FR2671407A1 - Procede d'analyse par electrophorese capillaire avec detection par fluorescence, et dispositifs de mise en óoeuvre. - Google Patents

Abstract

Procédé d'analyse par électrophorèse capillaire avec détection par fluorescence, dans lequel on fait passer dans un capillaire d'électrophorèse de diamètre intérieur inférieur ou égal à 100 mum un échantillon contenant les produits à analyser marqués au besoin par un agent de fluorescence, on utilise pour exciter la fluorescence un faisceau laser focalisé sur le capillaire par un dispositif de concentration de la lumière et on détecte la fluorescence de manière colinéaire, soit dans l'axe d'illumination par le faisceau laser et du même côté du capillaire, à l'aide du dispositif de concentration de la lumière utilisé pour focaliser le faisceau laser et d'un photodétecteur. Un dispositif de mise en œuvre du procédé est également décrit et représenté sur la figure 1.

Description

L'invention concerne un procédé d'analyse par électrophorèse capillaire avec détection par fluorescence, et des diypositifs permettant de le mettre en oeuvre.

L'électrophorèse capillaire est une technique de séparation puissante qui permet de détecter la présence de très faibles quantités de substances dans des zones de détection de très faible volume ;cf. J. W. Jorgenson and K. D. Lukacs, Anal. Chem. 53, 1298-1302, 1981 et N.

A. -Guzman, L. Hernandez and P. G. Hoebel, Biopharm.

Nanuf., 2 (1989), 22). La migration electrophorétique se fait dans un capillaire rempli d'un tampon essentiellement aqueux ou dans un capillaire garni de gel, les substances étant dissoutes dans une solution tamponnée.

Plusieurs modes de détection (spectrometrie Uv, ampérométrie, conductométrie, ... > peuvent être utilisés EW. G. Kuhr, Anal. Chem. 62, 1990 (403-R)) mais la détection par fluorescence s'est révélée être particulièrement sensible ER. T. Kennedy, K. D. Oates,
B. R. Cooper, B. Nickerson and J. W. Forgenson, Science, 246 (1989) 57]. La fluorescence est la propriété que possèdent certaines substances d'émettre, lorsqu'elles sont excitées par une lumière d'une certaine longueur dtonde, un rayonnement de longueur d'onde supérieure à celle des rayons incidents.Les substances qui ne possèdent pas de fluorescence naturelle peuvent toutefois être détectées si elles ont préalablement été marquées par un agent de fluorescence, par exemple la fluorescéine pour n'en citer qu'un.

La sensibilité de la détection par fluorescence vient du fait que l'émission de fond chors fluorescence) est faible de sorte qu'il se produit un changement important de l'émission provenant soit de fluorochromes soit de fluorescence native. Ceci contraste avec les phénomenes classiques d'absorption en UV ou en visible où la différence d'absorption entre la solution tamponnee et le produit analysé est faible. En outre du fait de l'existence de deux longueurs d'onde précises (énergie d'excitation et énergie d'émission), la sélectivité de la détection est élevée.

Toutefois pour certaines applications comme les recherches de traces au sein d'échantillons biologiques et le séquençage d'ADE, il est souhaitable de pouvoir encore améliorer la sensibilité, la vitesse et la sélectivité de l'analyse. Cette amélioration de sensibilité permet dans certains cas d'analyse de fragments d'ADN d'éviter d'utiliser la technique PCR CPolymerase Chain Reaction: amplification en chai ne par réaction) qui donne de bons résultats mais au prix d'une augmentation de la complexité de l'analyse. I1 a été suggéré d'utiliser un faisceau laser pour exciter la fluorescence, ainsi FR-A- 2 558 262 décrit l'utilisation d'un faisceau laser pour l'analyse par électrophorèse classique de fragments d'ADN.

Dans tous les systèmes de détection par fluorescence utilisés avec l'électrophorèse capillaire, la fluorescence est recueillie soit dans le prolongement des rayons incidents soit orthogonalement E (cf.

FR-A- 2 558 262 ainsi que R. K. Gassmann, J. E. Kuo and
R. Zare, Science, 230 (1985), 813; B. Wickerson and G.

W. Jorgenson, J. High Res., 11, (1988), 533; et Y. F.

Cheng and N. J. Dovichi, Science, 242 (1988), 52). I1 est donc nécessaire d'utiliser deux systèmes optiques, l'un pour focaliser les rayons incidents sur le capillaire et l'autre pour recueillir la lumière émise et la focaliser sur un tube photomultiplicateur par exemple.

