WO1992021351A1 - Compositions pharmaceutiques a base d'acide polydesoxyribonucleique et leur procede de preparation - Google Patents

Compositions pharmaceutiques a base d'acide polydesoxyribonucleique et leur procede de preparation Download PDF

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WO1992021351A1
WO1992021351A1 PCT/FR1992/000481 FR9200481W WO9221351A1 WO 1992021351 A1 WO1992021351 A1 WO 1992021351A1 FR 9200481 W FR9200481 W FR 9200481W WO 9221351 A1 WO9221351 A1 WO 9221351A1
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pdrn
solution
composition according
tnf
mice
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PCT/FR1992/000481
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Pierre Flecchia
Jacqueline Nezan
René CHARRIER
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Pierre Flecchia
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    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner

Definitions

  • DNA is a practically universal constituent of living cells. In eukaryotes, DNA is mainly located in the nuclei of cells; it is also misleading in the mitochondria.
  • DNA is a polymer formed from the union of nucleotides to deoxyriboses; a nucleotide results from the esterification of a nucleoside by an orthophosphoric acid molecule, the nucleoside itself being made up of a sugar (deoxyribose) and a purine base (adenine, guanine) or pyridine (cytosine, thymine).
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition containing polydeoxyribonucleotides (PDRN) or highly polymerized deoxyribonucleotides (DN HP or DNA HP) hereafter designated by PDRN; these PDRNs are obtained from milt from fish rich in deoxyribonucleic acid, and the organoleptic characteristics of this composition are excellent. It also relates to a process for the preparation of such a composition. Finally, it relates to applications of such a composition for obtaining medicaments having improved immunomodulating properties.
  • PDRN polydeoxyribonucleotides
  • DN HP or DNA HP highly polymerized deoxyribonucleotides
  • the structure of the PDRN gives it fragility with regard to various physico-chemical factors.
  • the heat leads to depolymerization and partial denaturation, which will have the expected properties of the molecule, and which will lead to increasing the concentrations of PDRN in order to observe a biological effect.
  • the PDRN when the PDRN enters a pharmaceutical composition, it is generally associated with other compounds, in particular salts, and the pharmaceutical compositions obtained in the prior art are solid or viscous at room temperature, but one does not obtain generally no low viscosity liquid.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition, characterized in that it contains polymers of deoxyribonucleic acid (PDRN) having a high degree of polymerization, in solution in a nonionic solvent.
  • PDRN deoxyribonucleic acid
  • the degree of polymerization of PDRN can be assessed by the molecular weight of the molecule.
  • the average molecular weight of PDRNs varies between 3 and 5 million, with a mass distribution lying between 1 and 20 million, which differentiates them from the standard DNA registered in the French Pharmacopoeia 9th edition .
  • This molecular mass can be determined by exclusion chromatography (gel permeation mechanism).
  • the retention time (Tr) of DNA with a high degree of polymerization (PDRN), due to its high molecular weight, will be shortened (however, secondary peaks corresponding to impurities may be present); on the other hand, standard DNA, due to its small steric bulk, is retained on the column and has an elongated retention time.
  • the report can be defined in
  • the structure of the PDRN in the compositions according to the invention is that described by Watson and Crick.
  • the use of sodium chloride should be avoided to ensure the isotonicity of the solution.
  • the Na + ions probably by causing the establishment of additional bonds, cause an increase in viscosity of the composition. This isotonicity could for example be ensured by mannitol.
  • compositions pharmaceuticals characterized in that they contain, in solution in a nonionic solvent, deoxyribonucleic polymers having a high degree of polymerization, at concentrations of between 1% and 1.6% (w / v).
  • compositions according to the invention may be characterized in that they are compositions which can be used by the parenteral route, in particular by the intramuscular and / or intravenous route.
  • compositions according to the invention by the intravenous route represents a considerable advantage compared to the compositions based on DNA already known. This is possible thanks to the liquid, non-viscous consistency at room temperature of the compositions according to the invention, in contrast to the compositions of the prior art which are in the form of a gel. In addition, intramuscular administration will be facilitated.
  • compositions thus defined may be compositions for topical use.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition characterized in that it is a solution which for 5 ml contains:
  • the present invention provides a process allowing the preparation of pharmaceutical compositions of
  • the present invention therefore relates to a process for the preparation of a pharmaceutical composition, characterized in that:
  • the PDRN fibers are put in an aqueous solution, at a temperature below about 65 ° C.
  • the PDRN will generally be in the form of its sodium salt.
  • Fish milt is known to be a raw material rich in DNA.
  • the addition of NaCl results in the precipitation of proteins.
  • the solution may be added with materials (bentonite, etc.) which facilitate separation by any physical means such as filtration, ce-ntrifugation, decantation.
  • the PDRN fibers are purified by a 95% ethanol solution; after drying, a water content of the order of 8 to 20% must however be maintained in order to preserve the fibrous structure of the PDRN. It is important that the solubilization of PDRN is carried out at a temperature below about 65 ° C., in fact, excessively higher temperatures cause partial depolymerization of the PDRN.
  • the sterilization step of the composition is carried out by filtration, in particular on a miliipore membrane; this filtration, which allows to eliminate microorganisms is possible because the composition is in liquid form; PDRN concentrations should not be greater than about 2% to avoid clogging the filters.
  • This sterilization mode avoids the heating of the solution which partially destroys the PDRN polymers.
  • step f) is preferably carried out at a temperature of approximately 60 ° ⁇ 5 ° C.
  • compositions according to the invention have remarkable immunomodulatory properties, as well as a "GM-CSF iike" effect on the production of leukocytes (granulocyte macrophage colony stimulating factor).
  • GM-CSF a blood factor obtained by genetic recombination techniques, is very expensive and can cause annoying side effects, which are not observed with the compositions based on PDRN with a high degree of polymerization of the invention.
  • PDRN in solution in a nonionic solvent, which can be prepared by the process described above, to obtain a medicament intended for the treatment or prevention of immune deficiencies as well as that of chemo and / or radiotherapeutic leukopenia.
  • the immune deficiency for which this drug is intended may be consecutive to an antineoplastic treatment. It is known that treatment, for example with adriblastine, vincablastine, etc., causes a fall in circulating leukocytes, sometimes also in blood platelets, due to damage to the stem cells of the bone marrow.
  • compositions according to the invention can be used for the preparation of an immunomodulating medicament, administered before, during and / or after such an antineoplastic treatment. This administration may in particular be carried out intravenously.
  • These compositions have an immunomodulating activity, exclusively on cell-mediated immunity. This activity seems to depend on the maintenance of a high degree of polymerization of PDRN in the composition.
  • phagocytic activity is increased by the administration of the composition.
  • composition according to the invention also results in an increase in the production of interleukin-1 as well as in the "tumor necrosis factor” or TNF.
  • FIG. 1 represents the restoration by PDRN of the number of leukocytes in BALB / C mice from leukopenia chemically induced by adriblastine
  • the raw material used is laitance from fish, the high DNA content of which is known.
  • DNA is combined with basic proteins (histones or protamins) which should be got rid of.
  • the process used comprises successive stages which are carried out in separate rooms linked together by airlocks, without going back.
  • First step Rupture of cell membranes and dissolution of deoxyribonucleoproteins (DNP)
  • the degreased and partially dehydrated laitances are finely chopped and brought into contact with sodium chloride solutions which dissociate the D.N.P into PDRN which remains soluble and proteins which are eliminated by any physical means such as filtration, centrifugation or decantation.
  • This operation is carried out in a second room where the PDRN solution thus clarified is mixed with 95% ethanol (v / v).
  • PDRN precipitates as long white to creamy white fibers. These are then wrung and then immersed again for 12 hours in a 95% ethanol solution (v / v) in order to undergo dehydration and "alcoholic purification".
  • This operation is carried out in a room with filtered air.
  • the fibers are dried in an air oven heated to low temperature and filtered on an absolute filter.
  • the PDRN fibers are immediately packaged in plastic bags.
  • the sealed, labeled PDRN bags are stored in a room specially reserved for this purpose.
  • the solute will be filtered, otherwise agitation is resumed for 10 minutes. If a new dosage is incorrect, the titer will be adjusted by dilution or addition of the active ingredient and the other components, but if the difference is too great, the cause of the anomaly must be investigated before possible resumption of the preparation.
  • Buffer solution pH 9.00 prepared as follows:
  • Sensitivity 0.05 A.U.F.S.
  • the chromatograms obtained must highlight a differentiation as regards the configuration of the peak and its retention time.
  • the standard bonucleic acid Deoxyri because of its low molecular weight (small stenic obstruction), presents an elongated retention time.
