WO1992006379A1

WO1992006379A1 - Method of immunological quantitative analysis

Info

Publication number: WO1992006379A1
Application number: PCT/JP1991/001373
Authority: WO
Inventors: Susumu Osawa; Kazunori Shibata; Minoru Takase; Takayuki Kohno
Original assignee: Idemitsu Petrochemical Co., Ltd.
Priority date: 1990-10-09
Filing date: 1991-10-09
Publication date: 1992-04-16
Also published as: EP0504432A4; EP0504432A1

Description

明細書免疫学的定量分析方法

[技術分野]

本発明は、免疫学的定量分析方法に関し、特に免疫学的検査の測定濃度領域の拡大、高感度化、高速度化及び全自動化を図ることのできる免疫学的定量分析方法並びに免疫学的検査の測定可能な濃度領域の拡大、検体の稀釈操作回数の低減及び測定精度の向上を図ることのできる免疫学的定量分析方法に関する。

[背景技術]

近年、医療分野においては、病気の早期発見等を目的として、体液中の微量成分の定量分析が頻繁に行なわれている。

例えば、血液中の微量成分の定量が行なわれているが、血液中に含まれる体液戍分はその濃度が n g (ナノグラム） Z m l オーダ一と極めて微量なものが多く、これらの微量成分を定量的に分析することは医療分野における重要な課題となっている。

従来、血液微量成分の測定には、放射性免疫測定法（R I A法）、酵素免疫測定法（ E I A法）あるいはラテックス凝集免疫測定法 ( L I A法）などの免疫学的手法が用いられてきた。

ここで、放射性免疫測定法（R I A法）は、放射性同位元素でラベルした抗体を用いて抗原一抗体反応を行なわせ、放射線量より抗原の濃度を求める方法である。

酵素免疫測定法（E I A法）は、酵素でラベルした抗体を用いて抗原一抗体反応を行なわせ、酵素反応による発色の程度により抗原の濃度を求める方法である。

ラテックス凝集免疫測定法（ L I A法）は、 1965年に Singerと Plotzらによって開発された方法であり、抗体を固定してなる不溶性担体粒子（ラテックス粒子）を用いて抗原—抗体反応を行なわせ、ラテックス粒子の凝集を生じさせて、濁度から抗原の濃度を求める - - 方法である。

しかしながら、上述した^来の血液微量成分の免疫学的定量分析法には、以下に示す問題がある。

すなわち、放射性免疫測定法（R I A法）は、感度がよく精度が高いものの、放射線を使用するため安全性の面で問題があり、また保守，管理上細心の注意を払う必要がある上、試薬の寿命が短いなど、取扱いが非常に面倒であった。

酵素免疫測定法（E I A法）は、 R I A法と同様に、感度が良く精度が高いものの、酵素を用いているため試薬の調製に時間と労力を要し、酵素の保管，保存の面でも細かい配慮を必要とし、測定時間も 4 5分〜数時間と長時間を要するという問題がある。

ラテックス凝集免疫測定法（ L I A法）は、濁度を目視法によつて判断するものであるため、半定量的であり、感度及び精度が不十分であるという問題がある。

ここで、 L I A法においては、濁度を光学的に測定する方法が提案されている ((l)Croatica Chemica Acto 42(1970) P457-466, (2) European Journal of Biochemistry Vol .20 No.4(1971) P553-560, (3)1画 nochemistry Vol.12 P349- 851(1975)参照）。し力し、この方法は、実験によると精度が悪く、また感度の面でも E I A法や R I A法に劣るという問題がある。

また、 L I A法において、ラテックス粒子の径を種々変えて測定する方法（特開昭 63-65369号）や、あるいは凝集したラテックス粒子を順々に管内流し光学的に測定する方法（特開眧 60-111963号）が提案されているが、これらの方法は、感度の向上を図ろうとすると、それに伴って全体の作業が煩雑化し、高速度化が図れないという問題がある。

一方、特開眧 56-151357号には、抗体を固定化した基板に被検液を接蝕させ、次いで抗体を固定した微粒子を反応させた後、基板上に捕捉された微粒子の数を計数することを特徴とする方法が開示されている。そして、基板上の異なる領域のそれぞれに異なる種類の抗体を固定することによって、同時多項目分折が可能である旨が記载されている。

しかしながら、特開眧 56 - 151357号には、抗体固定化基板としてスライドガラスを用いた例が示されているにすぎず、ディスクを用いる技術に関しては何ら開示されていない。スライドガラスを用いた場合には、スライドガス上への被検液の滴下、洗浄及び計測を自動的かつ迅速に行なうことが困難である。また、被検液はスライドガラス上に滴下されるだけで薄膜状に展蘭されないので、反応効率を高めることが困難である。さらに、抗体固定微粒子の計測手段として顕微鏡等を用いているため、計測の自動化及び高速化が著しく困難であるという問題がある。

さらに、特開昭 64 - 35373号には、上記特開眧 56 - 151357号に記載の方法において微粒子として蛍光ラテックスを使用し、計数手段として蛍光顕微鏡， T Vカメラ，画像処理装置を泪いることにより、計数の高感度化を図った技術が開示されている。

しかし、これらの計数手段は、光ディスク技術を利用した計数手段に比べ、計数の自動化，高速度化及び高感度化が困難であるという問題がある。

また、上記の各免疫学的測定方法においては、濃度既知の標準物質を用いて放射能強度，吸光度，濁度等を測定することによりあらかじめ検量線を作成しておき、未知濃度の検体を測定したときの測定値を検量線に当てはめ、それにより検体中の目的物質濃度を求めている。

しかし、上述した従来の免疫学的測定方法においては、作成される検量線はその性質上一本だけであり、この検量線による測定可能な濃度範囲は大きくても 2〜 3桁の範囲しかないため、 '臨床検査等で扱っている種々の濃度の検体をすベてカバ一することはできない。したがって、未知濃度の検体の測定を行なう場合、検体を測定可能 - - な濃度範囲になるまで何回も稀釈する必要があり、この稀釈操作が煩雑であり、時間面及びコスト面で不利であるという問題がある。しかも、稀釈操作に伴うピぺッティングの際に誤差の発生等が起き易いという問題がある。

また、一般に S Z N (信号 zノイズ）比は測定回数の平方根に比例して向上することが知られているが、上述した従来の免疫学的測定法においては検量線が一本であるため、一回の測定においては単一のデータしか得ることができず、測定精度の向上に限界があるという問題がある。

本発明は、上述した問題点にかんがみてなされたもので、第 1発明として、免疫学的検査の高感度化及び全自動化，高速度化を図ることのできる免疫学的定量分析方法を提供することを目的とする。また、本発明は、第 2発明として、免疫学的検査の測定可能な濃度領域の拡大、検体の稀釈操作回数の低減及び測定精度の向上を図ることのできる免疫学的定量分析方法を提供することを目的とする。

[発明の開示]

