WO1991001393A1 - Membrane biologique artificielle - Google Patents

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WO1991001393A1
WO1991001393A1 PCT/FR1990/000554 FR9000554W WO9101393A1 WO 1991001393 A1 WO1991001393 A1 WO 1991001393A1 FR 9000554 W FR9000554 W FR 9000554W WO 9101393 A1 WO9101393 A1 WO 9101393A1
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WO
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collagen
elastin
peptides
iii
compositions
Prior art date
Application number
PCT/FR1990/000554
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English (en)
Inventor
Michel Rabaud
Françoise LEFEBVRE
Original Assignee
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to DE69017453T priority patent/DE69017453T2/de
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/227—Other specific proteins or polypeptides not covered by A61L27/222, A61L27/225 or A61L27/24
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins

Definitions

  • the subject of the invention is compositions of protein materials having in particular properties of elasticity and robustness. It also targets their preparation and their biological, biochemical and pharmacological applications, in particular for the development of artificial biological membranes.
  • artificial biological membrane covers, in its most general sense, membranes obtained from products of biological origin and used in very diverse fields, such as surgery, medicine, pharmacy but also chemical, textile or paper industry.
  • the properties required for these applications are essentially properties of elasticity, good mechanical strength, chemical resistance and compatibility with various media.
  • the search for materials more specially adapted for grafting on small caliber vessels has led the inventor of the present application to study the behavior of different biological products vis-à-vis a frame of polymeric material serving as a support.
  • the work carried out has shown that by reacting elastin or elastin derivatives, under certain conditions, with another protein of the connective tissue, a protein material is obtained which strongly adheres to the support material used, having the properties of proteins. structural and thus satisfying, in a particularly satisfactory manner, the requirements for biological membranes.
  • the object of the invention is therefore to provide new compositions of proteinaceous materials endowed with important properties of elasticity, robustness and, where appropriate, of adhesiveness and retaining their properties with various additives. It also aims to provide a process making it possible to easily obtain these compositions.
  • Another object of the invention is to provide biological membranes useful more especially as artificial connective tissues and as support materials for cell cultures.
  • compositions of protein materials of the invention are essentially as obtained by reaction of a concentrated aqueous solution of collagen type I and / or III and elastin or elastin peptides of molecular weight (PM) greater than about 10,000, soluble in water, as obtained by solubilization of elastin.
  • PM molecular weight
  • Such a composition has qualities of elasticity and mechanical strength allowing it to be compared to structural proteins. It also has high adhesive properties particularly valuable for use in the biological applications envisaged.
  • a preferred protein material composition is essentially as obtained by reaction of elastin and collagen type I and type III.
  • the proportion of type III collagen relative to that of type I collagen is advantageously greater than 50% by weight, in particular at least 70% by weight (dry weight). It will be noted that the type III collagen as marketed contains such quantities of type I collagen.
  • L 1 elastin is an elastin of human or animal origin, native or mature, or, where appropriate, their derivatives. It is generally elastin extracted from animal tissues, in particular from the nuchal ligament of beef, or aorta of pigs, bovids or humans.
  • composition of the invention is essentially as obtained by reaction of solubilized peptides of elastin and type III collagen.
  • the collagen used in these compositions is collagen extracted from human placenta.
  • compositions unlike elastin, do not react with the fibrin monomers.
  • the elastin or PSE / collagen ratio (w / w, relative to the dry weight) is approximately 10 to 1, preferably of the order of 2.5.
  • the compositions of the invention include a composite material in which the EPS and collagen are attached to a bone substitute material.
  • the substitute material for 1 • bone is advantageously chosen from biocompatible materials and with osteoconduction (i.e. capable of being recolonized by organic or living structures capable of making bone, thanks to their surface properties and porosity) and osteinduction (it that is to say capable of creating an environment favorable to the initiation of osteogenesis).
  • Such materials are in particular based on Ca ++ , tricalcium phosphate or apatites.
  • a particularly suitable material consists of
  • the invention thus relates to compositions as obtained by reaction of hydroxyapatite with EPS and collagen type I and / or III.
  • the collagen concentration of the aqueous solution is approximately at least 3 mg / ml, in particular of the order of 3 to 10 mg / ml.
  • the contacting step is carried out under physiological conditions, namely at approximately 37 ° C., at a pH of the order of 7 to 7.5.
  • Elastin or EPS are respectively suspended or dissolved in a pH buffer of 7 to 7.5 approximately, preferably of pH 7.4, the constituent elements of which promote or at least do not inhibit the desired reaction.
  • Buffers containing, for example, cations, Na + , Ca ** and / or Mg **, P0 4 and / or Cl " anions appear advantageous in this regard.
  • a particularly suitable buffer which contains all of the above ions, is constituted by the PB buffer which corresponds to the following molar composition: imM PO 4 , 150mM NaCl, 2mM Ca * * , ImM Mg.
  • Gels particularly resistant to crushing under the finger are obtained from elastin or PS buffer and collagen used in a ratio of about 2.5. this ratio can be modified according to the application of the composition.
  • Elastin is generally obtained from animal tissue by dissolving and eliminating the accompanying proteins.
  • tissue preferably the nuchal ligament of beef or the aorta of pig or bovid.
  • the elastin peptides result for example from the hydrolysis of elastin by alkaline treatment in particular with 1 M potassium hydroxide, acid treatment, for example with oxalic acid or enzymatic treatment with elastase.
  • Collagen comes especially from the human placenta.
  • additives are successively added to the EPSs, making it possible to improve the qualities of the gel and to confer properties useful in the applications envisaged, followed by collagen.
