WO1993000428A1 - Nouveau procede d'elaboration d'adn et amorce utilisee a cette fin - Google Patents

Nouveau procede d'elaboration d'adn et amorce utilisee a cette fin Download PDF

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WO1993000428A1
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primer
linear
stranded
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Inventor
Aizo Matsushiro
Takashi Morita
Original Assignee
Sumitomo Denki Kogyo
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing DNA, and more particularly to a method for producing long-chain DNA, and a novel primer for producing DNA.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems, and in a replication step newly added to the conventional DNA production method, a trace amount of long-chain DNA artificially produced in the construction step is used.
  • the purpose is to isolate and selectively replicate impurities and to produce the desired long-chain DNA in a short time and in large quantities.
  • the gist of the present invention is as follows:
  • a double-stranded DNA is prepared by synthesizing a complementary strand using the enzyme, and (e) replicating the double-stranded DNA by repeating the series of steps (b), (c) and (d). This is a method for producing DNA that includes a series of steps.
  • FIG. 1 is a view showing a replication step of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing temperature control conditions (temperature and time) in the replication step of the present invention.
  • Figure 3 shows the molecular weight marker ⁇ X174 Haelll fragment), 1 pg / template DNA (1)
  • FIG. 4 is an electrophoretogram using the duplicated 1 ml II Template DNA (10).
  • a primer for the single-stranded DNA is also constructed according to the above method.
  • impurities generated during the synthesis of the linear DNA include those extending from the 3 ′ end of the linear DNA and the extension of the target DNA in the process of reaching the 5 ′ end. Includes short DNA. Therefore, it is preferable that the complementary portion (annealed to the linear DNA) of the 5′-end primer of the linear DNA be as short as possible in order to specifically and efficiently amplify the target linear DNA.
  • the 5′- and 3′-ends of the target long-chain DNA must be And the 5′-elongated primer and the 3′-end primer, respectively—and the main-strand DNA must be synthesized within the sequence of the target linear DNA. That is, to give an example, the single-stranded DNA to be produced has the same length as the target linear DNA, and the 5′-end primer and the 3′-end primer used in the production process 5 ′ end and 3 ′ end of the linear DNA It performs the synthesis of DNA as the terminus.
  • a primer having an E row incorporating a large amount of AT or GC cannot be used in practice because it easily takes a secondary structure.
  • the present inventors have focused on the fact that there is a ⁇ phage which uses the base pair (TCCAGCGGCGGG) portion of SEQ ID NO: 1 incorporating a large amount of GC as the cohesive end portion of a single strand, and this 12 base pair It has been found that the primer consisting of has very high specificity when annealed with the target DNII.
  • the base pair AAGTCGC The specificity can be further improved by using CGCCC).
  • the complementary strand (C) is maintained at a temperature of 90 to 94 for 1 minute, and denatured by heat to restore a single-stranded DNA (D). 7 Next, maintain the temperature at 37 to 55 for 2 minutes, and anneal the primer to the rain end of the single-stranded DNA (D) obtained by the heat denaturation.
  • the annealed single-stranded DNA (E) is heated to a temperature of 70-72. Hold at C for 3 minutes and synthesize the complementary strand (F) using a thermostable polymerase.
  • FIG. 2 shows the relationship between time and temperature for smoothly performing each reaction (1) to (4) in the above-mentioned replication process.
  • Heat denaturation (I) is 90-94 for 1 minute
  • primer annealing ( ⁇ ) is 37-55 for 2 minutes
  • complementary strand synthesis (III) is 70-72 for 3 minutes. A temperature-time setting of minutes was found to be favorable for completing each reaction.
  • Example 1 Reagent used in replication process manufactured by UTA
  • Oligonucleotide primers produced by the conventional construction process each complementary to the 3 'end of the target double-stranded DNA.
  • Template DNA single-stranded DNA (SEQ ID NO: 5: HObases) prepared according to a conventional construction method.
  • the target DNA is a few molecules If it exists, use it because it recognizes it and selectively replicates it
  • the amount of Template DNA may be small.
  • Taq polymerase (5000 U / ml) 11 Total 100 il.
  • the reaction solution was sealed with mineral oil or liquid paraffin to prevent the composition of the reaction solution from changing due to evaporation of the reaction solution.
  • oligonucleotide primer HM1 25mer, 20 M
  • the electropherogram is shown in FIG.
  • the present invention provides a new DNA replication method in addition to the conventional DNA production method, whereby a desired long-chain DNA can be produced in a shorter time and in a larger amount from a small amount of long-chain DNA produced in the construction step. It is provided in duplicate.