すなわち、第 1発明の免疫学的定量分析方法は、回転可能なディスク上の半径方向に形成した複数の流路のうち少なくとも 1 つの流路の一部又は全面に抗体（又は抗原）を固定し、ディスクの回転又は滴下により体液をディスク上に展開し、体液中の分析対象物である抗原（又は抗体）を、ディスク上に固定された抗体（又は抗原）に抗原一抗体反応により捕捉せしめた後、さらに該抗原（又は抗体）に、その抗原（爻は抗体）と特異的に反応する抗体（又は抗原）を固定してなる不溶性担体粒子を作用させ、前記抗原（又は抗体）により捕捉された不溶性担体粒子の数を、ディスクの半径方向に移動可能な光学読み取り装置を用いて、ディスクを回転させながら計数するようにしてあり、好ましくは、光学読み取り装置の光源を収束レ一ザ一光源とし、さらに好ましくは、不溶性担体粒子の粒子径を使用光源波長の 1 Z 5〜 1倍の大きさ、具体的には不溶性担体粒子の粒子怪を 0 . 1〜 5 mの大きさとしてある。

また、第 2発明の免疫学的定量分析方法は、固相上に測定可能な濃度領域が異なる複数の抗体（又は抗原）の固定領域を設け、この抗体（又は抗原）固定領域に該抗体（又は抗原）と特異的に反応する抗原（又は抗体）を含む試料を作用させて抗原（又は抗体）を抗原—抗体反応により捕捉せしめた後、さらに該抗原（又は抗体）と特異的に反応する抗体（又は抗原）を固定してなる不溶性担体粒子を作用させ、前記抗原（又は抗体）によって捕捉された不溶性担体粒子の数又はこの粒子数と相関する物理量を測定することにより、抗原（又は抗体）濃度を測定するようにしてある。また、好ましくは、濃度の異なる抗体（又は抗原）の溶液を用いて固相上の各領域に抗体（又は抗原）を固定せしめて、測定可能な濃度領域が異なる複数の抗体（又は抗原）を固定した領域を固相上に形成するように . してあり、不溶性担体粒子をラテックス粒子としてある。さらに、必要に応じ、固相として平板状の基板あるいは回転可能な円盤状の基板を用いた構成としてある。

なお、抗原とは、免疫応答（抗体産生）や免疫寛容を誘導し（免疫原性）、又は抗体と結合する活性を示す物質の総称をいう。

抗体とは、ある抗原に対して免疫性を獲得した個体が持つ、抗原特異的に働く抵抗性の実態の総称をいう。

[図面の簡単な説明]

図 1は第 1発明の免疫学的定量分析方法の手順を示す説明図、図 2は複数試料の同時分析を行なうための複数に区画されたディスクを示す平面図、図 3は分析装置の一例を示す構成図、図 4は光学的分折手段による測定の態様を示す図、図 5は蛍光強度を粒子数に換算する方法を示すグラフ、図 6は第 2発明の免疫学的定量分析方法の手順を示す説明図、図 7は抗体固定領域の態様を示す平面図、図 8 ( a ) は検量線を示すグラフ、図 8 ( b ) ， ( c ) は未知濃度の検体試料から抗原濃度を求める例を示した説明図、図 9は実施例 1 - - における検量線を表わすグラフ、図 1 0は実施例 1における検量線を表わすグラフ、図 1 1 は実施例 3で用いた抗原抗体反応形成部位

(F a b ' ) 2を示す図、図 1 2は実施例 3における検量線を表わすグラフ、図 1 3実施例 4 において作成した検量線を示すグラフである。

[発明を実施するための最良の形態]

以下、本発明を図面を参照しつつ詳細に説明する。なお、ここではディスク Z抗体 Z抗原/抗体 Ζ·不溶性担体粒子の構成をとる場合について説明する。

まず、第 1発明について説明する。

第 1発明

図 1は第 1発明の免疫学的定量分析方法の手順を示す説明図である。

第 1発明においては、抗体 2 0 0 を固定したディスク 1 0 0 (以下、抗体固定ディスクという）を使用する（図 1 (I) ) 。

ここで、ディスク 1 0 0の大きさ，厚さ，形状等は適宜選択され、特に制限されないが、試料の展開及びレーザー光等による分析に適するように、回転可能なものであることが必要であり、このような観点からすると円板状であることが好ましい。

また、図 2に示すように、ディスク 1 0 0に多数の突条 1 0 0 a を放射状に形成して多数の試料展開面 1 0 0 b及び抗体 2 0 0を固定した反応部 1 0 0 c を設けると、多数の試料の分析を同時に行なえる。

ディスク 1 0 0の形成材料としては、ポリカーボネート，ポリメチノレメタクリレート，ポリスチレン，ポリ塩化ビニル，ポリ酢酸ビニル，ポリウレタン，エポキシ樹脂等のプラスチック材料やガラス等の透明材料、あるいは光反射性の良い金属材料、その他シリコン単結晶のような無機材料等が挙げられるが、好ましくは、ポリ力一ボネート，ポリメチルメタクリレート等のプラスチックディスクで - - ある。このように基板を光透過性あるいは光反射性の良い材料で形成すると、レーザ一光等による光学的分析が可能となる。

ディスク 1 00に固定される抗体 20 0は、測定しょうとする抗原によって異なるが、例えば、測定しょうとする抗原をある免疫動物（例えば、兎，山羊，羊など）に投与して産生させたポリクロナ —ル抗体やモノクローナル抗体等が挙げられる。

抗体 2 00をディスク 1 00に固定するには、一般的な抗体固定方法における条件と同様の条件が採用される（酵素免疫反応法、石川栄治著、医学書院刊 1 9 8 7年参照）。

例えば、抗体の 0. 05 Mトリス緩衝食塩水（T B S) 溶液（ p H 8. 2 , 濃度 0. 5〜 1 0 gZm l ) あるいは 0. 05 M炭酸 • 重炭酸緩衝溶液（ P H 9. 6，濃度 0. 5〜： L O gZm l ) をディスク上に滴下し、 4 の温度下で一昼夜（あるいは 20〜 3 0 で 2時間）放置して、抗体 2 0 0をディスク 1 0 0上に物理的に吸着させればよい。

この場合、ディスク表面にスルホン基，アミノ基，カルボキシル基又はその誘導体等の官能基を有するディスクを用いることにより、抗体をディスク上に化学結合させることもできる（P.Tijssen荖、石川栄治監訳 "生化学実験法 1 1ェンザィムノアツセィ " 東京化学同人刊；岩崎辰夫，安東民衛著 "単クローン抗体ハイブリドーマと E L I S A" 講談社刊参照）。

なお、ディスク上には、後述する第 2 明のように、測定可能な濃度領域が異な^複数の抗体固定領域を設けることができ、これにより測定可能な濃度領域の拡大、検体の稀釈操作回数の低減及び測定精度の向上を図ることができる。