  • the chromatogram of the product to be analyzed can highlight the presence of a second peak (split or not). Due to its long retention time, this represents various molecules of low mass (non-polymerized nucleic acids, in particular ribonucleic acid, peptides, etc.).
  • the surface of the second peak taken tangentially will have to be largely minority compared to the total surface.
  • the area of the peak corresponding to the PDRN must represent at least 90 percent of the area attributable to nucleic acids.
  • mice Four batches of 7 mice were formed.
  • BALB / C mice were treated with PDRN, GM-CSF or physiological water on days D-8, D-5, D-2, D + 2, D + 5, D + 8, D + 11 and D + 14, D + 47, D + 55, D + 57, D + 60, D + 63, D + 66 and D + 69 intraperitoneally in a volume of 150 ⁇ l.
  • Adriblastine [Lot G 731 X] was administered at a dose of 5 mg / kg / 3 intravenously on days D + 0, D + 1, D + 55 and D + 56 in a volume of 50 ⁇ l.
  • the circulating leukocyte counts were performed on each animal on days D-8, D + 0, D + 2, D + 5, D + 8, D + 11, D + 14, D + 47, D + 55, D +57, J + 60, J + 63, J + 66 and J + 69.
  • the evaluation was made on 40 ⁇ l of blood obtained by puncture of the retro-orbital sinus on heparin capillary. Results:
  • mice stimulated by the two doses of PDRN like those stimulated by GM-CSF, showed a faster restoration of the number of white blood cells compared to the physiological water controls.
  • PDRN made it possible, under the conditions of our trials, to restore acute leukopenia caused by adriblastin. This restoration was achieved on the eighth day for the first trial [treatment before and after chemotherapy] and on the eleventh, sixty-fourth and sixty-fifth day for the second trial [treatment before and after chemotherapy with an intermediate rest of one month] . The reconstitution of the number of white blood cells in the control mice was observed on the seventeenth day during the first test and on the fourteenth and sixty-ninth days on the second.
  • compositions of the present invention unlike GM-CSF whose price is incommensurate with that of the compositions of the present invention, do not induce any leukocytosis and avoid certain side effects observed with GM-CSF.
  • EXAMPLE V COMPOSITION OF THE PHARMACEUTICAL SPECIALTY Composition per unit of intake
  • macrophages When macrophages are brought into contact with a mitogen or an immunostimulant, they can develop monokines [interleukin 1 (IL-1), Tumor Necrosis Factor (TNF) etc.]. Monokine induction therefore makes it possible to demonstrate activation of macrophages by the product studied.
  • IL-1 interleukin 1
  • TNF Tumor Necrosis Factor
  • Peritoneal macrophages are taken 48 hours after the last treatment. These macrophages were cultured in the presence of a secretor of monokine secretion.
  • LPS Lipopolysaccharide B from Escherichia coli O 55 B 5 (LPS) (Difco) at a dose of 10 ⁇ g / ml of cell suspension as an indicator of the induction of IL-1. After 24 hours, the macrophage culture supernatant was collected, centrifuged and kept at -20 ° C until use.
  • mice were used for the treatments with the products studied and C3H / Hej (Institut Pasteur), female, 5 weeks old mice for the analysis of the supernatants of macrophage culture.
  • the culture medium was RPMI-1640 (Gibco) containing 5% fetal calf serum (SVF), antibiotics (Penicillin G: 100 IU / ml and Streptomycin: 100 ⁇ g / ml), L-Glutamine 2 mM / ml (Seromed) and indomethacin 1 ⁇ g / ml.
  • the latter reagent was added during the production of supernatants of peritoneal macrophages.
  • mice Four batches of 5 mice were made up.
  • the treatment was carried out on days 3-8, 3-5 and 3-2 intraperitoneally.
  • the control animals received the excipient under the same conditions as the treated animals.
  • thymocytes were washed thoroughly once and the suspension was adjusted to 4 ⁇ 10 cells per ml.
  • the culture of these thymocytes was carried out in the presence of 5 ⁇ g of PHA per ml on 96-well flat-bottom plates (Falcon; 3072) after addition of the half-dilutions of the supernatants to be tested.
  • the incorporation of tritiated thymidine was evaluated after 44 hours of culture of the thymocytes, the last 16 hours in the presence of this radiolabelled reagent.
  • IL-1 The units of IL-1 are defined by the following equation:
  • TNF Tumor Necrosis Factor
  • Cachectin is a monokine produced mainly by monocytes and macrophages.
  • An important mediator of the destruction of tumors by monocytes in vivo, TNF is toxic to certain tumor lines in vitro. This cytokine is also inducing the production of interleukme 1 and increases the phagocytic and cytotoxic activities of neutrophils.
  • TNF constitutes a proliferation signal for an InterIeukin-2 dependent cell line, which underlines its importance in the regulation of cell-mediated immune responses.
  • TNF is the main mediator of shock, weight loss and death when attacked by bacterial endotoxin.
  • mice Four batches of 5 mice were made up.
  • Peritoneal macrophages from treated BALB / C mice were cultured and the supernatant was recovered in the same manner as that described above for the production of IL-1.
  • the TNF assay is carried out, in vitro, on the L929 tumor line. These cells are kept in liquid nitrogen. After thawing, the cells were washed twice in washing liquid (e.g. HANKS, PBS). The measurement of cell viability by staining with neutral red was applied in this study. This method is based on the incorporation of this dye by living cells.
  • the L929 cells were cultured in a cell culture flask in a MEM medium prepared with the following composition:
  • the culture supernatant was removed and the dilutions of the test samples were distributed at a rate of 200 ⁇ l / well.
  • the dilutions of the test samples were prepared in 200 ⁇ l of medium without SVF in the presence of 5 ⁇ g / ml of Actinomyone D and in the presence or absence of a 200th dilution of the anti-TNF-alpha mouse serum. (Genzyme) [in quadruplicate].
  • This dilution of anti-TNF-alpha blocks a unit of TNF-alpha calculated on the basis of rTNF-alpha (Genzyme). Therefore, the inhibition of cytotoxic effect of TNF-alpha by the anti-TNF-alpha serum depends on the concentration of this monokine in a dilution.
  • the cells are then incubated at 37 ° C for 20 hours in an atmosphere of 5% CO 2 .
  • the neutral red at 0.033% weight / volume in distilled water was prepared extemporaneously and distributed, on the plates containing the cultures of L929 cells with samples to be tested, at a rate of 50 ⁇ l / well and incubated for 1 hour at 37 ° C. After removal of the supernatants, two washes are carried out in hot PBS (37 ° C.) and 200 ⁇ l are added per well of the cell lysis solution prepared as follows:
  • cytotoxicity percentages were calculated according to the following formula:
  • TNF TNF-induced cytotoxicity caused by dilution of supernatant.
  • Intersection points between the 50% cytotoxicity value and the corresponding dilution were plotted using a "Locust Graph" statistical program.
  • the denominator of the corresponding dilution is the number of units of TNF for the initial volume of the supernatant added in the first dilution (0.01 ml). This value is then multiplied by the share of the initial volume (0.01 ml) in 1 ml; which makes it possible to obtain the unit of TNF per ml of supernatant.
  • the cytotoxic effect of the macrophage culture supernatants from the mice treated with the products studied was partially inhibited by the anti-TNF-alpha mouse serum compared to the macrophage culture supernatants from the mice treated with the physiological water.
  • TNF The production of TNF is equal to 4700 units / ml for 25 mg / kg of PDRN and 7000 units / ml for 50 mg / Kg of PDRN.
  • TNF-alpha PDRN product therefore induced TNF activity under the conditions of our tests.
  • mice of different strains of non-pathogenic mycobacteria in particular BCG, and immunomodulators, can cause both stimulation of phagocytic function and an increase in sensitivity to the lethal action of endotoxins.
  • the test consists in stimulating the animal to induce TNF by the macrophage-monocyte lines on the one hand and in activating the release of this monokine by the administration of LPS on the other hand.
  • BCG being the main stimulator of TNF, it is used in this study as a positive control of TNF induction.
  • mice Five batches of 5 mice were formed.
  • the treatment was performed on each of days 8, J-5 and J-2 to mice treated with saline, the PDRN and Ribomunyl ®.
  • the BCG specific protocol has been adapted for this product (3-14 and 3-7).
  • the administration of the various products was carried out intraperitoneally.
  • the batch of BCG-treated mice served as a positive control for TNF induction.
  • the assay was carried out according to the same method as that which was used previously for the macrophage culture supernatant. Results
  • TNF The production of TNF was 4500 units / ml for 25 mg / kg of PDRN and 5300 units / ml for 50 mg / kg of PDRN.
  • the PDRN product therefore induced the production of an activity
  • TNF demonstrated in the serum of animals treated under the conditions of our tests.
