WO1991015513A1 - Polypeptides ayant une activite de recepteur dopaminergique, acides nucleiques codant pour ces polypeptides et utilisation de ces polypeptides pour le criblage de substances actives sur ces polypeptides - Google Patents

Polypeptides ayant une activite de recepteur dopaminergique, acides nucleiques codant pour ces polypeptides et utilisation de ces polypeptides pour le criblage de substances actives sur ces polypeptides Download PDF

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nucleic acid
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Pierre Sokoloff
Marie-Pascale Martres
Jean-Charles Schwartz
Bruno Giros
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Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the subject of the invention is polypeptides having dopaminergic receptor activity and the genes coding for these polypeptides.
  • the invention also relates to
  • nucleotide probes capable of hybridizing with the genes coding for the above polypeptides, which probes are likely to be used for the in vitro diagnosis of ailments, in particular neurological, psychiatric, cardiovascular or neuroendocrine,
  • polypeptides directed against the above-mentioned polypeptides and usable for an analytical purpose to purify said polypeptides, of ij vitro diagnosis, or for a therapeutic purpose, in particular in the affections implying the dopaminergic systems,
  • kits for studying the degree of affinity of certain substances for the above-mentioned polypeptides
  • D-1 and D-2 receptors Two types of receptors commonly known as D-1 and D-2 receptors
  • Emorine L.J. and Schwartz J.C. "Alternative splicing direct the expression of two D-2 dopamine receptor isofor s". Nature, 1989, 342: 923-926; Dal Toso R.,
  • the D-2 receptor belongs to the family of receptors comprising seven trans bran domains, coupled to a G protein and having a certain degree of homology with the receptors of the family. rhodopsins which are expressed by photoreceptors in the retina.
  • the object of the invention is to provide access to new polypeptides having dopaminergic receptor activity, which is similar neither to that of D-1 dopaminergic receptors, nor to that of D-2 dopaminergic receptors.
  • the subject of the invention is also methods of screening for new drugs acting on new polypeptides having a dopaminergic receptor action or which, on the contrary, one would like to avoid interaction with the new polypeptides, and intended, inter alia, for the treatment of disorders psychiatric, neurological, cardiovascular or neuroendocrine.
  • the new polypeptide of the invention having dopaminergic receptor activity having dopaminergic receptor activity:
  • an advantageous variant polypeptide of the invention having dopaminergic receptor activity:
  • the formation of the antigen complex (that is to say 446 amino acid sequence or aforementioned fragment) - antibody and the detection of the existence of a complex formed can be done by conventional techniques. (such as those using a tracer labeled with radioactive isotopes or an enzyme).
  • fragment containing the sites As regards the definition of "fragments containing the sites" and corresponding to the above definition, reference is made below in the description.
  • fragments defined above preference is given to the fragment or fragments produced by alternative splicing of the messenger RNA produced by the gene coding for one of the two 446 amino acid sequences defined above.
  • polypeptides of 1 • invention correspond to fragments of the sequence shown in Figure 2, which contain the amino acid corresponding to that in position 139.
  • Advantageous polypeptides of the invention are such that they contain the sites contained in one of the above sequences of 446 amino acids, the presence of which is necessary so that, when these polypeptides are exposed on the surface of a cell in the presence of iodosulpride 15 I, and in the presence of an agonist, the respective affinity of the following agonists: quinpirole, apomorphine, dopamine, with respect to the polypeptides of the invention is in the following order:
  • the affinity of quinpirole vis-à-vis the polypeptides of the invention is greater than the affinity of apomorphine vis-à-vis the polypeptides of the invention, the affinity of 1 • pomorphine vis-à-vis vis the polypeptides of the invention is substantially equal to the affinity of dopamine vis-à-vis the polypeptides of the invention.
  • Advantageous peptides of the invention are such that they contain the sites contained in one of the above sequences of 446 amino acids, the presence is necessary so that, when these polypeptides are exposed on the surface of a cell in the presence of iodosulpride 125 I, and in the presence of an antagonist, the respective affinity of the following antagonists: raclopride, UH 232, haloperidol vis- with respect to the polypeptides of the invention is in the following order:
  • the affinity of racloprid with respect to the peptides of the invention is greater than the affinity of UH 232 with respect to the polypeptides of the invention
  • the affinity of UH 232 vis-à-vis the polypeptides of the invention is substantially equal to the affinity of haloperidol vis-à-vis the polypeptides of the invention.
  • UH 232 is defined in the article by Svensson K. et al. "(+) - AJ 76 and (+) - UH 232: central stimulants acting as preferential dopamine autoreceptor antagonists". Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol., 1986, 334, 234-245.
  • a ligand is considered to be “agonist” or “antagonist”, with reference to the known behavior of this ligand with respect to the D-2 receptor.
  • the measurement of the affinity of an agonist or of an antagonist with respect to the polypeptides of the invention is made by competition between the agonist or the antagonist (whose affinity is to be measured) and 1 ' iodosulpride 125 I, which is a high affinity ligand for the polypeptides of the invention.
  • the invention also relates to chimeric proteins in which the polypeptide as defined above or parts thereof are joined to a sequence of amino acids heterologous with respect to this polypeptide.
  • polypeptides and chimeric proteins of the invention may be glycosylated and may or may not contain disulfide bridges.
  • polypeptides of the invention will, for simplicity, be designated by "D-3 receptors".
  • An advantageous D-3 receptor of the invention is constituted by the chain of amino acids 1 to 446, represented in FIG. 1 or by the chain of amino acids 1 to 446 represented in FIG. 2.
  • This D-3 receptor is considered to have seven hydrophobic transmembrane regions separated by intra and extracellular hydrophilic loops.
  • the invention also relates to the variant polypeptides which correspond to the above-defined polypeptides comprising certain localized mutations, without the polypeptides losing the properties of dopaminergic D-3 receptor, and which are recognized by antibodies recognizing the transmembrane regions, as well as those which are recognized by antibodies recognizing regions other than the transmembrane regions.
  • the invention also relates to nucleic acids which comprise or consist of a sequence of nucleotides encoding any of the previously defined D-3 receptors.
  • the invention relates to the nucleic acid which comprises the sequence of nucleotides represented in FIG. 3, extending from the end constituted by the nucleotide in position 1 to that constituted by the nucleotide in position 1863.
  • the invention also relates to the nucleic acid which comprises the sequence of nucleotides represented in FIG. 4, extending from the end constituted by the nucleotide in position 1 to that constituted by the nucleotide in position 1863.
  • the invention particularly relates to the nucleic acid represented in FIG. 2 comprising or consisting of the chain extending from the end constituted by the nucleotide in position 442 to that constituted by the nucleotide in position 1779.
  • the above-defined nucleic acid corresponds to the coding part of the gene corresponding to the polypeptide shown in Figure 1.
  • the invention particularly relates to the nucleic acid represented in FIG. 4 comprising or consisting of the chain extending from the end constituted by the nucleotide in position 442 to that constituted by the nucleotide in position 1779.
  • the above-defined nucleic acid corresponds to the coding part of the gene corresponding to the polypeptide represented in FIG. 2.
  • the nucleic acids of the invention are such that they correspond to fragments of the nucleotide chain shown in Figure 4 and contain the nucleotides corresponding respectively to those located in positions 856, 857 and 859.
  • nucleic acids which vary from those defined above and which contain certain localized mutations insofar as these variant nucleic acids hybridize with the previously defined nucleic acids or with the nucleic probes defined below. under the hybridization conditions defined below in the description.
  • the nucleic acids of the invention can be prepared either by a chemical method or by other methods.
  • a suitable mode of preparation of the nucleic acids (comprising at most 200 nucleotides - or bp, in the case of double-stranded nucleic acids) of the invention by chemical means comprises the following steps: the synthesis of DNA using the automated 0-cyanethyl phosphoramidite method described in Bioorganic Che istry 4; 274-325, 1986,
  • a method of preparation, by chemical route, of nucleic acids longer than 200 nucleotides - or bp comprises the following steps:
  • Another method for preparing the nucleic acids of the invention from RNA comprises the following steps:
  • the chemically synthesized oligonucleotide hybridization probes can be the following: that defined by the nucleic acid sequence represented in FIG. 3, extending from the end constituted by the nucleotide in position 1, to that constituted by the nucleotide in position 441, that defined by the nucleic acid sequence represented in FIG. 3, extending from the end constituted by the nucleotide in position 442, to that constituted by the nucleotide in position 537, that defined by the nucleic acid sequence represented in FIG. 3, extending from the end constituted by the nucleotide in position 718, to that constituted by the nucleotide in position 753, that defined by the nucleic acid sequence represented in FIG.
  • nucleic acid sequence represented in FIG. 3 extending from the end constituted by the nucleotide in position 1068, to that constituted by the nucleotide in position 1566, or their complementary nucleotide sequence; these are sequences which have been derived from those of FIG. 3 and they can be used under the hybridization conditions described by Maniatis et al. , "Molecular cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.
  • the chemically synthesized oligonucleotide can be as follows: that defined by the nucleic acid sequence represented in FIG. 4, extending from the end constituted by the nucleotide at position 820, to that constituted by the nucleotide at position 888 this sequence derives sequences of Figure 4 and it can be used under the hybridization conditions described by Maniatis et al. (1982) already cited.
  • RNA strand synthesis in vitro can also be carried out using the PCR (Polymerase Chain Reaction) method, as described for example by Goblet et al. Nucleic Acid Research, 17, 2144, 1989 "One step amplification of transcripts in total RNA using Polymerase Chain Reaction", using two chemically synthesized amplimers defined from the sequence of Figure 3.
  • Suitable amplimers are for example: that defined in Figure 3 from nucleotide 410 to nucleotide 433 and that defined in Figure 3 from nucleotide 1800 to nucleotide 1825.
  • the amplified nucleic acid fragment can then be cloned according to the techniques described in Ausubel FM, Brent R., Kingston RE, Moore DD, Smith JA, Seidman JG and Struhl K. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, chapter 3, Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York.
  • the invention also relates to the recombinant vectors, in particular for cloning and / or expression, in particular of the plasmid, cosmid, phage, or virus type, containing a nucleic acid of the invention in one of its nonessential sites. for its replication.
  • a suitable vector of the invention contains, at one of its sites which are not essential for its replication, the elements necessary to promote the expression of a polypeptide according to the invention, in a cellular host and possibly a promoter recognized by the poly cell host erases, in particular an inducible promoter and optionally a signal sequence and an anchor sequence.
  • the invention also relates to a cellular host transformed by a recombinant vector defined above comprising the regulatory elements allowing the expression of the nucleotide sequence coding for one of the polypeptides according to the invention in this host.
  • cellular host any organism capable of being maintained in culture.
  • One of the microorganisms used can consist of a bacterium, in particular Escherichia coli.
  • An organism of choice is constituted by a eukaryotic organism such as CHO (Chinese Hamster Ovary) or COS-7 (African green monkey kidney fibroblast transformed by the SV-40 virus).
  • each of them has vectors, in particular plasmid vectors, capable of replicating therein and nucleotide sequences insertable into these vectors and capable, when followed in these vectors by an insert coding for a polypeptide of the invention, to ensure the expression of this insert in the selected organisms and their transport in the membranes of these cellular hosts.
  • vectors in particular plasmid vectors, capable of replicating therein and nucleotide sequences insertable into these vectors and capable, when followed in these vectors by an insert coding for a polypeptide of the invention, to ensure the expression of this insert in the selected organisms and their transport in the membranes of these cellular hosts.
  • the invention also relates to the antibodies directed specifically against one of the polypeptides of the invention, these antibodies being such that they recognize neither the dopaminergic receptor D-1, nor the dopaminergic receptor D-2.
  • these antibodies recognize the following amino acid sequences:
  • one of the above-mentioned polypeptides can be injected into animals.
  • Onoclonal antibodies are prepared by cell fusion between myeloma cells and spleen cells of immunized mice, according to conventional methods.
  • the antibodies of the invention can be used for the in vitro diagnosis of the tumor character or not of certain cells as well as the benign or malignant character of certain tumors, insofar as these elements are correlated with the pathological expression of the D- receptor. 3. It has been observed that, in certain tumors, in particular lung tumors, it is possible to detect the expression of dopaminergic receptors which should not normally be present (Sokoloff P., Riou JF, Martres MP and Schwartz JC "Présence of dopamine D-2 receptors in human tumor cell lines ". Biochem. Biophys. Res. Comm. 1989, 162: 575-582).
  • This in vitro diagnostic method based on the biological sample capable of containing the dopaminergic receptor D-3 comprises:
  • the invention also relates to the nucleotide probes, synthetic or not, hybridizing with one of the nucleic acids defined above or their complementary sequences or their corresponding RNA, these probes being such that they hybridize neither with the gene nor with the dopaminergic D-1 and D-2 receptor RNA messengers.
  • the probes of the invention comprise at least 10, advantageously 15 nucleic acids and can comprise at most the entire nucleotide sequence shown in FIG. 3 or in FIG. 4.
  • suitable hybridization conditions are as follows: 900 mM NaCl, 90 mM tri-sodium citrate pH 7.0, 100 ⁇ g / ml salmon sperm DNA, 0.05% sodium pyrophosphate, 10 to 25% formamide deionized, 0.02% Ficoll (P 400,000), 0.02% bovine serum albumin, 0.02% polyvinylpyrrolidone, for 14 to 16 hours at 42 ° C.
  • suitable hybridization conditions are as follows:
  • the invention relates in particular to the nucleotide probes defined above.
  • the probes of the invention can be used as diagnostic tools, especially in vitro for neurological, psychiatric and cardiovascular disorders.
  • the probes of the invention can also be used to detail the alternative splicing of the messenger RNA produced by the gene coding for the 446 amino acid sequence defined above, the existence or not of this splicing being possibly linked to neurological, psychiatric, cardiovascular or neuroendocrine pathologies.
  • the probes of the invention can be used to detect genetic anomalies, in particular polymorphisms or point mutations.
  • the detection of polymorphisms of the gene coding for the dopaminergic receptor D-3 in an individual it can be carried out from a biological sample such as blood, taken from the individual according to a method comprising the following steps : the treatment of the nucleic acid derived from the abovementioned biological sample carried out using a restriction enzyme under conditions allowing 1 • obtaining restriction fragments derived from the cleavage of said nucleic acid at these sites of restriction recognized by said enzyme,
  • nucleotide probe of the invention capable of hybridizing with the above-mentioned fragments under conditions allowing the possible production of hybridization complexes between said probe and the above-mentioned restriction fragments,
  • the in vitro diagnostic method for detecting point mutations of the nucleic acid or of a fragment of the nucleic acid coding for the dopaminergic receptor D-3 in an individual it can be carried out according to the method comprising the following steps:
  • nucleotide probe of the invention into contact with a biological sample, for example blood, under conditions allowing the possible production of a hybridization complex formed between the probe and the nucleic acid or a fragment above-mentioned nucleic acid,
  • the detection of the alternative splicing of the messenger RNA produced by the gene coding for the D-3 receptor it can be done by quantification of the messenger RNA contained in a tissue sample, using the one of the probes of the invention.
