20 ° C for 2 hours with shaking.
  • the stability of these immunonanoparticles was tested under the experimental conditions of Example 2.
  • EXAMPLE 4 Preparation of 1-ethoxycarbonyl methylenoxycarbonylethene immunonanoparticles coated with OKT4 anti-CD4 antico ⁇ s and study of their stability.
  • the immunonanoparticles are prepared according to the protocol described in Example 3 using 100 ⁇ l of monoclonal antico ⁇ s OKT4 (ORTHO DIAGNOSTIC SYSTEMS, USA) labeled with fluorescein isothiocyanate.
  • the CEM and MT4 cell lines are used.
  • Infection with HIV-1 BRU virus (F. Barre-Sinoussi et al., Science, 1983, 220, 868-871) is performed using a cell suspension at 2.10 cells / ml incubated at 37 ° C for lh using an equal volume of virus stock dilution. After infection, the cells are washed by centriguation 4 times with PBS buffer to remove the unbound viral particles.
  • the cells are then cultured at a concentration of 5 ⁇ 10 ⁇ cells / ml in RPMI 1640 medium (GIBCO, USA) containing phenol red supplemented with 10% fetal calf serum, 1% antibiotics and 1% glutamine. Every 3 or 4 days, the cells are diluted 3 times (MT4 cells) or 4 times (CEM cells) and returned to culture in a new culture medium. Lymphocyte infection is demonstrated using the reverse transcriptase test.
  • the syncytia are generally observed at 1 or 2 days of incubation after mixing a volume of chronically infected CEM cells with 2 volumes of MT4 cells at 2.10 5 cells / ml.
  • the ability of anti-CD4 monoclonal antibodies and immunonanoparticles carrying anti-CD4 antibodies to inhibit the formation of syncytia is evaluated by incubating the MT4 cells with the various preparations for 2 h and then adding the infected CEM cells.
  • Table 5 relates to the results obtained with the immunonanoparticles according to the invention carrying antico ⁇ s IOT4a;
  • Table 6 reports, by way of comparative example, the results obtained with PIHCA nanoparticles coated with IOT4a antico ⁇ s;
  • Table 7 reports, by way of comparative example, the results obtained using the antico fixés IOT4a which is not fixed.
  • Example 1 coated with anti-CD4 IOT4a monoclonal antibodies were tested according to the experimental protocol of Example 5, using instead of the HIV-1 BRU virus, the viral strain PAS 246 (F. Rey et al., Virology, 1991, 181, 165-171).

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Abstract

L'invention concerne des immunonanoparticules constituées de nanoparticules de polymère d'un composé méthylidène malonate revêtues d'anticorps anti-CD4, ainsi que leur utilisation pour la prophylaxie et/ou le traitement de pathologies dues à une infection par le virus HIV ou en tant que réactifs biologiques, ou encore dans un procédé de détection de la présence d'antigènes anti-CD4 dans un liquide biologique de mammifère.

Description

IMMUNOPARTICULES PORTEUSES D ' ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI-CD - ET LEUR UTI LISATION .
L'invention concerne des immunoparticules constituées de nanoparticules de méthylidène malonate polymérisé revêtues d'anticoφs anti-CD4 et leur utilisation pour la prophylaxie et/ou le traitement de pathologies dues à une infection par le virus HIV, ou en tant que réactifs biologiques.
De nombreuses études ont rapporté l'importance de l'antigène CD4 dans l'infection des lymphocytes par le virus de l'immunodeficience humaine (virus HIV), et suggère son rôle en tant que récepteur cellulaire du virus HIV (D.Klatzmann et al, Nature, 1984, 312, 767-768).
La capacité d'anticorps monoclonaux anti-CD4 à inhiber la formation de syncytia (cellules géantes formées par l'accolement de lymphocytes T sains et de lymphocytes T infectés) a été rapportée dans F. Rey et al, Virology, 1991, 181. 165-171.
