WO1992013229A2 - Procede d'analyse par electrophorese capillaire avec detection par fluorescence - Google Patents

Procede d'analyse par electrophorese capillaire avec detection par fluorescence Download PDF

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WO1992013229A2
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    • G01N33/561—Immunoelectrophoresis

Definitions

  • the invention relates to a method of analysis by capillary electrophoresis with fluorescence detection, and its applications.
  • Electrophoretic migration takes place in a capillary filled with an essentially aqueous buffer or in a capillary filled with gel, the substances being dissolved in a buffered solution.
  • Fluorescence is the property that certain suostances have of emitting, when they are excited by light of a certain wavelength, a radiation. longer wavelength than that of the incident rays. Substances which do not have natural fluorescence can, however, be detected if they have been previously marked with a fluorescent agent, for example tluorrscein or to cite only one.
  • the sensitivity of the fluorescence detection comes from the fact that the background emission (except fluorescence) is low so that there is a significant change in the emission originating either from fluorochromes or from native fluorescence. This contrasts with the classic UV or visible absorption phenomena where the difference in absorption between the buffered solution and the product analyzed is small. In addition, due to the existence of two precise wavelengths (excitation energy and emission energy), the selectivity of the detection is high.
  • FR-A-2,558,262 describes the use of a laser beam for the analysis by conventional electrophoresis of DNA fragments.
  • fluorescence is collected either in the extension of the incident rays, or ⁇ rthog ⁇ nalement C (cf. FR-A- 2 558 262 as well as E. K. Gassmann, J. E. Kuo and
  • the invention remedies these drawbacks by providing a method of analysis by capillary electrophoresis with fluorescence detection, in which a sample containing the labeled products to be analyzed is passed through an electrophoresis capillary with an internal diameter less than or equal to 100 ⁇ m. if necessary by a fluorescent agent,
  • a laser beam focused on the capillary is used using a light concentrating device to excite the fluorescence
  • fluorescence is detected collinearly, using the concentration device used to focus the laser beam and a photodetector.
  • the experiments carried out show unexpectedly that it is possible to obtain a much better detection sensitivity than by using a laser with an orthogonal mounting. Indeed, it turns out that the concentration detection limits are from 10 -13 1 to. 10 -14 M and those for mass detection are 60 to 200 molecules in the capillary, depending on the product detected. Flu ⁇ rescein-thioisocyanate, conventionally used as a reference standard, was even detected at 6 x 10 -15 M, which corresponds to. about the passage of 4 molecules in the capillary. The physical detection limits are therefore reached.
  • the other detection systems based on orthogonal systems have sensitivities 3 orders of magnitude (1000 times) lower than that based on a collinear arrangement according to the invention.
  • capillaries with a small internal diameter certainly allows a greater speed of analysis of a mixture of products, an advantageous property in many applications such as quality control or DNA sequencing, but the sensitivity is then reduced due to the difficulties in collecting the incident radiation coming from the capillary and especially the small detectable quantity.
  • the capillaries used up to now have an internal diameter of at least 75 ⁇ m or 100 ⁇ m to maintain good sensitivity, so the results according to the present invention have been obtained with capillaries of 50 ⁇ m, of 25 ⁇ m.
  • capillary tubes with an internal diameter as small as possible are very desirable in capillary electrophoresis because the separation efficiency obtained is much higher with capillaries of smaller diameter.
  • This is mainly due to the fact that the widening of the bands in capillary electrophoresis is largely due to the thermal convection created by the Joule effect inside the capillary when an electric current passes through the capillary.
  • the amount of heat due to the Joule effect produced inside the capillary is directly proportional to the internal diameter of the capillary tube, so the smaller the diameter of the tube, the lower the temperature rise, therefore the greater the separation efficiency.
  • the optical element used for focusing the excitation light and collecting the emitted fluorescence can have a high numerical aperture allowing placement very close to the capillary, as indicated above, so that the sensitivity does not decrease.
  • the light emitted can be collected with optical lenses before a focal distance of less than 1 mm, for example 330 ⁇ m, (instead of the value of approximately 1 cm imposed by orthogonal assemblies) and greater digital aperture, which improves the received signal.
  • the complete device according to the present invention occupies a space of the order of 30 x 10 cm while those of the prior art have a large size, for example that described in S. Wu and NJ Dovichi, J. Chrom. 480 (1989), 141 which constitutes an optical bench of 120 x 180 cm.
