WO1991006565A1 - Physiologically active peptide - Google Patents

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WO1991006565A1
WO1991006565A1 PCT/JP1990/001384 JP9001384W WO9106565A1 WO 1991006565 A1 WO1991006565 A1 WO 1991006565A1 JP 9001384 W JP9001384 W JP 9001384W WO 9106565 A1 WO9106565 A1 WO 9106565A1
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PCT/JP1990/001384
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Noboru Yanaihara
Original Assignee
Meiji Seika Kaisha, Ltd.
Daicel Chemical Industries, Ltd.
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    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
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    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a novel bioactive peptide having a smooth muscle relaxing action.
  • Vasoactive intestinaJ polypeptide isolated from the venom of poisonous moss, but these natural peptides must be treated as VIP.
  • Helodermin has a problem in that the medicinal effect is short-lived, and herodermin has a problem in that the strength of muscle relaxation is low, and various other points.
  • Hell dermin is a peptide having a structure having an amino acid sequence represented by the following formula.
  • VIP has a structure having an amino acid sequence represented by the following formula.
  • the peptide is:
  • the present inventors conducted a study with the aim of providing a novel peptide having a superior physiological activity as compared with the above-mentioned oral delmin or VIF.
  • a novel class of three derivatives which are composed of a part of the amino acid sequence of ⁇ -dermin and which can be regarded as derivatives of heguchi-dermin, represented as peptides of the following general formula (I):
  • peptides of the following general formula (I) We have succeeded in chemically synthesizing these peptides and found that these novel peptides have the physiological activity of relaxing vascular smooth muscle and increasing blood flow.
  • the present inventors have proposed novel peptides obtained by combining and combining the amino acid sequence of VIP and the-part of the amino acid sequence of helodermin, and the amino acid sequence of VIP.
  • the peptide of the general formula (I) is the last terminal of 35 amino acid residues in the amino acid sequence of heroderimin. -1
  • ⁇ 4 amino acids at positions 32 to 35 or three amino acids at positions 33 to 35 or two amino acids at positions 34 to 35 It is equivalent to a derivative made by shortening the herodelmin so that it is deleted from the molecule, that is, a truncated peptide derivative from the mouth delmin.
  • Peptides are three peptide of the following general formula (I) (la). ( I b) and (I c) encompassing t
  • the peptide of the formula ⁇ I a) is a part of the amino acid sequence (consisting of 35 amino acid residues) of mouth delmin, which is present in the 1st to 31st positions. It is a truncated peptide consisting of a sequence of amino acid [hereinafter sometimes referred to as Hd (l-31) -NH 2 ], and the peptide of the formula (1b) is shortening consisting a Mi Roh Sanhai column caries Chi on the sequence of a Mi Bruno acid moiety from position 1 to present up to 32 of peptide [hereinafter, Hd (] - ⁇ 2) - and the this abbreviated as NH 7 And the formula (1 ( :) 0) peptide is derived from the amino acid sequence at positions 1 to 33 in the amino acid sequence of herodermin. (Hereinafter sometimes abbreviated as Hd (l-33) -NH 2 ).
  • the peptide of formula ( ⁇ ) forms the amino acid sequence of V1P 2; the amino acids from position 1 (located at the last ⁇ -terminal) to position 11 of the amino acid residues array of Roh acid [hereinafter, VIP (1 - 11) - ⁇ 2 and ⁇ score and there] and, to an array of Ma Mi Roh acid by the final ⁇ 3 ⁇ 4 end of the mouth del Mi emissions from re-position 12 to position 31 [hereinafter, Hri - (12-31) - NH 2 and ⁇ score and is] peptides that combinational formed by combining the [hereinafter, ⁇ -ll) - Hd ( 12- 31) - NtL and ⁇ score and There is]. Further, according to the third aspect of the present invention, the following formula (II)
  • the peptide of formula (m) has the amino acid sequence of VIP (consisting of 28 amino acid residues, hereinafter sometimes referred to as VIP (1-28)).
  • VIP 28 amino acid residues
  • a peptide hereinafter referred to as Hd 9-35
  • Hd 9-35 which is a combination of the amino acid sequence from position 29 to position 3 from the final N-terminus of the mouth delmin (hereinafter abbreviated as Hd 9-35).
  • This peptide can be chemically synthesized by a conventional peptide synthesis method using either a solid phase method or a liquid phase method.
  • novel peptide of the present invention can be chemically synthesized in a conventional manner by a known active ester method or a mixed acid anhydride method described in many chemical textbooks and papers, but it can be synthesized by amino acids.
  • Beckman's peptide synthesizer Mode 2.00 g of benzohydralumin-polystyrene resin (A) as a resin for fixing amino acid or peptide in the reaction tank of 990C Mino group content O.Smmol / g resin (purchased from Peptide Research Laboratories) is added, and the mixture is stirred with CH 2 C £ 2 for 2 hours to swell the resin.
  • A benzohydralumin-polystyrene resin
  • Boc-Pro-OH a Boc-protected derivative of proline, which is the amino acid at position 33 of herodermin, was prepared according to the following steps from step 1 to step 2 The resin is reacted and worked up.
  • Step 2 By performing Step 2 from the above Step 1, the introduction of Boc-Pro-OH to the resin is completed first.
  • a predetermined protected amino acid is sequentially introduced into the peptide chain under construction.
  • the above-mentioned Step Co is repeated, and the protective amino acid to be reacted is added in an amount of 3. Ommoi in the following order.
  • the amount of H0F added in the step is 3. Ommo].
  • His is not used when coupling the His at the final N-terminus.
  • the order of adding the amino acid is as follows-.
  • Boc-ysCCi (* 2 G 0H, Boc-G.ly-0H,
  • Deprotection reaction from the peptide chain and dissociation of the deprotected peptide product from the resin are performed by treating with 20 mfi of hydrogen fluoride at 0 ° C for 1 hour in the presence of iiije. : The hydrogen fluoride was distilled off from the reaction mixture, and the residue was washed with ether and dried sufficiently. Then, the mixture was mixed with 3 M acetic acid (100 mL) to dissolve the peptide product. The insoluble resin is removed by filtration. The resulting filtrate containing the peptide product is freeze-dried to give 892 mg of crude peptide. The crude peptide is a Sephadex G-25 column eluted with 3M acetic acid aqueous solution.
  • This good cormorants-obtained purified peptidyl de Hd (l- 33) - NH 2 represents an A Mi Roh acid analysis following after acid hydrolysis.
  • a predetermined amino acid was sequentially condensed by the solid phase method in the same manner as in Example 1 to synthesize the peptide, and the peptide (l-31) - to obtain a NH 2. Also, peptide synthesis that by the liquid phase method was carried out in the same manner as in Example 1, Hd (1 -3 i) - A Mi Bruno acid analysis of n obtained peptide to give the NH 2 (acid hydrolysis , 6: HCi2, 110 ° C, 24 hours) to obtain the following amino acid analysis values.
  • Peptidyl de 'VIP (Bok 1 ⁇ ) - Hd (12 - 31 ) -' DOO 4 position H 2, 5 - 9-position, 10-position 15, 16 position 20, 2] -23-position, 24 - 31 of
  • the following six types of peptides (1) to (6) corresponding to the respective amino acid sequences of the above are specified by the stepwise elongation method iZ Q) Boc-7 mino acid is sequentially linked Then, they were synthesized.
  • the condensation reaction of each Boc-amino acid was performed using the active ester method (AE method) or the mixed acid anhydride method (MA method).
  • the G-type peptides synthesized here are as follows. The G-type peptides were synthesized by the method described below.
  • Boc-ASP (OcHex) -OH (molecular weight: 15-37) 9-46 g and NHS (molecular weight 115.09) 3.80 g were condensed in the presence of DCC as a condensing agent to give amino acid activity.
  • One thousand liters (I) of Boc-Asp (OcHex) -05 yielded 14.05 £ (yield 85.02%) 1 : 4.53 g of amino acid activated ester ( ⁇ ) and H-Ala -0H (Molecular weight 89.11) ⁇ '.9 ⁇ 3 ⁇ 4- -1
  • the peptide was condensed with Boc-Lys (Cfi'Z) -OH 3 ⁇ 61 g by the MA method, and the peptide (XD), Boc-Lys (CJ2 ': Z) -Leu- eu-Ala-0H 4.87 g (94.0%) was obtained.
  • the obtained peptide was condensed with 1.36 g of Boc-Thr (Bzl) -OH by the MA method to obtain a peptide ( ⁇ ).
  • Boc-Tyr (Cl 2 ⁇ ⁇ ) -0 ⁇ 22.12g and NHS 6.33 g as a condensing agent condensed in the presence of DCC -.
  • Boc-L.eu-Gly-Ser BzD
  • Boc-Arg Tos
  • -Thr Bzl
  • NH 2 2.19 & (90.7% yield) The Boc-Leu-Gly- , Boc-eu It is obtained by condensing -ONHS and H-Gly-OH by the AE method with a yield of 7S.7%.
  • the obtained crude condensation product which has been subjected to fragment condensation by the DCC-HOBt method, is post-treated in the same manner as described above, and is converted to a peptide (XXXIII) as Boc- Va! L-Phe-Thr (Bzl.)-Asp (OcHex) -Asri-Tyr (CIz -BzJ) -Thr (Bzn- Lys (Cl-Z) — Leu— Leu— Ala— Lys (Cl-Z) — Leu— Ala— Leu-Gin— ys (CI * Z) — Tyr (Cl 2 ⁇ ⁇ 1) —eu— Ala— Ser (Bz I) - Jle- teeth eu- Gly - Ser (Bzl) - Arg (Tos) - was obtained 530nig of NH 2 (74.1% yield) - Thr (Bzl).
