WO1990010456A1 - Compositions stabilisees a base de fgf - Google Patents

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WO1990010456A1
WO1990010456A1 PCT/FR1990/000164 FR9000164W WO9010456A1 WO 1990010456 A1 WO1990010456 A1 WO 1990010456A1 FR 9000164 W FR9000164 W FR 9000164W WO 9010456 A1 WO9010456 A1 WO 9010456A1
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WO
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fgf
agent
functionalized
composition according
dextrans
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PCT/FR1990/000164
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Denis Barritault
Jacqueline Jozefonvicz
Faouzi Slaoui
Michèle TARDIEU
Jean-Pierre Caruelle
José COURTY
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Therapeutiques Substitutives
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    • A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to agents with cellular and tissue regenerative activity consisting of dextrans, to stabilized compositions containing said agents associated with fibroblast growth factors (FGFs) as well as to their in vitro applications such as storage.
  • Fibroblast growth factors have been demonstrated by numerous teams, following studies of the biological activities of growth factors, obtained from extracts from a very large number of tissues or organs (brain, pituitary gland, retina, vitreous humor, choroid, iris, cartilage, kidney, liver, placenta, corpus luteum, prostate, bone, muscle etc ).
  • the first branch was described under the names of basic FGF, basic fibroblast growth factor or type 2 affin for heparin or
  • Heparin Binding Growth Factor II (HBGF II), from brain-derived growth factor or Brain-Derived Growth Factor (BDGF), growth factor derived from the eye or Eye-Derived Growth Factor II (EDGF II), growth factor astrocyte II or AGF II, growth factor derived from cartilage (CDGF) etc. while the second branch of the FGF family has been described under the names of acid FGF or affin factor for heparin type I (HBGF I), brain derived factor or BDGF I, etc.
  • FGF fibroblast growth factors
  • AGF a growth factor
  • ECGF endothelial growth factor
  • FGF fibroblast growth factors
  • AGF astrocytes or endothelial cells
  • ECGF vascular endothelial growth factor
  • factor growth derived from the brain derived from the retina or the eyes, from cartilage, from hepatocytes in culture with the acronyms BDGF, RDGF, EDGF, CDGF, respectively.
  • HDGF heparin
  • HBGF angiogenic tumor factor
  • TNF angiogenic tumor factor
  • FGFs are capable of stimulating the proliferation and differentiation of a large number of cells originating from different tissues and species.
  • Mention may in particular be made of fibroblastic, endothelial, epithelial cells, keratinocytes, chondrocytes, yoblasts, astrocytes, etc., as well as neuronal survival.
  • FGFs have neurotrophic, angiogenic and healing properties.
  • the FGFs described above are obtained by purification; we also know from PCT International Application US86 / 01879, FGFs obtained by genetic recombination.
  • Another healing composition based on at least one FGF is described in European Patent Application 243,179 and further comprises collagen and heparin and / or a glycoaminoglycan.
  • FGF topical application
  • standard formulations such as creams, pastes, solutions, gels or associated with polymers, sponges and pumps allowing salting out.
  • slow FGFs as is described in particular in the international PCT application US86 / 01879, in which it is specified that formulations comprising recombinant FGFs and suitable excipients or transport molecules can be prepared, in particular lotions, gels, retard forms or creams, the said formulations possibly being associated with other active ingredients, such as antibiotics.
  • the delay forms described in this Application, include in particular polymers.
  • compositions obtained can in particular be used as a healing agent, in the control of coagulation, in the improvement of neurological damage and in the regeneration of hard tissues. It appears, however, that the FGF does not systematically present a stimulation of the cicatrization; in fact an absence of stimulation has been reported in particular in J. Dermatol. Sing. Oncol. ; therefore, the topical application of acidic or basic FGF must often be iterative, in order to obtain the maximum effects, although certain compositions of the prior art such as that polyvinyl alcohol sponges soaked in FGFs, applied under the skin, cause fibroblastic and myoblastic proliferation.
  • European Patent Application 267,015 has proposed a composition containing a polypeptide growth factor, more particularly EGF, and an amount of water-soluble polysaccharide sufficient to stabilize said factor. against loss of biological activity, especially in the presence of water.
  • the water-soluble polysaccharides which can be used include the derivatives of cellulose, starch, agar, alginic acid, gum arabic, dextrans, fructans, inulin, mannans, xylans, arabinans, chitosans, glycogen and glucans.
  • dextrans has highlighted new properties of functionalized substituted dextrans; said dextrans appear to have a specific cellular and tissue regenerative activity and, moreover, not only have a stabilizing action on an FGF composition but cooperate with FGF in the biological activity of the latter.
  • the Applicant has accordingly set itself the goal of providing an agent with regenerative activity cell and tissue as well as to compositions containing said agent associated with FGFs which better meet the needs of the practice than the compositions aiming at the same goal proposed in the prior art, in particular in that the compositions in accordance with The invention has a markedly improved stability, allowing easier storage and therefore a therapeutic effect superior to the compositions of the prior art and in that their frequency of application is thus markedly reduced.
  • the subject of the present invention is an agent with cellular and tissue regenerative activity, characterized in that it consists of at least one functionalized substituted dextran.
  • the functionalized substituted dextrans are chosen from the group which comprises soluble dextrans and insoluble dextrans.
  • insoluble substituted functionalised dextrans those described in particular in French patent application No. 82 01641 or in French Patent No. 2,461,724.
  • said functionalized dextrans include functions chosen from the group which is consisting of carboxymethyl, benzylamide and benzylamide sulfonate.
  • the present invention also relates to a stabilized composition, characterized in that it comprises an agent with cellular and tissue regenerative activity as defined above combined with at least one acid FGF and / or a basic FGF and / or a derivative and / or an analog and / or a fragment thereof having biological activity, which agent is capable of partially or totally restoring the biological activity of the acid and / or basic FGF factor (s) inactivated by long-term storage duration or temperature.
  • Such a composition has an activity of cellular and tissue regeneration, and in particular a healing action, increased compared to the compositions of the prior art.
  • composition according to the invention, it comprises from 0.1 to 1000 ⁇ g / ml of at least one agent with cellular and tissue regenerative activity as defined above and from 0.01 ng to 300 ⁇ g of at least one FGF chosen from the group consisting of acidic FGFs, basic FGFs, their derivatives, their analogs and their fragments having biological activity.
  • FGF chosen from the group consisting of acidic FGFs, basic FGFs, their derivatives, their analogs and their fragments having biological activity.
  • the stabilized compositions containing the agent with cellular and tissue regenerative activity alone or associated with at least one FGF can be combined with other active principles and / or with at least one pharmaceutically acceptable vehicle and / or to a physiologically acceptable support.
  • the associated active ingredients are chosen from the group which notably includes local anesthetics, antiinfectives, serum proteins and collagen. Mention may in particular be made, as local anesthetic, of lidocaine, as bacteriostatic substances. sodium salts, silver salts, their derivatives or sulfadiazines. Mention may be made, as antibiotic, of streptomycin; as serum protein, serum albumin or fibronectin may be mentioned; mention may also be made of soluble collagens and elastin.
  • said composition when the vehicle is water, said composition is also associated with buffers and / or with suitable salts, so as to maintain the mixture approximately at a pH of between 6, 8 and 7.4 and at an ionic strength of, for example, between 0.1 and 0.2 in NaCl equivalent.
  • matrix composition Such associations in accordance with the invention are hereinafter called "matrix composition”.
  • composition it is associated with liposomes.
  • compositions in accordance with the invention are hereinafter called the FGF-functionalized dextran-liposome composition and functionalized dextran-liposome composition.
  • the support is chosen from the group which notably comprises dressings and bio-materials.
  • composition according to the invention is in the form of an aerosol, when the vehicle is a suitable gas.
  • the "matrix” composition is advantageously applied directly in solution or in aerosol.
  • said composition, in particular said "matrix” composition is included in a dosage form such as ointment, cream, paste, lotion or impregnates a gel, in particular a collagen gel.
  • said composition, in particular said "matrix” composition is included and / or impregnates an appropriate support such as pan- seed or biomaterial directly or indirectly promoting cell repair (for example, a surgical suture or coral for bone grafting).