  • the probes of the invention can also be used to detect the pathological expression of the dopaminergic D-3 receptor, this expression being revealed by the presence of messenger RNA of the dopaminergic D-3 receptor in cells where it should not be present .
  • This in vitro detection can be carried out using a biological sample taken from an individual, such as blood, according to a method which comprises the following steps:
  • This pathological expression of the dopaminergic D-3 receptor can manifest itself in the case of certain tumors, and can also be correlated with the malignant or benign character of certain tumors.
  • polypeptides of the invention can be prepared by culture in an appropriate medium of a cellular host previously transformed with a recombinant vector containing one of the nucleic acids defined above and by recovery from the above culture of the polypeptide produced by said transformed cell host.
  • Another process for the preparation of the polypeptides of the invention is characterized in that, preferably starting from the C-terminal amino acid, the successive aminoacyls are successively condensed two by two in the required order, or aminoacyles and fragments previously formed and already containing several aminoacyl residues in the appropriate order, or even several fragments previously thus prepared, it being understood that care has been taken to protect beforehand all the reactive functions carried by these aminoacyles or fragments to 1 ' exception of the amino functions of one and carboxyl of the other or vice versa, which should normally intervene in the formation of peptide bonds, in particular after activation of the carboxyl function, according to the methods known in the synthesis of peptides and so on , step by step, up to the N-terminal amino acid.
  • D-3 dopaminergic receptors in a bacterium, such as E. coli or in a eukaryotic cell such as a CHO cell, the following steps are carried out:
  • the regulatory elements may include the endogenous promoter of dopaminergic receptors or viral promoters such as those of SV40 viruses or of Rous sarcoma virus (RSV).
  • RSV Rous sarcoma virus
  • the regulatory elements may include the promoter of the lactose operon or of the tryptophan operon.
  • the invention also relates to a method for detecting the capacity of a dopaminergic molecule to behave as a ligand with respect to a polypeptide of the invention, which method comprises:
  • the invention also relates to a method for studying the affinity of a polypeptide of the invention for one or more determined ligands, which method comprises:
  • the method described above also makes it possible to identify the “fragments containing the sites” mentioned above and which comprise only part of the 446 amino acid sequence of FIG. 1 or of FIG. 2.
  • This identification consists in using inserts of a smaller size than the nucleic acid coding for the above sequence, in carrying out the steps relating to the expression, to the transport of the expression product and to the exposure recalled above. .
  • the expression the transport of the expression product and its exposure on the membrane, as well as the reaction with the ligands as previously defined, are obtained, the fragments containing the essential sites can thus be determined. Consequently, the absence of reaction with the ligands, as previously defined, using fragments of size smaller than the complete sequence, would tend to show that certain essential sites have been eliminated.
  • the invention also relates to a kit for detecting the possible affinity of a ligand for a polypeptide of the invention, which kit comprises:
  • control ligands having determined affinities for the above-mentioned polypeptide, physical or chemical means for the characterization of the biological activity of the expressed protein.
  • the invention also relates to a method for screening drugs intended for the treatment of neurological (such as Parkinson's disease), psychiatric (such as psychotic conditions), cardiovascular (such as hypertension) or neuroendocrine (such as hypothalamic-pituitary axis dysfunctions).
  • neurological such as Parkinson's disease
  • psychiatric such as psychotic conditions
  • cardiovascular such as hypertension
  • neuroendocrine such as hypothalamic-pituitary axis dysfunctions.
  • the invention also relates to medicaments containing, as active substance, an active substance on at least one of the polypeptides according to the invention, having dopaminergic receptor activity or containing as active substance active substances on cells transfected by genes or the fragments of genes coding for at least one of the polypeptides with dopaminergic receptor activity according to the invention, in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the invention also relates to medicaments containing, as active substance, a substance which is active on the dopaminergic receptors D-1 or D-2, but which is inactive on the polypeptides with dopaminergic receptor activity according to the invention.
  • the invention also relates to a method for measuring the affinity of ligands vis-à-vis a polypeptide of the invention, using a ligand labeled by a radioisotopic method and selective vis-à-vis the the above polypeptide of the invention, comprising the following steps:
  • kidney membranes As a biological membrane, one can also work on kidney membranes.
  • the ligand labeled and selective for a polypeptide of the invention can also be labeled by an enzymatic method.
  • the invention also relates to a method for selective labeling of a polypeptide of the invention using a ligand labeled according to a radioisotopic technique, on biological membranes containing on the one hand the D-1 and / or D receptor. -2 and on the other hand the above-mentioned polypeptide, comprising the following steps:
  • the detection of the complex of the labeled ligand-polypeptide type can be done by conventional techniques.
  • the labeled ligand can also be labeled using an enzymatic method.
  • This process relies on the use of a labeled ligand (by a radioisotopic or enzymatic technique), which ligand is non-selective with respect to the D-3 receptor, which implies that if the D-1 and / or D-2 are also contained in the above biological membranes, this labeled ligand is capable of binding to both the D-1, D-2 and D-3 receptors.
  • a labeled ligand by a radioisotopic or enzymatic technique
  • the D-3 receptor has an anatomical distribution and pharmacological characteristics that distinguish it from the D-1 and D-2 receptors. It is preferentially expressed in the limbic regions of the brain involved in cognitive and emotional processes while the D-1 and D-2 receptors are present in most dopaminoceptive regions, in particular the extrapyramidal system involved in involuntary motor skills.
  • D-3 receptor in the limbic system suggests that selective agonists of this receptor may have therapeutic effects on certain cognitive and emotional disorders associated with Parkinson's disease.
  • the neuroleptics used clinically to treat schizophrenia all have an affinity for the D-3 receptor of the order of 1 to 10 nM, which suggests that the blocking of this receptor probably participates in the therapeutic effects of neuroleptics.
  • the ratio of the respective affinities of the neuroleptics for the D-2 and D-3 receptors is expressed by the ratio KjD-2 / K, -D-3 as indicated in Table I below.
  • Table 1 Pharmacology of D-2 and D-3 receptors expressed in CHO cells
  • K, - are derived from experiments described in the legend of Figures 5a and 5b.
  • the curves were analyzed by the regression method nonlinear using a calculator (Martres MP et al. "Sresemble of dopamine antagonists discriminating various behavioral responses and radioligand binding-sites"Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol., 1984, 325: 102-115).
  • the values of * Kp derive from saturation kinetics at equilibrium.
  • the means ⁇ the mean deviation from the standard of values corresponding to 2-3 experiments, with similar results.
  • the terms agonists and antagonists refer to the actions of drugs with respect to D 2 receptors.
  • the compounds are ranked according to their K, -D-2 / Ki-D3 ratio.
  • SKF 38393 is described in Pendleton R.G. et al. "Studies on renal dopamine receptors with SK&F 38393, a new agonist" Eur. J. Pharmacol., 1978, £ 51: 19-28, AJ 76 and UH 232 are described in Svensson K. et al.
  • TL99 is described in Goodale D.B. et al. Neurochemical and behavioral evidence for a selective presynaptic dopamine receptor agonist. Science, 1980, 210, 1141-1143.
  • This ratio is correlated with certain clinical properties of neuroleptics: those with a low ratio, of approximately 0.05 to approximately 0.13 (haloperidol, thioproperazine, prochlorperazine) are neuroleptics for which the incidence of side effects (parkinsonism, dystonia and tardive dyskinesia) is strongest while those with the highest ratio, from around 0.3 to around 0.6 (clozapine, amisulpride, thioridazine, sulpiride) are "atypical" neuroleptics which cause less side effects and / or have disinhibitory properties in certain deficient forms of schizophrenia.
  • FIG. 1 represents the amino acid sequences of the rat dopaminergic receptor D-2 (second line), aligned with that of a variant of the rat dopaminergic receptor D-3 (first line).
  • NXS / T the consensus sequences for the glycosylation sites linked to asparagine
  • FIG. 2 represents the amino acid sequences of the rat dopaminergic receptor D-2 (second line), aligned with that of the rat dopaminergic receptor D-3 (first line) according to Bunzow J.R. et al. ("Cloning and expression of a rat D-2 dopamine receptor cDNA", Nature, 1988, 336: 783-787).
  • the transmembrane regions are boxed and the positions of the introns for the rat D-2A receptor (20, 22, 30, 33) and D-3, deduced from the analysis of ⁇ RGE 12A and ⁇ RGS 3, are indicated by arrows.
  • Each "equal” sign indicates a conservation in amino acids and the “dashes” correspond to the conservative substitutions where the groups are (H, K, R), (I, L, V, M), (A, G, S, T ), (Y, F, W), (D, E, P, N, B, Z), (P) and (C).
  • Figure 3 shows the nucleic acid sequence of the above variant (see Figure 1) of the dopaminergic receptor D-3 in rats, and the corresponding amino acid sequence.
  • Figure 4 shows the nucleic acid sequence of the dopaminergic receptor D-3 in rats, and the corresponding amino acid sequence.
  • - Figure 5 shows Northern Blot analyzes of RNA from rat brain tissue.
  • references 1 to 10 correspond respectively to:
  • the sequence D-3 is schematically represented by seven boxes corresponding to MbI-MbVII, the open lines representing coding sequences and the single lines the untranslated sequences.
  • ⁇ RGE 12A and ⁇ RGS 3 are genomic DNA clones
  • RT-PCR A and B represent cDNA clones obtained from amplification according to the PCR technique of cDNA obtained from poly (A) + MRNA and reverse transcriptase below designated by RT-PCR.
  • the dark lines represent the coding regions (exons of genomic DNA clones) and the thin lines represent the introns in genomic DNA clones.
  • the dotted lines indicate the continuity of the sequence.
  • Primers 1, 2 and 3 are used for the RT-PCR technique.
  • Figures 7a and 7b represent the compared properties of D-2 and D-3 receptors expressed in CHO transfected cells. More specifically, Figure 7a shows the inhibition of binding to 125 I 1'iodosulpride- by dopamine agonists and Figure 7b shows the inhibition of binding to 15 1'iodosulpride- I by the dopamine antagonists .
  • FIGS. 8a and 8b represent the characterization of transcripts of the D-3 receptor gene in different tissues.
  • Figure 9 shows the autoradiographic localization of binding sites to iodosulpride- 125 I and messenger RNA of the D-2 or D-3 receptors in the rat brain.
  • FIG. 10 shows the effects of lesions induced by 6-hydroxydopamine on the transcripts of the D-2 and D-3 receptor genes in the substantia nigra.
  • FIG. 11 shows the specific binding to receptors D 2 (curve with circles) and D 3 (curve with black dots) in the presence of 7 OHDPAT- 3 P in increasing concentrations.
  • 7 OHDPAT- 3 P binds to membranes of cells expressing the D 3 receptor with a high affinity (K j , - 2 riM) but very little to those of cells expressing the D 2 receptor, which demonstrates the specificity of the ligand for the D 3 receptor.
  • Oligonucleotides derived from the dopaminergic receptor D-2B are radioactively labeled and used to screen a rat brain cDNA library (Jes, B., Sokoloff, P., Martres, MP, Riou, JF, Emorine, LJ and Schwartz, JC Nature 342. 923-926 (1989)).
  • Nitrocellulose filters to which phages have been transferred are subjected to hybridization for 16 h at 42 ⁇ C in a medium containing 60% formamide, 10% dextran sulfate, 4 x SSC, 8 mM Tris-HCl, pH 7 , 4, 1 x Denhardt's, 20 ⁇ g / ml yeast tRNA, 20 ⁇ g / ml salmon sperm DNA, 0.1% SDS, and the probe at 7.5 10 5 dpm / ml.
  • the filters are washed twice for 20 minutes at 42 ⁇ C in 2 x SSC, 0.1% SDS and twice for 30 minutes in 0.2 x SSC, 0.1% SDS at 42 "C and 55 ⁇ C respectively.
  • Three identical positive clones are obtained (including ⁇ RGE 12A) from 800,000 clones and a 3.5 kb Nhel-Nhel fragment is subcloned in the Xbal site of M13 and sequence (Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, AR Pro ⁇ . Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977)).
  • primers derived from this sequence are synthesized (DNA synthesizer-Mate 391A, Applied Biosystems) at -32 (5'- ACATTTTGGAGTCGCGTTCCTCTG, primer 4) and at -7 (CGAATTCATGGCACCTCTGAGCCAGATAAGCAC, primer 1) and a degenerate primer of the of D2 receptor MbVII (primer 2) (5'-
  • a single-strand cDNA is synthesized using reverse transcriptase AMV (20 U, Boehringer), and poly (A) * mRNA (2 ⁇ g) from rat brain.
  • This matrix is amplified (Kawazaki, ES and Wang, PM In: PCR Technology, (ed Erlich, HA) 89-97 (Stockholm Press. 1989)) using primer 4 and primer 2 (75nM each) during 30 cycles (92 ° C, 52 ° C and 72 ° C for 1 min each) with 2.5U of Taq DNA polymerase (Perkin Elmer Cetus).
  • a restriction fragment radioactively labeled Bst XI-EcoRI is used to screen a rat genomic band, partially cut with Sau 3A (Clontech) as described above.
  • a positive RGS3 clone is obtained, analyzed and a 3.5 kb Nhel-Nhel fragment hybridizing with the Bst XI-EcoRI probe is subcloned in M13 and sequence.
  • a primer is synthesized 45 nucleotides downstream of the first stop codon TGA in the frame (primer 3: CCACGTCGACAGATCTCGAAGTGGGTAAAGGGAGTG). Primers 1 and 3 are then used in the RT-PCR technique as described above, using poly (A) + olfactory tuber mRNA as a source of RNA.
  • a band of expected size (1.4 kb) is extracted after agarose gel electrophoresis and digested with EcoRI-SalI for directional subcloning in M13 mp 18, M13 mp 19 and pGEM 4Z. Four individual clones in M13 are fully sequenced and appear to be identical.
  • the expression vectors are derived from the plasmid pSV / S 2 -MDH (Emorine, L., Marullo, S., Delavier-Klutchko, C., Kaveri, SV, Durieu-Trautmann, 0. and Strosberg, AD Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6995-6999 (1987)).
  • the ⁇ ⁇ adrenergic receptor is excised from pSV 8 2 -MDH by digestion with HindIII and EcoRI and replaced by a Smal-EcoRI restriction fragment of the clone of the D-2A receptor using a HindlII franc nucleotide adapter leading to the plasmid pSV D- 2.
  • the vector for expressing the D-3 receptor is obtained by replacing the HindIII-BglII restriction fragment of pSV D-2 with an EcoRI-BglII restriction fragment of the RT-PCR B clone, using a HindlII-EcoRI oligonucleotide adapter. leading to the plasmid pSV D-3.
  • the expression of the D-3 receptor is demonstrated by the binding of iodosulpride- 125 I to membranes of cells transfected according to the technique of Martres et al. 1985.
  • the binding experiments are carried out (Martres, MP, Bouthenet, ML, Salés, N., Sokoloff, P.
  • the D-2 and D-3 receptors have been expressed in COS-7 cells or CHO cells, which normally do not have binding sites for iodosulpride- 125 I, which is a ligand exhibiting a high affinity for D-2 receptors but not for the D-1 receptor in the brain.
  • the D-2 and D-3 receptors are both labeled above a non-specific binding threshold.