  • a device for implementing the method described above comprises a laser beam source, a beam splitter sending the laser beam through an optical focusing device on an electrophoresis capillary with an internal diameter less than or equal to 100 ⁇ m , a high-pass filter allowing only light due to fluorescence to pass to a photodetector which is situated in the axis of the incident beam upstream of the beam splitter relative to the incident beam.
  • the method according to the present invention makes it possible to carry out, because of its very high sensitivity. , analyzes which have not hitherto been carried out by this technique combining capillary electrophoresis and fluorescence detection.
  • FIG. 1 is a schematic representation of a device for implementing the method according to the invention
  • FIG. 2 is a schematic representation of another embodiment of the method according to the invention, using a different detector of the emitted fluorescence,
  • FIGS. 3a and 3b are diagrams respectively showing the main directions of emission of fluorescence and Raman and Rayleigh diffusions
  • FIGS. 4a and 4b illustrate the impact of the laser beam on the capillary
  • FIGS. 5a to 5d are examples of the electroph ⁇ r ⁇ grams obtained for different amino acids
  • Figure 6 iliustre the detection of a nonapeptide (bradykinin).
  • FIG. 7 illustrates the analysis of genetic material
  • FIG. 3 illustrates the detection of substance P, a hormone widely distributed in mammals
  • FIGS. 9a and 9b show - the detection of an antibiotic and its degradation products from a sample in water and in urine
  • FIG. 10 illustrates the analysis of ions using detection by indirect fluorescence.
  • An electrophoresis capillary tube 1 with an internal diameter less than or equal to 100 ⁇ m, for example 50 ⁇ m or 25 ⁇ m or even 5 ⁇ m, is conventionally mounted at the terminals of a high energy source 2 voltage Cde 0 to 30 kV, and from 0 to 300 ⁇ A).
  • a source 3 of laser beam sends a laser beam 4 to a chromatic beam splitter 5 which directs the beam 4 into an optical light concentration device 6, which focuses the beam 4 on the detection zone of the capillary 1.
  • the splitter chromatic 5 is chosen so as to reflect the light having the excitation wavelength of fluorescence and to let pass the light of longer wavelength corresponding to fluorescence.
  • the light emitted by fluorescence collected by the optical device 6 passes through the chromatic divider 5 and will strike a photodetector 7. Between the divider 5 and the photodetector 7, a pass filter is advantageously placed. top 8 with cut-off wavelength slightly greater than the cut-off wavelength of the chromatic divider to complete eliminating the light not corresponding to fluorescence and an interference filter 9 to eliminate the residual light coming from the laser .
  • the choice of the wavelength of the laser beam and the cutoff wavelengths of elements 5 and 8 is of course a function of the fluorescence to be detected.
  • a system of 40x magnification lenses and having a numerical aperture of 0.75 focuses the laser beam on a capillary made of fused silica with an internal diameter of 25 ⁇ m for example.
  • the laser beam used has an impact of 5 ⁇ m on the capillary, which allows the use of capillaries whose internal diameter can go down to 5 ⁇ m.
  • the capillary can contain a tampon or be filled with gel.
  • the photodetector is a photomultiplier tube connected to an intensity-voltage converter 10, the output signal of which is transmitted through a filter 11 to a paper recorder 12 (FIG. 1).
  • a photodetector As a photodetector, it is also possible to use a charge coupled device (CCD) of which it is known that it can simultaneously track several emission radiations, therefore several fluorophores. This is very advantageous during DNA sequencing which releases four bases to which four different fluorophores can be associated.
  • CCD charge coupled device
  • a polychromator 20 After the high-pass filter 8, a polychromator 20 is placed, a camera head 21, its associated electroni ⁇ ue 22 which is connected to a display and recording device 24, as well as to a computer (ffgure 2).
  • FIGS. 3a and 3b respectively show the fluorescence emission 16 for the excited zone 15, and the Raman and Rayleigh emissions: average intensity ⁇ rthogonally, arrows 17; strong intensity, arrows 18; and weak intensity in the direction of fluorescence, arrows 19.
  • Figures 4a and 4b show the impact of a laser beam on capillaries with an internal diameter of 75 ⁇ m and 25 ⁇ m respectively. It can be seen that for the same capillary length of 10 mm, the detectable quantity is lower the smaller the internal diameter. It is therefore important to have a very localized point of impact while preserving the quality of detection.