  • the obtained peptide was subjected to amino acid analysis (acid hydrolysis, 6N HC1, 1] () ° C, 24 hours), and the following amino acid analysis values were obtained.
  • the elution time was 4.9 minutes.
  • the HPLC conditions used here were column MC Pack R-ODS-5 (0.46 x 25 cm), and the eluent was 0.01 N HCl / acetonitrile (80/20) ⁇ (50/50).
  • the gradient time was set to 30 minutes.
  • the detector detected the absorbance at a wavelength of lJV (210 nm), and the test solution was flowed at a flow rate of l.OmlZmin.
  • a predetermined amino acid was sequentially condensed by the solid phase method in the same manner as in Example 1 to synthesize the peptide, and the peptide VIP ( l-ll) - Hd (12-31 ) - to obtain a NH 2.
  • the amino-protecting group for the amino group at the ⁇ -position of each amino acid to be condensed is t-butyloxycarbonyl (Boc3 ⁇ 4), and any Boc-amino acid used as a raw material is a peptide. Purchased from Do Research Laboratories (Osaka).
  • Boc-amino acids Arg, Asp, His, Lys, Ser, Th "and Tyr, which are amino acids having a functional group on the side chain, are in the form of the following protected amino acids.
  • Trifluoroacetic acid which is a de-Boc-removing reagent, is used for CH 2 CH 2 CJ2 2 in 50% TFA solution (50% TFA / CH 2 C £ 2) and to the use.
  • 11-hyriroxyhenzotriazole (HOBt) was used: Both the solvent and the reagent used in this example were reagent grades or reagents for peptide synthesis, and the condensation reaction of each amino acid was carried out. In conducting the test, the degree of progress was examined by a single test. That is, after the condensation reaction of each Boc-amino acid to the already formed peptide chain, about 0.01 g of the produced protected peptide-resin is taken out into a reaction tank or a test tube. 3 drops of each of the reagents (1), (2) and (: ⁇ C, 0) were added and heated for 1 min at 0 ° C for 2.5 min.
  • the procedure required to guide one hoc-amino acid involves the removal of a peptide already formed on the resin from the N-terminus. All of these operations were carried out in a stream of dry nitrogen, and each winding was performed as follows: Boc lig, neutralization, condensation of Boc-amino acid.
  • the protected peptide-resin was stirred with CH 2 Cfi 2 40mfi for 1.5 minutes and then filtered. This operation was repeated six times, and TF.A remaining on the peptide-resin was removed by washing.
  • CH 2 40mfi peptides produced a - stirred pressurized example 1.5 minutes the resin was filtered. This operation was repeated G times, and the remaining reaction reagents were washed and removed.
  • each of the following steps was performed in the order of ⁇ ) ⁇ , ⁇ , ⁇ , MeOH 40 mfi, and CH 2 Ci 2 40 mfi, and the mixture was stirred three times for three minutes to remove the protective peptide-resin. It washed (were collected filtration to this, the obtained resin was subjected to Kaiser one test. when showing the two emissions arsenide drill down positive performs operation of the ⁇ 9 again, the peptide chain Completed the condensation reaction of the amino acid
  • reaction tank is cooled with a dry ice bath-acetonitrile bath, and the hydrogen fluoride (15mfi) redistilled into the above-mentioned protection method is used.
  • -Resin, anisol, ethyl, and still sulfur The solution was added to the mixture h (7), and the mixture was stirred at 0X for 6 minutes to dissociate the lipstick from the resin and also to remove the protecting group of the side chain functional group from the protected peptide chain.
  • the solid residue was washed three times with ethyl acetate (30 mL) and filtered.
  • the solid residue was dried under reduced pressure, and extracted with 3M acetic acid (Omi) containing 0.02% entrenchone to obtain an extract containing crude oil / tide.
  • the resin was removed by filtration, and the aqueous solution was freeze-dried to obtain 455 mg of a crude peptide product.
  • the crude peptide product obtained in the previous section (3) was purified by reverse phase HPLC.
  • the preparative reverse-phase HPLC equipment used for purification includes a high-performance liquid chromatograph LKB 2249 LC
  • the eluate was searched by UV absorbance (210 nm ), and the fraction containing the desired polypeptide was identified. This fraction was freeze-dried to obtain 8.5 mg of the desired purified polypeptide.
  • the yield, calculated from the crude peptide product, was: I 7%.
  • the purified peptide (80 ⁇ g) obtained in the previous section (4) was removed in a rigid glass tube in the presence of phenol-containing 6 HCfi 3nifi.
  • the tube was sealed and hydrolyzed at ⁇ 10 ° C. for 24 hours.
  • the tube was opened, and 6i HCfi was distilled off from the reaction solution under reduced pressure on a boiling water bath.
  • the obtained peptide acid hydrolyzate was dissolved in Lithium citrate buffer (Beckman) (500 ⁇ ), and purified by an automatic amino acid analyzer (Beckman, model 7300). It was subjected to a no acid analysis.
  • the obtained amino acid analysis value is as shown below, and was consistent with the amino acid composition of VIP (1-28) -Hd (29-35) -NH 2 .
  • the measurement was carried out using two types of developing solvents (A) and (B) in the same manner as in '. The specific rotations of the peptides were also measured, and the measurement results are shown in the following table.
  • Rf 1 Rf value when developed in Atanada (A)
  • test peptide 10 g .0] The HCJS 25 Injection Bae Buchi de prepared by diluting the dissolved solution obtained by dissolving the ⁇ with saline, the r was injected into the artery by Bae Li Sutarutei Kuponpu peptide is r test peptide was injected at a dose of 200p mol / kg is the following compound.
  • vascular smooth muscle is relaxed.
  • New peptides have the effect of increasing blood flow.

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Description