  • the values of 1 ⁇ are 0.6nM and 1.2nM respectively for D-2 and D-3, and the values Bmax (Bmax representing the maximum concentration respectively in D-2 receptor and D-3) are about lpmol / mg membrane protein in both cases.
  • the two receptors can be clearly distinguished using several dopamine agonists and antagonists. Dopamine itself, in the absence of added guanylnucleotide, is approximately 20 times more refined vis-à-vis the D-3 receptor than vis-à-vis the D-2 receptor (see Table 1 and Figures 7a and 7b).
  • the dopamine displacement curve with respect to the D-2 receptor is transferred to the right ( Figure 7a) indicating the presence of an appropriate G protein.
  • the curve of displacement of dopamine with respect to the D-3 receptor is not significantly modified in the presence of guanylnucleotide ( Figure 7b). This may correspond to the absence of an appropriate G protein in the CHO cell as well as in the COS-7 cells. This may also correspond to a weak modulation of the dopamine binding by the guanylnucleotides towards the D-3 receptor.
  • apomorphine and bromocriptine show similar affinities towards the two receptors, while TL99 and pergolide, considered as selective selective autoreceptor agents (Clark, D. and White, FJ Synapse 1, 347-388 (1987); Wolf, ME and Roth, RH In: Dopamine receptors. Vol. 8 (eds Creese, I. and Fraser, CM.) 45-96 (Alan R. Liss Inc. New-York , 1987)) and quinpirole are much more affinity towards the D-3 receptor than vis-à-vis the D-2 receptor.
  • dopamine antagonists belonging to various chemical classes and clinically used as neuroleptics show nanomolar affinities with regard to the two receptors.
  • haloperidol, spiperone, thioproperazine, and prochlorperazine are approximately 10 to 20 times more affinity for of the D-2 receptor than vis-à-vis the D-3 receptor
  • sulpiride (-), clozapine, thioridazine, amisulpride or racloprid are only 2 to 3 times more affinent towards D-2 receiver than vis-à-vis the D-3 receiver.
  • FIG. 8a the analysis by transfer of the messenger RNAs of the D-3 receptor from the rat brain is shown.
  • poly (A) + RNAs are prepared (Chirgwin, JJ, Przbyla, AE, MacDonald, RJ and Rutter, WJ Biochemistry 18, 5294-5299 (1979); Aviv, H. and Leder, P., Proc Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408-1412 (1972)).
  • FIG. 8b shows the autoradiograms of agarose gel electrophoresis of cDNA products labeled with phosphorus 32, generated at starting from poly (A) + mRNA by PCR technique after amplification of 25 cycles (high) and amplification of 32 cycles (low).
  • the single-strand cDNA is synthesized using l ⁇ g of RNA, 2OU of AMV reverse transcriptase and primer 3 ( Figure 2).
  • the double-stranded cDNA is synthesized and amplified using 2.5U of Taq polymerase, primer 3 and an oligonucleotide derived from amino acids 300-306 ( Figure 2): 5 '-AAGCGCTACTACAGCATCTGC (primer 5) for 25 or 32 cycles (92 ⁇ C, 56 ⁇ C and 72 ° C, lmn each).
  • a tracer dose of ( 32 P) dCTP is incorporated during amplification and the DNA is electrophoresed in 1.5% agarose.
  • the bonding with 1 • iodosulpride 15 I is carried out on sections of non-fixed cryostat incubated with 0.3 nM d • iodosulpride 125 I, rinsed and affixed for 5 days on a film designated under the name 3 H- Amersham hyperfilm (Bouthenet , ML, Martres MP, Salés, N. and Schwartz JC Neuroscience 20, 117-155 (1987)).
  • monobrin RNA probes labeled with 32 P are synthesized using a kit sold under the name Riboprobe (Proméga) with 32 P-UTP and T7 RNA polymerase.
  • the templates (10ng) are recombinant plasmids from pGEM-4Z digested with EcoRI containing a SacI-AfllI fragment of the D-2 receptor clone or a BamHI-Downstream fragment of the RT-PCR clone B in the appropriate orientation. Sections of cryostat (10 ⁇ m) are mounted on plates, fixed in 4% for aldehyde, treated with proteinase K and are subjected to hybridization overnight at 55 ° C. (Meador-Woodruff, JH, Mansour, A ., Bunzow, JR, Van Toi, HHM, Watson, SJ and Civelli, 0. Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the rats receive a unilateral injection of 6-hydroxydopamine (8 ⁇ g / 4 ⁇ l of saline solution) into the median beam of the telencephalon at coordinates A 4.7mm, L 1.5mm and H 1.0mm (Paxinos, G. and Watson, C. In: The rat brain stereotaxic coordinates (Académie Press, London. 1982)).
  • the rats having contralateral rotations following an administration of 0.25 mg / kg of apomorphine are chosen. They are sacrificed 4 to 7 weeks after the lesion and the total RNA of the individual black substance or of the ventral tegmental area is prepared (Chomczynski, P. and Sacchi, N. Analytical Biochemistry 162, 156-159 (1987)) .
  • PCR experiments are carried out as described in connection with FIGS. 8a and 8b, using oligonucleotides derived from amino acids 43-51: 5'-GATGGTGGGTATGGGTCAGAAGGA and amino acids 243-253: 5 '-GCTCATTGCCGATAGTGATGACCT for J-actin.
  • oligonucleotides derived from amino acids 195-203: 5'-TCCGAATTCTCATTCTACGTGCCCTTCATC and amino acids 355-363: 5'-GCTTTCTGCGGCTCATCGTCTTAA are used for the D-2 receptor.
  • Primers 3 and 5 are used for the D-3 receptor.
  • PCR products are obtained after 16 cycles (rows 1 and 4), 23 cycles (rows 2 and 5) and 27 cycles (rows 3 and 6) for / 3-actin and after 23 cycles (rows 1 and 4), 27 cycles (rows 2 and 5) and 30 cycles (rows 3 and 6) for D-2 and D-3 receptors with rat black substance (rows 1-3: lesion side; rows 4-6: control side ).
  • the experiment is repeated 4-7 times with individual tissues and parallel experiments are carried out with the ventral tegmental area.
  • Gel autoradiograms are carried out, corresponding to 23 and 30 cycles for ⁇ -actin and the receptors respectively.
  • the ratio of the optical densities corresponding to the receptors and to jS-actin is calculated.
  • the reports obtained for the side of the lesion are then compared to the reports obtained for the control side in each of the animals. 6) Determination of a specific ligand with respect to the D-3 receptor:
  • FIG 11 shows the specific binding to D-2 and D-3 receptors in the presence of 7 OHDPAT- 3 H in increasing concentrations.
  • Such selective ligands for D-3 receptors could be obtained using the following molecules: quinpirole, pergolide, TL 99, quinolane (described in Foreman MM et al., 1989, "Preclinical studies on quinolane, a potent and highly selective D- 2-dopaminergic agonist ", J. Pharm. Exp. Ther., 250_: 227-235) and SND 919 (described in Yamada K. et al., 1990," Possible involvement of differing classes of dopamine D-2 receptors in yawning and stereotypy in rats ", Psychopharmacology, 100: 141-144).

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Abstract

L'invention a pour objet de nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur dopaminergique contenant: la séquence de 446 acides aminés de la Figure 1, ou un fragment de cette séquence, ce fragment étant tel que, soit il contient néanmoins les sites contenus dans cette séquence et dont la présence est nécessaire pour que, lorsque ce fragment est exposé à la surface d'une cellule, il soit capable de lier la dopamine à ses agonistes ou antagonistes de manière spécifique et mesurable, par exemple au moyen d'un ligand radioactif, soit il est susceptible d'être reconnu par des anticorps qui reconnaissent également la susdite séquence de 446 acides aminés, mais ne reconnaissent ni le récepteur dopaminergique D-1, ni le récepteur dopaminergique D-2, soit il est susceptible de générer des anticorps reconnaissant la susdite séquence de 446 acides aminés mais ne reconnaissant ni le récepteur dopaminergique D-1, ni le récepteur dopaminergique D-2.

Description

POLYPEPTIDES AYANT UNE ACTIVITE DE RECEPTEUR DOPAMINERGIQUE, ACIDES NUCLEIQUES CODANT POUR CES POLYPEPTIDES ET UTILISATION DE CES POLYPEPTIDES POUR LE CRIBLAGE DE SUBSTANCES ACTIVES SUR CES POLYPEPTIDES.
L'invention a pour objet des polypeptides ayant une activité de récepteur dopaminergique et les gènes codant pour ces polypeptides.
L'invention est également relative
- à des vecteurs contenant les gènes codant pour des polypeptides ayant une activité de récepteur dopaminergique,
- à des cellules transformées pour exprimer les gènes susdits sur lesquelles il est possible d'évaluer l'activité d'agents agonistes ou antagonistes desdits récepteurs , à des sondes nucléotidigues susceptibles de s'hybrider avec les gènes codant pour les susdits polypeptides, lesquelles sondes seraient susceptibles d'être utilisées pour le diagnostic in vitro d'affections, notamment neurologiques, psychiatriques, cardio-vasculaires ou neuroendocriniennes,
- à des anticorps polyclonaux et monoclonaux dirigés contre les susdits polypeptides et utilisables dans un but analytique pour purifier lesdits polypeptides, de diagnostic ij vitro, ou dans un but thérapeutique, notamment dans les affections impliquant les systèmes dopaminergiques,
- à des trousses (ou kits) pour étudier le degré d'affinité de certaines substances pour les susdits polypeptides ,
- à des médicaments destinés plus particulièrement au traitement des affections psychiatriques, neurologiques, cardio-vasculaires ou neuroendocriniennes et contenant des substances actives sur les susdits polypeptides ayant une activité de récepteur dopaminergique, ou contenant des substances actives sur des cellules transfectées par les gènes ou fragments de gènes codant pour lesdits polypeptides à activité de récepteur dopaminergique, - à des médicaments actifs sur les récepteurs dopaminergiques déjà identifiés mais dont on voudrait diminuer certains effets secondaires attribuables à leur interaction avec lesdits polypeptides.
Il était admis jusqu'alors que les divers effets de la dopamine résultaient de son interaction avec deux types de récepteurs communément désignés sous les noms de récepteurs D-1 et D-2 (Kekabian J. . et Calne
D.B., "Multiple receptors for dopamine". Nature, 1979,
277:93-96). Parmi ceux-ci, seule la séquence du récepteur D-2 était connue (Bunzow J.R. , Van Toi
H.H.M. , Grandy D.K. , Albert P., Salon J. , Christie Me
D. , Machida C.A. , Neve K.A. et Civelli 0. "Cloning and expression of a D-2 dopamine receptor cDNA". Nature,
1988, 336: 783-787) et deux isoformes du récepteur D-2
(parfois désignées D-2A et D-2B ou encore D-2(415) et
D-2(444) résultant de l'épissage alternatif de l'ARN messager du gène dudit récepteur avaient été décrites
(Giros B., Sokoloff P., Martres M.P., Riou J.F.,
Emorine L.J. et Schwartz J.C. "Alternative splicing directs the expression of two D-2 dopamine receptor isofor s". Nature, 1989, 342: 923-926 ; Dal Toso R. ,
Sommer B. , Ewert M., Herb A., Pritchett D.B., Bach A.,
Shivers B.D. et Seeburg P.H. "The dopamine D-2 receptor : two molecular forms generated by alternative splicing". The EMBO Journal, 1989, 8:
4025-4034) .
Le récepteur D-2 appartient à la famille des récepteurs comportant sept domaines transme branaires, couplés à une protéine G et présentant un certain degré d'homologie avec les récepteurs de la famille des rhodopsines qui sont exprimés par les photorécepteurs de la rétine.
L'existence de récepteurs dopaminergiques distincts des récepteurs D-1 et D-2 avait été suspectée par divers auteurs sur des observations indirectes (voir notamment Schwartz J.C., Delandre M., Martres M.P., Sokoloff P., Protais P., Vasse M., Costentin J., Laibe P., ermuth C.G., Gulat C. et Lafitte A. "Biochemical and behavioral identification of discriminant benzamide derivatives : new tools to differentiate subclasses of dopamine receptors". Catechola ines: neuropharmacology and central nervous system. Theoretical aspects. Alan R. Liss, Inc. N.Y. 1984, pp. 59-72) mais n'avait jamais été prouvée car lesdits récepteurs n'avaient jamais été isolés, ni identifiés quant à leur structure, ni entièrement définis par leurs propriétés pharmacologiques. En particulier, l'existence d'autorécepteurs régulant la synthèse et/ou la libération de dopamine et/ou encore l'activité des neurones dopaminergiques avait été démontrée mais il était couramment admis qu'ils étaient identiques aux récepteurs D-2 en ce qui concerne leur pharmacologie.
L'invention a pour objet de donner accès à de nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur dopaminergique, ne s'apparentant ni à celle des récepteurs dopaminergiques D-1, ni à celle des récepteurs dopaminergiques D-2.
L'invention a également pour objet des procédés de criblage de nouveaux médicaments agissant sur les nouveaux polypeptides ayant une action de récepteur dopaminergique ou dont on voudrait au contraire éviter 1•interaction avec les nouveaux polypeptides, et destinés, entre autres, au traitement des troubles psychiatriques, neurologiques, cardio-vasculaires ou neuroendocriniens. En particulier, le nouveau polypeptide de 1'invention ayant une activité de récepteur dopaminergique :
- contient la séquence de 446 acides aminés de la Figure 1 ou un fragment de cette séquence, ce fragment étant tel que
* soit il contient néanmoins les sites contenus dans cette séquence et dont la présence est nécessaire pour que, lorsque ce fragment est présent dans une membrane, il soit capable de lier la dopamine à ses agonistes ou antagonistes de manière spécifique et mesurable, par exemple au moyen d'un ligand radioactif selon la technique décrite dans Sokoloff P. , Martres M.P. et Schwartz J.C. "Three classes of dopamine receptor (D-2, D-3, D-4) identified by binding studies with 3H-apomorphine and 3H-domperidone". Naunyn- Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1980, 315: 89-102 et dans Martres M.P., Bouthenet M.L., Sales N. , Sokoloff P. et Schwartz J.C. "Widespread distribution of brain dopamine receptors evidenced with 125I-iodosulpride, a highly sélective ligand". Science, 1985, 228: 752-755.