  • Said "matrix” composition can in particular be included in creams or lotions used traditionally, in particular lanolin-based creams such as “SILVEADENE”, “MARIO”, “AQUAPHOR”, “EQUALIA”, ' for applications on the skin; it can also be included or soaked in dressings such as dressings for textiles, synthetic fabrics or sponges, or natural products used to cover wounds, for example collagen gels or dermes of animal origin.
  • lanolin-based creams such as "SILVEADENE”, “MARIO”, “AQUAPHOR”, “EQUALIA”, ' for applications on the skin
  • dressings such as dressings for textiles, synthetic fabrics or sponges, or natural products used to cover wounds, for example collagen gels or dermes of animal origin.
  • Said "matrix" composition according to the invention must impregnate these different forms of dressings, so that the FGF factor and / or the substituted functionalized dextran can be in contact or diffuse, up to the target tissues.
  • composition according to the invention is in particular maintained on the site of the wound and on open wounds, so as to maintain hydration according to the techniques of a person skilled in the art, particularly developed in the field. skin grafts. -
  • the occlusive dressings can be impregnated in the same way, adsorbed or cover a natural or synthetic support.
  • the vehicle For applications on the corneas, the vehicle must be compatible with eye tolerance (for example, the product sold under the name of "LACRIBULE"), saline solutions, isotopic solutions (for example, “NEOCADRON” ( Merck-Sharp-Dohme).
  • eye tolerance for example, the product sold under the name of "LACRIBULE”
  • saline solutions for example, saline solutions
  • isotopic solutions for example, “NEOCADRON” ( Merck-Sharp-Dohme).
  • compositions may also contain preservatives such as benzyl dimethyl alkyl ammonium chlorides or ethylene diamine sodium tetraacetate (EDTA).
  • preservatives such as benzyl dimethyl alkyl ammonium chlorides or ethylene diamine sodium tetraacetate (EDTA).
  • FGF-functionalized dextran-liposome or the functionalized dextran-liposome composition is included in a galenical form such as ointment, cream, paste, lotion or impregnates a gel, in particular a collagen gel.
  • insoluble functionalized dextrans these can also be included alone or associated with FGF in supports such as creams, gelatins or collagen gels, or on synthetic or natural fibers, usual supports for dressings of recovery.
  • insoluble functional polymers can be done by addition of collagen solution and gelation.
  • the procedures described in a series of YANNAS patents can be used.
  • a composite laminar composition giving an equivalent skin in which the part in contact with the wound is covered with collagen crosslinked with a glycosaminoglycan, the mixture being obtained by addition of glycosaminoglycans with solubilized collagen, the whole being precipitated or crosslinked with glutaraldehyde (US Patent 4,418,691).
  • composition according to the invention is especially prepared by the mixture of at least one suitable FGF with at least one agent with regenerative and stabilizing activity.
  • Said FGFs are obtained by extraction and purification, from natural sources, by chemical synthesis or by appropriate genetic recombination techniques. Said FGFs are of human origin or else come from other animals, in particular from other mammals.
  • These preferred methods include a step of treating the tissue extract at a very acid pH, thus excluding any risk of viral contamination, and the use of chromatography on immobilized heparin or substituted polystyrene.
  • the two forms of FGF can thus be isolated and separated, with the other proteins or individually with a degree of purity sufficient to be rid of significant quantities of other contaminating materials.
  • the invention also comprises other provisions, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the method which is the subject of the present invention, as well as to examples. showing the effect of substituted functionalized dextrans on the protection of the biological activity of FGFs.
  • Example 1 FGF stabilization process. 1) Preparation of a functionalized substituted dextran (cell regeneration agent and tissue).
  • a mixture of 0.26 ml of HSO3CI and 2.5 ml of dichloromethane is added to the reactor and the whole is kept for 4 hours at room temperature. After filtration and washing with dichloromethane, the product is dried, dissolved in 30 ml of water and the pH is adjusted to the value 7.0. The solution is ultrafiltered against a buffer solution, then against distilled water. The solution is then lyophilized until the dry polymer is obtained.
  • Another method of preparing a functionalized substituted dextran can be used as such as that described in European Patent No. 0023 854. 2) Preparation of / FGF. - The cell extract (s) is treated overnight in the presence of acetic acid at pH 3, then the FGFs are separated by chromatography on immobilized heparin or substituted polystyrene.
  • a dextran solution is prepared from the dry polymer obtained in 1) by placing it in solution in an isotonic phosphate buffer (PBS), so as to obtain a concentration of 400 ⁇ g / ml.
  • PBS isotonic phosphate buffer
  • the FGFs extracted in 2) are placed in solution in this buffer containing the appropriate dextrans substituted, so as to obtain a concentration of FGFs of 100 ⁇ g / ml.
  • Example 2 Stabilized ointment according to the invention. FGF 10 ⁇ g
  • the cream obtained can be applied to a scarification type wound on a rat, for three days.
  • Example 3 Stabilized dressing according to the intention.
  • the support of the dressing consists of a collagen film "Pangil” from Laboratoires FOURNIER, impregnated by passive adsorption of a mixture of FGF and Dex ⁇ trane functionalized in the following proportions: FGF 10 ⁇ g
  • a wound dressing is obtained which can be used in cases various ulcers, superficial or deep wounds.
  • This dressing can be stored under vacuum and packaged. * STUDY OF THE EFFECT OF BIOSPECIFIC POLYMERS
  • a stimulation unit is defined as the dose of growth factor which, added to a milliliter of culture medium on target cells is capable of inducing an increase in the number of cells or the incorporation of corresponding tritiated thymidine. at half (50%) of the maximum value of this increase measured in the dose-response curve.
  • EXAMPLE A PROTECTIVE EFFECT OF SUBSTITUTED DEXTRAN AGAINST INACTIVATION OF ACID AND BASIC FGFs BY ACID AND ALKALINE pH.
  • the FGFs are in solution at a concentration of 100 ⁇ g per milliliter, in an isotonic phosphate buffer (PBS) containing no dextran (control) or containing dextran substituted for 400 ⁇ g / ml. 10 ⁇ l of these different solutions are taken and mixed either with 1 ml of PBS buffer, acetic acid (CH3COOH) diluted adjusted to pH 2 (approximately 1 N), or sodium hydroxide (NaOH) diluted adjusted to pH 9.0. These samples are incubated at 20 ° C for two hours and a 1 .mu.l sample is performed for the determination of biolo ⁇ gical activity.
  • PBS isotonic phosphate buffer
  • CH3COOH acetic acid
  • pH 2 approximately 1 N
  • NaOH sodium hydroxide
  • Figure 1 shows the dose-response curve for bFGF on CCL39 fibroblasts.
  • This figure contains on the abscissa the logarithm of the concentration of bFGF in pg / ml and on the ordinate the percentage of stimulation.
  • the increase in incorporation of tritiated thymidine represents the value of the number of shots per mi ⁇ nute (cpm) obtained at the plateau of the dose-response curve for bFGF alone minus the value in cpm of tritiated thymidine incorporated in the cells in the absence of FGF and determined in the same experiment.
  • Curves 3 and 4 show that bFGF in the presence of dextran retains its stimulating power both in acidic and basic medium.
  • Table I summarizes the results obtained with the acid and basic FGFs.
  • the stimulation unit is arbitrarily fixed at 1 for the aFGF or the starting bFGF, incubated for two hours at 20 ° C.
  • DF functionalized dextran: in this example, it is dextran E as defined in table III, below.
  • H.S. heparane sulfate: (BIOVALORIS company in Plouhermel (Ile-et-Villaine, FRANCE)).
  • This table shows the protective effect of DF (functionalized Dextran) against the inactivation of acid and basic FGFs induced by acid and alkaline pHs.
  • EXAMPLE B EFFECT OF FUNCTIONALIZED DEXTRANE (DF) ON THE INACTIVATION OF FGFs BY SHORT-TERM AND LONG-TERM TEMPERATURE.
  • the FGF prepared as in Example A is incubated at 4 ° C, 20 ° C, 37 ° C or 60 ° C for different times, in the absence or in the presence of 400 ⁇ g of functionalized dextran (DF ) as defined in Table III below, then dosed.