明 細 書 o 5 生理活性ペプチ ド
技 術 分 野
本発明は平滑筋弛緩作用 を有する新規な生理活性ぺ プチ ドに関する。
従 来 技 術
哺轧動物の血管における血流增加作用 を有する天然 ペプチ ド と して、 ヒ トの腸-管に存在する VIP
0 (Vasoactive intestinaJ polypeptide; や， 毒 卜カケ の毒液よ リ単離されたへロデル ミ ン （Helodermin)が知 られている。 し かし これら天然ペプチ ド を医薬と して 使用する には、 VIPは医薬効果の持続性が短かい点で、 またへロデルミ ン は筋肉弛緩の強度が低い点で且つそ5 の他の種々 な点に問題がある。
へ口デルミ ンは次式に示されるア ミ ノ酸配列を有す る構造をもつペプチ ドである。
H-His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Gln-Tyr 一 ¾er—し ys—し eu— Leu— A丄 a_Lys— Leu— Ala—し eu— Gin—し ys— Tyr—し eu 一 Ala— Ser— I丄 e—し eu— my一 Ser— Arg— Thr— Ser— Pro— Pro— Pro— NH また、 VIPは次式に示されるア ミ ノ酸配列を有する 構造をもつぺプチ ドであ る：
H-His-Ser-Asp-Ala-Va ί -Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Tlir-Arg- Leu— Arg—し ys— Gln_Met— 41a— Val_Lys—し ys—' iyr—し eu— Asii— Ser- I]e -し eu - Asn一 NH- 発明の開示
本発明者らは、 前記へ口デル ミ ンや V I Fに比べてよ リ優れた生理活性を有する新規なぺプチ ド を提供する こ と を 目的と して研究を行っ た . その研究の結果、 へ αデルミ ンのア ミ ノ酸配列の一部分から成 り丑つ下記 の一般式（ I )のぺプチ ド と して表わされてへ口 デル ミ ンの誘導体とみな し得る新規な 3種のペプチ ド を化学 合成する こ と に成功 し、 またこれ らの新規べプチ Κが 血管平滑筋を弛緩させて血流増加を行う生理活性を , する こ と を見出 した。 更に、 本発明者 らは、 V I P のァ ミ ノ酸配列とへロデルミ ンのア ミ ノ酸配列の―部分と を組合わせ結合してなる新規なペプチ ド、 並びに V I P のア ミ ノ酸配列の一部分とへ口デル ミ ンのア ミ ノ酸配 列の別の一部分と を組合わせ結合 してなる新規なぺブ チ ド を化学合成する こ と に成功 し、 またこれ 後者の 2種の新規ペプチ ドも上記の一般式（ I )のべプチ ド と 同様の生理活性を有する こ と を見出 した。
従っ て、 第 1 の本発明によ る と、 次の一般式（ 1 ) Η— His— Ser— Asp— Ala_Ile— Phe—Thr— Gin— G丄 n—Tyr— Ser—し ys 一 Leu— Leu— Ala—し ys—し eu_Ala—し eu— bin—し ys— Tyr—し eu— Ala— Ser - lie -し eu - Gly - Ser - Arg - Thr - X - HZ ( I
(、式中、 Xは結合手—、 も し く は Se r又は Se r- P r oを示 す） で表わされるペプチ ドが提供される。
一般式（ I )のペプチ ドは， へロデルミ ン のア ミ ノ酸 配列をなす 35個のア ミ ノ酸残基の う ちで最終 末端か - 1
δ ら 32位〜 35位の 4 個のア ミ ノ酸又は 33位〜 35位の 3個 のア ミ ノ酸又は 34位〜 35位の 2個のア ミ ノ酸をへ口 千' ルミ ン分子か ら欠失させる よ う にへロ デルミ ンを短縮 させる こ と によ り作られた誘導体に相当するものであ り 、 即ちへ口デル ミ ンからの短縮ぺプチ ド誘導体であ る
一般式（ I )のペプチ ドは下記の 3種のペプチ ド ( l a) . ( I b)及び（ I c)を包含する t
！ i ) 一般式（ 1 )において X が結合手— を示す場合の
3
10 ペプチ ド、 すなわち次式（ 1 a)
H-His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-GJn-Tyr-Ser-Lys- し eu—し eu— Ala—Lys—し eu— Aia—し eu— in— Lys— iyr—し eu— Ala—
Ser—丄 le—し eu— Gly— Ser— Arg— Thr— NH2 ( 1 a) で表わされるぺプチド。
( ii ) 一般式（ I )において X が Serを示す場合のぺプ チ ド、 すなわち次式（ I b)
H-His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Gln-Tyr-Ser-Lys 一し eu—し eu_Ala-し ys-し eu— Ala—し eu— bin— Lys— l'yr—し eu— A丄 a— Ser-Ile-Leu-Gly-Ser-Arg-Thr-Ser-NHZ ( I )
20 で表わされるぺプチ ド，，
( Mi 一般式（ I )において： X が Ser- Pre. を示す場合の ペプチ ド、 すなわち次式（ I c)
H-His-Ser-Asp-Ala-Ile-Php-Thr-Gln-Gin-Tyr-Ser-Lys 一し eu—し eu— Ala— l」ys— Leu— A丄 a—し eu— G].n— Lys— Tyr—し eu— Ai —
25 Ser - lie -し eu-Gly - Ser - Arg- Thr - Ser- Pro - ( I c) で表わされるぺプチド。
式 ί I a ) のペプチ ドは、 へ 口 デルミ ン のア ミ ノ酸配 列（35個のア ミ ノ酸残基よ り なる）のう ちに存在する 1 位から 31位までの部分のマ ミ ノ酸の配列からなる短縮 ぺプチ ド〔以下、 Hd(l-31)-NH2と唣すこ と がある〕であ り 、 式（ 1 b ) のペプチ ドはへ口デル ミ ン のア ミ ノ酸配 列のう ちに存在する 1 位から 32位までの部分のア ミ ノ 酸の配列からなる短縮ペプチ ド 〔以下、 Hd ( ] - ΙΪ 2) - NH7 と略すこ と がある〕 であ り 、 また式（ 1 (： ) 0)ベプチ ド はへロデル ミ ン のア ミ ノ酸配列の う ちに存在する 1 位 から 33位までの部分のァ ミ ノ酸の配列からなる短縮ぺ プチ ド〔以下、 Hd(l-33)- NH2 と略す こ と がある〕である。
更に、 第 2 の本発明によ る と . 次式（ Π )
H— HJS— Ser— Asp— Ala— Val— Phe— Thr—Asp— Asn— Tyr— Thr—し ys 一し eu—し eu— Ala— Lys—し eu— Ala—し eu— Gin— Lys— Tyr—し e!J— Als—
Ser—丄 le—し eu— Gly— Ser— Arg— Thr-NH2 (11.) で表わされるペプチ ドが提供される。
式（ Π )のペプチ ドは、 V1P のア ミ ノ酸配列をなす 2； 個のア ミ ノ酸残基の う ちで 1 位 （最終 Ν末端に位置す る） から 11位までのア ミ ノ酸の配列 〔以下、 VIP (1 - 11 ) -ΝΗ2 と唣すこ と がある〕 と 、 へ 口デル ミ ン の最終 Τ ¾ 端よ リ 12位から 31位までのマ ミ ノ酸の配列 〔以下、 Hri - (12-31)- NH2 と唣すこ と がある〕 と を組合わせ結合 し てなるペプチ ド 〔以下、 νΐΡΠ-ll)- Hd(12- 31)- NtL と 唣すこ と がある〕 である。 更に、 第 3 の本発明によ る と 、 次式（ II ）
H一 His一 Ser一 Asp一 AJa一 Va丄一 Phe一 Thr一 Asp一 Asn一 lyr-Thr-Arg
一 Leu— Arg_し ys— Gin— Met— Ala—Val— Lys— Lys— Tyr— l.,eu— Asn—
Ser - lie -し eu - Asn - Ser - Arg - Thr - Ser - Pro- Pro -! ^ro - l (Dl ) で表わされるぺプチ ドが提供される ' _
式（ m )のペプチ ドは、 V IPのア ミ ノ酸配列〔 28個のマ ミ ノ酸残基よ り な り 、 以下、 VIP (1- 28) と唣す こ と が ある〕 と、 へ口デルミ ンの最終 N末端よ り 29位から 3 位までのア ミ ノ酸の配列 〔以下、 Hd 9- 35) と略すこ と がある〕 と を組合わせ結合 してなるペプチ ド 〔以下、 VIP(l-28)-Hd(29-35)-NH2 と略すこ と がある〕 である - 一般式（ I ) のペプチ ド、 式（ Π ) のペプチ ド及び式 ( ffl )のペプチ ドの各々 は、 ィ ヌ大腿動脈における試験 で血管平滑筋を弛緩させ、 血流增加作用 を示 した。 こ れ らのペプチ ドは ヒ ト に対 して有用な血流増加剤と な り う る。
発明を実施するための最良の形態
本発明によ る一般式（ 1 )のペプチ ドに包含される式 ( l a) , 式（ l b) 及び式（ I c)の各ペプチ ド、 並びに式 ( Π )のペプチ ド及び式（ ID )のペプチ ドは、 常套のぺプ チ ド合成法によ り 固相法でも液相法でも化学合成され る 。
例えば、 本発明の新規ペプチ ドは、 多く の化学教科 書及び論文に記載さ れる公知の活性エステ ル法又は混 合酸無水物法によ り常法で化学合成でき る が、 ァ ミ ノ 酸を固定し得るア ミ ノ官能基をもつ樹脂を用いる固相 法で化学合成さ れ るのが便利である
以下に、 本発明の新規ペプチ ドの化学合成を実施例 について説明する なお、 ア ミ ノ酸、 ア ミ ノ酸残基、 保護されたア ミ ノ酸、 ァ ミ ノ保護基、 ヒ ド ロ キ シ ル保 護基、 活性基、 等の表示は,. IL!PAC - IUB commission o〖，
Biological Nomenclature に基づく 号、 ある いは当 該ペプチ ド合成分野における慣用唣^ によ 行う場合 がある
なお、 以下の実施例中に用いた略号は次 と お り で ある。
Boc ： t-butyloxycarbonyl
Bzl ： benzyl
Tos ： p-toluenesulf onyl
し £Z ： 2-chlorobenzyloxycarbony]
Cfi2 *Bzl ： 2, 6-dichlorobenzyl
OcHex ： cyclohexy丄 ester
DCC ： , -dicyclohexy J carbodiimide
HOBt ： 1 - hydroxy benzotriazo丄 e
NHS ： N- hydroxy succinimide
MA¾ ： Mixed anhydride method
AE法 ： active ester method
TLX ： thin layer chromatography
HPLC ： high performance liqid chromatograph
TF ： trif luoroaceti c acid NMM ： -methylmorpholine
IBC ： iso-butylch] orofonnate
実施例 1
(a) 式（ l c)のペプチ ド、 すなわち Hd( 1-33)- l の合 成（固相法）
べッ クマン社製べプチ ド合成機 Mode] 990Cの反応槽 にア ミ ノ酸又はペプチ ドの固定用の樹脂と して、 2.00 g のべンズヒ ド リ ルァ ミ ン - ポリ スチ レン樹脂 （ア ミ ノ基含有量 O.Smmol/g樹脂； （株）ペプチ ド研究所よ り 購入） を添加 し、 CH2 C£2にて 2時間攪拌し樹脂を膨潤 させる。
次に、 下記のステ ッ プ⑤からステ ッ プ⑩の手順によ リ 、 へロデルミ ンの 33位のア ミ ノ酸であるプロ リ ンの Boc保護誘導体であ る Boc-Pro-OHを前記の樹脂に反応 させ且つ後処理する。
0Η20β2 20mi2で既に生成された保護ぺプチ ド -樹脂を 3 回洗浄。
② 30%TFAの CH2Cfi2溶液 20mfiで保護ぺプチ ド-樹脂を予 備洗浄。
Φ30 % TFAの CH2 Cfi2溶液 20ι«βで処理する こ と によ リ 、 樹脂に結合されたペプチ ドの Ν末端ア ミ ノ酸のア ミ ノ保護基を脱保護する。
¾CH,Cfi2 2ϋηιβで脱保護されたぺプチ ド-樹脂を 6 回洗 浄。
7 % Ν-メチルモルホ リ ンの CH 2 CJ ^溶液 20 mjpで脱保護 されたペプチ ド-樹脂を予備洗浄。
； B 7 % N-メチルモルホ リ ンの CH2 &2溶液 20mPでぺプチ ド-樹脂を中和。
7 CH2Cfi2 20mflで 6 回洗浄：
⑧新らたに結合させるべき Boc保護ア ミ ノ酸 3.0mm olと
HOBt 3.0mniol ¾ DMF 7ηιβ及び CH£Cii2 7nii2混液に溶解 した溶液を反応槽に添加。
'.9：· 0.5M DCCの CHZ Ci?.z溶液を 6 mfi加えて 2時間攪拌して
Boc保護ア ミ ノ酸のカ ッ プリ ング反応を行う .