Pour des raisons d'encombrement spatial, en particulier dans les montages orthogonaux, il n'est pas possible de placer les systèmes optiques très près du capillaire et la distance qui les sépare de celui-ci est de l'ordre de 1 cm, avec pour inconvenients principaux une faible collecte de la lumière émise en fluorescence alors qu'on recueille en plus la lumière produite par les diffusions Raman et Rayleigh, d'où un rapport signalSbruit faible. Les fibres optiques qui sont parfois utilisées permettent d'approcher du capillaire mais on constate qu'elles ne donnent pas une bonne sensibilité (10-'5 environ) (E. K. Gassmann et al,
Science, op. cit. et US-A- 4 675 300).

L1 invention remédie à ces inconvénients en fournissant un procédé d'analyse par électrophorése capillaire avec détection de fluorescence, dans lequel
on fait passer dans un capillaire d'électrophorèse de diamètre intérieur inférieur ou égal à 100 ym un échantillon contenant les produits à analyser marqués au besoin par un agent de fluorescence,
on utilise un faisceau laser focalisé sur le capillaire à l'aide d'un dispositif de concentration de la lumière pour exciter la fluorescence, et
on détecte la fluorescence de façon colinéaire, å l'aide du dispositif de concentration utilisé pour focaliser le faisceau laser et d'un photodétecteur.

L'expression "de façon colinéaire" signifie que la détection de la lumière émise se fait dans l'axe d'illumination et du même côté du capillaire.

Les expériences effectuées montrent de façon inattendue qu'il est possible d'obtenir une sensibilité de détection bien meilleure qu'en utilisant un laser avec un montage orthogonal. En effet il s'avère que les limites de détection en concentration sont de 10- 13! a 10-14X et celles de détection en masse sont de 60 à 200 molécules dans le capillaire, en fonction du produit détecté. Le fluorescéine-thioisocyanate, utilisé de maniée classique comme étalon de référence, a méme été détecté à 6 x l0-1M, ce qui correspond a peu près au passage de 4 molécules dans le capillaire. On atteint donc les limites de détection physiques.Les autres systèmes de détection basés sur des systèmes orthogonaux ont des sensibilités de 3 ordres de grandeur (1000 fois) plus faibles que celui basé sur un arrangement colinéaire selon l'invention. Dans E. K. Gassmann et al,
Science, op. cit., elle est de 10-e M; dans B. Nickerson and G. W. Jorgenson, J. Hish Res., op. cit., elle est de 10-l M; et H. Swerdlow and R. Gesteland, Nucleic Acid
Research, 18 (1990) 1415 donnent une valeur de 10-11 M.

Par ailleurs on sait que le fait d'utiliser des capillaires de faible diamètre intérieur permet certes une plus grande vitesse d'analyse d'un mélange de produits, propriété intéressante dans beaucoup d'applications comme le contrôle qualité ou le séquençage d'ADN, mais la sensibilité est alors réduite du fait des difficultés de collecte du rayonnement incident provenant du capillaire et surtout de la faible quantité détectable. C'est pourquoi les capillaires utilisés jusqu'ici ont un diamètre interne d'au moins 75 ou ou 100 pm pour conserver une bonne sensibilité, alors que les résultats selon la présente invention ont été obtenus avec des capillaires de 50 pm, de 25 Hm ou même de moins de 10 m de diamètre intérieur, car il est possible d'avoir une ouverture numérique élevée du fait que le dispositif de concentration est très proche du capillaire et que le point d'impact du faisceau laser permet une diminution du diamètre du capillaire sans que la sensibilité n'en pâtisse.

Il semble que les performances étonnantes du procédé selon l'invention proviennent de la combinaison des raisons suivantes
- la fluorescence est détectée du côté de l'échantillon qui est excité, donc là ou elle est la plus intense,
- elle est détectée dans l'axe où les diffusions
Raman et Rayleigh sont les plus faibles, ce qui augmente le rapport signal/bruit,
- la lumière émise peut être recueillie avec des lentilles optiques ayant une distance focale de moins de 1 mm, par exemple 330 pm, (au lieu de la valeur d'environ 1 cm imposée par les montages orthogonaux) et une plus grande ouverture numérique, ce qui améliore le signal reçu.