  • lymphocytes When lymphocytes are contacted with a specific antigen or immunostimulants, they turn into lymphoblasts.
  • the quantitative expression of the transformation is done by measuring the synthesis of DNA and that of proteins using precursors of radiolabelled bases (tritiated thymidine).
  • the activity of the product can be revealed directly, or with the help of mitogens brought into contact with splenocytes collected from animals previously immunostimulated.
  • mice We used 7 week old Balb / c female mice (Charles Rivers).
  • the treatment was carried out on days 3-8, 3-5 and 3-2 intraperitoneally.
  • the control animals received the excipient under the same conditions as the treated animals.
  • the spleen was removed sterile. It is ground and the recovered splenocytes are washed three times in RPMI-1640 (centrifugation 200 ⁇ g, 10 minutes). The cell concentration was adjusted to 1.5 ⁇ 10 splenocytes per ml.
  • the culture medium is RPMI-1640 (Gibco) containing 5% fetal calf serum, antibiotics (Penicillin G: 100 IU / ml and Streptomycin: 100 ⁇ g / ml) and L-Glutamine 2 mM (Steromed) .
  • the cells are distributed in micropiaques (flat bottom; 96 wells; Falcon-3072 at the rate of 200 ⁇ l per well of the suspension at 1.5 ⁇ 10 6 cells per ml. Each culture was made in quadruple copy and placed in the incubator (5% CO2, 98% humidity) for 66 hours including the last 18 hours in the presence of tritiated thymidine.
  • the tritiated thymidine was incorporated at a rate of 0.5 ⁇ Ci per well (specific activity 1 Ci / m mol (CEA)).
  • the cells were harvested 18 hours after incorporation.
  • the measurement of the incorporation of tritiated thymidine was carried out using a liquid scintillation beta counter.
  • PDRN stimulates the transformation of mouse splenocytes during intraperitoneal treatments at a dose of 5, 10 and 25 mg / ml. On the other hand, no transformation was recorded at the dose of 1 and 2 mg / kg.
  • the PDRN product induces, in vivo, a clear transformation of the mouse splenocytes when it is injected intraperitoneally at doses of 5, 10 and 25 mg / Kg.
  • This transformation demonstrated by the incorporation of tritiated thymidine is increased when the splenocytes of the animals having received the PDRN are brought into contact with either the PDRN itself or Concanavalin A or LPS (dose effect).
  • the addition of PHA does not modify the results compared to the controls.
  • Fig. 1 RESTORATION BY PDRN OF THE NUMBER OF LEUCOCYTES IN

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Abstract

La présente invention concerne une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient des polymères d'acide désoxyribonucléique possédant un fort degré de polymérisation (PDRN), en solution dans un solvant non ionique.

Description

COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES A BASE D'ACIDE POLYDESOXYRIBONUCLEIQUE ET LEUR PROCEDE DE PREPARATION
Il est tout d'aburd rappelé que l'ΛDN est un constituant pratiquement universel des cellules vivantes. Chez les eucaryotes, l'ADN est pr incipalement localisé dans les noyaux des cellules ; on en trom e également dans les mitochondries.
L'ADN est un polymère formé de l'union de nucléotides à des désoxyriboses ; un nucléotide résulte de l'estérification d'un nucléoside par une molécule d'acide orthophosphorique, le nucléoside étant lui-même constitué d'un sucre (désoxyribose) et d'une base purique (adénine, guanine) ou pyri midique (cytosine, thymine). Sa structure secondaire a été mise en évidence par Watson et Crick : il s'agit d'une double hélice, la succession.de désoxyri boses et de phosphoryles forme l'hélice proprement dite et les bases combinées aux oses sont perpendiculaires à la chaîne, permettant l'établissement de liaisons hydrophobes qui assurent la cohésion entre les deux hélices ; chaque tour de spire à une hauteur de 34 Å .
La présente invention concerne une composition pharmaceutique contenant des polydésoxyribonucléotides (PDRN) ou désoxyribonucléotides hautement polymérisés (DN HP ou ADN HP) ci-après désignés par PDRN ; ces PDRN sont obtenus à partir de laitance de poisson riche en acide désoxyribonucléique, et les caractéristiques organoleptiques de cette composition sont excellentes. Elle concerne également un procédé de préparation d'une telle composition. Elle concerne enfin des applications d'une telle composition pour obtenir des médicaments possédant des propriétés immunomodulantes améliorées.
La structure du PDRN lui confère une fragilité vis-à-vis de différents facteurs physico-chimiques. En particulier, la chaleur entraîne une dépolymérisation et une dénaturation partielle, qui a-ltéreront les propriétés attendues de la molécule, et qui conduiront à augmenter les concentrations en PDRN pour observer un effet biologique.
Par ailleurs, quand le PDRN entre dans une composition pharmaceutique, il est généralement associé à d'autres composés, en particulier des sels, et les compositions pharmaceutiques obtenues dans l'art antérieur sont solides ou visqueuses à température ambiante, mais on n'obtient généralement pas de liquide de faible viscosité. C'est pourquoi la présente invention à pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient des polymères d'acide désoxyribonucléique (PDRN) possédant un fort degré de polymérisation, en solution dans un solvant non ionique.
Le degré de polymérisation du PDRN peut être évalué par la masse moléculaire de la molécule. Dans les compositions selon l'invention, la masse moléculaire moyenne des PDRN varie entre 3 et 5 millions, avec une distribution de masse se situant entre 1 et 20 millions, ce qui les différencie de l'ADN standard inscrit à la Pharmacopée française 9ème édition. Cette masse moléculaire peut être déterminée par chromatographie d'exclusion (mécanisme de perméation de gel). Le temps de rétention (Tr) de l'ADN à fort degré de polymérisation (PDRN), en raison de son fort poids moléculaire, sera raccourci (cependant, des pics secondaires correspondant à des impuretés peuvent être présents) ; en revanche, l'ADN standard, du fait de son faible encombrement stérique est retenu sur la colonne et présente un temps de rétention allongé.
Tr ADN standard
Le rapport pourra être défini dans des
Tr PDRN
conditions données.
La structure du PDRN dans les compositions selon l'invention est celle décrite par Watson et Crick.
L'utilisation d'un solvant n'apportant pas de cation est essentielle pour conserver cette structure et ce fort degré de poiymérisation du PDRN dans les compositions selon l'invention.
C'est ainsi que dans le cas de préparations injectables, il faut proscrire l'utilisation de chlorure de sodium pour assurer l'isotonicité de la solution. En effet, les ions Na+, probablement en entraînant l'établissement de liaisons supplémentaires, provoquent une augmentation de viscosité de la composition. Cette isotonicité pourra par exemple être assurée par du mannitol.
Le maintien de l'intégrité structurale du PDRN permet d'utiliser des concentrations moindres de cette molécule. C'est pourquoi, la présente invention se rapporte, de manière préférée, à des compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles contiennent, en solution dans un solvant non ionique, des polymères désoxyribonucléiques possédant un fort degré de polymérisation, à des concentrations comprises entre 1 % et 1,6% (p/v).
Ces concentration modérées de PDRN, outre leur intérêt économique, contribuent à l'obtention d'une composition liquide de faible viscosité.
De telles compositions selon l'invention pourront être caractérisées en ce qu'il s'agit de compositions utilisables par voie parentérale, notamment par voie intramusculaire et/ou intraveineuse.
Sous réserves que les conditions de stérilité, apyrogénicité et isotonicite soient respectées, la possibilité d'administrer les compositions selon l'invention par voie intraveineuse représente un avantage considérable par rapport aux compositions à base d'ADN déjà connues. Ceci est possible grâce à la consistance liquide, non visqueuse à température ambiante des compositions selon l'invention, par opposition aux compositions de l'art antérieur qui se présentent sous forme de gel. En outre, l'administration par voie intramusculaire sera facilitée.
Selon un autre aspect de l'invention, les compositions pharmaceutiques ainsi définies pourront être des compositions à usage topique.
Plus particulièrement, la présente invention concerne une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'il s'agit d'une solution qui pour 5 ml renferme :
- PDRN : 0,0625 g
- Mannitol : 0,2500 g
- Paraben méthyl sodé : 0,0050 g
- Paraben propyl sodé : 0,0025 g
- Eau pour préparation
injectable qsp 5 ml
et en ce que le pH est maintenu à une valeur d'environ 7 par de l'acide chlorhydrique O, I N.
Cette composition répond à l'ensemble des caractéristiques énoncées précédemment. Le mannitol assure l'isotonicité de la solution, les autres composés ont un rôle de conservateurs. Le PDRN conserve son fort degré de polymérisation au sein de la composition ; il est stable pour un pH compris entre environ 6,8 et 9.