  • a long-chain DNA having a length of more than several hundred bases which had conventionally been obtained only from animals and plants existing in nature, can be produced in the construction step by the newly introduced replication step of the present invention.
  • a small amount of long-chain DNA can be used to artificially synthesize large amounts of double-stranded DNA.
  • the replication step of the present invention utilizes complementarity between bases in principle, it is applicable not only to DNA but also to RNA.
  • Type of row K nucleic acid
  • Type of IB column Other nucleic acid Synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid

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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
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Description

明 細 書
『新規 DN A作製方法および DN A作製用プライマー j] (技術分野）
本発明は DN Aの作製方法に関し、 特に長鎖 DN Aの作製方法. ならびに新規の DN A作製用プライマーに関する。
(背景技術）
近年の遣伝子搡作技術の発展に伴い、 未知の有用 DNAの探索. 及び人工的に DN Aを作製することが盛んに行われるようになつ
7 o
このうち、 人工的に DNAを作製する手段としては、 従来デォ キシリボヌクレオチドー分子ずつを試薬を用いて連結することに より、 鎖状 DNAを作製する方法等が知られていた。
しかしながら、 上述した従来の D N A作製方法および作製機器 においては、 下記の如く欠点が指摘されていた。
(1) デォキシリボヌクレオチドー分子ずつの連結反応における目 的とする DN Aの収率が、 長鎖になるに従い累積的に低下し、 結果として所望の塩基 K列を備えた鎖状 DN Aの取得が長鎖に なるほど難しくなる。
(2) 上記（1) に関連して、 比較的長鎖の DNAを適当量作製する 場合には、 目的の DN A以外の DN Aが著量副産されることに なり、 その結果、 相当量の試薬を余分に消費し、 鎖状 DNAの 作製作業終了後には使用した試薬の大部分が無駄に廃棄処分さ れることになり、 高価な試薬コストの負担だけが残る。 (3) また、 ヌクレオチド一つの連結には約 10分程度を要するため、 比較的長鎖の DNAを作製する場合には長時間を要し、 かなり の人的負担を強いるものでもある。
(4) さらに、 従来の DNA作成機器では一本鎖 DNAしか合成で きない。
これら従来技術の諸欠点がため、 従来の DNA作製機器では、 比較的短鎖 （30〜50bp程度） の鎖状 DNAを作製するにあたって は館便なものであつたが、 現在、 研究現場が必要としている自然 界に存在する遗伝子程度の （数百塩基単位以上の） 鎖状 DNAを 従来の DNA作製機器で作製しょうとすれば、 上述したような作 製作業に要する時間及び人的労力、 目的とする鎖状 DNAの収率 の低さ、 及び作製作業に要した試薬の大部分が無駄になる等の柽 済的な問題があつたため、 その実現は困難なものであつた。
(発明の開示）
本発明は、 上述した課題に鑑みて発明されたものであって、 従 来の DN A作製方法に新たに加えた複製工程において、 構築工程 で人工的に作製された微量の長鎖 DN Aを不純物の中から認截し、 選択的に複製して、 短時間の内に、 しかも大量に所望の長鎖 DN Aを提洪することを目的としている。
すなわち、 本発明の要旨とするところは、
(a) 結合剤で連結された複数のデォキシリボヌクレオチドからな る鎖状 DN Aならびに前記鎖状 DN Aのプライマーを作製し、
(b) 前記鎖状 DNAに熱変性処理を施し、
(c) 熱変性処理された前記鎖状 DN Aに前記プライマーをァニー ルし、
(d) 前記プライマ一をァニールした鎖状 DNAと DNAポリメラ ーゼを用いて相補鎖を合成して、 二本鎖 DNAを作製し、 及び (e) 前記一連の工程（b)(c)および（d) を反復して前記二本鎖 DN Aを複製を行う、 という一連の工程を包含した DNAの作製方 法である。