第 1発明においては、まず、上記抗体固定ディスク 1 00上で、試料中の抗原 30 0を抗原一抗体反応により捕捉せしめる（図 1 (II)) 。

ここで、分析対象とされる試料としては、抗原を含む液体であれば特に制限されない。例えば、血液，胸水，腹水，心臓水，関節水，尿等の体液を挙げることができる。

分析対象物である抗原は特に制限されないが、例えば、 C一反応性蛋白質（C R P) 、 α—フエトプロテイン（A F P) 、癌胎児性抗原（C EA) 等が挙げられる。ここで、 C R Ρとは C-reactive proteinの略であって、炎症性疾患や体内組緣の壊死があるような病態で著しく増量する血槳蛋白の一つであり、いわゆる急性相反応蛋白 acute phase proteins の代表的な成分である。

ディスク 1 00上で抗原一抗体反応を行なわせるには、例えば、抗体固定ディスク上に分折対象物である抗原 300を含んだ検体試料を適量（例えば 50 1程度）滴下し、ディスク 1 00を回転して、遠心力によって検体試料をディスク 1 0 0上に薄膜状に展開することによって、ディスク 1 0 0上に固定された抗体 200と検体試料中の抗原 30 0との間に効率よく抗原一抗体反応を行なわせることができる。この場合、抗原一抗体反応に要する時間は 1〜 5分程度の短い時間で済む。

抗原一抗体反応後、捕捉された抗原 3 0 0以外の残余の検体試料は、リン酸緩衝食塩水（P B S ) ( p H 7. 4) 、あるいはトリス緩衝食塩水（TB S ) (0. 0 5 M , p H 8. 2 ) 等を適量（例えば、 l m l程度）滴下した後、ディスク 1 0 0を回転して洗い流す _a 次いで、上記抗原—抗体反応後のディスク 1 0 0に、抗原 30 0 と特異的に反応する抗体 4 00を固定してなる不溶性担体粒子

50 0を作用さる（図 1 (111) ) 。

ここで、抗体 4 00を固定してなる不溶性担体粒子 500とは、不溶性担体粒子（ラテックス粒子）（例えば、プラスチック粒子、コロイド粒子等）に、分析対象物である抗原 30 0に対する抗体 400を、物理的あるいは化学的に吸着又は結合させて固定したものをいう。

この場合、ラテックス粒子は粒径が揃っていればよく、プラスチ - - ック微粒子（例えば、ポリスチレン等）、無機微粒子あるいは金属微粒子等のいずれであってもよい。

抗体を固定してなる不溶性担体粒子 5 0 0を得るには、具体的には、例えば、 T B Sを用いて p Hや塩濃度を調整した 1 . 0 %ラテックス水溶液に抗体を入れ、室温で 2時間放置して、ラテックス粒子に抗体を物理吸着させる。その後、遠心分離にかけた後上清を捨て、吸着されなかった抗体を除去し、沈殿部にリン酸緩衝食塩水 (P B S ) ( p H 7. 4 ) を注ぎ、再分散させて作製される（特開昭 62-267298号， Applied and Environmental Microbiology , Oct . 1988, P2345-2348参照）。

不溶性担体粒子 5 0 0は、蛍光性を有するもの、あるいは着色されたものであってもよい。この場合、蛍光性あるいは着色性を利用した分折が可能となる。なお、不溶性担体粒子 5 0 0 自体が蛍光物質で形成されている場合の他、不溶性担体粒子 5 0 0が蛍光材料でコ一ティングされている場合や蛍光物質が不溶性担体粒子 5 0 0に付着している場合も含まれる。なお、不溶性担体粒子 5 0 0の粒径については後述する。—

上記のようにして調製された抗体を固定してなる不溶性担体粒子 5 0 0を含んだ水溶液は、上述した抗原一抗体反応後のディスク 1 0 0に適量（例えば、 5 0 1 ) 滴下され、ディスク 1 0 0の回転によって展開されて、ディスク 1 0 0上に固定された抗体 2 0 0 に捕捉された抗原 3 0 0と再度抗原一抗体反応を起こし、不溶性担体粒子 5 0 0に @定された抗体 4 0 0を介して、不溶性担体粒子がディスク 1 0 0上に捕捉される（図 1 (111)) 。ディスク 1 0 0上に捕捉されなかった不溶性担体粒子 5 0 0は、上述した検体試料と同様の方法で洗い流される。このようにして、サンプルディスクが作製される。

次に、上記サンプルディスク上の抗原によって捕捉された不溶性担体粒子 5 0 0の数又は粒子数に相当する物理量を測定手段 6 0 0 - - で測定して、抗原 3 0 0の濃度を求める（図 1 ( IV) ) 。

ここで、粒子数等の測定手段 6 0 0としては、光学的測定手段が好ましい。光学的測定手段としては、反射率の変化，特定波長の光に対する吸収、蛍光強度あるいは傷光した光の偏光面の回転等の測定手段が例示される。

不溶性担体粒子の数を直接測定する場合には、光学的測定手段としてレ一ザ一を用いる。使用されるレ一ザ一源としては、一般に使用されている半導体レーザ一等をそのまま利用でき、不溶性担体粒子の大きさに応じて適当なレーザ一源が選択される。

光学的測定手段を具備した分析装置としては、例えば、図 3に示すような装置が使用される（特願平 1-92367号参照）。

同図において、 1 0 0はディスクであり、回転テーブル 2上に装着されている。ディスク 1 0 0の下部外周には、ディスク 1 0 0から落ちる試料を受けるための受け皿 6が配置され、ディスク 1 0 0 から落ちた試料が回収タンク 7に回収されるようになっている。モ —タ 8はディスク 1 0 0を回転させるためのものであり、能動制御回路 9はモータ 8の] |g動を制御するものである。ノズル 1 1 は、試料送り装置 1 2から送られる試料をディスク 1 0 0上に滴下する。光学式測定へッド 1 4 は、ディスク半径方向に延びる送りねじ軸 1 5に沿って往復移動する。モータ 1 6はヘッド 1 4 を駆動するためのものであり、駆動制御回路 1 7はモータ一 1 6の Sg動を制御する。

光学式測定へド 1 4'はレ一ザ一光の投光部と受光部を有し、図 4 ( a ) に示すように、投光部からの照射光 1 9 はハーフミラ一 2 0，レンズ 2 1 を経て収束光として試料展開面 1 0 0 b上の試料に照射され、試料から反射された反射光 2 2は受光部で受けられるようになつている。

なお、図 4 ( b ) に示すように、ディスクの裏面側から投射光 1 9 を照射するようにしてもよく、また、反射光でなく、透過光に - - よって分析を行なうようにしてもよい。これらの場合には回転テ一ブル 2を透明材料で形成するか、あるいは回転テーブル 2を取り払ラ。