CH2 Cfi2 2 Omfiで反応系を 3 回洗浄：
上記のステ ッ プ⑤からステ ッ プ⑩を行う こ と によつ て、 先づ樹脂への Boc-Pro-OHの導入が終了する
以上の如 く して導入された C末端 Pro 残基よ り開始 して、 以後は所定の保護ア ミ ノ酸を順次に構築中のぺ プチ ド鎖に導入する。 その各ア ミ ノ酸の縮合反応では 前記のステ ッ プ①よ リ Co;を繰 り返す 反応させる保護 ア ミ ノ酸は下記の順序でいずれも 3. Ommoiの量で加え る。 また、 各縮合反応では、 スチ ッ プ で加える H0F の量は 3. Ommo ]である。 但し、 Hi sは、 その分子中のィ ミ ダゾ一ル部分が HOBtによ る変化を受けるため、 最終 N端の His をカ ッ プリ ングさせる に当っ ては、 HOBt 使用 しない 次いで反応させるべき保護ァ ミ ノ酸の添 加順序は下記の通 り である --.
Boc-Ser(Bz])-0H. Boc-Thr (Bzl )-0H . ·
Boc-Arg(Tos)-0H-4/5Ac0Et · l/51l30. Boc-Ser (Bzl)-OH, Boc - Gly - 0H、
Boc—し eu— 0Η·Η20、 Boc_ 1丄 e— OH · 1 Z 2H2 ()、
Boc-Ser (Bzl)-OH, Boc - Ala - OH.
Boc—し eu— 0Η·Η20、 Boc-Tyr (CJ ?. ·ΒζΙ)— OH、
Boc -し ysCCi(*2ト 0H、 Boc-G.ly-0H、
Boc—し eu— ()Η·Η20、 Boc— A丄 a— 0H、 Roc-Leu-OH · H20 ,
Boc -し ys (Cfi，Z) - OH、 Boc-Ala-OH ,
Boc—し eu— OH ·ΗΖ 0、 Boc—し eu— OH · H20、
Boc—し ys(Cfi-Z)— 0H、 Boc-Ser (Bzi^ -OH ,
Boc-Tyr ( H -Bzl)-0H, Boc- Gin - OH、
Boc - Gin - 0H、 Boc-Thr (Bzl)-OH , Boc-Phe-OH,
Boc - lie - 0Η· 1/2H20、 Boc-Ala-OH,
Boc-Asp(0cHex)-0H. Boc-Ser (Bzl)-OH、
Boc-His (Tos)-OH
以上の操作によ り 、 反応すべき ア ミ ノ酸の導入がす ベて終了する と 、 樹脂上に、 次式で表わされる保護べ プチ ドすなわち保護された Hd(l- 33) が合成さ れる。
Boc-His (Tos)-Ser(Bz l)-Asp(0cHe )-Ala-Ile-Phe- Thr(Bzl)-Gln-Gln-Tyr(Cfi2 -Bzl)-Ser (Bzl)—し y s (Cfi · Z) 一し eu— Leu— Ala_Lys(Cfi，Z)— Leu— Ala—し eu— Glr!— LysiCf 'Zj — Tyr(CJ22 -Bzュ）一 Leu— Ala— Ser(Bzl)— lie—し eu— Gin— Ser(Bzl) - Arg(Tos') - Thr(Bzl) - Ser(BzJ ) - Pro - NH -樹脂 , この樹脂上に結合 した保護ぺプチ ド、 即ち保護ぺプ チ ド - 樹脂はデシケータ 一中で一夜乾燥する。 乾燥 し た保護ぺプチ ド-樹脂の内 2.0gを取 り . ァニ リ一ル 2. (； iiijeの存在下に フ ッ化水素 20mfiで 0 °C、 1 時間処理する こ と によ り 、 ペプチ ド鎖からの脱保護反応と樹脂から の脱保護されたペプチ ド生成物の解離と を行う ： 反応 混合物から フ ツ化水素を留去 し、 残留物をェ一テルて 洗浄し、 十分乾燥させた後、 3 M酢酸 I 00m£と混合させ これにペプチ ド生成物を溶解させ、 さ ら に不溶の樹脂 を濾去する。 ペプチ ド生成物を含む得られた濾液は凍 結乾燥する と 、 892 mgの粗ぺプチ ドが得られる こ の 粗ペプチ ドは、 3M酢酸水溶液を溶出液とする Sephadex G-25カ ラ ム ク ロ マ 卜 グラ フ ィ 一（3 X 140cm) に よ る ゲル 濾過で脱塩処理にかけ、 続いて 0.01N HCl/C!U CN系の 溶媒で溶出する YMC Pack D-0DS— 5カ ラム（ 2 X 25cm)に よ る逆相ク ロマ ト グラ フィ ーによ り ペプチ ド を精製 し た。 こ の よ う に して得た精製ぺプチ ド Hd (l- 33)- NH2は 酸加水分解後に下記のア ミ ノ酸分析値を示す。
Asp (l) 0.98 Thr (2) 1.91 ; Ser (5)4.55； Glu (3) 3.01 ; Gly(l) 1.09 Ala (4) 3.74 ; Ile (2) 1.89； Leu (6)6.03t Try (2) 2.05 Phe(l) 1.01 ; Lys (3)3.21； His (l) 1.08; Arg(l) 0.90 Pro(l ) 0.99
(b) 式（Ic)のペプチ ド、 すなわち Hd (l- 33)-NH2の合成 (液相法）
Hd (1-33) のト 6位、 7 - 9位、 10- 15位、 16 - 20位 - 21 - 23位、 および 24-33位の各々 のア ミ ノ酸配列に相当す る下記の ）〜（6)の 6種のペプチ ド を常法に従い、 活 性エステル法又は混合酸無水物法等を用いて合成した こ こ で合成した各ぺプチ ドは下記の通 り である。
(1) Boc-His (Tos)-Ser (Bz])-Asp (OcH x)— Ala— lie— Phe-OH
(2) Boc-T r (Bzl) -Gln-Gln-OH
(3) Boc-Tyr(C£2♦ Bz丄）一 Ser (Bzl)—し y s (Cfi— Z) -し eu— し eu - Ala - OH
(4) Boc— Lys (CJB ·Ζ)—し eu— Ala— Leu-Gln_OH
(5) Boc-Lys(CJ2-Z)-Tyr(Cj22 · BzJ )—し eu— (U!
(6) Boc: - A丄 a - Ser(Bzl) - lie - Leu - Gly - Ser (Bzl)- Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Ser (Bzl ) -Pro-NH2
これ らの 6種のペプチ ド を、 C末端よ り即ち（6) の ペプチ ド（ア ミ ド化体）から始めて順次に活性エ ステ ル 法によ り フ ラ グメ ン ト縮合法によ り縮合させて、 保護 Hd (1-33)-ΝΗ2 を得た。 保護1^(1_33)-1\1112 を ァニ ソ 一ル の存在下でフ ッ化水素中で処理する こ と に よ り脱保護 させる。 得られた粗ペプチ ド Hd ( 1- 33) -NH2 を、 ゲル滤 過ク ロマ ト グラ フ ィ ー（セ フ ア デッ ク ス G- 25)及び分取 用逆ネ目 HPし C(Column: YMC Pack D— 0DS— 5)で精製する と 精製べプチ ド Hd(l-33)- NH2 を得た。
実施例 2
式（ I b)のペプチ ド、 すなわち Hd(l-32)-NHzの合成 ベ ッ クマン社製ぺプチ ド合成機 Model 990Bを用い、 固相法によ り実施例 1 と同様な要領で所定のア ミ ノ酸 を順次に縮合させてペプチ ド合成を行ない、 ぺプチ ド Hd(l-32)-NH2 を得た。 また、 液相法も実施例 】 と同様 行 ヽ Hd(l— 32)— NH2を得た。
得られたぺプチ ド Hd(l-32)- NHZのア ミ ノ酸分析 （酸 加水分解、 6N HC£、 110°C、 24時間）を行って、 下記の ア ミ ノ酸分析値を得た u
Asp(l) 1.02； Thr(2)2.01; Ser (5)4.62； Glu(3)3.C3; Gly(l)1.08; Ala(4)4.17; Ile(2)1.81; し eu(6)5.94; Try(2)1.91; Phe(l)1.03; Lys(3)3.30; His(l) 1.04； Arg(l)0.98
実施例 3
式（ I a )の本発明のペプチ ド、 すなわち Hd(l- 31) - NH2の合成
べッ クマン社製ぺプチ ド合成機 Model 990Cを用い、 固相法によ り実施例 1 と同様な要領で所定のァ ミ ノ酸 を順次に縮合させてペプチ ド合成を行ない、 ペプチ ド Hd(l- 31)- NH2を得た。 また、 液相法によ るペプチ ド合 成も実施例 1 と同様に行い、 Hd ( 1 -3 i ) - NH2 を得た n 得られたペプチ ドのア ミ ノ酸分析 （酸加水分解、 6 : HCi2、 110°C、 24時間） を行っ て、 下記のア ミ ノ酸分析 値を得た。
Asp(l)1.08; Thr(2)1.96; Ser (4)3.76； Glu(3)3.10： Gly(l)1.13; Ala(4)4.14; Ile(2)1.90; Leu (6)6.09： Tyr(2)1.97; Phe(l)1.09; Lys(3)2.97; His (1)0.98； Arg(l)0.84
実施例 4
式（ Π )の本発明ペプチ ド、 すなわち νΐΡΠ-11_)- Hd (12-31)-NH2 の合成（液相法）