* soit il est susceptible d'être reconnu par des anticorps qui reconnaissent également la susdite séquence de 446 acides aminés, mais ne reconnaissent ni le récepteur dopaminergique D-1, ni le récepteur dopaminergique D-2,
* soit il est susceptible de générer des anticorps qui reconnaissent la susdite séquence de 446 acides aminés mais ne reconnaissent ni le récepteur dopaminergique D-1, ni le récepteur dopaminergique D-2, ou les polypeptides variants qui correspondent aux polypeptides sus-définis, comportant certaines mutations localisées, sans que les polypeptides ne perdent les propriétés de récepteur dopaminergique. En particulier, un polypeptide variant avantageux de 1'invention ayant une activité de récepteur dopaminergique :
- contient la séquence de 446 acides aminés de la Figure 2 ou un fragment de cette séquence, ce fragment étant tel que
* soit il contient néanmoins les sites contenus dans cette séquence et dont la présence est nécessaire pour que, lorsque ce fragment est présent dans une membrane, il soit capable de lier la dopamine à ses agonistes ou antagonistes de manière spécifique et mesurable, par exemple au moyen d'un ligand radioactif selon la technique décrite dans Martres, M.P., Bouthenet, M.L., Salés, N., Sokoloff, P. et Schwartz, J.C. Science 228, 752-755 (1985),
* soit il est susceptible d'être reconnu par des anticorps qui reconnaissent également la susdite séquence de 446 acides aminés, mais ne reconnaissent ni le récepteur dopaminergique D-1, ni le récepteur dopaminergique D-2,
* soit il est susceptible de générer des anticorps qui reconnaissent la susdite séquence de 446 acides aminés mais ne reconnaissent ni le récepteur dopaminergique D-1, ni le récepteur dopaminergique D-2.
La reconnaissance de l'une des susdites séquences de 446 acides aminés par les susdits anticorps - ou du susdit fragment par les susdits anticorps - signifie que la susdite séquence forme un complexe avec 1'un des susdits anticorps.
La formation du complexe antigène (c'est-à-dire séquence de 446 acides aminés ou susdit fragment)- anticorps et la détection de l'existence d'un complexe formé peuvent se faire par des techniques classiques (telles que celles utilisant un traceur marqué par des isotopes radioactifs ou une enzyme) .
Pour ce qui est de la définition des "fragments contenant les sites" et répondant à la susdite définition, on se reportera ci-après dans la description.
Parmi les fragments ci-dessus définis, on préfère le ou les fragments produits par épissage alternatif de l'ARN messager produit par le gène codant pour l'une des deux séquences de 446 acides aminés définie ci-dessus.
De façon avantageuse, les polypeptides de 1•invention correspondent à des fragments de la séquence représentée sur la Figure 2, qui contiennent l'acide aminé correspondant à celui en position 139.
Des polypeptides avantageux de 1'invention sont tels qu'ils contiennent les sites contenus dans l'une des susdites séquences de 446 acides aminés, dont la présence est nécessaire pour que, lorsque ces polypeptides sont exposés à la surface d'une cellule en présence d'iodosulpride 15I, et en présence d'un agoniste, l'affinité respective des agonistes suivants: quinpirole, apomorphine, dopamine, vis-à-vis des polypeptides de 1*invention est dans 1'ordre suivant :
- l'affinité du quinpirole vis-à-vis des polypeptides de l'invention est supérieure à l'affinité de 1'apomorphine vis-à-vis des polypeptides de l'invention, l'affinité de 1• pomorphine vis-à-vis des polypeptides de l'invention est sensiblement égale à l'affinité de la dopamine vis-à-vis des polypeptides de l'invention.
Des peptides avantageux de 1'invention sont tels qu'ils contiennent les sites contenus dans l'une des susdites séquences de 446 acides aminés, dont la présence est nécessaire pour que, lorsque ces polypeptides sont exposés à la surface d'une cellule en présence d'iodosulpride 125I, et en présence d'un antagoniste , l'affinité respective des antagonistes suivants : raclopride, UH 232, halopéridol vis-à-vis des polypeptides de l'invention est dans l'ordre suivant :
- l'affinité du raclopride vis-à-vis des peptides de l'invention est supérieure à l'affinité de UH 232 vis-à-vis des polypeptides de l'invention, et
- l'affinité de UH 232 vis-à-vis des polypeptides de l'invention est sensiblement égale à l'affinité de 1'halopéridol vis-à-vis des polypeptides de 1'invention.
UH 232 est défini dans l'article de Svensson K. et al. "(+)- AJ 76 and (+)-UH 232 : central stimulants acting as preferential dopamine autoreceptor antagonists". Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol., 1986, 334, 234-245.
Dans ce qui précède et dans ce qui suit, un ligand est considéré comme "agoniste" ou "antagoniste", par référence au comportement connu de ce ligand vis-à-vis du récepteur D-2.
La mesure de l'affinité d'un agoniste ou d'un antagoniste vis-à-vis des polypeptides de 1'invention se fait par compétition entre l'agoniste ou l'antagoniste (dont on veut mesurer l'affinité) et 1'iodosulpride 125I, qui est un ligand à haute affinité des polypeptides de l'invention.
En ce qui concerne la mesure de l'affinité des agonistes ou des antagonistes vis-à-vis des polypeptides de l'invention, elle peut avoir lieu dans les conditions suivantes : on utilise une solution (volume final = 400μl) de tampon Tris-HCl 50mM, contenant NaCl 120mM, KC1 5mM, CaCl2 2mM, MgCl2 2mM, 0,1% d'acide ascorbique, 8- hydroxy quinoléine lOμM, 0,1% d'albumine de sérum bovin et iodosulpride-125I 0,1 à 0,2nM , 5 μg de protéines de membrane provenant de cellules CHO transfectées, dans lesquelles les polypeptides sont présents à raison d'environ lpmol/mg de protéine membranaire.
L'invention concerne également des protéines chimères dans lesquelles le polypeptide tel que défini plus haut ou des parties de celui-ci sont réunis à un enchaînement d'acides aminés hétérologue par rapport à ce polypeptide.
Les polypeptides et protéines chimères de l'invention peuvent être glycosylés et peuvent comporter ou non des ponts disulfure.
Dans la suite de la description, les polypeptides de l'invention seront, pour simplifier, désignés par "récepteurs D-3".
Un récepteur D-3 avantageux de 1*invention est constitué par l'enchaînement des acides aminés 1 à 446, représentés sur la Figure 1 ou par l'enchaînement des acides aminés 1 à 446 représenté sur la Figure 2.
Ce récepteur D-3 est considéré comme comportant sept régions transmembranaires hydrophobes séparées par des boucles hydrophiles intra et extracellulaires. L'invention concerne également les polypeptides variants qui correspondent aux polypeptides sus- définis comportant certaines mutations localisées, sans que les polypeptides ne perdent les propriétés de récepteur D-3 dopaminergique, et qui sont reconnus par des anticorps reconnaissant les régions transmembranaires, ainsi que ceux qui sont reconnus par des anticorps reconnaissant les régions autres que les régions transmembranaires.
L'invention concerne également des acides nucléiques qui comprennent ou qui sont constitués par un enchaînement de nucleotides codant pour l'un quelconque des récepteurs D-3 précédemment définis.
Plus particulièrement, l'invention concerne l'acide nucléique qui comprend l'enchaînement de nucleotides représenté sur la Figure 3, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 1 à celle constituée par le nucléotide en position 1863.
Plus particulièrement, l'invention concerne également l'acide nucléique qui comprend l'enchaînement de nucleotides représenté sur la Figure 4, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 1 à celle constituée par le nucléotide en position 1863.
L'invention concerne particulièrement l'acide nucléique représenté sur la Figure 2 comprenant ou étant constitué par l'enchaînement s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 442 à celle constituée par le nucléotide en position 1779.
L'acide nucléique sus-défini correspond à la partie codante du gène correspondant au polypeptide représenté sur la Figure 1.
L'invention concerne particulièrement l'acide nucléique représenté sur la Figure 4 comprenant ou étant constitué par l'enchaînement s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 442 à celle constituée par le nucléotide en position 1779.
L'acide nucléique sus-défini correspond à la partie codante du gène correspondant au polypeptide représenté sur la Figure 2.
De préférence, les acides nucléiques de l'invention sont tels qu'ils correspondent à des fragments de l'enchaînement de nucleotides représenté sur la Figure 4 et contiennent les nucleotides correspondant respectivement à ceux situés aux positions 856, 857 et 859.
Font également partie de 1'invention les acides nucléiques variants par rapport à ceux sus-définis et qui comportent certaines mutations localisées dans la mesure où ces acides nucléiques variants s'hybrident avec les acides nucléiques précédemment définis ou avec les sondes nucléiques définies ci-après dans les conditions d'hybridation définies ci-après dans la description.
Les acides nucléiques de 1'invention peuvent être préparés soit par un procédé chimique, soit par d'autres procédés.
Un mode de préparation approprié des acides nucléiques (comportant au maximum 200 nucleotides - ou pb, lorsqu'il s'agit d'acides nucléiques bicaténaires) de 1'invention par voie chimique comprend les étapes suivantes : la synthèse d'ADN en utilisant la méthode automatisée de 0-cyanéthyl phosphoramidite décrite dans Bioorganic Che istry 4; 274-325, 1986,
- le clonage des ADN ainsi obtenus dans un vecteur plasmidien approprié et la récupération des ADN par hybridation avec une sonde appropriée.
Un mode de préparation, par voie chimique, d'acides nucléiques de longueur supérieure à 200 nucleotides - ou pb (lorsqu'il s'agit d'acides nucléiques bicaténaires) comprend les étapes suivantes:
- l'assemblage d'oligonucléotides synthétisés chimiquement, pourvus à leurs extrémités de sites de restriction différents, dont les séquences sont compatibles avec l'enchaînement en acides aminés du polypeptide naturel selon le principe décrit dans Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80; 7461-7465, 1983, - le clonage des ADN ainsi obtenus dans un vecteur plasmidien approprié et la récupération de l'acide nucléique recherché par hybridation avec une sonde appropriée.
Un autre procédé de préparation des acides nucléiques de l'invention à partir d'ARN comprend les étapes suivantes :
- préparation d'ARN cellulaire à partir de tout tissu exprimant le récepteur dopaminergique D-3 selon les techniques décrites par Maniatis et al., "Molecular cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, et Ausubel F.M., Brent R. , Kingston R.E., Moore D.D., Smith J.A., Seidman J.G. et Struhl K. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, chapitre 4, Green Publishing Associates et iley-Interscience, New York,
- récupération et purification des ARNm par passage des ARN cellulaires totaux par chromatographie avec un oligodT immobilisé,
- synthèse d'un brin d'ADNc à partir des ARNm purifiés d'après la technique décrite dans Gène 25:263, 1983,
- clonage des acides nucléiques ainsi obtenus dans un vecteur plasmidien approprié et récupération de la séquence nucléotidique recherchée en utilisant une sonde d'hybridation appropriée.
Pour préparer les acides nucléiques de l'invention, les sondes d'hybridation oligonucléotidiques synthétisées chimiquement peuvent être les suivantes : celle définie par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 3, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 1, à celle constituée par le nucléotide en position 441, celle définie par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 3, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 442, à celle constituée par le nucléotide en position 537, celle définie par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 3, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 718, à celle constituée par le nucléotide en position 753, celle définie par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 3, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 820, à celle constituée par le nucléotide en position 888, celle définie par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 3, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 958, à celle constituée par le nucléotide en position 996, celle définie par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 3, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 1068, à celle constituée par le nucléotide en position 1240,
- celle définie par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 3, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 1068, à celle constituée par le nucléotide en position 1566, ou leur séquence nucléotidique complémentaire; ce sont des séquences qui ont été dérivées de celles de la Figure 3 et elles peuvent être utilisées dans les conditions d'hybridation décrites par Maniatis et al. , "Molecular cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.
Pour préparer les acides nucléiques de l'invention, une autre sonde d'hybridation oligonucléotidique synthétisée chimiquement peut être la suivante : celle définie par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 4, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 820, à celle constituée par le nucléotide en position 888 cette séquence dérive des séquences de la Figure 4 et elle peut être utilisée dans les conditions d'hybridation décrites par Maniatis et al. (1982) déjà cité.
La synthèse du brin d'ADNc et son amplification subséquente in vitro peut également être effectuée en utilisant la méthode PCR (Polymerase Chain Reaction) , comme décrit par exemple par Goblet et al. Nucleic Acid Research, 17, 2144, 1989 "One step amplification of transcripts in total RNA using Polymerase Chain Reaction", en utilisant deux amplimères chimiquement synthétisés définis à partir de la séquence de la Figure 3. Des amplimères appropriés sont par exemple : celui défini sur la Figure 3 du nucléotide 410 au nucléotide 433 et celui défini sur la Figure 3 du nucléotide 1800 au nucléotide 1825.
Le fragment d'acides nucléiques amplifié peut être ensuite clone selon les techniques décrites dans Ausubel F.M., Brent R. , Kingston R.E., Moore D.D., Smith J.A., Seidman J.G. et Struhl K. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, chapitre 3, Green Publishing Associates et Wiley-Interscience, New York.
L'invention concerne également les vecteurs recombinants, en particulier pour le clonage et/ou l'expression, notamment du type plasmide, cosmide, phage, ou virus, contenant un acide nucléique de l'invention en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication. Un vecteur approprié de l'invention, contient en l'un de ses sites non essentiels pour sa replication des éléments nécessaires pour promouvoir l'expression d'un polypeptide selon l'invention, dans un hôte cellulaire et éventuellement un promoteur reconnu par les poly érases de l'hôte cellulaire, en particulier un promoteur inductible et éventuellement une séquence signal et une séquence d'ancrage.
L'invention concerne également un hôte cellulaire transformé par un vecteur recombinant défini précédemment comprenant les éléments de régulation permettant l'expression de la séquence nucléotidique codant pour l'un des polypeptides selon l'invention dans cet hôte.
Par hôte cellulaire on entend tout organisme susceptible d'être maintenu en culture.
L'un des microorganismes utilisés peut être constitué par une bactérie, notamment Escherichia coli.
Un organisme de choix est constitué par un organisme eucaryote tel que des cellules CHO (Chinese Hamster Ovary) ou COS-7 (fibroblaste de rein de singe vert africain transformé par le virus SV-40) .
Mais d'autres organismes peuvent être utilisés tout aussi aisément, naturellement sous réserve que l'on dispose pour chacun d'entre eux des vecteurs, notamment plasmidiques, susceptibles de s'y répliquer et des séquences de nucleotides insérables dans ces vecteurs et capables, lorsqu'elles sont suivies dans ces vecteurs par un insérât codant pour un polypeptide de l'invention, d'assurer l'expression de cet insérât dans les organismes choisis et leur transport dans les membranes de ces hôtes cellulaires.
L'invention concerne également les anticorps dirigés de façon spécifique contre l'un des polypeptides de l'invention, ces anticorps étant tels qu'ils ne reconnaissent ni le récepteur dopaminergique D-1, ni le récepteur dopaminergique D-2. En particulier, ces anticorps reconnaissent les séquences d'acides aminés suivantes :
- celle définie par la séquence d'acides aminés représentée sur la Figure 1 s'étendant de 1•extrémité constituée par l'acide aminé en position 1 à celle constituée par l'acide aminé en position 38,
- celle définie par la séquence d'acides aminés représentée sur la Figure 1 s•étendant de 1'extrémité constituée par l'acide aminé en position 135 à celle constituée par l'acide aminé en position 147, celle définie par la séquence d'acides aminés représentée sur la Figure 1 s'étendant de 1'extrémité constituée par l'acide aminé en position 175 à celle constituée par l'acide aminé en position 187,
- celle définie par la séquence d'acides aminés représentée sur la Figure 1 s'étendant de 1•extrémité constituée par l'acide aminé en position 210 à celle constituée par l'acide aminé en position 375,
- celle définie par la séquence d'acides aminés représentée sur la Figure 2 s•étendant de 1'extrémité constituée par l'acide aminé en position 135 à celle constituée par l'acide aminé en position 147.