  • Bradykinin (a nonapeptide of the formula Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg) is reacted with fluorescein-isothi ⁇ cyanate at the amino terminus at a concentration of 7 x 10 -3 t in a 50 mM borate buffer pH9, it is introduced into a capillary tube 60 cm long and 75 ⁇ m in diameter mounted in the device described above and applies a high voltage to it
  • FIG. 6 is a reproduction of the paper recording obtained, the peak corresponding to bradykinin being indicated by an arrow.
  • a capillary 40 cm long and 50 ⁇ m in diameter is filled into the device filled with a polyacrylamide gel.
  • a small portion of a sample of genetic material is introduced into the capillary in solution in 1 X TBE buffer, by electrokinetic injection. The duration of the injection is 5 seconds and the applied voltage is 200 Y / cm.
  • Figure 7 which reproduces the paper recording obtained, a 21-mer oligonucleotide at a concentration of 10 -11 M is clearly separated from its nearest neighbors 20-mer and 22-mer.
  • Substance P is a hormone widely distributed in mammals and its concentration in biological fluids allows certain diagnoses.
  • the biological fluid examined is a dialysate sampled by a microdialysis probe placed in the substantia nigra
  • Figure 8 is a reproduction of the paper recording obtained.
  • the analysis method according to the present invention makes it possible to analyze the degree of purity, the degradation products and the stability of pharmaceutical products, here an antibiotic.
  • FIG. 9a is a reproduction of the recording on paper obtained showing the presence of ampicillin (1) and of degradation products and / or synthetic impurities (2) in lower quantities.
  • the same technique can be applied to pharmacokinetic studies, by analysis of samples of urine or other biological fluids.
  • FIG. 9b illustrates the analysis thus made of ampicillin in a urine sample, where 1 designates ampicillin, 2 the metabolites and 3 the unknown products.
  • aqueous solution containing the following anions Br-, Cl-, SO 4 -, NO 2 -, NO 2 -, F- and CO 3 - is analyzed by passing this solution through a capillary containing a buffer having a concentration of approximately 10 -8 M of fluorescein, this buffer providing permanent fluorescence only interrupted by the passage of non-fluorescent ions.
  • Figure 10 reproduces the paper recording obtained, showing a clear separation of the different anions, at concentrations as low as 10 -9 M.

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Abstract

Procédé d'analyse par électrophorèse capillaire avec détection par fluorescence, dans lequel on fait passer dans un capillaire d'électrophorèse de diamètre intérieur inférieur ou égal à 100 νm un échantillon contenant les produits à analyser marqués au besoin par un agent de fluorescence. On utilise pour exciter la fluorescence un faisceau laser focalisé sur le capillaire par un dispositif de concentration de la lumière et on détecte la fluorescence de manière colinéaire, soit dans l'axe d'illumination par le faisceau laser et du même côté du capillaire, à l'aide du dispositif de concentration de la lumière utilisé pour focaliser le faisceau laser et d'un photodétecteur. Ce procédé permet un grand nombre d'applications, notamment en biologie moléculaire et dans le domaine pharmaceutique, ainsi que pour l'analyse de traces d'ions.

Description

Procédé d ' analyse par électrophorèse capillaire avec détection par fluorescence.
L'invention concerne un procédé d'analyse par électrophorèse capillaire avec détection par fluorescence, et ses applications.
L'électrophorèse capillaire est une technique de séparation puissante qui permet de détecter la présence de très faibles quantités de substances dans des zones de détection de très faible volume Ccf. J. V. Jorgenson and K. D. Lukacs, Anal. Chem. 53, 1298-1302, 1981 et N. A. Guzman, L. Hernandez and P. G. Hαebel, Biopharm. Manuf., 2 (1989), 22]. La migration èlectrophorétique se fait dans un capillaire rempli d'un tampon essentiellement aqueux ou dans un capillaire garni de gel, les substances étant dissoutes dans une solution tamponnée.