(図面の簡単な説明）
第 1図は、 本発明の複製工程を示す図である。
第 2図は、 本発明の複製工程の温度コントロール条件 （温度と 時間） を示す図である。
第 3図は、 '分子量マーカー ø X 174 Haelll 断片 ）、 未複製の 1 pg/ Template DNA (1)、
複製した 1 Pg/ Template DNA (2)、
未複製の 50 g/ t Template DNA (3)、
複製した 50 pg//i Template DNA (4)、
未複製の 1 ng/ Template DNA (5)、
複製した 1 iig/ Template DNA (6)、
未複製の 50 Tiu/n Template DNA (7)、
複製した 50 Tig/u Template DNA (8)、
未複製の】 1 I ]1 Template DNA (9)、 及び
複製した 1 ml II Template DNA (10) を用いた電気泳動図であ る。
(発明を実施するための最良の形態）
以下、 本発明の DNA作製方法につき、 添付した図面を参照し つつ詳細に説明する。
まず、 一本鎖 DNA及び該一本鎖 DNAのプライマーを作製す る構築工程を説明する。
① 目的とする一本鎖 DN Aを構成する塩基配列を DN A作製機 機器 （商品名 「Model 381A DNAシンセサイザー」 アプライドバ ィォシステム社製） のプログラム部に入力する。
② 複数のホスフォ ·アミダイ ド♦ ボトルそれぞれに個別に収め られた DNAを構成する各種塩基、 および DNA分子を連結す るところの （トリクロ口 S ^麾、 テトラゾール及び H20/I2からな る） 結合剤が、 入力されたプログラムに従って、 経時的に DN A作製機器に備え付けの合成力ラム内に放出されてヌクレオチ ドーつずつを化学反応により連結し、 目的とする一本鎖 DNA を構築する。
⑧ また、 前記手法に従って該一本鎖 DNAのプライマーも構築 する。
なお、 鎖状 DNAの合成の際に生じる不純物には、 鎖状 DN Aの 3'末端から伸長し、 5'末端に至る過程の中途で伸長が俘止 した目的とする鎖状 DN Aよりも短鎖の DN Aが含まれる。 従って、 鎖状 DNAの 5'末端側プライマーの （鎖状 DNAにァ ニールされる） 相補部分はできるだけ短い方が、 目的とする鎖 状 DNAの増幅を特異的かつ効率的に行う上で好ましい。
また、 目的とする長鎖 DNAを得るための一本鎖 DNAの合 成とプライマーの合成をより短時間に効率良く行うためには、 目的とする長鎖 DNAの 5'末端および 3'末端は、 5'末嫋側ブラ イマ一および 3'末端側プライマー各々によって規定され、 かつ —本鎖 DN Aは目的の鎖状 DN Aの配列内で合成する必要があ る。 すなわち、 例を挙げると、 作製しょうとする一本鎖 DNA は目的とする鎖状 DNAと同一の長さであり、 作製過程で用い られる 5'末端側ブライマーおよび 3'末端側プライマー各々は、 目的の鎖状 DN Aの 5'末端及び 3'末端を各々のプライマーの 5' 末端として DN Aの合成を実施するのである。
さらに好ましくは、 プライマーと目的の鎖状 DNAとの特異 性を高めるためには、 ATまたは GCを多く組み込んだ E列を有す るプライマーを用いるのが望ましい。 しかしながら、 このよう な配列を有するプライマーは、 それ自体が二次構造をとり易い ので、 実際には用いることができない。 ところが本発明者は、 GCを多く組み込んだ配列番号 1に記載の塩基対（TCCAGCGGCGGG) 部分を一童鎖の付着端部分として用いている λファージがある ことに着目し、 この 12個の塩基対からなるプライマーが目的と する DN Αとのァニールの際に非常に高い特異性を示すことを 知見したのである。 また、 5'末端及び 3'末端それぞれに対応す る二種類のプライマーを必要とする場合には、 上記塩基対 列 とは全く逆の IE列を有する紀列番号 2に記載の塩基対（AGGTCGC CGCCC)を用いれば、 さらに特異性を高めることができる。
次に、 上記構築工程により作製された一本鎖 DN Aの複製ェ 程を第 1図に沿って説明する。
④ 上記構築工程で得られた一本鎖 DNA (斜錄部は必要とする DNA部分を示す）（A) をチューブに採り、 そして該チューブ を DNA複製機器 （商品名 「BiGene PHC- 1」 Techne社製） に装 着し、 温度 （水温） を 37〜55でに 2分間維持して、 前記一本鎖 DN Aの一端にプライマ一をァニールする。
⑤ 該ァニールされた一本鎖 DNA (B) を温度を 70〜72でに 3 分間維持して、 耐熱性ポリメラーゼを用いて相補鎖 （C) を合 成する。
⑥ 該相補鎖 （C) を温度を 90〜94でに 1分間維持して、 熱変性 させて一本鎖 DNA (D) に復元する。 ⑦ 次いで、 温度を 37〜55でに 2分間維持して、 該熱変性により 得られた一本鎖 DNA (D) の雨端にプライマーをァニールす る