  • DF functionalized dextran
  • the initial stimulation unit is arbitrarily set to a value equal to 1.
  • EXAMPLE C EFFECT OF DIFFERENT FUNCTIONALIZED DEXTRANES ON THE DOSE-RESPONSE EFFECTS OF FGF.
  • R / us is the value of the ratio of the values of the stimulation units of aFGF without functionalized dextran divided by the stimulation unit in the presence of functionalized dextran.
  • Example D KINETIC, PLANIMETRIC AND HISTOLOGICAL STUDIES OF THE HEALING EFFECT OF THE FUNCTIONALIZED FGF / DEXTRAN ⁇ ASSOCIATION.
  • Experimental protocol The operations are carried out on male istar rats weighing 300 to 400 grams. Each experiment is carried out on a series of 5 animals.
  • Types of wounds Two types of skin wounds are made on the dorsal side of animals, previously shaved.
  • the wounds are treated with different mixtures of products in solution in sterile buffered saline (pH 7.4).
  • the products are deposited directly in liquid form on the wound.
  • FGF radiolabelled at 1 • 125 l is deposited in the presence or in the absence of functionalized dextran in a collagen buffer.
  • the variation in radioactivity in the impregnated collagen is assessed as a function of time.
  • the radioactivity is measured in the collagen gel and in samples taken from the periphery of the wound, 2 cm from the latter, using a punch equivalent to that of the original.
  • Morphological study Observation of the evolution of wounds with the naked eye makes it possible to note a very clear action of the association FGF + dextran functionalized on the speed and the quality of superficial healing (epidermis + clot lysis). 1) After 24 hours, the collagen pads impregnated by this association have fully adhered to the walls of the wound, and can only be removed by damage to the regenerated tissue. Té ⁇ minus experiments show total adhesion of collagen only after 36 to 48 hours.
  • Planimetric analysis the planimetric analysis of the external surface of the wounds shows the total absence of retraction of the regenerating tissues.
  • the rate of scar retraction is evaluated as a function of time by considering the P / A ratio where P is the perimeter of the wound and At the surface of the scar.
  • FIG. 3 has the time in days on the abscissa and the P / A ratio on the ordinate.
  • the rate of retraction is represented by l__l for the witness; by S for bFGF; by Si for the FGFs in the presence of heparan sulfate and by Q for the FGFs associated with the functionalized dextrans.
  • Table IV gives the percentage of the healing area as a function of the amount of functionalized dextran (DF) in the presence or in the absence of bFGF;
  • Table V gives the P / A ratio under the same conditions.
  • the treated regions are removed, fixed, impregnated with paraffin.
  • the histological study is carried out on 7 ⁇ m sections. The colors used allow topographic and histochemical studies. Histological analysis shows that the FGF + DF combination accelerates the traditional stages of dermoepidermal healing and increases the quality of the reconstituted tissues.
  • the impregnated collagen allows very rapid colonization (1 day) of the surrounding cell categories (fibroblasts, smooth muscles) from the surrounding healthy tissue, and in particular from the connective tissue of the underlying striated muscle floor.
  • neoangiogenesis allows the tissue in formation to be colonized by a very high density of blood capillaries.
  • FIG. 4 presents a photograph of a histological section of a control scarring (absence of treatment) four days after the realization of the wound
  • FIG. 5 presents the photograph of a histological section of a wound healing after treatment with a collagen buffer impregnated with a bFGF solution at
  • Figure 5 shows the epidermis (E) fully reconstructed while in Figure 4, it is not re ⁇ formed. A retraction of the surrounding tissue on the control wound is not recorded on the treated wound.
  • This scar space relatively anarchic in Figure 4, presents for the wound treated ( Figure 5) an organization and a satisfactory cell density. It is characterized by the presence of blood vessels translating the local angiogenic effect of the combination of the products of this invention.
  • Example E Planimetric and histological studies of the healing effect of functionalized dextrans.
  • Example D The experimental protocol, identical in all respects to that carried out in the context of Example D, is carried out to assess the healing effects of the functionalized dextrans.
  • the dextrans studied are listed in Table III of Example C.
  • the healing effects of these functionalized dextrans or of their association were assessed in relation to two control experiments in the presence of vehicle alone, of collagen buffer, or of buffer of collagen impregnated with unsubstituted dextran (product denoted A).
  • the re-epithelialization follows kinetics comparable to that observed under the action of FGFs.
  • the neoangiogenesis is clear but less sustained than that observed in the presence of FGFs.
  • the epidermal extensions are confronted around day 4, preceding by at least 24 hours the reepithelialization observed in the controls.

Abstract

Agents à activité régénératrice cellulaire et tissulaire constitués par des dextranes substitués fonctionnalisés, compositions stabilisées contenant lesdits agents associés à au moins un facteur de croissance des fibroblastes (FGFs) tels qu'un FGF acide et/ou un FGF basique et/ou un dérivé et/ou un analogue et/ou un fragment de ceux-ci présentant une activité biologique et leurs applications in vitro telles que stockage des FGFs et cultures cellulaires et in vivo comme agent thérapeutique, notamment pour la cicatrisation et la régénération tissulaire ou comme agent cosmétique.

Description

Compositions stabilisées à base de FGF. La présente invention est relative à des agents à activité régénératrice cellulaire et tissulaire constitués par des dextranes, à des compositions stabi¬ lisées contenant lesdits agents associés à des facteurs de croissance des fibroblastes (FGFs) ainsi qu'à leurs applications in vitro telles que stockage des FGFs et cultures cellulaires et in vivo comme agent thérapeu¬ tique, notamment pour la cicatrisation et la régénération tissulaire ou comme agent cosmétique.
Les facteurs de croissance des fibroblastes (FGFs) ont été mis en évidence par de nombreuses équipes, à la suite des études des activités biologiques des fac¬ teurs de croissance, obtenus à partir d'extraits d'un très grand nombre de tissus ou d'organes (cerveau, hypo¬ physe, rétine, humeur vitrée, choroïde, iris, cartilage, rein, foie, placenta, corpus luteum, prostate, os, muscle etc...)
La diversité même des tissus étudiés et des cellules stimulées par ces facteurs in vitro et in vivo, ainsi que le grand nombre d'équipes qui ont indépendam- ment contribué à la caractérisation, l'isolement et l'identification complète de ces facteurs, explique la multitude de noms et sigles donnés par ces différents au¬ teurs pour les désigner.
Il apparaît que tous ces extraits contiennent des facteurs de croissance de la famille des FGFs et que cette famille peut être divisée en deux branches princi¬ pales.
La première branche a été décrite sous les noms de FGF basique, de facteur basique de croissance des fibroblastes ou de type 2 affin pour l'héparine ou
"Heparin Binding Growth Factor II" (HBGF II) , de facteur de croissance dérivé du cerveau ou Brain-Derived Growth Factor (BDGF) , de facteur de croissance dérivé de l'oeil ou Eye-Derived Growth Factor II (EDGF II) , de facteur de croissance des astrocytes II ou AGF II, de facteur de croissance dérivé du cartilage (CDGF) etc.. alors que la deuxième branche de la famille FGF a été décrite sous les noms de FGF acide ou facteur affin pour l'héparine de type I (HBGF I), facteur dérivé du cerveau ou BDGF I, etc...
Ces facteurs ont été nommés soit selon le type de cellules cibles utilisées (facteurs de croissance des fibroblastes, astrocytes ou cellules endothéliales avec les sigles FGF, AGF, ECGF) , soit selon la source à partir de laquelle ce facteur est extrait (exemple : facteur de croissance dérivé du cerveau, dérivé de la rétine ou des yeux, du cartilage, d'hépatocytes en culture avec respectivement les sigles BDGF, RDGF, EDGF, CDGF,
HDGF...), soit encore selon une propriété biochimique ou biologique (facteurs de croissance affins pour l'héparine
(HBGF) ou facteur tumoral angiogénique (TAF) ; les deux principales branches de la famille sont nommées selon ces sigles, précédés ou suivis de acide ou basique, ou type I ou type II.