  • advantageous additives used alone or in combination mention will be made of fibronectin and laminin, which promote the cohesive qualities of the gel, type IV collagen which improves the adhesive qualities, growth hormones, nutrients, vitamins, proteoglycans such as heparan and dermatan sulfate, enzymes, antiseptics, catalysts or redox agents.
  • fibronectin and laminin which promote the cohesive qualities of the gel
  • type IV collagen which improves the adhesive qualities
  • growth hormones such as heparan and dermatan sulfate
  • enzymes such as heparan and dermatan sulfate
  • antiseptics such as heparan and dermatan sulfate
  • catalysts or redox agents retain the structure of the protein materials of the invention.
  • the mixture formed is then incubated at a temperature of about 37 ⁇ C until the gel forms.
  • a satisfactory dispersion of the various elements of the mixture is ensured by a mixer, for example of the VORTEX * type.
  • the reaction is carried out in an appropriate mold, taking advantage of the modular nature of the compositions of the invention. It is thus possible to obtain the composition which will be used as a biomaterial in the form of tubes, filaments or strips.
  • composition is removed from the mold and, if necessary, dried to remove the excess water.
  • the product is rehydrated by contacting with sterile physiological water before use.
  • the bone substitute material is advantageously reacted with EPS and then
  • compositions of the invention have remarkable properties of elasticity, robustness as well as great tightness, properties of biocompatibility, and where appropriate of adhesiveness.
  • the invention therefore also relates to membranes 15 characterized in that they comprise a composition of protein materials as defined above.
  • These membranes are of particular interest as artificial connective tissues.
  • the membranes of the invention can be used in particular as sealing, supporting and reinforcing parts. They can be temporary support pieces to initiate and then guide the tissue repair process.
  • these membranes adhere strongly to the support materials 35 8 polymers usually used as wefts in the preparation of biomaterials.
  • these membranes do not induce a coagulation phenomenon being devoid of fibrin and not binding to fibrin.
  • the membranes of the invention can be used in all fields of surgery, in particular digestive, vascular, urinary, genital and obstetric, maxilo-facial and plastic, dermatological, fetal and neonatal as well as veterinary.
  • the membranes of the invention also constitute particularly useful support materials for cell cultures.
  • Various cell cultures can be developed, operating under the usual conditions, using these supports. Mention will in particular be made of cultures of smooth muscle cells, fibroblasts, keratinocytes, epithelial cells and endothelial cells. The yields obtained are high.
  • the membranes produced from the composite materials mentioned above more particularly those containing hydroxyapatite with EPS and collagen, can be used as osteoblast culture supports.
  • the membranes based on composite materials are in the form of gels.
  • the centrifugation pellets can be used in biochemical studies.
  • the invention also relates to kits containing the elements necessary for carrying out tissue repair or cell culture.
  • FIGS. 1a and 1b photos taken with a scanning electron microscope, at different magnifications, of protein materials of the invention
  • FIG. 2 the variation of the quantity in mg of dry product as a function of the quantity of collagen added in mg (test with 40 mg of PSE), and - Figure 3, the radioactivity, in cpm / mg of the washed centrifugation pellet, corresponding to a composition of the invention, depending on the amount of collagen added, and the reaction time.
  • the elastin used in these examples is elastin marketed by SIGMA from beef nuchal ligament.
  • Collagen type I + III or collagen type III and fibronectin are products marketed by Institut Mérieux, obtained from human placenta. Collagen type I + III contains 73% type
  • EXAMPLE 1 PREPARATION OF ELASTINE-COLLAGEN GEL To a suspension of crushed and sieved elastin of 40 mg in 1 ml of PB buffer of pH 7.4 (ImM P0 4 , 150mM NaCl, 2mM Ca **, ImM Mg **) , 1 ml of collagen gel type I + III is added, either at 3 mg / ml or at 6 mg / ml. Homogenized with VORTEX R for 5 sec, the mixture is then poured into a mold at 37 ⁇ C without stirring for 15 min., 1, 2, 12 hours. The product is recovered, washed and dried.
  • the incubation is carried out in a container and then the product formed is separated by centrifugation (10 min /
  • the recovered product is in the form of a single homogeneous phase.
  • elastin 1 g is used. After grinding and sieving, the elastin is suspended in 50 ml of tert-butyl alcohol. 50 ml of 1M potassium hydroxide are added in water, with sufficient stirring to maintain an emulsion. At 25 ° C., a complete dissolution of the elastin is obtained after 48 hours.
  • the preparation is frozen at -40 ° C. and lyophilized for storage. The yield is 65 to 85%.
  • STUDY OF THE STABILITY OF THE GEL OBTAINED 50 mg of peptides resulting from the solubilization of elastin (labeled with iodine 125 ) are solubilized in 2 ml of PB. 2 ml of collagen III solution in water (10 mg / ml) are added. Homogenize with VORTEX R (5 sec). Place in a water bath at 37 ° C for 5 hours. Centrifuge 10 min. at 6.000t / min. The pellet is washed with 5 ml of water for 15 min., Then with 5 ml of water for 1 hour, then with 5 ml of water overnight. After each washing, the radioactivity of the pellet is measured.
  • the product is then left for 7 days and another series of washing with water is carried out.
  • the washed product is placed in water. 25 ⁇ C for 18 days without changing its appearance.
  • the product is air dried (25-29 ⁇ C) for two days.
  • Centrifugation 10 min at 5000 rpm, after one hour, allows the separation of the gels: from 5 to 20 mg PSE, they are soft; from 30 to 100 mg EPS, much firmer. The most resistant to crushing under the fingers are the gels obtained with 30 and 40 mg of PSE. The gels were brought to dryness, to air, and weighed. There is a certain proportionality of the weight obtained as a function of the weight of EPS.