Selon un autre de ses aspects, la présente invention fournit un procédé permettant la préparation des compositions pharmaceutiques de
PDRN à fort degré de polymérisation. La présente invention concerne donc un procédé de préparation d'une composition pharmaceutique, caractérisée en ce que :
a) on met des laitances de poisson dégraissées en contact avec une solution de NaCl, afin de solubiliser l'ADN présent,
b) on recueille la solution,
c) on additionne de l'éthanol à 95 % (v/v) afin de précipiter le PDRN, d) on essore les fibres de PDRN obtenues et on les plonge à nouveau dans une solution d'éthanol à 95 % (v/v),
e) on sèche les fibres de PDRN ainsi obtenues,
f) on met les fibres de PDRN en solution aqueuse, à une température inférieure à environ 65°C,
g) on additionne les différents excipients,
h) on filtre la solution sur membrane miliipore,
i) on obtient une composition stérile apyrogène.
Le PDRN sera en général sous forme de son sel de sodium. Les laitances de poisson sont connues pour être une matière première riche en ADN. L'addition de NaCl entraîne la précipitation des protéines. La solution pourra être additionnée de matériaux (bentonite, etc) qui facilitent la séparation par tout moyen physique tel que filtration, ce-ntrifugation , décantation.
Les fibres de PDRN sont purifiées par une solution d'éthanol à 95 % ; après séchage, une teneur en eau de l'ordre de 8 à 20 % doit toutefois être maintenue pour conserver la structure fibreuse du PDRN. II est important que la solubilisation de PDRN soit effectuée à une température inférieure à environ 65°C, en effet, des températures trop supérieures entraînent une dépolymérisation partielle du PDRN.
L'étape de stérilisation de la composition est effectuée par filtration, notamment sur membrane miliipore ; cette filtration, qui permet d'éliminer les microorganismes, est possible car la composition est sous forme liquide ; les concentrations en PDRN ne doivent pas être supérieures à environ 2 %, pour éviter de colmater les filtres. Ce mode de stérilisation évite le chauffage de la solution qui détruit partiellement les polymères de PDRN. On opère en général sous pression d'azote, pour vaincre la résistance des filtres au passage des liquides.
L'ensemble des opérations est réalisé de manière aseptique et on obtient une solution stérile apyrogène.
Dans le procédé de préparation selon l'invention, l'étape f) est de préférence conduite à une température d'environ 60° ± 5°C.
De manière surprenante, on a trouvé que les compositions selon l'invention présentent des propriétés immunomodulatπces remarquables, ainsi qu'un effet "GM-CSF iike" sur la production des leucocytes (granulocyte macrophage colony stimulating factor) . Le GM-CSF, facteur sanguin obtenu par des techniques de recombinaison génétique, est très coûteux et peut entraîner des effets secondaires gênants, qui ne sont pas observés avec les compositions à base de PDRN à fort degré de polymérisation de l'invention.
C'est pourquoi selon encore un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet l'application de compositions contenant du
PDRN en solution dans un solvant non ionique, pouvant être préparées par le procédé décrit ci-dessus, pour obtenir un médicament destiné au traitement ou à la prévention des déficits immunitaires ainsi que celle des leucopénies chimio et/ou radiothérapiques.
En particulier, le déficit immunitaire auquel est destiné ce médicament peut être consécutif à un traitement antinéoplasique. On sait que le traitement, par exemple par l'adriblastine, la vincablastine, etc, entraîne une chute des leucocytes circulants, parfois également des plaquettes sanguines, due à une atteinte des cellules souches de la moelle osseuse.
Les compositions selon l'invention peuvent servir à la préparation d'un médicament à visée immunomodulant, administré avant, pendant et/ou après un tel traitement antinéoplasique. Cette administration pourra notamment être réalisée par voie intra-veineuse. Ces compositions ont une activité immunomodulante, exclusivement sur l'immunité à médiation cellulaire. Cette activité semble dépendante du maintien d'un degré de polymérisation élevé du PDRN dans la composition.
Elle se manifeste notamment par une restauration quantitative des leucocytes après leucopénie induite par un traitement antinéoplasique.
Cette activité s'observe aussi bien lors d'un premier traitement que lors d'une rechute, mais contrairement au traitement par le GM-CSF, on n'observe pas d'effet rebond conduisant à une hyperleucocytose, non souhaitable, et le nombre des leucocytes circulants est rétabli. L'activité phagocytaire, en particulier, est augmentée par l'administration de la composition.
La composition selon l'invention entraîne également une augmentation de la production d'ιnterleukιne-1 ainsi que du "tumor necrosis factor" ou TNF.
Enfin, la production de plaquettes est stimulée.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent.
Dans ces exemples, on se référera notamment à la figure 1, qui représente la restauration par PDRN du nombre de leucocytes chez la souris BALB/C d'une leucopénie chimiquement induite par adriblastine
EXEMPLE I Description du procédé de préparation de la composition de PDRN selon l'invention
La matière première utilisée est de la laitance de poisson dont on connaît la teneur élevée en ADN.
Dans les spermatozoïdes, l'ADN est combiné à des protéines basiques (histones ou protamines) dont il convient de se débarasser.
Le procédé utilisé comporte des étapes successives qui s'effectuent dans des locaux distincts reliés entre eux par des sas, sans retour en arrière possible. Première étape : Rupture des membranes cellulaires et mise en solution des désoxyribonucléoprotéines (D.N.P)
Les laitances dégraissées et partiellement déshydratées sont hachées finement et mises en contact avec des solutions de chlorure de sodium qui dissocient les D.N.P en PDRN qui reste soluble et- en protéines qui sont éliminées par tous moyens physiques tels que filtration, centrifugation ou décantation.
Deuxième étape : Purification et précipitation
Cette opération s'effectue dans un deuxième local où la solution de PDRN ainsi clarifiée est mélangée à l'éthanol à 95 % (v/v).
Le PDRN précipite sous forme de longues fibres blanches à blanc crème. Celles-ci sont ensuite essorées puis plongées de nouveau pendant 12 heures dans une solution d'éthanol à 95 % (v/v) afin d'y subir une déshydratation et une "purification alcoolique".
Troisième étape
Cette opération s'effectue dans un local à air filtré. Les fibres sont séchées dans une étuve à air chauffé à basse température et filtré sur un filtre absolu.
A la sortie du séchoir, les fibres de PDRN sont conditionnées immédiatement dans des sacs en matière plastique.
Quatrième étape : Stockage
Les sacs de PDRN scellés, étiquetés sont stockés dans un local spécialement réservé à cet effet.
SCHEMA DE FABRICATION
POLYDESOXYRIBONUCLEOTIDE (SEL DE SODIUM)
Stockage frigorifique des pains de laitance de poisson (-22°C)
↓
Concassage des pains de
laitance congelée
↓
Eau potable Mise en solution des Chlorure de sodium désoxyribonucléoprotéines
↓
Séparation :
PDRN - protéines
↓
Précipitation du PDRN
dans l'alcool éthylique
↓
Déshydratation et
"purification alcoolique"
des fibres d'ADN
↓
Séchage (basse température- air filtré sur fibre absolu) ↓
Mise en sac
- étiquetage - ↓
Stockage
↓
Libération du lot EXEMPLE II : Matériel
Cuve en acier inoxydable de 100 litres, avec double enveloppe, avec graduation du volume, munie d'un couvercle et d'un agitateur en acier inoxydable.
Mise en solution
Introduire dans la cuve "+5 litres d'eau pour préparation injectable portés préalablement à une température de 60°C + ou - 5°C. Cette température sera maintenue constante pendant toute la durée de la dissolution.
Mettre en marche l'agitateur à turbine ; vitesse de rotation : 1000 T/min. Introduire dans un premier temps le PDRN par petites fractions (environ 100 g).
Lorsque toute la quantité de PDRN a été versée, maintenir l'agitation pendant 45 min, la température de la solution restant constante (60°C).
Introduire ensuite dans la solution le mannitol puis les parahydroxybenzoates. Laisser sous agitation pendant 15 min.
Contrôler le PH de la solution, l'amener à une valeur de 7 + ou - 0,2 à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique N/ 10 préparée extemporanément à partir d'acide chlorhydrique concentré.
Lorsque cette valeur est atteinte, compléter avec de l'eau pour préparations injectables à 60°C pour obtenir 50 litres de solution.
Maintenir sous agitation pendant 5 min, puis effectuer le contrôle de conformité de la solution avant filtration.
Contrôle de la conformité de la solution
Vérification de l'homogénéité de la solution.
Dosage du PDRN et vérification du pH.
Si le dosage est correct, le soluté sera filtré, sinon il y a reprise de l'agitation pendant 10 minutes. Si un nouveau dosage est incorrect, le titre sera ajusté par dilution ou addition du principe actif et des autres composants, mais si l'écart est trop fort, la cause de l'anomalie doit être étudiée avant reprise éventuelle de la préparation.