Plusieurs modes de détection (spectrometrie UV, amperometrie, conductometrie,...) peuvent être utilisés C V. G. Kuhr, Anal. Chem. 62, 1990 (403-R)] mais la détection par fluorescence s'est révélée être particulièrement sensible CE. T. Kennedy, M. D. Oates, B- R- Cooper, B. Nickerson and J. V. Jorgenson, Science, 246 (1989) 57]. La fluorescence est la propriété que possèdent certaines suostances d'émettre, lorsqu'elles sont excitées par une lumière d' une certaine longueur d'onde, un ravonnemen. de longueur d'onde supérieure a celle des rayons incidents. Les substances qui ne possèdent pas de fluorescence naturelle peuvent toutefois être détectées si elles ont préalablement été marαuees par un agent αe fluorescence, par exemple la tluorrsceine oour n'en citer qu'un. La sensibilité de la détection par fluorescence vient du fait que l'émission de fond (hors fluorescence) est faible de sorte qu'il se produit un changement important de l'émission provenant soit de fluorochromes soit de fluorescence native. Ceci contraste avec les phénomènes classiques d' absorption en UV ou en visible où la différence d'absorption entre la solution tamponnée et le produit analysé est faible. En outre du fait de l'existence de deux longueurs d'onde précises (énergie d'excitation et énergie d'émission), la sélectivité de la détection est élevée.
Toutefois pour certaines applications comme les recherches de traces au sein d'échantillons biologiques et le séquençage d' ADN, il est souhaitable de pouvoir encore améliorer la sensibilité, la vitesse et la sélectivité de l'analyse. Cette amélioration de sensibilité permet dans certains cas d'analyse de fragments d' ADN d'éviter d'utiliser la technique PCR (Polymerase Chain Réaction: amplification en chaîne par réaction) qui donne de bons résultats mais au prix d' une augmentation de la complexité de l'analyse. Il a été suggéré d'utiliser un faisceau laser pour exciter la fluorescence, ainsi FR-A- 2 558 262 décrit l'utilisation d'un faisceau laser pour l'analyse par électrophorèse classique de fragments d'ADN.
Dans tous les systèmes de détection par fluorescence utilisés avec l'électrophorèse capillaire, la fluorescence est recueillie sait dans le prolongement des rayons incidents soit σrthogαnalement C (cf . FR-A- 2 558 262 ainsi que E. K. Gassmann, J. E. Kuo and
R. Zare, Science, 230 (1905., 813; B. Nickersαn and G.
V. Jorgenson, J. High Res., 11, 41988), 533; et Y. F.
Cheng and N. J. Dαvichi, Science, 242 (1988), 562]. Il est donc nécessaire d'utiliser deux systèmes optiques, l'un pour focaliser les rayons incidents sur le capillaire et l'autre pour recueillir la lumière émise et la focaliser sur un tube photomultiplicateur par exemple.
Pour des raisons d'encombrement spatial, en particulier dans les montages orthogonaux, il n'est pas possible de placer les systèmes optiques très près du capillaire et la distance qui les sépare de celui-ci est de l'ordre de 1 cm, avec pour inconvénients principaux une faible collecte de la lumière émise en fluorescence alors qu'on recueille en plus la lumière produite par les diffusions Raman et Rayleigh, d'où un rapport signal/bruit faible. Les fibres optiques qui sont parfois utilisées permettent d'approcher du capillaire mais on constate qu'elles ne donnent pas une bonne sensibilité (10-7M environ) (E. K. Gassmann et al, Science, op. cit. et US-A- 4 675 300).
L'invention remédie à ces inconvénients en fournissant un procède d'analyse par électrophorèse capillaire avec détection de fluorescence, dans lequel on fait passer dans un capillaire d' électrophorèse de diamètre intérieur inférieur ou égal à 100 μm un échantillon contenant les produits à analyser marqués au besoin par un agent de fluorescence,
on utilise un faisceau laser focalisé sur le capillaire à l'aide d'un dispositif de concentration de la lumière pour exciter la fluorescence, et
on détecte la fluorescence de façon colinèaire, à l'aide du dispositif de concentration utilise pour focaliser le faisceau laser et d'un photodétecteur.
L'expression "de façon colinèaire" signifie que la détection de la lumière émise se fait dans l'axe d'illumination et du même côte du capillaire.