  • 2nd experiment The procedure is carried out as indicated above, using doses of 10, 20, 30, 40, 60 and 80 mg of PSE in 1 ml of PB, pH 7.4 and 1 ml of collagen I + III.
  • a solution of PSE-I 125 is prepared at 5 mg / ml and at
  • the curve with the symbols corresponds to a duration of experience of 1 hour, that with the symbols O, to a duration of 2 hours and that with the symbols A, to a duration of 4 hours.
  • Example 3 PREPARATION OF GELS COMPRISING IBRONECTIN, LAMININ AND TYPE IV COLLAGEN Labeled fibronectin is used in solution in a 0.1 M P0 4 buffer, 0.15 NaCl pH 7.2, at 1.2 mg / ml and 8.10 6 cmp / mg.
  • 35 PSEs are prepared at 10 mg / ml PB 7.4. To 1 ml of this solution, 10, 20, 50, 100 and 200 ⁇ l of the fibronectin-I 125 solution are added. Incubate for 30 min at 37 ° C. and add 0.4 ml of collagen I + III and the qs of PB 7.4 for 2 ml of final volume. Homogenize with VORTEX R (5 sec.) And store without stirring for 4 hours at 37 ° C. Centrifugation at 5500 rpm. for 40 min. used to separate pellets and supernatants. It is noted that the addition of fibronectin accelerates the formation of the gel: it is formed instantly for 200 ⁇ l of fibronectin.
  • PSEs are prepared at 10 mg / ml in PB 7.4. To 1 ml of this solution, 10, 20, 50, 100 and 200 ⁇ l of the laminin or collagen IV solution are added. Incubate 15 min. at 37 * C. Qs is added for 2 ml (final volume) of PB 7.4 and 0.4 ml of collagen I + III. Homogenized with VORTEX "(5 sec) and kept without stirring for 4 hours at 37 ⁇ C. Centrifugation at 5500 rpm for 40 min makes it possible to separate pellets and supernatants. It is found that the resulting gel is all the more compact as the amount of laminin or collagen IV, is high, repeated or long washes do not release the radioactivity linked to the pellets, which demonstrates the important affinity with these 2 proteins. 15
  • a Dacron * prosthesis sample (cylinder 1 cm long, 0.6 cm in diameter) is incubated in PB buffer pH 7.4 for 4 hours.
  • the gel is prepared: PSE-collagen by operating as follows: To 1 ml of PSE-I 125 (10 mg / ml), 0.6 ml of TPS of pH 7.4 and 0.4 is added ml of type III collagen (10 mg / ml), taking care to homogenize between each addition. We give up 4 hours at 37'C. Then, centrifugation 10 min. at 5000 rpm. and the pellet is washed twice with 2 ml of deionized water (pH 6). For the length of prosthesis used, twice this amount of gel is used.
  • the gel is then applied with a spatula inside the Dacron R material , stretching it, then allowed to air dry for about 14 hours. A slightly less flexible prosthesis is obtained, but which has retained radioactive material.
  • This prosthesis is then washed with water (2 ml) without too sudden stirring for 5 hours, the water being renewed after each measurement.
  • the prosthesis is immersed in a beaker containing 100 ml of water with fairly strong magnetic stirring. During all these washes, the radioactivity remaining on the prosthesis is evaluated until the 23rd hour.
  • hydroxyapatite hereinafter hA
  • PSE-I 125 hydroxyapatite
  • the resulting product is a composite material of the hA-PSE-collagen type, in the form of a gel around hA, which remains firmly fixed after several washes.
  • PSE is advantageously used at a rate of 20 mg / ml.
  • the association sites offered by hA are saturated with 2 x 1 ml after 15 min. incubation at 37 ° C.
  • the reaction of hA-PSE with collagen is carried out for example with 40 mg of hA-PSE, 1.2 ml of buffer at pH 7.4 and 0.8 ml (8 mg) of collagen I + III.

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Abstract

Les matériaux protéiques de l'invention sont essentiellement tels qu'obtenus par réaction d'une solution aqueuse concentrée de collagène de type I et/ou III et d'élastine ou de peptides d'élastine de poids moléculaire (PM) supérieur à environ 10.000, solubles dans l'eau, tels qu'obtenus par solubilisation de l'élastine.

Description

MEMBRANE BIOLOGIQUE ARTIFICIELLE L'invention a pour objet des compositions d matériaux protéiques possédant notamment des propriété d'élasticité et de robustesse. Elle vise également leu préparation et leurs applications biologiques, biochimiques et pharmacologiques, en particulier pou l'élaboration de membranes biologiques artificielles.
L'expression "membrane biologique artificielle" recouvre, dans son acception la plus générale, des membranes obtenues à partir de produits d'origine biologique et utilisées dans des domaines très divers, tels que la chirurgie, la médecine, la pharmacie mais aussi l'industrie chimique, textile ou du papier. Les propriétés requises pour ces applications sont esentiellement des propriétés d'élasticité, de bonne tenue mécanique, de résistance chimique et de compatibilité avec des milieux divers.
Comme constituant de telles membranes, on a déjà proposé d'utiliser de 1'elastine en mettant à profit ses propriétés d'élasticité et son caractère à la fois hydrophile et hydrophobe.
Ainsi, dans la demande FR n"8503057 du 01.03.85 au nom de l'INSERM, on a rapporté un produit à base d'élastine et de fibrine soluble (à savoir de monomères de fibrine) particulièrement approprié pour l'élaboration de biomatériaux et matériaux supports, tels que tissus artificiels ou supports de cultures cellulaires.