EXEMPLE III : Analyse du degré de polymérisation
Cette étude est réalisée par chromatographie liquide du type exclusion, dans les conditions suivantes : . Chromatographie en phase liquide
. Pré-colonne : SHODEX IONPAK S 800 p (5 cm)
. Colonnes : SHODEX IONPAK S 806 (50 cm)
. Température de la colonne et Précolonne 20-22°C
. Solvant d'élution :
Solution tampon pH 9,00 préparée de la manière suivante :
Solution A :
Dissoudre 6,18 g d'acide borique dans une solution aqueuse de chlorure de potassium 0, 1 M et compléter à un litre avec la même solution.
Solution B :
Hydroxyde de sodium 0,1N
Ajouter 1000 Ml de solution .A, 420 ml de solution B. . Débit solvant : 1 ml/ minute
. Pression : 10 atmosphères
. Longueur d'onde de détection : 260 nm
. Sensibilité : 0,05 A.U.F.S.
. Enregistrement : 0,5 cm/min. - Solutions injectées :
. Solution à 0,1 p.cent (p/v) de produit selon l'invention dans le chlorure de potassium 0,1 M.
. Solution à 0, 1 p.cent (p/v) d'Acide Désoxyri bonuciéique de type standard (conforme à la Pharmacopée Française, IXème Edition, 1976, Tome 1 ) dans le chlorure de potassium 0,1 M.
- Chromatographie
Après filtration préalable sur filtre de 0,45 μm, 10 μl de. chacune des solutions sont injectés, successivement dans le chromatographe.
Les chromatogrammes obtenus devront mettre en évidence une différenciation quant à la configuration du pic et à son temps de rétention.
La nature "hautement polymérisée" du produit à analyser doit se traduire par une exclusion de cette molécule et par conséquent un temps de rétention chromatographique raccourci.
Par contre, l'Acide Désoxyri bonucléique standard, en raison de son faible poids moléculaire (encombrement sténque faible), présente un temps de rétention allongé. Toutefois, le chromatogramme du produit à analyser peut mettre en évidence la présence d'un deuxième pic (dédoublé ou non). Celui-ci représente, du fait de son temps de rétention important, diverses molécules de faibles masses (acides nucléiques non polymérisés en particulier acide ribonucléique, peptides etc.).
Ces composés naturellement associés devront être quantifiés en terme de surface : la surface du second pic prise en tangentielle devra être largement minoritaire par rapport à la surface totale. Dans ces conditions expérimentales, la surface du pic correspondant au PDRN doit représenter au minimum 90 pour cent de la surface attribuable aux acides nucléiques.
Tr A.D.N. standard Dans les conditions opératoires décrites, le rapport :
Tr PDRN
doit être voisin de 1,4 + 0,05 (Tr = temps de rétention) EXEMPLE IV : Activité du PDRN avant et après une leucopénie chimiquement induite par Adriblastine avec un repos d'un mois entre deux séances de traitement Le test consiste à analyser l'effet de stimulation des souris par PDRN vis-à-vis d'une leucopénie chimiquement induite par l'Adriblastine [Doxorubicine Chlorhydrate Lactose ; produit cytostatique du groupe des anthracyclmes - Adriblastine N.D.]. Une comparaison a été établie avec l'activité, dans les mêmes conditions, de GM-CSF naturel de souris [Granulocyte-Macrophage Colony Stimuiating Factor].
Deux séances de traitements avec un repos d'un mois ont été réalisées sur les mêmes lots de souris dans le but d'analyser l'effet de PDRN lors d'une rechute de la leucopénie. Traitements :
Quatre lots de 7 souris ont été constitués.
- Lot 1 = souris traitées par le PDRN à la dose de 25 mg/kg
- Lot 2 = souris traitées par le PDRN à la dose de 50 mg/kg - Lot 3 = souris traitées par le GM-CSF à 100 Ul/souris
- Lot 4 = souris témoins eau physiologique.
Méthologie utilisée :
Les souris BALB/C ont été traitées par le PDRN, le GM-CSF ou l'eau physiologique aux jours J-8, J-5, J-2, J+2, J+5, J+8, J+ 11 et J+ 14, J+47, J+55, J+57, J+60, J+63, J+66 et J+69 par voie intra-péritonéale sous un volume de 150 μl. L'Adriblastine [Lot G 731 X] a été administrée à raison de 5 mg/kg/3 par voie intra-veineuse aux jours J+0, J+ 1, J+55 et J+56 sous un volume de 50 μl. Les numérations des leucocytes circulants ont été réalisées sur chaque animal aux jours J-8, J+0, J+2, J+5, J+8, J+11, J+14, J+47, J+55, J+57, J+60, J+63, J+66 et J+69. L'évaluation a été faite sur 40 μl de sang obtenu par ponction du sinus rétro-orbital sur capillaire héparine. Résultats :
Les résultats sont présentés dans le tableau 1 et dans la figure 1 en annexe. Ils sont exprimés en nombre moyen de globules blancs par μl de sang périphérique. L'analyse statistique des résultats a été effectuée par le test t de student.
TABLEAU 1 : ESSAI DE RESTAURATION QUANTITATIVE DES LEUCOCYTES PAR PDRN D'UNE LEUCOPENIE CHIMIQUEMENT INDUITE PAR ADRIBLASTINE.
Jour 1 Sourit Sourit Sourit Sourit
Témoins PDRN 25 PDRN 50 GM-CSF
J - 8 8171 ± 621 8243 ± 583 8300 ± 695 7943 ± 721
J.0 10000 ± 1066 10257 ± 1184 11829 ± 1827 11800 ± 1534
J + 2 6614 ± 313 8200 ± 970 7386 ± 1160 7386 ± 501
J + 5 4986 ± 631 5771 ± 1029 5757 ± 971 6871 ± 909
J + 8 5514 ± 752 7129 ± 1319 6886 ± 687 7414 ± 1194
J + 1 1 6000 ± 825 8014 ± 899 7757 ± 476 9071 ± 492
J + 1 4 8043 ± 509 9729 ± 1010 9500 ± 700 10314 ± 1833
J + 47 8386 ± 1191 8457 ± 1050 8557 ± 1964 12514 ± 1863
J + 55 10143 ± 1325 10986 ± 1541 10186 ± 923 10700 ± 633
J + 57 5329 ± 650 5500 ± 633 5386 ± 474 5643 ± 450
J + 60 4143 ± 864 5100 ± 630 4757 ± 697 5371 ± 1024
J +.63 5343 ± 663 7343 ± 941 6629 ± 832 805/ ± 476
J + 66 6543 ± 836 9829 ± 1527 8786 ± 1209 10971 ± 1613
J + 69 8157 ± 310 9000 ± 973 8857 ± 454 9229 ± 759 Les souris stimulées par les deux doses de PDRN comme celles stimulées par le GM-CSF ont manifesté une restauration du nombre de globules blancs plus rapide par rapport aux témoins eau physiologique. Lors du premier traitement, la valeur normale du nombre de leucocytes circulants a été atteinte en 1 1 jours chez les souris traitées par PDRN et GM-CSF [valeur théorique à partir de la courbe = 1 1 jours pour le PDRN, 9 jours pour le GM-CSF] et en 14 jours chez les souris traitées par l'eau physiologique [valeur théorique tracée à partir de la courbe = 14 jours ]. Lors du deuxième traitement, la valeur normale du nombre de leucocytes circulants a été atteinte au 66ème jour chez les souris traitées par ADN-HP [valeurs théoriques tracées à partir de le courbe = 64ème jour pour la dose de 25 mg/kg de PDRN et 65ème jour pour la dose de 50 mg/kg de PDRN], au 63ème jour chez les souris traitées par GM-CSF [valeur théorique tracée à partir de la courbe = 63ème jour] et au 69ème jour chez les souris traitées par l'eau physiologique [valeur théorique tracée à partir de la courbe = 69ème jour]. Lors de l'analyse du 47ème jour, on observe une augmentation du nombre de leucocytes du sang circulant chez les souris traitées par GM-CSF alors que chez les animaux stilulés par PDRN et l'eau physiologique, le nombre de leucocytes reste à la valeur normale.
La stimulation intra-péntonéale des souris BALB/C par le
PDRN a permis, dans les conditions de nos essais, de restaurer une leucopénie aiguë provoquée par l'adriblastine. Cette restauration a été atteinte au huitième jour pour le premier essai [traitement avant et après chimiothérapie] et au onzième, soixante-quatrième et soixante-cinquième jour pour le deuxième essai [traitement avant et après chimiothérapie avec un repos intermédiaire d'un mois]. La reconstitution du nombre de globules blancs chez les souris témoins a été observée au dix-septième jour lors du premier essai et au quatorzième et au soixante-neuvième jour lors du deuxième.