ぺプチ ド' VIP (卜 1Γ) - Hd (12 - 31) - 'H2のト 4位、 5 - 9位、 10- 15位、 16- 20位、 2】 -23位、 24 - 31位の夫 々 のァ ミ ノ 酸配列に相当する下記（1)〜（6)の 6種のぺプチ ド を、 Stepwise elongat i on法 iZよ り所定 Q) Boc- 7 ミ ノ酸を 順次に結合する こ と で合成した。 各 Boc-ア ミ ノ酸の縮 合反応は、 活せエステル法（AE法）または混合酸無水物 法（MA法）を用いて行っ た。 こ こで合成 した上 §Ξ G種の ぺプチ ドはそれぞれ下記の通 り であ り . ド記の手法に よ り合成された。
(1) Boo-His (Tos)-Ser (Bzl)-Asp (OcHex) - la-OH
(2) Boc-Val-Phe-Thr (Bzl)- sp (OcHex) -Asn-OH
(3) Boc-Tyr (Cfi2 · Bzl)— Thr (Bzl)—し y s (Cfi · Z)—し eu— し eu - Ala - OH
(4) Boc-し ys (Cfi-Z)— Leu— A la— Leu— Gin— OH
(δ) Boc し ys (C£«Z)— Tyr (Cfi^: ·Βζ1)—し eu— OH
(6) Boc - Ala - Ser (Bzl) - lie -し eu_Gly - Ser (Kzl卜
Arg (Tos)-Thr (Bzl)-NH2
(1) Boc-His (Tos)-Ser (Bzl) -Asp (OcHex) -Ala-QH の合 處
Boc - A SP (OcHex) -OH (分子量:] 15· 37) 9· 46gと NHS (分子 量 115.09) 3.80gと を縮合剤と して DCCの存在下に縮合 し、 ア ミ ノ酸活性エス千ル（ I )と して Boc - Asp (OcHex) -0 5の 14.05£(収率85.02 % )を得た 1： ア ミ ノ酸活性ェ ス子ノレ（ ί )の 4.53gと H-Ala-0H (分子量 89.11) ί'.9δε ¾- - 1
5
活性エ ステル法（AE法）に よ り 縮合する と 、 ペプチ ド ( Π ) と して Boc - Asp (OcHex) - Ala - 0H (分子量 386.44； 3.26g (収率 76.8 % ) を得た„ ぺプチ ド（ Π )の 2.00 g を TFA処理によ り脱 Boc化 した後、 得られたぺプチ ド . す なわ ¾ AsP(0cHex)-Ala-0H ¾ Boc-Ser (Bzl)-OH (分子量 295.33)】 .84gと混合酸無水物法（MA法）に よ リ縮合させ る と 、 ペプチ ド'（ ΙΠ )と して Boc-Ser (Bzl )-AsP (OcHex)— Ala-0H (分子量 563.65) 2.54g (収率 87.〗％ ) を得た .— ベ プチ ド（ DI )の 1.17gを TFA処理によ リ脱 Boc化 した後、
10 得られたペプチ ド を Boc-His(Tos)-0H 1.10gと MA法に よ り縮合する と、 ペプチ ド（IV)と して Boc- His(Tos) - Ser(Bzl)-Asp(0cHex)-Ala-0H(^:f ft854.98)の 940mg (収率 53.0%)を得た。
(2) Boc-Val-Phe-Thr (Bzl)-Asp(0cHex)-Asn-0Hの合成 Boc-Asp (OcHex) -画 Sの 6· 19gと H - Asp 0Hの 1 ,9Sgを AE法に よ り 縮合させる と 、 ペプチ ド（ V ) と し て Bor- Asp(OcHex) - Asn - 0Hの 4,10g (収率 63·6% )を得た。 ぺプ チ ド（ V )の 3.87gを TFA処理によ り脱 Bocィヒ した後， 得 られたぺプチ ド を Boc-Thr (Bz】）-0Hと MA法によ り縮合
20 する と、 ペプチ ド（VI)と して Boc— Thr(Bzi)— Asp(()cHex:
-Asn-0Hの;].70g (収率 66.2 % )を得た ぺプチ ド（' VI )の 3.70gを TFA処理に よ り 脱 Boc化 し た後、 得 られたぺ プチ ド を Boc-Phe-0H 2.2] gと MA法に よ リ縮合させる と、 ペプチ ド（ΥΒ)と して Boc-Phe-Thr(Bz])- Asp(GcHeX
25 -Asn-OH 4.()4g (収率 88.3% ) を得た：. ペプチ ド（YD)の l.]5gを TFA処理によ り脱 Bocィヒ した後、 得られたぺプ チ ド を Boc-Val- 0H 0.39gと MA法によ り縮合させる と ， ペプチ ド（ ）と して Boc - Val— Phe - Thr(Bzl) - Asp(OcHex) -Asn-OH 0.7Sg (収率 60.0% )を得た。
(3) Boc-Tyr (CH2 · Bzl )—丁 hr (Bz 1 ) Ly s (C£ · Z )—し eu— A 1 a— OHの合成
Boc - Leu— Oil 11.56gと NHS 5.75gを縮合剤と して DCC の存在下に縮合し、 ア ミ ノ酸活性エステル（β )と して Boc-Leu-ONHS 12.3 lg (収率 75.0 % ) を得た。 この活性 エステル（IX)の 9.85gを H-Ala- OH 2.67gと AE法によ り 縮合 し、 ペプチ ド（X)と して Boc-Leu-Ala- OH8.12g (収 率 89.3%)を得た。 ぺプチ ド（X)の 4.0gを TFA処理によ り 脱 Boc化 し た後、 得 ら れたペプチ ド を Boc-Leu-OH 4.88g と MA法によ り縮合させる と、 ペプチ ド（XI)と し て Boc- Leu-Leu-Ala- 0H 3.72g (収率 67.7g) を得た ぺ プチ ド（XI)の 2.50gを TFA処理によ り脱 Bocィヒ した後、 得られたぺプチ ド を Boc-Lys (Cfi'Z)-OH 3 · 61 gと MA法に よ り縮合 し、 ペプチ ド（XD)、 Boc-Lys (CJ2':Z)-Leu-し eu - Ala-0H 4.87g(94.0% )を得た。 ペプチ ド（ΧΠ)の 2.35g を TFA処理によ り脱 Boc化 した後、 得られたぺプチ ド を Boc-Thr (Bzl)-OH 1.36g と MA法によ り縮合する と 、 ぺ プチ ( X ΙΠ ) , Boc-Thr (Bzl)-Lys (Cfi · Z ) -Leu- Leu- A 1 a -O!l 2.]5g (収率 72.1 % ) を得た。 このペプチ ド（Χ ΙΠ ) の 2.20gを TFA処理によ り脱 Bocィヒ した後、 その脱 Boc体 を Boc-Tyr (C£;, ·Βζ])-ϋΗ 1.40gと ! ^法によ り縮合させ る と、 ペプチ ド（X IV )、 Boc— Tyr (C£2 ·Βζ] )— Thr ( 3zi)_ し ys(Cfi-Z)—し eu—し eu— Ala— OH 2- 98g (収率 99.8 % ) を得 た。
(4) Boc—し ys (CJ¾-Z)— Leu— Ala—し eu— Gin— 01ίの合成
Boc-Leu-ONHS 3 , 28gと H— G丄 n— OH l *46gを Af^去によ リ 縮合させる と 、 ペプチ ド（X V ) 、 Boc-Leu-Gln-OII 2.48g (収率 69.1 % ) を得た。 ペプチ ド（ X V )の 3.10 % を TFA処理に よ り脱 Boc化後、 得 られたぺプチ ド を Boc-Ala-OH 2. ] 2gと HA法によ リ縮合する と 、 ぺプチ ド ( X VI) . Boc - Ala -し eu - Gin - OH 1 · 93g (：収率 5 0 %：)を得 た。 ペプチ ド（X VI)の 900mgを TFA処理によ り脱 Boc化 後、 得られたペプチ ドを Boc-Leu-OH 680ra と HA法に よ り 縮合する と 、 ペプチ ド（X Vn)、 Boc-Leu-Ala-Leu- Gln-OH 710mg (収率 62.5 % )を得た。 ペプチ ド（ X 11 )の 670mgを TFA処理によ リ脱 Boc化した後、 得られたぺプ チ ド を Boc— Lys (Cl ' Z)-0H 660mgと MA法によ リ 縮合さ せる。 ペプチ ド'（X ：)、 Boc -し ys (Cl · Ζ) - L,eu - Ala - Leu- Gln-OH 850rag(82.1 % ) を得た。
(5) Boc— Lys (C丄 ·Ζ)— Tyr (Cl2 · Bzl )—し eu— OHの合成
Boc-Tyr(Cl2 ·Βζ)-0Η 22.12gと NHS 6.33gを縮合剤と して DCCの存在下に縮合し -. ペプチ ド（X E)、 Boc-Tyr (Cl2 -BzD-ONHS 15.84g (収率 58.7 % ) を得た：. ぺプチ ド（X K )の 5.39gと H- Leu-OH i .31gを、 法によ り縮 合 し 、 ペプチ ド' （X X ) , Boc - Tyr · Bzl) -し eu— f)H 3.93g (収率 71.1 % ) を得た r ペプチ ド（X X )の 2.33ε を TFA処理によ り脱 Boc化後、 得られたペプチ ド を Boc- Lys (Cl-Z)-OH 2.09gと MA法によ り縮合させる ： ぺブチ