C'est en suivant l'activité biologique sur des cellules en culture que ces facteurs ont pu être purifiés. Les premières caractéristiques physicochimiques (poids moléculaire et point isoélectrique) ont été pu¬ bliées dès 1975 (GOSPODARO ICZ, J. Biol. Che . 250, 2515) pour la forme basique et en 1982 (BARRITAULT et al., J. Neurosci. 8, 477-490) pour la forme acide. La purification à homogénéité des deux formes du FGF a permis d'établir leurs structures primaires
(ESCH. et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. US, 82, 6507 pour la forme basique et GIMENEZ G. et al., 1985,
Science, 230, 1385-1388 pour la forme acide) . L'isolement des deux formes a été grandement favorisée par la mise en évidence d'une forte affinité de ces facteurs pour l'héparine et l'utilisation subséquente d'une chromâtographie d'affinité sur héparine immobilisée (SHING et al., 1984, Science, 223, 1296-1299).
Il est connu que, in vitro, les FGFs sont ca- pables de stimuler la prolifération et la différenciation d'un grand nombre de cellules provenant de tissus et d'espèces différents.
On peut citer notamment les cellules fibroblastiques, endothéliales, épithéliales, les kérati- nocytes, chondrocytes, yoblastes, astrocytes etc..., ainsi que la survie neuronale.
Il est également connu que, in vivo, les FGFs présentent des propriétés neurotrophiques, angiogéniques et cicatrisantes. On peut citer notamment le Brevet français
79 18282, qui enseigne un procédé de stimulation de la croissance des cellules épidermiques ; ce procédé montre en particulier le rôle d'un extrait aqueux de rétine partiellement purifié et contenant du FGF sur la stimula- tion desdites cellules épidermiques.
On connaît également le Brevet américain 4 477 435, qui enseigne une méthode de cicatrisation de l'épithélium cornéen à l'aide d'une composition contenant un extrait aqueux de rétine. On connaît également de nombreux travaux concernant la mise en évidence et la caractérisation des FGFs et leur rôle dans la régénération et la cicatrisa¬ tion de la peau, des vaisseaux, des nerfs, des os, des muscles etc.. tant in vitro qu'in vivo. On peut citer en particulier le Brevet améri¬ cain 4 444 760, qui décrit un facteur de croissance acide dérivé du cerveau, son procédé d'extraction et son application à la cicatrisation des plaies et la demande de Brevet européen 186 084 qui décrit une méthode de sti- mulation de la croissance des cellules endothéliales vas- culaires à l'aide d'une composition contenant le facteur de croissance acide dérivé du cerveau décrit précédem¬ ment.
Les FGFs décrits ci-dessus sont obtenus par purification ; on connaît par ailleurs, par la Demande internationale PCT US86/01879, des FGFs obtenus par recombinaison génétique.
Une autre composition cicatrisante à base d'au moins un FGF est décrite dans la Demande de Brevet euro¬ péen 243 179 et comprend en outre du collagène et de l'héparine et/ou un glycoaminoglycane.
Dans ces différents documents, l'application topique du FGF, seul ou associé, est réalisée à l'aide de formulations usuelles telles que crèmes, pâtes, solu¬ tions, gels ou associées à des polymères, des éponges et des pompes permettant un relargage lent des FGFs, comme cela est en particulier décrit dans la demande Interna¬ tionale PCT US86/01879, dans laquelle il est précisé que des formulations comprenant des FGFs recombinants et des excipients ou des molécules de transport appropriés peu- vent être préparées, notamment des lotions, des gels, des formes retard ou des crèmes, ledites formulations étant éventuellement associées à d'autres principes actifs, tels que des antibiotiques. Les formes retard, décrites dans cette Demande, comprennent en particulier des poly- mères.
Les compositions obtenues peuvent notamment être utilisées comme cicatrisant, dans le contrôle de la coagulation, dans l'amélioration des dommages neurolo¬ giques et dans la régénération des tissus durs. II apparaît toutefois, que le FGF ne présente pas systématiquement une stimulation de la cicatrisa¬ tion ; en effet une absence de stimulation a été notam¬ ment rapportée dans J. Dermatol. Sing. Oncol. ; de ce fait, l'application topique de FGF acide ou basique doit souvent être itérative, pour obtenir les effets maximaux, bien que certaines compositions de l'Art antérieur telles que des éponges d'alcoolpolyvinylique imbibées de FGFs, appliquées sous la peau, entraînent une prolifération fi- broblastique et myoblastique.
Ceci est dû à une instabilité thermique de la molécule, à une inactivation de la molécule liée au pH, à une protéolyse par des enzymes, ainsi qu'à une interac¬ tion entre les FGFs et les glycoaminoglycanes comme l'héparane sulfate ou le protéohéparane sulfate des mem¬ branes cellulaires ou des membranes basales, entraînant une immobilisation des FGFs pouvant empêcher leur accès aux récepteurs cellulaires.
De tels inconvénients limitent les possibili¬ tés de stockage et d'exploitation des FGFs.
La Demande de Brevet européen 267 015 a pro- posé, pour pallier cet inconvénient, une composition contenant un facteur de croissance polypeptidique, plus particulièrement de l'EGF, et une quantité de polysaccha- ride soluble dans l'eau suffisante pour stabiliser ledit facteur contre la perte d'activité biologique, en pré- sence d'eau notamment. Il est spécifié dans cette De¬ mande, que les polysaccharides solubles dans l'eau qui peuvent être utilisés incluent les dérivés de la cellu¬ lose, l'amidon , l'agar, l'acide alginique, la gomme ara¬ bique, les dextranes, les fructanes, l'inuline, les man- nanes, les xylanes, les arabinanes, les chitosanes, le glycogène et les glucanes.
Les Inventeurs, poursuivant leurs travaux sur les dextranes, ont mis en évidence de nouvelles proprié¬ tés de dextranes substitués fonctionnalisés ; lesdits dextranes s'avèrent présenter une activité régénératrice cellulaire et tissulaire propre et présentent, de plus, non seulement une action stabilisante sur une composition de FGF mais coopèrent avec le FGF dans l'activité biolo¬ gique de ce dernier. La Demanderesse s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à un agent à activité régénératrice cellulaire et tissulaire ainsi qu'à des compositions contenant ledit agent associé à des FGFs qui répondent mieux aux nécessités de la pratique que les compositions visant au même but proposées dans l'Art antérieur, nota - ment en ce que les compositions conformes à l'invention ont une stabilité nettement améliorée, permettant un sto¬ ckage plus aisé et de ce fait un effet thérapeutique su¬ périeur aux compositions de l'Art antérieur et en ce que leur fréquence d'application est ainsi nettement di- minuée.
La présente invention a pour objet un agent à activité régénératrice cellulaire et tissulaire, caracté¬ risé en ce qu'il est constitué par au moins un dextrane substitué fonctionnalisé. Selon un mode de réalisation avantageux dudit agent, les dextranes substitués fonctionnalisés sont choisis dans le groupe qui comprend des dextranes so- lubles et des dextranes insolubles.
On entend par dextranes solubles substitués fonctionnalisés, ceux qui sont notamment décrits dans le Brevet français n° 2 555 589 ou dans le Brevet français n* 2 461 724.
On entend par dextranes insolubles substitués fonctionnalisés, ceux qui sont notamment décrits dans la Demande de Brevet français n' 82 01641 ou dans le Brevet français n* 2 461 724.
De tels dextranes sont stables et ne perdent pas leurs propriétés avec le temps.
De plus, ils présentent la propriété inatten- due de présenter une activité régénératrice cellulaire et tissulaire propre, à faibles doses et plus particulière¬ ment une activité cicatrisante.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, lesdits dextranes fonctionnalisés com- prennent des fonctions choisies dans le groupe qui est constitué par le carboxyméthyle, le benzylamide et le benzylamide sulfonate.
La présente invention a également pour objet une composition stabilisée, caractérisée en ce qu'elle comprend un agent à activité régénératrice cellulaire et tissulaire tel que défini ci-dessus associé avec au moins un FGF acide et/ou un FGF basique et/ou un dérivé et/ou un analogue et/ou un fragment de ceux-ci présentant une activité biologique, lequel agent est capable de restau- rer partiellement ou totalement l'activité biologique du/des facteurs FGF acides et/ou basiques inactivés par un stockage de longue durée ou la température.