信号処理装置 2 3は、ヘッド 1 4に信号を送り光源を点灯させる機能と、ヘッド 1 4で受光された光信号を処理し、分折する機能を有する。ディスプレイ装置 2 4は分析結果を画面表示し、記録装置 2 5は分析結果をプリントアウトして出力する。 C P U (中央処理装置） 2 7は、試料送り装置 1 2、躯動制御回路 9及び 1 7、信号処理装置 2 3等の制御を行ない、これらをプログラム通り作動させる。 C P U 2 7は、プログラムの操作装置 2 8と、プログラムの記億装置 2 9を有している。

上記構成からなる分析装置によれば、免疫学的定量分析の全ての工程をディスク上で行なうことができ、また、分析の全自動化を図ることができる。

不溶性担体粒子が蛍光を発するものである場合には、光学的測定手段としてフォトディテクタ一を用いる。この場合、フィルタ一を介在させることによって、特定波長（例えば、 3 9 7 n m， 4 7 2 n m , 5 7 7 n mなど）の蛍光強度を検出し（図 5 ( a ) ) 、その蛍光強度を粒子数に換算する（図 5 ( b ) ) 。

なお、蛍光ラテックスを用いた場合、入射光と異なる波長の光を測定することができるため、信号検出上有利であり、粒径の小さな不溶性担体粒子を使用できる。

上記の観点及び抗原一抗体の反応性からすると、不溶性担体粒子の粒径は 0 . l ~ 5 mの範囲内であることが好ましい。

計測した不溶性担体粒子の個数から抗原の濃度を求めるには、抗原濃度既知の試料を用いること以外は上述の場合と同様にし、抗原濃度と不溶性担体粒子の数との関係を求めてあらかじめ検量線を作成しておき、この検量線から抗原濃度を求めればよい。

次に、第 2発明について説明する。 - - 第 2発明

図 6は第 2発明の免疫学的定量分析方法の手順を示す説明図である。

なお、第 2発明において、抗体や抗原の種類、固相（基板）の形成材料、固相（基桉）への抗体，抗原の固定方法、分析対象とされる検体試料、分析対象物である抗原、抗体を固定してなる不溶性担体粒子等については、第 1発明と同様のものが使用される。

第 2発明の免疫学的定量分析方法においては、まず、固相上に測定可能な濃度領域が異なる複数の抗体固定領域を設ける。

ここで、固相としては抗体を固定しうるものであれば特に限定されないが、通常は基板が使用されている。例えば、図 6 ( I ) に示すように基板 1 0 1上に抗体 2 0 1が固定される。

ここで、基板 1 0 1の大きさ，厚さ，形状等は適宜選択され、特に制限されないが、平板状（プレート状）あるいは回転可能な円盤状（ディスク状）とするのが好ましい。平板状の基板は、電子顕微鏡等を用いた分析に適する。また、基板を回転可能な円盤状に形成すると、試料の展開及びレーザ一光等による分折が容易かつ自動的に行なえるので好ましい。

上記固相（基板）上に測定可能な濃度領域が異なる複数の抗体固定領域を設けるには、例えば、濃度の異なる抗体溶液を用い、これを基板上に滴下し、物理吸着あるいは化学吸着によつて固定する。滴下する抗体溶液の濃度はその抗体と特異的に反応する抗原により異なるが、一般的には 1 0 —2 1 0—マ g Z m lオーダ一の濃度のものが使用される。また、測定可能な濃度領域が異なる複数の抗体固定領域を設ける別の方法としては、活性度の異なる抗体を上記固定法により固定してもよい。

上記複数の抗体固定領域の形状、配列に関しては種々の態様が可能である。例えば図 7に示すように、各抗体固定領域 A〜Dの形状は円形（同図（ b ) ， ( d ) ， ( e ) ， ( f ) ) や矩形（同図（ a ) ， - -

( c ) ) とされる。また各抗体固定領域の §3列としては、長方形状の基板（プレート） 1 0 1 の長手方向に配列する場合（同図（ a ) ，

( b ) ) 、円盤状の基板（ディスク） 1 0 1 の半径方向に配列する場合（同図（ c ) ， ( d ) ) 、円盤状のディスクの円周方向に配列する場合（同図（ e ) ) 等が挙げられる。この場合、各領域 A〜D は連続して配列してもよく（同図（ a ) ， ( c ) ) 、間隔をあけて S3列してもよい（同図（ 1> ) ，（ 3 ) ，（ 6 ) ，（ぞ））。

また、基板 1 0 1は図 7 ( f ) に示すように、円盤状のディスクに多数の突条 1 0 1 a を放射状に形成して多数の試料展開面 1 0 1 bを設け、これら試料展開面 1 0 1 bのそれぞれに抗体固定領域 A 〜Dを設けることにより、多数の検体試料の同時分析を行なえるようにしてちょい。

なお、抗体固定領域の数は図 7に示したように四つの場合に限られず、任意の個数とできる。

図 7において、各抗体固定領域 A〜Dの濃度は、領域 A ： 1 0 -³ gZm l ，領域 B : 1 0 - 4 g /_m l ，領域 C : 1 0 - 5g Zm l ，領域 D : 1 0— ⁶g Zm l のように図示右方向あるいは下方向に向かつて濃度が減少するように構成してあるが、その逆の順序になるように構成してもよい。

上記のように得られた複数の抗体固定領域 A〜Dを形成した基板は、図 6 (II) に示すように、非特異性吸着防止のため、ブロッキング剤 3 0 1 でその表面を覆い、ブロッキング処理を行なうことが好ましい。ここで、ブロッキング剤としては、ゥシ血清アルブミン，カゼイン，スキムミルク等が挙げられる。

第 2発明においては、次に、上記抗体固定基板 4 0 1上で、検体試料 5 0中の抗原 5 1 を抗原—抗体反応により捕捉せしめる（図 6 (III ) ) 。

基板 1 0 1上で抗原一抗体反応を行なわせるには、例えば、基板上の抗体固定領域 A〜Dの各々に分析対象物である抗原 5 1 を含んだ検体試料 50を適量（例えば 50 1 程度）滴下すればよい。これによって、基板 1 0 1上に形成された抗体固定領域 A〜D中の抗体 20 1と検体試料 5 0中の抗原 5 1との間に抗原—抗体反応を行なわせることができる。また、円盤状の基板 1 0 1を回転して、遠心力で検体試料を基板 1 0 1上に薄膜状に展開することによって、基板 1 0 1上で抗原一抗体反応を行なわせるようにしてもよい。この場合、抗原一抗体反応に要する時間は 1〜 5分程度の短い時間で済む。

抗原一抗体反応後、捕捉された抗原 5 1以外の残余の成分 52， 53は、リン酸緩衝食塩水（P B S ) ( p H 7. 4 ) 、あるいはトリス緩衝食塩水（T B S ) ( p H 8. 2 ) 等を適量（例えば、 l ml程度）滴下して洗い流すか、あるいは滴下後さらに基板 1 0 1 を回転して洗い流す。