H' ( X IT ) . Boc—し ys(CJ ·Ζ)— Tyr(Cl2 ·Βζ1)—し eu— OH 2.56 g (収率 71.7% ) を得た。
(6) Boc - Ala - Ser(Bz:iレ lie -し eu - Gly - Ser(Bzl) - Arg (Tos)-Thr-NH7の合成
保護さ れたア ミ ノ酸と して Boc- Thi'(Bzl.)-0H G.19g に M及び IBCを夫々 に当量の割合で加え、 混合酸無水 物をつ く り 、 そ こへ、 NHS 2.53£ を反応させァ ミ ノ酸 活性エステルに変換する。 次いで、 ΝΗ3 · H2()を 10倍量 加え、 ア ミ ド化反応を行う と、 ア ミ ノ酸のア ミ ド化生 成物（XSB)、 Boc-Thr(Bzl)-NH2 3.69g (収率 59·8% ) を得た 。 こ の生成物（X ΧΠ)の 2.00gを TFA処理に よ り 脱 Boc化後、 得られた Thr (Bzl)- NH2 を Boc- Arg (Tos) -OH 3.06gと MA法によ り縮合させる と 、 ペプチ ド（X X BO、 Boc-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-OH 3.12g (77.6 % )を得た . ぺ プチ ド（X X m )の 2,16gを TFA処理によ り脱 Boc化後、 得 られた Arg(Tos) - Thr(B2l ) - 0Hを Boc- Ser(Bzl) - 0H 1.13gと MA法によ り縮合させる と、 ペプチ ド（X X IV)、 Boc-Ser (Bzl) -Arg (Tos)- Thr(Bzl)NH2 2 · 29g 収率 82 · 2 % ) を得た 。 ペプチ ド（ X X IV )の 2.00gを TF A処理に よ リ 脱 hoc.ィ匕後、 その脱 Boc生成物 を Boc - Leu - GJy— OH 0.87g と MA法によ り縮合 し 、 ペプチ ド（X X \' )、 Boc- L.eu-Gly-Ser (BzD)-Arg (Tos)-Thr (Bzl)NH2 2.19 & (収 率 90.7%)を得た„ 前記の Boc- Leu-Gly- は、 Boc-し eu -ONHSと H-Gly-OH を AE法によ り縮合 して収率 7S.7%で 得られたものである。
次にぺプチ ド（ X V )の 2.0 Ogを TF A処理し て脱 Boc 後.. その脱 Boc生成物を Boc-I丄 e- OH U.72gと MA法によ り縮合し、 ペプチ ド（X X VI) , Boc-Ile-Leu-Gly-Ser
(BzD-Arg(Tos)-Thr (B2l)-NH2 1 · 99"収率 8 10/o ) * 得た。 ペプチ ド （ X X VI )の 830mgを TFA処理によ り 脱 Bocィ匕後、 得 ら れた脱 Boc生成物 を Boc— Ser (bzl) -OH 270mgと MA法によ り縮合させる と 、 ぺプチ ド （ X X Ί1 ) Boc— Ser (Bzl)— lie—し eu— Gly— Ser (Βζ】）一 Arg (Tos)—丁 iu
(Bzl)-NH2 630mg (収率 66.8% ) を得た - ペプチ ド (Χ Χ ΥΙί)の 630mgを TFA処理によ り脱 Boc化後、 その脱 Boc生成物を Boc— Ala— OH 11 Omgと MA法によ り縮合させ る と 、 ペプチ ド（X X ）、 Boc— Ala— Ser (Bzl)—丄] e— し eu - Gly - Ser (Bzl) - Arg (Tos) - Thr (Bzl)- ΝΗ · 570rag (収 率 85.9% ) を得た。
(7) 保護されたペプチ ド VIP(1- 1])- 31)-NHZ の 合成
前項（6)で得られたぺプチ ド（X X W) 900mgを TFA処 理によ り脱 Boc化後、 その得られた脱 Boc生成物！： ， 前 項（5)で得られたぺプチ ド（： H )の 693mgと DCL- HOBt法 によ リ縮合反応させた ,. 常法に従いその縮合生成物を 後処理 し、 メ タ ノ ールで洗浄し、 ペプチ ド（ X X M ) . Boc - Lys(C】 ·Ζ) - Tyr(C · Bzl ) - Leu - A la - Ser (Bz】） - 1 ] ft - し eu - Gly - Ser(Bzl) - Arg(Tos) - Thr(Bz ) - Nl 1.22c. ("収 率 87.4% ) を得た。 ペプチ ド（X X K)の l.OOgを TFA処 理に よ り脱 Boc化後、 そ の脱 Boc生成物を、 前項（4) で ί たペプチ ド（X珊）の 490mgと DCC-HOBt法によ り 、 フ ラ グメ ン ト縮合し、 得られた粗製の縮合生成物を DM1'' に溶解後、 そ の溶液から AcOEt /エーテル（1/4) の添加 に よ り ペプチ ド生成物 を再沈澱させる と 、 ペプチ ド ( X X X )と し て 、 Boc -し ys(Cl'Z) - Leu - Ala -し eu— Glri— し ys(C丄 ·Ζ) _ ΐγΓ ((:ΐ2 ·Βζ1)— Ιβιι— Αΐ3 56Γ (Βζ1)Ι1Ρ— Ιευ -Gly-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-NH2 l-16g (収率 85.9% ) を得た。
こ の べプチ ド （ X X X )の 1.00gを TFA処理によ り 脱 Boc化後、 得られた脱 Boc生成物を、 前項（3) で得られ たペプチ ド（X IV)の 662ragと、 DCC-HOBt法によ り 、 フ ラ グメ ン ト縮合 した。 得られた粗製の縮合生成物を上 述 し た方法 と 同様に後処理 し、 ペプチ ド（X X )と して Boc— Tyr(Cl2 «821)—丁111" (82：0— 1^5((1*2)—し60— 1^リー Ala-Lys(C] -∑)—し611— 13—し6リー610—し 3((：；1-2)—丁 1"((：]2 · Bzl)—し eu— Ala— Ser (Bz 1 )— 11 e し e u— G 1 y— Ser (Bzl)- Arg CTos)-Thr(Bzl)-NH2 1 · 39g (収率 99.4 % )を得た。 こ の ぺプチ ド（X X )の 600mgを TFA処理によ リ脱 boc化後 , その脱 Boc生成物を、 前項（2)で得られたペプチ ド（II) の 195mgと DCC-HOBt法によ り 、 フ ラ グメ ン ト縮合 した , 得 ら れた粗製の縮合生成物 を 、 上述 し た方法と 同様 に後処理し、 ペプチ ド（X X X Π )と して Boc- Va!l-Phe - Thr(Bzl.)-Asp(OcHex)-Asri-Tyr(CIz -BzJ)-Thr(Bzn- Lys(Cl-Z)— Leu— Leu— Ala— Lys(Cl-Z)— Leu— Ala— Leu-Gin— し ys (CI *Z)— Tyr (Cl2 ·Βζ1)—し eu— Ala— Ser (Bz I )— Jle—し eu— Gly - Ser(Bzl) - Arg(Tos) - Thr(Bzl) - NH2 の 530nig (収率 74.1 % ) を得た。 こ のペプチ ド（ X X X Π )の 400mgを TFA処理によ り脱 Boc化後、 得られた脱 Boc生成物 ¾ 前 項（1)で得もれたぺプチ ド（ IV )の 147iiigと DCC- HOBt法に よ り 、 フ ラ グ メ ン ト縮合さ せる と ， 保護さ れた' I P (l-ll)-Hd(12-31)-NHz 370nig (収率 79.8 %：) を得た - (8) VIP (ト 11) - Hd(12 - 31) - NH2の合成
前項（7)で得られた保護された VIPn-ll)-Hd(12- 31) -NH2の 200mgを無水フ ッ化水素-ァニソ一ル（10 ： 1 ) の混液の 5 ιηβに溶解させた後に、 その溶液を 0 °C、 60 分間撹拌して脱保護反応を行っ た。 そ の反応液を常法 に従い後処理した後、 3M - 酢酸で抽出 した 抽出液を 凍結乾燥 し 、 得 ら れた粗生成物をゲル濾過ク ロ マ ト グラ フィ ー （セ フ ア デッ ク ス G- 25) 及び； 相 HPLC(YMr. Pack D-0DS-5、 溶出液 ： 0.01N塩酸-ァセ トニ 卜 リ ル混 合液）によ り精製し、 1?(卜11)-11(1(12-31)-!^2すなゎ ち式（ Π )の本発明ぺプチ ド の 18nigを得た。
こ の得られたペプチ ド をア ミ ノ酸分析（酸加水分解、 6N HC1、 1]()°C、 24時間）する と、 下記のア ミ ノ酸分析 値を示 した。
Asp(3)2.88; Thr(3)2.92; Ser(3)2.78: Glu(l)1.05; Gly (1) 1.07； Ala(4)4.21; Val(l)0.97; lie (1)1.02；" Leu (6)6.1：1； Tyr(2)2.08; Phe(l)0.95: し ys(3)3,05 His(l)1.01; Arg(l)0.95