Des conjugués nanoparticules-anticorps monoclonaux dans lesquels la nanoparticule est constituée d'un polymère d'hexylcyano-acrylate et l'anticorps monoclonal est un anticorps anti-alpha foetoprotéine (en vue de l'application au dosage de l'alpha foetoprotéine) d'une part, ou un anticorps anti-sarcome (en vue d'une application anti-tumorale) ont été décrits respectivement dans C. Kubiak et al, Int. J. Pharmaceutics, 1988, 41, 181-187 et L. Illum et al, J. Pharmacol. Exp. Therapeutics, 1984, 230. 733-736. Néanmoins, ces conjugués à base de polymère cyano-acrylique présentent une toxicité vis à vis des lymphocytes T4. Des liposomes revêtus d'anticorps anti CD4 LEU3-A ont été décrits dans N. Phillips et al, Cancer Detect Prev., 1990, .14, 383-390. Néanmoins, ces liposomes ont présenté le désavantage de susciter l'apparition d'anticorps antiliposomes chez les souris (N. Philipps, Second European Symposium on Controlled Drug Delivery, 1992, Noorduijk aan Zee, Pays-Bas, Abstract book, p. 172-175).
On a maintenant trouvé qu'il était possible d'utiliser des immunonanoparticules porteuses d'anticorps monoclonaux anti-CD4 dans la prophylaxie et/ou le traitement de pathologies dues à une infection par le virus HIV, en particulier le SIDA. Ces immunonanoparticules présentent les avantages de conférer auxdits anticorps une meilleure stabilité, une plus grande activité et une meilleure immunoréactivité. Elles sont également totalement biodégradables et présentent une très faible toxicité, leurs produits de dégradation étant eux-mêmes non- toxiques. De plus, elles peuvent avantageusement être stérilisées et lyophilisées.
L'invention concerne donc des immunonanoparticules constituées de nanoparticules de polymère d'un composé méthylidène malonate de formule (I) :
COOR! H2C = C ^ (I)
COO-(CH2)n-COOR2
dans laquelle R^ et R2, identiques ou différents, représentent un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C -C5 et n est un entier de 1 à 5, lesdites nanoparticules étant revêtues d'anticorps anti-CD4.
La préparation des composés de formule (I) est décrite dans le brevet EP 0 283 364.
Les composés de formule (I) se polymérisent sous forme d'un réseau polymérique pour former les nanoparticules ayant un diamètre compris entre 100 et 400 nm, de préférence de l'ordre de 300 nm. Le poids moléculaire moyen (Mp) des polymères de méthylidène malonate de formule (I) est de l'ordre de 600 exprimé en équivalents polystyrènes.
De préférence, le composé méthylidène malonate de formule (I) est le 1-éthoxycarbonyl-l-éthoxycarbonylméthylèneoxycarbonyléthène (composé de formule (I) dans laquelle R^ = R = éth le et n = 1).
Les immunonanoparticules selon l'invention peuvent avantageusement contenir au sein de leur réseau polymérique une substance biologiquement active, de préférence un agent antiviral. A titre d'exemples d'agents antiviraux, on peut citer de manière non limitative la didanosine, la ribavirine, la zidovudine, l'aciclovir, la vidarabine et la zalcitabine.
Dans un aspect avantageux, l'anticorps monoclonal anti CD4 dont est revêtue la nanoparticule pour constituer l'immunonanoparticule est choisi parmi les anticorps OKT4, OKT4-A, et l'anticorps IOT4a issu de l'hybridome 13 B8-2, l'anticorps IOT4a étant préféré. On utilisera notamment les anticorps monoclonaux sous forme d'une solution contenant de la sérumalbumine bovine telle que fournie commercialement .
On peut utiliser des anticoφs monoclonaux anti-CD4 marqués par une substance fluorescente telle que l'isothiocyanate de fluoresceine, ou, de préférence, des anticoφs anti-CD4 non marqués.
Les anticoφs monoclonaux anti-CD4 sont fixés sur les nanoparticules pour constituer les immunonanoparticules par des techniques connues en soi, de préférence par adsoφtion passive, notamment dans un tampon phosphate.
Lesdits anticoφs peuvent également être fixés sur les nanoparticules par adsoφtion spécifique notamment via la protéine A de Staphylococcus aureus ou une liaison biotine-avidine.
Différents procédés de fixation des anticoφs sont décrits notamment dans la publication L. Illum et al, Meth. Enzymol., 1985, 112, 67-84.