Pour obtenir les anticorps, on peut injecter chez l'animal l'un des susdits polypeptides.
On prépare des anticorps onoclonaux par fusion cellulaire entre des cellules de myélome et des cellules spléniques de souris immunisées, selon les procédés classiques.
Les anticorps de l'invention peuvent être utilisés pour le diagnostic in vitro du caractère tumoral ou non de certaines cellules ainsi que du caractère bénin ou malin de certaines tumeurs, dans la mesure où ces éléments sont corrélés à l'expression pathologique du récepteur D-3. On a pu constater en effet, que dans certaines tumeurs, notamment tumeurs du poumon, il est possible de détecter l'expression de récepteurs dopaminergiques qui ne devraient pas être normalement présents (Sokoloff P., Riou J.F., Martres M.P. et Schwartz J.C. "Présence of dopamine D-2 receptors in human tumoral cell lines". Biochem. Biophys. Res. Comm. 1989, 162: 575-582) .
Ce procédé de diagnostic ^n vitro à partir du prélèvement biologique susceptible de contenir le récepteur dopaminergique D-3 comprend :
- la mise en contact d'un anticorps de l'invention avec le susdit prélèvement biologique dans des conditions permettant la production éventuelle d'un complexe immunologique formé entre le récepteur dopaminergique D-3 ou produit qui en a dérivé et 1'anticorps de 1*invention,
- la détection du susdit complexe immunologique formé.
L'invention concerne également les sondes nucléotidiques synthétiques ou non, s'hybridant avec l'un des acides nucléiques définis ci-dessus ou leurs séquences complémentaires ou leur ARN correspondant, ces sondes étant telles qu'elles s'hybrident ni avec le gène ni avec les ARN messagers des récepteurs D-1 et D-2 dopaminergiques.
Les sondes de 1'invention comportent au minimum 10, avantageusement 15 acides nucléiques et peuvent comporter au maximum la totalité de la séquence nucléotidique représentée sur la Figure 3 ou sur la Figure 4.
Pour les sondes les plus courtes, c'est-à-dire d'environ 10 à environ 100 nucleotides, des conditions d'hybridation appropriées sont les suivantes: 900 mM de NaCl, 90 mM de tri-sodium citrate pH 7,0, 100 μg/ml d'ADN de sperme de saumon, 0,05% de pyrophosphate de sodium, 10 à 25% de formamide déionisée, 0,02% de Ficoll (P de 400.000), 0,02% d'albumine de sérum bovine, 0,02% de polyvinylpyrrolidone, pendant 14 à 16 heures à 42°C.
Pour les sondes les plus longues, c'est-à-dire présentant plus d'environ 100 nucleotides, des conditions d'hybridation appropriées sont les suivantes :
600 mM de NaCl, 60 mM de tri-sodium citrate, 20 μg/ml d'ADN de sperme de saumon, 20 μg/ml d'ARNt de levure, 8 mM de Tris-HCl pH 7,4, 40 à 60% de formamide déionisée, 0,02% de Ficoll, 0,02% d'albumine de sérum bovine, 0,02% de polyvinylpyrrolidone, 0,2% de sodium dodécyl sulfate, 10% de sulfate de dextrane.
L'invention concerne en particulier les sondes nucléotidiques définies précédemment.
Les sondes de l'invention peuvent être utilisées comme outils de diagnostic notamment in vitro d'affections neurologiques, psychiatriques et cardio- vasculaires.
Les sondes de 1'invention peuvent également servir à détailler l'épissage alternatif de l'ARN messager produit par le gène codant pour la séquence de 446 acides aminés définie ci-dessus, l'existence ou non de cet épissage pouvant être liée à des pathologies neurologiques, psychiatriques, cardio-vasculaires ou neuroendocriniennes.
Plus particulièrement, les sondes de l'invention peuvent être utilisées pour détecter les anomalies génétiques, notamment polymorphismes ou mutations ponctuelles.
En ce qui concerne la détection des polymorphismes du gène codant pour le récepteur dopaminergique D-3 chez un individu, elle peut être réalisée à partir d'un échantillon biologique tel que le sang, prélevé chez l'individu selon un procédé comprenant les étapes suivantes : le traitement de l'acide nucléique issu de l'échantillon biologique sus-mentionné réalisé à l'aide d'une enzyme de restriction dans des conditions permettant 1•obtention de fragments de restriction issus du clivage dudit acide nucléique au niveau de ces sites de restriction reconnus par ladite enzyme,
- la mise en contact d'une sonde nucléotidique de l'invention, susceptible de s'hybrider avec les fragments sus-mentionnés dans des conditions permettant la production éventuelle de complexes d'hybridation entre ladite sonde et les fragments de restriction sus-mentionnés,
- la détection des susdits complexes d'hybridation,
- la mesure de taille des éventuels fragments de restriction polymorphes engagés dans les complexes d'hybridation sus-mentionnés.
En ce qui concerne la méthode de diagnostic in vitro de détection des mutations ponctuelles de l'acide nucléique ou d'un fragment de l'acide nucléique codant pour le récepteur dopaminergique D-3 chez un individu, elle peut être effectuée selon le procédé comprenant les étapes suivantes :
- la mise en contact d'une sonde nucléotidique de l'invention avec un prélèvement biologique, par exemple du sang, dans des conditions permettant le production éventuelle d'un complexe d'hybridation formé entre la sonde et l'acide nucléique ou un fragment d'acide nucléique sus-mentionné,
- la détection du susdit complexe d'hybridation,
- le séquençage de l'acide nucléique ou du fragment d'acide nucléique intervenant dans le susdit complexe d' ybridation,
- la comparaison de la séquence de 1'acide nucléique ou du fragment d'acide nucléique intervenant dans le susdit complexe d'hybridation avec la séquence de l'acide nucléique (ne présentant pas de mutation) ou du fragment de l'acide nucléique (ne présentant pas de mutation) du récepteur dopaminergique D-3.
En ce qui concerne la détection de 1'épissage alternatif de l'ARN messager produit par le gène codant pour le récepteur D-3, elle peut se faire par quantification de l'ARN messager contenu dans un échantillon de tissu, en utilisant l'une des sondes de 1'invention.
Les sondes de l'invention peuvent également être utilisées pour détecter l'expression pathologique du récepteur dopaminergique D-3, cette expression étant révélée par la présence d'ARN messager du récepteur dopaminergique D-3 dans des cellules où il ne devrait pas être présent.
Cette détection in vitro peut être effectuée à partir d'un échantillon biologique prélevé chez un individu, tel que le sang, selon un procédé qui comprend les étapes suivantes :
- l'amplification préalable possible des quantités de séquence nucléotidique susceptible d'être contenue dans un échantillon biologique prélevé sur un patient, au moyen d'une amorce d'ADN,
- la mise en contact de l'échantillon biologique indiqué ci-dessus avec une sonde nucléotidique, dans des conditions permettant la production d'un complexe d'hybridation formé de ladite sonde et ladite séquence nucléotidique,
- la détection du complexe d'hybridation ci-dessus qui a pu se former.
Cette expression pathologique du récepteur dopaminergique D-3 peut se manifester dans le cas de certaines tumeurs, et peut aussi être corrélée au caractère malin ou bénin de certaines tumeurs.
Les polypeptides de 1'invention peuvent être préparés par culture dans un milieu approprié d'un hôte cellulaire préalablement transformé par un vecteur recombinant contenant 1'un des acides nucléiques définis précédemment et par récupération à partir de la susdite culture du polypeptide produit par ledit hôte cellulaire transformé.
Un autre procédé de préparation des polypeptides de l'invention est caractérisé en ce que, partant de préférence de 1'amino acide C-terminal, 1'on condense successivement deux à deux les aminoacyles successifs dans l'ordre requis, ou des aminoacyles et des fragments préalablement formés et contenant déjà plusieurs résidus aminoacyles dans l'ordre approprié, ou encore plusieurs fragments préalablement ainsi préparés, étant entendu que l'on aura eu soin de protéger au préalable toutes les fonctions réactives portées par ces aminoacyles ou fragments à 1'exception des fonctions aminés de l'un et carboxyles de l'autre ou vice versa, qui doivent normalement intervenir dans la formation des liaisons peptidiques, notamment après activâtion de la fonction carboxyle, selon les méthodes connues dans la synthèse des peptides et ainsi de suite, de proche en proche, jusqu'à l'acide aminé N-terminal.
S'agissant de réaliser l'expression des récepteurs dopaminergiques D-3 dans une bactérie, telle que E. coli ou dans une cellule eucaryote telle qu'une cellule CHO, on effectue les étapes suivantes :
- la transformation d'un hôte cellulaire compétent avec un vecteur, notamment un plasmide ou un phage, dans lequel a auparavant été insérée une séquence de nucleotides codant pour le récepteur D-3 (insérât) , sous le contrôle d'éléments de régulation, notamment d'un promoteur reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire et permettant l'expression dans l'hôte cellulaire utilisé de ladite séquence de nucleotides,
- la culture de l'hôte cellulaire transformé dans des conditions permettant l'expression dudit insérât, et le transport du récepteur D-3 exprimé vers la membrane de façon telle que les séquences transmembranaires du récepteur D-3 soient exposées à la surface de 1•hôte cellulaire transformé.
S'agissant de l'expression en cellules eucaryotes, les éléments de régulation peuvent comporter le promoteur endogène des récepteurs dopaminergiques ou des promoteurs viraux tels que ceux des virus SV40 ou du virus du sarcome de Rous (RSV) .
S'agissant de l'expression dans E_;_ coli, les éléments de régulation peuvent comporter le promoteur de l'opéron lactose ou de l'opéron tryptophane.
L'invention concerne également un procédé de détection de la capacité d'une molécule dopaminergique à se comporter comme ligand vis-à-vis d'un polypeptide de l'invention, lequel procédé comprend :
- la mise en contact de la molécule dopaminergique avec un hôte cellulaire préalablement transformé par un vecteur lui-même modifié par un insérât codant pour le susdit polypeptide, cet hôte portant à sa surface un ou plusieurs sites spécifiques de ce polypeptide, le cas échéant après induction de l'expression de cet insérât, cette mise en contact étant effectuée dans des conditions permettant la formation d'une liaison entre l'un au moins de ces sites spécifiques et ladite molécule dès lors qu'elle s'avérerait effectivement posséder une affinité pour ce polypeptide,
- la détection de la formation éventuelle d'un complexe du type ligand-polypeptide.
L'invention concerne également un procédé pour l'étude de l'affinité d'un polypeptide de l'invention pour un ou plusieurs ligands déterminés, lequel procédé comprend :
- la transformation d'un hôte cellulaire compétent avec un vecteur, notamment un plasmide ou un phage, dans lequel avait auparavant été insérée une séquence de nucleotides codant pour le récepteur D-3 (insérât) , sous le contrôle d'éléments de régulation, notamment d'un promoteur reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire et permettant l'expression dans l'hôte cellulaire utilisé de ladite séquence de nucleotides,
- la culture de l'hôte cellulaire transformé dans des conditions permettant l'expression dudit insérât, et le transport du récepteur D-3 exprimé vers la membrane de façon telle que les séquences transmembranaires du récepteur D-3 soient exposées à la surface de l'hôte cellulaire transformé,
- la mise en contact de cet hôte cellulaire avec ces ligands déterminés,
- la détection d'une liaison spécifique entre ledit hôte cellulaire transformé et lesdits ligands déterminés.
Le procédé décrit ci-dessus permet également l'identification des "fragments contenant les sites" dont question précédemment et qui ne comportent qu'une partie de la séquence de 446 acides aminés de la Figure 1 ou de la Figure 2.
Cette identification consiste à utiliser des insérats de taille plus réduite que l'acide nucléique codant pour la susdite séquence, à mettre en oeuvre les étapes relatives à l'expression, au transport du produit d'expression et à l'exposition rappelées ci- dessus. Lorsqu'on obtient l'expression, le transport du produit d'expression et son exposition sur la membrane, ainsi que la réaction avec les ligands telle que précédemment définie, on peut déterminer ainsi les fragments contenant les sites essentiels. Par conséquent, l'absence de réaction avec les ligands, telle que précédemment définie, en utilisant des fragments de taille plus réduite que la séquence complète, tendrait à montrer qu'on a éliminé certains sites essentiels. L'invention concerne également une trousse pour la détection de l'affinité éventuelle d'un ligand pour un polypeptide de l'invention, laquelle trousse comprend:
- une culture d'hôtes cellulaires transformés par un vecteur modifié tel que défini précédemment ou une culture d'hôtes cellulaires définis précédemment, ou une préparation de membranes desdits hôtes,
- des moyens physiques ou chimiques pour induire l'expression de la séquence nucléotidiques contenue dans le vecteur modifié lorsque le promoteur placé en amont de cette séquence est un promoteur inductible par lesdits moyens physiques ou chimiques, et obtenir une protéine,
- un ou plusieurs ligands témoins ayant des affinités déterminées pour le susdit polypeptide, des moyens physiques ou chimiques pour la caractérisation de l'activité biologique de la protéine exprimée.
L'invention concerne également un procédé de criblage de médicaments destinés au traitement d'affections neurologiques (telles que la maladie de Parkinson) , psychiatriques (telles que les états psychotiques) , cardio-vasculaires (telles que l'hypertension artérielle) ou neuroendocriniennes (telles que les dysfonctionnements de l'axe hypothalamo-hypophysaire) .
L'invention concerne également des médicaments contenant, comme substance active, une substance active sur l'un au moins des polypeptides selon l'invention, ayant une activité de récepteur dopaminergique ou contenant comme substance active des substances actives sur des cellules transfectées par les gènes ou les fragments de gènes codant l'un au moins des polypeptides à activité de récepteur dopaminergique selon l'invention, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. L'invention concerne également des médicaments contenant, comme substance active, une substance active sur les récepteurs dopaminergiques D-1 ou D-2, mais inactive sur les polypeptides à activité de récepteur dopaminergique selon l'invention.
L'invention concerne également un procédé de mesure de l'affinité de ligands vis-à-vis d'un polypeptide de l'invention, à l'aide d'un ligand marqué par une méthode radioisotopique et sélectif vis-à-vis du susdit polypeptide de l'invention, comprenant les étapes suivantes :
- s'il y a lieu, la détermination du susdit ligand sélectif vis-à-vis du susdit polypeptide selon le procédé décrit à propos de l'étude de l'affinité d'un polypeptide de 1'invention pour un ou plusieurs ligands déterminés,
- le marquage du ligand sélectif ainsi déterminé par un procédé radioisotopique,
- la mise en contact, selon la technique décrite dans Martres, M.P., Bouthenet, M.L., Salés, N. , Sokoloff, P. et Schwartz, J.C. Science 228, 752-755 (1985), avec des membranes biologiques, notamment de cerveau, contenant le susdit polypeptide de 1•invention avec le ligand sélectif marqué et un ligand dont on veut mesurer l'affinité,
- la détection de la formation éventuelle d'un complexe du type ligand sélectif marqué-polypeptide.
Comme membrane biologique, on peut également travailler sur des membranes de rein.