Une telle composition présente une activité de régénération cellulaire et tissulaire, et notamment une action cicatrisante, accrue par rapport aux compositions de l'Art antérieur.
Selon un mode de réalisation avantageux de la composition conforme à l'invention, celle-ci comprend de 0,1 à 1 000 μg/ml d'au moins un agent à activité régéné- ratrice cellulaire et tissulaire tel que défini ci- dessus et de 0,01 ng à 300 μg d'au moins un FGF choisi dans le groupe constitué par les FGF acides, les FGF ba¬ siques, leurs dérivés, leurs analogues et leurs fragments présentant une activité biologique. Conformément à l'invention, les compositions stabilisées contenant l'agent à activité régénératrice cellulaire et tissulaire seul ou associé à au moins un FGF peuvent être associés à d'autres principes actifs et/ou à au moins un véhicule pharmaceutiquement accep- table et/ou à un support physiologiquement acceptable.
Les principes actifs associés sont choisis dans le groupe qui comprend notamment les anesthésiques locaux, les antiinfectieux, des protéines sériques et du collagène. On peut citer notamment, comme anesthésique local, la lidocaïne, comme substances bactériostatiques. les sels de sodium, les sels d'argent, leurs dérivés ou des sulfadiazines. On peut citer comme antibiotique, la streptomycine ; on peut citer comme protéine sérique, la sérumalbumine ou la fibronectine ; on peut citer égale- ment des collagènes solubles et de l'élastine.
Conformément à l'invention, lorsque le véhi¬ cule est de l'eau, ladite composition est en outre asso¬ ciée à des tampons et/ou à des sels appropriés, de manière à maintenir le mélange approximativement à un pH compris entre 6,8 et 7,4 et à une force ionique comprise par exemple entre 0,1 et 0,2 en équivalent NaCl.
De telles associations conformes à 1'invention sont ci-après dénommées "composition matrice".
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite composition, elle est associée à des liposomes.
De telles compositions conformes à l'invention sont ci-après dénommées composition FGF-dextrane fonc¬ tionnalisé-liposome et composition dextrane fonctionna¬ lisé-liposome. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite composition, le support est choisi dans le groupe qui comprend notamment les pansements et les bio¬ matériaux.
Selon un autre mode de réalisation de la composition conforme à l'invention, celle-ci est sous forme d'aérosol, lorsque le véhicule est un gaz appro¬ prié.
La composition "matrice" est avantageusement appliquée directement en solution ou en aérosol. Conformément à l'invention, ladite composi¬ tion, notamment ladite composition "matrice" est incluse dans une forme galénique telle que pommade, crème, pâte, lotion ou imprègne un gel, notamment un gel de collagène. Egalement conformément à l'invention, ladite composition, notamment ladite composition "matrice" est incluse et/ou imprègne un support approprié tel que pan- sèment ou biomatériau favorisant directement ou indirec¬ tement la réparation cellulaire (par exemple, un fil de suture chirurgical ou le corail pour greffe osseuse) .
Ladite composition "matrice" peut notamment être incluse dans des crèmes ou lotions utilisées tradi¬ tionnellement, notamment les crèmes à base de lanoline telles que "SILVEADENE", "MARIO", "AQUAPHOR", "EQUALIA",' pour des applications sur la peau ; elle peut également être incluse ou imbiber des pansements tels que panse- ments de textiles, de tissus synthétiques ou d'épongés, ou des produits naturels servant de recouvrement de plaies, par exemple des gels de collagène ou des dermes d'origine animale.
Ladite composition "matrice" conforme à l'invention, doit imprégner ces différentes formes de pansements, de manière à ce que le facteur FGF et/ou le dextrane fonctionnalisé substitué puissent être en contact ou diffuser, jusqu'aux tissus cibles.
La composition conforme à l'invention est no- tamment maintenue sur le site de la blessure et sur les blessures ouvertes, de manière à maintenir l'hydratation selon les techniques de l'homme de l'Art, particulière¬ ment élaborées dans le domaine des greffes de peau. -
Les pansements occlusifs peuvent être impré- gnés de la même manière, adsorbés ou recouvrir un support naturel ou synthétique.
Pour les applications sur les cornées, le véhicule doit être compatible avec la tolérance oculaire (par exemple, le produit commercialisé sous le nom de "LACRIBULE") , des solutions salines, des solutions isoto¬ niques (par exemple, le "NEOCADRON" (Merck-Sharp-Dohme) .
Ces véhicules peuvent contenir également des agents conservateurs comme les chlorures de benzyl- diméthyl alcoyle d'ammonium ou l'éthylène diamine tétra- acétate de sodium (EDTA) . Conformément à l'invention, la composition
FGF-dextrane fonctionnalisé-liposome ou la composition dextrane fonctionnalisé-liposome est incluse dans une forme galénique telle que pommade, crème, pâte, lotion ou imprègne un gel, notamment un gel de collagène.
Dans le cas de dextranes fonctionnalisés inso¬ lubles, ceux-ci peuvent également être inclus seuls ou associés au FGF dans des supports comme les crèmes, les gélatines ou gels de collagènes, ou sur des fibres syn- thétiques ou naturelles, supports habituels de pansements de recouvrement. L'inclusion des polymères fonctionnali¬ sés insolubles peut se faire par addition de solution de collagène et gélification. Les procédures décrites dans une série de brevets de YANNAS peuvent être utilisées. Dans ces brevets (US 4, 060081) , une composition lami¬ naire composite donnant une peau équivalente dans la¬ quelle la partie en contact avec la blessure est couverte de collagène réticulé avec un glycosaminoglycane, le mé¬ lange étant obtenu par addition de glycosaminoglycanes au collagène solubilisé, l'ensemble étant précipité ou réti¬ culé par du glutaraldéhyde (Brevet US 4418691).
La composition conforme à l'invention, est no¬ tamment préparée par le mélange d'au moins un FGF appro¬ prié avec au moins un agent à activité régénératrice et stabilisante.
Lesdits FGFs sont obtenus par extraction et purification, à partir de sources naturelles, par syn¬ thèse chimique ou bien par des techniques de recombinai¬ son génétique appropriées. Lesdits FGFs sont d'origine humaine ou bien proviennent d'autres animaux, notamment d'autres mammi¬ fères.
De nombreux procédés de purification pour ex¬ traire et isoler les deux formes de FGFs à partir de ces sources naturelles (rétine, cerveau, hypophyse, placenta, rein etc..) ont été décrits dans l'Art antérieur. Les méthodes préférées de la présente inven¬ tion sont celles décrites dans Biochimie, 1986 (COURTY et al.) ou celle décrite dans la Demande de Brevet français 2 613 936, qui utilise la chromatographie d'affinité sur polystyrènes substitués biospécifiques.
Ces méthodes préférées incluent une étape de traitement de l'extrait tissulaire à pH très acide, ex¬ cluant ainsi tout risque de contamination virale, et l'utilisation d'une chromatographie sur héparine immobilisée ou polystyrène substitué.
Les deux formes de FGF peuvent ainsi être iso¬ lées et séparées, avec les autres protéines ou individuellement avec un degré de pureté suffisant pour être débarassé de quantités significatives d'autres maté- riels contaminants.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comporte encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se ré¬ fère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'à des exemples montrant l'effet des dextranes substitués fonctionnalisés sur la protection de l'activité biologique des FGFs.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Exemples Exemple 1 : Procédé de stabilisation des FGF. 1) Préparation d'un dextrane substitué fonc- tionnalisé (agent de régénération cellulaire et tissu¬ laire) .
. 30 grammes de dextrane T40 (0,185 mole) sont dissous dans 146 ml d'eau distillée et refroidis à 4*C dans un bain de glace fondante. 59,2 g de NaOH (1,48 moles) sont dissous dans 100 ml d'eau distillée, puis re¬ froidis à 4*C. La solution de soude est versée lentement dans la solution de dextrane sous agitation et l'ensemble est maintenu à 4*C pendant 20 minutes. On ajoute alors 61 g de CICH2COOH (0,647 mole) très progressivement, afin que la température atteigne 20"C après 5 minutes. Le milieu réactionnel est alors porté à 40'C en 10 minutes et maintenu à cette température pendant 90 minutes, puis refroidi vers 20βC. Le pH est abaissé vers 7 avec de l'acide acétique concentré. L'ensemble est précipité dans 2 litres de méthanol, filtré et lavé deux fois avec 1 litre d'éthanol, puis séché sous vide à 40"C.