Dans un aspect ultérieur, l'invention concerne l'utilisation des immunonanoparticules selon l'invention pour la prophylaxie et/ou le traitement de pathologies dues à une infection par le virus HIV et en particulier pour la fabrication d'un médicament pour la prophylaxie et/ou le traitement de pathologies dues à une infection par le virus HIV.
En effet, les immunonanoparticules décrites ci-dessus possèdent des propriétés d'inhibition de la formation de syncytia dans le modèle expérimental de F. Rey et al, Virology, 1991, 181, 165-171.
Selon un autre aspect, l'invention concerne également un procédé de détection de la présence d'antigènes CD4 dans un échantillon de liquide biologique provenant d'un mammifère, humain ou animal, consistant à mettre en contact un échantillon de ce liquide biologique avec des immunonanoparticules décrites ci- dessus, constituées de nanoparticules de polymère d'un composé méthylidène malonate de formule (I) :
. COOR! H2C = C (I) X COO-(CH2)n-COOR2 dans laquelle Ri et R2, identiques ou différents, représentent un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C1-C5 et n est un entier de 1 à 5, lesdites nanoparticules étant revêtues d'anticoφs anti-CD4, en quantité suffisante pour former un complexe antigène-anticoφs susceptible d'être détecté. Dans un autre aspect, l'invention concerne également l'utilisation des immunanoparticules revêtues d'anticoφs anti-CD4 décrites ci-dessus en tant que réactifs biologiques, notamment en tant que contrôles pour l'évaluation de l'activité de composés dans un modèle d'inhibition de la formation de syncytia, ou encore dans des techniques d'immunoséparation, d'immunoprécipitation, d'immunomarquage ou d'immunopurification.
L'invention est illustrée par les exemples ci-après qui ne présentent aucun caractère limitatif.
EXEMPLE 1 : Préparation d'immunonanoparticules de 1-éthoxycarbonyl-l- éthoxycarbonylméthylèneoxycarbonyléthène revêtues d'anticoφs anti-CD4 IOT4a. 1) Préparation des nanoparticules :
Les nanoparticules sont préparées dans des conditions stériles à 25*C par émulsion-polymérisation du monomère comme décrit dans F. Lescure et al,
Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater, 1991, 18, 325-326,
Controlled Release Society Inc.
Brièvement, 100 μl de monomère d'éthoxycarbonyl-1-méthylèneoxycarbonyl-
1-éthène (UPSA laboratoires/CARBIPEM, France) sont appauvris en SO2 sous vide pendant 3 h à 10~2 torr, puis ajoutés goutte à goutte sous agitation à un milieu de polymérisation (10 ml) thermostaté à 25*C constitué d'un tampon
KH Pθ4/NaH2Pθ4, 0,066 M, pH 5,5 contenant 1% de dextran (Mr = 70 000,
FLUKA CHEMIE, Suisse).
L'ensemble est laissé sous agitation pendant 18 h puis les nanoparticules sont récupérées par filtration sur papier filtre 8μm (Whatman, Grande-Bretagne), puis réparties en fractions aliquotes, lyophilisées et conservées à température ambiante.
Au moment de l'utilisation, les nanoparticules sont remises en suspension dans de l'eau pour préparation injectable. La taille moyenne des nanoparticules est mesurée avant et après lyophilisation à l'aide d'un appareil à analyser les particules submicrométriques (Coulter
Electronics, USA). Le diamètre moyen des particules est de l'ordre de 320 nm.
Les masses moléculaires des polymères constitutifs des nanoparticules sont déterminées par chromatographie d'exclusion stérique (SEC) (Polymer laboratories, Grande-Bretagne). Pour l'analyse, la suspension nanoparticulaire est ultracentrifugée à 200.000 g durant 5 minutes, puis le culot repris par du THF auquel on ajoute 0,5% de toluène, est injecté. La détection se fait par réfractométrie. 2) Fixation des anticoφs sur les nanoparticules :
Les nanoparticules sont diluées dans un tampon phosphate pH 7,4 à 2,7 mg/ml. On ajoute 100 μ\ d'anticoφs monoclonaux IOT4a marqués ou non à l'isothiocyanate de fluoresceine (clone 13B8-2, solution à 100 μg/ml contenant 0,2% de sérum albumine bovine, IMMUNOTECH, France) à une suspension de 450 μl de nanoparticules. Le mélange est incubé à 20*C pendant 2h sous agitation.