Le ligand marqué et sélectif vis-à-vis d'un polypeptide de 1'invention peut également être marqué par une méthode enzymatique.
En ce qui concerne la détection du complexe du type ligand sélectif marqué-polypeptide, elle a lieu selon des procédés classiques. L'invention concerne également un procédé de marquage sélectif d'un polypeptide de 1•invention à l'aide d'un ligand marqué selon une technique radioisotopique, sur des membranes biologiques contenant d'une part le récepteur D-1 et/ou D-2 et d'autre part le susdit polypeptide, comprenant les étapes suivantes :
- s'il y a lieu, la détermination d'un ligand sélectif vis-à-vis du récepteur D-1 et/ou D-2 selon le procédé décrit à propos de l'étude de l'affinité d'un polypeptide de l'invention,
- la mise en contact, selon la technique décrite dans Martres, M.P., Bouthenet, M.L., Salés, N., Sokoloff, P. et Schwartz, J.C. Science 228, 752-755 (1985), des susdites membranes biologiques avec le susdit ligand sélectif vis-à-vis du récepteur D-1 et/ou D-2 et avec un ligand marqué selon une technique radioisotopique, notamment 1•iodosulpride-125I, ce qui conduit au marquage sélectif du susdit polypeptide, le récepteur D-1 et/ou D-2 étant occupé par le susdit ligand sélectif,
- la détection de la formation du complexe du type ligand marqué-polypeptide.
La détection du complexe du type ligand marqué- polypeptide peut se faire par des techniques classiques.
Le ligand marqué peut également être marqué selon une méthode enzymatique.
Ce procédé repose sur l'utilisation d'un ligand marqué (par une technique radioisotopique ou enzymatique) , lequel ligand est non sélectif vis-à-vis du récepteur D-3, ce qui implique que si les récepteurs D-1 et/ou D-2 sont également contenus dans les susdites membranes biologiques, ce ligand marqué est susceptible de se lier à la fois aux récepteurs D-1, D-2 et D-3. Afin d'utiliser le ligand marqué dans des conditions telles que le marquage du récepteur D-3 soit sélectif, on a recours à un ligand sélectif vis- à-vis du récepteur D-2 et/ou D-1. Ceci a pour objet d'occuper le récepteur D-2 et/ou D-1 et de le(les) rendre indisponible(s) vis-à-vis du susdit ligand marqué. Il en résulte donc que le susdit ligand marqué ne peut plus qu'occuper le récepteur D-3, ce qui entraîne la formation d'un complexe du type ligand marqué-récepteur D-3.
Le récepteur D-3 présente une distribution anatomique et des caractéristiques pharmacologiques qui le distinguent des récepteurs D-1 et D-2. Il est exprimé préférentiellement dans les régions limbiques du cerveau impliquées dans les processus cognitifs et émotionnels alors que les récepteurs D-1 et D-2 sont présents dans la plupart des régions dopaminoceptives, notamment le système extrapyramidal impliqué dans la motricité involontaire.
La localisation anatomique très particulière du récepteur D-3 dans le système limbique laisse supposer que des agonistes sélectifs de ce récepteur puissent avoir des effets thérapeutiques sur certains troubles cognitifs et émotionnels associés à la maladie de Parkinson.
Les neuroleptiques utilisés en clinique pour traiter les schizophrénies ont tous une affinité pour le récepteur D-3 de l'ordre de 1 à 10 nM qui suggère que le blocage de ce récepteur participe probablement aux effets thérapeutiques des neuroleptiques. De plus, le rapport des affinités respectives des neuroleptiques pour les récepteurs D-2 et D-3 est exprimé par le rapport KjD-2/K,-D-3 comme indiqué dans le tableau I ci-après. Tableau 1 : Pharmacologie des récepteurs D-2 et D-3 exprimés dans des cellules CHO
Figure imgf000029_0001
Les valeurs de K,- sont dérivées d'expériences décrites dans la légende des Figures 5a et 5b. Les courbes ont été analysées par la méthode de régression non linéaire à l'aide d'un calculateur (Martres M.P. et al. "Sélection of dopamine antagonists discriminating various behavioural responses and radioligand binding-sites" Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol., 1984, 325:102-115) . Les valeurs de *Kp dérivent de cinétique de saturation à l'équilibre. Les moyennes ± l'écart moyen au standard de valeurs correspondant à 2-3 expériences, avec des résultats similaires. Les termes agonistes et antagonistes se réfèrent aux actions des médicaments vis-à-vis des récepteurs D2. Les composés sont rangés selon leur rapport K,-D-2/Ki-D3.
SKF 38393 est décrit dans Pendleton R.G. et al. "Studies on rénal dopamine receptors with SK&F 38393, a new agonist" Eur. J. Pharmacol., 1978, £51:19-28, AJ 76 et UH 232 sont décrits dans Svensson K. et al.
"(+)- AJ 76 and (+)-UH 232 : central stimulants acting as preferential dopamine autoreceptor antagonists" Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol., 1986, 334:234-245.
TL99 est décrit dans Goodale D.B. et al. Neurochemical and behavioral évidence for a sélective presynaptic dopamine receptor agonist. Science, 1980, 210, 1141-1143.
Ce rapport est corrélé avec certaines propriétés cliniques des neuroleptiques : ceux qui présentent un faible rapport, d'environ 0,05 à environ 0,13 (halopéridol, thiopropérazine, prochlorpérazine) sont des neuroleptiques pour lesquels 1'incidence des effets secondaires (parkinsonisme, dystonie et dyskinésies tardives) est la plus forte alors que ceux dont le rapport est le plus élevé, d'environ 0,3 à environ 0,6 (clozapine, amisulpride, thioridazine, sulpiride) sont des neuroleptiques "atypiques" qui provoquent moins d'effets secondaires et/ou ont des propriétés désinhibitrices dans certaines formes déficitaires de schizophrénie.
Le criblage de neuroleptiques potentiels par comparaison de leurs affinités respectives pour les récepteurs D-2 et D-3 fournit donc un test prédictif de leurs propriétés "atypiques" ce qui n'existait pas jusqu'alors.
D'autres caractéristiques et avantages de 1'invention apparaissent dans la suite de la description et des exemples, notamment en rapport avec les dessins et tableaux dans lesquels :
- La Figure 1 représente les séquences d'acides aminés du récepteur dopaminergique D-2 (deuxième ligne) de rat, alignée avec celle d'un variant du récepteur dopaminergique D-3 de rat (première ligne) . Dans les séquences du récepteur dopaminergique D-2, les résidus d*amino acides identiques et en position analogue à ceux du variant du récepteur dopaminergique D-3 sont marqués par des doubles traits (=) .
Pour mettre en évidence les homologies, on a effectué des délétions dans les deux séquences, et ces délétions sont représentées par les espaces pointillés
Dans la région N-terminale extra-cellulaire du variant du récepteur D-3, les séquences consensus pour les sites de glycosylation liés à l'asparagine (NXS/T) sont en positions 12 et 19.
- La Figure 2 représente les séquences d'acides aminés du récepteur dopaminergique D-2 (deuxième ligne) de rat, alignée avec celle du récepteur dopaminergique D-3 de rat (première ligne) selon Bunzow J.R. et al. ("Cloning and expression of a rat D-2 dopamine receptor cDNA", Nature, 1988, 336:783-787) .
Les régions transmembranaires sont encadrées et les positions des introns pour le récepteur D-2A du rat (20, 22, 30, 33) et D-3, déduites de l'analyse de λRGE 12A et λRGS 3, sont indiquées par des flèches. Chaque signe "égal" indique une conservation en amino acides et les "tirets" correspondent aux substitutions conservatives où les groupes sont (H,K,R), (I,L,V,M) , (A,G,S,T), (Y,F,W), (D,E,P,N,B,Z), (P) et (C) .
La Figure 3 représente la séquence d'acides nucléiques du susdit variant (cf. Figure 1) du récepteur dopaminergique D-3 chez le rat, et la séquence d'acides aminés correspondante.
La Figure 4 représente la séquence d'acides nucléiques du récepteur dopaminergique D-3 chez le rat, et la séquence d'acides aminés correspondante. - La Figure 5 représente des analyses de Northern Blot d'ARN de tissus cérébraux de rat. Dans la Figure 5, les références 1 à 10 correspondent respectivement à :
Figure imgf000032_0001
ente sché atiquement 1•organisation des clones obtenus après le criblage de l'ADN génomique et l'amplification par technique PCR.
La séquence D-3 est schématiquement représentée par sept cases correspondant à MbI-MbVII, les lignes ouvertes représentant des séquences codantes et les lignes uniques les séquences non traduites. λ RGE 12A et λ RGS 3 sont des clones d'ADN génomique, tandis que RT-PCR A et B représentent des clones d'ADNc obtenus à partir d'amplification selon la technique PCR d'ADNc obtenu à partir de poly(A)+ ARNm et de réverse transcriptase ci-après désignée par RT-PCR. Les lignes sombres représentent les régions codantes (exons de clones d'ADN génomique) et les lignes fines représentent les introns dans les clones d'ADN génomique. Les lignes en pointillés indiquent la continuité de la séquence. Les amorces 1, 2 et 3 sont utilisées pour la technique RT-PCR. Les sites de restriction indiqués sont tels que: A = Aval; Ba = BamHI; Bg = BglII; Bs = Bst XI; E = EcoRI; N = Nhel et S = Sali. A noter que EcoRI, Bgll et Sali sont des adaptateurs de l'extrémité 5' des amorces de RT-PCR.
- Les Figures 7a et 7b représentent les propriétés comparées des récepteurs D-2 et D-3 exprimés dans les cellules transfectées CHO. Plus précisément, la Figure 7a représente l'inhibition de la liaison à 1'iodosulpride-125I par les agonistes de la dopamine et la Figure 7b représente l'inhibition de la liaison à 1'iodosulpride-15I par les antagonistes de la dopamine.
- Les Figures 8a et 8b représentent la caractérisation des transcripts du gène du récepteur D-3 dans différents tissus.
La Figure 9 représente la localisation autoradiographique des sites de liaison à 1'iodosulpride-125I et de l'ARN messager des récepteurs D-2 ou D-3 dans le cerveau de rat.
- La Figure 10 représente les effets des lésions induites par la 6-hydroxydopamine sur les transcripts des gènes des récepteurs D-2 et D-3 dans la substance noire.
- La Figure 11 représente la liaison spécifique aux récepteurs D2 (courbe avec des cercles) et D3 (courbe avec des points noirs) en présence de 7 OHDPAT-3P en concentrations croissantes. Le 7 OHDPAT-3P se lie à des membranes de cellules exprimant le récepteur D3 avec une haute affinité (Kj, - 2 riM) mais très peu à celles de cellules exprimant le récepteur D2, ce qui démontre la spécificité du ligand pour le récepteur D3.
EXEMPLES
1) Clonage du récepteur dopaminergique D-3 :
Des oligonucléotides dérivés du récepteur dopaminergique D-2B (nucleotides 146-233 Bunzow, J.R. , Van Toi, H.H.M., Grandy, D.K., Albert, P., Salon, J., Christie, Me. D. , Machida, C.A., Neve, K.A. , and Civelli, 0. Nature 336. 783-787 (1988)) sont marqués radioactivement et utilisés pour cribler une banque d'ADNc de cerveau de rat (Giros, B. , Sokoloff, P., Martres, M.P., Riou, J.F., Emorine, L.J. et Schwartz, J.C. Nature 342. 923-926 (1989)). On montre que l'un des clones s'hybride faiblement avec un fragment de restriction BamHI-BglII du clone du récepteur D-2A mais pas avec une sonde Accl-Accl (nucleotides 278-571) codant pour les régions transmembranaires MblI à MbV représentées sur la Figure 2. Un fragment Aatll-Mscl de ce clone, marqué au phosphore 32 selon la technique de "nick-translation", est utilisé pour cribler une banque génomique de rat, partiellement coupée par EcoRI construite dans le vecteur Charon 4A. Des filtres de nitrocellulose sur lesquels ont été transférés des phages sont soumis à une hybridation 16 h à 42βC dans un milieu contenant 60% de formamide, 10% de sulfate de dextran, 4 x SSC, Tris-HCl 8 mM, pH 7,4, 1 x Denhardt's, 20μg/ml d'ARNt de levure, 20μg/ml d'ADN de sperme de saumon, 0,1% de SDS, et la sonde à 7,5 105dpm/ml. On lave les filtres deux fois pendant 20mn à 42βC dans 2 x SSC, 0,1% de SDS et deux fois pendant 30mn dans 0,2 x SSC, 0,1% de SDS à 42"C et 55βC respectivement. Trois clones identiques positifs sont obtenus (y compris λ RGE 12A) parmi 800.000 clones et un fragment Nhel-Nhel de 3,5kb est souscloné dans le site Xbal de M13 et séquence (Sanger, F. , Nicklen, S. et Coulson, A.R. Proσ. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977)). On synthétise deux amorces dérivées de cette séquence (synthétiseur d'ADN PCR- Mate 391A, Applied Biosystems) à -32 (5'- ACATTTTGGAGTCGCGTTCCTCTG, amorce 4) et à -7 (CGAATTCATGGCACCTCTGAGCCAGATAAGCAC, amorce 1) et une amorce dégénérée de la séquence de MbVII du récepteur D2 (amorce 2) (5'-
CGAATTCGAC(GA)GCACTGTT(GC)AC(GA)TA(GC)CC(GC)AGCCA) à 375nM.
On synthétise un ADNc monobrin en utilisant de la réverse transcriptase AMV (20 U, Boehringer) , et du poly(A)* mARN (2μg) de cerveau de rat. Cette matrice est amplifiée (Kawazaki, E.S. et Wang, P.M. In : PCR Technology, (ed Erlich, H.A.) 89-97 (Stockholm Press. 1989)) en utilisant l'amorce 4 et l'amorce 2 (75nM de chacun) pendant 30 cycles (92°C, 52°C et 72°C pendant lmn chacun) avec 2,5U d'ADN polymerase Taq (Perkin Elmer Cetus) .
Après résolution des produits qui ont été obtenus par la technique PCR par électrophorèse sur gel d'agarose, transfert et hybridation avec la sonde du récepteur D-2 AccI-AccI, une bande réactive est excisée à l,3kb, et on extrait l'ADN. Cet ADN est amplifié à nouveau par technique PCR avec les amorces 1 et 2. Une bande est détectée après coloration au bromure d'éthidium, coupée, l'ADN est extrait et digéré par EcoRI et souscloné dans M13 (clone RT-PCR A) pour séquençage, et dans le plasmide pGEM-4Z (Promega) . Un fragment de restriction marqué radioactivement Bst XI-EcoRI est utilisé pour cribler une bande génomique de rat, partiellement coupée par Sau 3A (Clontech) comme décrit ci-dessus. Un clone positif RGS3 est obtenu, analysé et un fragment Nhel- Nhel de 3,5kb hybridant avec la sonde Bst XI-EcoRI est souscloné dans M13 et séquence. Une amorce est synthétisée 45 nucleotides en aval du premier codon stop TGA dans le cadre (amorce 3: CCACGTCGACAGATCTCGAAGTGGGTAAAGGGAGTG) . Les amorces 1 et 3 sont ensuite utilisées dans la technique RT-PCR comme décrit ci-dessus, utilisant le poly(A)+ ARNm de tubercule olfactif comme source d'ARN.