La recherche de matériaux plus spécialement adaptés pour effectuer des greffes sur des vaisseaux de petit calibre a conduit 1'inventeur de la présente demande à étudier le comportement de différents produits biologiques vis-à-vis d'une trame de matériau polymère servant de support. Les travaux effectués ont montré qu'en faisant réagir de l'elastine ou des dérivés d'élastine, dans certaines conditions, avec une autre protéine du tissu conjonctif, on obtient un matériau proteique adhérant fortement au matériau support utilisé, possédant les propriétés de protéines structurelles et répondant ainsi, de manière particulièrement satisfaisante, aux exigences requises envers les membranes biologiques. L'invention a donc pour but de fournir de nouvelles compositions de matériaux protéiques dotées de propriétés importantes d'élasticité, de robustesse et, le cas échéant, d'adhésivité et conservant leurs propriétés avec divers additifs. Elle vise également à fournir un procédé permettant d'obtenir aisément ces compositions.
L'invention a également pour but de fournir des membranes biologiques utiles plus spécialement en tant que tissus conjonctifs artificiels et comme matériaux supports pour des cultures cellulaires.
Les compositions de matériaux protéiques de l'invention sont essentiellement telles qu'obtenues par réaction d'une solution aqueuse concentrée de collagène de typé I et/ou III et d'élastine ou de peptides d'élastine de poids moléculaire (PM) supérieur à environ 10.000, solubles dans l'eau, tels qu'obtenus par solubilisation de l'elastine.
Dans la suite de la description, ces peptides d'élastine dont il est question ci-desus seront appelés "peptides solubilisés d'élastine" et désignés par 1'abbréviation PSE.
Une telle composition présente des qualités d'élasticité et de tenue mécanique permettant de la comparer aux protéines structurelles. Elle possède également des propriétés d'adhésivité élevées particulièrement précieuses pour l'utilisation dans les applications biologiques envisagées.
Une composition de matériau proteique préférée est essentiellement telle qu'obtenue par réaction d'élastine et de collagène de type I et de type III. La proportion de collagène de type III par rapport à celle de collagène de type I est avantageusement supérieure à 50% en poids, en particulier d'au moins 70% en poids (poids sec). On notera que le collagène de type III tel que commercialisé, renferme de telles quantités de collagène de type I.
L1elastine est une elastine d'origine humaine ou animale, native ou mature, ou le cas échéant, leurs dérivés. Il s'agit généralement d'élastine extraite de tissus animaux, en particulier de ligament nucal de boeuf, ou d'aorte de porc, de bovidé ou humaine.
Une autre composition préférée de 1'invention est essentiellement telle qu'obtenue par réaction de peptides solubilisés d'élastine et de collagène de type III.
Le collagène utilisé dans ces compositions, selon une disposition de l'invention, est du collagène extrait de placenta humain.
Ces compositions, contrairement à l'elastine, ne donnent pas de réaction avec les monomères de fibrine.
Dans une disposition préférée de l'invention, le rapport elastine ou PSE/collagène (p/p, par rapport au poids sec) est de 10 à 1 environ, de préférence de l'ordre de 2,5. En variante, les compositions de l'invention comprennent un matériau composite dans lequel les PSE et le collagène sont fixés à un matériau de substitution de l'os.
Le matériau de substitution de 1•os est avantageusement choisi parmi les matériaux biocompatibles et dotés de propriétés d'osteoconduction (c'est-à-dire capables d'être recolonisés par les structures organiques ou vivantes susceptibles de fabriquer l'os, grâce à leurs propriétés de surface et leur porosité) et d'ostéinduction (c'est-à-dire capables de créer un environnement favorable au déclenchement de l'ostéogénèse) .
De tels matériaux sont notamment à base de Ca++, de phosphate tricalcique ou d'apatites. Un matériau particulièrement approprié est constitué par
1'hydroxyapatite.
L'invention vise ainsi des compositions telles qu'obtenues par réaction d'hydroxyapatite avec des PSE et du collagène de type I et/ou III.
Le procédé de préparation des compositions de matériaux protéiques définies ci-dessus est caractérisé en ce qu'il comprend:
- la mise en contact, avec une solution aqueuse concentrée de collagène de type I et/ou III, dans des conditions permettant la formation d'un gel, d'élastine ou de peptides d'élastine de PM au moins égal à environ
10.000, ces peptides étant solubles dans un mélange 50-50 d'alcool tertiobutylique-potasse 1M dans de l'eau, - la récupération du gel formé et son traitement ultérieur, si souhaité.
La concentration en collagène de la solution aqueuse est d'environ au moins 3 mg/ml, notamment de l'ordre de 3 à 10 mg/ml. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'étape de mise en contact est réalisée dans des conditions physiologiques, à savoir à 37*C environ, à un pH de l'ordre de 7 à 7,5.
L'elastine ou les PSE sont respectivement en suspension ou dissous dans un tampon de pH de 7 à 7,5 environ, de préférence de pH 7,4, dont les élément constitutifs favorisent ou tout au moins n'inhibent pa la réaction recherchée. Des tampons renfermant pa exemple, des cations, Na+, Ca** et/ou Mg**, des anions P04 et/ou Cl" apparaissent avantageux à cet égard.
Un tampon particulièrement approprié, qui renferm l'ensemble des ions ci-dessus, est constitué par l tampon PB qui répond à la composition molaire suivante : imM P04, 150mM NaCl, 2mM Ca**, ImM Mg .
Des gels particulièrement résistants à l'écrasemen sous le doigt sont obtenus à partir d'élastine ou de PS de tampon et de collagène utilisés dans un rappor d'environ 2,5. ce rapport peut être modifié selon l'application d la composition.