EXEMPLE 2 : Etude de la stabilité des immunonanoparticules de l'exemple 1.
Les immunonanoparticules sont ajoutées à une concentration en polymère de 50 μg ml à un milieu RPMI 1640 exempt de rouge de phénol (GIBCO, USA) contenant 1% de glutamine, 1% de pénicilline, 1% de streptomycine, 1% de néomycine, et 10% de sérum de veau foetal.
Les nanoparticules revêtues d'anticoφs sont séparées des anticoφs libres par ultracentrifugation à 40 000 g pendant 5 mn, immédiatement et 2h après le début de l'incubation à 37 C.
A titre de témoin, on a également préparé des nanoparticules d'isohexylcyano acrylate (PIHCA) préparées comme décrit dans les brevets
EP 0007 895 et U.S 4,329,332. Dans ce cas, les nanoparticules revêtues d'anticoφs sont séparées des anticoφs libres par centrifugation à 80 000 g pendant 5 min.
Pour déterminer la quantité d'anticoφs IOT4a fixés, on mesure la fluorescence du surnageant (λexcitation = 485 nm, λémission = 535 nm) à l'aide d'un spectrofluorimètre L530 (Perkin Elmer Ltd, Grande-Bretagne).
La concentration en anticoφs libre est calculée par référence à une courbe d'étalonnage, et le pourcentage d'anticoφs fixé est déduit par différence.
Les résultats sont donnés dans les tableaux 1 et 2 ci-dessous :
- le tableau 1 rapporte les résultats obtenus avec les immunonanoparticules de l'exemple 1 ; - le tableau 2 rapporte, à titre d'exemple comparatif, les résultats obtenus avec des nanoparticules de PIHCA revêtues des mêmes anticoφs que les immunonanoparticules de l'exemple 1.
Tableau 1
Concentration en Pourcentage de fixation anticoφs (μg/ml) Initial Après 2h d'incubation
0,1 24±1,52 23±1
0,05 49±0 48±1,15
0,025 63±4,9 61±9,16
Tableau 2 (exemple comparatif)
Concentration en Pourcentage de fixation anticoφs (αg/ml) Initial Après 2h d'incubation
0,4 31±0,64 0,76±0,55 0,2 56±1,9 6,7±1,2 0,1 85±0 30±3,6
Les résultats montrent que le pourcentage d'anticoφs fixés ne varie pas significativement au bout de 2h pour les immunonanoparticules selon l'invention, alors qu'il décroît fortement dans le cas des nanoparticules de PIHCA.
EXEMPLE 3 : Préparation d' immunonanoparticules de 1-éthoxycarbonyl méthylènoxycarbonyléthène revêtues d'anticoφs anti-CD4 OKT4-A et étude de leur stabilité.
Les nanoparticules préparées selon l'étape 1) de l'exemple 1 sont diluées dans un tampon phosphate pH 7,4 à 2,7 mg/ml. On ajoute 100 μl d'anticoφs monoclonaux OKT4-A (solution à 50 μg/ml contenant 0,1 % de sérum albumine bovine, ORTHO DIAGNOSTIC SYSTEMS, USA) marqués à l'isothiocyanate de fluoresceine à une suspension de 450 μl de nanoparticules. Le mélange est incubé à 20*C pendant 2h sous agitation. La stabilité de ces immunonanoparticules a été testée dans les conditions expérimentales de l'exemple 2.
Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau 3 ci-dessous :
Tableau 3
Concentration en Pourcentage de fixation anticoφs (μg/ml) Initial Après 2h d'incubation
0,1 25±5 14±2
0,05 44±3 30±0
0,025 43±6 30±0
EXEMPLE 4 : Préparation d'immunonanoparticules de 1-éthoxycarbonyl méthylènoxycarbonyléthene revêtues d'anticoφs anti-CD4 OKT4 et étude de leur stabilité.
Les immunonanoparticules sont préparées selon le protocole décrit à l'exemple 3 en utilisant 100 μl d'anticoφs monoclonaux OKT4 (ORTHO DIAGNOSTIC SYSTEMS, USA) marqués à l'isothiocyanate de fluoresceine.