Les expériences effectuées montrent de façon inattendue qu'il est possible d'obtenir une sensibilité de détection bien meilleure qu'en utilisant un laser avec un montage orthogonal. En effet il s'avère que les limites de détection en concentration sont de 10-131 à. 10-14M et celles de détection en masse sont de 60 à 200 molécules dans le capillaire, en fonction du produit détecté. Le fluαrescèine-thioisocyanate, utilisé de manière classique comme étalon de référence, a même été détecté à 6 x 10-15M, ce qui correspond à. peu près au passage de 4 molécules dans le capillaire. On atteint donc les limites de détection physiques. Les autres systèmes de détection bases sur des systèmes orthogonaux ont des sensibilités de 3 ordres de grandeur (1000 fois) plus faibles que celui basé sur un arrangement colinèaire selon l'invention. Dans E. K. Gassmann et al, Science, op. cit., elle est de 10-8 M; dans B. Nickerson and G. V. Jorgenson, J. Hish Res., op. cit., elle est de 10-10 M; et H. Swerdlαw and R. Gesteland, Nucleic Acid Research, 18 (1990) 1415 donnent une valeur de 10-11 M.
Par ailleurs on sait que le fait d'utiliser des capillaires de faible diamètre intérieur permet certes une plus grande vitesse d'analyse d'un mélange de produits, propriété intéressante dans beaucoup d'applications comme le contrôle qualité ou le séquençage d'ADN, mais la sensibilité est alors réduite du fait des difficultés de collecte du rayonnement incident provenant du capillaire et surtout de la faible quantité détectable. C'est pourquoi les capillaires utilisés jusqu'ici ont un diamètre interne d'au moins 75 μm ou 100 μm pour conserver une bonne sensibilité, alors αue les résultats selon la présente invention ont été obtenus avec des capillaires de 50 μm, de 25 μm ou même de moins de 10 μm de diamètre intérieur, car il est possible d'avoir une ouverture numérique élevée du fait que le dispositif de concentration est très proche du capillaire et que le peint d' impact du faisceau laser Dermet une diminution du diamètre du capillaire sans que la sensibilité n'en pâtisse.
En outre, l'u'ilisation de tubes capillaires avec un diamètre interne aussi faible que possible est très souhaitable en électrophorèse capillaire car l'efficacité de séparation obtenue est nettement supérieure avec les capillaires de plus petit diamètre. Ceci est principalement dû au fait que l'élargissement des bandes en électrophorèse capillaire est en grande partie dû à la convexion thermique créée par effet Joule a l'intérieur du capillaire quand un courant électrique passe dans le capillaire. Selon la loi d'Ohm, la quantité de chaleur due à l'effet Joule produite à l'intérieur du capillaire est directement proportionnelle au diamètre interne du tube capillaire, ainsi plus faible est le diamètre du tube, plus faible est l'échauffement, donc plus grande est l'efficacité de séparation.
Selon la présente invention, il est possible de travailler avec des capillaires d'un diamètre interne pouvant descendre jusqu'à 5 à 25 μm car l'élément optique utilisé pour la focalisation de la lumière d'excitation et la collecte de la fluorescence émise peut avoir une ouverture numérique élevée permettant un placement très proche par rapport au capillaire, comme indiqué précédemment, de sorte que la sensibilité ne diminue pas.
Il semble que les performances étonnantes du procédé selon l'invention proviennent de la combinaison des raisons suivantes :
- la fluorescence est détectée du côté de l'échantillon qui est excité, donc là où elle est la plus intense,
- elle est détectée dans l'axe ou les diffusions Raman et Rayleigh sont les plus faibles, ce qui augmente le rapport signai/bruit,
- la lumière émise peut être recueillie avec des lentilles optiques avant une distance focale de moins de 1 mm, par exemple 330 μm, (au lieu de la valeur d' environ 1 cm imposée par les montages orthogonaux) et une plus grande ouverture numérique, ce qui améliore le signal reçu.
L'utilisation d'un seul dispositif optique et donc d'un seul système de déplacement XYZ pour focaliser la lumière incidente sur le capillaire et simultanément concentrer la lumière émise sur le dispositif de collecte est avantageuse tant du point de vue de la structure simplifiée du dispositif complet que de la limitation des manipulations à effectuer.
Il est en outre à noter que le dispositif complet selon la présente invention occupe un espace de l'ordre de 30 x 10 cm alors que ceux de la technique antérieure ont un encombrement important, par exemple celui décrit dans S. Wu and N. J. Dovichi, J. Chrom. 480 (1989), 141 qui constitue un banc optique de 120 x 180 cm.