L'elastine est généralement obtenue à partir de tissus animaux par dissolution et élimination des protéines d'accompagnement. Comme tissus, on utilise de préférence le ligament nucal de boeuf ou l'aorte de porc ou de bovidé.
Les peptides d'élastine résultent par exemple de l'hydrolyse de l'elastine par traitement alcalin notamment avec de la potasse 1 M, traitement acide, par exemple avec de l'acide oxalique ou traitement enzymatique avec de l'élastase.
Le collagène provient plus spécialement de placenta humain.
Pour disposer de membranes utilisables dans les applications envisagées ci-après, on ajoute successivement aux PSE des additifs permettant d'améliorer les qualités du gel et de lui conférer des propriétés utiles dans les applications envisagées, puis le collagène. Parmi les additifs avantageux utilisés seuls ou en combinaison, on citera la fibronectine et la laminine, qui favorisent les qualités cohésives du gel, le collagène de type IV qui améliore les qualités adhésives, des hormones de croissance, des éléments nutritifs, des vitamines, des protéoglycanes tels que l'héparane et le dermatane-sulfate, des enzymes, des antiseptiques, des catalyseurs ou des oxydo-réducteurs. Ces additifs conservent la structure des matériaux protéiques de l'invention.
De nombreux autres additifs, agents thérapeutiques, antibactériens, sont utilisables et seront aisément choisis par l'homme de l'art en fonction des propriétés recherchées, et mis en oeuvre selon les doses appropriées compte tenu des applications envisagées.
Le mélange formé est ensuite incubé à une température de l'ordre de 37βC jusqu'à la formation du gel. Une dispersion satisfaisante des différents éléments du mélange est assurée par une mélangeur par exemple de type VORTEX*.
Lorsqu'on souhaite imprimer une forme et une dimension donnée à la composition, on réalise la réaction dans un moule approprié, en mettant à profit le caractère modulable des compositions de l'invention. Il est ainsi possible d'obtenir la composition qui sera utilisée comme biomatériau sous forme de tubulures, filaments ou de bandes.
La composition est démoulée et, le cas échéant, séchée pour éliminer l'excès d'eau.
La conservation est effectuée à l'état humide en présence d'un antiseptique ou à l'état lyophylisé. Dans ce cas, le produit est rehydraté par mise en contact avec de l'eau physiologique stérile avant utilisation. Pour l'élaboration de compositions formées de matériaux composites, on fait avantageusement réagir le matériau de substitution de l'os avec des PSE et ensuite
5 avec du collagène. Les conditions de température et de pH sont en particulier telles qu'indiquées ci-dessus.
Comme déjà rapporté, les compositions de l'invention présentent de remarquables propriétés d'élasticité, de robustesse ainsi qu'une grande étanchéité, des propriétés 10 de biocompatibilité, et le cas échéant d'adhésivité.
Ces propriétés sont particulièrement avantageuses pour l'élaboration de membranes biologiques artificielles.
L'invention vise donc également des membranes 15 caractérisées en ce qu'elles comprennent une composition de matériaux protéiques telle que définie ci-dessus.
Ces membranes présentent un intérêt tout particulier en tant que tissus conjonctifs artificiels.
Par leur constitution, elles sont très proches de la 20 lamina densa des membranes basales, et plus spécialement, lorsqu'elles renferment du collagène type III, du sous- endothélium artériel.
Les membranes de l'invention sont utilisables notamment comme pièces d'obturation, de soutien et de 25 renforcement. lles peuvent constituer des pièces de soutien temporaire permettant d'initier puis de guider le processus de réparation tissulaire.
Elles sont appliquées à l'aide de colles 30 biocompatibles ou fixées par sutures. En variante, leurs propriétés d'adhésivité élevée permet leur fixation à l'endroit souhaité sans recours à d'autres moyens.
Selon un aspect de grand intérêt de l'invention, ces membranes adhèrent fortement aux matériaux supports 35 8 polymères habituellement utilisés comme trames dans la préparation de biomatériaux.
On constate en outre qu'elles favorisent la cicatrisation.
On notera que, de manière avantageuse, ces membranes n'induisent pas de phénomène de coagulation étant dépourvues de fibrine et ne se fixant pas à la fibrine.
Dans le traitement des brûlés, elles permettent de compenser certaines pertes de tissus.
Elles présentent aussi un grand intérêt pour fabriquer des vaisseaux artificiels de faible calibre.
D'une manière générale, les membranes de l'invention sont utilisables dans tous les domaines de la chirurgie notamment digestive, vasculaire, urinaire, génitale et obstétricale, maxilo-faciale et plastique, dermatologique, foetale et néonatale ainsi que vétérinaire.
Le choix d'un ou plusieurs additifs particuliers permet de disposer aisément des membranes appropriées pour une application donnée.
Ainsi, en considérant comme additifs par exemple les protéoglycanes, il est possible de préparer des membranes utilisables comme sous-endothélium artériel en utilisant de l'heparane sulfate, ou encore des membranes substituts de cartilage avec des chondroîtines sulfates. De même, pour reconstituer un interface épiderme-derme, il est spécialement avantageux d'ajouter aux compositions de l'invention le ératane-sulfate. L'invention fournit ainsi à l'homme de l'art les moyens de réaliser une membrane adaptée à ses besoins.
Les membranes de l'invention constituent également des matériaux supports particulièrement utiles pour les cultures cellulaires. Des cultures cellulaires variées peuvent être développées, en opérant dans les conditions habituelles, à l'aide de ces supports. On citera notamment les cultures de cellules musculaires lisses, de fibroblastes, de kératinocytes, de cellules épithéliales et de cellules endothéliales. Les rendements obtenus sont élevés.