このペプチ ド を HPLCによ る分祈にかける と、 溶出時 間 ] 4.9分であっ た。 この際の HPLCの条件はカ ラム MC Pack R-ODS-5 (0.46 X 25cm) を用い、 溶出液は 0.01N塩 酸/ァセ トニ ト リル（80/20)→ (50/50)であ り 、 グラ ジ ェ ン ト時間は 30分と した。 検出器では lJV(210nm) の波 長の吸光度で検出 し、 被検液は流量 l.OmlZmin.で流 した。
実施例 5
式（ Π )の本発明ぺプチ ド、 すなわち V T P (】 - 11) - H d (12-31)-NH2の合成（固相法）
ベッ クマン社製ペプチ ド合成機 ModJe 990Cを用い、 固相法によ り実施例 1 と同様な要領で所定のア ミ ノ酸 を順次に縮合させてペプチ ド合成を行ない、 ぺプチ ド VIP(l-ll)- Hd (12-31)- NH2 を得た。
実施例 6
式（ ffl )の本発明ペプチ ド、 すなわち VIP (l-28)-Hd (29- 35)- NH2の合成（固相法）
本実施例においては、 35個のア ミ ノ酸基からナ るぺ プチ ド VIP(l-28)-Hd(29-35)-NH2 の合成は、 自動べプ チ ド合成機！: Beckman社製 自動ぺ プチ ド合成機 Mode】 990B〕 を用い、 固相法によ り 、 所定のア ミ ノ酸を順次 に縮合させる こ と によ り ペプチ ド鎖を延長 して行っ た 合成中のペプチ ドの固相担体と して
p-methtylbenzhydr laraine-¾^g ( % d i i n y 1 b e n 2 e 11 一 11一
- polystyrene共重合体） （- NH2含量'， C、3顏 i/g樹脂、 2.0g) (国産化学社製）を 自動ペプチ ド合成機の反応槽 に装入 した。
縮合される各ア ミ ノ酸の α位ァ ミ ノ基のア ミ ノ保護 基は、 t-butyloxycarbonyl (Boc¾) であ り 、 原料と し て使用される Boc-ア ミ ノ酸はいずれもペプチ ド研究所 (大阪）よ り購入 した。
そ の Boc-ア ミ ノ 酸の う ち、 側鎖に官能基を有する ア ミ ノ酸である Arg， Asp, His, Lys， Ser , Th「および Tyrは下記の保護ア ミ ノ酸の形で用いた
Boc-Arg(Tos)-OH, Boc- Asp (OcHex ) , Boc-His (Tos) -OH , Boc -し ys - 2 - Cfi-Z) - 0H， Boc-Ser (Bzl ) -OH , Roc-Thr (Bzl)-OH, Boc-Tyr(2,6-CJ¾2-Bzl)-0H
上記のア ミ ノ酸の側鎖官能基に結合された保護基は いずれもア ミ ノ酸の縮合反応中で安定である が、 ぺブ チ ド鎖の完成後には液体フ ッ化水素処理によ リ脱離で さ る。
各ア ミ ノ酸の縮合後には、 ペプチ ドの N末端のア ミ ノ保護基 Boc基は脱離されるが、 このための脱 Boc化試 薬である ト リ フルォロ酢酸（TFA)は、 CH2CJ22中 50 % TFA 溶液（50%TFA/CH2C£2)と して使用 した。
脱 B 0 t、化反応の後、 ペプチ ド末端に生成す る マ ミ ノ基 TFA塩の中禾ロ剤と し T N ,Ν-diisopropyieth lamine (DIEA)を ]0%DIEA/CH2C£2溶液の形で使用 したレ
ア ミ ノ酸の縮合のための縮合試薬と して ；3 ο dicycJohexylcarbodiimiae (DCC)、 および縮合反応
媒と し て 1一 hyriroxyhenzotriazole (HOBt )を使用 し た： なお、 本実施例で用いた溶媒および試薬は、 いずれ も試薬特級またはペプチ ド合成用試薬を用いたし 各ア ミ ノ酸の縮合反応を行う に当っ ては、 カ イ せ'一 試験によ り その進行度を調ベた。 すなわち、 すでに形 成さ れたペプチ ド鎖への各 Boc-ァ ミ ノ酸の縮合反応後， 生成した保護ペプチ ド - 樹脂の約 0.01 gを反応槽か h 試験管に取 り 出 し 、 以下の試薬（1)、 （2)および（：ぃ C,0 溶液をそれぞれ 3滴加え、 2.5分、 1 ] 0°Cで加熱 した
ニ ン ヒ ド リ ン陽性を示 した場合には、 縮合反応を再度 行つ た。
(1) フ I ノ ール 4mg/mfiエタ ノ ール溶液
(2) ImM KCN 2πι£を ピ リ ジン 1 ΟΟηιβで希釈 した溶液δ (3) ニ ン ヒ ド リ ン 50mg/in£エ タ ノ ール溶液
以下に本実施例で行っ た反応工程を具体的に記載す る
(1 ) 保護ペプチ ド - 樹脂の合成
P-Methylbenzhydrylamine-^ S| (~ΝΗ2 g； (K 3ramr>】 Zg樹脂） 2.0g (0.6 ol)をペプチ ド 自動合成機の反応槽 に添力 []、 DMF 45mJ2中で 24時間、 ついで CH2 CJ^ 4δπιί ^ で 24時間撹拌 し 、 樹脂を膨潤させたのち、 所定の Bo - T S ノ酸を順次に用い縮合反応を行つ た
hoc-ア ミ ノ酸 1 個を導人するのに必要な操作は、 樹 脂上ですでに形成されたべプチ ドの N —末端からの脱 Bocィヒ、 中和、 Boc - ア ミ ノ酸の縮合の過程からなる： これ らすべての操作は乾燥窒素気流中で行つ た 各捲 作は、 次のよ う に行っ た。
α 保護ペプチ ド-樹脂を反応槽に人れ、 cn2c^ 4'·; rajBを注入、 その混合物を 1.5分間撹拌し濾過した . こ の操作を 3 回繰 り返 した
② 50 % TFA/CH2 CJ2Z 40mfiと共に保護ぺプチ ド-樹脂 を 】 .5分間撹拌し、 洗浄および樹脂と 平衡化を行い 濾過 した。
'-¾· 50 % TFA/CHzCfiz 4 Omfiと共に保護べブチ ド -樹脂 を 30分撹拌しペプチ ドの N末端から脱 Boc化 し、 濾過 した。
CH2Cfi2 40mfiと共に保護ペプチ ド - 樹脂を 1.5分 間撹拌したのち、 濾過した。 この操作を 6 回繰 り返 し ペプチ ド - 樹脂上に残留する TF.Aを洗浄によ り 除去 し た。
(5· 10 %DIEA/CH2Cfi2 40mJ2を反応槽に注入、 ぺプチ ド - 樹脂と共に 1.5分間撹拌したのち、 滤過 した。 こ の操作を ： 3 回繰 り返し、 ペプチ ド中の TFA塩を中和 し た。
Φ' CllzCfi? 40mfiを注入 . ペプチ ド - 樹脂と共に ] . 分間撹拌し、 濾過した。 この操作を 6 回繰 り返 し、 残 留する DIEAを除去 した。
¾ 所定の Bor-ア ミ ノ酸およぴ Η(Η のそれぞれ 3倍 当量（0.6mmo】）を DMF 5 πιβと C1 CJ^ ] (Jm に溶解 し.た溶 液を . 反応槽に添加、 5 分間撹拌 して樹脂と の平衡化 を行つ た
(3· 0.5 DCC/C ZC9, 3.6m)2 ( 1 , διη!ηο 1 )を加え、 反応 槽内で室温で 120分間撹拌 し、 Boc-ア ミ ノ酸の縮合 応を行っ たのち、 濾過 した。
CH2 40mfi を生成さ れたペプチ ド - 樹脂に加 え 1.5分間撹拌し、 濾過 した。 こ の操作を G 回繰 り返 し、 残留 した反応試薬を洗浄、 除去 した。
上記一連の操作が完了 した後、 さ ら に、 Ι)Μト Ο,η 、 MeOH 40mfi、 CH2 Ci2 40mfiの順でそれぞ才し 3 回ずつ 分 間撹拌し、 保護ペプチ ド - 樹脂を洗浄 した ( こ れを濾 取 し、 得られた樹脂についてカイザ一試験を行っ た。 ニ ン ヒ ド リ ン陽性を示した場合には、 上記 〜⑨の操 作を再度行い、 ペプチ ド鎖へのア ミ ノ酸の縮合反応を 完結させた
上記の要領で順次に各 Boc-ア ミ ノ酸を導入する こ と によ り 、 ペプチ ド鎖を延長させて行く と、 VIP(1- 2δ)- Hd(29-35)-NH2 に相当するべプチ ド を含む保護べプチ ドが樹脂上に結合 した状態で生成さ れた。 こ の保護べ プチ ド-樹脂を反応槽から取 り 出 し、 DMF 40ιηί：、 MeOH 4( ijeおよび CH2C£2 40mj(iにて、 それぞれ 3 回ずつ洗浄 し たのち、 濾取 し、 乾燥剤 P20; を収容するデシケ一タ —中で減圧乾燥する と 、 保護ペプチ ド - 樹脂 ：.54£：を 得た
(2) 保護ベプチ ド - 樹脂の液体フ ッ化水素処理 前項（1)で得られ V I P ( ] - 28 ) - H d ( 2 Π - 35 ) - H ,に相当 する保護ペプチ ド を結合 し た樹脂 U .27ε) をテ フ ロ ン 被膜撹拌子と と も に HF反応容器 （ペプチ ド研究所、 大 阪 -)に入れ-、 ァニ ソ一ル U .5ιιιβ )およびェチル チルス ルフイ ド（0.5mfl) を加えて室温で減圧下で 30分間放置 し た - 反応槽を ドライ アイ ス - ァセ ト ン浴で冷却下、 に再蒸留 し た フ ッ 化水素（ 15mfi) を前記の保護ぺブ手 ド - 樹脂と ァニ ソ一ルと ェチル 、スチル スルフ ィ ド h (7) 混合物に対して添加、 0 X、で 6 分間撹拌し、 ぺゴチ を樹脂から解離する と共に側鎖官能基の保護基も保護 ペプチ ド鎖から脱離した。 反応混合物から HFを留去 し たのち、 固体残留物を酢酸ェチル（30m£)で 3 回洗浄し 濾取 した。 固体残留物を減圧乾燥 し、 これを 0.02%ェ タ ンチ才一ル含有 3M酢酸 OOOmi にて抽出 して粗ぺ— /· チ ドを含む抽出液を得た。 樹脂を濾過に-よ り除き、 滤 液を凍結乾燥 し、 粗ぺプチ ド生成物 455mgを得た，