On notera également que les compositions de la présente invention, contrairement au GM-CSF dont le prix est sans commune mesure avec celui des compositions de la présente invention, n'induisent aucune hyperleucocytose et évitent certains effets secondaires observés avec le GM-CSF. EXEMPLE V : COMPOSITION DE LA SPECIALITE PHARMACEUTIQUE Composition par unité de prise
Nom des composants Quantités Fonctions
PDRN 0,0625 g Principe actif
(à 20 % d'humidité)
Mannitol 0,250 g Isotonisant
Méthyle (parahydroxyben- 0,0050 g Conservateur zoate de) sodé
Propyle (parahydroxyben- 0,0025 g Conservateur zoate de) sodé
Acide chlorhydrique N/10 qsp pH=7 Tampon
Eau pour préparations 5 ml Solvant injectable qsp
EXEMPLE VI : CAPACITE D'INDUCTION DE MONOKINES PAR LES
MACROPHAGES PERITONEAUX [INTERLEUKINE- 1 (IL-1)
ET TUMOR NECROSIS FACTOR (TNF)]
Principe
Lorsque les macrophages sont mis en contact avec un mitogène ou un immunostimulant, ils peuvent élaborer des monokines [interleukine 1 (IL-1 ), Tumor Necrosis Factor (TNF) etc.]. L'induction des monokines permet donc de mettre en évidence une activation des macrophages par le produit étudié.
Etude de la capacité d'induction d'interleukine-1 (111) par les macrophages péritonéaux des souris BALB/C traitées par le PDRN.
Principe du test
Des souris BALB/C reçoivent le produit étudié. On prélève les macrophages péritonéaux 48 heures après le dernier traitement. Ces macrophages ont été mis en culture en présence d'un révélateur de sécrétion des monokines. Nous avons utilisé le Lipopolysaccharide B d'Escherichia coli O55B5 (LPS) (Difco) à la dose de 10 μg/ml de suspension cellulaire comme révélateur de l'induction d'IL-1. Après 24 heures, le surnageant de culture des macrophages a été récolté, centrifugé et gardé à -20°C jusqu'à l'utilisation. On teste ensuite l'effet du surnageant brut sur la transformation des thymocytes de souris C3H/Hej qui ne sont pas sensible aux effets du LPS afin d'éviter une interférence possible avec cet inducteur d'IL-1. Les cultures ont été réalisées en présence de 5 μg PHA par ml de suspension cellulaire.
Matériel et méthodes
Animaux
Nous avons utilisé des souris Balb/c (Charles Rivers), femelles, âgées de 6 semaines pour les traitements avec les produits étudiés et des souris C3H/Hej (Institut Pasteur), femelles, âgées de 5 semaines pour l'analyse des surnageants de culture des macrophages.
Milieu de culture
Le milieu de culture a été du RPMI-1640 (Gibco) contenant 5% de sérum de veau foetal (SVF), des antibiotiques (Pénicilline G:100 Ul/ml et Streptomycine: 100 μg/ml), de la L-Glutamine 2 mM/ml (Seromed) et de l'indomethacine 1 μg/ml. Ce dernier réactif a été ajouté lors de la production des surnageants des macrophages péritonéaux. Traitements :
Quatre lots de 5 souris ont été constitués.
- Lot 1 = Souris traitées par le PDRN à la dose de
25 mg/kg
- Lot 2 = Souris traitées par le PDRN à la dose de
50 mg/kg
- Lot 3 = Souris traitées par le Ribomunyl®; 0,4 μg/kg
- Lot 4 = Souris témoins eau physiologique
Le traitement a été réalisé aux jours 3-8, 3-5 et 3-2 par voie intra-péritonéale. Les animaux témoins ont reçu l'excipient dans les mêmes conditions que les animaux traités. Epreuve
Après le prélèvement aseptique du thymus des souris C3H/Hej, les thymocytes ont été lavés abondamment une fois et la suspension a été ajustée à 4 × 10 cellules par ml. La culture de ces thymocytes a été réalisée en présence de 5 μg de PHA par ml sur plaques à fond plat de 96 puits (Falcon ; 3072) après addition des dilutions en demies des surnageants à tester. Nous avons utilisé i'IL-1 récombinant (Genzyme) à titre de comparaison. L'incorporation de thymidine tritiée a été évaluée après 44 heures de culture des thymocytes dont les dernières 16 heures en présence de ce réactif radiomarqué.
Les unités d'IL- 1 sont définis par l'équation suivante :
Figure imgf000019_0001
où 10 représente la part du premier volume (0,1 ml) du surnageant utilisé. Les résultats obtenus pour les différents lots sont les suivants :
Moyenne (cpm) des témoins cellules : 296 ± 68
Valeur calculée :
- pour le lot traité par le PDRN à 25 mg/kg : 2170-1 130 × 16× 10 = 281,1
2(296)
- pour le lot traité par le PDRN à 50 mg/kg : 2180-1252 ×32× l0 = 501,6
2(296)
- pour le lot traité par Ribomunyl® : 2028-1252 ×32×10 = 419,5
2(296)
On peut donc conlure que le PDRN induit une production d'IL-1. Cette production est équivalente à 501,6 unités/ml pour la dose de
50 mg/kg de PDRN et à 281,1 unités/ml pour la dose de 25 mg/kg d'.ADN-HP de surnageant. La quantité d'IL-1 produite par le Ribomunyl® à la dose de 0,4 μg/kg, est équivalente à 419,5 unités/ml de surnageant.
EXEMPLE VII : Etude de la capacité d'induction de "Tumor Necrosis
Factor" [TNF] par les macrophages péritonéaux de souris BALB/C traitées par PDRN.
Principe du test
"Tumor Necrosis Factor" [TNF] ou "Cachectin" est une monokine élaborée principalement par les monocytes et les macrophages. Médiateur important de la destruction des tumeurs par les monocytes in vivo, le TNF est toxique pour certaines lignées tumorales in vitro. Cette cytokine est également inductrice de la production d'interleukme l et augmente l'activités phagocytaire et cytotoxique des polynucléaires neutrophiles. Le TNF constitue un signal de prolifération pour une lignée de cellule InterIeukine-2 dépendante, ce qui souligne son importance dans la régulation des réponses immunitaires à médiation cellulaire. Le TNF est le principal médiateur du choc, de l'amaigrissement et de la mort lors de l'agression par endotoxine bactérienne. L'administration aux babouins des anticorps anti-TNF une heure avant l'infection par une DL100 d'Escherichia coli neutralise le choc létal. Le fait que la souris C3h/Hej soit 1000 fois plus sensible à une infection létale par Escherichia coli qu'une souche de souris traditionnelle, témoigne du rôle protecteur de cette cytokine contre les effets toxiques des microorganismes. La souris C3H/Hej étant insensible à l'endotoxine, n'élabore pas de TNF. Au cours des infections, le TNF contribue à la fois à la pathogénicité des microorganismes et à la suppression de croissance de ces agents par stimulation du système phagocytaire.
Matériel et méthodes
Traitements :
Quatre lots de 5 souris ont été constitués.
- Lot 1 = Souris traitées par le PDRN à la dose de
25 mg/kg
- Lot 2 = Souris traitées par le PDRN à la dose de
50 mg/kg
- Lot 3 = Souris traitées par le Ribomunyl®; 0,4 μg/kg
- Lot 4 = Souris témoins eau physiologique.
Le traitement a été réalisé aux jours J-8, J-5 et J-2 par voie intra-péritonéale. Les animaux témoins ont reçu l'excipient dans les mêmes conditions que les animaux traités. Production du TNF in vitro
Les macrophages péritonéaux issus des souris BALB/C traitées ont été cultivés et le surnageant a été récupéré de la même façon que celle décrite ci-dessus pour la production d'IL-1. Dosage
Le dosage du TNF s'effectue, in vitro, sur lignée tumorale L929. Ces cellules sont conservées en azote liquide. Après décongélation, les cellules ont été lavées deux fois dans du liquide de lavage (ex. : HANKS, PBS). La mesure de viabilité cellulaire par coloration avec le rouge neutre a été appliquée dans cette étude. Cette méthode est fondée sur l'incorporation de ce colorant par les cellules vivantes.