Ces membranes jouent également le rôle de socle dermique lorsqu'on ensemence des cellules épithéliales en vue de reconstituer un morceau d'epiderme. Ce dernier est ensuite transplantable sur l'organisme d'un receveur.
Les membranes élaborées à partir des matériaux composites évoqués ci-dessus, plus particulièrement ceux renfermant de l'hydroxyapatite avec des PSE et du collagène sont utilisables comme supports de culture d'ostéoblastes.
Les membranes à base de matériaux composites se présentent sous forme de gels. Les culots de centrifugation sont utilisables dans des études biochimiques.
L'invention vise également des kits renfermant les éléments nécessaires pour effectuer une réparation tissulaire ou une culture cellulaire.
On rapporte dans les exemples qui suivent, donnés à titre illustratif, d'autres caractéristiques et avantages de l'invention.
Les figures auxquelles il est fait référence dans ces exemples représentent
- les figures la et lb, des photos prises au microscope électronique à balayage, à différents grossissements, de matériaux protéiques de l'invention,
- la figure 2, la variation de la quantité en mg de produit sec en fonction de la quantité de collagène ajoutée en mg (essai avec 40 mg de PSE) , et - la figure 3, la radioactivité, en cpm/mg du culot de centrifugation lavé, correspondant à une composition de l'invention, en fonction de la quantité de collagène ajoutée, et du temps de réaction.
L'elastine utilisée dans ces exemples est de 1'elastine commercialisée par SIGMA provenant de ligament nucal de boeuf.
Le collagène de type I + III ou le collagène de type III et la fibronectine sont des produits commercialisés par l'Institut Mérieux, obtenus à partir de placenta humain. Le collagène de type I + III renferme 73% de type
III et 27% de type I.
EXEMPLE 1 : PREPARATION DE GEL ELASTINE-COLLAGENE A une suspension d'élastine broyée et tamisée de 40 mg dans 1 ml de tampon PB de pH 7,4 (ImM P04, 150mM NaCl, 2mM Ca**, ImM Mg**) , on ajoute 1 ml de gel de collagène type I + III, soit à 3 mg/ml, soit à 6 mg/ml. On homogénéise au VORTEXR pendant 5 sec, on verse ensuite le mélange dans un moule à 37βC sans agiter pendant 15 min., 1, 2, 12 heures. On récupère le produit, on le lave et on le sèche.
En variante, au lieu de verser le mélange dans un moule, on effectue l'incubation dans un récipient puis on sépare le produit formé par centrifugation (10 min/
3000t/mn) Le produit récupéré se présente sous forme d'une seule phase homogène.
Une étude des structures a été entreprise à 1'aide de la microscopie électronique à balayage. Cette technique permet d'observer - en analyse immédiate - une association très étroite entre l'elastine et le collagène (voir figure la (grossissement de 5600) et figure lb (grossissement 33600)).
EXEMPLE 2 : PREPARATION DE GEL PEPTIDES SOLUBILISES D *ELASTINE-COLLAGENE 11
* PREPARATION DES PEPTIDES SOLUBLISES D'ELASTINE
On utilise 1 g d'élastine. Après broyage et tamisage, l'elastine est mise en suspension dans 50 ml d'alcool tertiobutylique. On ajoute 50 ml de potasse 1M dans l'eau, sous agitation suffisante pour maintenir une émulsion. A 25*C, on obtient une dissolution complète de l'elastine au bout de 48 heures.
On ajoute alors 50 ml d'eau et on neutralise à pH 7 par addition d'acide acétique.
Par dialyse durant environ 14 heures contre l'eau courante, on élimine l'alcool tertiobutylique, les sels et les peptides de poids moléculaire inférieur ou égal à 10.000 environ. On effectue ensuite une dialyse contre 1'eau permutée (2 bains de deux heures environ) .
La préparation est congelée à -40*c et lyophylisée aux fins de conservation. Le rendement est de 65 à 85%. ETUDE DE LA STABILITE DU GEL OBTENU 50 mg de peptides issus de la solubilisation de l'elastine (marqués avec de l'iode125) sont solubilisés dans 2 ml de PB. On ajoute 2 ml de solution de collagène III dans l'eau (10 mg/ml). On homogénéise au VORTEXR (5 sec). On place au bain-marie à 37*C pendant 5 heures. On centrifuge 10 min. à 6.000t/min. Le culot est lavé par 5 ml d'eau pendant 15 min., ensuite par 5 ml d'eau pendant 1 heure, puis par 5 ml d'eau jusqu'au lendemain. Après chaque lavage, on mesure la radio-activité du culot.
Le produit est alors abandonné 7 jours et une autre série de lavage à l'eau est effectuée. Le produit lavé est placé dans l'eau . 25βC pendant 18 jours sans changer d'aspect. Après centrifugation, le produit est séché à l'air (25-29βC) durant deux jours.
On obtient un matériau compact - alors qu'au cours des lavages, il avait été assez dilacéré pour des raisons 12 d'efficacité de l'opération - et très résistant. ce moment-là, repris dans l'eau, il fournit une matrice plus plastique qui, en présence d'acide acétique 1/2 (pH ≈ 1) , n'est pas solubilisée mais donne à terme un gel assez semblable au premier. * REACTION AVEC LE COLLAGENE DES PSE
1ère expérimentation : avec PSE, non marqués à l'iode125, on met en contact puis homogénéise (5 sec, VORTEXR) , des doses croissantes de PSE - de 0, 5, 10, 20,
30, 40, 60 et 100 mg dans 1 ml PB 7,4 à 37'C - avec 1 ml du gel de collagène I + III à 3mg/ml.