. 10 g du polymère modifié précédent sont dis¬ sous dans 55 ml d'eau distillée acidifiée à pH 3. 60 ml de diméthylformamide sont ajoutés très progressivement sous agitation, en maintenant le pH à la valeur de 3. La température est abaissée à -15°C et 12,3 ml de N- méthylmorpholine sont ajoutés avec 14,5 ml de chloro- formate d'isobutyle. On ajoute ensuite 12,2 ml de benzyl- amine. Après 30 minutes, le polymère est précipité dans 800 ml de méthanol filtré et séché. . 9 g du polymère modifié précédent sont dis¬ persés dans 25 ml de dichlorométhane anhydre. Un mélange de 0,26 ml de HSO3CI et de 2,5 ml de dichlorométhane est ajouté dans le réacteur et l'ensemble est maintenu 4 heures à température ambiante. Après filtration et lavage par du dichlorométhane, le produit est séché, dissous dans 30 ml d'eau et le pH est ajusté à la valeur 7,0. La solution est ultrafiltrée contre une solution tampon, puis contre de l'eau distillée. La solution est alors lyophilisée jusqu'à obtention du polymère sec. Une autre méthode de préparation d'un dextrane substitué fonctionnalisé peut être utilisée comme telle que celle décrite dans le Brevet Européen n* 0 023 854. 2) Préparation du/des FGF. - On traite le/les extraits cellulaires pen- dant une nuit en présence d'acide acétique à pH 3, puis on sépare les FGFs par chromatographie sur héparine immo¬ bilisée ou polystyrène substitué.
3) Préparation d'une composition stable de FGF conforme à l'invention. - On prépare une solution de dextrane à partir du polymère sec obtenu en 1) en le mettant en solution dans un tampon phosphate isotonique (PBS) , de manière à obtenir une concentration de 400 μg/ml.
- On met les FGFs extraits en 2) en solution dans ce tampon contenant les dextranes substitués appro¬ priés, de manière à obtenir une concentration en FGFs de 100 μg/ml.
Exemple 2 : Pommade stabilisée conforme à 1'invention. FGF 10 μg
DF 5 mg
Carboxyméthyl cellulose 2,5 g
Eau purifiée stérile apyrogène 100 ml DF = Dextrane fonctionnalisé de type E tel que défini dans le tableau III ci-après.
La crème obtenue peut être appliquée sur une plaie de type scarification sur un rat, et ce pendant trois jours.
Exemple 3 : Pansement stabilisé conforme à 1'in ention.
Le support du pansement est constitué d'un film collagène "Pangil" des Laboratoires FOURNIER, impré¬ gné par adsorption passive d'un mélange de FGF et de Dex¬ trane fonctionnalisé dans les proportions suivantes : FGF 10 μg
DF 500 μg
Sérum physiologique 10 ml
Après incubation du film de collagène pendant 30 minutes à 4*C dans la solution décrite ci-dessus, on obtient un pansement pouvant être utilisé dans des cas d'ulcérations diverses, de plaies superficielles ou pro¬ fondes.
Ce pansement peut être stocké sous vide et em¬ paqueté. * ETUDE DE L'EFFET DE POLYMERES BIOSPECIFIQUES
FONCTIONNALISES SUR LA PROTECTION DE L'ACTIVITE BIOLO¬ GIQUE DES FGFs in vitro.
Méthodologie utilisée pour la mesure de l'activité biologique des FGFs in vitro. Les méthodes d'évaluation in vitro de l'activité biologique des FGFs sont décrites dans de nom¬ breuses publications, et sont toutes basées soit sur une mesure de 1'augmentation du nombre de cellules induite par des doses croissantes de facteurs ajoutés au milieu de culture des cellules, soit sur une augmentation de 1'incorporation de thymidine tritiée dans le DNA des cel¬ lules stimulées par le facteur de croissance. Dans les deux méthodes évoquées, ces augmentations sont dépen¬ dantes de la dose de facteur ajoutée, et l'on peut donc établir des effets dose et des courbes dose-réponse avec un effet maximal de stimulation. Par simplification, on définit une unité de stimulation comme la dose de facteur de croissance qui, ajoutée à un millilitre de milieu de culture sur des cellules cibles est capable d'induire une augmentation du nombre de cellules ou de 1'incorporation de thymidine tritiée correspondant à la moitié (50 %) de la valeur maximale de cette augmentation mesurée dans la courbe dose-réponse. Cette définition et la reproductibi- lité de ces mesures sont exposées notamment dans PLOUET et al., 1984, Cellular and Molecular Biology 30, p 105.
EXEMPLE A : EFFET PROTECTEUR DU DEXTRAN SUBSTITUE CONTRE L'INACTIVATION DES FGFs ACIDE ET BASIQUE PAR DES pH ACIDES ET ALCALINS.
Dans ces expériences, les FGFs sont en solu- tion à une concentration de 100 μg par millilitre, dans un tampon phosphate isotonique (PBS) ne contenant pas de dextrane (témoin) ou contenant du dextrane substitué à 400 μg/ml. 10 μl de ces différentes solutions sont préle¬ vés et mélangés soit à 1 ml de tampon PBS, d'acide acé¬ tique (CH3COOH) dilué ajusté à pH 2 (environ 1 N) , soit de soude (NaOH) diluée ajustée à pH 9,0. Ces échantillons sont incubés à 20*C pendant deux heures et un prélèvement de 1 μl est effectué pour le dosage de l'activité biolo¬ gique.
La figure 1 présente la courbe dose-réponse du bFGF sur des fibroblastes CCL39.
Cette figure comporte en abscisse le loga¬ rithme de la concentration de bFGF en pg/ml et en ordon¬ née la pourcentage de stimulation.
La courbe 1 correspond au témoin ; la courbe 2 correspond au bFGF seul à pH 2 ; la courbe 3 correspond au bFGF en présence de dextrane à pH 2 ; la courbe 4 correspond au bFGF en présence de dextrane à pH 9 ; la courbe 5 correspond au bFGF seul à pH 9 et la courbe 6 correspond au témoin en présence de dextrane. L'augmentation d'incorporation de thymidine tritiée représente la valeur du nombre de coups par mi¬ nute (cpm) obtenue au plateau de la courbe dose-réponse du bFGF seul moins la valeur en cpm de thymidine tritiée incorporée dans les cellules en absence de FGF et déter- minée dans la même expérience.
Les courbes 3 et 4 montrent que le bFGF en présence de dextrane conserve son pouvoir de stimulation tant en milieu acide que basique.
Le tableau I résume les résultats obtenus avec les FGFs acide et basique. L'unité de stimulation est arbitrairement fixée à 1 pour le aFGF ou le bFGF de dé¬ part, incubé deux heures à 20'C.
Figure imgf000017_0001
TABLEAU I
Figure imgf000018_0001
DF = dextrane fonctionnalisé : dans cet exemple, il s'agit du dextrane E tel que défini dans le tableau III, ci-après.
H.S. = heparane sulfate : (Société BIOVALORIS à Plouhermel (Ile-et-Villaine, FRANCE) ) .
Ce tableau montre l'effet protecteur -du DF (Dextrane fonctionnalisé) contre 1'inactivation des FGFs acide et basique induits par des pH acides et alcalins.
L'incubation du FGF basique pendant deux heures à 20°C dans une solution tampon pH 2 à 9 induit une inactivation de l'activité biologique du FGF basique.
En effet, il faut 53 fois plus de produit à pH acide et 13 fois plus à pH basique pour induire un effet biologique au produit initial.
L'adjonction de DF à ce mélange protège totalement l'activité biologique du FGF basique contre des incubations à pH 2 ou 9.
Des résultats similaires sont observés dans le cas du FGF acide concernant les deux types de traitement. EXEMPLE B : EFFET DU DEXTRANE FONCTIONNALISE (DF) SUR L*INACTIVATION DES FGFs PAR LA TEMPERATURE A COURT TERME ET LONG TERME.