⑧ 該ァニールされた一本鎖 DNA (E) を温度を 70〜72。Cに 3 分間維持して、 耐熱性ポリメラーゼを用いて相補鎖 （F) を合 成する。
⑨ 以下、 ⑥〜⑧の一連の搮作を適宜反復して選択的複製 （増幅） を行い、 相当量の所望の二本鎖 DNA断片 （X) を謌製する。 また、 上記複製工程の各反応⑥〜⑧を円滑に行うための時間と 温度関係を第 2図に示した。 すなわち、 熱変性（I) は、 90〜94で で 1分間、 プライマーのアニーリング（Π)は、 37〜55でで 2分間、 そして、 相補鎖の合成（III) は、 70〜72でで 3分間という温度 · 時間設定が各反応を完了する上で好ましいことが判明した。
実施例 1 ：複製工程に用いる試薬の謌製
下記の試薬を謌製した。
(1) 尉熱性 DN Aポリ メラーゼ
Taq polymerase (Cetus 社製)
(2) d-ATP 、 d-CTP 、 d-GTP 、 d-TTP
(3) 後 «液 （10倍程度に希釈して用いるように濃縮したもの） (4) oligonucleotide primer MH1 (配列番号 3 ： 25mer) 、
および oligonucleotide primer MM2 (IS列番号 4 ： 25mer)
従来法の構築工程で作製されたオリゴヌクレオチド ·ブライ マーであり、 目的とする二本鎖 DNA部分のそれぞれ 3'末端側 に相補的なもの。
(5) Template DNA：従来の構築方法に従って作製された一本鎖 D NA (配列番号 5 ： HObases) 。 目的とする D N Aが数分子で も存在すれば、 それを認識し、 選択的に複製するので使用する
Template DNAは微量でよい。
実施例 2 ：反応液の混合
上記実施例 1で藹製した試薬を下記第 1表に記載した順で混合 する。 この際、 試薬の混合順序に注意を払う必要がある。 第 1表
(1) 蒸溜水 70 1
(2) 10倍希釈緩衝液 10 1
(3) d-NTP (200 iM) (2 1 x 4種類） 8 \
(4) oligonucleotide primer 、1 /iM)
( 5 iil x 2種類） lO il
(5) Template DNA (微量） 1 1
(6) 酎熱性 DNAポリ メラーゼ
Taq polymerase (5000U/ml) 1 1 合 計 100 il なお、 反応液の蒸発により、 反応液の組成が変化することを防 ぐため、 鉱物油または流動パラフィ ンでシールした。
実施例 3 ：実驗例
下記第 2表に示した試薬及び DNA複製機器 （商品名 「BiGene PHC-1」 Techne社製） を用いて、 D N Aの複製実験を行った。
(1) 試薬の混合
5本のチューブを用意し、 下記第 2表に示した試薬を記載し た順に添加した。 但し、 Template DNA以外は全チューブ同一の 試薬を同一量添加した 第 2表
(I) 蒸溜水 70 (2) 10倍希釈緩衝液 】0 1
(3) d-ATP (lOmM) 2 l
(4) d-CTP (lOmM) 2 ul
(5) d-GTP (lOmM) 2 l
(6) d-TTP (lOmM) 2 ul (7) oligonucleotide primer HM1 (25mer, 20 M) 5 1
(8) oligonucleotide primer HM2 (25mer, 20 jul) 5 fi 1
(9) Template 醒
チューブ （No.l) Template DNA ( 1 fig/ ΐ) 1 fi\ チューブ （No.2) Template DNA (50ng/ 1 fil チューブ （No.3) Template DNA ( 1 ng/ 1 ill チューブ （No.4) Template DNA (50pg/ \) 1 \ チューブ （No.5) Template DNA ( 1 pg/ ϊ) 1 ul
(10) Taq polymerase (5000U/ml) 1 1
(II)流動パラフィ ン 20 1 合 計 120 1
(2) 温度コン トロール
前記反応温度変化の諝整には 1分程度を要するので、 熱変性 を 94eC♦ 2分間、 プライマーのァニーリングを 37eC * 3分間、 及び相補鎖の合成を 72で * 4分間に設定した。 (3) 結果
20サイクルの反応後、 反応液 100/il 中 20 1(1/5 量） を 8 %ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動した。
その電気泳動図を第 3図に示した。
第 3図に示した結果から、 各種濃度の未複製の Template DNA を用いたレーン （第 3図 ：奇数番レーン） では、 最大の
Template DNA 含有濃度 1 iig/jil のレーン （第 3図 ： レーン 9 ) でも該 DNAの存在が確認できなかったのに対して、 本発明 の方法で作製 （複製） した各種濃度 Template DNAを用いたレー ン （第 3図 ：偶数番レーン） では、 50pg/ nl という希薄な濃 度の Template DNA (第 3図 ： レーン 4 ) においても複製された 140塩基対の DN Aの bandが認められ （第 3図白抜矢印参照） 、 これより本発明の複製工程が微量の DN Aであってもそれを認 識し、 選択的に複製することが確認できた。