(3) 粗ペプチ ド生成物の検定
前項（2) で得られた粗ペプチ ド生成物の純度は、 逆 相 HPLCによ リ検討した。 分析用逆相 HPLC用機器と して は、 高速液体ク ロマ ト グラ フ装置 （T0S0H CCPD, 東ソ 一社製）、 低圧グラ ジェン 卜装置 GE-8000 (東、)—社製） 紫外可視分光検出器 U V-model Π (東リ一社製）およぴフ ラ ッ トペン レコーダ一 Type 3066 (横河電機社製）を用 い、 溶出用カ ラム と して YMC-Pack R-ODS-δ (ϋ.46 X 2'- cm) (ヮ イエムシィ 社製） を用 いた。 溶出条件は、 30分 間、 流速 1.0m£/分で 0.0】N HC£/CH3CNの jtを 80/20力、ら 50/50まで変化させ、 l!V吸光度（210 ）で検索 した。
粗ペプチ ドの主要溶出 ピーク を分取 し、 fi H によ る酸加水分解物のア ミ ノ酸分析を行っ た結果、 得られ たペプチ ドが目的とする VIP(1- 28)-Hd (29- 35)_ H2の ア ミ ノ酸組成に一致する こ と がわかっ た。
(4) 粗ペプチ ド生成物の精製
前項（3)で得 ら れた粗べプチ ド生成物 を逆相 HPLC に よ り 精製 し た。 精製 に使用 した分取用逆相 HPLC用 機器には、 高速液体ク ロ マ ト グラ フ装置 LKB 2249 LC
Gradient Pump (Pharmacia LKB社製、 Sweden) , 紫外可 視分光検出器 LKB 2251 (Pharmacia LKB社製、 Sweden) およびペン レコーダ一LKB 2210 (Pharmacia LKB社製、 Sweden) が含まれる。 溶出用カ ラムは分取用 YMC- Pack D-0DS- 5(2.0 X 25cm) (ヮイエムシィ 社製）を用 いた。 粗 ぺプチ ド生成物（50rag)を 50%酢酸に溶解した溶液を 力 ラムに添加 し、 0.01N HCJS/CH3 CN、 流速 10m /分で溶出 させた。 溶出物は、 UV吸光度（210nm) によ り検索 し、 目的とするポリ ペプチ ド を含む画分を分敢 した。 この 画分を凍結乾燥 し 、 目 的 と する精製ポ リ ぺプチ 'の 8.5mg を得た。 収率は、 粗ペプチ ド生成物から計算 し て : I 7 %であっ た。
(5) 精製ペプチ ドのア ミ ノ酸分析
前項（4)で得 られた精製ペプチ ド（80 μ g)を、 硬質ガ ラ ス管中でフエ ノール含有 6 HCfi 3nifiの存在下、 脱 気封管し、 〗10°C、 24時間加水分解したのち . 開管 し、 更に沸騰水浴上で減圧下にその反応液から 6i HCfiを留 去した。 得られたペプチ ド酸加水分解物を、 Lithium citrate buffer (Beckman社製）（500 β) に ί容解 し 、 自 動ア ミ ノ酸分析装置（Beckman社製、 モデル 7300) に よ り ア ミ ノ酸分析に供した。 得られたア ミ ノ酸分析値は 下記に示す通 りであ り VIP(1- 28)- Hd(29-35)-NH2 のァ ミ ノ酸組成に一致した。
ASP (5) 5.05 ; Thr(3) 2.9i; Ser(4) 4.03 ; Glu(l)l.2δ; Pro(3)3.31; Ala (2) 2.03； Vai(2)l .59； Met(l)0.99;
Ile(l)0.99; し eu(3)3，06j Tyr(2)1.87; Phe(!)0.80; LysC3)3.10; His(l)0.99; Arg(3)3.00
(6) TLCの Rf値および比旋光度の測定
シ リ 力ゲル TLCにおいて、 展開溶媒（A)と して]- ΒυΟΗ -AcOH-H20 (4 ： 1 ： 5 ) を用いた場合の前項（5)の精 製ペプチ ド の Ri値は 0 · 00であ り 、 ま た展開溶媒（B) と してト BuOH - Pyridine - AcOH - H20 (30 ： 20 ： 6 ： 24)、 (upper phase) を用いた場合の Rf値は 0. 20であっ た c また、 本ペプチ ドの比旋光度は、 [ « ]^ — 85° (c 0.1、 1M 酢酸）であっ た。
更に、 前記の実施例 1 で合成された式（ I c )の本発 明ぺプチ ド !: Hd (l-33)-NH2〕、 実施例 3で合成された式 ( ί a )の本発明ペプチ ド〔HdU- 31)-NH2〕及び実施例 4 で合成された式（ Π ) の本発明ぺプチ ド〔V'IP ( 1- 1 ] ) - H'i (12-31)-NH2] のシ リ カゲル TLCにおける Ri値を、 上記 と同様に 2種の展開溶媒（A)及び（B)を用いて測定 した ' また、 それ らペプチ ドの比旋光度も測定 した 測定糸 果を次表に示す。
2
9
Figure imgf000031_0001
Rf 1：觸灘 (A)で展開した時の Rf値、
RfD：展開灘 (B)で展開した時の Ri値、
次に本発明の新規ペプチ ドの生理活性を下記の通 り 試験 した。
試験例
本発明ペプチ ドのィ ヌ大腿動脈血流に及ぼす影饗
S3idと Muttによ る VIP biossssy法 〔rNsturej 225， 863-864 (1970)参照〕に準じて行っ た。 体重 10kgの ビ一 ダル成犬 3頭を 18時間絶食後、 チア ミ ラール（10mg/kg) 及びネンブタ一ル（25m£/kg) にて麻酔 した。 実験中に は、 生理食塩水を静脈内に持続注入（ 2 ηιβ/分） し、 電 気加温器にて体温を 37〜38°Cに保つ た 大腿動脈を剥 離し、 その動脈の筋肉枝にへパリ ン添加生理食塩水を 満た したポ リ エチ レ ンチューブを揷入固定し ， 供試ベ プチ ドの注入路と した。 この筋肉枝の抹梢側の大腿動 脈に電磁血流計のプローブを装着 し、 該動脈中の平均 血流量を経時変化と してポリ グラ フ に記録した
供試ペプチ ド 10 gを .0 ] HCJS 25 βに溶解 した溶 液を生理食塩水で希釈して調製したぺブチ ドの注射液 を、 ぺ リ スタルテイ クポンプにて動脈内に注入 し た r 各ペプチ ドは 200p mol/kgの投与量で注入 し た r 供試 ペプチ ドは次の化合物である。
化合物 1 ： Hd(l-33)-NH2 〔本発明の式（ Ϊ じ）のぺプチ ド'〕
化合物 2 ： Hd(l-31)-NH2 〔本発明の式（ 1 a )のぺプチ ド'〕
化合物 3 ： VIP(l-28)-Hd(29-35)-NHz〔本発明の式（ΙΠ )
のペプチ ド〕
化合物 4 ： VIP(l-ll)-Hd(12-31)-NH2〔本発明の式（ Π )
のぺプチ ド〕
対照化合物 ： へ口デルミ ン
供試ペプチ ドの注入から 0.5分、 1 分、 2分、 3分 及び 4 分経過後の血流量を測定し、 .基礎血流量に比較 しての血流量増加分（m£/分） を算定 して、 その結果を 下記の表 1 及び表 2 に示す r なお、 表 1 の試験結果と 表 2 の試験結果は、 同一の方法で但し相異な る時期に 行われた試験で得られたものである 1 初発の基礎血流量に比べての大腿動脈血流 量の増加分 （ffijez分）
Figure imgf000033_0001
表 1及び表 2 の結果から、 上記の化合物 1 、 2 、 3 4 、 従って本発明の新規ペプチ ドはへ口デルミ ンに比 ベて増強された血流量増加効果とその血流量増加効果 の持続効果と をもつ こ と が分かった。
産業上の利用可能性
以上のよう に、 本発明によ り、 血管平滑筋を弛緩さ せて血流量を増加する作用を有する新たなペプチ ドが 提供された。

Claims

請 求 の 範 囲
次の一般式（ I )
H— His— i>er ASP Ala—丄 le— Phe— Thr ϋΐπ ϋΐπ— Tyr— Ser—し ys leu—し eu— Ala—し ys—し eu— Ala—し eu— Gin—し ys— fyr—し eu— Ala I ) Ser-Ile-Leu-Gly-Ser-Arg-Thr-X-NH2
(式中、 Xは結合手 -、 も し く は S e r '又は S er - Proを 示す） で表わされるペプチ ド。
次式（ Π )
H— His Ser Asp Aia_Val Phe— Thr— Asp— Asn Tyr— Thr Lys Leu—し eu— A丄 a—Lys-Leu—Ala-Leu—Gln—Lys-Tyr—Leu—Ala- ( Π ) Ser - lie - Leu - laly -; ser - Arg - Thr - ΝΗ2
で表わされるペプチ ド。
次式（ΙΠ )
H-His - Ser - Asp - Aia-Val - Phe - Thr-Asp - Asn - Tyr - Thr - Arg 一し eu_Arg—し ys_Gln— Met_Ala— Val-し ys_し ys— Tyr—し eu—Asn (ΙΠ ) Ser-Ile-Leu-Asn-¾er-Arg-Thr-Ser-Pro-Pro-Pro-NHz で表わされるペプチ ド。
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