次いで、上記抗原一抗体反応後の基板 1 0 1に、抗原 5 1 と特異的に反応する抗体 54を固定してなる不溶性担体粒子 55を作用させる（図 6 (IV) ) 。

抗体を固定してなる不溶性担体粒子を含んだ水溶液は、上述した抗原—抗体反応後の基板 1 0 1 (図 6 (III)) に適量（例えば 5 0 1 ) 滴下される（あるいは滴下後さらに基板 1 0 1の回転によつて展開される）。これにより、第 1発明と同様に、基板 1 0 1の抗体 2 0 1に捕捉された抗原 5 1 と、不溶性担体粒子 5 5に固定された抗体 54とが再度抗原一抗体反応を起こし、抗体 54を介して不溶性担体粒子 55が捕捉される（図 6 (IV) ) 。基板上に捕捉されなかった不溶性担体粒子は、上述した検体試料と同様の方法で洗い流される。このようにして、サンプル基板が作製される。

次に、上記サンプル基板上の抗原 51によって捕捉された不溶性担体粒子 55の数又は粒子数と相関する物理量を測定手段 5 6で測定して、抗原 5 1の濃度を求める（図 6 (IV) ) 。

ここで、粒子数等の測定手段 5 6としては、光学的測定手段が好ましい。光学的測定手段としては、光学顕微鏡で得られる面像を画像解折装置を介して解折し粒子数の測定を行なう測定手段が例示される。

また、他の光学的測定手段としては、レ一ザ一， L E D , ハロゲンランプ等の光源と、フォトディテクタ一， C C D (ラインセンサ —含む）等の受光系とを組み合わせた種々の測定手段が例示される。この場合、レーザー光等を用い反射率の変化等から直接粒子数を計数（カウント）するようにしてもよく、あるいは着色による吸光度や蛍光物質による蛍光強度等のように粒子数と相関する物理童を測定し、これを粒子数に換算して粒子数を求めてもよい（特願平 2— 2 7 0 9 0 0号参照）。

なお、光学的測定手段と不溶性担体粒子の粒径との関係については、第 1発明の説明で述べたことの他、次のことがいえる。

光学顕微鏡と画像解析装置とを組み合わせた測定手段を用いる場合には、不溶性担体粒子の粒径は 0 . 2 μ m以上であることが好ましい。また、電子顕微鏡を用いれば 0 . 2 μ in以下の不溶性担体粒子も利用することができる。

上記の観点及び抗原一抗体の反応性からすると、不溶性担体粒子の粒径は 0 . 0 1 〜 1 0 mの範囲内であることが好ましい。

上記で計測した不溶性担体粒子の個数から抗原の濃度を求めるには、第 1発明と同様にあらかじめ検量線を作成しておき、この検量線から、抗原濃度を求めればよい。

この場合、検羞線は、抗体固定領域 A〜Dごとに作成される（したがって検量線は四本作成される）。例えば、抗原濃度既知の試料であって抗原濃度が異なるものを 6種（ 1 0— ²〜 1 0— ⁷ g Z m 1 ) 用意し、この抗原濃度既知の 6種のそれぞれを各抗体固定領域 A〜 Dに作用させ、上述したのと同様にして、不溶性担体粒子の数を測定して、各抗体固定領域 A〜Dにおける抗原濃度と担体粒子の数との関係を求める。そして、これらの関係を一つのグラフにプロット - - して検量線 A，〜： D' を作成する（図 8 ( a ) 参照）。

次に、図 8 ( a ) に示す検量線から未知濃度（C_a) の抗原濃度を求める方法を具体的に説明する。

例えば、未知濃度（C_s) の検体試料を各抗体固定領域 A〜Dに作用させたとき、抗体固定領域 A〜 Cにおいてラテックス数 a i， a ₂, a sが計測されたとすると（Dでは検量線 D，の範囲外であるので計測されない）、図 8 ( a ) の各抗体固定領域についての検量線 A，〜C，により、そのラテックス数に対応する濃度 Cal， Ca2, C_a3が求められる。そして、それらの平均値 C_aが抗原濃度とされる（図 8 ( b ) 参照）。

同様に、抗原濃度を未知濃度（Ct ) とし、各濃度領域 A〜Dにおけるラテックス数が b 1 (領域 C) ， b 2 (領域 D) (A , B領域ではラテックス数が多すぎて有効測定領域外でありラテックス数は得られない）であるとすると、図 8 ( a ) の検量線 C，， D，より濃度 Cw， Cb2が求められる。そしてそれらの平均値 Cbが抗原濃度とされる（図 8 ( c ) 参照）。

図 8 ( a ) に示されたごとく固定抗体の濃度差によって検量線 A，〜D，の位置が違うので、 1つの検量線ではカバ一できなかったダイナミックレンジが見掛け上拡大した形になる。

これにより、従来行なっていた測定可能範囲になるまでの稀釈の繰り返し操作が省略又は低減される。

また、もし抗原濃度が図 8 ( a ) に示す C_aの場合には、 A， B， Cエリアで捕捉されたラテックス数より各々濃度が求められる（図 8 ( b ) ) 。この場合、その値が予め決定されている測定可能領域内にある測定値のみを有効測定値とし、それらを平均することにより目的物質濃度が求められる（図 8 ( b ) ) 。これにより従来の検童線一つだけによるものより測定精度の向上が期待でぎる。一般に、 S N (信号ノノイズ）比は測定回数の平方根に比例することが知られているからである。 - - なお、上述した第 1発明及び第 2発明の免疫学的定量分析方法においては、説明の都合上、ディスク又は基板ノ抗体 Z抗原抗体/ 不溶性担体粒子の構成となる場合を示したが、代わりに、ディスク又は基板抗原ノ抗体/抗原/不溶性担体粒子の構成とし、抗体濃度の定量を行なうものとしてもよい。

[実旌例]

以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例 1

( 1 ) 抗体固定ディスクの作製

C一反応性蛋白質（C R P) 抗体のトリス綾衝食塩水（T B S ) 溶液（濃度 5. 0 6 X 1 0 -6 _g 1 ) 5 l を、半径 6. 5 c m の回転可能なポリカーボネ一トディスクの半径 4 c mの地点に滴下し、ディスクを回耘させて 3 0 . 0 mm²の薄膜状に均一に展開した。温室で 2時間放置した後、 T B S溶液（ 0. 0 5 M， p H 8. 2) 2 0 0 μ 1 で 3回洗浄して抗体固定ディスクを作成した。

( 2 ) 抗体固定不溶性担体粒子（抗 C R Pラテックス）の作製粒径 0. 2 μ πιの不溶性担体粒子（ポリスチレンラテックス）を l w t %含むリン酸緩衝食塩水（P B S ) ( p H 7. 4 ) 中に、ヒト C R Pを兎に投与して得られた C R P抗体を入れ、十分攪拌してポリスチレンラテックスに C R P抗体を固定（感作）させた。これを遠心分離にかけた後、上清を除き、沈殿したラテックス粒子を P B Sに再分散させ、抗体固定不溶性担体粒子（抗 CR Pラテックス；を作製した。