(産業上の利用可能性）
本発明は、 従来の DNA作製方法に新たに複製工程を加えるこ とにより、 構築工程で作製された微量の長鎖 DNAから、 所望の 長鎖 DN Aを従来よりも短時間に、 しかも大量に複製して提供す るものである。
本発明により、 従来自然界に存在する動植物から直接入手する しか方法のなかった数百塩基を越えるような長鎖の DN Aでも、 新たに導入された本発明の複製工程によって、 構築工程で作製さ れた棰微量の長鎖 DN Aから容易にまとまった量の二本鎖 DN A を人工的に合成できるのである。 また、 本発明によって、 既知の (塩基配列等の） 情報を基に所望の鎖状 DNAを復元 *複製する ことも可能になったのである。 また、 本発明の複製工程は原理的には塩基間の相補性を利用し たものなので、 DN Aに限らず RN Aについても適用可能である。
さらに、 本発明により作製された長鎖 DNAの有用な使用方法 として、 作製した DNAを大腸菌等の細菌に導入して、 新規のぺ プチドあるいは酵素等を產生させることが考えられる。
これまで述べたように、 本発明による DN Aの作製方法によれ ば、 自然界に存在する動植物が保持している程度の長鎖の ¾伝子 DN Aを人工的に合成、 あるいは復元 *複製することが可能とな り、 今後、 自由自在に新規物質あるいは新規生物を創造するため の手段として産業面、 学術面等において大いに實献することが期 待できるものである。
(配列表） 配列番号 ： 1
配列の長さ ： 12
ΪΕ列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 他の核酸 合成 DNA
配列
TCCAGCGGCG GG 12 配列番号 ： 2
配列の長さ ： 12
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 他の核酸 合成 DNA
ハイポセティカル配列 ： Yes
配列
AGGTCGCCGC CC 12
K列番号 ： 3
配列の長さ ： 25
IB列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA
ハイポセティカル配列： Yes
配列
TCTCCTGTGG CAGATGCCCC AAATA 25 配列番号： 4
配列の長さ ： 25
K列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
IB列の種類：他の核酸 合成 DNA
ハイボセティカル E列： Yes
IB列
CATGACCAGA TGTCGAGCTG AGAAC 25 記列番号： 5
配列の長さ ： 140
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
E列の種類：他の核漦 合成 DNA
ハイポセティ力ル 12列： Yes
n OiVOlOOLOJ, 0VV0OLO3VO
021 lQii3 09V VVOiOViOVO 0V0I010090 V00010099V
08 VOVVOOOOIO 0000003000 VV000D009J, OOOVOOOOOV
0 漏環 30 0IV09VLVVV 00330J.V0V0 OOlOIOOLOi
81
l6df/JDd 8ZtO0/£6 OAV

Claims

請 求 の 範 囲
1. DNAの作製方法であって下記工程を含む。 すなわち、
(a) 結合剤で連結された複数のデォキシリボヌクレオチドからな る鎖状 DN Aならびに前記鎖状 DN Aのプライマ一を作製し、
(b) 前記鎖状 DNAに熱変性処理を施し、
(c) 熱変性処理された前記鎖状 DN Aに前記プライマーをァニー ルし、
(d) 前記プライマ一をァニールした鎖状 DNAと DNAポリメラ —ゼを用いて相補鎖を合成して、 二本鎖 DNAを作製し、 及び
(e) 前記一連の工程（b)(c)及び（d) を反復して前記二本鎖 DNA を複製する。
2. 前記鎖状 DNAが、 一本鎖 DNAである請求の範囲第 1項に 記載の DNAの作製方法。
3. 前記一本鎖 DNAが、 100塩基以上の DNA分子を含む請求 の範囲第 2項に記載の DN Aの作製方法。
4. 前記プライマ一が、 前記鎖状 DNAの雨末端がプライマ—の
5'末端となるようにァニールされる請求の範囲第】項に記載の
DNAの作製方法。
5. 前記プライマーが、 TCCAGCGGCGGG の塩基配列を含む請求の 範囲第 1項に記載の DNAの作製方法。
6. 前記プライマーが、 AGGTCGCCGCCC の塩基 E列を含む請求の 範囲第 1項に記載の DN Aの作製方法。
7. TCCAGCGGCGGGの塩基配列を含む D N A作製用ブライマ一。
8. AGGTCGCCGCCCの塩基 E列を含む DNA作製用プライマー。
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