L'utIlisation d'un seul dispositif optique et donc d'un seul système de déplacement XYZ pour focaliser la lumière incidente sur le capillaire et simultanément concentrer la lumière émise sur le dispositif de collecte est avantageuse tant du point de vue de la structure simplifiée du dispositif complet que de la limitation des manipulations à effectuer.

Il est en outre a noter que le dispositif complet selon la présente invention occupe un espace de l'ordre de 30 x 10 cm alors que ceux de la technique antérieure ont un encombrement important, par exemple celui décrit dans S. Wu and N. J. Dovichi, J. Chrom. 480 C1989 > ,' 141 qui constitue un banc optique de 120 x 180 cm.

L'invention fournit donc un dispositif de mise en oeuvre du procédé décrit ci-dessus, comprenant une source de rayon laser, un diviseur de faisceau envoyant le faisceau laser à travers un dispositif optique de concentration sur un capillaire d'électrophorèse de diamètre intérieur inférieur ou égal a 100 pm, un filtre passe-haut ne laissant passer que la lumière due à la fluorescence vers un photodétecteur qui est situé dans l'axe du faisceau incident en amont du diviseur de faisceau par rapport au faisceau incident
L'invention va maintenant être décrite plus en détail en référence aux dessins annexés dans lesquels
la figure 1 est une représentation schématique d'un dispositif de mise en oeuvre du procédé selon l'invention,
la figure 2 est une représentation schématique d'un autre mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, utilisant un détecteur de la fluorescence émise différent,
les figures 3a et 3b sont respectivement des schémas montrant les principaux sens d'émission de la fluorescence et des diffusions Raman et Rayleigh,
les figures 4a a 4d sont des exemples des électrophorogrammes obtenus pour différents acides aminés, et
les figures 5a et 5b illustrent l'impact du faisceau laser sur le capillaire.

Un tube capillaire 1 d'électrophorèse, d'un diamètre intérieur inférieur ou égal à 100 pm, par exemple de 50 ou ou 25 ym ou même de 5 pm, est monté de manière classique aux bornes d'une source 2 d'énergie haute tension (de 0 à 30 kV, et de o a 300 pA).

Une source 3 de rayon laser envoie un faisceau laser 4 sur un diviseur chromatique 5 de faisceau qui dirige le faisceau 4 dans un dispositif optique, de concentration de la lumière 6, qui focalise le faisceau 4 sur la zone de détection du capillaire 1. Le diviseur chromatique 5 est choisi de façon à réfléchir la lumière ayant la longueur d'onde d'excitation de la fluorescence et à laisser passer la lumière de longueur d'onde supérieure correspondant à la fluorescence. La lumière émise par fluorescence recueillie par le dispositif optique 6 (par exemple une lentille ou un système de lentilles) traverse le diviseur chromatique 5 et va frapper un photodétecteur 7.Entre le diviseur 5 et le photodétecteur 7, on place avantageusement un filtre passe-haut 8 à longueur d'onde de coupure légèrement supérieure à la longueur d'onde de coupure du diviseur chromatique pour achever d'éliminer la lumière ne correspondant pas a la fluorescence et un filtre d'interférence 9 pour éliminer la lumière résiduelle provenant du laser.

Le choix de la longueur d'onde du faisceau laser et des longueurs d'onde de coupure des éléments 5 et 8 est bien entendu fonction de la fluorescence à détecter. On peut toutefois mentionner que pour l'analyse des acides aminés qui se fait avec transformation des composes a rechercher en dérivés de fluorescéine, on utilise avantageusement un laser à l'ion argon refroidi à l'air dont on isole la raie à 488 nm que l'on envoie sur un miroir dichroïque (diviseur de faisceau) qui réfléchit les longueurs d'onde inférieures à 510 nm, avec un filtre passe-haut de 520 nm. Un système de lentilles de grossissement 40x et ayant une ouverture numérique de 0,75 focalise le faisceau laser sur un capillaire en silice fondue de 25 pm de diamètre intérieur par exemple.Le faisceau laser utilisé a un impact de 5 Hm sur le capillaire, ce qui permet d'utiliser des capillaires dont le diamètre intérieur peut descendre jusqu'à 5 Hm. Le capillaire peut contenir un tampon ou être garni de gel.