(3 ) 検量線の作成

次いで、検量線作成のため、上記抗体固定ディスクを図 3に示す分析装置の回転テ一ブル上にセットし、 T B Sで調製した C R P濃度既知の標準試料（ 1 . 0 X 1 0— ¹²g Zm l， 1 . 0 X 1 0 - /m 1 , 1 . 0 X 1 0— ⁹g Zm l， 1 . 0 X 1 0— ⁷g Zm l， - -

1. 0 X 1 0— SgZm l , 1 . 0 X 1 0— ⁵gZm l ) をこの抗体固定ディスク上の抗体固定部に Ι Ο μ Ι滴下し、 3 0 で 5分間反応させ、抗体固定ディスク上に固定された抗体に抗原を捕捉させた。その後、抗体固定ディスクを T B S (0. 0 5 Μ , ρ Η 8. 2 ) 20 0 A 1で 3回洗浄して残っている試料を除去した。

さらに、このディスク上に上記で作製した抗 CRPラテックスの P. B S溶液（ラテックス粒子径 0. 2 /i m， 1 w t % ) 50 1 を、ディスク半径 4 c mの地点に滴下し、回転により展開して、 30 で 5分間インキュベーションし、その後 T B S (0. 05 M , p H 8. 2 ) 200 1で 3回洗浄して検量線作成のためのサンプルデイスクを作製した。

その後、ディスクを 1 8 00 r p m で回転させながら、デイスク上に捕捉されたラテックス粒子の個数を光学へッド 14 ( 83 0 n mの波長の半導体レ一ザ一を光源とする）で走査しながら計測した。この結果を表 1に示す。

また、この結果をもとに抗原濃度とラテックス粒子の個数の関係をグラフ化し、図 9に示すような検量線を得た。

(4 ) 未知試料中の C R P濃度の定量

次に、被検者から採血した血液を常法（遠心分難）によって血清分離し、 CR P濃度未知の試料を 3種類用意した。各試料中の C R P濃度の定量を本発明方法及び従来法（L I A法、三菱化成社製免疫検査装置 LPIA100M使用）の両方法で行なった。

なお、本発明法の手順は上述した検量線の作成の場合と同様であり、分折装置に装着した抗体固定ディスク上に被検試料を滴下して反応させ、さらにその上に抗 CR Pラテックスを 5 0 l滴下して反応させた後、デイスク上に捕捉されたラテックス粒子の個数を計測し、この計測されたラテックス粒子の個数から、図 9に示す検量線にもとづき CRP濃度を求めた。反応時間は 1 0分、ラテックスは計測時間 5分、合計 1 5分間であった。上記両方法による C R P濃度の定量結果を表 2に示す。

実施例 2

不溶性担体粒子として励起波長 5 6 0 n m , 蛍光波長 5 7 7 n m を有する蛍光物質を含有した粒径 0. 5 のポリスチレンラテツグスを用いたこと、 T B Sで調製した C R P濃度既知の標準試料の濃度を 1 . 0 X 1 0一 I3 g m l ， 1 . 0 X 10— g /m l ,

1 . 0 X 1 0 - ⁹g /m l ， 1 . 0 X 1 0 - ⁷g Zm l ， 1 . 0 X

1 0— ⁵g Zm l ， 1. 0 X 1 0— 3 g Zm 1 としたこと、及び図 3に示す分折装置における光学的測定へッドを 5 6 0 n m付近の単色光源及びフオトディテクタ一とし、図 5に示したようにして蛍光強度からラテックス粒子の個数を換算して検量線を作成したこと以外は，実旖例 1 と同様にして、上記 C RP濃度未知の検体の 1 0 0倍稀釈 (T B Sにて稀釈）試料について C RP濃度の定量を行なった。反応時間は 1 0分、ラテックス計測時間は 3分、合計 1 3分間であつた。

C R P濃度の比較結果を表 3 に示す。また、得られた検量線を図 1 0に示す。

；

抗原濃度！ラテックス数

( g Zm 1 ) ^: (個ノ 3 6 0 ii m2)

1 X 1 0 1 2 0 0

1 X 1 0 -¹¹ 1 4 6 0

1 1 0 -9 2 2 0 0

1 X 1 0 -⁷ 2 8 9 0

1 X 1 0 -⁶ 3 1 5 0

1 X 1 0 -⁵ 3 3 6 0 - - 表 2

C R P濃度（ n s /m l )

検体番号

本発明法 L I A法

1 3 1 9 3 2 0

2 5 1 54 0

3 2 1 0 2 1 0 表 3

表 2及び表 3から明らかなように ·、本発明方法は従来法（ L I A 法）に比べ、 0. 0 1 〜 0. 1 ( n gZm l ) のオーダーまで測定でき、感度が高く、したがって 1 n g Zm 1 以下の極微量成分の定量が可能となる。

また、検査にかかる所要時間は、従来法（E I A法）が 1 〜 2時間なのに対し、本発明方法は 1 0分〜 3 0分であり、検査の高速度化を実現しうる。

さらに、従来法（L I A法， E I A法）は出力信号がアナログなのに対し、本発明方法においては出力信号をデジタル化できるため - -

S N比の向上、回路の簡便さという利点を有する。

実施例 3 : α —フエトプロテイン（A F P ) の定量

( 1 ) ヒト A F Pを予め兎に投与して得られた A F P抗体（ I g G) を従来法（石川栄治：酵素免疫測定法，第 3版，医学書院；小山次郎，大沢利眧著：免疫学の基礎，東京化学同人刊， P30〜P34参照）によりペプシンで消化し、 I g Gの不変領域 F c部を除去して、抗原抗体反応形成部位である（F a b ' ) 2を得た（図 1 1参照）。

( 2 ) 上記実施例と同様にチャンネルを設けた回転可能なポリカーボネートディスク上のチャンネノレ内の半径 3 . 5 c mめ地点、に（ F a b ' ) 2の T B S溶液（濃度 2. 3 X l O -⁴g /m l ) 2 0 ^ 1 を滴下し、 3 0 の状態で 2時間静置して、ディスク上に抗体を感作（物理吸着）させた。その後、吸着されなかった抗体を T B S

2 0 O 1 で 3回洗浄し、除去した。

( 3 ) B S A (牛血清アルブミン） 0. 5 %含有 T B S溶液 1 0 μ 1 を該抗体固定位置に滴下し、 4 °Cの状態で 2 4時間静置した。その後、界面活性剤である T w e e n 2 0 (ポリサイエンス社製）を 0 . 1 %含有する T B S溶液（ P H 8 . 2 ) 2 0 0 μ 1 で 3回洗浄した。