Un dispositif de mise en oeuvre du procédé décrit ci- dessus, comprend une source de rayon laser, un diviseur de faisceau envoyant le faisceau laser à travers un dispositif optique de concentration sur un capillaire d' électrophorèse de diamètre intérieur inférieur ou égal à 100 μm, un filtre passe-haut ne laissant passer que la lumière due à la fluorescence vers un photodétecteur qui est situé dans l'axe du faisceau incident en amont du diviseur de faisceau par rapport au faisceau incident.
En dehors de l'analyse d'acides aminés marqués par des composes fluorescents qui est effectuée de manière classique par la technique d' électrophorèse capillaire à détection par fluorescence, le procédé selon la présente invention permet de réaliser, en raison de sa très grande sensibilité, des analyses qui n'ont jusqu'à présent pas été réalisées par cette technique associant l''lectrophorèse capillaire et la détection par fluorescence. On citera par exemple dans les domaines de la biologie moléculaire l'analyse de peptides marques par des composes fluorescents, l'analyse de matêrialgenetique, la recherche et le dosage de composes spécifiques permettant un diagnostic- médical tant chez l'homme que chez l'animai, les analyses de contrôle de qualité de produits pharmaceutiques (degré de pureté, produits de dégradation, stabilité des ingrédients actifs et des excipients), la détermination de paramètres pharmacocinétiques, l'identification et le dosage de métabolites obtenus à partir de médicaments dans des échantillons biologiques, etc..., et même l'analyse d'ions (aminés et/ou cations) par utilisation d'une détection indirecte de la fluorescence. De telles applications seront décrites plus en détail dans les exemples qui suivent.
L'invention va maintenant être décrite plus en détail en référence aux dessins annexés dans lesquels :
la figure 1 est une représentation schématique d'un dispositif de mise en oeuvre du procédé selon l'invention,
la figure 2 est une représentation schématique d'un autre mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, utilisant un détecteur de la fluorescence émise différent,
les figures 3a et 3b sont respectivement des schémas montrant les principaux sens d'émission de la fluorescence et des diffusions Raman et Rayleigh,
les figures 4a et 4b illustrent l'impact du faisceau laser sur le capillaire,
les figures 5a à 5d sont des exemples des électrophαrαgrammes obtenus pour différents acides aminés,
la figure 6 iliustre la détection d'un nonapeptide (bradykinine).
la figure 7 illustre l'analyse de matériel génétique, la figure 3 illustre la détection de la substance P, hormone largement répandue chez les mammifères, les figures 9a et 9b montrent - la détection d' un antibiotique et de ses produits de dégradation à partir d'un échantillon dans l'eau et dans l'urine,
la figure 10 illustre l'analyse d'ions utilisant la détection par fluorescence indirecte.
Un tube capillaire 1 d' électrophorèse, d'un diamètre intérieur inférieur ou égal à 100 μm, par exemple de 50 μm ou 25 μm ou même de 5 μm, est monté de manière classique aux bornes d'une source 2 d'énergie haute tension Cde 0 à 30 kV, et de 0 à 300 μA).
Une source 3 de rayon laser envoie un faisceau laser 4 sur un diviseur chromatique 5 de faisceau qui dirige le faisceau 4 dans un dispositif optique de concentration de la lumière 6, qui focalise le faisceau 4 sur la zone de détection du capillaire 1. Le diviseur chromatique 5 est choisi de façon à réfléchir la lumière ayant la longueur d'onde d'excitation de la fluorescence et à laisser passer la lumière de longueur d'onde supérieure correspondant à la fluorescence. La lumière émise par fluorescence recueillie par le dispositif optique 6 (par exemple une lentille ou un système de lentilles) traverse le diviseur chromatique 5 et va frapper un photodétecteur 7. Entre le diviseur 5 et le photodétecteur 7, on place avantageusement un filtre passe-haut 8 à longueur d' onde de coupure légèrement supérieure à la longueur d' onde de coupure du diviseur chromatique pour achever d'éliminer la lumière ne correspondant pas a la fluorescence et un filtre d'interférence 9 pour éliminer la lumière résiduelle provenant du laser.