La stabilité de ces immunonanoparticules a été testée dans les conditions expérimentales de l'exemple 2.
Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau 4 ci-dessous :
Tableau 4
Figure imgf000009_0001
Les résultats montrent une variation non significative du pourcentage d'anticoφs fixés après 2 h d'incubation. EXEMPLE 5 : Etude de l'activité inhibitrice de la formation de syncytia dans un modèle in vitro par les immunonanoparticules de l'exemple 1. 1) Culture des lymphocytes et infection par le virus HIV-1 :
Les cultures cellulaires et l'infection par le virus HIV-1 sont réalisées selon le protocole décrit dans F. Rey et al., Virology, 1991, 181, 165-171.
On utilise les lignées cellulaires CEM et MT4. L'infection par le virus HIV-1 BRU (F. Barré-Sinoussi et al., Science, 1983, 220, 868-871) est effectuée en utilisant une suspension cellulaire à 2.10^ cellules/ml incubée à 37*C pendant lh à l'aide d'un volume égal de dilution de stock du virus. Après infection, les cellules sont lavées par centriguation à 4 reprises avec du tampon PBS pour éliminer les particules virales non liées.
Les cellules sont ensuite cultivées à une concentration de 5 x 10^ cellules/ml dans un milieu RPMI 1640 (GIBCO, USA) contenant du rouge de phénol supplémenté à 10 % de sérum de veau foetal, 1% d'antibiotiques et 1% de glutamine. Tous les 3 ou 4 jours, les cellules sont diluées 3 fois (cellules MT4) ou 4 fois (cellules CEM) et remises en culture dans un nouveau milieu de culture. L'infection des lymphocytes est mise en évidence en utilisant le test de la réverse-transcriptase.
2 Inhibition de la formation de syncytia
Comme indiqué dans la publication F. Rey et al. citée ci-dessus, les syncytia sont généralement observées à 1 ou 2 jours d'incubation après avoir mélangé un volume de cellules CEM infectées de façon chronique avec 2 volumes de cellules MT4 à 2.105 cellules/ml. La capacité des anticoφs monoclonaux anti-CD4 et des immunonanoparticules porteuses d'anticoφs anti-CD4 à inhiber la formation des syncytia est évaluée en incubant les cellules MT4 avec les différentes préparations pendant 2h puis en ajoutant les cellules CEM infectées.
La formation des syncytia, indiquée par le signe +, est évaluée au microscope après 2 jours d'incubation à 37 C.
Les résultats sont rapportés dans les tableaux 5, 6 et 7 ci-dessous : - le tableau 5 concerne les résultats obtenus avec les immunonanoparticules selon l'invention porteuses d'anticoφs IOT4a ; le tableau 6 rapporte, à titre d'exemple comparatif, les résultats obtenus avec des nanoparticules de PIHCA revêtues d'anticoφs IOT4a ; le tableau 7 rapporte, à titre d'exemple comparatif, les résultats obtenus en utilisant l'anticoφs IOT4a non fixé.
Tableau 5 Inhibition de la formation de syncytia par les immunonanoparticules selon l'invention
Polymère Anticoφs total Anticoφs fixé Formation de
(μg/ml) (μg/ml) (μg/ml) syncytia
25 0,05 0,012 -
25 0,025 0,012 -/+
25 0,012 0,0069 +
25 0,006 0,004 +
25 0 0 +
0 0 0 +
Tableau 6
Inhibition de la formation de syncitia par des nanoparticules de PIHCA porteuses d'anticoφs IOT4a (exemple comparatif)
Polymère Anticoφs total Anticoφs fixé Formation de
(μg/ml) (μg/ml) (μg/ml) syncytia
5 0,045 0,012 +
5 0,02 0,011 +
5 0,01 0,008 +
5 0,005 0,005 +
+ : présence de syncytia - : absence de syncytia Tableau 7 Inhibition de la formation de syncytia par l'anticoφs IOT4a non fixé (exemple comparatif
Concentration (μg/ml) Formation de syncytia
10 -
5 -
1 +
0,5 +
0,1 +
Les résultats montrent qu'en utilisant les immunonanoparticules selon l'invention, on obtient une inhibition de la formation de syncytia à une concentration en anticoφs 100 fois inférieure à celle de l'anticoφs libre. Une inhibition complète de la formation des syncytia est en effet obtenue avec 0,05 μg/ml d'anticoφs lorsque ceux-ci se trouvent sous la forme d'immunonanoparticules selon l'invention, alors qu'une concentration de 5 μg/ml est nécessaire pour obtenir le même résultat avec l'anticoφs libre. De plus, ces résultats avantageux ne sont pas retrouvés en utilisant une nanoparticule constituée d'un polymère différent de celui des immunonanoparticules selon l'invention. EXEMPLE 6 : Etude de l'activité inhibitrice de la formation de syncytia dans un modèle in vitro par les immunonanoparticules de l'exemple 3.