(4 ) 一方、読み取り使用光源である半導体レーザ一（波長 7 8 0 n m ) の 6倍波長の大きさである 3 0 0 n m ( 0 . 3 μ m) のポリスチレンラテックスに上記（ 1 ) で得た抗体を実施例 1 の如く抗体感作し、感作ラテックスを作製した（ラテックス濃度 : 0 . 2 5 w t % T B S溶液）。

( 5 ) 検量線作成のため、濃度既知の A F P抗原標準溶液（ 1 . 0 X 1 0- ¹²g m l ， 1 . 0 X 1 0 - 1口 g Zm l ， 1 . 0 X 1 0 - 8 g /m 1 , 1 . 0 X 1 0— ⁶g m l ， T B Sにより稀釈） 2 0 1 をデイスク上の抗体固定部位に滴下し、 3 0 の状態で 5'分間静置して抗原抗体反応させ、ディスク上の固定抗体により A F P抗原を捕捉させた。その後、未反応の試料は実施例 1 と同様に T w e e n 2 0含有 T B S溶液（T w e e n 20濃度 0. 1 %) 2 0 0 1で 3 回洗浄した。

( 6 ) 上記（4) で調製した A F P抗体感作ラテックス 20 1 を該抗原捕捉部位に滴下し、 30での状態で 5分間静置して抗原抗体反応させ、該抗原にラテックス粒子を捕捉させた。捕捉されずに残つたラテックスは、 T w e e n 20含有 TB S溶液 200 μ 1で 3 回、さらに蒸留水 50 0 1で洗浄し、塩と共に除去し、サンプルディスクを作製した。

( 7 ) その後、サンプルディスクを 1 8 00 r p mで回転させ、波長 780 n mの半導体レーザーを光源とした図 3に示した光学へッド 14を走査させながらディスク上に捕捉されたラテックス粒子の個数を計剃した。計測結果を表 4に示し、これらの個数と A F P抗原との関係をグラフ化した検量線を図 1 2に示す。

(8 ) 被検者から採血した血液を実施例 1同様に従来法で遠心分離し、血清を得た。この血清 20 i を上記（ 5) と同様に本発明法により反応させ、ラテックス粒子数を計数し検量線から濃度を検出したところ、 0 · I n gZm l ( 1 X 1 0— iQgノ m 1 ) の結果を得た。従来の R I Aにより測定したところほぼ同じ結果が得られた。また、従来の L I A法の三菱化成 LPIA100Mでは上記の被検試料は測定出来なかった。

被検試料滴下からラテックス粒子假数計測までに要した時間は

1 5分であった。

表 4

卖施例 4 ： CRP (C—反応性蛋白質）の定量

( 1 ) 抗体固定基板の作製

図 7 ( b ) に示すように、縦 2 c m、横 7 c mのポリ力一ボネ一ト製プレート上に CR P抗原を兎に免疫させて得た C R P抗体を固定させた。抗体の固定には、抗体濃度 1 X 1 0_³， 1 0— ⁴， 1 0一⁵， 1 0— ^sgZm lの TB S ( トリス緩衝食塩水）溶液 5 0 1 を、 1 c m 径の面積となるようにそれぞれ上記の順番で領域 A〜Dに滴下し、 3 0 °Cで 2時間静置して物理吸着させた。

その後、吸着されなかった抗体を T B S ( p H 8. 2 ) 1 0 m l で洗浄し、さらに非特異吸着の防止のため、ブロッキング剤（ブロックエース：雪印製）を用い 4 でー晚静置してブロッキング処理を行なった。

T w e e n 20を 0. 0 5 w t %加えたトリス緩衝食塩水（以下 T B S - T w e e nという） 1 0 m l で残ったブロッキング剤を洗浄し、抗体固定基板とした。

(2 ) 検量線の作成

C R P抗原濃度既知の T B S溶液標準液（例えば 1 . 0 X 1 0 - 3 g /m 1 ) 5 0 1 を基板上の抗体固定領域 A〜Dを全て覆うように広げた。 - -

3 0 で 5分間静置し、抗原一抗体反応を行なわせた後、上記 T B S - T w e e n 1 0 m 1 で未反応の抗原溶液を洗浄した。

予め C R P抗体を物理吸着により感作（固定）した 0. 1 μ m φ の抗体感作ポリスチレンラテックス粒子を T B Sに分散させた分散溶液（ラテツクス濃度： 0. 0 5 w t %) 5 0 1 を、上記抗原溶液と同様にして領域 A〜Dに広げた。

3 0 で 5分間静置し、抗原—抗体反応によりラテックス粒子を捕捉させた後、上記 T B S— T w'e e n 1 0 m l により未反応のラテックス溶液を洗浄した。

各領域（A〜D) におけるラテックス粒子数を画像解析装置を接続した日立製電子顕微鏡 S — 8 0 0でカウントし、各抗体固定領域.

(A〜D) の抗原（濃度 1 . 0 X 1 0— 3 g m l ) に対するラテツクス数とした。

同様に 1 . 0 X 1 0一⁴， 1. 0 Χ 1 0 _⁵， 1 . 0 X 1 0一⁷，

1 · 0 X 1 0—⁹， 1 . 0 X 1 0— ¹¹ g Zm 1 の C R P抗原濃度既知の T B S標準溶液にて上記のごとくラテックス粒子数をカウントし、各領域 A〜Dの各抗原濃度に対するラテックス数とした。

上記各領域 A〜Dの各抗原濃度に対するラテツクス数は、表 5に示す通りになった。

これらの関係を 1つのグラフにプロットしたのが図 1 3である。これを C R P抗原定量における検量線とした。

表 5

各抗体固定領域における杭原濃度とラテツクス粒子数の関係

抗原 (g/ml) 領域杭体濃度

l.OxlQ- 1.0x10-" 1.0X10— 1.0X10" 1.0x10' 1.0X10" (名） (g/ml) ラテ、'ノクス数（個/ 100μ·πι² )

A 1.0x10一³ 秦 340 420 1100 1870

B 1.0x10-" ■ - 330 780 1420 1780 1970

C 1.0X10一¹⁵ ▲― 410 940 1390 1580

D 1.0x10— ⁶ ♦ - 570 930 1250

- -

(3 ) 未知試料中の C RP濃度の定量

表 6に示したように、被^者から採血した血液を常法（遠心分雞法）で血清分難し、検体 1， , 3とした。

上記検体 1を T B Sにより 5倍稀釈した溶液 5 0 /i lを、上記検量線作成法と同様に、基板上の抗体固定領域 A〜D上に広げた。

3 OT:で 5分間静置、反応させた後、未反応の検体溶液は TB S 1 0 m l により洗浄、除去した。

C R P抗体感作ラテックス分散溶液（ 0. 05 w t %ZT B S溶液） 50 1 を領域 A〜Dに広げて、 3 0 で 5分間静置、反応させた。

抗原抗体反応により捕捉されなかったラテックス溶液を、 TB S — T w e e η 1 0 m 1 で洗浄、除去した。

各エリアにおけるラチックス粒子数を電子顕微鏡観察によりカウントし、各エリアの検量線から検体 1の濃度を 540 (A) n g / m 1 , 5 38 (Β ) η g /m 1 , 5 34 (C) n gZm l とした。なお、 Dエリアより得たラテックス数は測定可能領域外であり、これを無視した。次いで、これらの濃度の算術平均をとり、 540 η gZm l を検体 1の C R P濃度とした。