Dans cet exemple, le FGF préparé comme dans l'exemple A est incubé à 4 ' C, 20°C, 37°C ou 60°C pendant différents temps, en l'absence ou en présence de 400 μg de dextrane fonctionnalisé (DF) tel que défini dans le tableau III ci-après, puis dosé.
Les résultats sont présentés dans le tableau II ci-après.
TABLEAU II
Figure imgf000019_0001
DF •= dextrane fonctionnalisé H.S. = héparane sulfate
L'unité de stimulation initiale est fixée arbitrairement à une valeur égale à 1.
Dans ce tableau, on observe une forte inhibi¬ tion de l'activation du FGF acide ou basique induit par un traitement d'une semaine à 37*C. La présence du DF dans le milieu d'incubation protège les deux types de FGF contre la dénaturation thermique.
Des résultats similaires sont observés en uti¬ lisant l'HS (Héparane Sulfate), équivalent biologique du DF.
EXEMPLE C : EFFET DE DIFFERENTS DEXTRANES FONCTIONNALISES SUR LES EFFETS DOSE-REPONSE DU FGF.
L'effet de différents dextranes fonctionnali¬ sés est mesuré à l'unité sur le tableau III ci-dessous.
TABLEAU III
Figure imgf000020_0001
Pourcentage :
D : Dextrane
W : Carboxyméthyle
X : Benzylamide
Y : Benzylamidesulfonate
R/us est la valeur du rapport des valeurs des unités de stimulation du aFGF sans dextrane fonctionna¬ lisé divisé par l'unité de stimulation en présence de dextrane fonctionnalisé.
* ETUDE DE L'EFFET DE POLYMERES BIOSPECIFIQUES FONCTIONNALISES SUR LA PROTECTION DE L'ACTIVITE BIOLO¬ GIQUE DES FGFS in vivo
Exemple D : ETUDES CINETIQUE, PLANIMETRIQUE ET HISTOLOGIQUE DE L'EFFET CICATRISANT DE L'ASSOCIATION FGF/DEXTRANΞ FONCTIONNALISE. Protocole expérimental : Les opérations sont réalisées sur des rats istar mâles de 300 à 400 grammes. Chaque expérience est effectuée sur une série de 5 animaux. Types de plaies : Deux types de plaies cutanées sont effectuées sur la face dorsale des animaux, préalablement rasée.
- Les prélèvements sont effectués par punch (0,6 cm de diamètre) jusqu'au plancher musculaire.
- Des scarifications de 1 cm de long sont pra- tiques au scalpel. Elles n'affectent pas la région dermo- épidermique. Mode opératoire :
Selon le type de plaies, les blessures sont traitées par différents mélanges de produits en solution dans du sérum physiologique tamponné (pH 7,4) stérilisé.
Ces solutions sont déposées pour les plaies par punch dans un tampon collagène (GINGESTAT) prédécoupé aux mesures exactes de l'excision tissulaire.
Dans le cas des scarifications, les produits sont déposés directement sous forme liquide sur la plaie.
Les effets de l'association FGF (basique ou acide ou un mélange en solution de 1 ng à 10 μg/ml) et des dextranes fonctionnalisés (en solution de 100- ng à 1 mg/ml) sont évalués et comparés à l'action d'un dex- trane fonctionnalisé substitué seul et de chacun des constituants, considérés comme témoins de réaction (collagène, solution de dissolution, FGF) .
Chaque série expérimentale d'animaux est sacrifiée à intervalle de temps défini par période de 24 heures, et les régions lésées sont prélevées pour deux types d'étude :
~ une analyse morphologique externe avec planimétrie de la plaie ;
- une étude histologique. Résultats :
I - Effets stabilisants des dextranes fonctionnalisés :
Du FGF radiomarqué à 1'•i25l est déposé en pré- sence ou en absence de dextrane fonctionnalisé dans un tampon de collagène.
La variation de la radioactivité dans le collagène imprégné est appréciée en fonction du temps.
Les résultats sont illustrés dans la figure 2, qui comporte en abscisse le temps en heure et en ordon¬ née, le pourcentage de radioactivité. La courbe 7 corres¬ pond au FGF en présence de dextrane et la courbe 8 cor¬ respond au FGF seul.
La radioactivité est mesurée dans le gel de collagène et dans des prélèvements effectués en périphé¬ rie de la plaie, à 2 cm de celle-ci, par un punch équiva¬ lent à celui d'origine.
II - Etudes morphologique et histologique : A) Etude morphologique : L'observation de l'évolution des plaies à l'oeil nu permet de constater une action très nette de l'association FGF + dextrane fonctionnalisé sur la vi¬ tesse et la qualité de la cicatrisation superficielle (épidermisation + lyse du caillot) . 1) Après 24 heures, les tampons de collagène imprégnés par cette association ont totalement adhéré aux parois de la plaie, et ne peuvent être prélevés que par lésions des tissus régénérés. Les expérimentations té¬ moins ne manifestent une adhérence totale des coll'agènes qu'au bout de 36 à 48 heures.
2) La réépithélialisation est visible à l'oeil nu au bout du troisième jour, en présence de l'association FGF + dextrane fonctionnalisé, alors qu'une image identique sur les contrôles demande des temps d'expérimentation de 5 à 7 jours. 3) Analyse planimétrique : l'analyse planimé- trique de la surface externe des plaies montre 1'absence totale de rétraction des tissus en régénération.
Le taux de rétraction cicatricielle est évalué en fonction du temps en considérant le rapport P/A où P est le périmètre de la plaie et A la surface de la cica¬ trice.
L'ordre de grandeur de ce rapport P/A est du type K/R où K est une constante et R le rayon de la plaie originelle circulaire.
En fonction du temps, plus ce rapport est faible et constant, plus la cicatrice conserve une planimétrie proche de celle de la lésion d'origine. Par conséquent, plus le rapport P/A est faible, plus le taux de restructuration cicatriciel est limité. La qualité de cicatrisation peut ainsi être reflétée par l'absence de contraction.
Les résultats obtenus sont illustrés sur la figure 3, qui comporte en abscisse le temps en jour et en ordonnée le rapport P/A. Le taux de rétraction est repré¬ senté par l__l pour le témoin ; par S pour le bFGF ; par Si pour les FGFs en présence d'héparane sulfate et par Q pour les FGFs associés aux dextrane fonctionnalisés.-
Les résultats sont également présentés dans les tableaux IV et V ci-après ; le tableau IV donne le pourcentage de l'aire de cicatrisation en fonction de la quantité de dextrane fonctionnalisé (DF) en présence ou en l'absence de bFGF ; le tableau V donne le rapport P/A dans les mêmes conditions.
Figure imgf000023_0001
TABLEAU IV
Figure imgf000024_0001
TABLEAU V
Figure imgf000024_0002
Les effets des dextranes fonctionnalisés sur cette rétraction sont particulièrement visibles aux qua¬ trième et huitième jours après l'opération.
Les tableaux ci-dessus montrent bien l'effet cicatrisant propre des dextranes ; en effet, dans le tableau IV, après 8 jours, le pourcentage de l'aire en présence de 5 μg de DF est proche de celui en présence de 1 μg de bFGF seul, eux-mêmes inférieurs au témoin.
La rétraction est très faible en comparaison avec celles observées dans les expérimentations témoins ou celles observées en présence des FGFs seuls ou asso¬ ciés à des heparanes sulfates, conditions déjà nettement plus favorables que celles du témoin.
B) Etude histologique
Les régions traitées sont prélevées, fixées, imprégnées en paraffine. L'étude histologique est réali¬ sée sur des coupes de 7 μm. Les colorations utilisées permettent des études topographiques et histochimiques. L'analyse histologique montre que l'associa¬ tion FGF + DF accélère les étapes traditionnelles de la cicatrisation dermoépidermique et augmente la qualité des tissus reconstitués. Le collagène imprégné permet une colonisation très rapide (1 jour) des catégories cellulaires environ¬ nantes (fibroblastes, musculaires lisses) à partir des tissus environnants sains, et en particulier à partir du conjonctif du plancher musculaire strié sous-jacent. Dans le même temps, une néoangiogénèse permet au tissu en formation d'être colonisé par une densité très forte de capillaires sanguins. Au bout de trois jours (contre cinq à six pour les témoins) , la réépithé- lialisation engagée à partir de l'épiderme des lèvres de la plaie arrive à affrontement. Le quatrième jour, l'épiderme est totalement reconstitué et les tissus sous- jacents, totalement réorganisés, présentent une densité normale comparativement aux témoins, à la densité beau¬ coup plus faible. Ces mêmes illustrations révèlent l'absence de rétraction des bords de la plaie pour les punchs traités par l'association FGF + dextranes fonctio- nalisés, contrairement aux témoins qui comblent, par ex¬ traction, les tissus excisés.