Préparation de culture des cellules L929 pour le dosage du TNF
24 heures avant la préparation des plaques pour le dosage, les cellules L929 ont été mises en culture en flacon de culture cellulaire dans un milieu MEM préparé de composition suivante :
- Bicarbonate 2 g/l
- L-giutamme 1 % (2 mM)
- Antibiotique 1 % (100 u/ml de pénicilline
et 100 μg/ml de streptomycine
- S.F.V. = 5 %
- 100 ml de MEM (10 x) concentré/l
- Eau bidistiilée stérile jusqu'à 1000 ml
Lorsque la couche cellulaire a été uniforme, le surnageant a été éliminé et les cellules ont été recouvertes par une solution de trypsme à 10 %. Elles sont ensuite incubées 5 à 15 minutes à 37°C et les boîtes sont soumises à agitation à plusieurs reprises pendant le temps de cette incubation. Après décollement des cellules, celles-ci ont été lavées abondamment dans du HANKS (deux centrifugation = 5 min à 1500 tr/min.). Les cellules sont ensuite, numérées à l'hématimètre et ajustées à 7,5 × 10 /ml. Après répartition de 200 μl de cellules/puits (= 1,5 × 10 cellules/puits) dans des plaques de 96 puits, elles sont mises à l'étuve à 37°C pendant 24 heures dans une atmosphère de 5 % de CO2. Test
Après cette incubation de 24 heures, le surnageant de culture a été éliminé et les dilutions des échantillons à tester ont été réparties à raison de 200 μl/puits. Les dilutions des échantillons à tester ont été préparées dans 200 μl de milieu sans SVF en présence de 5 μg/ml d'Actinomyone D et en présence ou à l'absence d'une dilution au 200ème du sérum anti-TNF-alpha souris- (Genzyme) [en quadruple exemplaires]. Cette dilution d'anti-TNF- alpha bloque une unité de TNF-alpha calculé sur la base de rTNF-alpha (Genzyme). Donc, l'inhibition d'effet cytotoxique de TNF-alpha par le sérum anti-TNF-alpha dépend de la concentration de cette monokine dans une dilution.
Après répartition des dilutions, les cellules sont ensuite incubées à 37°C pendant 20 heures dans une atmosphère de 5 % de CO2.
Le rouge neutre à 0,033 % poids/volume en eau distillée a été préparé extemporanément et réparti, sur les plaques contenant les cultures de cellules L929 avec des échantillons à tester, à raison de 50 μl/puits et incubé 1 heure à 37°C. Après élimination des surnageants, sont effectués deux lavages en PBS chaud (37°C) et sont ajoutés 200 μl par puits de la solution de lyse cellulaire préparé comme suit :
Ethanol pur 1 volume + Phosphate Monosodique (1 M) 1 volume.
Après agitation des plaques, la lecture a été réalisée au spectrophomètre à 540 nm de longueur d'onde.
Calcul des pourcentages et des unités de TNF
Les pourcentages de cytotoxicité ont été calculés selon la formule suivante :
Figure imgf000023_0001
à partir des densités optiques obtenus par les lectures à l'aide d'un spectrophomètre multiscan. Une unité de TNF est équivalente à 50 % de cytotoxicité provoqué par une dilution de surnageant. Des points d'intersection entre la valeur de 50 % de cytotoxicité et la dilution correspondante ont été tracées à l'aide d'un programme statistique "Criquet Graph". Le dénominateur de la dilution correspondante est le nombre d'unité de TNF pour le volume initial du surnageant ajouté dans la première dilution (0,01 ml). Cette valeur est ensuite multipliée par la part du volume initial (0,01 ml) dans 1 ml ; ce qui permet d'obtenir l'unité du TNF par ml de surnageant. Résultat
Les résultats sont exprimés dans le tableau 2. L'effet cytotoxique des surnageants de culture des macrophages issus des souris ayant reçu l'excipient n'a pas été inhibé par le sérum anti-TNF-alpha. L'effet cytotoxique des surnageants des macrophages péritonéaux issus des souris traitées par les produits étudiés ont été partiellement inhibés par l'anti-TNF-alpha (voir tableau).
Figure imgf000025_0001
L'effet cytotoxique des surnageants de culture des macrophages issus des souris traitées par les produits étudiés a été partiellement inhibé par le sérum anti-TNF-alpha souris (tableau 1) par rapport aux surnageants de culture des macrophages issus des souris traitées par l'eau physiologique.
La production de TNF est égale à 4700 unités/ml pour 25 mg/kg de PDRN et 7000 unités/ml pour 50 mg/Kg de PDRN. La production de TNF induite par Ribomunyl® à la dose de 0,4 μg/kg a été 2300 unités/ml dans les conditions de nos essais.
Conclusions
Les surnageants des macrophages péritonéaux de souris BALB/C traitées par le PDRN et le Ribomunyl®, par voie intra-péritonéale, ont provoqué une cytotoxicité sur la lignée tumorale (L929)
sensible à l'action du TNF-alpha. Le produit PDRN a donc induit une activité TNF dans les conditions de nos essais.
EXEMPLE VIII : Capacité d'induction de TNF dans le sérum des souris traitées par le PDRN
Principe
L'inoculation, à la souris, de différentes souches de mycobactéries non pathogènes, en particulier le BCG, et d'immunomodulateurs, peut provoquer à la fois une stimulation de la fonction phagocytaire et une augmentation de la sensibilité à l'action létale des endotoxines. L'essai consiste à stimuler l'animal pour induire le TNF par les lignées macrophages-monocytes d'une part et à activer la libération de cette monokine par l'administration du LPS d'autre part. Le BCG étant le principal stimulateur de TNF, il est utilisé dans cette étude comme témoin positif d'induction de TNF. Matériel et méthodes
Animaux
Nous avons utilisés les souris BALB/C femelles âgées de six semaines. Traitement
Cinq lots de 5 souris ont été constitués.
- Lot 1 = Souris traitées par le PDRN à la dose de
25 mg/kg
- Lot 2 = Souris traitées par le PDRN à la dose de
50 mg/kg
- Lot 3 = Souris traitées par le Ribomuny®, 0,4 μg/kg
- Lot 4 = Souris traitées par le BCG à la dose de 2 × 10 BCG viables/souris
- Lot 5 = Souris témoins eau physiologique.
Le traitement a été réalisé aux jours J-8, J-5 et J-2 pour les souris traitées par l'eau physiologique, le PDRN et le Ribomunyl®. Le protocole propre au BCG a été adapté pour ce produit (3-14 et 3-7). L'administration des différents produits a été réalisée par voie intra péritonéale. Le lot de souris traitées par le BCG a servi comme témoin positif d'induction du TNF.
Récolte du sérum
L'administration de Lipopolysaccharide-B d'Escherichia coli
O55B5 (LPS) (Difco), 10 μg/souris a été réal isé au jour J.O. Le sang périphérique (ponction du sinus retro-orbital) a été récolté une heure et demie après l'administration du LPS. Le sang a été stocké à 4°C pour une nuit, centrifugé, et le sérum a été placé à 4°C jusqu'à l'utilisation.
Dosage
Le dosage a été réalisé selon le même procédé que celui qui a été utilisé précédemment pour le surnageant de culture des macrophages. Résultats
Les résultats sont exprimés dans le tableau 3. L'effet cytotoxique des sérums issus des souris ayant reçu l'excipient n'a pas été inhibé par le sérum anti-TNF-alpha. L'effet cytotoxique des sérums issus des souris traitées par les produits étudiés ont été bloqués par l'anti-TNF-alpha (voir tableau).
L'effet cytotoxique des sérums issus des souris traitées par les produits étudiés a été partiellement inhibé par le sérum anti-TNF-alpha souris (tableau 3) par rapport aux sérums issus des souris traitées par l'eau physiologique.
La production de TNF a été de 4500 unités/ml pour 25 mg/kg de PDRN et de 5300 unités/ml pour 50 mg/kg de PDRN. La production de TNF induite par le Ribomunyl® à la dose de 0,4 μg/kg a été de 3800 unités/ml et celle induite par le BCG a été de 450000 unités/ml dans les conditions de nos essais.
Conclusions
Les sérum de souris BALB/C traitées par PDRN, Ribomunyl® et BCG ont provoqué une cytotoxicité sur la lignée tumorale (L929) sensible à l'action du TNF.
Le produit PDRN a donc induit la production d'une activité
TNF mise en évidence dans le sérum des animaux traités dans les conditions de nos essais.
EXEMPLE IX : Activité du PDRN sur les cellules de l'immunité à médiation cellulaire
Etude de l'activité de l'ADN-HP sur la transformation des splenocytes de la souris Principe du test
Lorsque les lymphocytes sont mis en contact d'un antigène spécifique ou d'immunostimulants, ils se transforment en lymphoblastes.
Cette propriété permet de mettre en évidence la réponse des cellules immunocompétentes lors d'une stimulation par un immunostimulant.