Une bande de taille prévue (l,4kb) est extraite après électrophorèse sur gel d'agarose et digérée avec EcoRI-SalI pour sousclonage directionnel dans M13 mp 18, M13 mp 19 et pGEM 4Z. Quatre clones individuels dans M13 sont entièrement séquences et s'avèrent être identiques.
2) Expression du récepteur D-3 dans des cellules CHO transfectées :
On a effectué l'inhibition de la liaison iodosulpride-125I par les agonistes de la dopamine (Figure 7a) et les antagonistes (Figure 7b) . METHODE
Les vecteurs d'expression dérivent du plasmide pSV /S2-MDH (Emorine, L. , Marullo, S., Delavier-Klutchko, C. , Kaveri, S.V., Durieu-Trautmann, 0. et Strosberg, A.D. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6995-6999 (1987)). Le récepteur adrénergique β≥ est excisé de pSV 82-MDH par digestions avec HindlII et EcoRI et remplacé par un fragment de restriction Smal-EcoRI du clone du récepteur D-2A en utilisant un adaptateur de nucléotide franc HindlII conduisant au plasmide pSV D-2. Le vecteur pour exprimer le récepteur D-3 est obtenu en remplaçant le fragment de restriction HindIII-BglII de pSV D-2 par un fragment de restriction EcoRI-BglII du clone RT-PCR B, en utilisant un adaptateur d'oligonucléotide HindlII- EcoRI conduisant au plasmide pSV D-3. Ces constructions sont cultivées et purifiées sur gradient de chlorure de césium (Sambrook J. et al., Molecular cloning - a laboratory manual. C. Nolan, éd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) et transfectées (Graham, F.L. et Van der Eb, A.J. Virology 52, 456-467 (1973)) à des cellules d'ovaire de hamster chinois (CH0-K1) déficientes en dihydrofolate réductase. Les transfectants stables sont sélectionnés dans un milieu de culture (Dubelcco's Modified Eagle médium) sans hypoxanthine et sans thymidine.
L'expression du récepteur D-3 est mise en évidence par la liaison de l*iodosulpride-125I à des membranes de cellules transfectées selon la technique de Martres et col. 1985. Les expériences de liaison sont effectuées (Martres, M.P., Bouthenet, M.L. , Salés, N. , Sokoloff, P. et Schwartz, J.C. Science 228, 752-755 (1985)) dans un tampon Tris-HCl 50mM (volume total 400μl) contenant NaCl 120mM, KC1 5mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 2mM, 0,1% d'acide ascorbique, 8-hydroxy quinoléine lOμM, 0,1% d'albumine de sérum bovin et iodosulpride-125I 0,1 à 0,2nM dans les expériences avec des récepteurs D-2 et D-3, respectivement. RESULTATS
Les récepteurs D-2 et D-3 ont été exprimés dans des cellules COS-7 ou des cellules CHO, qui normalement n'ont pas de sites de liaison vis-à-vis du d'iodosulpride-125I, qui est un ligand présentant une haute affinité vis-à-vis des récepteurs D-2 mais pas du récepteur D-1 dans le cerveau. Les récepteurs D-2 et D-3 sont 1'un et 1•autre marqués au-dessus d•un seuil de liaison non spécifique.
Dans des clones transfectés en permanence de cellules CHO, les valeurs de 1^ sont de 0,6nM et l,2nM respectivement pour D-2 et D-3, et les valeurs Bmax (Bmax représentant la concentration maximale respectivement en récepteur D-2 et D-3) sont d'environ lpmol/mg de protéine de membrane dans les deux cas. On peut distinguer clairement les deux récepteurs à l'aide de plusieurs agonistes et antagonistes de la dopamine. La dopamine elle-même, en l'absence de guanylnucleotide ajouté est d'environ 20 fois plus affine vis-à-vis du récepteur D-3 que vis-à-vis du récepteur D-2 (cf. Tableau 1 et Figures 7a et 7b) .
En présence de Gpp(NH)p, un guanylnucleotide, la courbe de déplacement de la dopamine vis-à-vis du récepteur D-2 est transférée à droite (Figure 7a) indiquant la présence d'une protéine G appropriée. Au contraire, la courbe de déplacement de la dopamine vis-à-vis du récepteur D-3 n'est pas modifiée de façon significative en présence de guanylnucleotide (Figure 7b). Ceci peut correspondre à l'absence d'une protéine G appropriée dans la cellule CHO ainsi que dans les cellules COS-7. Cela peut aussi correspondre à une modulation faible de la liaison de la dopamine par les guanylnucléotides vis-à-vis du récepteur D-3.
Parmi les agonistes de la dopamine, 1'apomorphine et la bromocriptine montrent des affinités similaires vis-à-vis des deux récepteurs, tandis que TL99 et le pergolide, considérés comme des agents sélectifs autorécepteurs sélectifs présumés (Clark, D. and White, F.J. Synapse 1, 347-388 (1987) ; Wolf, M.E. and Roth, R.H. In : Dopamine receptors. vol. 8 (eds Creese, I. and Fraser, CM.) 45-96 (Alan R. Liss Inc. New-York, 1987)) et le quinpirole sont beaucoup plus affins vis-à-vis du récepteur D-3 que vis-à-vis du récepteur D-2.
La plupart des antagonistes de la dopamine appartenant à des classes chimiques variées et cliniquement utilisés comme neuroleptiques montrent des affinités nanomolaires vis-à-vis des deux récepteurs. Par exemple le halopéridol, le spiperone, la thioproperazine, et la prochlorperazine sont approximativement 10 à 20 fois plus affins vis-à-vis du récepteur D-2 que vis-à-vis du récepteur D-3 tandis que le sulpiride (-) , la clozapine, la thioridazine, l'amisulpride ou le raclopride sont seulement 2 à 3 fois plus affins vis-à-vis du récepteur D-2 que vis- à-vis du récepteur D-3.
Les seuls antagonistes qui présentent des affinités limitées mais significativement plus élevées vis-à-vis du récepteur D-3 que vis-à-vis de D-2, sont UH232 et AJ76 (défini ci-après) , considérés comme des agents présumés sélectifs des autorécepteurs. 3) Caractérisation des transcripts du gène du récepteur D-3 dans plusieurs tissus (cf. Figure 8a et Figure 8b) :
Sur la Figure 8a, on a représenté l'analyse par transfert des ARN messagers du récepteur D-3 à partir de cerveau de rat. Pour ce faire, des ARNs poly(A)+ sont préparés (Chirgwin, J.J., Przbyla, A.E., MacDonald, R.J. et Rutter, W.J. Biochemistry 18, 5294-5299 (1979) ; Aviv, H. et Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408-1412 (1972)). Des échantillons (8μg) sont dénaturés, soumis à électrophorèse sur agarose, transférés sur des membranes de nitrocellulose et hybrides (Giros, B. , Sokoloff, P., Martres, M.P., Riou, J.F., Emorine, L.J. et Schwartz, J.C. Nature 342. 923-926 (1989)) en utilisant un fragment sélectif de 422pb de restriction BamHI-Aval marqué au 32P par la technique de "nick-translation", lequel fragment est situé dans la troisième boucle présumée intracytoplasmique, à 5 x 106dpm/ml. Les membranes sont exposées pendant 6 jours à -80βC avec des écrans amplificateurs. Les tailles des marqueurs d'ARN (en kb) sont représentées sur la gauche de la Figure 8a.
On a représenté sur la Figure 8b, les autoradiogrammes d'électrophorèse sur gel d'agarose de produits d'ADNc marqués au phosphore 32, générés à partir de poly(A)+ ARNm par technique PCR après amplification de 25 cycles (haut) et amplification de 32 cycles (bas) . L'ADNc monobrin est synthétisé en utilisant lμg d'ARN, 2OU de transcriptase réverse AMV et l'amorce 3 (Figure 2). L'ADNc double brin est synthétisé et amplifié en utilisant 2,5U de polymerase Taq, l'amorce 3 et un oligonucléotide dérivé des amino acides 300-306 (Figure 2) : 5 '-AAGCGCTACTACAGCATCTGC (amorce 5) pour 25 ou 32 cycles (92βC, 56βC et 72°C, lmn chacun) . Une dose traceuse de (32P)dCTP est incorporée pendant l'amplification et l'ADN est soumis à une électrophorèse dans de l'agarose à 1,5%. 4) Localisation autoradiographique des sites de liaison iodosulpride 125ι et des ARNm des récepteurs D-2 ou D-3 dans le cerveau de rat :
Cette localisation fait l'objet de la Figure 9. Les sections sagittales (A,B,C) ou coronales (D,E,F) (latéralité 0.4mm, niveau interaural 10.7mm (Paxinos, G. et Watson, C. In : The rat brain stereotaxic coordinates (Académie Press, London. 1982)) sont incubées avec soit de 1'iodosulpride 125I (A,D), une sonde à la fois pour les récepteurs D-2 ou D3, soit avec des sondes d'ARN marquées au phosphore 32 sélectives vis-à-vis de l'ARNm du récepteur D-2 (B,E) ou vis-à-vis de l'ARNm du récepteur D-3 (C,F) .
Les abréviations utilisées sur la Figure 9 sont les suivantes : Acb : nucleus accumbens; Cl : claustrum; Cg : cortex cingule; CM: noyau thalamique médian central; CPu : caude putamen; Fr : cortex frontal; G : noyau thalamique gélatineux; Hip : formation hippocampale; Icj : ilôts de Calleja; ICJM : ilôt de Calleja majeur; MM : partie médiane du noyau mammillaire médian; MP : partie postérieure du noyau mammillaire médian; MPA : aire préoptique médiane; OB: bulbe olfactif; PF : noyau thalamique parafasciculaire; Tu : tubercule olfactif; TT : ténia tecta; VTA : aire tegmentale ventrale; VI : couche VI du cortex cérébral.
La liaison avec 1•iodosulpride 15I est effectuée sur des sections de cryostat non fixées incubées avec 0,3nM d•iodosulpride 125I, rincées et apposées pendant 5 jours sur une pellicule désignée sous le nom 3H- hyperfilm d'Amersham (Bouthenet, M.L., Martres M.P., Salés, N. et Schwartz J.C. Neuroscience 20, 117-155 (1987)). Pour les études d'hybridation iji situ, on synthétise des sondes d'ARN monobrin marquées au 32P en utilisant une trousse commercialisée sous le nom Riboprobe (Proméga) avec 32P-UTP et de l'ARN polymerase T7. Les matrices (lOng) sont des plasmides recombinants de pGEM-4Z digérés avec EcoRI contenant un fragment SacI-AfllI du clone du récepteur D-2 ou un fragment BamHI-Aval du clone B RT-PCR dans l'orientation appropriée. Des sections de cryostat (lOμm) sont montées sur des plaques, fixées dans du for aldéhyde à 4%, traitées avec la protéinase K et sont soumises à l'hybridation une nuit à 55°C (Meador-Woodruff, J.H. , Mansour, A., Bunzow, J.R., Van Toi, H.H.M., Watson, S.J. et Civelli, 0. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7625-7628 (1989)) avec des sondes marquées au 32P à 2.106 dpm dans 50μl. Les plaques sont rincées, déshydratées (Meador-Woodruff, J.H. , Mansour, A., Bunzow, J.R., Van Toi, H.H.M. , Watson, S.J. et Civelli, 0. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7625-7628 (1989)) et apposées sur des pellicules désignées sous le nom *'3max hyperfilm" (Amersham) pendant 20 jours à -80°C.
5) Effets des lésions induites par la 6- hydroxydopamine sur les transcripts des gènes des récepteurs D-2 et D-3 dans la substance noire :
Les rats reçoivent une injection unilatérale de 6-hydroxydopamine (8μg/4μl de solution saline) dans le faisceau médian du télencéphale aux coordonnées A 4,7mm, L 1,5mm et H 1,0mm (Paxinos, G. et Watson, C. In: The rat brain stereotaxic coordinates (Académie Press, London. 1982)). Après 10 jours, les rats présentant des rotations controlaterales suite à une administration de 0,25mg/kg d'apomorphine sont choisis. On les sacrifie 4 à 7 semaines après la lésion et on prépare l'ARN total de la substance noire individuelle ou de l'aire tegmentale ventrale (Chomczynski, P. et Sacchi, N. Analytical Biochemistry 162, 156-159 (1987)). On effectue les expériences de PCR comme décrites à propos des Figures 8a et 8b, en utilisant des oligonucléotides dérivés des amino acides 43-51 : 5'-GATGGTGGGTATGGGTCAGAAGGA et amino acides 243-253 : 5 '-GCTCATTGCCGATAGTGATGACCT pour la J-actine. Pour le récepteur D-2, on utilise des oligonucléotides dérivés des amino acides 195-203 : 5'-TCCGAATTCTCATTCTACGTGCCCTTCATC et des amino acides 355-363 : 5'-GCTTTCTGCGGCTCATCGTCTTAA. Les amorces 3 et 5 (Figure 8) sont utilisées pour le récepteur D-3.
Les produits PCR sont obtenus après 16 cycles (rangées 1 et 4) , 23 cycles (rangées 2 et 5) et 27 cycles (rangées 3 et 6) pour la /3-actine et après 23 cycles (rangées 1 et 4) , 27 cycles (rangées 2 et 5) et 30 cycles (rangées 3 et 6) pour les récepteurs D-2 et D-3 avec la substance noire d'un rat (rangées 1-3 : côté lésion; rangées 4-6: côté témoin). L'expérience est répétée 4-7 fois avec des tissus individuels et des expériences parallèles sont conduites avec l'aire tegmentale ventrale. On procède aux autoradiogrammes de gel, correspondant à 23 et 30 cycles pour la β- actine et les récepteurs respectivement. On calcule le rapport des densités optiques correspondant aux récepteurs et à la jS-actine. Les rapports obtenus pour le côté de la lésion sont ensuite comparés aux rapports obtenus pour le côté témoin dans chacun des animaux. 6) Détermination d'un ligand spécifique vis-à-vis du récepteur D-3 :
L'hydroxy-7 N,N'dipropylaminotétraline radiomarqué au tritium (7 OHDPAT-3H) a été incubé avec des membranes de cellules CHO exprimant, soit le récepteur D-2 soit le récepteur D-3 et le 7 OHDPAT-3H lié séparé du libre par filtration sous vide.
La Figure 11 représente la liaison spécifique aux récepteurs D-2 et D-3 en présence de 7 OHDPAT-3H en concentrations croissantes. Le 7 OHDPAT-3H se lie à des membranes de cellules exprimant le récepteur D-3 avec une haute affinité (Ko = 2 nM) mais très peu à celles de cellules exprimant le récepteur D-2, ce qui démontre la spécificité du ligand pour le récepteur D-3.