On observe que les gels se forment d'autant plus rapidement et se présentent sous une forme d'autant plus compacte que la quantité de PSE est élevée.
La centrifugation, 10 min à 5000 t/min, au bout d'une heure, permet la séparation des gels : de 5 à 20 mg PSE, ils sont mous ; de 30 à 100 mg PSE, beaucoup plus fermes. Les plus résistants à l'écrasement sous les doigts sont les gels obtenus avec 30 et 40 mg de PSE. Les gels ont été amenés à sec, à l'air, et pesés. On observe une certaine proportionalité du poids obtenu en fonction du poids de PSE.
2ème expérimentation : On opère comme indiqué ci- dessus, en utilisant des doses de 10, 20, 30, 40, 60 et 80 mg de PSE dans 1 ml de PB, pH 7,4 et 1 ml de collagène I + III.
Avec 40 mg de PSE, on utilise 1, 2 et 3 ml de solution de collagène. 3ème expérimentation : On opère comme indiqué ci- dessus mais avec une quantité fixe de PSE (40 mg/ml) et des doses croissantes de collagène I + III à 10 mg/ml, soit 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 et 20 mg.
Le gel se prend en masse rapidement à partir de 6 mg, les tubes à 14 et 20 mg sont beaucoup plus opaques. 13
Pour les décanter, on ajoute H20/EtOH avant la centrifugation. Tous les gels obtenus sont lavés, et mis à sécher sur papier filtre. On observe une assez bonne 5 proportionalité entre la quantité de produit obtenu après séchage du gel et la quantité de collagène (voir figure 2).
4ème expérimentation : Pour étudier des gels PSE- collagène, on utilise des PSE marqués à l'iode 125 et on 10 détermine les événements produits par la mesure de la radio-activité retenue sur le précipité.
Une solution de PSE-I125 est préparée à 5 mg/ml et à
4.600 cpm/mg à laquelle on ajoute les doses croissantes de collagène : 0.5, 1, 2, 4 et 6 mg précédé de la
15 quantité suffisante de tampon PB 7,4, pour 2 ml volume final. Le gel se forme bien.
On centrifuge 30 à 40 min. à 5500 t/min. puis on mesure la radio-activité du surnageant, du culot brut, puis du culot lavé 2 fois avec H20. 20 Cette expérience est réalisée sur des temps variables : 1, 2 et 4 heures.
Les résultats obtenus sont rapportés sur la figure 3 qui donne la mesure de la radio-activité (cpm/mg) sur le culot lavé en fonction de la quantité pondérale de 25 collagène, et ce en fonction du temps de l'expérience.
La courbe avec les symboles correspond à une durée d'expérience de 1 heure, celle avec les symboles O, à une durée de 2 heures et celle avec les symbolesA, à une durée de 4 heures. 30 EXEMPLE 3 ; PREPARATION DE GELS COMPORTANT DE LA IBRONECTINE, DE LA LAMININE ET DU COLLAGENE DE TYPE IV On utilise de la fibronectine marquée en solution dans un tampon P04 0,1 M, NaCl 0.15 pH 7,2, à 1,2 mg/ml et 8,106 cmp/mg.
35 On prépare des PSE à 10 mg/ml PB 7.4. A 1 ml de cette solution, on ajoute 10, 20, 50, 100 et 200 μl de la solution de fibronectine-I125. On incube 30 min à 37'C et ajoute 0,4 ml de collagène I + III et la qsp de PB 7,4 pour 2 ml de volume final. On homogénise au VORTEXR (5 sec.) et conserve sans agitation 4 heures à 37*C. La centrifugation à 5500 t/min. pendant 40 min. permet de séparer culots et surnageants. On constate que l'addition de fibronectine accélère la formation du gel : il se forme instantanément pour 200 μl de fibronectine. Des lavages répétés, d'abord courts et dans l'eau, puis 14 heures environ dans l'eau à 20"C, ne diminuent que de 17% en moyenne la radio-activité retenue dans le gel et portée par la fibronectine, ce qui démontre 1'importance de 1'affinité de la fibronectine vis-à-vis des constituants du gel.
On utilise de la laminine (Sigma) et du collagène de type IV (Mérieux) marqués en solution dans le tampon P04 0,1 M utilisé dans l'essai avec la fibronectine - laminine 500.000 cp /ml, collagène IV 850.000 cpm/mg.
On prépare des PSE à 10 mg/ml dans PB 7,4. A 1 ml de cette solution, on ajoute 10, 20, 50, 100 et 200 μl de la solution de laminine ou de collagène IV. On incube 15 min. à 37*C. On ajoute qsp pour 2 ml (volume final) de PB 7,4 et 0,4 ml de collagène I + III. On homogénéise au VORTEX" (5 sec) et conserve sans agitation 4 heures à 37βC. La centrifugation à 5500 t/min. pendant 40 min. permet de séparer culots et surnageants. On constate que le gel résultant est d'autant plus compact que la quantité de laminine ou de collagène IV, est élevée. Des lavages répétés ou longs, ne libèrent pas la radio-activité liée aux culots, ce qui démontre l'affinité importante avec ces 2 protéines. 15
EXEMPLE 6 ; ETUDE DES PROPRIETES D'ADHESIVITE DE GEL PSE-COLLAGENE SUR DU DACRONR
Un échantillon de prothèse en Dacron* (cylindre de 1 cm de longueur, 0,6 cm de diamètre) est mis à incuber dans du tampon PB de pH 7,4 pendant 4 heures. Dans le même temps, on prépare le gel : PSE-collagène en opérant comme suit : A 1 ml de PSE-I125 (10 mg/ml), on ajoute 0,6 ml de TPS de pH 7,4 et 0,4 ml de collagène type III (10 mg/ml) , en prenant bien soin d'homogénéiser entre chaque addition. On abandonne 4 heures à 37'C. Puis, on centrifuge 10 min. à 5000 t/min. et on lave 2 fois le culot par 2 ml d'eau permutée (pH 6) . Pour la longueur de prothèse utilisée, on a recours à 2 fois cette quantité de gel.