以下検体 2， 3も同様にして、それぞれ 24. 8 μ g /m 1 , 3. 5 η g/m 1の C R Ρ濃度を得た。この結果を表 6に示す。比較例 1

従来法（L I A法）で同検体 1〜 3を測定した。この結果、検体 1の〇濃度は 5 3 8 11 gZm l、検体 2の C RP濃度は 24 gZm l であり、検体 3の C R P濃度は測定不能であった。この結果を表 6に示す。

未知試料中の C R P 濃度

1 )平 ^直をもって ^J^^CRP^ ^とした。

2 )≡ Mi LPI A- 100を^ fflした。 3) LPI A— 100用キットとして

CRP : 0. 2〜1 lnig/dl ¾ί¾¾Τ能を麵した。 CRP-H： 2〜500 ^gAUS ^能を棚した' 上述した第 2発明の免疫学的定量分析方法によれば、測定可能な濃度領域が異なる複数の抗体固定領域を設けているので、各領域の各検量線が重なり合って、見掛け上のダイナミックレンジ（測定可能域）が拡大し（個々の領域については、ダイナミックレンジが拡大しているわけではない）、実際上の測定可能な濃度領域が拡大する。したがって、煩雑な稀釈操作を省略し、あるいは稀釈回数を減らすことができ、これによつて、検査時間の短縮及び検査のコストダウンが図られる。また、一回の検体測定によって、複数のデータ

(検出濃度）が得られるため、検出精度が向上する。

[産業上の利用可能性]

第 1発明においては、抗体固定基板として回転可能なディスクを使用するとともに、抗体固定微粒子の計数を光ディスク技術を利用して、ディスクを回転させながら光へッドで走査して行なうことによって、計数の自動化，高速化及び高感度化が図れる。そして、デイスクへの被検液の滴下（分注）、被検液の展開及び洗浄等の分析に必要な一連の操作をディスク上で全て行なわせると、分析の完全自動化及び迅速化が達成できる。

したがって、第 1発明の免疫学的定量分析方法によれば、免疫学的検査の測定濃度領域の拡大、高感度化及び高速度化を図ることができる。

また、第 2発明においては、測定可能な濃度領域が異なる複数の抗体固定領域を設けているので、各領域の各検量線が重なり合って、見掛け上のダイミックレンジ（測定可能域）が拡大し（櫥々の領域については、ダイナミックレンジが拡大しているわけではない）、実際上の測定可能な濃度領域が拡大する。このため、煩雑な稀釈操作を省略し、あるいは稀釈回数を減らすことができ、これによつて、検査時間の短縮及び検査のコストダウンが図られる。また、一回の検体測定によって、複数のデータ（検出濃度）が得られるため、検出精度が向上する。 - - したがって、第 2発明の免疫学的定量分析方法によれば、免疫学的検査の測定可能な濃度領域の拡大、稀釈操作回数の低減及び測定精度の向上を図ることができる。

Claims

請求の範匪

1 . 回転可能なディスク上の半柽方向に形成した複数の流路のうち少なくとも 1つの流路の一部又は全面に抗体を固定し、前記ディスクの回転又は滴下により体液をディスク上に展開し、体液中の分析対象物である抗原を、デイスク上に固定された抗体に抗原一抗体反応により捕捉せしめた後、さらに該抗原に、その抗原と特異的に反応する抗体を固定してなる不溶性.担体粒子を作用させ、前記抗原により捕捉された不溶性担体粒子の数を、ディスクの半径方向に移動可能な光学読み取り装置を用いて、ディスクを回転させながら計数することを特徴とした免疫学的定量分析方法。

2 . 回転可能なディスク上の半径方向に形成した複数の流路の少なくとも 1つの流路の一部に抗原を固定し、前記ディスクの回転又は滴下により体液をディスク上に展開し、体液中の分析対象物である抗体を、固定された抗原との抗原一抗体反応により捕捉せしめた後, さらに該抗体に、その抗体と特異的に反応する抗原を固定してなる不溶性担体粒子を作用させ、前記抗体により捕捉された不溶性担体粒子の数を、ディスクの半径方向に移動可能な光学読み取り装置を用いて、ディスクを回転させながら計数することを特徴とした免疫学的定量分析方法。

3 . 光学読み取り装置の光源が収束レ一ザ一光源であることを特徴とする請求項 1又は 2記載の免疫学的定量分析方法。

4 . 不溶性担体^子の粒子径を、使用光源波長の 1 Z 5 〜 1倍の大きさとしたことを特徴とする請求頊 1， 2又は 3記載の免疫学的定量分析方法。

5 . 不溶性担体粒子の粒子径を、 0 . 1〜 5 m の大きさとしたことを特徴とする請求項 1， 2又は 3記載の免疫学 ^定量分析方法。

6 · ディスク上に測定可能な濃度領域が異なる複数の抗体又は抗原の固定領域を設けた請求項 1又は 2記載の免疫学的定量分析方法

7 . 固相（基板）上に測定可能な濃度領域が異なる筏数の抗体固定領域を設け、この抗体固定領域に該抗体と特異的に反応する抗原を含む試料を作用させて抗原を抗原一抗体反応により捕捉せしめた後. さらに該抗原と特異的に反応する抗体を固定してなる不溶性担体粒子を作用させ、前記抗原によつて捕捉された不溶性担体粒子の数又は粒子数と相関する物理量を検出することにより試料中の抗原濃度を測定することを特徴とした免疫学的定量分析方法。

8 . 固相（基板）上に測定可能な濃度領域が異なる複数の抗原の固定領域を設け、この抗原の固定領域に該抗原と特異的に反応する抗体を含む試料を作用させて抗体を抗原一抗体反応により捕捉せしめた後、さらに該抗体と特異的に反応する抗原を固定してなる不溶性担体粒子を作用させ、前記抗体によって捕捉された不溶性担体粒子の数又は粒子数と相関する物理量を検出することにより試料中の抗体濃度を測定することを特徴とした免疫学的定量分析方法。

9 . 濃度の異なる抗体，抗原の溶液を用いて固相（基板）上の各領域に抗体，抗原を固定せしめて、測定可能な濃度領域が異なる複数の抗体，抗原を固定した領域を固相上に形成することを特徴とした請求項 7又は 8記載の免疫学的定量分析方法。

1 0 . 固相（基板）が回転可能な円盤状である請求項 7， 8又は 9 記載の免疫学的定量分析方法。 .

1 1 . 不溶性担体粒子がラテックス粒子である請求項つ， 8， 9又は 1 0記載の免疫学的定量分析方法。