De tels ligands sélectifs des récepteurs D-3 pourraient être obtenus en utilisant les molécules suivantes : quinpirole, pergolide, TL 99, quinérolane (décrit dans Foreman M.M. et al., 1989, "Preclinical studies on quinérolane, a potent and highly sélective D-2-dopaminergic agonist", J. Pharm. Exp. Ther., 250_:227-235) et SND 919 (décrit dans Yamada K. et al., 1990, "Possible involvement of differing classes of dopamine D-2 receptors in yawning and stereotypy in rats", Psychopharmacology, 100:141-144) .

Claims

REVENDICATIONS
1. Polypeptide ayant une activité de récepteur dopaminergique contenant :
. la séquence de 446 acides aminés de la Figure
1,
. ou un fragment de cette séquence, ce fragment étant tel que
* soit il contient néanmoins les sites contenus dans cette séquence et dont la présence est nécessaire pour que, lorsque ce fragment est exposé à la surface d'une cellule, il soit capable de lier la dopamine à ses agonistes ou antagonistes de manière spécifique et mesurable, par exemple au moyen d'un ligand radioactif selon la technique décrite dans Sokoloff P. , Martres M.P. et Schwartz J.C. "Three classes of dopamine receptor (D-2, D-3, D-4) identified by binding studies with 3H-apomorphine and 3H-domperidone". Naunyn- Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1980, 315: 89-102 et Martres M.P., Bouthenet M.L., Sales N. , Sokoloff P. et Schwartz J.C. "Widespread distribution of brain dopamine receptors evidenced with 125I-iodosulpride, a highly sélective ligand". Science, 1985, 228: 752-755,
* soit il est susceptible d'être reconnu par des anticorps qui reconnaissent également la susdite séquence de 446 acides aminés, mais ne reconnaissent ni le récepteur dopaminergique D-1, ni le récepteur dopaminergique D-2,
* soit il est susceptible de générer des anticorps reconnaissant la susdite séquence de 446 acides aminés mais ne reconnaissant ni le récepteur dopaminergique D-1, ni le récepteur dopaminergique D-2 ou polypeptides variants qui correspondent aux polypeptides sus-définis, comportant certaines mutations localisées, sans que les polypeptides ne perdent les propriétés de récepteur dopaminergique. 2. Polypeptide selon la revendication 1, contenant:
. la séquence de 446 acides aminés de la Figure
2,
. ou un fragment de cette séquence, ce fragment étant tel que
* soit il contient néanmoins les sites contenus dans cette séquence et dont la présence est nécessaire pour que, lorsque ce fragment est exposé à la surface d'une cellule, il soit capable de lier la dopamine à ses agonistes ou antagonistes de manière spécifique et mesurable, par exemple au moyen d'un ligand radioactif selon la technique décrite dans Martres, M.P., Bouthenet, M.L., Salés, N. , Sokoloff, P. et Schwartz, J.C. Science 228, 752-755 (1985),
* soit il est susceptible d'être reconnu par des anticorps qui reconnaissent également la susdite séquence de 446 acides aminés, mais ne reconnaissent ni le récepteur dopaminergique D-1, ni le récepteur dopaminergique D-2,
* soit il est susceptible de générer des anticorps reconnaissant la susdite séquence de 446 acides aminés mais ne reconnaissant ni le récepteur dopaminergique D-1, ni le récepteur dopaminergique D-2.
3. Polypeptide selon la revendication 1, dont l'affinité des agonistes déterminée par compétition avec le ligand iodosulpride-125I est décroissante dans l'ordre suivant : quinpirole > apomorphine = dopamine.
4. Polypeptide selon la revendication 1 sont 1'affinité des antagonistes déterminée par compétition avec le ligand iodosulpride-15I est décroissante dans 1•ordre suivant : raclopride > UH 232 ≈ halopéridol.
5. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par la séquence. représentée sur la Figure 1 ou sur la Figure 2, s'étendant de l'extrémité constituée par l'acide aminé en position 1 à celle constituée par l'extrémité en position 446.
6. Acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué par un enchaînement de nucleotides codant pour les polypeptides selon 1'une quelconque des revendications 1 à 5.
7. Acide nucléique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué par l'enchaînement de nucleotides représenté sur la Figure 3 ou sur la Figure 4, s'étendant de 1'extrémité constituée par le nucléotide 1 à celle constituée par le nucléotide 1863, ou est constitué par l'enchaînement de nucleotides représenté sur la Figure 3 ou sur la Figure 4, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide 442 à celle constituée par le nucléotide 1779.
8. Vecteur recombinant, en particulier pour le clonage et/ou l'expression, notamment du type plasmide, cosmide, phage ou virus, caractérisé en ce qu'il contient un acide nucléique selon l'une des revendications 6 ou 7 en l'un de ses sites non essentiels pour sa replication.
9. Vecteur recombinant selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il contient en l'un de ses sites non essentiels pour sa replication des éléments nécessaires pour promouvoir l'expression d'une séquences d'acides aminés selon l'une des revendications 1 à 5, dans un hôte cellulaire et éventuellement un promoteur reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire, en particulier un promoteur inductible et éventuellement une séquence signal et une séquence d'ancrage.
10. Hôte cellulaire transformé par un vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9 et comprenant les éléments de régulation permettant l'expression de la séquence nucléotidique codant pour le polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 dans cet hôte.
11. Hôte cellulaire transformé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les bactéries, notamment E_;_ coli.
12. Hôte cellulaire transformé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les organismes eucaryotes tels que des cellules CHO ou COS-7.
13. Anticorps caractérisé(s) en ce qu'il(s) est (ou sont) dirigé(s) de façon spécifique contre un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, et en ce qu'il(s) ne reconnaît (ou reconnaissent) ni le récepteur dopaminergique D-1, ni le récepteur dopaminergique D-2 et en particulier celui ou ceux reconnaissant les séquences d'acides aminés suivantes:
- celle définie par la séquence d'acides aminés représentée sur la Figure 1 s'étendant de 1'extrémité constituée par l'acide aminé en position 1 à celle constituée par l'acide aminé en position 38,
- celle définie par la séquence d'acides aminés représentée sur la Figure 1 s*étendant de 1*extrémité constituée par l'acide aminé en position 135 à celle constituée par l'acide aminé en position 147, celle définie par la séquence d'acides aminés représentée sur la Figure 1 s'étendant de 1'extrémité constituée par l'acide aminé en position 175 à celle constituée par l'acide aminé en position 187,
- celle définie par la séquence d'acides aminés représentée sur la Figure 1 s•étendant de 1'extrémité constituée par l'acide aminé en position 210 à celle constituée par l'acide aminé en position 375, celle définie par la séquence d'acides aminés représentée sur la Figure 2 s'étendant de 1'extrémité constituée par l'acide aminé en position 135 à celle constituée par l'acide aminé en position 147.
14. Sonde nucléotidique caractérisée en ce qu'elle s'hybride avec l'un des acides nucléiques selon les revendications 6 ou 7 ou leur séquence complémentaire dans les conditions d'hybridation telles qu'elle ne s'hybride pas aves les gènes ou ARN messager des récepteurs dopaminergiques D-1 ou D-2, et en particulier les sondes choisies parmi les sondes nucléotidiques suivantes : celle définie par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 3, s'étendant de 1•extrémité constituée par le nucléotide en position 1, à celle constituée par le nucléotide en position 441, celle définie par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 3, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 442 à celle constituée par le nucléotide en position 537, celle définie par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 3, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 718, à celle constituée par le nucléotide en position 753,
- celle définie par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 3, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 820, à celle constituée par le nucléotide en position 888, celle définie par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 3, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 958, à celle constituée par le nucléotide en position 996, celle définie par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 3, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 1068, à celle constituée par le nucléotide en position 1240, celle définie par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 3, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 1068, à celle constituée par le nucléotide en position 1566,
- celle définie par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 4, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 820, à celle constituée par le nucléotide en position 888, ou leur séquence nucléotidique complémentaire.
15. Procédé de détection de la capacité d'une molécule à se comporter comme ligand vis-à-vis d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par :
- la mise en contact de la molécule avec un hôte cellulaire préalablement transformé par un vecteur lui-même modifié par un insérât codant pour le susdit polypeptide, cet hôte portant à sa surface un ou plusieurs sites spécifiques de ce polypeptide, le cas échéant après induction de l'expression de cet insérât, cette mise en contact étant effectuée dans des conditions permettant la formation d'une liaison entre l'un au moins de ces sites spécifiques et ladite molécule dès lors qu'elle s'avérerait effectivement posséder une affinité pour ce polypeptide, la détection de la formation éventuelle . d'un complexe du type ligand-polypeptide.
16. Procédé pour l'étude de l'affinité d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour un plusieurs ligands déterminés, caractérisé par :
- la transformation d'un hôte cellulaire compétent avec un vecteur, notamment un plasmide ou un phage, dans lequel avait auparavant été insérée une séquence de nucleotides ou codant pour le récepteur D-3 (insérât), sous le contrôle d'éléments de régulation, notamment d'un promoteur reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire et permettant l'expression dans l'hôte cellulaire utilisé de ladite séquence de nucleotides,
- la culture de l'hôte cellulaire transformé dans des conditions permettant l'expression dudit insérât, et le transport du récepteur D-3 exprimé vers la membrane de façon telle que les séquences transmembranaires de récepteur D-3 soient exposées à la surface de l'hôte cellulaire transformé,
- la mise en contact de cet hôte cellulaire avec ces ligands déterminés,
- la détection d'une réaction affine entre ledit hôte cellulaire transformé et lesdits ligands déterminés.
17. Procédé de diagnostic in vitro de l'expression pathologique du récepteur dopaminergique D-3, dans lequel on utilise l'une ou plusieurs quelconques des sondes définies selon la revendication 14, comprenant les étapes suivantes :
- l'amplification préalable possible des quantités de séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7 susceptible d'être contenue dans un échantillon biologique prélevé sur un patient, au moyen d'amorces d'ADN,
- la mise en contact de l'échantillon biologique indiqué ci-dessus avec une sonde nucléotidique selon la revendication 14, dans des conditions permettant la production d'un complexe d'hybridation formé de ladite sonde et ladite séquence nucléotidique,
- la détection du complexe d'hybridation ci-dessus qui a pu se former.
18. Procédé de diagnostic in vitro d'anomalies génétiques, notamment polymorphismes du gène codant pour le récepteur dopaminergique D-3 chez un individu, susceptibles d'être corrélées à des affections psychiatriques, neurologiques, cardiovasculaires ou neuroendocriniennes, à partir d'un échantillon biologique, tel que le sang, prélevé chez un individu, selon un procédé comprenant les étapes suivants : le traitement de l'acide nucléique issu de l'échantillon biologique sus-mentionné réalisé à l'aide d'une enzyme de restriction dans des conditions permettant l'obtention de fragments de restriction issus du clivage dudit acide nucléique au niveau de ces sites de restriction reconnus par ladite enzyme,
- la mise en contact d'une sonde nucléotidique selon la revendication 14, susceptible de s'hybrider avec les fragments sus-mentionnés dans des conditions permettant la production éventuelle de complexes d'hybridation entre ladite sonde et les fragments de restriction sus-mentionnés,
- la détection des susdits complexes d'hybridation,
- la mesure de taille des éventuels fragments de restriction polymorphes engagés dans les complexes d'hybridation sus-mentionnés.
19. Procédé de diagnostic in vitro de détection de mutations ponctuelles de l'acide nucléique ou d'un fragment de 1'acide nucléique codant pour le récepteur dopaminergique D-3 selon les revendications 6 ou 7, chez un individu, comprenant les étapes suivantes :
- la mise en contact d'une sonde nucléotidique selon la revendication 14, avec un prélèvement biologique. par exemple du sang, dans des conditions permettant le production éventuelle d'un complexe d'hybridation formé entre la sonde et 1'acice nucléique ou le fragment d'acide nucléique sus-mentionné,
- la détection du susdit complexe d'hybridation,
- le séquençage de l'acide nucléique ou du fragment d'acide nucléique intervenant dans le susdit complexe d'hybridation,
- la comparaison de la séquence de 1•acide nucléique ou du fragment d'acide nucléique intervenant dans le susdit complexe d'hybridation avec la séquence de l'acide nucléique (ne présentant pas de mutation) ou du fragment de l'acide nucléique (ne présentant pas de mutation) du récepteur dopaminergique D-3.
20. Procédé de diagnostic _in vitro de l'expression pathologique du récepteur dopaminergique D-3, dans lequel on utilise l'un ou plusieurs anticorps selon la revendication 13 comprenant les étapes suivantes : la mise en contact d'un anticorps selon la revendication 13 avec le susdit prélèvement biologique dans des conditions permettant la production éventuelle d'un complexe immunologique formé entre le récepteur dopaminergique D-3 ou produit qui en a dérivé et l'anticorps de l'invention,
- la détection du susdit complexe immunologique formé.
21. Médicament contenant comme substance active une substance active sur l'un au moins des polypeptides selon l'une des revendications 1 à 5, ayant une activité de récepteur dopaminergique ou contenant comme substance active des substances actives sur des cellules transfectées par les gènes ou les fragments de gènes codant l'un au moins des polypeptides à activité de récepteur dopaminergique selon l'une des revendications 1 à 5 en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
22. Médicament contenant comme substance active une substance active sur les récepteurs dopaminergiques D-1 ou D-2, mais inactive sur les polypeptides à activité de récepteur dopaminergique selon l'une des revendications 1 à 5.
23. Procédé de mesure de l'affinité de ligands vis-à-vis d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5, à l'aide d'un ligand marqué par une méthode radioisotopique et sélectif vis-à-vis du susdit polypeptide, comprenant les étapes suivantes :
- s'il y a lieu, la détermination du susdit ligand sélectif vis-à-vis du susdit polypeptide selon le procédé décrit dans la revendication 16,
- le marquage du ligand sélectif ainsi déterminé par un procédé radioisotopique,
- la mise en contact, selon la technique décrite dans Martres, M.P., Bouthenet, M.L., Salés, N. , Sokoloff, P. et Schwartz, J.C. Science 228, 752-755 (1985), avec des membranes biologiques, notamment de cerveau, contenant le susdit polypeptide avec le ligand sélectif marqué et un ligand dont on veut mesurer l'affinité, la détection de la formation éventuelle d'un complexe du type ligand sélectif marqué-polypeptide.
24. Procédé de marquage sélectif d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, à l'aide d'un ligand marqué selon une technique radioisotopique, sur des membranes biologiques contenant d'une part le récepteur D-1 et/ou D-2 et d'autre part un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5, comprenant les étapes suivantes:
- s'il y a lieu, la détermination d'un ligand sélectif vis-à-vis du récepteur D-1 et/ou D-2 selon le procédé décrit dans la revendication 16,
- la mise en contact, selon la technique décrite dans Martres, M.P., Bouthenet, M.L., Salés, N., Sokoloff, P. et Schwartz, J.C. Science 228, 752-755 (1985), des susdites membranes biologiques avec le susdit ligand sélectif vis-à-vis du récepteur D-1 et/ou D-2 et avec un ligand marqué selon une technique radioisotopique, notamment 1'iodosulpride-125I, ce qui conduit au marquage sélectif du susdit polypeptide, le récepteur D-1 et/ou D-2 étant occupé par le susdit ligand sélectif,
- la détection de la formation du complexe du type ligand marqué-polypeptide.
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