Les effets de l'association des bFGF et des dextranes fonctionnalisés sur la qualité de la cicatrisa¬ tion, comparés à une cicatrisation naturelle sans adjonc¬ tion de produits sont présentés sur les figures 4 et 5.
La figure 4 présente une photographie d'une coupe histologique d'une cicatrisation témoin (absence de traitement) quatre jours après la réalisation de la plaie
(X 40) . La figure 5 présente la photographie d'une coupe histologique d'une cicatrisation après traitement par un tampon de collagène imprégné d'une solution de bFGF à
1 μg/ml et de dextranes fonctionnalisés à 50 μg/ml, quatre jours après la réalisation de la plaie et au même grossissement de 40. La figure 5 montre l'épiderme (E) reconstitué entièrement alors que sur la figure 4, il n'est pas re¬ formé. Une rétraction des tissus environnants sur la plaie témoin n'est pas enregistrée sur la plaie traitée. Cet espace cicatriciel, relativement anarchique en figure 4, présente pour la plaie traitée (figure 5) une organisation et une densité cellulaire satisfaisante. Il se caractérise par la présence de vaisseaux sanguins tra¬ duisant l'effet angiogénique local de l'association des produits de cette invention.
Il apparaît donc que l'association bFGF + dex¬ trane fonctionnalisé se présente comme un puissant agent cicatrisant in vivo, accélérant d'une part les processus naturels régénératifs, et permettant d'autre part une qualité accrue de la cicatrisation par l'absence de tout phénomène de rétraction comme la mobilisation rapide des différentes catégories cellulaires nécessaires à la restauration tissulaire.
Exemple E : Etudes planimétriques et histolo- giques de l'effet cicatrisant de dextranes fonctionnali¬ sés.
Le protocole expérimental, en tous points identique à celui effectué dans le cadre de l'exemple D, est réalisé pour apprécier les effets cicatrisants des dextranes fonctionnalisés. Les dextranes étudiés sont répertoriés dans le tableau III de l'exemple C. Les effets cicatrisants de ces dextranes fonctionnalisés ou de leur association ont été appréciés par rapport à deux expérimentations témoins en présence de véhicule seul, de tampon de collagène, ou de tampon de collagène imprégné de dextrane non substitué (produit noté A) .
A - Etude morphologique
L'observation de l'évolution des plaies à l'oeil nu permet de constater une action très nette des dextranes fonctionnalisés sur la vitesse et la qualité de la cicatrisation superficielle. Par rapport aux expérimentations témoins, l'adhérence du véhicule est accélérée pour les plaies traitées par les dextranes fonctionnalisés.
La réépithélialisation suit une cinétique co - parable à celle observée sous l'action des FGFs.
Le rapport P/A où P est le périmètre de la plaie et A la surface de la cicatrice traduit une diminu¬ tion tout à fait significative du taux de rétraction cicatricielle. Les résultats obtenus sont illustrés par le tableau VI.
Ces expérimentations confirment le rôle spéci¬ fique des dextranes fonctionnalisés sur l'inhibition de la rétraction cicatricielle et la déformation du plan cu¬ tané environnant, comme cela a déjà été spécifié ci- dessus à l'exemple D.
B - Etude histologique
L'analyse est identique à celle menée dans 1*exemple précédent.
Elle révèle par rapport aux observations des expérimentations témoins, une colonisation du collagène imprégné par les dextranes fonctionnalisés plus rapide et plus intense à partir des différents types cellulaires environnant la plaie.
La néoangiogénèse est nette mais moins soute- nue que celle observée en présence des FGFs.
Les prolongements épidermiques s'affrontent aux alentours du jour 4, précédant d'au moins 24 heures la réépithélialisation observée chez les témoins.
Il apparaît donc un effet cicatrisant propre à l'action des dextranes fonctionnalisés qui se manifeste par une cicatrisation aux contours harmonieux traduisant une diminution de la contraction naturelle des berges de la plaie et une mobilisation accrue et rapide de cellules colonisatrices des collagènes aboutissant à un tissu de régénération plus dense et vascularisé que celui observé pour les expérimentations témoins. Un tel effet pourrait peut-être s'expliquer par le fait que les dextranes fonctionnalisés substitués potentialisent, au niveau des tissus, l'action des FGFs sécrétés in situ par les tissus environnants.
TABLEAU VI Les taux de rétraction P/A sont présentés pour les témoins collagènes seuls, collagène imprégné de dex¬ trane de type A et pour les différents dextranes réperto¬ riés précédemment. Toutes ces molécules agissent à une dilution de 3 μg/ml.
Figure imgf000028_0001
(1) : Collagène
(2) : Collagène + A
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien¬ nent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en em¬ brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent ve¬ nir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente in¬ vention.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Agent à activité régénératrice cellulaire et tissulaire, caractérisé en ce qu'il est constitué par au moins un dextrane substitué fonctionnalisé. 2°) Agent selon la revendication 1, caracté¬ risé en ce que les dextranes substitués fonctionnalisés sont choisis dans le groupe qui comprend des dextranes solubles et des dextranes insolubles.
3°) Agent selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que lesdits dextranes fonctionnalisés comprennent des fonctions choisies dans le groupe qui est constitué par le carboxyméthyle, le benzylamide et le benzylamide sulfonate.
4°) Composition stabilisée, caractérisée en ce qu'elle comprend un agent à activité régénératrice cellu¬ laire et tissulaire selon l'une quelconque des revendica¬ tions 1 à 3 associé avec au moins un FGF acide et/ou un FGF basique et/ou un dérivé et/ou un analogue et/ou un fragment de ceux-ci présentant une activité biologique, lequel agent est capable de restaurer partiellement ou totalement l'activité biologique du/des facteurs FGF acides et/ou basiques inactivés par un stockage de longue durée ou la température.
5°) Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que celle-ci comprend de 0,1 à 1 000 μg/ml d'au moins un agent à activité régénératrice cellulaire et tissulaire tel que défini ci-dessus et de 0,01 ng à 300 μg d'au moins un FGF choisi dans le groupe constitué par les FGF acides, les FGF basiques, leurs dérivés, leurs analogues et leurs fragments présentant une activité biologique.
6°) Composition contenant un agent à activité régénératrice cellulaire et tissulaire selon l'une quel¬ conque des revendications 1 à 3 ou une composition conte- nant ledit agent associé à un FGF telle que définie dans la revendication 4 ou la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle comprend, de plus, d'autres principes actifs associés.
7°) Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que les principes actifs associés sont choisis dans le groupe qui comprend notamment les anes- thésiques locaux, les antiinfectieux, des protéines sé- riques et du collagène.
8°) Composition selon la revendication 6 ou la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable approprié et/ou un support physiologiquement acceptable.
9°) Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce que le véhicule est de l'eau et en ce que ladite composition comprend, en outre, des tampons et/ou des sels, de manière à maintenir le mélange approximativement à un pH compris entre 6,8 et 7,4 et à une force ionique comprise entre 0,1 et 0,2 en équivalent NaCl.
10°) Composition selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisée en ce qu'elle est incorporée à des liposomes appropriés.
11°) Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisée en ce que le support est choisi dans le groupe qui comprend notamment les pansements et les biomatériaux.
12°) Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle est sous forme d'aérosol, lorsque le véhicule est un gaz appro¬ prié. 13°) Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle est incluse dans une forme galénique telle que pommade, crème, pâte, lotion ou imprègne un gel, notamment un gel de collagène. 14°) Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle est in- cluse et/ou imprègne un support approprié tel que panse¬ ment ou biomatériau favorisant directement ou indirecte¬ ment la réparation cellulaire.
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