L'expression quantitative de la transformation se fait en mesurant la synthèse d'ADN et celle des protéines grâce à des précurseurs de bases radiomarqués (thymidine tritiée). L'activité du produit peut être révélée directement, ou avec le concours de mitogènes mis en contact des splenocytes récoltés sur les animaux préalablement immunostimulés. A) Révélation directe de la transformation lymphoblastique
Matériel et méthodes
Animaux
Nous avons utilisé des souris femelles Balb/c (Charles Rivers), âgées de 7 semaines.
Traitements
Six lots de 5 souris ont été constitués.
- Lot 1 = Souris traitées par le PDRN à la dose de
1 mg/kg
- Lot 2 = Souris traitées par le PDRN à la dose de
2 mg/kg
- Lot 3 = Souris traitées par le PDRN à la dose de
5 mg/kg
- Lot 4 = Souris traitées par le PDRN à la dose de
10 mg/Kg
- Lot 5 = Souris traitées par le PDRN à la dose de
25 mg/kg
- Lot 6 = Souris témoins eau physiologique.
Le traitement a été réalisé aux jours 3-8, 3-5 et 3-2 par voie intra-péritonéale. Les animaux témoins ont reçu l'excipient dans les mêmes conditions que les animaux traités. Préparation des splenocytes
La rate a été prélevée stérilement. Elle est broyée et les splenocytes récupérés sont lavés trois fois dans du RPMI-1640 (centrifugation 200 × g, 10 minutes). La concentration cellulaire a été ajustée à 1,5.10 splenocytes par ml.
Milieu de culture
Le milieu de culture est du RPMI-1640 (Gibco) contenant 5 % de sérum de veau foetal, des antibiotiques (Pénicilline G : 100 Ul/ml et Streptomycine : 100 μg/ml) et de la L-Glutamine 2 mM (Steromed).
Culture cellulaire
Les cellules sont réparties en micropiaques (fond plat; 96 puits; Falcon-3072 à raison de 200 μl par puits de la suspension à 1,5 × 10 6 cellules par ml. Chaque culture a été faite en quadruple exemplaire et mise à l'étuve (5 % CO2, 98 % d'humidité) pendant 66 heures dont les dernières 18 heures en présence de la thymidine tritiée.
Mesure de la réponse
La thymidine tritiée a été incorporée à raison de 0,5 μCi par puits (activité spécifique 1 Ci/m mol (CEA)). Les cellules ont été récoltées 18 heures après l'incorporation. La mesure de l'incorporation de thymidine tritiée a été réalisée à l'aide d'un compteur béta à scintillation liquide. Résultats
Les résultats sont indiqués dans le tableau 4. Ils sont exprimés en coups par minutes (cpm- moyenne de cinq souris ± leurs écart types). L'analyse statistique de ces résultats a été réalisée par le test t de Student. TABLEAU 4 : TRANSFORMATION LYMPHOBLASTIQUE DES SPLENOCYTES DE SOURIS BALB/C TRAITEES PAR DIFFERENTES DOSES De PDRN
cpm Ecarts Types
Lot témoin 1 073 145
Lot PDRN 1 mg/kg 1 114 364
Lot PDRN 2 mg/kg 1017 212
Lot PDRN 5 mg/kg 1694 475
Lot PDRN 10 mg/kg 1 636 329
Lot PDRN 25 mg/kg 1481 1 53
B Révélation de la transformation lymphoblastique après mise en contact des splenocytes avec des mitogenes ou le PDRN lui même
Matériel et méthodes
Les modalités précédentes ont été utilisées. Mais les mitogenes ou le PDRN ont été mis en contact avec les splenocytes aux doses suivantes :
- Concanavaline A (ConA) = 2,5 μg/ml de suspension cellulaire
- Phytohemagglutinine (PHA) = 10 μg/ml de suspension
cellulaire
- Lipopolysaccharide (LPS) = 50 μg/ml de suspension
cellulaire
- Le PDRN a été utilisé aux doses 5, 10 et 20
μg/ml de suspension cellulaire.
Résultats
Les rés ltats sont indiqués dans le tableau 5. Il sont exprimés en coups par minutes (cpm- moyenne de cinq souris ± leurs écart types). L'analyse statistique de ces résultats a été réalisée par le test t de Student. TABLEAU 5 EFFET DE LA STIMULATION DE SOURIS BALB/C AUX DIFFERENTES DOSES DE PDRN SUR LA TRANSFORMATION LYMPHOBLASTIQUE DES SPLENOCYTES STIMULES PAR DIVERS MITOGENES OU PAR ADN-HP.
Stimulation Lot Lot Lot Lot Lot Lot
in vitro Témoin PDFN-1mg PDFN -2mg PDRN-5mg PDFN-10mg PDFN -25mg
PDRN 5 μg 3299 4981 6327 10922 10658 10434
PDRN 10 μg 3578 4895 6398 13170 12565 13668
PDRN 20 μg 3101 5046 6571 14985 15311 18084
Con A 2,5 μg 119522 165511 165652 167629 155949 155208
PHA10μg 12437 15194 11676 12917 14238 9865
LPS 50 μg 15777 31071 55709 79039 103301 106148
Le PDRN stimule la transformation des splenocytes de la souris lors des traitements intra-péritonéaux à la dose de 5, 10 et 25 mg/ml. II n'a pas été, en revanche, enregistré de transformation à la dose de 1 et 2 mg/Kg.
Une augmentation importante des réponses des splenocytes vis-à-vis de la ConA et du LPS ont été observées pour toutes les doses de PDRN utilisées ; ce qui n'a pas été le cas pour la PHA. Les réponses obtenues pour le PLS sont croissantes en fonction de la dose de PDRN injecté à la souris.
Conclusions
Le produit PDRN induit, in vivo, une nette transformation des splenocytes de la souris lorsqu'il est injecté par voie intra-péritonéale aux doses de 5, 10 et 25 mg/Kg. Cette transformation mise en évidence par l'incorporation de thymidine tritiée est augmentée lorsque les splenocytes des animaux ayant reçus le PDRN sont mis en contact soit du PDRN lui même soit de la Concanavaline A ou des LPS (effet dose). En revanche, l'addition de PHA ne modifie pas les résultats par rapport aux témoins.
LEGENDES RELATIVES AUX FIGURES
Légende relative à la figure 1
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Fig.1 : RESTAURATION PAR PDRN DU NOMBRE DE LEUCOCYTES CHEZ
LA SOURIS BALB/C D'UNE LEUCOPENIE CHIMIQUEMENT INDUITE PAR ADRIBLASTINE. LES STIMULATIONS ONT ETE REALISEES
AUX 30URS J-S, J-5, J-2, J+2, J+8, J+11, J+ 14, J+47, J+50, J+53,
J+57, J+60, J+63, J+66 ET J+69 ↑ = 30URS D'ADMINISTRATION DE L'ADRIBLASTINE * = 30URS DE STIMULATIONS

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient des polymères d'acide desoxyribonucleique possédant un fort degré de polymérisation (PDRN), en solution dans un solvant non ionique.
2. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient une proportion de PDRN comprise entre 1 % et 1,6 % (p/v).
3. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une solution qui pour 5 ml renferme
- PDRN 0,0625 g
- Mannitol 0,2500 g
- Paraben méthyi sodé 0,0050 g
_ Paraben propyl sodé 0,0025 g
- Eau p.p.i qsp 5 ml
et en ce que le pH est maintenu à une valeur d'environ 7 par de l'acide chlorhydrique 0,1 N.
4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une composition utilisable par voie parentérale, notamment par voie intramusculaire et/ou intraveineuse.
5. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une composition à usage topique.
6. Procédé de préparation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que :
a) on met des laitances de poisson dégraissées en contact avec une solution de NaCl, afin de solubiliser l'ADN présent, b) on recueille la solution d'ADN,
c) on additionne de l'éthanol à 95 % (v/v) afin de précipiter le PDRN,
d) on essore les fibres de PDRN obtenues et on les plonge à nouveau dans une solution d'éthanol à 95 % (v/v), e) on sèche les fibres de PDRN ainsi obtenues,
f) on met les fibres de PDRN en solution aqueuse, à une température inférieure à environ 65°C, g) on additionne les différents excipients,
h) on filtre la solution sur membrane miliipore, i) on obtient une composition stérile apyrogène.
7. Procédé de préparation d'une composition selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'étape (f) est conduite à une température comprise entre 55°C et 65°C.
8. Application d'une composition selon l'une des revendications 1 à 5, pouvant être préparée par le procédé selon l'une des revendications 6 et 7, pour obtenir un médicament destiné au traitement ou à la prévention des déficits immunitaires.
9. Application selon la revendication 8, caractérisée en ce que le déficit leucocytaire est un déficit leucocytaire consécutif à un traitement antinéoplasique.
10. Application selon l'une des revendications 8 et 9, caractérisée en ce que ledit médicament est associé à un autre médicament antinéoplasique.
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