Le choix de la longueur d' onde du faisceau laser et des longueurs d' onde de coupure des éléments 5 et 8 est bien entendu fonction de la fluorescence à détecter. On peut toutefois mentionner que pour l'analyse des acides aminés qui se fait avec transformation des composes à rechercher en dérives de fluαrescêine, on utilise avantageusement un laser a l'ion argon refroidi à l'air dont on isole la raie a 488 nm que l'on envoie sur un miroir dichroïque (diviseur de faisceau) qui réfléchit les longueurs d' onde inférieures à 510 nm, avec un filtre passe-haut de 520 nm. Un système de lentilles de grossissement 40x et ayant une ouverture numérique de 0,75 focalise le faisceau laser sur un capillaire en silice fondue de 25 μm de diamètre intérieur par exemple. Le faisceau laser utilisé a un impact de 5 μm sur le capillaire, ce qui permet d'utiliser des capillaires dont le diamètre intérieur peut descendre jusqu'à 5 μm. Le capillaire peut contenir un tampon ou être garni de gel.
Le photodètecteur est un tube photomultiplicateur relié à un convertisseur 10 intensité-tension dont le signal de sortie est transmis à travers un filtre 11 à un enregistreur à papier 12 (figure 1).
On a constate lors d'essais avec des capillaires très fins (5 μm) que l'on obtient des vitesses d'analyse importantes sans que la sensibilité n'en pâtisse. De ce fait il apparaît comme tout à fait approprié d'utiliser cette technique à la place de l'électrophorèse classique sur plaques pour le séquençage d'ADN ou de protéines.
Comme photodètecteur, on peut également utiliser un dispositif à couplage de charge (CCD) dont on sait qu'il peut suivre simultanément plusieurs radiations d'émission, donc plusieurs fluorophores. Ceci est très avantageux lors du séquençage d'ADN qui libère quatre bases auxquelles on peut associer quatre fluorophores différents. Dans ce cas, après le filtre passe-haut 8, est place un polychromateur 20, une tête de caméra 21, son electroniαue associée 22 qui est reliée à un dispositif de visualisation et d'enregistrement 24, ainsi qu'a un ordinateur (ffgure 2). Le fonctionnement d'un tel dispositii tel qu'appliqué a l'électrophorèse capillaire avec détection de fluorescence en montage orthogonal est décrit par Yung-Fong Cheng et al dans Applied Spectroscopy 44, n 5 (1990) p.755-765. Mais la sensibilité obtenue n'est que 10-11M, â comparer avec les résultats selon la présente invention.
Les figures 3a et 3b montrent respectivement l'émission de fluorescence 16 pour la zone excitée 15, et les émissions Raman et Rayleigh: intensité moyenne αrthogonalement, flèches 17; intensité forte, flèches 18; et intensité faible dans la direction de la fluorescence, flèches 19.
Les figures 4a et 4b montrent l'impact d'un faisceau laser sur des capillaires de diamètre intérieur de 75 μm et 25 μm respectivement. On voit que pour une même longueur de capillaire de 10 mm, la quantité détectable est d'autant plus faible que le diamètre intérieur est faible. Il importe donc d'avoir un point d'impact très localisé tout en préservant la qualité de la détection.
Exemples d'application
Exemple 1
On analyse des échantillons contenant de la phénylalanine 5 x 10-13M, de l'arginine 10-13M, de la cystéine 8,25 x 10-11M et de la glycine 1,3 x 1012M en utilisant le dispositif décrit ci-dessus avec un capillaire de 25 μm, on obtient des enregistrements sur papier dont les figures 5a à 5d sont des reproductions. Exemple 2
On fait réagir de la bradykinine (un nonapeptide de formule Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg) avec du fluoresceine—isothiαcyanate a l'extrémité amino à une concentration de 7 x 10-3t dans un tampon borate 50 mM pH9, on l'introduit dans un tube capillaire de 60 cm de longueur et 75 μm de diamètre monté dans le dispositif décrit précédemment et en applique une tension élevée
(environ 30 kV). La figure 6 est une reproduction de l'enregistrement sur papier obtenu, le pic correspondant a la bradykinine étant indique par une flèche. Exemple 3
Dans cet exemple, on monte dans le dispositif un capillaire de 40 cm de longueur et de 50 μm de diamètre rempli d'un gel de polyacrylamide. Une petite portion d'un échantillon de matérial génétique est introduite dans le capillaire en solution dans du tampon 1 X TBE, par injection électrocinétique. La durée de l'injection est de 5 secondes et la tension appliquée est de 200 Y/cm. Comme le montre la figure 7 qui reproduit l'enregistrement sur papier obtenu, un oligonucléotide 21-mer à une concentration de 10-11M est nettement séparé de ses voisins les plus proches 20-mer et 22-mer.