Les immunonanoparticules revêtues d'anticoφs monoclonaux anti-CD4 OKT4-A de l'exemple 3 ont été testées selon le protocole de l'exemple 5. Les résultats sont rapportés dans le tableau 8 ci-dessous : Tableau 8
Polymère Anticoφs total Anticoφs fixé Formation de (μg/ml) (μg/ml) (μg/ml) syncytia
80 0,5 0,044 80 0,2 0,044 -/+ 80 0,11 0,048 + EXEMPLE 7 : Etude de l'activité inhibitrice de la formation de syncytia dans un modèle in vitro par les immunonanoparticules de l'exemple 1 en utilisant la souche virale PAS 246.
Les immunonanoparticules de l'exemple 1 revêtues d'anticoφs monoclonaux anti-CD4 IOT4a ont été testées selon le protocole expérimental de l'exemple 5, en utilisant à la place du virus HIV-1 BRU, la souche virale PAS 246 (F. Rey et al., Virology, 1991, 181, 165-171).
Les résultats sont rapportés dans le tableau 9 ci-dessous :
Tableau 9
Figure imgf000013_0001
Les résultats montrent qu'on obtient une inhibition de la formation de syncitia à partir d'une concentration de 0,025 μg/ml d'anticoφs, cette inhibition étant complète à 0,05 μg/ml.

Claims

REVENDICATIONS
1. Immunonanoparticules constituées de nanoparticules de polymère d'un composé méthylidène malonate de formule (I) :
COORi H2C = C ^" (I)
COO-(CH2)n-COOR2
dans laquelle R et R , identiques ou différents, représentent un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C1-C5 et n est un entier de 1 à 5, lesdites nanoparticules étant revêtues d'anticoφs anti-CD4.
2. Immunonanoparticules selon la revendication 1, caractérisée en ce que le composé méthylidène malonate est un composé de formule (I) dans laquelle Ri = R2 = éthyle et n = 1.
3. Immunonanoparticules selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisées en ce que les anticoφs monoclonaux anti-CD4 sont choisis parmi les anticoφs OKT4, OKT4-A et IOT4a.
4. Immunonanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que l'anticoφs monoclonal anti-CD4 est l'anticoφs IOT4a.
5. Immunonanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisées en ce que les anticoφs monoclonaux anti-CD4 sont fixés sur la nanoparticule par adsoφtion passive.
6. Immunonanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisées en ce que la nanoparticule a un diamètre compris entre 100 et 400 nm, de préférence de l'ordre de 300 nm.
7. Immunonanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce que le polymère de composé méthylidène malonate de formule (I) a un poids moléculaire moyen de l'ordre de 600 exprimé en équivalents polystyrènes.
8. Immunonanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisées en ce que les nanoparticules contiennent une substance biologiquement active, de préférence un agent antiviral.
9. Utilisation d'immunonanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour la prophylaxie et/ou le traitement de pathologies dues à une infection par le virus HIV et en particulier pour la fabrication d'un médicament pour la prophylaxie et/ou le traitement de pathologies dues à une infection par le virus HTV.
10. Utilisation d'immunonanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, en tant que réactifs biologiques.
11. Procédé de détection de la présence d'antigènes CD4 dans un échantillon de liquide biologique provenant d'un mammifère, humain ou animal, consistant à mettre en contact un échantillon de ce liquide biologique avec des immunonanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, en quantité suffisante pour former un complexe antigène-anticoφs susceptible d'être détecté.
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