On applique alors le gel à la spatule à l'intérieur du matériel en DacronR, en l'étirant, puis on laisse sécher à l'air durant environ 14 heures. On obtient une prothèse un peu moins souple mais qui a retenu du matériel radio-actif.
Cette prothèse est alors lavée à l'eau (2 ml) sans agitation trop brusque pendant 5 heures, 1'eau étant renouvelée après chaque mesure. A la 6e heure, on plonge la prothèse dans un bêcher contenant 100 ml d'eau sous assez vive agitation magnétique. Au cours de tous ces lavages, la radio-activité restant sur la prothèse est évaluée jusqu'à la 23e heure.
Les résultats obtenus montrent que le gel PSE- collagène apparaît assez bien retenu sur le DacronR alors qu'il n'a pas été fortement fixé. Cette expérimentation confirme également, outre l'adhésivité, le caractère d'insolubilité du matériau dans l'eau.
EXEMPLE 7 t PREPARATION D'UN MATERIAU COMPOSITE A BASE D'HYDROXYAPATITE, DE PEPTIDES SOLUBILISES D'ELASTINE ET DE COLLAGENE 16
On fait réagir tout d'abord de l'hydroxyapatite (ci-après hA) avec PSE-I125 à 37'C, pH 7,4. On obtient un produit hA-PSE-I125 ayant fixé 25 à 30% de la radioactivité.
On fait ensuite réagir ce produit avec du collagène de type I + III, à 37'C et pH 7,4.
Le produit résultant est un matériau composite du type hA-PSE-collagène, se présentant sous forme d'un gel autour de hA, qui reste solidement fixé après plusieurs lavages.
On utilise avantageusement PSE à raison de 20 mg/ml. Les sites d'association offerts par hA sont saturés avec 2 x 1 ml au bout de 15 min. d'incubation à 37'C. La réaction de hA-PSE avec le collagène est réalisée par exemple avec 40 mg de hA-PSE, 1,2 ml de tampon à pH 7,4 et 0,8 ml (8 mg) de collagène I + III.

Claims

17REVENDICATIONS
1. Compositions de matériau proteique, caractérisées en ce qu'elles sont essentiellement telles qu'obtenues par réaction d'une solution aqueuse concentrée de collagène de type I et/ou III et d'élastine ou de peptides d'élastine de poids moléculaire (PM) supérieur à environ 10.000, solubles dans l'eau, tels qu'obtenus par solubilisation de l'elastine.
2. Compositions selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles sont essentiellement telles qu'obtenues par réaction de collagène de type I et de type III.
3. Compositions selon la revendication 2, caractérisées en ce que la proportion de collagène de type III est supérieure à 50% en poids, en particulier d'au moins 70% en poids, par rapport au poids sec.
4. Compositions selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles sont essentiellement telles qu'obtenues par réaction de peptides solubilisés d'élastine et de collagène de type III.
5. Compositions selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisées en ce que le rapport elastine ou peptides solubil, es d'élastine/collagène (p/p, par rapport au poids sec) est Je 10 à 1 environ, de préférence de l'ordre de 2,5.
6. Compositions selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisées en ce qu'elle sont essentiellement telles qu'obtenues par réaction en outre avec un matériau de substitution de l'os, en particulier un matériau à base de Ca*4, de phosphate tricalcique ou d'apatites, plus spécialement d'hydroxyapatite. 18
7. Procédé de préparation de compositions selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend :
5 - la mise en contact, avec une solution aqueuse concentrée de collagène de type I et/ou III, dans des conditions permettant la formation d'un gel, d'élastine ou de peptides d'élastine de PM au moins égal à environ 10.000, ces peptides étant solubles dans un mélange 50-50 10 d'alcool tertiobutylique-potasse 1M dans de l'eau, la récupération du gel formé et son traitement ultérieur, si souhaité.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'étape de mise en contact est réalisée dans des
15 conditions physiologiques, à savoir à 37*C environ, à un pH de l'ordre de 7 à 7,5.
9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce qu'on utilise un tampon de pH de 7 à 7,5 environ, de préférence de 7,4, renfermant des cations
20 Na*Ca** et/ou Mg**, des anions P04 = et/ou Cl", en particulier le tampon PB de composition ImM P04, 150mM NaCl, 2mM Ca**, ImM Mg**.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce qu'on ajoute
25 successivement aux PSE, des additifs permettant d'améliorer les qualités du gel et de lui conférer des propriétés spécifiques, puis le collagène, le ou les additifs ajoutés étant choisis, notamment, parmi la fibronectine, la laminine, le collagène IV, des agents
30 thérapeutiques et/ou antibactériens.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que pour obtenir les compositions de la revendication 6, on fait réagir le matériau de substitution de l'os avec des peptides
35 19 solubilisés d'élastine et de collagène de type I et/ou III.
12. Membranes biologiques artificielles, caractérisées en ce qu'elles sont élaborées à partir d'une composition de matériau proteique selon l'une quelco que des revendications 1 à 6.
13. Utilisation de membranes biologiques artificielles selon la revendication 12 en tant que tissus conjonctifs artificiels.
14. Utilisation de membranes biologiques artificielles selon la revendication 12, comme matériaux supports pour des cultures cellulaires.
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