Le photodétecteur est un tube photomultiplicateur relié à un convertisseur 10 intensité-tension dont le signal de sortie est transmis à travers un filtre 11 à un enregistreur à papier t2 (figure 1).

Les figures 4a a 4d sont des reproductions des enregistrements sur papier lors de l'analyse d'échantillons contenant de la phénylalanine 5 x 10-1 3 (figure 4a), de l'arginine 10-l3M (figure 4b), de la cystéine 8,25 x 10-llM (figure 4c) et de la glycine 1,3 x 10-2K (figure 4d), utilisant le dispositif décrit ci-dessus (avec un capillaire de 25 pm).

On a constaté lors d'essais avec des capillaires très fins (5 m) que l'on obtient des vitesses d'analyse importantes sans que la sensibilité n'en pâtisse. De ce fait il apparaît comme tout à fait approprié d'utiliser cette technique à la place de l'électrophorése classique sur plaques pour le séquençage d'ADN ou de protéines.

Comme photodétecteur, on peut également utiliser un dispositif à couplage de charge (CCD) dont on sait qu'il peut suivre simultanément plusieurs radiations d'émission, donc plusieurs fluorophores Ceci est très avantageux iors du séquençage d'ADN qui libère quatre bases auxquelles on peut associer quatre fluorophores différents.Dans ce cas, après le filtre passe-haut 8, est placé un polychromateur 20, une tête de caméra 21, son électronique associée 22 qui est reliée à un dispositif de visualisation et d'enregistrement 24, ainsi qu a un ordinateur (figure 2). Le fonctionnement d'un tel dispositif tel qu'appliqué a l'électrophorése capillaire avec détection de fluorescence en montage orthogonal est décrit par Yung-Fong Cheng et al dans
Applied Spectroscopy 44, n 5 ( p. 755-765. Mais la sensibilité obtenue n'est que 10-1lM, à comparer avec les résultats selon la présente invention.

Les figures 3a et 3b montrent respectivement l'émission de fluorescence 16 pour la zone excitée 15, et les émissions Raman et Rayleigh: intensité moyenne orthogonalement, flèches 17; intensité forte, flèches 18; et intensité faible dans la direction de la fluorescence, flèches 19.

Les figures 5a et 5b montrent l'impact d'un faisceau laser sur des capillaires de diamètre intérieur de 75 pm et 25 pm respectivement. On voit que pour une même longueur de capillaire de 10 mm, la quantité détectable est d'autant plus faible que le diamètre intérieur est faible. Il importe donc d'avoir un point d'impact très localisé tout en préservant la qualité de la détection.

Claims (10)

REVENDICATIONS

1.- Procédé d'analyse par électrophorése capillaire avec détection par fluorescence, dans lequel

on fait passer dans un capillaire d'électrophorése de diamètre intérieur inférieur ou égal a 100 pm un échantillon contenant les produits a analyser marques au besoin par un agent de fluorescence,

an utilise pour exciter la fluorescence un faisceau laser focalisé sur le capillaire par un dispositif de concentration de la lumière et

on détecte la fluorescence de manière colinéaire, soit dans l'axe d'illumination par le faisceau laser et du même côté du capillaire, à l'aide du dispositif de concentration de la lumière utilisé pour focaliser le faisceau laser et d'un photodétecteur.

2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le capillaire est garni de gel.

3.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le capillaire est rempli d'un tampon.

4.- Procédé selon l'une quelconque des revendicafions 1. à 3, caractérisé en ce que le photodétecteur est un tube photomultiplicateur.

5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le photodétecteur est un dispositif à couplage de charge.

6.- Dispositif de mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une source de rayon laser, un diviseur de faisceau envoyant le faisceau laser à travers un dispositif de concentration sur un capillaire d'électrophorése de diamètre intérieur inférieur ou égal à 100 pm, un filtre passe-haut- ne laissant passer que la lumière due d la fluorescence vers un photodétecteur et situé dans l'axe du faisceau incident en amont du diviseur de faisceau par rapport au faisceau incident.

7.- Dispositif selon la revendication 6, caractérisé en ce que le capillaire est garni de gel.

8.- Dispositif selon la revendication 6, caractérise en ce que le capillaire est rempli d'un tampon.

9.- Dispositif selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le photodétecteur est un tube photomultiplicateur.

10.- Dispositif selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérise en ce que le photodétecteur est un dispositif à couplage de charge.