Exemple 4
Ceci est un exemple Illustratif de ce que la présente technique permet de réaliser en matière de diagnostic médical et vétérinaire.
La substance P est une hormone largement répandue chez les mammifères et sa concentration dans les fluides biologiques permet certains diagnostics. Ici le fluide biologique examiné est un dialysat prélevé par une sonde de microdialyse placée dans la substantia nigra
(striatum) d'un rat. D'une manière similaire à celle utilisée dans l'exemple 2, la substance P est marquée au fluorescéine-isocyanate et est ensuite analysée dans un capillaire de 50 cm de longueur et 75 μm de diamètre dans un tampon de borate 50 mM pH9 sous une tension de
20 kV. La figure 8 est une reproduction de l'enregistrement sur papier obtenu.
Exemple 5
Le procédé d'analyse selon la présente invention permet d'analyser le degré de pureté, les produits de dégradation et la stabilité de produits pharmaceutiques, ici d'un antibiotique.
On analyse une solution d' ampicilline dans de l'eau en marquant l'a'picilline comme décrit dans l'exemple 2. La figure 9a est une reproduction de l'enregistrement sur papier obtenu montrant la présence d'ampicilline (1) et de produits de dégradation et/ou d'impuretés de synthèse (2) en plus faibles quantités.
La même technique peut s'appliquer à des études pharmacocinètiques, par analyse d'échantillons d'urine ou d'autres fluides biologiques.
La figure 9b illustre l'analyse ainsi faite de l'ampicilline dans un échantillon d'urine, où 1 désigne l'ampicilline, 2 les métabolites et 3 les produits inconnus.
Dans les deux cas (figure 9a et figure 9b), les identifications des différents produits sont faites par comparaison de témoin blanc (eau ou urine), de réactif de marquage témoin et dans le cas d' une étude pharmacocinétique, d'urine au temps zéro (avant administration de l'ampicilline).
Exemple 6
On analyse une solution aqueuse contenant les anions suivants Br-, Cl-, SO4-, NO2-, NO2-, F- et CO3- en faisant passer cette solution dans un capillaire contenant un tampon ayant une concentration d'environ 10-8M de fluorescèine, ce tampon fournissant une fluorescence permanente seulement interrompue par le passage des ions non fluorescents.
La figure 10 reproduit l'enregistrement sur papier obtenu, montrant une séparation nette des différents anions, à des concentrations aussi faibles que 10-9M.
Les exemples précédents ont ete donnes a titre illustratif des applications possibles de la présente invention, applications qui n'avaient jamais été envisagées pour la combinaison électrophorèse capillaire - détection par fluorescence et qui ne sont réalisables en pratique que grâce a l'utilisation du procédé et du dispositif utilisant un capillaire d'électrophorèse de moins de 100 μm, une illumination par laser et une détection colinèaire de la fluorescence.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Procédé d'analyse par électrophorèse capillaire avec détection par fluorescence, dans lequel
on fait passer dans un capillaire d' électrophorèse de diamètre intérieur inférieur ou égal à 100 μm un échantillon contenant les produits à analyser marqués au besoin par un agent de fluorescence,
on utilise pour exciter la fluorescence un faisceau laser focalisé sur le capillaire par un dispositif de concentration de la lumière et
on détecte la fluorescence de manière colinèaire, soit dans l'axe d'illumination par le faisceau laser et du même côté du capillaire, à l'aide du dispositif de concentration de la lumière utilisé pour focaliser le faisceau laser et d'un photodètecteur.
2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le capillaire est garni de gel.
3.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le capillaire est rempli d' un tampon.
4.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le photodétecteur est un tube phαtomultiplicateur.
5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le photodètecteur est un dispositif à couplage de charge,
6.- Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 a 5, pour la recherche de substances naturelles dans les fluides biologiques.
7.- Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 a 5, pour des études pharmacσcinétiques ou de qualité de produits pharmaceutiques.
8.- Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 a 5, pour le séquençage d'ADN.
9.- Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour l'analyse d'ions.
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